KR100380626B1

KR100380626B1 - Ｄｎａ 자이레이즈 서브유닛 ａ 유전자 절편의 염기서열및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 및 관련 종의 동정방법

Info

Publication number: KR100380626B1
Application number: KR10-2000-0040830A
Authority: KR
Inventors: 천종식; 배경숙; 오현우; 김영국
Original assignee: 주식회사 마이크로아이디; 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-07-15
Filing date: 2000-07-15
Publication date: 2003-04-18
Also published as: KR20020007543A

Abstract

본 발명은 DNA 자이레이즈 서브유닛 A(DNA gyrase subunit A,gyrA) 유전자 절편의 염기서열 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 관련 종의 동정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바실러스 서브틸리스 종의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 결정하고 그 계통수를 분석함으로써 대표적 유용 미생물인 바실러스 서브틸리스 및 관련 종을 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 동정 방법을 이용하면 기존의 16S rRNA 유전자 분석법으로 동정이 불가능했던 바실러스 서브틸리스 관련 종을 아종 단계까지 정확하게 동정할 수 있으며, 본 발명의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 염기서열은 DNA 탐침(probe) 또는 DNA 칩(chip) 등에 응용되어 바실러스 서브틸리스 관련 종을 탐색하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＤＮＡ 자이레이즈 서브유닛 Ａ 유전자 절편의 염기서열 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 및 관련 종의 동정방법{Partial gyrA gene sequences and an identification method of Bacillus subtilis and related taxa using the said sequences}

본 발명은 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 및 관련 종의 동정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바실러스 서브틸리스 종의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 결정하고 그 계통수를 분석함으로써 대표적 유용 미생물인 바실러스 서브틸리스 및 관련 종을 동정하는 방법에 관한 것이다.

정확한 미생물 동정방법은 미생물에 관한 연구가 시작된 이후로 미생물학계의 최대 연구과제이다. 초기 동정은 현미경을 이용하여 미생물의 세포 형태를 관찰함으로써 미생물을 동정하는 방법을 이용하였고, 그 후 세포염색을 통한 미생물 동정방법인 그람 염색(gram staining)방법이 도입되었다. 상기 그람 염색방법을 이용하면 미생물을 크게 그람-양성균(Gram-positive bacteria)과 그람-음성균(Gram-negative bacteria)으로 분류할 수 있는데, 그람 염색약으로 염색할 경우 푸른색으로 염색되면 그람 양성균이고 붉은색으로 염색되면 그람 음성균이다. 또한, 미생물 성장을 위한 산소의 요구 유무가 미생물 동정에 사용되는데, 성장에 산소를 요구하는 균은 호기성균(aerobic bacteria)으로 동정되고, 성장에 산소를 요구하지 않는 균은 혐기성균(anaerobic bacteria)으로 동정된다. 상기와 더불어, 진단 미생물의 발달과정에서 개발된 성장 저해시험(Growth inhibition test)은 특정한 미생물의 성장을 저해하는 화합물을 미생물 배양배지에 첨가하여 균의 성장 유무를 확인함으로써 미생물을 동정하는 방법이다. 대표적인 예로, 6.5% 염화나트륨이 첨가된 배지에서 스트렙토코시(streptococci)는 성장하지 못하지만 엔테로코시(enterococci)는 성장할 수 있다. 이외에도, 미생물의 종류에 따라서 동일한 영양분을 이용하여도 다른 생성물을 합성할 수 있는데, 이러한 특성을 이용하여 미생물을 동정하는 생화학적 시험방법(Biochemical test)도 있다. 예를 들면, 장내세균(entericbacteria)은 포도당을 발효하여 산 말단 생성물(acid end products)을 생성하지만 비발효성 박테리아(Non-fermentative bacteria)는 산 말단 생성물을 생성하지 않는다.

