KR102084862B1 - 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 초산균의 검출 및 정량 방법 - Google Patents

실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 초산균의 검출 및 정량 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 초산균의 검출 또는 정량용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 초산균의 검출 또는 정량용 키트; 및 초산균의 검출 및 정량 방법에 관한 것으로서, 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 신속하고 정확하게 초산균만을 검출하고 정량할 수 있어 식품분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 초산균의 검출 및 정량 방법{Method for detection and quantification of acetic acid bacteria using real-time polymerase chain reaction}
본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 초산균의 검출 및 정량 방법에 관한 것이다.
초산균은 그람 음성의 절대 호기성 세균으로 알코올이나 당을 산화시켜 최종 산물로서 초산을 생성하는 능력을 가지고 있다. 초산균은 주로 과일, 꽃, 발효식품에서 존재하고 있다. 초산균은 주로 초산발효를 이용한 식초의 생산 및 셀룰로오스 등 다양한 기질을 생산할 때 사용된다. 하지만 주류 산업에서는 알코올을 분해하는 중요한 오염 미생물로 인식되고 있다. 이 밖에도 농업에서는 우수한 질소 고정 능력을 바탕으로 토질 개선에 활용되며, 최근에는 동물과 사람의 건강에 도움을 주는 생균제로서도 새롭게 주목을 받고 있다.
이처럼 초산균의 다양한 역할을 고려할 때, 초산균을 대상으로 하는 신속 검출 및 정량 기술의 확립은 관련 산업 발전에 필수적이다. 특히 시대적 흐름에 부응하여 발효식품의 미생물학적 품질을 더욱 정밀하게 관리하고 다양한 고기능성 초산균종을 분리 및 확보하려면 초산균을 대상으로 하는 분석기법을 개발하는 것이 중요하다. 일반적으로, 세균을 대상으로 사용되는 가장 기본적인 분석기법은 배지를 이용한 배양법이지만, 초산균의 경우 식품시료에서 초산균군만을 선택적으로 검출 및 정량할 수 있는 배양법이 아직까지 존재하지 않기 때문에, 다양한 비-배양적(culture-independent) 분석기법들이 개발되어있다. 하지만, 이 방법들은 주로 단일 초산균 종(species)을 위해 개발되어있기 때문에 그 이용이 제한적인 상태이다. 초산균은 오늘날 총 11개의 속(genus) 및 46개의 종(species)이 알려져 있지만, 이들을 통합적으로 검출 및 정량 할 수 있는 분석기법은 전무한 상황이다.
미국등록특허 제7,384,770호
본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 초산균의 검출 또는 정량용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 초산균의 검출 또는 정량용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 초산균의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 수행하여 얻은 Ct 값을 표준 검량선에 대입하는 단계를 포함하는 식품 시료 내에 존재하는 초산균의 정량 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 초산균의 검출 또는 정량용 조성물을 제공한다.
본 발명에서의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 염기서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 염기서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 초산균의 16S rRNA 유전자에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 초산균은 Acetobacter 속, Gluconobacter 속, Gluconacetobacter 속, Asaia 속, Granulibacter 속, Rhodopila 속, Saccharibacter 속, Kozakia 속, Neoasaia 속, Swaminathania 속 또는 Acidomonas 속 균주인 것이고, 바람직하게는 Acetobacter aceti NCIB 8621T (Accession No.: X74066.1), Acetobacter cerevisiae LMG 1625T (Accession No.: AJ419843.1), Acetobacter cibinongensis 4H-1T (Accession No.: AB052710.1), Acetobacter estunensis IFO 13751T (Accession No.: AB032349.1), Acetobacter indonesiensis NRIC 0313T (Accession No.: AB032356.1), Acetobacter lovaniensis IFO 13753T (Accession No.: AB032351.1), Acetobacter malorum LMG 1746T (Accession No.: AJ419844.1), Acetobacter nitrogenifigens RG1T (Accession No.: AY669513.2), Acetobacter oeni B13T (Accession No.: AY829472.1), Acetobacter orientalis 21F-2T (Accession No.: AB052706.1), Acetobacter orleanensis IFO 13752T (Accession No.: AB032350.1), Acetobacter pasteurianus LMD 22.1T (Accession No.: X71863.1), Acetobacter peroxydans IFO 13755T (Accession No.: AB032352.1), Acetobacter pomorum LTH 2458T (Accession No.: AJ001632.1), Acetobacter syzygii 9H-2T (Accession No.: AB052712.1), Acetobacter tropicalis NRIC 0312T (Accession No.: AB032354.1), Gluconobacter albidus NBRC 3250T (Accession No.: AB178392.1), Gluconobacter cerinus LMG 1368T (Accession No.: X80775.2), Gluconobacter frateurii IFO 3264T (Accession No.: X82290.1), Gluconobacter oxydans DSM 3503T (Accession No.: X73820.1), Gluconobacter thailandicus F149-1T (Accession No.: AB128050.1), Gluconacetobacter azotocaptans CFN-Ca54T (Accession No.: AF192761.1), Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC 49037T (Accession No.: X75618.1), Gluconacetobacter johannae CFN-Cf55T (Accession No.: AF111841.1), Gluconacetobacter liquefaciens IFO 12388T (Accession No.: X75617.1), Gluconacetobacter sacchari SRI 1794T (Accession No.: AF127407.1), Gluconacetobacter entanii LTH4560T (Accession No.: AJ251110.1), Gluconacetobacter europaeus DSM 6160T (Accession No.: Z21936.1), Gluconacetobacter hansenii NCIB 8746T (Accession No.: X75620.2), Gluconacetobacter intermedius TF2T (Accession No.: Y14694.1), Gluconacetobacter nataicola LMG 1536T (Accession No.: AB166743.1), Gluconacetobacter oboediens LTH 2460T (Accession No.: AJ001631.1), Gluconacetobacter rhaeticus DST GL02T (Accession No.: AY180961.1), Gluconacetobacter saccharivorans LMG 1582T (Accession No.: AB166740.1), Gluconacetobacter swingsii DST GL01T (Accession No.: AY180960.1), Gluconacetobacter xylinum NCIB 11664T (Accession No.: X75619.1), Asaia bogorensis 71T (Accession No.: AB025928.1), Asaia krungthepensis AA08T (Accession No.: AB102953.2), Asaia siamensis S60-1T (Accession No.: AB035416.1), Granulibacter bethesdensis NIH 1T (Accession No.: AY788950.1), Rhodopila globiformis DSM 161T (Accession No.: D86513.1), Saccharibacter floricola S-877T (Accession No.: AB110421.1), Kozakia baliensis strain Yo-3T (Accession No.: AB056321.1), Neoasaia chiangmaiensis BCC 15763T (Accession No.: AB208549.1), Swaminathania salitolerans PA51T (Accession No.: AF459454.1) 및 Acidomonas methanolica LMG 1668T (Accession No.: X77468.1)로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 균주인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 초산균의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계를 포함하는 초산균의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에서 중합효소연쇄반응은 (i) 초기 변성(denaturation) 과정, (ii) 어닐링(annealing), 연장(elongation) 및 변성(denaturation)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (iii) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)인 것일 수 있다.
본 발명에서 실시간 중합효소연쇄반응은 타겟 DNA의 증폭과 동시에 형광 방출에 의한 타겟 DNA의 절대 또는 상대적인 정량이 가능한 실험방법으로서, 전기영동하여 분석하는 단계가 생략되고, 증폭산물의 증폭정도를 자동화, 수치화시켜 신속하고 정확하게 검출 및 정량이 가능하다. 상기 방법을 수행하는 경우 타겟 DNA 내의 증폭된 서열에 특이적으로 결합하고 형광물질 및 형광억제물질이 태깅되어 있는 프로브를 사용하여 수행될 수 있고, 프로브의 사용없이 SYBR-Green 등의 형광물질을 사용하여 수행될 수도 있다. 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 결과는 Ct(cycle threshold) 값을 이용하여 분석될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 수행하여 얻은 Ct 값을 표준 검량선에 대입하는 단계를 포함하는 식품 시료 내에 존재하는 초산균의 정량 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행함으로써 신속하고 정확하게 초산균만을 검출하고 정량할 수 있어 식품분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 real-time PCR에서 얻은 Ct값과 GYC agar에 평판도말하여 얻은 집락수를 각각 대응하여 작성한 표준 검량선을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 프라이머 세트(Primer set)의 개발
본 발명자들은 46 종(species)의 초산균들의 16S rRNA gene을 표적으로 하여 real-time PCR에 사용될 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머 세트의 제작에 사용된 46 종(species)의 염기서열은 표 1에 기재하였다. 또한, 제작된 최종 프라이머 서열은 표 2에 기재하였다.
