CN1942592B - 淋病奈瑟氏球菌检测 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种确定个体是否被或已经被淋病奈瑟氏球菌所感染的方法。所述方法检测获自生物样品的淋病奈瑟氏球菌，porA核酸片段。所述方法包括使用具有按照SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的分别核苷酸序列的引物来使生物样品进行核酸序列扩增，从而产生porA淋病奈瑟氏球菌扩增产物。使用寡核苷酸通过荧光共振能量转移来检测所述扩增产物，所述寡核苷酸具有按照SEQ ID NO：3的具有供体荧光团和具有受体荧光团的SEQ ID NO：4的分别的核苷酸序列。
Description
发明领域
本发明涉及细菌淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的检测，更具体地涉及细菌核酸的检测。本发明具体涉及典型地出于临床诊断的目的，检测淋病奈瑟氏球菌的porA基因的扩增片段以确定细菌是否存在于获自个体的生物样品中。
发明背景
淋病奈瑟氏球菌是一种革兰氏阴性双球菌细菌病原体，它是已知为淋病的性传播疾病(STD)的病原生物。尽管淋病是首先由Galen在AD150发现的古老疾病，其仍旧是人类主要的STD。不能检测和治疗淋病奈瑟氏球菌感染会使疾病发展到严重的系统感染，所述系统感染影响心脏、关节、脑膜、眼睛和咽。因此，早期的确定诊断可以协助治疗疾病并且预防作为这种细菌感染的结果引起的严重并发症。
尽管聚合酶链式反应(PCR)是用于淋病奈瑟氏球菌的常规检测的选择方法，PCR具有限制，而细菌分离仍旧是确定诊断的金标准。这主要是因为淋病奈瑟氏球菌与其它的奈瑟球菌属物种包括脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)具有很高的序列同源性，此外包含许多非保守序列(Palmer等，2003，J.Clin.Microbiol.41835-7)。因此，当使用PCR来常规检测淋病奈瑟氏球菌时，有发生假阳性和假阴性结果的可能。在两种情况下，结果会是有重大影响的。从公众健康的角度来看，假阴性结果可以使疾病不受制止地传播，而假阳性结果对于患者而言会具有相当的社会效应。
Roche Cobas Amplicor系统(Roche Diagnostics，澳大利亚)是广泛用于检测淋病奈瑟氏球菌的PCR测定法。它的吸引力存在于同时检测淋病奈瑟氏球菌、鹦鹉热衣原体(Chlamydia trachomatis)和抑制物质的存在的能力，同时还携有美国食品和药监局(FDA)的批准。但是所述Cobas Amplicor系统确实具有局限。最显著地，已知其淋病奈瑟氏球菌测定与一些共生的奈瑟球菌属物种的菌株，包括微黄色奈瑟氏球菌(N.subflava)，灰色奈瑟氏球菌(N.cinerea)，变黄奈瑟氏球菌(N.flavescens)，嗜乳糖奈瑟氏球菌(N.lactamica)和干燥奈瑟氏球菌(N.sicca)交叉反应(Palmer等，2003，上文；Farrell，1999，J.Clin.Microbiol.37386-90)。结果，需要使用第二PCR测定来证实Cobas Amplicor的阳性结果。作为响应，临床实验室已经采取了内部(in-house)证实测定法。
到目前为止，内部证实测试的最常用靶标是淋病奈瑟氏球菌的隐蔽性质粒(cppB)基因，其中已经描述了一些这样的方法(Ho等，1992，J.ClinPathol.45439-442；Farrell，1999，上文；Whiley等，2002，Diagn.Microbiol.Infect.Dis.4285-9；Tabrizi等，2004，Sex.Trans.Infect.8068-71)。特别地，已经开发了基于LightCycler的cppB PCR(cppB-LC)测定法来证实Cobas淋病奈瑟氏球菌的阳性样本(Whiley等，2002，上文)。然而，现在存在关于靶向cppB基因的淋病奈瑟氏球菌测定法的灵敏度和特异性的深度关注。在英国和澳大利亚进行的研究已经鉴定了缺乏cppB基因的淋病奈瑟氏球菌分离株(Palmer等2003，上文，Ottawa：A cluster of culture-positive，but PCR false negative infections with Neisseria gonorrhoeae.Tapsall等，Abstract 0129.15th Biennial Congress of the International SocietyforSexually Transmitted Diseases Research ISSTDR)。因此靶向该基因的实验室冒着假阴性结果的风险。此外，所述cppB基因可以存在于包括灰色奈瑟氏球菌的共生的奈瑟氏球菌菌株中，并且因此还会产生假阳性的结果(Palmer等2003，上文)。
交叉反应是基于淋球菌核酸诊断测试的严重问题并且在奈瑟氏球菌属中的水平基因交换是这些交叉反应的主要来源(Johnson等，2002，MMWR Recomm.Rep181-38)。此外，将淋球菌测试用在未消毒的部位，而其它的奈瑟氏球菌属菌株可以频繁地在这些部位发现。
已经将porA基因的PCR检测用于检测脑膜炎奈瑟氏球菌(Glustein等，1999,Molecular Diagnosis 4233-9)，部分是由于该基因在共生的奈瑟氏球菌中不存在的假设(Feavers&Maiden，1998，Mol.Microbiol.30647-656)。而且，在这些测定中，当这些测试用在消毒的部位上时，交叉反应(或交叉反应的可能)不是显著的威胁，所述消毒的部位包括血液和CSF。
其中porA序列已经被鉴定的仅有的其它的奈瑟氏球菌属物种是淋病奈瑟氏球菌，它具有与脑膜炎奈瑟氏球菌porA基因有相当大的序列类似性的porA假基因(Feavers&Maiden，1998，上文)。然而，不清楚的是这种假基因是否存在于淋病奈瑟氏球菌所有的菌株中，也没有证实其在共生菌株中的不存在。
发明概述
尽管存在这样的事实，即淋病奈瑟氏球菌porA假基因是基于核酸检测淋病奈瑟氏球菌、更具体地，区分淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌的不大可能的靶标，并且可能在淋病奈瑟氏球菌分离株和菌株中不是普遍存在的，或在共生菌株中不存在，本发明人已经令人惊奇地开发了敏感的和可再现的使用淋病奈瑟氏球菌porA假基因作为靶标的基于核酸的检测方法。
因此，本发明已经广泛涉及确定个体是否被或已经被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法使用来自其中的porA假基因或porA核酸作为感染的指示物。
本发明还广泛涉及一种或多种寡核苷酸，其有利于检测淋病奈瑟氏球菌，porA基因或porA核酸。
在第一方面中，本发明提供确定个体是否被或已经被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括，如果分离的porA核酸存在于获自所述个体的生物样品中，检测淋病奈瑟氏球菌的步骤，所述porA核酸的存在指示所述个体被或已经被淋病奈瑟氏球菌感染。
优选地，所述方法包括使核酸样品在促进所述分离的porA核酸扩增到可检测水平的条件下，使核酸样品进行核酸序列扩增的步骤。
在本发明的第二个方面，提供了确定个体是否被或已经被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括如果存在于获自所述个体的所述生物学样品中，从另一种奈瑟氏球菌属物种的porA核酸中选择性检测或区分分离的淋病奈瑟氏球菌的porA核酸的步骤，所述分离的porA核酸的存在指示所述个体被或已经被淋病奈瑟氏球菌所感染。