미생물 학자들은 상기 동정방법을 조합하여 미생물을 종, 속, 과 등으로 동정하였다. 그러나, 미생물학의 발달과 함께 한 종이나 속을 더욱 자세히 동정하려는 시도가 진행되었는데, 그 예로 Facklam 등은 비리단스 스트렙토코시(Viridans streptococci)의 물질대사와 성장 특성에 맞도록 기존의 포도당 발효 시험(Glucose fermentation test)을 변형하여 비리단스 스트렙토코시를 더욱 상세히 동정하였다(Facklam, R.R.et al., Manual of Clinical Microbiology, 5th ed., 238-257, 1991).

상술한 미생물 동정법을 이용하여 특정 과에 속하는 균을 동정하기 위한 배지가 시판되고 있는데, 스트렙토코시를 동정하기 위한 페놀 레드액(phenol red broth), 혐기성 균을 동정하기 위한 P.R.A.S.(Pre-Reduced Anaerobically Sterilized) 배지 및 초콜레이트(Chocolate) 배지, 패스티디오스균(Fastidious microorganisms)을 동정하기 위한 CTA(Cystine Trypticase Agar) 배지 및 심장 인퓨전액(heart infusion broth), 비발효성 그람 음성 바실리(Bacilli) 및 장내세균(enterics)를 동정하기 위한 OF(Oxidation-Fermentation) 배지 및 효모를 동정하기 위한 효모 발효액(Yeast fermentation broth)등이 있다. 그러나, 상기의 방법들은 특정한 균의 동정하기 위해서는 특정한 성장배지를 필요로하고, 상호 관련성이 높은 종을 동정할 경우에는 정확성이 매우 낮으며, 동정시 다량의 시료를 요구할 뿐만 아니라 배양된 미생물을 사용해야 하므로 미생물 배양에 소요되는 긴 배양 시간이 단점으로 지적되고 있다.

이외에도 기존에 많이 사용되고 있는 대표적인 동정방법으로 탄수화물 동화능 분석법 및 지방산 분석법이 있다. 탄수화물 동화능 분석법(carbohydrate assimilation tests)은 미생물이 서로 다른 탄수화물을 생장에 이용할 수는 점에 착안한 방법으로 보통 20 개 이상의 다른 기질을 사용하여 동정하고자 하는 실험 균주의 탄수화물 동화능 프로파일(profile)을 데이터베이스(database)에 입력된 표준균주의 프로파일과 비교하여 동정하는 방법이다. 현재 바이오로그(Biolog), 에이피아이(API) 등의 상용 시스템이 상기 탄수화물 동화능 분석법에 널리 사용되고 있고 이들을 이용하면 그람 양성 및 그람 음성 등의 다양한 세균을 동정할 수 있으나, 데이터 베이스가 한 두 종의 표준균주의 프로파일에 기초하여 작성되어 있으므로 처음 분리된 균주를 동정할 경우에는 그 정확도가 떨어진다.

지방산 분석법(Fatty acid composition analysis)은 미생물의 종마다 다른 지방산 패턴(cellular fatty acid pattern)을 이용하여 동정하는 방법으로, 같은 속에 속하는 미생물일지라도 그 종에 따라 독특한 지방산의 종류 및 비율을 가지고 있다는 점에 착안하여 개발된 동정법이다. 지방산 분석법을 이용하여 균을 동정할 경우, 먼저 지방산을 균으로부터 분리하여 메틸화(methylation)한 후 가스 액체 크로마토그래피(Gas liquid chromatography)를 사용하여 지방산의 패턴을 분석하여 그 패턴에 따라 종을 동정한다. 예를 들면, 안쓰로박터 속(Anthrobacterspecies)으로 동정된 A. 커민시이(A. cumminsii)는 지방산 분석 결과 안쓰로박터 속의 다른 종에서는 볼 수 없는 C16:Oi 및 C16:0 지방산의 함량이 높았고 C14:Oi 및 C14:0 지방산이 검출되어 새로운 종으로 분류되었다.