Genus (No. of species) Microorganisms (accession No.)
Acetobacter (16) Acetobacter aceti NCIB 8621T (X74066.1), Acetobacter cerevisiae LMG 1625T (AJ419843.1), Acetobacter cibinongensis 4H-1T (AB052710.1), Acetobacter estunensis IFO 13751T (AB032349.1), Acetobacter indonesiensis NRIC 0313T (AB032356.1), Acetobacter lovaniensis IFO 13753T (AB032351.1), Acetobacter malorum LMG 1746T (AJ419844.1), Acetobacter nitrogenifigens RG1T (AY669513.2), Acetobacter oeni B13T (AY829472.1), Acetobacter orientalis 21F-2T (AB052706.1), Acetobacter orleanensis IFO 13752T (AB032350.1), Acetobacter pasteurianus LMD 22.1T (X71863.1), Acetobacter peroxydans IFO 13755T (AB032352.1), Acetobacter pomorum LTH 2458T (AJ001632.1), Acetobacter syzygii 9H-2T (AB052712.1), Acetobacter tropicalis NRIC 0312T (AB032354.1)
Gluconobacter (5) Gluconobacter albidus NBRC 3250T (AB178392.1), Gluconobacter cerinus LMG 1368T (X80775.2), Gluconobacter frateurii IFO 3264T (X82290.1), Gluconobacter oxydans DSM 3503T (X73820.1), Gluconobacter thailandicus F149-1T (AB128050.1)
Gluconacetobacter (15) Gluconacetobacter azotocaptans CFN-Ca54T (AF192761.1), Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC 49037T (X75618.1), Gluconacetobacter johannae CFN-Cf55T (AF111841.1), Gluconacetobacter liquefaciens IFO 12388T (X75617.1), Gluconacetobacter sacchari SRI 1794T (AF127407.1)
Gluconacetobacter entanii LTH4560T (AJ251110.1), Gluconacetobacter europaeus DSM 6160T (Z21936.1), Gluconacetobacter hansenii NCIB 8746T (X75620.2), Gluconacetobacter intermedius TF2T (Y14694.1), Gluconacetobacter nataicola LMG 1536T (AB166743.1), Gluconacetobacter oboediens LTH 2460T (AJ001631.1), Gluconacetobacter rhaeticus DST GL02T (AY180961.1), Gluconacetobacter saccharivorans LMG 1582T (AB166740.1), Gluconacetobacter swingsii DST GL01T (AY180960.1), Gluconacetobacter xylinum NCIB 11664T (X75619.1)
Asaia (3) Asaia bogorensis 71T (AB025928.1), Asaia krungthepensis AA08T (AB102953.2), Asaia siamensis S60-1T (AB035416.1)
Granulibacter (1) Granulibacter bethesdensis NIH 1T (AY788950.1)
Rhodopila (1) Rhodopila globiformis DSM 161T (D86513.1)
Saccharibacter (1) Saccharibacter floricola S-877T (AB110421.1)
Kozakia (1) Kozakia baliensis strain Yo-3T (AB056321.1)
Neoasaia (1) Neoasaia chiangmaiensis BCC 15763T (AB208549.1)
Swaminathania (1) Swaminathania salitolerans PA51T (AF459454.1)
Acidomonas (1) Acidomonas methanolica LMG 1668T (X77468.1)
Primer 명칭 서열 농도
K-AAB_F
(forward primer)		 5'- AAGGGGGCTAGCGTTGCTCG-3' (서열번호 1) 500 nM
K-AAB_R
(reverse primer)		 5'- ACCGCCTACACGCCCTTTACG-3' (서열번호 2) 500 nM
실시예 2. 초산균 및 비초산균 미생물을 활용한 민감도 및 특이도의 검증
개발된 프라이머 세트의 민감도 및 특이도를 평가하기 위하여, 16주의 초산균 및 20주의 비초산균 미생물을 사용하여 검증실험을 실시하였다. 각 균주들에서 genomic DNA를 추출한 후, 하기 표 3에 기재된 바와 같은 PCR 반응 용액을 제조하였다. 이후, 반응액을 real-time PCR system (CFX96, BioRad)을 이용하여 95℃에서 30초 반응시킨 후, 95℃에서 5초, 62℃에서 34초로 구성된 반응사이클을 35회 반복하며 결과를 얻었다. 또한, 반응 이후 95℃에서 65℃까지 0.5℃/s의 속도로 온도를 감소시키며 형광 강도를 측정하여 melting curve analysis를 실시하였다. 반응이 종료된 이후에는 CFX manager software v3.1 (BioRad)를 이용하여 데이터를 분석하였다.
