WO2009145603A1 - Kit molecular de diagnostico de cepas virulentas de helicobacter pylori - Google Patents

Kit molecular de diagnostico de cepas virulentas de helicobacter pylori Download PDF

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WO2009145603A1
WO2009145603A1 PCT/MX2009/000047 MX2009000047W WO2009145603A1 WO 2009145603 A1 WO2009145603 A1 WO 2009145603A1 MX 2009000047 W MX2009000047 W MX 2009000047W WO 2009145603 A1 WO2009145603 A1 WO 2009145603A1
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pylori
kit
virulence
strain
antisense
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PCT/MX2009/000047
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Apolinaria GARCÍA CANCINO
Carlos Gonzalez Correa
Natalia TRABAL FERNÁNDEZ
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Universidad De Concepcion
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • Helicobacter pylori infection is a major problem for public health, since it is expensive to find control measures. This supports the need for tools to detect risk factors against this pathology. However, at present there are no commercial microbiological tests that allow virulent strains to be detected.
  • this bacterium has been identified at a generic level, through the reaction of the enzyme urease, which allows the colonization of the gastric mucosa, since in the presence of urea, ions Hydrogen and water catalyzes the formation of ammonium and bicarbonate, which neutralizes the hydrogen ions that surround the bacteria and allows their survival in the gastric epithelium (Hazell et al., 1986; Mobley et al., 1988; Megraud et al., 1989 ).
  • H. pylori has several virulence factors, which allow it to colonize the gastric mucosa of the stomach and free itself from the host's defense mechanisms. Some of these factors are characteristic of the species and others, of variable presence.
  • virulence factors present in all strains, we can mention urease, spiral structure, flagella and adhesins, as well as endotoxin (LPS), in addition the arginase enzyme participates in the evasion of the immune response.
  • LPS endotoxin
  • the adhesins expressed by the bacteria recognize specific sugars in the epithelial cell.
  • the most studied are hemagglutinin N-acetylneuraminillactose and the BabA protein (blood group antigen binding adhesin), the latter allows binding from the bacteria to the Lewis Le B antigen group of the gastric mucosa.
  • the bacterium prevents the immune reaction, due to the presence of a specific secretory IgA protease, in addition to the LPS, it has low immunogenic power, which inhibits an effective immune reaction by the host (Muotiala et al., 1992).
  • a new gene that has been involved in the pathogenesis of H pylori is the gene that codes for BabAl and BabA2 proteins, which allow to activate and deactivate adhesin synthesis (Gerhard et al., 1996).
  • a product based on the microarray technique of MWG Biotech, Inc. for the search of H. pylori is on the market.
  • This product consists of 1877 oligonucleotides to recognize H. pylori of strain J99 and 26695.
  • 1307 oligonucleotides coincide with both strains, with 295 oligonucleotides specific for H. pylori strain 26695 and 278 oligonucleotides specific for H. pylori strain J99. It does not submit applications for linked invention patents.
  • INVIGENE ® The company Invitek developed a kit commercially called INVIGENE ® , for the detection of the H. pylori cagA genotype in stool, being able to determine the presence of active infection of this bacterium
  • This device is not related to a patent application invention. This device only allows to establish the presence of the microorganism, but not the virulence of it.
  • the Kit is designed for rapid detection of H. pylori using multiple PCR.
  • the contained splitters amplify the genes cagA (358 bp), flagellin (152bp), urea C (315bp) and 16S rRNA (llObp).
  • the product includes all the reagents necessary for amplification, with the exception of the enzyme Taq polymerase and dNTPs.
  • the kit includes the working buffer, the respective positive control, the molecular weight marker, DNAase-free water and specific cleaners. Both splitters and genes used by this Kit are not used in our invention.
  • the invention differs from other initiatives, because the invented kit detects prevalent genes associated with virulence.
  • Both commercial kits and other related inventions in general, detect the presence of the enzyme urease (characteristic of Helicobacter sp.), Through a positive test visualized by the turn of a pH indicator, which does not necessarily indicate that it is a strain of H. pylori, much less that it is a potentially pathogenic strain.
  • kits are not specific, as other helicobacteria present in the biopsy, such as the H. helmannii species, also generate a positive urease reaction, as this is a characteristic associated with the Helicobacter genus.
  • Other kits used are based on the detection of serum antibodies against the bacteria.
  • patents KR20030031243 and WO2005108995 which are directly related to the present invention, stand out, because said incentives determine the toxicity of H. pylori at the genetic level. But nevertheless, in all these initiatives they are not associated with more than 2 virulence genes and at most one identification sequence, or correspond to difficult techniques to implement.
  • This molecular kit differs from existing initiatives, both for the genes it researches, and the reagents it requires.
  • Existing initiatives take longer to find the optimal conditions to simultaneously amplify genes associated with virulence, in the few existing initiatives that determine them.
  • Other inventions have the disadvantage that the DNA concentration of some biopsy samples does not allow the simultaneous detection of several genes, unlike the present invention.
  • the invention has advantages in design and novelty with respect to existing kits.
  • the invention can generate a genetic pattern in H. pylori associated with more severe pathologies, an aspect not addressed by any previous initiative.
  • the molecular kit for the simultaneous detection of genes associated with virulence and the species allows the investigation of strains of H. pylori with greater capacity for colonization and human infection, and which are associated with severe pathologies derived from chronic infection with H. pylori
  • This kit allows the rapid and efficient detection of strains of H. pylori with greater pathogenic potential.
  • the invented product has a clear differentiation and superiority with respect to the existing diagnostic methods, since currently, there are no commercial products that detect H. pylori genes from specific strains, and what is even more important, the scarce products include more only one gene associated to virulence and another to specificity.
  • the invention relates to a kit for the diagnosis of H. pylori infection, which requires human samples. Subsequently, the kit is applied under a pre-established protocol.
  • the kit of this invention is designed for the genetic detection of H. pylori.
  • This initiative determines the existence of various virulence genes of these microorganisms, associating with specific sequences.
  • there is no initiative that links various identification and virulence genes to At the same time for the diagnosis although there are other similar technologies in the objectives of the detection of this microorganism, there are few tending to determine the existence of various virulence genes of these microorganisms.
  • kits contains all the elements for its best performance, such as Taq polymerase, dNTPs, working buffer, respective positive control, molecular weight marker, specific splitters and DNase free water.
  • Taq polymerase dNTPs
  • working buffer respective positive control
  • molecular weight marker e.g., glycerol
  • DNase free water e.g., glycerol
  • kits are claimed in a large number of inventions, whose only application is aimed at the recognition of specific strains, recognizing at most two genes present in the species.
  • the surprising and unexpected of this invention lies in the set of selected genes, in addition this kit is designed to be applied anywhere in the world and in various types of samples.
  • This kit has the particularity that can be used for the detection of strains whose distribution is very wide, making it possible to extend the applications of the invention, where virulence rates and their range can be determined.
  • the invention we have worked with a group of H. pylori genes of great incidence, and a kit has been prepared based on sequences of strains representative of large geographic areas, so the present initiative is of great incidence in various groups ethnic, responding to an old problem in the diagnosis of H. pylori of high pathogenicity, which remained unresolved until now. With this technology these problems are overcome by generating a solution of wide applicability.
  • Another advantageous aspect of this technology is its high reliability, the probability of obtaining consistent and accurate results is certainly high.
  • these are attributes specific to each molecular-based test or kit, in this case it is fair to point out that the rigorous selection of the genetic sequences to be replicated are decisive for obtaining accurate results, and the fact that they work with a large number of them, It grants superior comparative advantages over existing tests.
  • a new feature given by this invention is its clinical validity, that is, the certainty with which this DNA kit diagnoses, predicting the risk of a disease in clinical practice.