그러나, 상기 동정방법은 모두 그 정확성이 떨어져 더욱 정확한 미생물의 동정방법이 요구되어 왔다. 그 결과 최근에 특정 유전자의 염기서열을 분석하여 유사도를 비교하는 동정방법이 개발되었는데, 그 대표적 방법으로 16S rRNA(ribosomal Ribonucleic acid) 유전자 분석방법이 개발되어 많은 균종을 유전자 수준에서 정확히 분석하는데 이용되어 왔다. 16S rRNA는 다양한 단백질들과 상호작용하여 리보솜(Ribosome)을 구성하는 RNA로서, 그 완전한 서열이나 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide) 목록에 대한 염기서열이 2000 종 이상의 세균에서 밝혀졌기 때문에 16S rRNA의 유전자 유사성에 근거하여 세균을 몇 가지 주요군으로 나눌 수 있다. 상기 16S rRNA 유전자 염기서열의 변화율이 대부분의 게놈에 있는 다른 유전자 염기서열보다 월등히 적기 때문에 16S rRNA 염기서열 유사도의 정도가 생물간의 계통학적 거리를 반영하는 것으로 인식되고 있다. 상기 16S rRNA 유전자 절편의 염기서열을 분석하여 그 유사도에 따라 미생물을 동정하는 방법은 상술한 지방산 분석 및 탄수화물 자화능 분석법과 함께 미생물, 특히 산업적으로 유용한 미생물을 동정하는데 대표적인 동정방법으로 이용되어 왔다.

한편, 산업적으로 유용한 미생물은 인간에게 유용한 항생제, 포도주, 빵, 맥주, 유제품, 곤충구제 및 효소를 포함한 많은 유용 물질을 생산하기 때문에 보다 정확한 동정이 필요하다. 이러한 대표적인 유용 미생물로서 바실러스 서브틸리스 관련 균종을 예로 들 수 있는데, 바실러스 서브틸리스 관련 균종은 단순 유기 화합물(당, 아미노산, 유기산)을 호흡기질로 이용하여 탄수화물을 발효할 수 있으며, 이들의 최적온도는 30℃ 내지 45℃이나 일부 균종이 65℃에서도 성장하는 것으로보고되었다. 바실러스 서브틸리스 균종은 공기 존재하에서 포도당을 대사하여 많은 양의 2,3-부탄디올(2,3-butanediol)을 생성할 수 있으나 혐기적 조건하에서는 포도당을 대사할 수 없다. 또한, 바실러스 서브틸리스 관련 균종은 산업적으로 유용한 항생제(Antibiotics)인 바시트라신(Bacitracin)을 생산하는데, 상기 항생물질은 폴리펩티드(Polypeptide) 군에 속하는 것으로 세균 세포벽인 펩티도글리칸(Peptidoglycan)의 합성을 저해함으로써 항생작용을 나타낸다. 아울러, 바실러스 서브틸리스 관련 종은 프로테아제(protease)라는 효소를 분비하여 단백질의 가수분해 반응(Hydrolysis)을 촉매함으로써 세척제 및 사진으로부터 은을 회수하기 위한 젤라틴(Gelatin) 제거제의 생산에 이용되고 있다.