优选地，所述方法包括在这样的条件下，使核酸样品进行核酸序列扩增的步骤，所述条件促进所述分离的porA核酸扩增到可检测的水平，但是不有利于所述另一种奈瑟氏球菌属物种的porA核酸扩增到可检测水平。
优选地，所述另一种奈瑟氏球菌属物种是脑膜炎奈瑟氏球菌。
在优选的实施方案中，本发明提供确定人个体被或已经被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)如果存在于所述生物样品中，使获自所述人个体的生物样品进行核酸序列扩增以选择性地产生来自淋病奈瑟氏球菌porA核酸的porA淋病奈瑟氏球菌扩增产物；和
(ii)如果存在，通过探针杂交来检测所述扩增产物，其中所述porA扩增产物的存在指示所述个体被或已经被淋病奈瑟氏球菌所感染。
在第三个方面，本发明提供足以使得所述porA核酸的检测能够进行的能够与淋病奈瑟氏球菌的porA核酸杂交的寡核苷酸，但是其在足以使所述另一种奈瑟氏球菌属物种的所述porA核酸能够检测的情况下，不能与另一种奈瑟氏球菌属物种的porA核酸杂交。
优选地，所述另一种奈瑟氏球菌属物种是脑膜炎奈瑟氏球菌。
在优选的实施方案中，所述寡核苷酸包括如表1和图1所提出的核苷酸序列(SEQ ID NOS：3-9)。
在第四个方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括按照第三个方面的一种和多种寡核苷酸以及DNA聚合酶和/或一种或多种检测试剂。
在第五个方面，本发明提供一种核酸阵列，其包括按照第二个方面的寡核苷酸，所述寡核苷酸固定，偶联，浸透于基底或以其它方式与基底联系。
要理解的是，本发明提供有利于淋病奈瑟氏球菌的porA核酸的检测的方法和寡核苷酸。
优选地，所述porA核酸对应于淋病奈瑟氏球菌的porA假基因的片段。
更优选地，按照该实施方案，porA核酸对应于淋病奈瑟氏球菌的porA假基因的片段，所述片段具有不同于另一种奈瑟氏球菌属物种的porA基因或假基因的片段的核苷酸序列。
在特别优选的实施方案中，淋病奈瑟氏球菌的porA核酸包括足以使所述porA核酸的检测能够进行的核苷酸序列，寡核苷酸能够与所述核苷酸序列退火。
适合地，所述核苷酸序列不存在，或不具有一个或多个不同于另一种奈瑟氏球菌属物种的porA核酸的核苷酸序列的核苷酸，从而使所述寡核苷酸不能与所述另一种奈瑟氏球菌属物种的所述porA核酸杂交，所述寡核苷酸足以有利于检测所述另一种奈瑟氏球菌属物种的所述porA核酸。
一优选地，所述另一种奈瑟氏球菌属物种是脑膜炎奈瑟氏球菌。
在特别有利的实施方案中，本发明的方法和寡核昔酸有利于检测可以存在于淋病奈瑟氏球菌的多种分离株，菌株，等位基因变体或亚种的每种中的porA核酸。
在整个说明书中，除非另外指出，所用的“包括(comprise)”，“包括(comprises)，，和“包括(comprising)’’是包含性的而不是穷尽性的，从而使指定的整数或整数的组可以包括一个或多个其它未指定的整数或整数的组。
附图简述
图1淋病奈瑟氏球菌porA假基因的优选的寡核苷酸引物序列(AS＝反义讶口核苷酸序列列表。加粗体表示的残基表示(5’到3’)NG-pap-F(正向)引物退火位点；NG-pap-p1探针杂交位点；NG-pap-p2探针杂交位点；和NG-pap-R(反向)引物退火位点。预期的扩增产物大小是132 bp。用阴影表示的残基是与相应的脑膜炎奈瑟氏球菌porA序列不相同的那些。序列标识如下：NG-pap-F(正向)引物序列：(SEQ ID NO：1)；NG-pap-R(反向)引物序列(SEQ ID NO：2)；NG-pap-pl探针(SEQ ID NO：3)；NG-pap-p2探针序列(SEQ ID NO：4、)；NG-pap-p3探针序列(SEQ ID NO：5)；NG-pap-p4探针厅列(SEQ ID NO：6)；NG-pap-p5探针序列(SEQ ID NO：7)；NG-pap-p6探针序列(SEQ ID NO：8)；NG-pap-p7探针序列(SEQ ID NO：9)；淋病奈瑟氏球菌porA假基因序列(SEQ ID NO：10)；
优选实施方案详述
本发明涉及淋病奈瑟氏球菌的改善的基于核酸的检测。为此目的，本发明人已经鉴定了在淋病奈瑟氏球菌的基因组上的备选PCR靶标序列，即porA假基因，其在以前从未用作淋病奈瑟氏球菌检测的靶标并且出乎意料地提供与目前所述的其它PCR测定相比，大大提高的淋病奈瑟氏球菌检测的临床灵敏度和特异性。
更具体地，本发明人已经开发了靶向淋病奈瑟氏球菌的porA假基因的新淋病奈瑟氏球菌的LightCyclerTM测定法。重要的是，显示奈瑟氏球菌属porA基因存在于所测试的所有的淋病奈瑟氏球菌样品和分离株中，但是在共生的奈瑟氏球菌属物种中不存在。因此，这种基因靶标的选择消除或至少部分减少与共生的奈瑟氏球菌属物种交叉反应的可能。
在淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌之间的porA序列之间存在的差异还已经被用于开发研制这样得寡核苷酸，其能够只特异性PCR扩增和检测淋病奈瑟氏球菌来源的porA核酸。
本发明克服的特别的困难是在淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌之间仅存在极少的小部分的具有足够差异的porA序列来发展特异性的淋球菌测定法。在扩增引物和污染DNA，即脑膜炎球菌porADNA之间的过少的错配，将导致测定交叉反应。在引物和它们各自的靶标之间的过多的错配可能减少淋球菌靶标porA序列的PCR扩增的扩增效率。
本发明的寡核苷酸引物具有足够的错配从而即使当被相当高浓度的脑膜炎球菌DNA(约0.5μg/反应)所污染，该测定也特异于淋球菌porADNA。
因此，本发明提供检测生物样品中淋病奈瑟氏球菌的分离的porA核酸的方法和有利于扩增和/或检测所述porA核酸的一种或多种寡核苷酸。
出于本发明的目的，所谓“分离的”指已经从天然状态移去或进行了人工操作的物质。分离的物质可以相当多地或基本上游离于通常在其天然状态伴随其的成分，或可以被进行操控以与通常在其天然状态伴随其的成分一起处于人工状态。分离的物质可以是天然的，化学合成的或重组形式的。
用于本文时，“核酸”包括和涵盖DNA，RNA和DNA-RNA杂交分子。DNA包括单链和双链基因组DNA和cDNA，如本领域所公知。RNA包括单链和双链未加工的RNA，mRNA和tRNA。
将理解的是所谓“porA核酸”指对应于porA基因或假基因的至少片段或区域的核酸。
用于本文时，“基因”是可以包括一个或多个元件的基因组的不连续的结构单元，所述元件诸如典型地存在于一个或多个顺反子中的氨基酸编码区域，操纵基因，启动子、终止子和/或任何其它调节核苷酸序列。
用于本文时，“假基因”是基因组的无活性的单元、区域或序列，其与已知的功能基因具有类似的序列。典型地，因为这种序列类似性，考虑假基因通常相对于正常发挥功能的基因是进化的。
在淋病奈瑟氏球菌中，porA是假基因而在脑膜炎奈瑟氏球菌中porA是基因。
在上下文中的所谓“对应于”或“相应于”指porA核酸包括存在于porA假基因中的核苷酸序列，或互补于存在于porA假基因中的核苷酸序列的核苷酸序列，或与这些中的任一具有至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％或甚至更优选地至少95％，96％，97％，98％或99％同一性的核苷酸序列。
在特别优选的实施方案中，所述porA核酸对应于porA假基因的132bp的片段。
在特别的方面中，本发明提供一种或多种寡核苷酸和/或使用其来促进核酸序列扩增和/或porA核酸检测的方法。
用于本文时，“寡核苷酸”是具有不超过一百(100)个核苷酸(碱基)或核苷酸对(碱基对)的单链或双链核酸。“多核苷酸”具有超过一百(100)个核苷酸或核苷酸对。
在核酸序列扩增的具体上下文中，本发明的寡核苷酸可以以引物的形式存在。
用于本文时，“引物”是单链寡核苷酸，其能够与核酸“模板”杂交并且通过适合的DNA聚合酶诸如Taq聚合酶、RNA-依赖型DNA聚合酶或测序酶TM的作用以模板-依赖型方式进行延伸。