  • the clinical validity of this kit offers a favorable test, which includes reagents that give unusual sensitivity.
  • the positive predictive value which in other words is the probability that people with positive tests for this test develop a related pathology
  • the negative predictive value associated with this tool which is the probability that people with negative results do not manifest the disease
  • the kit can detect the presence of a strain of H. pylori and surprisingly what are the virulence genes that the bacteria have. With all these advantages a molecular kit was developed based on detection simultaneous genes associated with virulence in H. pylori: cagA, vacAml, and dupA, which allow the investigation of strains with greater pathogenic capacity.
  • the procedure for the detection of this organism is on patient samples, where this microorganism or part of its genetic material is found.
  • biopsies of the intestinal tract, faeces, blood, serum, breath, among others can be used, where H. pylori strains with greater pathogenic potential are detected quickly and effectively.
  • the physician can make decisions in the therapeutic management of the patient infected with H. pylori.
  • kits Another aspect addressed by this invention, and that most existing kits have not solved, is to determine the virulence of strains. Most related inventions are designed for clinical action and not preventive action. With this invention, a permanent problem in the art is solved, which corresponds to the detection of virulent strains. Above all, this kit allows to detect virulent strains, even when the individual does not have clinical symptoms linked to the disease, which is directly correlated with the virulent microorganism.
  • This invention is capable of being implemented in any clinical diagnostic laboratory and only basic training of personnel and simple equipment.
  • This kit is a real alternative to traditional culture in microbiological diagnostic laboratories, with the advantage of saving time and material. It provides more information for the clinician, than the technologies that are currently available in the market, because it allows the rapid investigation of strains of H. pylori with a greater pathogenic potential.
  • kits of the present invention are high incidence genes.
  • the proposed molecular examination is done by shortening the time to obtain the result, since traditional culture needs at least one week. Therefore, this technique is seen as the best current alternative to make the diagnosis of pathogenic H. pylori.
  • the invention has advantages in the short, medium and long term, so you can increase the quality of life of people by promoting their health and decreasing the progression of chronic H. infection. pylori to more severe gastroduodenal pathologies, with significant impact associated with the diagnosis and treatment of the pathologies caused by H. pylori.
  • H. pylori strains present in various samples can now be determined, preferably in gastric biopsies with various gastroduodenal pathologies, or without symptoms linked to this microorganism.
  • very small concentrations of DNA lng / ⁇ l are determined in this invention, which are sufficient for the detection of H. pylori genes.
  • the proposed initiative determines the optimal conditions to simultaneously amplify two or more genes associated to virulence in strains of H. pylori present in stool samples, fluids or gastric biopsies.
  • the physician does not have the support of the bacteriological laboratory to make a decision about when to start an H. pylori eradication treatment and what would be the most recommended therapy to increase the chances of success in eradication.
  • the clinician uses the urease test for the detection of the bacteria, for example, from the gastric sample, however a positive reaction only indicates the presence of Helicobacter sp. It is not a specific species and much less indicates its pathogenic potential.
  • the invention contemplates a process and a product that allows, in several analysis steps, to identify a microorganism present in a sample, in addition to determining the virulence of the specific strain.
  • the processing scheme is as follows:
  • Total DNA from gastric biopsies, pure cultures, body fluids or feces is generally based on the treatment of the sample with proteinase K followed by alcohol precipitation (with ethanol-chloroform or isopropanol). The genotyping of H.
  • pylori strains by multiple PCR consists in the amplification of several genes at the same time, for this purpose lyophilized PCR spheres are used, which contain all the reagents necessary for amplification (dNTPs, Taq polymerase, specific cleaners, reaction buffer, MgCl 2 ), which must be reconstituted with the appropriate amount of water at a final volume in a range between 15-30 ⁇ L.
  • the required hybridization temperature range is 40 to 55 0 C and is used between 30 and 45 PCR cycles.
  • ready-to-split PCR spheres Amersham Biosciences ®
  • in a range of 0.1 to 10 ng / ⁇ L of DNA previously extracted
  • thermocycler with programmable thermal control, according to the following program: • the procedure involves an initial denaturation in a temperature range between 80 to 98 0 C, for a period of time between 1 and 15 minutes,
  • the hybridization is carried out in a temperature range between 45 to 60 0 C for a period of 1 - 70 seconds, • the initial extension stage is performed at a temperature between 65 - 75 0 C for a period of time from 1 to 60 seconds,
  • the final extension stage is carried out at the same temperature range as the initial extension, but the period of time comprises from 3 to 10 min.
  • the kit contains negative controls that can be used during all stages, particularly during amplification (Human genome DNA). It also has positive controls (DNA H. pylori strain ATCC 43504), which are a DNA sequence as tempered, these controls are run in parallel.
  • the products of this amplification are analyzed by 3% agarose gel electrophoresis (w / v) and stained with ethidium bromide (0.5 ⁇ g / ⁇ L, or syber green, figure N ° 2).
  • the positive controls used are the multiple PCR amplification pattern for the cagA and vacAml genes of the genomic DNA, derived from control strains of H. pylori ATCC43504.
  • the amplified fragments are analyzed by electrophoresis in 3% agarose gels, followed by staining with ethidium bromide and visualization with UV transilluminator.
  • the invention comprises a kit as a ready-to-use product, which is capable of simultaneously detecting 5 genes: one identifying Helicobacter pylori, three virulence genes; vacAml, cagA and dupA and a couple of primers, which determine the quality of DNA extraction (universal Eubacteria 16-23S gene).
  • the invention also includes a kit and a method that contemplates reagents and steps, thus the following elements are included:
  • the kit has an amplification reagent, to perform the multiple PCR technique and the positive and negative controls.
  • PCR reagents to perform the multiple PCR technique and the positive and negative controls.
  • Reaction buffer which is Tris-HCl, pH range between 8.5 and 9.5, KCl in a concentration range between 480 and 560 mM and MgCl 2 in a concentration range between 10 and 20 mM, thermostable enzyme
  • Taq polymerase in a range of 400 to 6000U, MgCL 2+ , dNTPs (2'-deoxynucleoside 5 "-triphosohate, containing
  • kits can carry quality H 2 O for molecular biology assays.
  • the kit also carries positive and negative DNA controls, obtained from pure cultures of strains of H. pylori from the ATCC43504 collection and human genome, respectively. Table No. 2. List of sequences of the primers used for the detection of virulence genes and recognition of Helicobacter pylori.
  • Virulence genes cagA Direction 5 'TCA GA AAT TTG GGG 375 bp
  • This step includes the realization of a 3% agarose gel, which can optionally be contained in the kit, in addition to the specific molecular weight marker.
  • the sample is visualized by means of a reagent that produces differential DNA staining, for example, Ethidium bromide and subsequent exposure to ultraviolet light.
  • a reagent that produces differential DNA staining for example, Ethidium bromide and subsequent exposure to ultraviolet light.
  • the kit includes and points to the DNA staining method, it can include other DNA staining methods with Ethidium Bromide, or alternatives such as read green, cyber green or the like, since the staining method is not limiting for this invention.
  • the kit has a simple user manual.
  • the kit is capable of simultaneously detecting at least four genes, one identifying Helicobacter pylori and three virulence vacAml, cagA and duo
  • the kit contemplates the association of primers that determine the quality of DNA extraction.
  • the kit has the necessary protocols for the correct extraction of DNA from samples and / or pure cultures of H. pylori.
  • the kit is provided with the necessary reagents for the realization of multiple PCR, with the use of sterile lyophilized spheres or sterile liquids, in addition to the molecular weight marker and, optionally, it can be included in the agarose kit to perform the gel and developers for visualization of genes, for example, ethidium bromide, syber green.