전술한 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 관련 균종은 산업적으로 매우 유용한 미생물이기 때문에 더욱 정확한 동정이 필요하다. 하지만, 탄수화물 자화능 분석법, 지방산 분석법 및 16S rRNA 유전자 분석법을 포함한 기존의 미생물 동정방법은 바실러스 서브틸리스 관련 균종의 정확한 동정에 적합하지 못하다. 우선, 탄수화물 자화능 분석법 및 지방산 분석법은 그 정확성이 매우 낮을 뿐만 아니라 최근에 발견된 바실러스 서브틸리스 관련 균종의 경우 그 상업용 데이터베이스가 구축되어 있지 않아 바실러스 서브틸리스 관련 균종을 정확히 동정할 수 없다. 또한, 16S rRNA 유전자 분석법의 경우 바실러스 서브틸리스 관련 종간의 16S rRNA 유전자염기서열의 유사도가 99% 이상으로 변이도가 매우 낮아 동정에 사용하는 것이 불가능하다. 따라서, 바실러스 서브틸리스 관련 균종의 정확한 동정을 위해서는 16S rRNA 유전자 이외에 비교가능한 계통학적 거리에 분포되어 있으면서 비교적 잘 보존되어 온 염기서열을 이용해야 한다. 이러한 목적으로 사용가능한 유전자로는 양성자 전달 ATPase(Proton-traslocating ATPase), DNA 중합효소(DNA polymerase), RNA 중합효소(RNA polymerase), 히스톤-유사 단백질(Histone-like protein), 페레독신(ferredoxin) 및 DNA 자이레이즈 등이 있다. 상기 효소들중 DNA 자이레이즈는 서브유닛 A와 서브유닛 B로 구성되어 있고, DNA 복제(Replication)가 진행될 때 한쪽 가닥에서 주기적으로 인산이에스테르 결합(phosphodiester bond)을 절단함으로써 절단된 가닥이 반대가닥을 자유로이 회전할 수 있게 하여 다시 꼬이는 것을 방지하는 작용을 한다. 현재까지 알려진 몇 가지 생물체로부터 분리된 DNA 자이레이즈의 염기서열 분석으로부터, DNA 자이레이즈는 그 염기서열이 비교적 잘 보존되어 있으면서 16S rRNA 유전자에 비해 가까운 유연관계를 지닌 미생물의 동정에 적합한 변이도를 보일 것으로 기대되는 대표적인 유전자이다.

이에, 본 발명자들은 바실러스 서브틸리스 관련 균종의 정확한 동정에 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 염기서열을 이용하기 위하여, 7 종의 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주로부터 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 분석하였으며, 그 유사도를 16S rRNA 유전자 염기서열의 유사도와 비교하여 매우 낮음을 확인하고 상기 유전자 절편을 이용하여 바실러스 서브틸리스 관련 균종을 종 및 아종 단계까지 정확히 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 바실러스 서브틸리스 및 관련 균종의 동정에 유용하게 이용될 수 있는 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 염기서열을 이용하여 바실러스 서브틸리스 및 관련 종을 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 상기 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 염기서열을 이용하여 바실러스 서브틸리스 관련 균종을 탐색하기 위한 DNA 탐침 및 DNA 칩을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 이용하여 바실러스 서브틸리스 및 관련 균주의 계통수를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 7 종의 바실러스 관련 표준균주의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 제공한다.

본 발명에서 동정한 7 종의 바실러스 관련 표준균주는

i) 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) KCTC 1660T;

ii) 바실러스 아트로페우스(Bacillus atrophaeus) KCTC 3701T;

iii) 바실러스 리쉔니포미스(Bacillus licheniformis) KCTC 1918T;

iv) 바실러스 모자벤시스(Bacillus mojavensis) NRRL B-14698T;

v) 바실러스 서브틸리스 속 서브틸리스(Bacillus substilis subsp. substilis) KCTC 3135T;

vi) 바실러스 서브틸리스 속 스피지제니이(Bacillus substilis subsp. spizizenii) NRRL B-23049T; 및

vii) 바실러스 발리스모티스(Bacillus vallismortis) NRRL B-14890T이다.