典型地，引物可以具有至少12、15、20、25、30、35或40个但是不超过50个连续的核苷酸碱基。
将理解的是，已经按照选定的标准对本文所述的引物进行设计从而使检测敏感型和特异性最大化。
适合地，对本发明的引物进行设计从而能够与淋病奈瑟氏球菌的核苷酸序列、不存在于或具有一个或多个不同于另一种奈瑟氏球菌属物种的porA核酸的核苷酸序列的核苷酸的porA核酸退火，从而使所述寡核苷酸不能与所述另一种奈瑟氏球菌属物种的所述porA核酸进行退火，从而不足以促进所述另一种奈瑟氏球菌属物种的所述porA核酸的检测。
优选地，所述另一种奈瑟氏球菌属物种是脑膜炎奈瑟氏球菌。
将理解的是，本发明部分根据这样观察，即，其它的共生奈瑟氏球菌属物种诸如微黄色奈瑟氏球菌，灰色奈瑟氏球菌，变黄奈瑟氏球菌，嗜乳糖奈瑟氏球菌和干燥奈瑟氏球菌交叉反应不具有porA假基因。
在一个特别有利的实施方案中，对本发明的引物进行设计从而促进淋病奈瑟氏球菌的多个分离株、菌株、等位基因变体或亚种的porA核酸的检测。
因此，本发明人已经鉴定了淋病奈瑟氏球菌的porA基因中的核苷酸序列，其在该病原生物中多个分离株中是保守的，所述序列不存在于，或充分不同于脑膜炎奈瑟氏球菌的porA假基因的各自的核苷酸序列。
这已经使本发明人能够设计有利于淋病奈瑟氏球菌、porA核酸的特异性、灵敏度和广谱扩增的引物，同时避免扩增所述另一种奈瑟氏球菌属物种的porA核酸，或至少使其扩增最小化到不可检测的水平。
按照本发明的引物的具体实例提供在图1和表1中(SEQ ID NOS：1和2)。
比较图1的引物序列(SEQ ID NOS：1和2)，淋病奈瑟氏球菌，在图1中提出的porA假基因核苷酸序列(SEQ ID NO：10)和相应的公布的脑膜炎奈瑟氏球菌porA核苷酸序列的引物序列，将被理解的是，在引物序列中的变化容易实现，同时维持选择性扩增淋病奈瑟氏球菌，porA序列所必需的特异性。
在优选的实施方案中，本发明意欲通过porA扩增产物的核酸序列扩增和随后的检测来检测porA核酸或其片段。
核酸扩增技术对于本领域技术人员而言是公知的，并且包括如例如在Ausubel等CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY的第15章中的聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)(John Wiley&SonsNY，1995-1999)；如例如在美国专利号5,422,252中描述的链置换扩增(SDA)；如例如在Liu等，1996，J.Am.Chem.Soc.1181587和国际申请号WO 92/01813和Lizardi等在国际申请号WO 97/19193中描述的滚环复制(RCR)；如例如在Sooknanan等，1994，Biotechniques 171077中所述的基于核酸序列的扩增(NASBA)；如例如在Tyagi等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA935395中描述的Q-β复制酶扩增和如在国际出版物WO 2004/02025中所述的解选酶依赖型扩增。
上述是核酸序列扩增技术的实例，但是不作为技术的穷尽性列表出现。本领域技术人员将充分意识到各种其它的可应用的技术以及本文所述技术的变化和改进。
例如，本发明意欲使用有利于核酸序列扩增产物的量化的具体技术诸如“竞争PCR”或技术诸如“实时”PCR扩增诸如在Whiley等，2002，上文中所述。
优选地，核酸序列扩增技术是PCR。
用于本文时，“扩增产物”是由如前面所述的核酸序列扩增技术所产生的核酸。
在特别优选的实施方案中，所述方法产生单一的132bp的porA扩增产物。
用于本文时，“杂交(hybridization)”，“杂交(hybridize)”和“杂交(hybridizing)”指在限定条件下，通过在互补或至少部分互补的核苷酸序列之间通过碱基配对形成杂交的核酸，如本领域所公知的。在互补的A和T或U碱基之间，和G和C碱基之间通过形成氢键发生正常的碱基配对。还将理解的是，碱基配对可能发生在嘌呤(G和A)和嘧啶(C，T和U)的各种衍生物之间。嘌呤衍生物包括肌昔、甲基次黄嘌呤和甲基腺苷。嘧啶衍生物包括含硫的嘧啶诸如硫尿苷和甲基化嘧啶诸如甲基胞嘧啶。对于通常影响核酸杂交的因素的详细讨论而言，本领域技术人员涉及CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，上文的第2章。
更具体地，术语“退火(aneal)”和“退火(anealing)”用在引物与核酸模板杂交以进行随后的引物延伸反应的背景中，诸如在例如核酸序列扩增或双脱氧核苷酸测序过程中发生。
对于影响PCR引物的退火的因素的讨论而言，本领域技术人员参考CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds Ausubel等(John Wiley&Sons NY 1995-1999)的第15章。
本发明提供在生物样品中检测淋病奈瑟氏球菌的porA核酸作为淋病奈瑟氏球菌的指示或存在，在生物样品来自或获自其中的个体中检测淋病奈瑟氏球菌的porA核酸，或作为过去淋病奈瑟氏球菌，所述个体的感染的指示。
优选地，porA核酸扩增产物，所述扩增产物通过本领域所公知的一种或多种方法来检测。
扩增产物的检测可以通过杂交于扩增产物的探针的检测，通过以琼脂糖凝胶电泳直接观察扩增产物，扩增产物的核苷酸测序或通过荧光-标记扩增产物进行检测来实现扩增产物的检测。
用于本文时，“探针”是单链或双链寡核苷酸或多核苷酸，其中的一个和/或其它链能够杂交于另一种核酸从而形成“杂交”核酸。
本发明的探针和/或引物可以用例如生物素或地高辛，用荧光染料或供体荧光团诸如FITC，TRITC，得克萨斯红，TET，FAM6，HEX，ROX或Oregon Green，受体荧光团诸如LC-Red640，酶诸如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)或用放射性核素诸如125I，32P，33P或35S进行标记来辅助通过本领域公知的技术检测扩增产物。
按照本发明的探针的优选实施方案具有在图1和表2中提出的分别的核苷酸序列(SEQ ID NOS：3-9)。
按照本发明的探针的特别的优选实施方案具有在SEQ ID NOS：3和4中提出的分别的核苷酸序列。
关于荧光标记的扩增产物的检测，这可以使用结合了如前所述的荧光标记的一种或多种引物来实现。
在另一个实施方案中，检测可以使用结合了荧光标记的探针通过熔解曲线分析进行，所述探针在序列扩增反应中与扩增产物杂交。具体的实例是当扩增产物在扩增的每个循环中产生时，使用荧光共振能量转移(FRET)探针来以“实时”与扩增产物杂交。
对FRET杂交探针对进行设计从而与靶标DNA上的邻近区域进行杂交。每个探针用不同的标记染料进行标记。两种染料的相互作用仅发生在两者与它们的靶标结合的时候。典型地，用荧光团(诸如FITC，TRITC，得克萨斯红TET，FAM6，HEX，ROX或Oregon Green)在3’末端标记供体探针，并用受体荧光团(诸如LC-Red640，TAMRA或QSY染料)在其5’末端标记受体探针。在PCR过程中，两种不同的寡核苷酸探针与靶标DNA的邻近区域进行杂交从而使与寡核苷酸偶联的荧光团在杂交结构的近端。供体荧光团由外部光源激发，接着将其激发能量的部分传递到邻近的受体荧光团。激发的受体荧光团发射不同波长的光，其可以接着进行检测和测量。
在另一个实施方案中，本发明意欲使用熔解曲线分析，其中核酸-嵌入染料诸如溴化乙锭(EtBr)或SYBR Green I结合扩增产物并且对嵌入复合物的荧光发射进行检测。
熔解曲线分析可以有利地使用装置诸如LightCyclerTM进行，如例如在Whiley等，2002，上文中所述。