재료 용량
SYBR Premix Ex Taq
(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)		 10 μL
K-AAB_F (forward primer) 0.4 μL
K-AAB_R (reverse primer) 0.4 μL
Distilled water 7.2 μL
Extracted genomic DNA 2 μL
총 합 20 μL
그 결과, 총 36주의 미생물을 이용한 검증실험에서 16주의 초산균주만이 양성반응을 나타내었으며, 나머지 20주의 비-초산균주들은 음성 반응을 나타내었다 (표 4 및 표 5). 따라서, 제작된 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행하여 초산균주를 검출하는데 있어, 100%의 민감도 및 100%의 특이도를 나타내었다.
Classification Species Real-time PCR results
Acetic
acid
bacteria		 Acetobacter aceti ATCC15973 +
Acetobacter aceti IFO3281 +
Acetobacter estunensis ATCC23753 +
Acetobacter liquefaciens ATCC14835 +
Acetobacter orleanensis ATCC12876 +
Acetobacter pasteurianus ATCC12875 +
Acetobacter pasteurianus ATCC7839 +
Acetobacter persicus A396 +
Gluconacetobacter hansenii ATCC35959 +
Gluconacetobacter medellinensis IFO3288 +
Gluconacetobacter xylinus subsp. xylinus ATCC11142 +
Gluconobacter cerinus ATCC49206 +
Gluconobacter frateurii IFO3251 +
Gluconobacter morbifer JCM15512 +
Gluconobacter oxydans ATCC15163 +
Gluconobacter oxydans IFO3293 +
No. of positive species/No. of tested species (%) 16/16 (100)
Classification Species Real-time PCR results
Non-acetic
acid
bacteria
and
yeast		 Bacillus cereus ATCC 14579 -
Bacillus circulans ATCC21783 -
Bacillus licheniformis ATCC21415 -
Bacillus megaterium ATCC10778 -
Bacillus sphaericus ATCC33203 -
Bifidobacterium adolescents ATCC15703 -
Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM10140 -
Bifidobacterium breve ATCC15700 -
Candida inconspicua ATCC16783 -
Clostridium perfringens ATCC3624 -
Enterococcus faecalis ATCC19433 -
Escherichia coli ATCC25922 -
Escherichia coli ATCC11775 -
Lactobacillus acidophilus ATCC4357 -
Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens ATCC43761 -
Listeria grayi ATCC19120 -
Listeria innocua ATCC33090 -
Saccharomyces cerevisiae ATCC6037 -
Saccharomyces cerevisiae ATCC7752 -
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus KCTC5091 -
No. of positive species/No. of tested species (%) 0/20 (0)
실시예 3. 발효식초에 존재하는 초산균의 정량
본 발명자들은 식품에 포함된 초산균을 정량하기 위한 실험을 수행하였다. 우선, 아세토박터 아세티 (Acetobacter aceti) ATCC 15973 균주를 단계희석한 후 real-time PCR 반응을 수행하여 real-time PCR에서 얻은 Ct값과 GYC agar에 평판도말하여 얻은 집락수를 각각 대응시켜 표준 검량선을 작성하였다. 이에 대한 수식은 하기와 같다. 이후, 식품 중 시판되는 발효식초 1ml에서 genomic DNA를 추출한 후, 상기와 같이 real-time PCR을 수행하여 얻은 Ct값을 표준 검량선에 대입하여 발효식초에 존재하는 초산균의 수를 정량하였다.