본 발명자들은 상기 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 염기서열을 결정하기 위하여, 이들 표준균주로부터 염색체 DNA(chromosomal DNA)를 분리한 후 상기 염색체 DNA를 주형으로 하고 DNA 자이레이즈 서브유닛 A를 특이적으로 인식한 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 시발체(primer) 쌍을 이용하여 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편을 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편을 그 크기에 따라 아가로스 젤에서 전기영동하여 분리하고자 하는 1 kb의 DNA 절편을 확인하고 아가로스 젤로부터 순수 분리한 후 흡광도 분석기를 이용하여 자외선 흡광도를 측정하여 분리된 DNA 절편의 농도를 결정하였다. 적당한 양의 상기 DNA 절편을 주형으로 서열번호 1로 기재되는 전방향 시발체와 서열번호 2로 기재되는 역방향 시발체를 이용하여 시퀀싱(sequencing) PCR을 실시한 후 자동 시퀀서(automatic sequencer)에 로딩(loading)하여 염기서열을 분석하였다.

그 결과,

i) 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 KCTC 1660T의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편 염기서열은 서열번호 3으로 기재되고,

ii) 바실러스 아트로페우스 KCTC 3701T의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열은 서열번호 4로 기재되고,

iii) 바실러스 리쉔니포미스 KCTC 1918T의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열: 서열목록 5로 기재되고,

iv) 바실러스 모자벤시스 NRRL B-14698T의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열은 서열번호 6으로 기재되고,

v) 바실러스 서브틸리스 속 서브틸리스 KCTC 3135T의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열은 서열목록 7로 기재되고,

vi) 바실러스 서브틸리스 속 스피지제니이 NRRL B-23049T의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열은 서열목록 8로 기재되고,

vii) 바실러스 발리스모티스 NRRL B-14890T의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열은 서열목록 9로 기재된다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 이용하여 바실러스 서브틸리스 관련 종 및 아종 단계까지 정확하게 동정하는 방법을 제공한다.

상기 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주사이에 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편 염기서열의 유사도를 결정하기 위하여, 클루스탈 프로그램(CLUSTAL program)을 이용하여 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주 사이의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 유사도를 결정하여 기존의 16S rRNA 유전자 분석법에 의하여결정된 상기 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주 사이의 16S rRNA 유전자의 유사도와 비교하였다.

그 결과, DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 유사도는 16S rRNA 유전자의 유사도 보다 매우 낮은 변이도를 나타내어 바실러스 서브틸리스 및 관련 종의 동정에 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 염기서열을 이용한 본 발명의 동정방법이 매우 적합하며, 상기 방법을 이용하면 기존의 방법으로 동정이 불가능했던 바실러스 서브틸리스 관련 아종 단계의 동정까지 가능함을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 염기서열을 이용한 동정방법을 검증하기 위하여, 이미 동정이 된 바실러스 리쉔니포미스 KCTC 2215, 바실러스 서브틸리스 KCTC 3014, KCTC 3239 및 KCTC 3494를 국가 공인 미생물 기탁기관인 생명공학연구소 유전자은행으로부터 분양받아 상기와 동일한 방법으로 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 분석한 후, 상기 4 종의 균주와 기존에 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열이 알려진 바실러스 서브틸리스 속 서브틸리스 균주 168 및 본 발명에서 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 결정한 7 종의 표준균주를 이용하여 바실러스 서브틸리스 관련 균주의 계통수를 작성하였다(도 1참조).

상기 계통수로부터, KCTC 2215는 기존에 동정된 바와 동일한 바실러스 리쉔니포미스로 동정되었으며, 바실러스 서브틸리스로만 알려져 있던 KCTC 3014, KCTC 3239 및 KCTC 3494는 바실러스 서브틸리스 속 서브틸리스로 동정되었다. 이러한 결과는 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 이용한 본 발명의 동정방법이 바실러스 서브틸리스 및 관련 균종을 종 및 아종 단계까지 정확하게 동정하는데 이용될 수 있음을 의미한다.

마지막으로, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 관련 종 및 아종의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편 염기서열을 이용하는 DNA 탐침 및 DNA 칩을 제공한다.

본 발명의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 염기서열은 바실러스 서브틸리스 관련 균종의 탐색 등의 분자생물학적 연구에 유용한 DNA 탐침의 제조에 이용될 수 있다.