根据前述，显而易见的是，本发明的淋病奈瑟氏球菌检测方法理想地适合于辅助诊断可能已经或目前具有淋病奈瑟氏球菌感染的个体。
淋病奈瑟氏球菌是人主要的病原生物，因此本发明特别涉及人个体的淋病奈瑟氏球菌感染的检测。
适合地，所述生物样品是宫颈、尿道、阴茎、肛门、直肠、咽喉、唾液、粪便或尿液样品，尽管不局限于此。
适合地，所述生物样品包括一种或多种细菌或可以来自其中的以DNA或RNA存在的核酸。
优选地，为了使所述生物样品的操作最少化，按照本发明的方法，基因组DNA分离自所述生物样品。然而，原则上，cDNA可以通过本领域公知的逆转录分离的RNA来产生，如例如描述在CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULARBIOLOGY的第15章，上文。
特别地出于临床诊断的目的，尽管不限于此，本发明提供一种试剂盒，其包括一种或多种寡核苷酸诸如按照本发明第三个方面的引物对，所述试剂盒还可以包括其它的试剂诸如热稳定性的DNA聚合酶，porA核酸探针，阳性和/或阴性核酸对照样品，分子量标记物，诸如用于扩增产物的比色检测或荧光检测的检测试剂和/或反应容器诸如微量滴定板。
还将理解的是，本发明的方法可以单独或组合以其它形式的诊断使用，所述其它形式的诊断诸如细菌培养测试或基于临床症状的常规诊断以提高的诊断的精确性。
在优选实施方案中，本发明提供确定人个体是否被或已经被淋病奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)使获自所述人个体的生物样品进行核酸序列扩增从而选择性地产生来自淋病奈瑟氏球菌porA核酸的porA淋病奈瑟氏球菌扩增产物，如果存在于所述生物样品中的话；和
(ii)如果存在，通过探针杂交检测所述扩增产物，其中所述porA扩增产物的存在指示所述个体被或已经被淋病奈瑟氏球菌所感染。
按照该实施方案的特别优选的形式，在步骤(ii)中通过使用邻近的杂交探针形式的荧光共振能量转移(FRET)使用实时PCR检测。优选的上游寡核苷酸探针(NGpapPl；表1；SEQ ID NO：3)用供体荧光团，荧光素在3???末端进行标记，而优选的下游寡核苷酸探针(NGpapP2；表1；SEQ ID NO：4)用受体荧光团LC-Red640在5’末端进行标记。探针NGpapP2(SEQ ID NO：4)还在3’末端进行磷酸化。
还将理解的是，本发明可以与其它病原生物的基于核酸的检测结合来进行。
在该方面，本发明意欲淋病奈瑟氏球菌的porA核酸的核酸阵列检测，其中可以检测其它病原生物的一种或多种其它的核酸。
在Bryant等，2004，Lancet Infect.Dis.4100中提供关于这种类型的多-病原体检测的微阵列方法的一般讨论。
将理解的是，核酸阵列可以包括按照第二个方面的寡核苷酸，所述寡核苷酸固定、偶联、浸透于基底，或以其它方式与基底联系。
更通常地，核酸阵列技术已经成为本领域众所周知的并且在CURRENT PROTOCOLSINMOLECULAR BIOLOGY Eds Ausubel等(John Wiley&Sons NY USA 1995-2001)的第22章中提供可应用于阵列技术的方法的实例。
在某些实施方案中，多个的至少一个地址(address)包括核酸捕获探针，所述探针与核酸文库的成员，例如有义链或反义链特异性杂交。在一个优选实施方案中，多个地址的地址的子集具有用于核酸文库成员的核酸捕获探针。每个地址的亚组可以包括杂交于文库成员的不同区域的捕获探针。
关于本发明，优选的阵列形式包括载玻片，所述载玻片具有多个cDNA片段的固定的、有序的栅格。
所述阵列可以具有至少10，50,100，200，500，1,000，2,000，或10,000个或更多地址/cm2和在其间的范围的密度。基底可以是两维基底诸如载玻片，片(例如硅石或塑料)，质谱板，或三维基底诸如凝胶垫。
阵列可以通过各种方法，例如通过光刻法(见，例如美国专利号5,143,854；5,510,270；和5,527,681)，机械方法(例如，如在美国专利号5,384,261中所述的定向流动方法)，基于针的方法(例如，如在美国专利号5,288,514中所述)，和基于珠的技术(例如，如在PCT/US93/04145中所述)来产生。
参考下面的非限制性实施例，使本发明可以容易地理解，并且进行实践应用。
实施例
材料&方法
患者样品
将来自进行性健康筛查的患者的总共282个临床样本(46个宫颈拭子，12个尿道拭子和224个尿液样本)用在该研究中。考虑到淋病奈瑟氏球菌感染在我们当地人群中的低发生率，选择样品来提供大比例的Cobas阳性样本。
患者包括178个女性和104个男性，并且年龄在13岁到70岁，其中平均年龄26岁，中位值年龄为23岁。通过NgpapLC测定并通过组合RocheCobas Amplicor测定和cppB-LC测定的测试算法来测试所有的282个样本。使用该算法，开始通过Cobas Amplicor方法来测试样品。通过CobasAmplicor测定提供阳性淋病奈瑟氏球菌结果的任何样品接着通过cppB-LC测定进行测试从而确证。
Roche Cobas Amplicor测定
对尿液和拭子样本进行处理并按照生产商的说明书在Roche CobasAmplicor系统上进行测试。同时对每个样品测试淋病奈瑟氏球菌、鹦鹉热衣原体和抑制物质的存在。使用生产商提供的标准来进行结果解释。简言之，将提供少于0.2的吸光度的样本认为是淋病奈瑟氏球菌阴性的，而将提供0.2或更大的吸光度值的样本认为是阳性的。
LightCycler测定(NGpapLC和cppB-LC)
将柱提取用于NGpapLC和cppB-LC LightCycler测定。按照生产商的说明书，使用高纯病毒核酸试剂盒(Roche Diagnostics，澳大利亚)来从0.2ml的每个样品提取核酸。以50μl的洗脱缓冲液(Roche Diagnostics，澳大利亚)来从柱上洗脱纯化的样品DNA。将DNA提取物贮存于-20℃直到分析。
所述NGpapLC测定包括一个引物对，一对杂交探针并且靶向淋病奈瑟氏球菌porA假基因。使用引物papF和papR(表1；Invitrogen，澳大利亚)来进行扩增，其在反应中产生132bp的PCR产物。实时PCR检测通过使用邻近杂交探针形式的荧光共振能量转移(FRET)来实现。上游寡核苷酸探针(papP1；表1)用供体荧光团，荧光素在3’末端进行标记，而下游寡核苷酸探针(papP2；表1)用受体荧光团，LC-Red640在5’末端(TIBMOLBIOL，德国)进行标记。探针papP2还在3’末端进行了磷酸化。将LightCycler FastStart DNA Master杂交探针试剂盒(Roche Diagnostics，澳大利亚)用作反应混合物的基础，在每个反应毛细管中使用20μl体积。简言之，毛细管装载有2μl的试剂盒专用试剂(10x；Roche Diagnostics，澳大利亚，试剂1)，4mM的MgCl2(Roche Diagnostics，澳大利亚，试剂2)，0.4μM的引物papF，0.6μM的引物papR，0.2μM的每种杂交探针和5μl的DNA提取物。使用无菌的PCR级水(Roche Diagnostics，澳大利亚，试剂3)将每个混合物补足到20μl。每轮测试包括阳性对照和三个无靶标的对照，由15μl的反应混合物和5μl的提取物洗脱缓冲液组成。使用下列参数在LightCycler(软件版本5.32)上进行扩增和检测：在95℃进行开始的变性步骤达10分钟，随后进行55个循环的在95℃变性10秒，在55℃进行引物和探针退火达10秒，在72℃延伸20秒。在退火阶段获得荧光反应数据，并且用通道设定(channel setting)F2/F1来进行分析。在PCR扩增后，进行熔解曲线分析。简言之，在40℃进行所述分析，并以0.2℃/秒的速率将温度升到95℃。