  • Line A is the procedure to be followed when there is a sample that the DNA must be extracted, as an example, BG is Gastric Biopsy, • E: DNA extraction stage, "Line B: is the application of the same procedure to follow when isolating the strain of pure H. pylori,
  • DNA is the DNA extracted from samples containing H. pylori
  • Multiple PCR consists of the stage in which the samples are subjected to multiple PCR. This stage is common for those samples that have been originated through DNA isolation from gastric biopsy samples, deposition or those samples in which the DNA of the directly isolated bacteria is obtained. This stage aims at the identification and detection of virulence genes of H. pylori, "Visualization: last stage of the process where the results are evidenced by agarose gel electrophoresis, subsequent staining and interpretation of the results.
  • Example N ° l Application of the Kit in gastric biopsy samples
  • DNA extraction was performed using the reagents detailed below and available in the proposed kit: lysis buffer (1OmM TrisHCl, ImM EDTA, 10% SDS); Proteinase K (20mg / mL); CTAB / NaCl solution; Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1); phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1); Ethanol and TE buffer. 50 of the analyzed biopsies were tested, other samples were grouped as controls, these were extracted with DNA by the method of Mazurier et al. (1992) from the pure isolates of the culture for H. pylori. As a negative control, human genome DNA was used. 2. -Second stage of amplification of H. pylori by Multiple PCR:
  • the amplification of the DNA of H. pylori strains was performed by multiple PCR, lyophilized PCR spheres (Lyophilised Puree Taq ready-to-go PCR Beads, Amersham, Pharmacia Biotech were used ), containing 10X PCR buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl and 15 mM MgCl 2 ), Taq polymerase at a concentration of 2.5U / ⁇ L, dNTPS (2'-deoxynucleoside 5 "- triphosohate, containing 4 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1OmM dinucleotides), MgCl 2 (100 mM) and specific primers (lOpmol / L), to amplify the 16S DNAr H.
  • 10X PCR buffer 100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl and 15 mM MgCl 2
  • pylori identification genes of quality of rDB EUB DNA and of vacAml, dupA and cagA virulence genes All these reagents were reconstituted with nuclease-free water in a final volume of 15 ⁇ L, 5 ⁇ L of previously extracted DNA was added to the mixture.
  • the hybridization temperatures ranged from 50 to 74 ° C and 39 cycles of amplification were used.
  • Example No. 2 Comparison of the invention with a commercial kit
  • the reagents are in liquid and includes sterile sensitive to loss of activity by changes in temperature format ( to be stored and transported at -20 0 C).
  • Our invention includes two types of format of choice, lyophilized sterile spheres (completely stable, maintenance and transfer at room temperature) or sterile liquid.
  • the MPCR Kit H. pylori kit; Cat No. MP-700081 detects the ureA gene, which as reported in the international literature is not exclusive to H. pylori, so it only detects a virulence gene (cagA), while the invention proposed by us includes at least three genes of virulence.

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Abstract

Se divulga un kit como producto y un procedimiento capaz de detectar simultáneamente cuatro genes de Helicobacter pylori (ADNrl6S Hpy), uno de identificación y tres genes de virulencia (cagA, vacAml, dupA). Además, el Kit contempla la asociación de cebadores que determinan la calidad de la extracción del ADN (gen Eub).

Description

TJN KIT MOLECULAR DE DIAGNOSTICO DE CEPAS VIRULENTAS DE
HELICOBACTER PYLORI.
Estado del Arte
La infección por Helicobacter pylori constituye un problema importante para la salud pública, ya que es costoso encontrar medidas de control . Esto avala la necesidad de contar con herramientas que permitan detectar factores de riesgo frente a esta patología. Sin embargo, en la actualidad no se dispone de exámenes microbiológicos comerciales que permitan detectar cepas virulentas.
En la actualidad, no se dispone de herramientas de laboratorio que permitan la detección eficaz de H. pylori, consecuentemente los tratamientos de erradicación de esta bacteria se basan sólo en un método cualitativo, no existen tratamientos, ni terapias para determinar la virulencia de H. pylori.
Los métodos existentes sólo indican la presencia o ausencia del microorganismo, pero no revelan propiedades o características de la cepa infectante. Otro aspecto importante, es que en forma muy esporádica se realizan estudios endoscópicos en población, de modo que existen escasos datos de infección en este grupo etario.
A nivel mundial se ha informado que las terapias de erradicación fracasan entre un 20 y 80% de los casos por diferentes razones, entre ellas, la emergencia de cepas resistentes a los agentes antibacterianos y la ausencia de estudios de susceptibilidad previos a la elección del tratamiento. No obstante, la situación descrita implica un alto costo en salud para el paciente y para el sistema de salud. Debido a que no se disponen de antecedentes claros respecto del potencial patogénico de la cepa infectante, se entorpece la recuperación del paciente.
Clásicamente, se ha identificado esta bacteria a nivel genérico, a través de la reacción de la enzima ureasa, que permite la colonización de la mucosa gástrica, puesto que en presencia de urea, iones hidrógeno y agua, cataliza la formación de amonio y bicarbonato, que neutraliza los iones hidrógeno que rodean la bacteria y permite su sobrevivencia en el epitelio gástrico (Hazell y col., 1986; Mobley y col., 1988; Megraud y col., 1989) .
H. pylori posee diversos factores de virulencia, que le permiten colonizar la mucosa gástrica del estómago y liberarse de los mecanismos de defensa del hospedador. Algunos de estos factores son característicos de la especie y otros, de presencia variable. Entre los factores de virulencia clásicos presentes en todas las cepas, se puede mencionar la ureasa, la estructura espiralada, los flagelos y las adhesinas, al igual que la endotoxina (LPS), además la enzima arginasa participa en la evasión de la respuesta inmune. Las adhesinas expresadas por la bacteria reconocen azúcares específicos de la célula epitelial. Las más estudiadas son la hemaglutinina N- acetilneuraminillactosa y la proteína BabA (blood group antigen binding adhesin) , esta última permite la unión de la bacteria al grupo de antígenos de Lewis LeB de la mucosa gástrica.
La colonización por esta bacteria se ve favorecida por la presencia de proteínas específicas, como lipasas
(mucinasas) que degradan el moco alterando la hidrofobicidad de la superficie epitelial. Esto posibilita el desplazamiento en la mucosa gástrica, y las proteasas de la bacteria hidrolizan las inmunoglobulinas del hospedador (Smoot, 1997) . Por otra parte, la bacteria evita la reacción inmunitaria, debido a la presencia de una proteasa específica de la IgA secretora, además el LPS, tiene bajo poder inmunogénico, lo que inhibe una efectiva reacción inmunitaria por parte del hospedador (Muotiala y col., 1992) .
Diversos genes han sido estudiados en un intento de lograr establecer qué cepas de H. pylori son más patogénicas, y si existe asociación entre éstas con las manifestaciones clínicas de la infección. Es conocido en el arte, que la virulencia depende de gran número de genes, la mayoría reside en un islote de patogenicidad (PAI) . Los genes más estudiados son vacA y cagA, iceA, babA2 y dupA (Zambón y col., 2003; Faúndez y col., 2002; Censini y col., 1996) .
Algunos autores han sugerido el análisis de la combinación de estos marcadores; por ejemplo, el análisis de vacA y cagA, en conjunto. Al respecto, las cepas de H. pylori con una secuencia señal de vacA del tipo si, se asocia a una mayor inflamación gástrica y con enfermedad péptica ulcerosa, mientras que los alelos vacA que presentan una región media del tipo mi, se relacionan con un daño epitelial más severo (Pan y col., 1999) . Otros investigadores proponen que los genotipos cagA e iceA, serían una buena combinación de marcadores para la identificación de paciente con úlcera péptica (Faúndez y col., 2002) .