DNA 탐침은 특정 염기서열의 일부를 이용하여 유전자를 탐색하기 위한 단일가닥 DNA 절편으로 짧게는 수 십개부터 길게는 천 개 이상의 뉴클레오티드로 이루어져 있으며, 방사선 동위원소 또는 형광물질을 표지하여 이용한다. DNA 탐침이 이용되는 분자생물학적 실험에는 돗 블러팅(dot blotting) 및 스롯 블러팅(slot blotting) 등이 있으며, 이러한 실험 기술을 이용하여 다량의 균주를 동시에 동정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 관련 균주의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 염기서열을 이용한 DNA 탐침은 다량의 바실러스 관련 균종을 탐색하는데 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열은 생명공학적으로 유용한 DNA 칩의 제조에 이용될 수 있다. DNA 칩은 분자생물학적 지식과 기계 및 전자공학적 기술을 접목하여 제조되는 것으로, 적게는 수 백개부터 많게는 수 십만개의 DNA를 아주 작은 공간에 고밀도로 붙여 놓은 것이다. 이로 인하여 DNA 칩은 동시에 최소 수백 개 이상의 유전자를 빠른 시간내에 검색할 수 있어, 상기 DNA 칩을 이용하면 기존의 생명공학적 기술을 이용하는 것보다 새로운 유전자 탐색 및 진단을 신속하고 간편하게 할 수 있다. DNA 칩은 유전물질의 크기에 따라 올리고뉴클레오티드 칩(Oligonucleotide chip) 및 cDNA 칩으로 나눌 수 있고 찾고자 하는 유전자 및 실험목적에 따라 선택하여 사용할 수 있다. 따라서, 상기의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 염기서열을 이용한 DNA 칩은 수백 개 이상의 바실러스 서브틸리스 관련 균종을 동시에 신속하고 간편하게 탐색할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열 분석

<1-1> DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 증폭

7 종의 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편을 증폭하기 위하여, 표준균주들로부터 염색체 DNA를 Chun 과 Goodfellow 의 방법(Chun, J. Goodfellow, M.,Int J Syst Bacteriol45, 240-245,1995)으로 분리한 후 정제된 염색체 DNA를 주형으로 하고 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자를 특이적으로 인식하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 시발체를 이용하여 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편을 PCR로 증폭하였다. 이 때, 실험에 이용된 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주는

i) 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 KCTC 1660T,

ii) 바실러스 아트로페우스 KCTC 3701T,

iii) 바실러스 리쉔니포미스 KCTC 1918T,

iv) 바실러스 모자벤시스 NRRL B-14698T,

v) 바실러스 서브틸리스 속 서브틸리스 KCTC 3135T,

vi) 바실러스 서브틸리스 속 스피지제니이 NRRL B-23049T,

vii) 바실러스 발리스모티스 NRRL B-14890T이다.

상기 PCR은 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 20 mM Tris-HCl(pH 8.0); 2 mM MgSO₄; 0.1% Triton X-100)에 주형 DNA 100 ng, 각 시발체 50 pmol을 넣은 후 0.15 unit의 Taq DNA 중합효소를 첨가하여 수행되었다. 이 때, 반응조건은 95℃에서 5 분간 한 번 열처리한 후 95℃에서 1 분간 변성, 55℃에서 1 분간 재생, 72℃에서 1 분간 중합하였고 상기 변성, 재생 및 중합반응은 총 30 회 반복 수행되었다(이하 기술되는 모든 PCR은 특별한 언급이 없는 한 상기의 조건을 따라 수행된 것으로 한다.). PCR이 종료된 후 증폭된 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편을 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였다.