如前所述(Whiley等，2002，上文)进行cppB-LC测定并使用类似于NGpapLC测定的条件的条件。简言之，将LightCycler FastStart DNA Master杂交探针试剂盒(Roche Diagnostics，澳大利亚)用作反应混合物的基础。每个反应毛细管包括20μl的总反应体积，其包括两种引物(HO1@0.2M和HO2@0.4M)和靶向淋病奈瑟氏球菌cppB基因的两种杂交探针(0.2M每种)(Whiley等，2002，上文)。
检测限度
通过测试5×10E4菌落形成单位/ml(cfu/ml)的淋病奈瑟氏球菌培养物(ATCC49226)的混悬液的测试稀释物来确定和比较NGpapLC和cppB-LC测定的检测限度。提取该混悬液的系列10倍稀释物，并通过使用上述条件的两种测定来对其进行测试。将每个测定的检测限度确定为重现阳性反应的最低浓度。
奈瑟氏球菌属的组群
通过NGpapLC和cppB-LC测定来测试奈瑟氏球菌属物种的组。该组包括63个非淋球菌奈瑟氏球菌属分离株，测试它们以确定假阳性交叉反应。该物种包括脑膜炎奈瑟氏球菌(38)，微黄色奈瑟氏球菌(12)，干燥奈瑟氏球菌(6)，长奈瑟氏球菌(N.elongata)(3)，粘液奈瑟氏球菌(N.mucosa)嗜乳糖奈瑟氏球菌(3)和与奈瑟氏球菌属紧密相关的卡他莫拉氏菌(Branhamella catarrhalis)(6)。此外，测试84株淋病奈瑟氏球菌分离株以确定是否观察到每个测定中的引物和探针序列靶标。其中包括的6株淋病奈瑟氏球菌分离株以前用cppB-LC测定测试为阴性。这6株分离株由RoyalDarwin Hospital，Northern Territory提供。从整个昆士兰州的不同地理位置选择剩下的淋病奈瑟氏球菌分离株以确保分离株的宽交叉部分。按照生产商的说明书，使用高纯病毒核酸试剂盒(Roche Diagnostics，澳大利亚)从每个分离株的培养物中提取核酸。将约0.5μg的细菌DNA加入每个反应中。非奈瑟氏球菌属组群-常见的人病原体和正常菌群
还使用常见的人病原体和正常菌群的其它组群进一步确定NGpapLC测定法的特异性；Acinetobacter aranitratus ATCC 19606，Acinetobacterbeaumanni ACM 686，溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)ACM620，约氏不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii)ACM 621，琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)ACM 617，鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwolfii)ACM 664，气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)ATCC 35654，粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)ATCC 35655，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquifaciens)ATCC 3642，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)ATCC 37，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC 11778，环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)ATCC 61，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)ATCC 264，坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)ATCC 31，侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)ATCC 295，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC127559，浸麻类芽孢杆菌(Bacillus macerans)ATCC 401，巨兽芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ATCC 2640，蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)ATCC 28，多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)ATCC 35，短小芽孢杆菌(Bacillus pumulis)ATCC 433，球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)ATCC4525，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)ATCC 11774，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ATCC 453，迪氏拟杆菌(Bacteroides distasonis)ATCC 8503，牙龈卟啉单胞菌(Bacteroides gingivalis)ATCC 33277，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)ATCC 8482，支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)ATCC 10580，副百日咳博德特氏菌(Bordetellaparapertussis)ATCC 15237，洋葱伯克氏菌(Burkholduria cepacia)ATCC17765，空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)ATCC 33291，白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 14053，克鲁斯念珠菌(Candida krusei)(实验室分离株)，热带念珠菌(Candidatropicalis)(实验室分离株)，费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)ATCC 8090，白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiptheriae)ATCC 13812，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)ATCC13048，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(实验室分离株)，耐久肠球菌(Enterococcus durans)ATCC 6506，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)ATCC 29212，屎肠球菌(Enterococcusfaecium)ATCC 35667，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)ATCC 19414，大肠杆菌(Esherichiacoli)ATCC 35218，产吲哚黄杆菌(Flavobacterium indologenes)(实验室分离株)，Flavobacterium multivoram ATCC 35656，流感嗜血菌(Haemophilisinfluenzae)ATCC 