Un nuevo gen que ha sido involucrado en la patogénesis de H pylori, es el gen que codifica para las proteínas BabAl y BabA2 , las que permiten activar y desactivar la síntesis en adhesinas (Gerhard y col., 1996) .
Se ha efectuado una búsqueda en las principales bases de datos y oficinas de patentes del mundo. Los documentos que presentan mayor relación con la presente invención, se discuten a continuación.
Un producto basado en la técnica de microarreglos de MWG Biotech, Inc. destinado a la búsqueda de H. pylori se encuentra en el mercado. Este producto consta de 1877 oligonucleótidos para reconocer H. pylori de la cepa J99 y 26695. De estos, 1307 oligonucleótidos coinciden con ambas cepas, siendo 295 oligonucleótidos específicos de H. pylori cepa 26695 y 278 oligonucleótidos específicos de H. pylori cepa J99. No presenta solicitudes de patentes de invención vinculadas .
La empresa Invitek desarrolló un kit denominado comercialmente INVIGENE®, para la detección del genotipo cagA de H. pylori en deposiciones, siendo capaz de determinar la presencia de infección activa de esta bacteria. Este dispositivo no esta relacionado a una solicitud de patente invención. Este dispositivo sólo permite establecer la presencia del microorganismo, no así la virulencia de éste.
El producto "MPCR KIT for H. pylori detection" y el MP- 70080, de la empresa Maxim Biotech, Inc, han sido desarrollados bajo la técnica de PCR múltiple. El Kit está diseñado para la detección rápida de H. pylori usando PCR múltiple. Los partidores contenidos amplifican los genes cagA (358 bp) , flagelina (152bp) , urea C (315bp) y ARNr 16S (llObp) . El producto incluye todos los reactivos necesarios para la amplificación, con la excepción de la enzima Taq polimerasa y dNTPs . El kit incluye el buffer de trabajo, el control positivo respectivo, el marcador de peso molecular, agua libre de ADNasas y partidores específicos. Tanto partidores como genes que utiliza este Kit, no son utilizados en nuestra invención.
Respecto a las solicitudes de patentes invención vinculadas con la presente invención, podemos mencionar que existen 64 solicitudes de patentes asociadas a la unidad inventiva. A continuación, se entrega información pormenorizada de las solicitudes y patentes de invención que se encuentran más referidas con el kit para la detección de H. pylori: Invenciones relacionadas con Kit asociados a la detección de Ureasa.
Tabla N° 1. Invenciones relacionadas con kits para detectar H pylori
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* No hay información
La invención se diferencia de otras iniciativas, porque el kit inventado detecta genes prevalentes asociados a virulencia. Tanto los kits comerciales y otras invenciones relacionadas, en general, detectan la presencia de la enzima ureasa (característica de Helicobacter sp.), a través de una prueba positiva visualizada por el viraje de un indicador de pH, lo que no indica necesariamente que se trate de una cepa de H. pylori, mucho menos que sea una cepa potencialmente patógena.
Además, la mayoría de los kit existentes no son específicos, pues otras helicobacterias presentes en la biopsia como por ejemplo, la especie H. helmannii, también generan una reacción de ureasa positiva, pues ésta es una característica asociada al género Helicobacter. Otros kits utilizados se basan en la detección de anticuerpos en suero contra la bacteria.
El resultado de nuestra búsqueda, indica que existen 7 solicitudes de patentes de invención más vinculadas, a saber: JP2006284567 , KR20030031243 , WO2005108995 ,
WO2004111265, WO0029618, WO9949890 y WO9853082. Dentro de estas solicitudes de patente de invención, se destacan las patentes KR20030031243 y WO2005108995 , que se relacionan directamente con la presente invención, porque dichas incitativas determinan la toxicidad de H. pylori a nivel genético. Sin embargo, en todas estas iniciativas no se asocian a más de 2 genes de virulencia y a lo sumo una secuencia de identificación, o corresponden a técnicas difíciles de irap1ementar .
No se han encontrado iniciativas de similares particularidades del invento propuesto y, más importante aún, estas iniciativas con sus peculiaridades se han desarrollado a partir de cepas, cuyas secuencias en sus genes no se vinculan a las secuencias que se desean reivindicar en la presente invención.
Breve descripción de la invención
Este kit molecular se diferencia de las iniciativas existentes, tanto por los genes que pesquisa, como en los reactivos que requiere. Las iniciativas existentes tardan más en encontrar las condiciones óptimas para amplificar simultáneamente genes asociados a virulencia, en las contadas iniciativas existentes que los determinan. Otras invenciones tienen la desventaja que la concentración de ADN de algunas muestras biópsicas no permiten la detección simultánea de varios genes, a diferencia de la presente invención. No se dispone de información de algún kit que detecte variados factores de virulencia, por lo tanto la invención presenta ventajas en el diseño y novedad respecto a los kits existentes . La invención puede generar un patrón genético en H. pylori asociado a patologías más severas, aspecto no abordado por ninguna iniciativa anterior.
El kit molecular para la detección simultánea de genes asociados a virulencia y a la especie, permite la pesquisa de cepas de H. pylori con mayor capacidad para la colonización e infección humana, y que se asocian con patologías severas derivadas de la infección crónica con H. pylori. Este kit permite la detección rápida y eficiente de cepas de H. pylori con mayor potencial patogénico. El producto inventado presentan una clara diferenciación y superioridad respecto a los métodos de diagnóstico existentes, puesto que actualmente, no existen productos comerciales que detecten genes de H. pylori de cepas especificas, y lo que es aún más importante, los escasos productos incluyen a lo más sólo un gen asociado a virulencia y otro a especificidad.
Descripción de la Invención
La invención se relaciona con un kit para el diagnóstico de la infección por H. pylori, el que requiere muestra humanas. Posteriormente, se aplica el kit bajo un protocolo preestablecido.
El kit de esta invención está concebido para la detección genética de H. pylori., esta iniciativa determina la existencia de variados genes de virulencia de estos microorganismos, asociándose a secuencias específicas. Además, no existe ninguna iniciativa que vincule variados genes de identificación y virulencia a la vez para la diagnosis, si bien existen otras tecnologías similares en los objetivos de la detección de este microorganismo, existen pocas tendientes a determinar la existencia de variados genes de virulencia de estos microorganismos.
No existe ninguna iniciativa que vincule genes de identificación y virulencia a la vez para la diagnosis, todos estos asociados a las secuencias específicas que se divulgan en la presente invención.
Una importante ventaja de este kit, es que contiene todos los elementos para su mejor desempeño, tales como Taq polimerasa, dNTPs, buffer de trabajo, control positivo respectivo, marcador de peso molecular, partidores específicos y agua libre de ADNasa. Además, presenta los protocolos necesarios para la extracción del ADN. Éstos son aspectos novedosos de insuperable distinción en esta iniciativa, no considerados en invenciones similares. En el arte, no existen productos que detecten varios genes de H. pylori de virulencia y a la vez reconozcan genes de la especie en H. pylori. Es más, en gran número de invenciones se reivindican kits, cuya única aplicación está orientada al reconocimiento de cepas especificas, reconociendo a lo sumo dos genes presentes en la especie. Lo sorprendente e inesperado de esta invención radica en el conjunto de genes seleccionados, además este kit está concebido para ser aplicado en cualquier parte del mundo y en diversos tipos de muestras.
Este kit presenta la particularidad que puede ser utilizado para la detección de cepas cuya distribución es muy amplia, posibilitando extender las aplicaciones de la invención, en donde se pueden determinar los índices de virulencia y el rango de la misma. En la invención se ha trabajado con un grupo de genes de H. pylori de gran incidencia, y se ha confeccionado un kit en base a secuencias de cepas representativas de grandes áreas geográficas, por lo que la presente iniciativa es de gran incidencia en diversos grupos étnicos, respondiendo a una antigua problemática en el diagnóstico de H. pylori de alta patogenicidad, que permanecía sin resolver hasta ahora. Con esta tecnología se superan estos inconvenientes generando una solución de amplia aplicabilidad.