[수식 1]
Y = -3.583 X + 36.730 (R2 = 0.999)
상기 표준 검량선을 이용하여 발효식초에 존재하는 초산균의 수를 정량한 결과, 발효식초 내에는 2.3 x 105CFU/ml의 초산균이 함유되어 있다는 사실을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 프라이머 세트는 초산균만을 특이적으로 검출할 수 있고, 식품 내에 존재하는 초산균을 2시간 이내에 정량할 수 있음을 확인하였다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Method for detection and quantification of acetic acid bacteria using real-time polymerase chain reaction <130> 2018-I318 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetic acid bacteria_forward primer <400> 1 aagggggcta gcgttgctcg 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetic acid bacteria_reverse primer <400> 2 accgcctaca cgccctttac g 21

Claims (11)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 초산균의 검출 또는 정량용 조성물로서, 상기 초산균은 아세토박터(Acetobacter)속, 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 및 글루코노박터(Gluconobacter)속 균주인 것을 특징으로 하는 초산균의 검출 또는 정량용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 초산균의 16S rRNA 유전자에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 초산균은 아세토박터 아세티 NCIB8621T(Acetobacter aceti NCIB 8621T (Accession No.: X74066.1)), 아세토박터 세레비지애 LMG 1625T( Acetobacter cerevisiae LMG 1625T (Accession No.: AJ419843.1)), 아세토박터 시비논젠시스 4H-1T(Acetobacter cibinongensis 4H-1T (Accession No.: AB052710.1)), 아세토박터 에스투넨시스 IFO 13751T(Acetobacter estunensis IFO 13751T (Accession No.: AB032349.1)), 아세토박터 인도네시엔시스 NRIC 0313T(Acetobacter indonesiensis NRIC 0313T (Accession No.: AB032356.1)), 아세토박터 로바니엔시스 IFO 13753T(Acetobacter lovaniensis IFO 13753T (Accession No.: AB032351.1)), 아세토박터 말로룸 LMG 1746T(Acetobacter malorum LMG 1746T (Accession No.: AJ419844.1)), 아세토박터 니트로제니피젠스 RG1T(Acetobacter nitrogenifigens RG1T (Accession No.: AY669513.2)), 아세토박터 오에니 B13T(Acetobacter oeni B13T (Accession No.: AY829472.1)), 아세토박터 오리엔탈리스 21F-2T(Acetobacter orientalis 21F-2T (Accession No.: AB052706.1)), 아세토박터 올레넨시스 IFO 13752T(Acetobacter orleanensis IFO 13752T (Accession No.: AB032350.1)), 아세토박터 파스테우리아누스 LMD 22.1T(Acetobacter pasteurianus LMD 22.1T (Accession No.: X71863.1)), 아세토박터 퍼옥시안스 IFO 13755T(Acetobacter peroxydans IFO 13755T (Accession No.: AB032352.1)), 아세토박터 포모륨 LTH 2458T(Acetobacter pomorum LTH 2458T (Accession No.: AJ001632.1)), 아세토박터 시지지 9H-2T(Acetobacter syzygii 9H-2T (Accession No.: AB052712.1)), 아세토박터 트로피칼스 NRIC 0312T(Acetobacter tropicalis NRIC 0312T (Accession No.: AB032354.1)), 글루코노박터 알비두스 NBRC 3205T(Gluconobacter albidus NBRC 3250T (Accession No.: AB178392.1)), 글루코노박터 세리누스 LMG 1368T(Gluconobacter cerinus LMG 1368T (Accession No.: X80775.2)), 글루코노박터 프라테우리 IFO 3264T(Gluconobacter frateurii IFO 3264T (Accession No.: X82290.1)), 글루코노박터 옥시단스 DSM 3503T(Gluconobacter oxydans DSM 3503T (Accession No.: X73820.1)), 글루코노박터 타이란디쿠스 F149-1T(Gluconobacter thailandicus F149-1T (Accession No.: AB128050.1)), 글루콘아세토박터 아조토캅탄스 CFN-Ca54T(Gluconacetobacter azotocaptans CFN-Ca54T (Accession No.: AF192761.1)), 글루콘아세토박터 디아조트로피쿠스 ATCC 49037T(Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC 49037T (Accession No.: X75618.1)), 글루콘아세토박터 조한네 CFN-Cf55T(Gluconacetobacter johannae CFN-Cf55T (Accession No.: AF111841.1)), 글루콘아세토박터 리큐파시엔스 IFO 12388T(Gluconacetobacter liquefaciens IFO 12388T (Accession No.: X75617.1)), 글루콘아세토박터 사카리 SRI 1794T(Gluconacetobacter