JP2011522533A - ヘリコバクター・ピロリのビルレント菌株の検出のための分子診断キット - Google Patents

ヘリコバクター・ピロリのビルレント菌株の検出のための分子診断キット Download PDF

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Abstract

ヘリコバクター・ピロリ（rDNA16S Hpy）の4個の遺伝子、即ち、1個の識別遺伝子、および3個のビルレンス遺伝子（cagA、vacAm1、dupA）を同時に検出できる製品の形態にあるキットおよび方法が開示される。さらに、本キットではDNAの抽出の質を判定するプライマーの関連について考察されている（Eub遺伝子）。

Description

背景
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）による感染は管理費用が膨大であるため、公衆衛生上重大な問題である。 この状況から、本病態に関連する危険因子を検出するツールが必要となっている。しかしながら現時点で市販されている、ビルレント菌株検出のための微生物学的検査法は存在しない。
現在、ヘリコバクター・ピロリを検出するための信頼できる検査ツールがないため、本細菌に対する除菌治療は定性法にのみ基づいており、ヘリコバクター・ピロリのビルレンスを決定する治療や療法は存在していない。
現存の方法は微生物の有無を示すに過ぎず、感染菌株の性質または特性を明らかにするものではない。その他の重要な局面は、小児集団における内視鏡検査は非常に散発的に行われるため、この年齢群についての感染データがほとんどないことである。
世界的な報告によると、除菌療法は、抗菌剤耐性菌株の出現、および治療の選択に先立つ感受性試験が行われないことを含む様々な原因によって20％〜80％の症例で失敗する。このように説明される状況は、患者および医療制度にとって高い医療費がかかることを意味する。感染菌株の病原性ポテンシャルに関する明らかな情報がないことにより、患者の回復が妨げられるのである。
酵素ウレアーゼは尿素、水素イオン、および水の存在下においてアンモニアおよび重炭酸塩の生成を触媒し、それにより本細菌を取り囲む水素イオンを中和し、胃上皮における細菌の生存を可能にしていることから、本細菌は従来的に、胃粘膜におけるコロニー形成を可能にする酵素ウレアーゼの反応による属レベルでの同定が行われている（Hazell et al, 1986; Mobley et al, 1988; Megraud et al, 1989）。
ヘリコバクター・ピロリは様々なビルレンス因子を有し、それにより胃粘膜におけるコロニー形成を可能にし、自身を宿主の生体防御機構から免れさせている。これらの因子の幾つかは種に特徴的なものであり、その他の因子の存在は変動し得るものである。全ての菌株に存在する、従来的に知られるビルレンス因子は、ウレアーゼ、らせん構造、鞭毛およびアドヘシン、そしてエンドトキシン（LPS）である；さらに、酵素アルギナーゼが免疫応答の回避に関与している。細菌によって発現されるアドヘシンは上皮細胞からの特定の糖類を認識する。最も広く研究されているのはN-アセチルノイラミニラクトースヘマグルチニンおよびタンパク質BabA（血液型抗原結合アドヘシン）であり、後者は胃粘膜におけるLewis LeB群抗原への細菌の結合を可能にする。
本細菌によるコロニー形成は、粘液を分解し上皮表面の疎水性を変化させるリパーゼ（ムチナーゼ）のような特定のタンパク質の存在によって促進される。これにより胃粘膜における移動が可能になり、細菌性プロテアーゼによって宿主の免疫グロブリンが加水分解される（Smoot, 1997）。同時に、分泌型IgAの特異的なプロテアーゼの存在によって、さらに、LPSの有する免疫原性が低いことによって、宿主による有効な免疫反応が妨げられ、本細菌は免疫反応を回避している（Muotiala et al, 1992）。
ヘリコバクター・ピロリのどの菌株がより病原性が高いか、そしてそれらと感染の臨床症状の間に関係があるのかどうかを確証するために、様々な遺伝子について研究が行われている。当技術分野においては、ビルレンスはそのほとんどが病原性アイランド（PAI）に存在する多数の遺伝子に依存することが知られている。最も広く研究されている遺伝子はvacA およびcagA、iceA、babA2およびdupAである（Zambon et al, 2003; Faundez et al, 2002; Censini et al, 1996）。
著者らの何人かによってはこれらのマーカーの組み合わせを解析したもの、例えばvacA とcagAを組み合わせた解析、が提示されている。これに関して、vacA s1型のシグナル配列を有するヘリコバクター・ピロリ菌株がより重大な胃の炎症や消化性潰瘍疾患と関わっている一方、vacA m1型中間領域アレルはより重症の上皮損傷と関連している（Pan et al, 1999）。その他の研究者らは、消化性潰瘍を有する患者の識別について、cagAおよびiceA 遺伝子型がマーカーの優れた組み合わせとなることを示唆している（Faundez et al, 2002）。
ヘリコバクター・ピロリの病原性に関与するとされている新たな遺伝子は、アドヘシンの合成を活性化および不活性化させるタンパク質BabA1およびBabA2をコードする遺伝子である（Gerhard et al, 1996）。