10211，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)ATCC 13883，单核细胞增多性李斯特杆菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 7646，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 4988，奇异变形菌(Proteus mirabilus)ATCC 7002，普通变形菌(Proteus vulgaris)ATCC 6380，斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)ATCC 35031，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 27853，泡囊假单胞菌(Pseudomonas vesicularis)(实验室分离株)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ATCC 2366，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)(实验室分离株)，气味沙雷氏菌(Serratia oderifera)ATCC 33077，弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)(实验室分离株)，宋氏志贺氏菌(Shigella sonnei)ATCC 25931，模仿葡萄球菌(Staphyloccus simulans)ATCC 27851，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(实验室分离株)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC33591，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)NCTC 6751，头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)ATCC 27840，科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii)ATCC 29974，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(实验室分离株)，溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)ATCC 29970，人葡萄球菌(Staphylococcus hominus)ATCC 27844，中间葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)ATCC 29663，里昂葡萄球菌(Staphylococcuslugdenensis)(实验室分离株)，Staphylococcus scuiri(实验室分离株)，沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)ATCC 27836，木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)ATCC 29971，嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(实验室分离物)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ATCC 12386，牛链球菌(Streptococcus bovis)ATCC 9809，马链球菌(Streptococcus equi)ATCC 9528，似马链球菌(Streptococcus equisimilis)ATCC 35666，链球菌(B组)ATCC 12386，链球菌(F组)ATCC 12392，链球菌(G组)ATCC 12394，变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC 35668，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)ATCC 27336，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)ATCC 19615，唾液链球菌(Streptococcus salivarius)ATCC13419，解藻酸弧菌(Vibrioalginolyticus)ATCC 17749，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC17802，Yarrowialipolytica ATCC 9773和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)ATCC 23715。由这些生物的培养物中纯化基因组DNA并利用上述条件在NGpapLC测定法中进行测试。
结果
通过NGpapLC测定法并且通过结合了Roche Cobas Amplicor测定法与cppB-LC测定法的测试算法对总共282个临床样品进行测试。在表2中提供了这些结果的总结。
总体上，通过全部三种PCR方法，对于淋病奈瑟氏球菌DNA来说，79(28.0％)个样本是阳性的而120(42.6％)个样本是阴性的。通过CobasAmplicor测定法另外81(28.7％)个样本是阳性的，但是通过NGpapLC和cppB-LC测定法则为阴性。这些被认为是由Cobas Amplicor获得的假阳性结果。通过Cobas Amplicor测定法另外两个(0.7％)样本是阳性的，但是对于LightCycler测定法则给出了不同的结果；一个样本通过cppB-LC测定为阳性，周期阈值(Ct值)为47，但是通过NGpapLC则为阴性，而剩余的样本只通过NGpapLC为阳性，提供Ct值为41。这些Ct值是每种测试最高记录的Ct值，并且指示在每个样本中的低淋病奈瑟氏球菌DNA浓度。在进行重复测试后，没有一个样本始终是阳性的。这提示在两种样本中的DNA浓度是各自测试的灵敏度的阈值。
通过测试淋病奈瑟氏球菌的稀释物，从5×10E+4到5×10E-2cfu/ml范围，确定NGpapLC灵敏度的限度为5cfu/ml的样本中的淋病奈瑟氏球菌。cppB-LC的检测限度被确定为5×10E-1cfu/ml。这提示cppB-LC比NGpapLC测定法具有更加好10倍的检测限度。
为了进一步确定NGpapLC测定法的特异性，从许多种生物的培养物中纯化基因组DNA并进行测试。这些包括奈瑟氏球菌属物种以及其它常见的人病原体和正常菌群。当通过NGpapLC测定法测试时所有非淋球菌物种都是阴性的。相反，三种脑膜炎奈瑟氏球菌分离株通过cppB-LC测定法测试为阳性。在cppB-LC测定法中这三种脑膜炎奈瑟氏球菌分离株提供的周期阈值(Ct值)比阳性淋病奈瑟氏球菌分离株所提供的显著更大，淋病奈瑟氏球菌分离株的Ct值始终低于16，而这三种脑膜炎奈瑟氏球菌分离株提供了Ct值为33或更大。这提示cppB基因可能在这些脑膜炎奈瑟氏球菌分离株中以较低的拷贝数存在。
在测试的84株淋病奈瑟氏球菌分离株中，七个通过cppB-LC测定法为阴性。这七个阴性分离株中的六个为获自Northern Territory的淋病奈瑟氏球菌分离株，之前通过cppB-LC测定法测试为阴性。因此只有另外一个cppB阴性分离株是在昆士兰州分离株中鉴定出来的。相反，当通过NGpapLC测定法测试时，全部84个淋病奈瑟氏球菌分离株都提供阳性结果。这显示NGpapLC寡核苷酸靶标存在于所有分离株中。此外，通过NGpapLC测定法进行的荧光熔解曲线分析显示在淋病奈瑟氏球菌分离株或任何阳性临床样本之间没有变化；所有NGpapLC阳性反应都提供65℃的熔解温度。