sacchari SRI 1794T (Accession No.: AF127407.1)), 글루콘아세토박터 엔타니 LTH4560T(Gluconacetobacter entanii LTH4560T (Accession No.: AJ251110.1)), 글루콘아세토박터 유로페우스 DSM 6160T(Gluconacetobacter europaeus DSM 6160T (Accession No.: Z21936.1)), 글루콘아세토박터 한세니 NCIB 8746T(Gluconacetobacter hansenii NCIB 8746T (Accession No.: X75620.2)), 글루콘아세토박터 인터메디우스 TF2T(Gluconacetobacter intermedius TF2T (Accession No.: Y14694.1)), 글루콘아세토박터 나타이콜라 LMG 1536T(Gluconacetobacter nataicola LMG 1536T (Accession No.: AB166743.1)), 글루콘아세토박터 오보에디엔스 LTH 2460T(Gluconacetobacter oboediens LTH 2460T (Accession No.: AJ001631.1)), 글루콘아세토박터 라에티쿠스 DST GL02T(Gluconacetobacter rhaeticus DST GL02T (Accession No.: AY180961.1)), 글루콘아세토박터 사카리보란스 LMG 1582T(Gluconacetobacter saccharivorans LMG 1582T (Accession No.: AB166740.1)), 글루콘아세토박터 스윙시 DST GL01T(Gluconacetobacter swingsii DST GL01T (Accession No.: AY180960.1)) 및 글루콘아세토박터 자일리늄 NCIB 11664T(Gluconacetobacter xylinum NCIB 11664T (Accession No.: X75619.1))로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항의 조성물을 포함하는 초산균의 검출 또는 정량용 키트로서,
    상기 초산균은 아세토박터(Acetobacter)속, 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 및 글루코노박터(Gluconobacter)속 균주인 것을 특징으로 하는 초산균의 검출 또는 정량용 키트.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 키트는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계를 포함하는 초산균의 검출 방법으로서,
    상기 초산균은 아세토박터(Acetobacter)속, 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 및 글루코노박터(Gluconobacter)속 균주인 것을 특징으로 하는 초산균의 검출 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 중합효소연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 초산균은 아세토박터 아세티 NCIB8621T(Acetobacter aceti NCIB 8621T (Accession No.: X74066.1)), 아세토박터 세레비지애 LMG 1625T( Acetobacter cerevisiae LMG 1625T (Accession No.: AJ419843.1)), 아세토박터 시비논젠시스 4H-1T(Acetobacter cibinongensis 4H-1T (Accession No.: AB052710.1)), 아세토박터 에스투넨시스 IFO 13751T(Acetobacter estunensis IFO 13751T (Accession No.: AB032349.1)), 아세토박터 인도네시엔시스 NRIC 0313T(Acetobacter indonesiensis NRIC 0313T (Accession No.: AB032356.1)), 아세토박터 로바니엔시스 IFO 13753T(Acetobacter lovaniensis IFO 13753T (Accession No.: AB032351.1)), 아세토박터 말로룸 LMG 1746T(Acetobacter malorum LMG 1746T (Accession No.: AJ419844.1)), 아세토박터 니트로제니피젠스 RG1T(Acetobacter nitrogenifigens RG1T (Accession No.: AY669513.2)), 아세토박터 오에니 B13T(Acetobacter oeni B13T (Accession No.: AY829472.1)), 아세토박터 오리엔탈리스 21F-2T(Acetobacter orientalis 21F-2T (Accession No.: AB052706.1)), 아세토박터 올레넨시스 IFO 13752T(Acetobacter orleanensis IFO 13752T (Accession No.: AB032350.1)), 아세토박터 파스테우리아누스 LMD 22.1T(Acetobacter pasteurianus LMD 22.1T (Accession No.: X71863.1)), 아세토박터 퍼옥시안스 IFO 13755T(Acetobacter peroxydans IFO 13755T (Accession No.: AB032352.1)), 아세토박터 포모륨 LTH 2458T(Acetobacter pomorum LTH 2458T (Accession No.: AJ001632.1)), 아세토박터 시지지 9H-2T(Acetobacter syzygii 9H-2T (Accession No.: AB052712.1)), 아세토박터 트로피칼스 NRIC 0312T(Acetobacter tropicalis NRIC 0312T (Accession No.: AB032354.1)), 글루코노박터 알비두스 NBRC 3205T(Gluconobacter albidus NBRC 3250T (Accession No.: AB178392.1)), 글루코노박터 세리누스 LMG 1368T(Gluconobacter cerinus LMG 1368T (Accession No.: X80775.2)), 글루코노박터 프라테우리 IFO 3264T(Gluconobacter frateurii IFO 3264T (Accession No.: X82290.1)), 글루코노박터 옥시단스 DSM 3503T(Gluconobacter