Otro aspecto ventajoso de esta tecnología es su altísima confiabilidad, la probabilidad de obtener los resultados consistentes y certeros es ciertamente alta. Si bien estos son atributos propios de cada test o kit con base molecular, en este caso es justo señalar que la rigurosa selección de las secuencias genéticas a replicar son determinantes para obtener resultados precisos, y el hecho que se trabajen con gran número de ellas, otorga superiores ventajas comparativas por sobre los test existentes.
Además, esta iniciativa presenta la ventaja que estos resultados son inesperadamente exactos, debido a la detección por parte de un número de genes, que al ser evaluados en su conjunto ofrecen reveladoras pruebas de virulencia de H. pylori, lo que posesiona a esta tecnología de diagnosis analítica muy por encima de las invenciones existentes.
Una nueva particularidad otorgada por esta invención es su validez clínica, es decir, la certeza con la cual este kit de ADN diagnostica, prediciendo el riesgo de una enfermedad en la práctica clínica. La validez clínica de este kit ofrece una prueba favorable, que incluye reactivos que otorgan una inusual sensibilidad. El valor predictivo positivo, que en otras palabras es la probabilidad que las personas con pruebas positivas para este test desarrollen una patología relacionada, y el valor predictivo negativo asociado a esta herramienta, que es la probabilidad que las personas con resultados negativos no manifiesten la enfermedad, es un aspecto que considera este kit, el cual no ha sido considerado en invenciones similares, otorgando una favorable supremacía. El kit puede detectar la presencia de una cepa de H. pylori y sorprendentemente cuáles son los genes de virulencia con que cuenta la bacteria. Con todas estas ventajas se desarrolló un kit molecular en base a la detección simultánea de genes asociados a virulencia en H. pylori: cagA, vacAml, y dupA, los que permiten la pesquisa de cepas con mayor capacidad patogénica.
El procedimiento para la detección de este organismo es sobre muestras de pacientes, en donde se encuentre este microorganismo o parte de su material genético. Preferentemente, se pueden utilizar biopsias del tracto intestinal, heces fecales, sangre, suero, aliento, entre otros, donde se detecta en forma rápida y efectiva las cepas de H. pylori con mayor potencial patogénico. Con esta nueva herramienta, el facultativo podrá tomar decisiones en el manejo terapéutico del paciente infectado por H. pylori.
El diagnóstico microbiológico tradicional y molecular de H. pylori, generalmente, presenta la desventaja que se debe capacitar al personal en procedimientos diagnósticos de endosonagrafía, endoscopía e histopatologxa, con este kit se superan estas dificultades técnicas por el manejo y fácil uso que presenta. Con la introducción del kit diagnóstico en la rutina clínica se contribuye a un ahorro en salud, pues permite detectar en forma precoz la infección por cepas patogénicas, especialmente en el grupo infantil, lo que evitará la progresión de la infección a lesiones mayores .
Otro aspecto abordado por esta invención, y que la mayoría de kits existentes no han solucionado, es determinar la virulencia de cepas. La mayoría de invenciones vinculadas están concebidas para una acción clínica y no una acción preventiva. Con esta invención, se soluciona un problema permanente en el arte, que corresponde a la detección de cepas virulentas. Sobretodo, este kit permite detectar cepas virulentas, aún cuando el individuo no cuenta con sintomatología clínica vinculada al padecimiento de la patología, la que está directamente correlacionada con el microorganismo virulento.
Esta invención es susceptible de ser implementada en cualquier laboratorio de diagnóstico clínico y sólo se requiere de un entrenamiento básico del personal y equipamiento sencillo. Este kit constituye una alternativa real al cultivo tradicional en los laboratorios de diagnóstico microbiológico, con la ventaja de ahorro de tiempo y material. Aporta mayor información para el clínico, que las tecnologías que actualmente están disponibles en el mercado, pues permite la pesquisa en forma rápida de cepas de H. pylori con un potencial patogénico mayor.
El hecho de conocer si se está frente a una cepa más patogénica permite tomar medidas oportunas para prevenir la aparición de enfermedades severas y recuperar la salud, lo que contribuye a mejorar la calidad de vida de la población con patología gastroduodenal asociada a H. pylori.
Otra ventaja de este kit es la posibilidad de ser adecuado para su uso en equipos de PCR en tiempo real, lo que garantiza mayor sensibilidad pues detecta cantidades tan pequeñas como 3pg de DNA, incluso si es diluido el DNA hasta niveles límites. Además, esta técnica acorta considerablemente el tiempo de obtención del resultado.
Otras ventajas operativas de la invención es que se realiza por PCR múltiple, en la única invención relacionada existente que emplea PCR múltiple se requiere la adición de algunos reactivos frescos, en cambio la invención propuesta sólo adiciona agua destilada libre de nucleasas, o puede presentar ambas formas. Además, los genes de virulencia que detecta el kit de la presente invención son genes de alta incidencia.
El examen molecular propuesto se realiza acortando el tiempo de obtención del resultado, pues el cultivo tradicional necesita al menos de una semana. Por lo tanto, esta técnica se ve como la mejor alternativa actual para realizar el diagnóstico de H. pylori patógena. La invención presenta ventajas a corto, mediano y largo plazo, así se puede incrementar la calidad de vida de las personas favoreciendo su salud y disminuyendo el avance de la infección crónica de H. pylori a patologías gastroduodenales más severas, con importante impacto asociado al diagnóstico y tratamiento de las patologías causadas por H. pylori .
El desarrollo de un kit molecular en base a la detección simultánea de genes asociados a virulencia en H. pylori {cagA, vacAml , y dupA) , prevalentes en la población que permiten la pesquisa de cepas con mayor capacidad para la colonización, infección crónica y desarrollo de lesiones de la mucosa gástrica humana no ha sido reivindicado anteriormente.
Con la presente invención ahora se puede determinar la prevalencia de las cepas de H. pylori presentes en diversas muestras, preferentemente en biopsias gástricas con diversas patologías gastroduodenales, o sin sintomatología vinculada a este microorganismo. Además, en esta invención se determinan concentraciones ínfimas de ADN (lng/μl) , que son suficientes para la detección de genes de H. pylori. La iniciativa propuesta determina las condiciones óptimas para amplificar simultáneamente dos o más genes asociados a virulencia en cepas de H. pylori presentes en muestras de heces, fluidos o biopsias gástricas.
Hasta ahora, el facultativo no dispone de apoyo del laboratorio bacteriológico para la toma de decisión sobre cuándo iniciar un tratamiento de erradicación de H. pylori y cuál sería la terapia más recomendable para aumentar las probabilidades de obtener éxito en la erradicación. El clínico utiliza el test de la ureasa para la detección de la bacteria, por ejemplo, a partir de la muestra gástrica, no obstante una reacción positiva sólo indica presencia de Helicobacter sp. , no es especie especifica y mucho menos señala su potencial patogénico.
La ausencia de métodos eficaces y asequibles para la identificación de poblaciones de alto riesgo y de marcadores biológicos útiles para el diagnóstico precoz, son consideraciones válidas en la solución de este problema, contemplados en la solución divulgada en este documento. El empleo de PCR múltiple permite la detección rápida y eficiente de cepas de H. pylori con mayor potencial patogénico a partir de muestras.