NGpapLC与细菌培养物相比较
在当地昆士兰州人群中进行与细胞培养物的比较，并包括557个取自参加性健康门诊患者的样本。考虑到在该人群中的淋病奈瑟氏球菌的低发生率，该人群对于测试NGpapLC测定法的特异性而言是理想的。
与细菌培养物相比，该测定法是100％灵敏的并且是88.2％特异性的(表3)。
然而，这种特异性计算基于这样的假设，即两种另外的PCR阳性是假阳性结果。相反，我们相信这些另外的阳性结果是真实的阳性结果。这是因为NgpapLC的结果由靶向单独的淋病奈瑟氏球菌基因的第二PCR测定所支持。此外，以前的研究已经显示PCR比细胞培养物具有更好的临床灵敏度。因此，另外的PCR阳性将是意外的。总而言之，上述结果显示新的NGpapLC测定法是高度适合于在临床样品中常规检测淋病奈瑟氏球菌。
表4-7提供表3的数据分类到样本的类型。
对于尿道和宫颈样本二者而言，所述NGpapLC测定法是100％特异性的。
咽喉拭子的结果显示该NGpapLC还适合于用在这些样本类型上，对在肛门拭子上的更局限的数据也一样。
讨论
与Cobas Amplicor淋病奈瑟氏球菌测定法的特异性相关的问题和对于确证测定的需要在文献中充分记载。不幸的是，还证实了用于确证测试的常规基因靶标具有限制。该研究的结果显示NGpapLC测定法对于证实Cobas Amplicor淋病奈瑟氏球菌阳性结果，是对于cppB-LC的适合的备选。通过靶向淋病奈瑟氏球菌porA假基因，NGpapLC克服了与cppB基因相关的局限并且提供了对于提高临床灵敏度和特异性的可能。
通过测试淋病奈瑟氏球菌的ATCC菌株的稀释物，cppB-LC测定法与我们新的NGpapLC测定法相比具有10倍更好的检测限制。这可能是因为隐蔽性质粒比淋病奈瑟氏球菌porA假基因具有更高的拷贝数。然而，在检测限制中的差异没有影响测定法的临床灵敏度。对于临床样本而言，NGpapLC和cppB-LC测定法给出了检测淋病奈瑟氏球菌的良好一致性。在282个样本中只有两个提供了不同的结果，其中每个LightCycler测定检测不同于其它的另外的阳性结果。起初，认为另外的cppB-LC阳性结果可能来自低于NGpapLC测定法的检测限度的淋病奈瑟氏球菌DNA负载。然而，通过使用更灵敏的嵌套式PCR测定法，我们还是不能检测在该样本中的淋病奈瑟氏球菌porA假基因的存在(数据未显示)。这说明使用我们的Roche Amplicor和cppB-LC测试算法，该样本的是假阳性，或表示淋病奈瑟氏球菌菌株缺乏porA假基因。尽管，到目前为止，仍旧没有关于淋病奈瑟氏球菌菌株缺乏porA假基因的报道。还令人感兴趣的是，注意到通过使用嵌套式扩增，我们能够检测cppB基因在样本中的存在，所述样本通过cppB-LC测定法检测为阴性，而通过NGpapLC测试为阳性。这说明该cppB-LC阴性结果没有发生，因为在该假定的淋病奈瑟氏球菌菌株中cppB基因的缺乏(数据未显示)。
总而言之，临床样本的结果显示NGpapLC和cppB-LC测定法具有相似的临床灵敏度和特异性，并且cppB-LC测定法可能事实上适合于用在我们人群中的尿液和生殖器拭子样本中。然而，这些结果与细菌组群的那些相反，这突出了cppB-LC测定法的局限。更显著地，该cppB-LC测定法不能检测7个淋病奈瑟氏球菌分离株。这显示，在我们的人群中，存在缺乏cppB基因的淋病奈瑟氏球菌菌株。更重要地，我们的测试算法可能产生假阴性结果；通过Cobas Amplicor测试为阳性的样本会被cppB-LC测定法错误地鉴定为假阳性。在该研究中，没有对淋病奈瑟氏球菌分离株进行随机选择，因此需要更多的测试来确定总的cppB-LC假阴性率。其它的研究已经显示缺乏cppB基因的这些分离株的发生率在澳大利亚是低的(Leslie等，2003，Commun Dis Intell.27373-9)。
然而，当使用cppB-LC测定法时，假阴性结果的可能性存在。与此相反，所述NGpapLC方法在本研究中正确地鉴定所测试的所有的淋病奈瑟氏球菌分离株。这说明NGpapLC测定法可能不易受由在我们当地淋病奈瑟氏球菌菌株中的porA假基因的缺乏所引起的假阴性结果的影响。因此，其应该提供与cppB-LC测定法相比的提高的临床灵敏度。
还证明所述NGpapLC测定法对于淋病奈瑟氏球菌的DNA具有高度特异性；当通过NGpapLC方法测试时，所有的非-淋球菌物种提供阴性结果。应该注意的是，我们经历了获得奈瑟氏球菌属物种的困难并且因此我们的细菌组群不包括所有已知的奈瑟氏球菌属物种，仅包含对于大多数物种的有限数量的分离株。因此，与其它奈瑟氏球菌属物种的交叉反应不能单独在这些结果的基础上被排除。然而，仅报道奈瑟氏球菌属porA基因存在于淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌中(Feavers&Maiden 1998，上文)，并且因此将与脑膜炎奈瑟氏球菌的交叉反应视为更相关的。在该研究中，我们测试了38株脑膜炎奈瑟氏球菌分离株，并且没有发现交叉反应。结果，当用在我们当地的样品群中时，我们确信该测试的特异性。
当从三种脑膜炎奈瑟氏球菌培养物种获得阳性结果时，用于细菌组群的cppB-LC结果提供了与使用cppB靶标相关的特异性问题的良好实例。然而，在当地脑膜炎奈瑟氏球菌分离株中的cppB基因的存在可能没有引起主要的特异性问题，如果测试不局限于尿液和生殖器拭子样本的话。到目前为止，没有关于在Cobas Amplicor测定法中产生假阳性结果的脑膜炎奈瑟氏球菌的报道，并且当开始通过Cobas Amplicor筛选时，这些分离株是阴性的。另一方面，已经发现在其它的奈瑟氏球菌属物种的分离株中的cppB基因，所述奈瑟氏球菌属物种包括灰色奈瑟氏球菌，其也与CobasAmplicor测定法交叉反应(Palmer等，2003，supra；Farrell，1999，上文)。此外，我们的研究仅检查了有限数量的奈瑟氏球菌属物种和菌株，因此与我们人群中的其它奈瑟氏球菌属物种的交叉反应的可能性不能被排除。
与淋病奈瑟氏球菌的确证测试的特异性有关的重要性还取决于样本部位。Cobas Amplicor的关键限制的一个是当在生殖器外部位上使用时，其特异性显著下降。具体而言，咽喉拭子是主要的问题，因为它们可以具有各种奈瑟氏球菌属物种并且因此提供假阳性交叉反应的更大的可能性。最近的研究(Leslie等，2003，上文)发现Cobas Amplicor淋病奈瑟氏球菌阳性结果的确证率从对于阴茎和尿道拭子的86.2％下降到对于口咽拭子的5.6％。应该注意的是，甚至当使用cppB-LC确证测定法时，获自咽喉拭子的真实阳性的数量可能比获自生殖器样本的那些低得多。这是因为在咽喉拭子中的多种奈瑟氏球菌属物种的存在增加了两种测定提供假阳性结果的机会；一个物种能够与筛选测定交叉反应，而另一个物种可能与确证测定交叉反应，因此从算法产生假阳性结果。我们相信由我们新的NGpapLC确证测定法提供的特异性可能提供在生殖器外部位的淋病奈瑟氏球菌的提高的检测。我们的目标是广泛评价NGpapLC测定法在多种样本类型上的使用，所述样本包括咽喉拭子。
该研究的结果显示porA假基因是PCR检测淋病奈瑟氏球菌的适合靶标。值得强调的是，porA基因以前是通过PCR检测脑膜炎奈瑟氏球菌的一般靶标。然而，其已经失去了吸引力，因为发现插入序列可能结合到一些脑膜炎奈瑟氏球菌分离株的porA基因中，给出假阴性结果(van der Ende等，1999，Infect Immun.672928-34；Newcombe等，1998，Mol Microbiol.30453-4；Jelfs等2000，Clin Diagn Lab.Immunol 7390-5)。