世界中の主要データベースおよび特許事務所において検索を行った。本発明に非常に密接に関連する文献について以下の節にて述べる。
ヘリコバクター・ピロリを検出するために設計されたMWG Biotech , Incのマイクロアレイ技術に基づく製品が市販されている。本製品はヘリコバクター・ピロリ菌株J99および26695を認識するための1877個のオリゴヌクレオチドから構成される。これらのオリゴヌクレオチドのうち1307個は双方の菌株において一致し、ヘリコバクター・ピロリ菌株26695に特異的な295個のオリゴヌクレオチドおよびヘリコバクター・ピロリ菌株J99に特異的な278個のオリゴヌクレオチドが存在する。関連発明の特許出願は存在しない。
Invitek社により、ヘリコバクター・ピロリによる活動性の感染の有無を決定できる、糞便（deposiciones）中の本細菌の遺伝子型cagAを検出するためのINVIGENEE（登録商標）という商品であるキットが開発された。本装置は発明の特許出願に関連するものではない。本装置では微生物の存在を確証できるにすぎず、そのビルレンスが確証されるものではない。
Maxim Biotech, Inc社の「ヘリコバクター・ピロリの検出のためのMPCRキット」およびMP-70080という製品は、マルチプルPCR技術を用いて開発された。本キットはマルチプルPCRを用いてヘリコバクター・ピロリを迅速に検出するよう設計されている。キットに含まれるプライマーにより遺伝子cagA（358 bp）、flagellin（152 bp）、ureaC（315 bp）およびARNr 16S（110 pb）が増幅される。酵素TaqポリメラーゼおよびdNTPを例外として、本製品は増幅に必要な全ての試薬を含む。本キットは実施用緩衝液、各々の正の対照、分子量マーカー、DNアーゼを含有しない水および特異的なプライマーを含む。このキットで使用されるプライマーも遺伝子も本発明者らの発明においては使用されない。
本発明に関連する発明特許出願は64件存在する。本ヘリコバクター・ピロリ検出キットに非常に密接に関連する出願および既存の特許についての詳細な情報は、以下の通りである：
ウレアーゼの検出に関するキットに関連する発明
（表１）ヘリコバクター・ピロリ検出キットについての関連発明
Figure 2011522533
Figure 2011522533
Figure 2011522533
Figure 2011522533
Figure 2011522533
Figure 2011522533
＊与えられた情報なし
発明された本キットはビルレンスと関連する一般的な遺伝子を検出するため、本発明は他の取り組みとは異なるものである。市販されているキットおよびその他の関連発明は一般に、pHインジケーターの呈色反応を用いて可視化される陽性検出テストを使用して（ヘリコバクター属に特徴的な）酵素ウレアーゼの存在を検出するものであり、それがヘリコバクター・ピロリ菌株であることを必ずしも示すものではなく、潜在的に病原性を有する菌株である可能性を示すものではなおさらない。
さらに、生検中に存在する例えばH.helmannii種のようなその他のヘリコバクターもヘリコバクター属に特徴的な陽性のウレアーゼ反応を生じさせるため、既存のキットのほとんどは特異的なものではない。使用される他のキットは血清中の細菌に対する抗体の検出に基づくものである。
本発明者らの検索から、密接に関連する発明の特許出願が以下のように7件あることが示される：
JP2006284567（特許文献１）, KR20030031243（特許文献２）, WO2005108995（特許文献３）, WO2004111265（特許文献４）, WO0029618（特許文献５）, WO9949890 （特許文献６）およびWO9853082（特許文献７）。これらの発明特許出願のうち最も重要なのは、本発明に直接関連する特許KR20030031243およびWO2005108995であり、それは該取り組みがヘリコバクター・ピロリの毒性を遺伝子レベルで決定しているためである。しかし、これらの特許のいずれも、多くても1つの識別配列には関連するが、2つ以上ビルレンス遺伝子には関連していない、またはそれらは実施が難しい技術となっている。
提案される本発明と同様の特性を有する取り組みは見当たらず、なおもより重要なことに、上記の取り組みの特徴は、その遺伝子配列が本発明において主張されようとしている配列とは関連のない株から得られていることである。
JP2006284567 KR20030031243 WO2005108995 WO2004111265 WO0029618 WO9949890 WO9853082
発明の簡単な説明
本分子キットはそれが認識する遺伝子においても、それが必要とする試薬においても、既存の取り組みとは異なっている。ビルレンスに関連する遺伝子を同定するための既存の取り組みでは、それらの遺伝子を同時に増幅させる最適条件を見出すのにより長い時間がかかる。
本発明とは異なり、他の発明には、生検サンプルのDNA濃度によっては多数の遺伝子を同時に検出できないことがあるという不利益がある。様々なビルレンス因子を検出する既知のキットは存在しておらず、そのため既存のキットに係る設計および技術における革新が本発明によって提供される。本発明では、より重症の病態に関連するヘリコバクター・ピロリの遺伝子発現パターンを解明することが可能であり、それは過去の取り組みのいずれにも含まれなかった局面である。