Descripción detallada de la Invención
Específicamente, la invención contempla un proceso y un producto que permite, en varios pasos de análisis, identificar un microorganismo presente en una muestra, además de determinar la virulencia de la cepa específica. El esquema de procesamiento es el siguiente:
Una vez obtenida la muestra se procede a extraer el ADN, según las recomendaciones especificadas en el kit, que asegura un buen resultado en calidad y cantidad de ADN extraído. El ADN total a partir de biopsias gástricas, cultivos puros, fluidos corporales o heces se basa en términos generales, en el tratamiento de la muestra con proteinasa K seguido por precipitación alcohólica (con etanol-cloroformo o isopropanol) . La genotipificación de las cepas de H. pylori por PCR múltiple consiste en la amplificación de varios genes a la vez, para ello se utilizan esferas de PCR liofilizadas, que contienen todos los reactivos necesarios para la amplificación (dNTPs, Taq polimerasa, partidores específicos, buffer de reacción, MgCl2) , que deben ser reconstituidos con la cantidad adecuada de agua a un volumen final en un rango comprendido entre 15 - 30μL. El rango de temperatura de hibridación requerido es de 40 a 55 0C y se utiliza entre 30 y 45 ciclos de PCR. Como condición inicial, se usan esferas PCR listas para partir (Amersham Biosciences®) y en un rango de 0,1 a 10 ng/μL de ADN (previamente extraído) .
Finalmente, se realiza la amplificación en un termociclador con control térmico programable, de acuerdo con el siguiente programa: • el procedimiento implica una denaturación inicial en un rango de temperatura entre 80 a 98 0C, por un periodo de tiempo entre 1 y 15 minutos,
• luego una denaturación suave, en el mismo rango de temperatura, por un periodo comprendido entre
0,1 a 3min,
• posteriormente, la hibridación se realiza en un rango de temperatura entre 45 a 60 0C por un periodo de tiempo de 1 - 70seg, • la etapa de extensión inicial se realiza a una temperatura comprendida entre 65 - 75 0C por un periodo de tiempo de 1 a 60 segundos,
• la etapa de extensión final se lleva a cabo al mismo rango de temperaturas que la extensión inicial, pero el periodo de tiempo comprende de 3 a 10 min.
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El kit contiene controles negativos que pueden ser utilizados durantes todas las etapas, particularmente durante la amplificación (ADN genoma Humano) . Además cuenta con controles positivos (ADN cepa H. pylori ATCC 43504) , los que son una secuencia de ADN como templado, estos controles son corridos en paralelo. Los productos de esta amplificación se analizan por electroforesis en gel de agarosa al 3% (p/v) y teñidos con bromuro de etidio (0,5 μg/μL, o syber green, figura N° 2) . Los controles positivos que se utilizan son el patrón de amplificación por PCR múltiple para los genes cagA y vacAml del ADN genómico, derivado de cepas control de H. pylori ATCC43504. Los fragmentos amplificados se analizan por electroforesis en geles de agarosa al 3%, seguido de tinción con bromuro de etidio y visualización con transiluminador UV.
En caso que el contenido de ADN sea escaso para amplificar todos los genes deseados, la invención subsana este problema utilizando las muestras del duplicado del cultivo, aspecto que se ha pensado en este particular protocolo, no obstante en la invención se demuestra que pequeñas cantidades de ADN (lng/μL) sirven para amplificar varios genes simultáneamente o en forma separada sin dificultad. La invención comprende un kit como producto listo para usar, que es capaz de detectar simultáneamente 5 genes: uno de identificación de Helicobacter pylori , tres genes de virulencia; vacAml, cagA y dupA y un par de cebadores, que determinan la calidad de la extracción de ADN (gen 16-23S universal Eubacteria) .
La invención también incluye un kit y un procedimiento que contempla reactivos y etapas, de este modo se incluyen los siguientes elementos:
I . Etapa de extracción de ADN desde muestras . Es opcional, según el tipo de muestra a trabajar. II. Reactivos y etapa de amplificación PCR múltiple.
Toda muestra ya procesada y cuyo resultado termine en ADN puro, es sometida a esta etapa.
El kit cuenta con un reactivo de amplificación, para efectuar la técnica de PCR múltiple y los controles positivos y negativos. Reactivos de PCR
Buffer de reacción, que es Tris-HCl, pH rango entre 8,5 y 9,5, KCl en un rango de concentraciones entre 480 y 560 mM y MgCl2 en un rango de concentraciones entre 10 y 20 mM, enzima termoestable
Taq polimerasa en un rango de 400 a 6000U, MgCL2+, dNTPs (2 '-deoxynucleoside 5" -triphosohate, conteniendo
4 dinucleótidos dATP, dCTP, dGTP, dTTP, en un rango de concentraciones entre 15 y 3OmM) , y cebadores específicos (ver tabla N °2) .
Todos estos reactivos pueden encontrarse bajo dos formas en el kit : deshidratados, estériles y liofilizados o bien, liquido y estéril. Opcionalmente, el kit puede portar H2O de calidad para ensayos de biología molecular. El kit también porta controles de ADN positivos y negativos, obtenidos a partir de cultivos puros de cepas de H. pylori de colección ATCC43504 y de genoma humano, respectivamente. Tabla N° 2. Listado de secuencias de los cebadores utilizados para la detección de genes de virulencia y reconocimiento de Helicobacter pylori .
Gen Secuencia Tamaño detectado amplicón
Identificación H. pylori:
Sentido 5' CTG GAG AGA CTA AGC 109 pb
16 ADNr H. CCT CCA 3' pylori Antisentido 5' CAT TAC TGA CGC
TGA TTG 3"
Genes de virulencia: cagA Sentido 5' TCA GA AAT TTG GGG 375 pb
ATC AGC 3' aprox
Antisentido 5' GGG GAA CTG GTT
CTT GAT TG 3~
Opcionalmente : 360-380pb
Sentido: 5' ACG ATA GGG ATA
ACA GGC AAG C 3~
Antisentido: 5'GAT CCG TTC
GGAT TTG ATT CCC 3'
380pb
Opcionalmente :
Sentido: 5'
TCAGAAATTTGGGGATCAGC 3'
Antisentido: 5'
ACATGGGGAACTGGTTCTTG 3" vacAm alelol Sentido 5' ATT TGG TCC GAG GTG 250 pb
GGA AAG T 3^
Antisentido 5' GCT AGG CGC TCT
TTG AAT TGC T 3'
Opcionalmente : 205 Pb
Sentido: 5' GCA ATG CAG CAG
CTA TGA TG 3'
Antisentido: 5' GCG CTC TTT
GAA TTG CTC TT 3'
209
Opcionalmente :
Sentido: 5' GCA ATG CAG CAG
CTA TGA TG 3'
Antisentido: 5' TAG GCG CTC
TTT GAA TTG CT 3' dupA Sentido 5' ACA AGG ACG ATT GAG 515 pb
CGA TGG GAA 3~
Antisentido 5' TGG CTA GTT TGA
GGT CTT AGG CGT 3 ' '
Determinación calidad de ADN:
16S ADNr Eub Sentido 5' GCA CAA GCG GTG GAG 415 pb
CAT GTG G 3 ' '
Antisentido 5' GCC CGG GAA CGT
ATT CAC CG 3 ' ' III. Etapa de visualización de los genes detectados e interpretación de datos
Esta etapa incluye la realización de un gel de agarosa al 3%, el que puede encontrarse opcionalmente contenido en el kit, además del marcador de peso molecular específico.
La visualización de la muestra se efectúa mediante un reactivo que produce la tinción diferencial del ADN, por ejemplo, bromuro de Etidio y posterior exposición a luz ultravioleta. El kit incluye y señala el método de tinción de ADN, puede incluir otros métodos de tinción de ADN con Bromuro de Etidio, o alternativos como read green, cyber green o similares, ya que el método de tinción no es limitante para esta invención. Además, el kit cuenta con un sencillo manual de uso.