这些突变会有可能阻断PCR扩增或探针杂交，并因此阻止一些脑膜炎奈瑟氏球菌分离株的检测。所有的淋病奈瑟氏球菌分离株在该研究中被检测的事实说明插入序列可能未在淋病奈瑟氏球菌porA假基因中发现。然而，考虑到我们淋病奈瑟氏球菌分离株的选择不是随机的，可能包含插入序列的淋病奈瑟氏球菌分离株仅是在该研究中失去。或者，插入序列可以已经存在，但是由于其小的PCR产物大小(132bp)而没有影响NGpapLC测定；这样的小PCR产物大小可以减少序列在PCR引物靶标之间插入的可能性。我们的目标是进一步评价针对淋病奈瑟氏球菌分离株的延伸组群的NGpapLC测定法。
在整个说明书中，目标是描述本发明的优选实施方案而不将本发明局限于任何一个实施方案或具体的特征的集合。因此，本领域那些技术人员要理解的是，根据本公开内容，在不背离本发明范围的前提下，可以在例示的具体实施方案中作出各种改进和变化。
将本说明书参考的所有的专利和科技文献，算法和计算机程序全部内容并入本文作为参考。
表1：靶向淋病奈瑟氏球菌的porA假基因的NGpapLC引物和探针
aGenbank登记号AJ223448
表2：提高的靶向porA假基因的确证淋病奈瑟氏球菌的实时PCR测定
| N＝282 | Cobas Amplicor&cppB-LC测试算法阳性 | Cobas Amplicor&cppB-LC测试算法阴性 |
| NGpapLC阳性 | 79 | 1 |
| NGpapLC阴性 | 1 | 201* |
*在这些样本中的81个通过Cobas Amplicor测定证实为阳性，但是通过
cppB-LC测定证实为阴性
表3：所有的样本类型：PCR v培养物
| N＝557 | 培养物阳性 | 培养物阴性 |
| NGpapLC阳性 | 15 | 2* |
| NGpapLC阴性 | 0 | 540 |
*目前，没有可获得的测定法能够可靠地用于在这些样本上的差异分析。然而，这些样本通过cppB-LC也是阳性的(其还可以与其它的奈瑟氏球菌属物种交叉反应)。此外，这些样本提供在NGpapLC和cppB-LC测定法中可比较的Ct值。这说明通过这些测定检测的细菌DNA在大约相同的浓度上。总而言之，这些结果说明这些是真实的淋病奈瑟氏球菌阳性样本。
表4：宫颈拭子：PCR v培养物
| N＝216 | 培养物阳性 | 培养物阴性 |
| NGpapLC阳性 | 1 | 0 |
| NGpapLC阴性 | 0 | 215 |
表5：尿道拭子：PCR v培养物
| N＝184 | 培养物阳性 | 培养物阴性 |
| NGpapLC阳性 | 9 | 0 |
| NGpapLC阴性 | 0 | 175 |
表6：咽喉拭子：PCR v培养物
| N＝133 | 培养物阳性 | 培养物阴性 |
| NGpapLC阳性 | 1 | 1* |
| NGpapLC阴性 | 0 | 131 |
表7：肛门拭子：PCR v培养物
| N＝24 | 培养物阳性 | 培养物阴性 |
| NGpapLC阳性 | 4 | 1* |
| NGpapLC阴性 | 0 | 19 |
Claims (23)
1.一种或者多种寡核苷酸在制备用于确定个体是否被或已经被淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)感染的试剂的用途，其中所述的一种或者多种寡核苷酸能够与淋病奈瑟氏球菌的porA核酸杂交，但是不能够充分地与脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的porA核酸杂交从而不能检测所述脑膜炎奈瑟氏球菌的porA核酸，如果其存在于所述生物样品的话。
2.权利要求1的应用，其中所述一种或者多种寡核苷酸能够从存在于所述生物样品中的脑膜炎奈瑟氏球菌的porA核酸中区分所述淋病奈瑟氏球菌的分离的porA核酸。
3.权利要求2的应用，其中所述一种或者多种寡核苷酸能够从不同于除脑膜炎奈瑟氏球菌之外的另一种奈瑟氏球菌属物种区分所述淋病奈瑟氏球菌的porA核酸。
4.权利要求1的应用，所述一种或者多种寡核苷酸适合于在这样的条件下进行核酸序列扩增从而产生扩增产物，所述条件有利于所述淋病奈瑟氏球菌的分离的porA核酸的扩增。
5.权利要求4的应用，其中所述的扩增产物对应于淋病奈瑟氏球菌porA假基因的片段。
6.权利要求5的应用，其中的核酸序列扩增在这样的条件下进行，所述条件促进将所述淋病奈瑟氏球菌分离的porA核酸扩增到可检测得到的水平，而不促进将所述脑膜炎奈瑟氏球菌的porA核酸扩增到可检测得到的水平。
7.权利要求6的应用，其中所述一种或者多种寡核苷酸是PCR引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
8.权利要求4的应用，其中所述的一种或者多种寡核苷酸含有通过探针杂交而用于检测所述扩增产物的探针。
9.权利要求8的应用，其中所述探针的核苷酸序列选自由下列各项组成的组：SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9。
10.权利要求9的应用，其中所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
11.权利要求8的应用，其中使用荧光共振能量转移(FRET)可检测所述扩增产物。
12.一种寡核苷酸，其能够杂交于淋病奈瑟氏球菌的porA核酸，足以能够检测所述porA核酸，但是所述寡核苷酸不能够充分地与脑膜炎奈瑟氏球菌的porA核酸杂交而不能检测所述脑膜炎奈瑟氏球菌的porA核酸。
13.权利要求12的寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸不能够杂交于另一个不同于脑膜炎淋病奈瑟氏球菌的奈瑟氏球菌属物种的porA核酸。
14.权利要求13的寡核苷酸，其核苷酸序列选自由下列各项组成的组：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9。
15.一种检测淋病奈瑟氏球菌的porA核酸的试剂盒，所述试剂盒包括按照权利要求12的一种或多种寡核苷酸和DNA聚合酶和/或一种或多种检测试剂。
16.权利要求15的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸的核苷酸序列选自由下列各项组成的组：SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ IDNO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
18.权利要求15的试剂盒，其还包括有利于淋病奈瑟氏球菌，porA核酸扩增的一种或多种引物。
19.权利要求18的试剂盒，其中所述一种或多种引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
20.权利要求18的试剂盒，用于通过探针杂交和荧光共振能量转移(FRET)来检测扩增产物，所述试剂盒包括具有供体荧光团的SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列和具有受体荧光团的SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
21.一种核酸阵列，所述阵列包括按照权利要求12的一种或多种寡核苷酸，所述寡核苷酸固定、偶联、结合、浸透于基底，或以其它形式与基底联系。
22.按照权利要求21的核酸阵列，其中所述一种或多种寡核苷酸的核苷酸序列选自由下列各项组成的组：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ IDNO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9。
23.权利要求22的核酸阵列，其中所述一种或多种寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
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