ビルレンスおよび種に関連する遺伝子を同時に検出するための本分子キットにより、慢性のヘリコバクター・ピロリ感染に起因する重症の病態に関わる、より強いコロニー形成能およびヒトへの感染力を持ったヘリコバクター・ピロリ菌株の認識が可能になる。本キットにより、病原性ポテンシャルがより高いヘリコバクター・ピロリ菌株の迅速かつ効率のよい検出が可能になる。
特定の菌株に由来するヘリコバクター・ピロリ遺伝子を検出する市販の製品は現時点で存在しないため、そしてさらに重要なことに、わずかな既存の製品はビルレンスに関連する遺伝子を最大でも1つだけ含み、そして特異性に関連する遺伝子をもう1つ含むようなものなので、発明された本製品は既存の診断法とは明らかに異なり、より優れたものである。
発明の説明
本発明は、ヒトから採取されたサンプルを必要とする、ヘリコバクター・ピロリによる感染を診断するためのキットに関連する。続いて、本キットは予め確立されたプロトコールにおいて適用される。
本発明のキットは、ヘリコバクター・ピロリの遺伝子検出のために考え出されている。本取り組みは、特異的な配列と関連させて、これらの微生物の多数の異なるビルレンス遺伝子の存在を決定するものである。さらに、診断のために多数のビルレンス遺伝子および識別遺伝子に同時に関連する既存の取り組みはない。その目的、即ちこの微生物を検出するという目的に関して同様の他の技術はあるとしても、これらの微生物の多数の異なるビルレンス遺伝子の存在を決定することを目指す技術はほとんどない。
その全てが本発明において開示される特異的な配列に関連する識別遺伝子およびビルレンス遺伝子に診断のために同時に関与するような既存の取り組みはない。
本キットの重要な利点は、Taqポリメラーゼ、dNTP、実施用緩衝液、各々の正の対照、分子量マーカー、特異的プライマーおよびDNアーゼを含有しない水のような、その最適な実行のための全ての要素を含むということである。さらに、それはDNAの抽出に必要なプロトコールを提供する。これらは類似の発明においては検討されていない、卓越した価値のある、本取り組みの革新的な局面である。
当技術分野においては、様々なヘリコバクター・ピロリのビルレンス遺伝子を検出すると同時にそのヘリコバクター・ピロリ種に特徴的な遺伝子を認識するような製品はない。さらに加えれば、その種が有する最大でも2つの遺伝子を認識するもので、その適用が特定の菌株の認識を目指すに過ぎないようなキットは数多くの発明によって主張されている。本発明の驚くべきかつ意外なことは、選択された遺伝子を組み合わせる点である。さらに、本キットは世界中のどこにおいても、また多様なタイプのサンプルに適用されるように設計されている。
本キットは非常に広い範囲で分布する菌株を検出するために使用できるという特徴を有し、ビルレンスの指標およびその範囲を決定できる場について本発明の適用を拡げることが可能である。本発明においては、発生率の高いヘリコバクター・ピロリ遺伝子群を用いて研究が行われ、地理的に広い領域の代表的な菌株の配列に基づきキットが作製された。したがって、本取り組みは様々なエスニックグループにとって著しく意義深く、今日まで解決されていないままの、病原性が高いヘリコバクター・ピロリの診断における古くからの問題に対応するものである。本技術は広範に適用され得るような解決策を編み出すために過去の障害を克服したものである。
本技術のその他の有益な局面は、その究極の信頼性である；一貫したかつ確実な結果が得られる確率は、疑いなく非常に高い。これは分子ベースのいかなる検査法またはキットでも有する属性であるが、この場合、複製する遺伝子配列の厳密な選択が正確な結果を得るための決定要因であると指摘するのは全く正しく、実際にこれらの多くの遺伝子配列を用いることによって本技術は他の検査法よりも明らかに有益なものとなっている。
さらに、同時に評価されることによってヘリコバクター・ピロリのビルレンスの根拠が明らかになる、多数の遺伝子に関与する検出であるため、その結果が予想外に正確であるという利益を本取り組みは提供する。したがって、本解析的診断技術は既存の発明に比してはるかに優れている。
本発明に特有のその他の特徴は、その臨床的妥当性である；即ち、本DNAキットが臨床的実用において疾患のリスクを予測し、診断に与える確実性である。本キットの臨床的妥当性によって、並外れた感度を与える試薬を含む検査法が提供される。正の予測値、言い換えれば本検査について陽性の結果を有する個体が関連病態を進行させる確率、そして本ツールに関する負の予測値、即ち陰性の結果を有する個体がその疾患を進行させない確率は、本キットが検討する1つの局面で、類似の発明においては検討されてこなかったものであり、再度それが既存のキットより明らかに優れている点である。驚くべきことに、本キットはヘリコバクター・ピロリ菌株の存在のみならず、細菌が有するビルレンス遺伝子をも検出することができる。ヘリコバクター・ピロリのビルレンス関連遺伝子：cagA、vacAm1、およびdupAの同時の検出に基づき、より高い病原性ポテンシャルを有する菌株の認識を可能にする、これら全ての利点を備えた分子キットが開発されたのである。