Ejemplos de Aplicación Procedimiento El kit es capaz de detectar simultáneamente al menos cuatro genes, uno de identificación de Helicobacter pylori y tres de virulencia vacAml, cagA y dupA. Además, el kit contempla la asociación de cebadores que determinan la calidad de la extracción de ADN. El kit cuenta con protocolos necesarios para la correcta extracción de ADN desde muestras y/o cultivos puros de H. pylori.
El kit está provisto de los reactivos necesarios para la realización de PCR múltiple, con la utilización de esferas liofilizadas estériles o líquidos estériles, además del marcador de peso molecular y, opcionalmente, se puede incluir en el kit agarosa para realizar el gel y los reveladores para visualización de los genes, por ejemplo, bromuro de Etidio, syber green.
El procedimiento general se observa en la figura N °1, que muestra un esquema general de uso del kit de la invención, en donde las variables son:
" Línea A: es el procedimiento a seguir cuando se cuenta con muestra que debe ser extraído el DNA, a modo de ejemplo, BG es Biopsia Gástrica, • E: etapa de extracción del ADN, " Línea B: es la aplicación del mismo procedimiento a seguir cuando se cuenta con aislamiento de la cepa de H. pylori pura,
" ADN: es el ADN extraído desde muestras que contienen de H. pylori,
' PCR múltiple: consiste en la etapa en que se someten las muestras a PCR múltiple. Esta etapa es común para aquellas muestras que han sido originadas a través de aislamiento de ADN desde muestras de biopsia gástrica, deposición o bien aquellas muestras en que se obtiene el ADN de la bacteria directamente asilada. Esta etapa tiene como objetivo la identificación y la detección de genes de virulencia de H. pylori, " Visualización: última etapa del proceso donde se ponen en evidencia los resultados mediante electroforesis en gel de agarosa, posterior tinción e interpretación de los resultados. Ejemplo N°l: Aplicación del Kit en muestras de biopsias gástricas
Este no es un ejemplo limitante de la tecnología, sino una aplicación puntual de kit desarrollado. Muestras :
Se analizaron 56 biopsias provenientes del antro y cuerpo del estómago de 26 pacientes que consultaron por molestias gastroduodenales Como controles positivos se utilizó una muestra proveniente de cepas H. pylori ATCC 43504, ATCC 25695 y 96.978 y una muestra control negativo correspondiente al ADN de genoma humano.
1.- Primera etapa de Extracción de ADN y subetapas :
Se realizó la extracción de ADN utilizando los reactivos detallados a continuación y disponibles en el kit propuesto: buffer de lisis (TrisHCl 1OmM, EDTA ImM, SDS 10%) ; Proteinasa K (20mg/mL) ; solución CTAB/NaCl; Cloroformo: alcohol isoamílico (24:1); fenol : cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1); Etanol y buffer TE. Se sometieron a ensayo 50 de las biopsias analizadas, otras muestras se agruparon como controles, a éstas se les realizó extracción de ADN por el método de Mazurier y col, (1992) a partir de los aislados puros del cultivo para H. pylori. Como control negativo se utilizó ADN genoma humano. 2. -Segunda etapa de amplificación de H. pylori por PCR Múltiple :
En el caso de la genotipificación de la invención, la amplificación del ADN de las cepas de H. pylori se realizó por PCR múltiple, para ello se utilizaron esferas PCR liofilizadas (Lyophilised Puré Taq ready-to-go PCR Beads, Amersham, Pharmacia Biotech) , que contienen buffer PCR 10X (Tris-HCl 100 mM, pH 8,3, KCl 500 mM y MgCl2 15 mM) , Taq polimerasa a una concentración de 2,5U/μL, dNTPS (2'- deoxynucleoside 5" -triphosohate, conteniendo 4 dinucleótidos dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1OmM) , MgCl2 (100 mM) y cebadores específicos (lOpmol/L) , para amplificar los genes de identificación 16S ADNr H. pylori, de calidad de ADNrlβS EUB y de genes de virulencia vacAml, dupA y cagA. Todos estos reactivos fueron reconstituidos con agua libre de nucleasas en un volumen final de 15μL, a la mezcla se le adicionaron 5μL de ADN previamente extraído. Las temperaturas de hibridación oscilaron entre 50 y 74 °C y se utilizaron 39 ciclos de amplificación. 3.- Tercera etapa de visualización de los productos de amplificación e interpretación de los datos:
Los resultados fueron analizados en gel de agarosa 3%, 70 voltios/seg por un tiempo de 45 min y comparados con un marcador de peso molecular, que consiste en ADN del fago lambda digerido con enzimas de digestión HindIII, que proporciona un perfil de 12 bandas de 100 pb cada una. Se tiñó con bromuro de etidio (0,5 μg/mL) y se visualizó mediante exposición con luz UV, finalmente se fotografió. Los resultados obtenidos se observan en la figura N °2.
Como se pude observar en la figura N°2, se obtuvo amplificación positiva simultánea para los genes a detectar por el kit, en todos los casos ensayados. En los casos en que el diagnóstico histopatológico del paciente es más grave, se detectan al menos dos de los genes involucrados detectados por el kit de la invención. Se concluyó, tras aplicar este kit, que los pacientes que presentan alguna patología gastroduodenal, son aquellos que presentan los genes de virulencia en sus muestras gastroduodenales, en otras muestras del mismo ensayo que evidencian la ausencia de estos genes no muestran esta patología.
Ejemplo N° 2 : Comparación de la invención con un kit comercial
Se efectuó una comparación de nuestra tecnología con el kit comercial alternativo MPCR Kit H. pylori;
Cat N° . MP-700081. Este último presenta diferencias significativas a partir de los resultados, como las que se manifiestan a continuación:
1) No contiene reactivos o procedimientos necesarios para realizar la extracción de ADN desde biopsias gástricas y/o cultivo de H. pylori.
2) No proporciona los reactivos Taq polimerasa y dNTPS, por lo que el interesado en usar dicho kit debe disponerlos de antemano. Además, los reactivos que incluye vienen en formato líquido y estéril, sensibles a la perdida de actividad por cambios en la temperatura (deben almacenarse y transportarse a -20 0C) . Nuestra invención incluye dos tipos de formato a elección, esferas liofilizadas estériles (completamente estables, manutención y traslado a temperatura ambiente) o líquido estéril.
3) El kit MPCR Kit H. pylori; Cat N° . MP-700081 detecta el gen ureA, que según lo reportado en la literatura internacional no es exclusivo de H. pylori, por lo que sólo detecta un gen de virulencia (cagA) , mientras que la invención propuesta por nosotros incluye al menos tres genes de virulencia.
4) A diferencia de la invención no proporciona un control negativo.
5) Nuestra tecnología proporciona la posibilidad de contar con los reactivos y procedimiento a seguir para la visualización e interpretación de los resultados .

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento y kit para detectar la virulencia de una cepa de H. pylori CARACTERIZADO porque consta de la siguientes etapas:
(a) etapa de extracción de ADN,
(b) etapa de amplificación de secuencias por PCR múltiple, a través de la utilización de los partidores esquematizados en tabla N° 1,
(c) etapa de visualización e interpretación de los datos .
2. Un procedimiento y kit para detectar la virulencia de una cepa de H. pylori según reivindicación N° 1, CARACTERIZADO porque la etapa de extracción de ADN se compone de las siguientes fases:
i. fase de lisis celular, ii. fase de preparación de los componentes celulares y ADN, iii. fase de elusión celular y recuperación del ADN.
3. Un procedimiento y un kit para detectar la virulencia de una cepa de H. pylori según reivindicaciones N° 1 y N° 2, CARACTERIZADO porque en la etapa de extracción de ADN, específicamente en la fase de lisis celular, es utilizado un tampón, proteinasa K y solución CTAB/NaC1.