<1-2> DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열 결정

상기 <1-1>에서 얻은 1 kb DNA 절편의 염기서열을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 1 kb DNA 절편을 위저드 PCR 프렙 키트(Wizard PCR Prep kit, Promega Co.)를 이용하여 순수 분리한 후 흡광도 분석기로 자외선 흡광도를 측정하여 1 kb DNA 절편의 농도를 결정하였다. 적당한 양의 상기 1 kb DNA 절편을 주형으로 서열번호 1로 기재되는 전방향 시발체와 서열번호 2로 기재되는 역방향 시발체를 이용하여 시퀀싱(sequencing) PCR을 실시한 후 자동 시퀀서(automatic sequencer)에 로딩(loading)하여 염기서열을 분석하였다.

그 결과,

i) 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 KCTC 1660T의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열은 서열번호 3으로 기재되고,

vi) 바실러스 서브틸리스 속 스피지제니이 NRRL B-23049T의 DNA 자이레이즈서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열은 서열목록 8로 기재되고,

<1-3> 7 종의 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 염기서열의 유사도와 16S rRNA 유전자 염기서열의 유사도 비교

본 발명의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 염기서열을 이용하는 동정방법을 16S rRNA 유전자 절편의 염기서열을 이용하는 동정방법과 그 정확성을 비교하기 위하여, 7 종의 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 생명공학 웹 사이트(web site)인 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 유전자 은행(GenBank) 데이터베이스에서 확보하였다. 상기 실시예 <1-2> 에서 결정된 표준균주의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 염기서열간의 유사도(% similarity)를 이에 상응하는 16S rRNA 유전자 염기서열의 유사도와 비교하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

<표 1> DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 및 16S rRNA 유전자의 유사도 비교

	1	2	3	4	5	6	7
1	---	99.55	98.30	99.43	99.43	99.35	99.50
2	82.59	---	76.19	99.32	99.40	99.24	99.40
3	78.20	76.19	---	98.42	98.31	98.29	98.23
4	85.13	95.81	95.81	---	99.72	99.79	99.47
5	93.29	81.37	81.37	82.88	---	99.64	99.44
6	84.22	82.99	82.99	84.49	95.26	---	99.64
7	82.31	81.10	78.45	82.75	93.16	92.21	---

1: 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스

2: 바실러스 아트로페우스

3: 바실러스 리쉔니포미스

4: 바실러스 모자벤시스

5: 바실러스 서브틸리스 속. 서브틸리스

6: 바실러스 서브틸리스 속. 스피지제니이

7: 바실러스 발리스모티스

상기 표 1에 나타나 있듯이, 16S rRNA 유전자의 유사도는 평균 99.1%로 매우 높아 바실러스 서브틸리스 관련 종간의 동정에 사용하기에는 낮은 변이도를 보이지만 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 유사도는 평균 83.7%로 상기 16S rRNA 유전자의 유사도 보다 상당히 낮아 바실러스 서브틸리스 관련 종간의 동정에 적합한 변이도를 보였다. 또한, 바실러스 서브틸리스에 속하는 두 아종(5 및 6)의 경우 16S rRNA 유전자의 유사도가 99.64%로 나타나 상기 두 균주의 분리동정이 불가능한 변이도를 나타낸 반면에 이들간의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 유사도는 95.2%의 낮은 값을 보여 16S rRNA 유전자를 이용해서는 동정이 불가능했던 바실러스 서브틸리스 속 균주를 종 뿐만 아니라 아종 단계의 동정에도 적합한 변이도를 나타내었다. 이러한 결과는 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 염기서열의 유사도를 이용한 본 발명의 바실리스 관련 균주의 동정 방법이 종 뿐만 아니라 아종 단계의 동정에도 적합함을 의미한다.