本生物体の検出のための手順は、本微生物またはその遺伝的材料の一部が認められる患者からのサンプルについて実行される。非常に高い病原性ポテンシャルを有するヘリコバクター・ピロリ菌株が迅速かつ効果的に検出される、腸管からの生検、便（heces)、血液、血清、呼気などを用いることが好ましい。この新規のツールにより、ヘリコバクター・ピロリに感染した患者の治療管理に関する決定を医師が下すことが可能になる。
従来からあるヘリコバクター・ピロリの微生物学的分子診断法は概して、職員が超音波検査、内視鏡および組織病理学における診断手順について熟練していなければならない不利益を伴っている。しかしながら本キットは使用が簡便であるため、これらの技術的な困難はない。臨床現場への本診断キットの導入は、特に小児における病原性菌株への感染の早期の検出を可能にするため、さらなる損傷に至る感染の進行を予防でき、健康の保持に役立つ。
既存のほとんどのキットでは解決されていない、本発明によって包含されるその他の局面は、菌株のビルレンスの決定である。ほとんどの関連発明は臨床的使用のために設計されており、予防のためのものではない。本発明は、当技術分野において常に存在しているビルレント菌株の検出という問題を解決するものである。とりわけ、ビルレント微生物に直接関連する病気への罹患に関わる臨床症状を個体が有していない場合でさえも、本キットではビルレント菌株の検出ができる。
本発明は、任意の臨床的診断検査室において実行することができ、基礎的な職員の訓練および簡単な設備のみを要するものである。本キットは微生物学的診断検査室における従来的な培養法に対する真の代替法であり、時間および材料を節約できる利点がある。それは、非常に高い病原性ポテンシャルを有するヘリコバクター・ピロリ菌株の迅速な認識を可能にするため、現在市販されている技術よりも多くの情報を医師に提供する。
病原性菌株に直面していることを知ることで、重症の病気の出現を予防するために、かつその個体の健康を回復するために適切な行動をとることも可能になり、それによりヘリコバクター・ピロリに関連する胃十二指腸の病態を有する集団の生活の質（QOL）が改善される。
本キットのその他の利点は、リアルタイムPCR装置での使用に適合可能なことであり、それにより、DNAが限界レベルにまで希釈されていても、DNA 3 pgのように少ない量でも検出されるため、より高い感度が保証される。さらに、本技術では結果を得るためにかかる時間が少なからず短縮される。
本発明のその他の操作上の利点は、マルチプルPCRによって実施できることである。マルチプルPCRを使用する唯一の既存の関連発明では幾つかの新しい試薬の添加が必要とされる；しかし、本発明はヌクレアーゼを含まない蒸留水のみを必要とするか、またはどちらの形態で提供されてもよい。さらに、本発明における本キットにより検出されるビルレンス遺伝子は発生率の高い遺伝子である。
従来的な培養法では結果を得るために少なくとも1週間は必要であるため、かかる時間は提案される本分子検査法によって短縮される。したがって本技術は病原性ヘリコバクター・ピロリを診断するための現時点における最良の選択肢である。本発明は、ヘリコバクター・ピロリによって引き起こされる病態の診断および治療に重大な影響を与えることにより、人々の健康を改善し、胃十二指腸のより重症の病態に至る慢性的なヘリコバクター・ピロリ感染の進行を遅らせて、人々の生活の質（QOL）を向上させることが可能であり、短期的、中期的、そして長期的な利点を有している。
非常に強いコロニー形成能、慢性感染力、およびヒトの胃粘膜に対する損傷能を有する菌株の認識を可能にする、集団において一般的なヘリコバクター・ピロリにおけるビルレンス関連遺伝子（cagA、vacAm1およびdupA）を同時に検出するための分子キットの開発は、以前には主張されていない。
本発明はここで、好ましくは胃十二指腸の異なる病態を有する胃の生検、または本微生物に関連する症状のない胃の生検のような異なるサンプル中に存在するヘリコバクター・ピロリ菌株の有病率を決定することを可能にする。さらに、本発明では、ヘリコバクター・ピロリを検出するには十分である、極微の濃度のDNA（1 ng/μl）が同定される。提案される本取り組みでは、便、液体または胃の生検のサンプル中に存在するヘリコバクター・ピロリ菌株における、2つまたはそれ以上のビルレンス関連遺伝子の同時の増幅についての最適条件が決定される。
今日まで、除菌の成功率を上げるためにヘリコバクター・ピロリの除菌療法のタイミングおよび最も適した療法の選択に関して医師が決定を行うために、利用可能な細菌学的検査の助けが得られてこなかった。例えば胃のサンプルに基づいて細菌を検出するために、医師はウレアーゼ検査を使用する。しかし、陽性反応はヘリコバクター属の存在を示すに過ぎない。それは種特異的ではなく、病原性ポテンシャルを示すものではなおさらない。
ハイリスク集団を識別するために有効かつ利用可能な方法がないこと、および早期の診断のための有用な生物学的マーカーがないことが、本問題の解決において妥当な検討事項であり、これらの検討事項は本文書において開示される解決法に考慮されている。
マルチプルPCRの使用により、サンプルに基づいた、より高い病原性ポテンシャルを有するヘリコバクター・ピロリ菌株の迅速かつ効率の良い検出が可能になる。
発明の詳細な説明
本発明は具体的に、多数の解析段階を用いてサンプル中に存在する微生物を同定し、さらにその特定の菌株のビルレンスを決定することを可能にする工程および製品を意図する。
工程を行う順序は以下の通りである：