oxydans DSM 3503T (Accession No.: X73820.1)), 글루코노박터 타이란디쿠스 F149-1T(Gluconobacter thailandicus F149-1T (Accession No.: AB128050.1)), 글루콘아세토박터 아조토캅탄스 CFN-Ca54T(Gluconacetobacter azotocaptans CFN-Ca54T (Accession No.: AF192761.1)), 글루콘아세토박터 디아조트로피쿠스 ATCC 49037T(Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC 49037T (Accession No.: X75618.1)), 글루콘아세토박터 조한네 CFN-Cf55T(Gluconacetobacter johannae CFN-Cf55T (Accession No.: AF111841.1)), 글루콘아세토박터 리큐파시엔스 IFO 12388T(Gluconacetobacter liquefaciens IFO 12388T (Accession No.: X75617.1)), 글루콘아세토박터 사카리 SRI 1794T(Gluconacetobacter sacchari SRI 1794T (Accession No.: AF127407.1)), 글루콘아세토박터 엔타니 LTH4560T(Gluconacetobacter entanii LTH4560T (Accession No.: AJ251110.1)), 글루콘아세토박터 유로페우스 DSM 6160T(Gluconacetobacter europaeus DSM 6160T (Accession No.: Z21936.1)), 글루콘아세토박터 한세니 NCIB 8746T(Gluconacetobacter hansenii NCIB 8746T (Accession No.: X75620.2)), 글루콘아세토박터 인터메디우스 TF2T(Gluconacetobacter intermedius TF2T (Accession No.: Y14694.1)), 글루콘아세토박터 나타이콜라 LMG 1536T(Gluconacetobacter nataicola LMG 1536T (Accession No.: AB166743.1)), 글루콘아세토박터 오보에디엔스 LTH 2460T(Gluconacetobacter oboediens LTH 2460T (Accession No.: AJ001631.1)), 글루콘아세토박터 라에티쿠스 DST GL02T(Gluconacetobacter rhaeticus DST GL02T (Accession No.: AY180961.1)), 글루콘아세토박터 사카리보란스 LMG 1582T(Gluconacetobacter saccharivorans LMG 1582T (Accession No.: AB166740.1)), 글루콘아세토박터 스윙시 DST GL01T(Gluconacetobacter swingsii DST GL01T (Accession No.: AY180960.1)) 및 글루콘아세토박터 자일리늄 NCIB 11664T(Gluconacetobacter xylinum NCIB 11664T (Accession No.: X75619.1))로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 수행하여 얻은 Ct 값을 표준 검량선에 대입하는 단계를 포함하는 식품 시료 내에 존재하는 초산균의 정량 방법으로서,
    상기 초산균은 아세토박터(Acetobacter)속, 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 및 글루코노박터(Gluconobacter)속 균주인 것을 특징으로 하는 초산균의 정량 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102215852B1 (ko) 2020-07-09 2021-02-15 부산대학교 산학협력단 치주 질환 원인균의 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11137259A (ja) * 1997-11-05 1999-05-25 Mitsui Norin Co Ltd 細菌同定のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌の同定方法
US7384770B1 (en) 2007-01-09 2008-06-10 Gas Technology Institute Rapid quantification of acetic acid-producing bacteria using real-time PCR
KR20170043957A (ko) * 2015-10-14 2017-04-24 건국대학교 산학협력단 Lactobacillus kefiri 유산균 특이 신속 정량 검출용 프라이머, 프로브 세트 및 이를 이용한 실시간 PCR 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11137259A (ja) * 1997-11-05 1999-05-25 Mitsui Norin Co Ltd 細菌同定のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌の同定方法
US7384770B1 (en) 2007-01-09 2008-06-10 Gas Technology Institute Rapid quantification of acetic acid-producing bacteria using real-time PCR
KR20170043957A (ko) * 2015-10-14 2017-04-24 건국대학교 산학협력단 Lactobacillus kefiri 유산균 특이 신속 정량 검출용 프라이머, 프로브 세트 및 이를 이용한 실시간 PCR 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Angel Gonzalez et al., FEMS Microbiol. Lett., 254, pp.123-128, 2006.* *
M.J. Torija et al., Food Microbiology, 27, pp.257-265, 2010.* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102215852B1 (ko) 2020-07-09 2021-02-15 부산대학교 산학협력단 치주 질환 원인균의 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도

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