<실시예 2> DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 이용한 동정방법의 검증

<2-1> 기존에 동정된 4 종 바실러스 서브틸리스 관련 균주의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열 결정

DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 염기서열을 이용한 본 발명의 동정방법을 검증하기 위하여, 본 발명자들은 이미 동정이 된 4 종의 바실러스 관련 균주를 국가공인 미생물 기탁기관인 생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)으로부터 분양받아 그들의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 결정하였다. 검증에 사용된 균주는 바실러스 서브틸리스 균주인 바실러스 리쉔니포미스 KCTC 2215, 바실러스 서브틸리스 KCTC 3014, KCTC 3239 및 KCTC 3494이다.

상기 4 종의 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 결정하기 위하여, 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 각 균주의 염색체 DNA를 분리한 후 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편을 PCR로 증폭하였고, 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편을 순수 분리한 후 염기서열을 분석하였다.

<2-2> DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 유사도 비교

상기 실시예 <2-1>에서 결정된 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 염기서열을 가지는 4 종의 바실러스 서브틸리스 관련 균주, 기존에 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열이 알려진 바실러스 서브틸리스 속 서브틸리스 균주 168 및 본 발명에서 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 결정한 7 종의 표준균주를 이용하여 바실러스 서브틸리스 관련 균주의 계통수를 작성하였다(도 1).

상기 계통수로부터, KCTC 2215는 기존에 동정된 바와 동일한 바실러스 리쉔니포미스로 동정되었으며, 바실러스 서브틸리스로만 알려져 있던 KCTC 3014, KCTC 3239 및 KCTC 3494는 바실러스 서브틸리스 속 서브틸리스로 동정되었다. 따라서, DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 염기서열을 이용한 본 발명의 동정방법이 바실러스 서브틸리스 관련 균종의 동정에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 절편의 염기서열을 이용한 동정방법은 기존의 동정방법으로는 정확한 동정이 불가능했던 바실러스 서브틸리스 관련 균주를 종 및 아종 단계까지 정확하게 동정할 수 있는 방법으로서, 산업적으로 유용한 바실러스 서브틸리스 관련 균주의 동정에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자의 염기서열은 DNA 탐침 또는 DNA 칩에 응용되어 바실러스 서브틸리스 관련 종을 탐색하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

바실러스 서브틸리스 관련 균종을 동정하기 위한, 서열번호 3 내지 9로 기재되는 염기서열 중 어느 하나를 갖는 바실러스 서브틸리스 관련 표준균주의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 단편.
제 1항에 있어서, 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 인지 여부를 동정하기 위한, 서열번호 3으로 기재되는 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 단편.
제 1항에 있어서, 바실러스 아트로페우스(Bacillus atrophaeus)인지 여부를 동정하기 위한, 서열번호 4로 기재되는 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 단편.
제 1항에 있어서, 바실러스 리쉔니포미스(Bacillus licheniformis)인지 여부를 동정하기 위한, 서열번호 5로 기재되는 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 단편.
제 1항에 있어서, 바실러스 모자벤시스(Bacillus mojavensis)인지 여부를 동정하기 위한, 서열번호 6으로 기재되는 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 단편.
제 1항에 있어서, 바실러스 서브틸리스 속 서브틸리스(Bacillus substilissubsp. substilis)인지 여부를 동정하기 위한, 서열번호 7로 기재되는 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 단편.
제 1항에 있어서, 바실러스 서브틸리스 속 스피지제니이(Bacillus substilissubsp. spizizenii)인지 여부를 동정하기 위한, 서열번호 8로 기재되는 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 단편.
제 1항에 있어서, 바실러스 발리스모티스(Bacillus vallismortis)인지 여부를 동정하기 위한, 서열번호 9로 기재되는 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 단편.
서열번호 3 내지 9로 기재되는 염기서열 중 어느 하나의 염기서열과 동정하고자 하는 미생물의 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 유전자 단편의 염기서열과의 유사도를 이용하는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 및 관련 균종의 동정방법.
삭제
서열번호 3 내지 9로 기재되는 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 DNA 탐침(probe) 또는 DNA 칩(chip)을 사용하는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 및 관련 균종의 탐색방법.
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