一旦サンプルが得られたら、抽出されるDNAの質および量について優れた結果を確証するために、キットの特定の推奨に従ってDNAを抽出する。胃の生検、純培養、体液または便からの総DNAとは、サンプルのプロテイナーゼKによる処理およびそれに続くアルコール沈殿（エタノール-クロロホルムまたはイソプロパノールを使用）に基づく総称である。
マルチプルPCRによるヘリコバクター・ピロリ菌株の遺伝子型解析は、様々な遺伝子の同時の増幅により行われ、そのため、適切な量の水によって15〜30μlの範囲の最終容量に再構成されなければならない、増幅に必要な全ての試薬（dNTP、Taqポリメラーゼ、特異的プライマー、反応緩衝液、MgCl2）を含む凍結乾燥PCR用スフェアを用いる。必要とされるハイブリダイゼーション温度範囲は40〜55℃であり、30〜45 PCRサイクルが使用される。初期条件として、既製のPCRビーズ（Amersham Biosciences(登録商標)）を（予め抽出された）DNA が0.1〜10 ng/μlの範囲となるように使用する。
最後に、以下のプログラムに従い、プログラム可能な対照を用いてサーマルサイクラーにおいて増幅を実行する：
・手順が意味するのは、80〜98℃の温度範囲にて1〜15分間の初期変性、
・その後、同じ温度範囲を用いた0.1〜3分間の軽度の変性を行う、
・続いて、45〜60℃の温度範囲にて1〜70秒間、ハイブリダイゼーションを実行する、
・65〜75℃の温度にて60秒間、初期伸長段階を実行する、
・初期伸長と同じ温度範囲にて3〜10分間、最終伸長段階を実行する。
本キットは、全ての段階、特に増幅中に使用できる負の対照（ヒトゲノムDNA）を含む。それはまた、鋳型としてのDNA配列である正の対照（ヘリコバクター・ピロリ菌株ATCC 43504のDNA）をも含む；これらの対照は並行して使用される。3％（w/v）アガロースゲルを用いた電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（0.5μg/μl、またはsybr green、図2）によって染色してこの増幅産物を解析する。使用される正の対照は、ヘリコバクター・ピロリ ATCC 43504対照菌株に由来するゲノムDNAからの遺伝子cagAおよびvacAm1についてのマルチプルPCR増幅パターンである。3％アガロースゲルを用いた電気泳動を行い、その後エチジウムブロマイドによって染色し、UVトランスイルミネーターによって可視化して、増幅された断片について解析する。
望ましい全ての遺伝子を増幅するにはDNAの含有量が十分でない場合、重複培養サンプルを使用することによって本発明ではこの問題を解決し、それはこの特定のプロトコールにおいて検討された局面である。それにも関わらず本発明では、少量のDNA（1 ng/μl）でも、何も問題なく、同時にまたは別々に様々な遺伝子を増幅させるために十分であることが証明される。
本発明は、5個の遺伝子：1個のヘリコバクター・ピロリ識別遺伝子、3個のビルレンス遺伝子；vacAm1、cagAおよびdupA、ならびにDNA抽出の質を判定する1組のプライマー（真正細菌ユニバーサル遺伝子16-23S）を同時に検出できる、既製の製品であるキットを含む。
本発明は、試薬および段階を検討して以下の要素を有するキットおよび手順をも含む：
I．サンプルからDNAを抽出する段階。これは処理されるサンプルのタイプに従って任意である。
II．試薬およびマルチプルPCRを用いた増幅段階。処理された結果純粋なDNAが得られた全てのサンプルは本段階に供される。
本キットは、マルチプルPCR技術を実行するための増幅試薬、ならびに正および負の対照を含む。
PCR試薬
反応緩衝液としてpH域8.5〜9.5のTris-HCl、濃度範囲480〜560 mMのKCl、および濃度範囲10〜20 mMのMgCl2、400〜6000Uの範囲の耐熱性酵素Taqポリメラーゼ、MgCl2+、dNTP（15〜30mMの濃度範囲の、4種のジヌクレオチドdATP、dCTP、dGTP、dTTPを含む2’-デオキシヌクレオシド5’-三リン酸）、および特異的プライマー（表2を参照のこと）。
これら全ての試薬は本キットにおいては2つの形態にて認められ得る：脱水、無菌かつ凍結乾燥、または液体かつ無菌。任意で、本キットは分子生物学的検査法に必要とされる質のH2Oを含み得る。本キットは、ATCC 43504のヘリコバクター・ピロリ菌株の純培養およびヒトゲノムの各々から得られた、正および負のDNA対照をも含む。
（表２）ヘリコバクター・ピロリのビルレンス遺伝子および認識遺伝子の検出のために使用されるプライマーの配列一覧
Figure 2011522533
Figure 2011522533
III．検出された遺伝子の可視化段階およびデータの解釈
本段階には、特定の分子量マーカーに加えて本キットに含まれ得る選択肢である、3％アガロースゲルの調製が含まれる。
例えばエチジウムブロマイドのようなDNAの示差的染色を生み出す試薬を用いてサンプルの可視化を実行し、その後UV光に曝露する。本キットはDNA染色法を指示するものであり、本発明について染色法は非限定的であるため、エチジウムブロマイドまたはsybr greenもしくはその類似物のような代替物を用いたDNA染色の他の方法を含み得る。さらに、本キットは簡単な利用者用マニュアルを含む。
実施例
手順
本キットは少なくとも4個の遺伝子、即ち1個のヘリコバクター・ピロリ識別遺伝子ならびに3個のビルレンス遺伝子vacAm1、cagAおよびdupAを同時に検出できる。さらに、本キットはDNA抽出の質を判定するプライマーに関連する。本キットはヘリコバクター・ピロリのサンプルおよび／または純培養からの正しいDNA抽出に必要なプロトコールを備えている。
本キットは、無菌凍結乾燥スフェアまたは無菌液を使用する、マルチプルPCR解析に必要な試薬、および分子量マーカーを備え、ゲルを作製するためのアガロースおよび例えばエチジウムブロマイドまたはsybr greenのような遺伝子の可視化のための染色試薬を任意で含み得る。
一般的な手順については、本発明のキットの使用の一般的な体系を示す図1において認められ、その内容は以下の通りである：
・ラインAはDNAを抽出すべきサンプルを使用する場合に従うべき手順であり、例えばGBは胃の生検である、
・EはDNA抽出段階である、
・ラインBは純粋なヘリコバクター・ピロリ菌株が単離された場合の、同じ手順の応用である、
・DNAはヘリコバクター・ピロリを含むサンプルから抽出されたDNAである、
・マルチプルPCRはサンプルがマルチプルPCRに供される段階である。本段階は胃の生検サンプル、糞便からのDNAの単離を通して得られたサンプル、または直接単離された細菌からDNAが得られたサンプルに共通のものである。本段階の目的はヘリコバクター・ピロリビルレンス遺伝子の同定および検出である、
・可視化は、アガロースゲル電気泳動を用い、その後染色および結果の解釈を行って結果を得る工程の最終段階である。
実施例1：胃の生検サンプルへの本キットの適用
本実施例は技術を限定するものではなく、開発された本キットの特定の適用であるに過ぎない。
サンプル：
胃十二指腸の問題について医師の診察を受けた26例の患者の胃の幽門洞および胃体部からの56個の生検について解析した。ヘリコバクター・ピロリ菌株ATCC 43504、ATCC 25695および96.978のサンプルを正の対照として使用し、ヒトゲノムDNAのサンプルを負の対照として使用した。
1．最初のDNA抽出段階およびサブステージ：
提案される本キットにおいて利用可能な、以下に説明される試薬を用いて、DNAの抽出を実行した：溶解緩衝液（TrisHCl 10 mM、EDTA 1mM、SDS 10％）；プロテイナーゼK（20 mg/ml）；CTAB/NaCl溶液；クロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）；フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）；エタノールおよびTE緩衝液。解析した生検のうち50個を試験に含んだ；ヘリコバクター・ピロリ培養からの純粋な単離物からMazurier et al, (1992)の方法を用いてDNAを抽出したその他のサンプルは対照として使用した。ヒトゲノムDNAを負の対照として使用した。
2．第二段階：マルチプルPCRを用いたヘリコバクター・ピロリ遺伝子の増幅：
本発明の遺伝子型解析においては、PCR緩衝液10×（100 mM、pH 8.3のTris-HCl、500 mMのKClおよび15 mM のMgCl2）、濃度2.5U/μlのTaqポリメラーゼ、dNTP（10mMの、4種のジヌクレオチドdATP、dCTP、dGTP、dTTPを含む2’-デオキシヌクレオシド5’-三リン酸)、MgCl2 (100 mM)および特異的なプライマー (10 pmol/l)を含む凍結乾燥PCRスフェア（Lyophilised Pure Taq ready-to-go PCR Beads, Amersham, Pharmacia Biotech）を使ったマルチプルPCRを用いてヘリコバクター・ピロリ菌株のDNAの増幅を行い、ヘリコバクター・ピロリ識別遺伝子16S DNAr、質判定遺伝子DNAr16S EUBならびにビルレンス遺伝子vacAm1、dupAおよびcagAを増幅させた。これら全ての試薬はヌクレアーゼを含まない水によって最終容量15μlに再構成した；予め抽出しておいたDNA5μlを混合物に加えた。ハイブリダイゼーション温度は50〜74℃の範囲で変化させ、39サイクルの増幅を行った。
3．第三段階：増幅産物の可視化およびデータの解釈：
3％アガロースゲルを用いた電気泳動を70 ボルト／秒で45分間行って増幅産物を解析し、100 bpごとの12個のバンドのプロフィールを提供する、制限酵素HindIIIによって切断されたラムダファージDNAからなる分子量マーカーと比較した。染色にはエチジウムブロマイド（0.5 μg/ml）を使用し、UV光に曝露することによって可視化を行った。最後に写真を撮った。得られた結果は図2において示される。
図2において認められるように、本キットによって検出されるべき遺伝子については全ての場合において同時に正の増幅が得られた。患者の組織病理診断がより重篤な場合には、本発明の本キットにより関連遺伝子の少なくとも2つが検出された。本キットの適用後、ある胃十二指腸の病態を示している患者はその胃十二指腸のサンプルにおいてビルレンス遺伝子が提示される患者であると結論づけられた；同じ試験においてこれらの遺伝子が存在しない他のサンプルはこの病態を示さない。
実施例2：本発明と市販されているキットとの比較
本発明者らの技術を市販されている代替のキットMPCRキットH.pylori；Cat No. MP-700081と比較した。後者は以下に説明されるように、結果に関して著しい相違を示した。
1）それは胃の生検および／またはヘリコバクター・ピロリの培養からDNAの抽出を行うのに必要な試薬または手順を含まない。
2）それは試薬TaqポリメラーゼおよびdNTPを提供しないので、キットの利用者は事前にそれらを準備しなければならない。さらに、それが含む試薬は無菌、液体の形態にあり、温度変化によって活性を失いやすい（それらは-20℃で保管および運搬されなければならない）。本発明者らの発明は選択できる2つのタイプの形式：無菌凍結乾燥ビーズ（完全に安定であり、環境温度において保管および運搬される）または無菌液体を含む。
3) MPCRキットH.pylori；Cat No. MP-700081は、国際的な文献での報告によるとヘリコバクター・ピロリに独占的ではない遺伝子ureAを検出する。即ち、前述されるキットでは1個のビルレンス遺伝子（cagA）を検出するに過ぎないが、一方、本発明者らによって提案される本発明は少なくとも3個のビルレンス遺伝子を含む。
4)本発明者らの発明とは異なり、それは負の対照を提供しない。
5) 本発明者らの技術は任意で、可視化および結果の解釈のための試薬および従うべき手順を含む。

Claims (29)

  1. 手順が以下の段階を含む、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）菌株のビルレンスを検出するための手順およびキット：
    （a）DNA抽出段階、
    （b）表1において図式化されるプライマーを用いたマルチプルPCRによる配列の増幅段階、
    （c）可視化およびデータの解釈を行う段階。
  2. DNAの抽出段階が以下の相から構成される、請求項1記載の、ヘリコバクター・ピロリ菌株のビルレンスを検出するための手順およびキット：
    i．細胞溶解相、
    ii．DNAの調製相、
    iii．DNAの回収相。
  3. DNAの抽出段階、具体的には細胞溶解相において、タンポン（tampon）、プロテイナーゼKおよびCTAB/NaCl溶液が使用される、請求項1および2記載の、ヘリコバクター・ピロリ菌株のビルレンスを検出するための手順およびキット。
  4. DNAの抽出段階において、具体的にはDNAの調製相が、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合物を用いて、またはフェノール、クロロホルムおよびイソアミルアルコールの混合物を用いて行われる、請求項1および2記載の、ヘリコバクター・ピロリ菌株のビルレンスを検出するための手順およびキット。
  5. DNAの抽出段階、具体的にはDNAの回収相において、以下のプライマーを用いて関心対象の配列の増幅が行われる、請求項1および2記載の、ヘリコバクター・ピロリ菌株のビルレンスを検出するための手順およびキット：
    a．ヘリコバクター・ピロリ識別遺伝子16 DNAr H. pylori：
    Figure 2011522533
    b．ビルレンス遺伝子：
    Figure 2011522533
    c．DNA質判定遺伝子16S DNAr Eub：
    Figure 2011522533
    。
  6. 該手順で正および負のDNA抽出対照を使用する、請求項1記載の、ヘリコバクター・ピロリ菌株のビルレンスを検出するための手順およびキット。
  7. 正のDNA抽出対照がヘリコバクター・ピロリ ATCC 43504であり、負のDNA抽出対照がヒトゲノムである、請求項1記載の、ヘリコバクター・ピロリ菌株のビルレンスを検出するための手順およびキット。
  8. 可視化段階のために、1.2〜4％の濃度範囲のアガロースゲルを使用しなければならない、請求項1記載の、ヘリコバクター・ピロリ菌株のビルレンスを検出するための手順およびキット。
  9. 対照、任意で以下に加え、増幅試薬および適切なプライマーを含む、請求項1記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット：
    a．検出試薬およびデータの解釈、
    b．細胞溶解試薬、
    c．沈殿試薬。
  10. 増幅試薬が以下の要素を含む、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット：
    a．ヘリコバクター・ピロリについて特異的なプライマーを含むマルチプルPCR試薬、
    b．関心対象の配列の増幅対照。
  11. 増幅試薬、具体的にはマルチプルPCRに使用される試薬が以下である、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット：
    a．反応緩衝液；
    b．耐熱性酵素Taqポリメラーゼ；
    c．ヌクレオチド；
    d．特異的なプライマー、ヘリコバクター・ピロリ識別遺伝子16 DNAr H.pylori：
    Figure 2011522533
    ；
    e．ビルレンス遺伝子：
    Figure 2011522533
    ；
    任意で：
    Figure 2011522533
    ；
    任意で：
    Figure 2011522533
    ；
    Figure 2011522533
    ；
    f．DNA質判定遺伝子16S DNAr Eub：
    Figure 2011522533
    。
  12. 増幅試薬の反応緩衝液が、100 mM、pH域8.5〜9.5のTris-HCl、濃度範囲480〜560 mMのKCl、および濃度範囲10〜20 mMのMgCl2からなる、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  13. 配列の増幅に使用されるTaqポリメラーゼの濃度範囲が400〜6000Uである、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  14. ジヌクレオチドの濃度範囲が15〜30mMである、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  15. 使用されるプライマーが以下の特徴を有する、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット：
    a．ヘリコバクター・ピロリ識別遺伝子16 DNAr H. pylori：
    Figure 2011522533
    ；
    b．ビルレンス遺伝子：
    Figure 2011522533
    ；
    c．DNA質判定遺伝子16S DNAr Eub：
    Figure 2011522533
    。
  16. 使用されるプライマーが1〜20 pmol/lの濃度である、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  17. キット中の全ての試薬が以下の2つの物理的形態にある、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット：
    a．脱水、無菌かつ凍結乾燥、または
    b．液体かつ無菌。
  18. 関心対象の配列の増幅対照が以下である、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット：
    a．正の対照：ヘリコバクター・ピロリ菌株ATCC 43504からのDNA、
    b．負の対照：ヒトDNA。
  19. 該プライマーが事前に標準化される、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット：
    a．ヘリコバクター・ピロリ識別遺伝子16 DNAr H.pylori：
    Figure 2011522533
    ；
    b．ビルレンス遺伝子：
    Figure 2011522533
    ；
    c．DNA質判定遺伝子16S DNAr Eub：
    Figure 2011522533
    。
  20. ビルレンス遺伝子、種識別遺伝子、およびDNA抽出質判定遺伝子が同時に増幅される、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  21. 増幅ビーズ支持体を用いて、容量25μl、温度範囲58〜65℃；サイクル範囲35〜45で増幅が行われる、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  22. 1 ngの濃度のDNAについてキットを使用できる、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  23. 該キットが抽出されたDNAの質の判定を可能にするプライマーを含む、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  24. 該キットによって体液、組織または便（heces）を含む様々なサンプルにおける異なるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスが決定される、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  25. 該キットによってビルレンス遺伝子cagA、vacAmアレル1、およびdupA 遺伝子の同定が可能になる、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  26. 該キットによって遺伝子16S DNArを用いたヘリコバクター・ピロリの同定が可能になる、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  27. 該キットによって遺伝子16S DNAr Eubの可視化を用いたDNAの質の判定が可能になる、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  28. 該キットがヌクレアーゼを含有しない超純水を含み得る、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
  29. 該キットが利用者用マニュアルを含む、請求項9記載の、異なるタイプのサンプルにおけるヘリコバクター・ピロリ菌株の存在およびビルレンスを検出するためのキット。
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