4. Un procedimiento y un kit para detectar la virulencia de una cepa de H. pylori según reivindicaciones N° 1 y N° 2, CARACTERIZADO porque en la etapa de extracción de ADN, específicamente, en la fase de preparación del ADN se realiza con una mezcla de cloroformo, alcohol izoamílico, o bien una mezcla de fenol, cloroformo y alcohol izoamílico.
5. Un procedimiento y un kit para detectar la virulencia de una cepa de H. pylori según reivindicaciones N° 1 y N° 2, CARACTERIZADO porque en la etapa de extracción de ADN, específicamente, en la fase de recuperación del ADN , se realiza la amplificación de las secuencias de interés a través de los siguientes partidores:
a. Gen de Identificación H. pylori, 16 ADNr H. pylori :
Sentido 5' CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3' Antisentido 5' CAT TAC TGA CGC TGA TTG 3',
b. Genes de Virulencia: cagA: Sentido 5' TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3';
Antisentido: 5' GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3^ vacAm alelol: Sentido 5'ATT TGG TCC GAG GTG GGA
AAG T 3\ Antisentido 5'GCT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3'
Gen dupA: Sentido5' ACA AGG ACG ATT GAG CGA TGG
GAA 3~
Antisentido 5' TGG CTA GTT TGA GGT CTT AGG CGT
3',
c. Gen Determinación calidad de ADN 16S ADNr Eub: Sentido 5' GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G 3', Antisentido 5' GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG 3 ' .
6. Un procedimiento y un kit para detectar la virulencia de una cepa de H. pylori según reivindicación N° 1, CARACTERIZADO porque este procedimiento utiliza controles de extracción de ADN positivo y negativo.
7. Un procedimiento y un kit para detectar la virulencia de una cepa de H. pylori según reivindicación N° 1, CARACTERIZADO porque el control de extracción de ADN positivo es H. pylori ATCC43504 y el control negativo de extracción es genoma humano.
8. Un procedimiento y un kit para detectar la virulencia de una cepa de H. pylori según reivindicación N° 1, CARACTERIZADO porque para la etapa de visualización se debe utilizar un gel de agarosa en un rango de concentraciones entre 1,2 y 4%.
9. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 1, CARACTERIZADO porque contiene los reactivos de amplificación y los partidores adecuados, además de los controles, opcionalmente :
a. reactivo de detección e interpretación de los datos, b. reactivo de lisis celular, c. reactivo de precipitación.
10. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N °9, CARACTERIZADO porque el reactivo de amplificación contiene los siguientes elementos:
a. reactivos de PCR múltiple con los partidores específicos para H. pylori, b. controles de amplificación de las secuencias de interés .
11. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque el reactivo de amplificación, específicamente, los reactivos utilizados para PCR múltiple son:
a. buffer de reacción; b. enzima termoestable, Taq polimerasa; c. nucleotidos; d. cebadores específicos Gen de Identificación H. pylori, 16 ADNr H. pylori: Sentido 5' CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3'; Antisentido 5' CAT TAC TGA CGC TGA TTG 3'; e. genes de virulencia: i. cagA: Sentido 5' TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3';
Antisentido 5'GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3 " ; ii. vacAm alelol: Sentido 5'ATT TGG TCC
GAG GTG GGA AAG T 3"; Antisentido 5'G0CT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3; iii. Gen dupA: Sentido5' ACA AGG ACG ATT GAG CGA TGG GAA 3"; Antisentido 5' TGG CTA GTT TGA GGT CTT AGG CGT 3 ' ' ;
Opcionalmente :
cagA: Sentido: 5' ACG ATA GGG ATA ACA GGC AAG
C 3"; Antisentido: 5'GAT CCG TTC GGAT TTG ATT
CCC 3"; cagA: Sentido: 5' TCAGAAATTTGGGGATCAGC 3 ' ; Antisentido: 5' ACATGGGGAACTGGTTCTTG 3".
Opcionalmente : vacAml: Sentido: 5" GCA ATG CAG CAG CTA TGA TG 3'; Antisentido: 5' GCG CTC TTT GAA TTG CTC TT 3"; iv. vacAml: Sentido: 5' GCA ATG CAG CAG CTA TGA TG 3'; Antisentido: 5' TAG GCG CTC TTT GAA TTG CT 3'; gen determinación calidad de ADN 16S ADNr Eub; Sentido 5' GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G
3'; Antisentido 5' GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG
12. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque el buffer de reacción del reactivo de amplificación está constituido por Tris-HCl 100 mM, pH rango entre 8,5 y 9,5, KCl en un rango de concentraciones entre 480 y 560 mM y MgCl2, en un rango de concentraciones entre 10 y 20 mM.
13. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque la Taq polimerasa utilizada para la amplificación de secuencia, tiene un rango de concentración entre 400 a 6000U.
14. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque el rango de concentraciones de los dinucleótidos es entre 15 y 3OmM.
15. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque los cebadores utilizados responden a las siguientes particularidades:
a. Gen de Identificación H. pylori, 16 ADNr H. pylori: Sentido 5' CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3'; Antisentido 5' CAT TAC TGA CGC TGA
TTG 3'; b. Genes de Virulencia: i. cagA Sentido 5' TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3'; Antisentido 5'GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3 " ; ii. vacAm alelol Sentido 5'ATT TGG TCC GAG
GTG GGA AAG T 3";
Antisentido 5'GCT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3'; iii. Gen dupA, Sentido5' ACA AGG ACG ATT GAG
CGA TGG GAA 3 "" ; Antisentido 5' TGG CTA GTT TGA GGT CTT AGG CGT 3 ' ' ; c. Gen determinación calidad de ADN 16S ADNr Eub; Sentido 5' GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G 3 ' ; Antisentido 5 ' GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG
16. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque los cebadores utilizados presentan una concentración entre 1 y 20 pmol/1.
17. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque todos los reactivos del kit pueden encontrarse bajo dos formas físicas:
a. deshidratados, estériles y liofilizados, o b. líquidos y estériles.
18. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque los controles de amplificación de las secuencias de interés son:
a. control positivo: ADN de cepa de H pylori ATCC43504, b. control negativo: ADN humano.
19. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque los partidores se estandarizan previamente:
a. gen de identificación H. pylori, 16 ADNr H. pylori: Sentido 5' CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3'; Antisentido 5' CAT TAC TGA CGC TGA TTG 3'; b. genes de virulencia: i. cagA Sentido 5' TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3'; Antisentido 5'GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3 " ; ii. vacAm alelol Sentido 5'ATT TGG TCC GAG GTG GGA AAG T 3 " ;
Antisentido 5'GCT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3'; iii. Gen dupA, Sentidoδ' ACA AGG ACG ATT GAG
CGA TGG GAA 3 " ; Antisentido 5' TGG CTA GTT TGA GGT CTT
AGG CGT 3 ' ' ; c. gen determinación calidad de ADN 16S ADNr Eub; Sentido 5' GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G 3', Antisentido 5' GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG 3''.
20. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque los genes de virulencia, de identificación de la especie y de calidad de extracción del ADN son amplificados al unisono.
21. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque la amplificación se realiza con un volumen de 25 μl, un rango de temperaturas entre 58 y 65 0C; un rango de ciclos entre 35 y 45, utilizando soporte esferas de amplificación .
22. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque el kit puede ser utilizado a partir de una concentración de lng de ADN.
23. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque este kit consta de partidores que permiten determinar la calidad del ADN extraído.
24. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque el kit determina la presencia y virulencia de diferentes cepas de H. pylori, en diversas muestras, en grupo que comprende muestras de fluidos corporales, tejidos o heces.
25. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque el kit permite identificar los genes de virulencia cagA, vacAm alelol, y Gen dupA.
26. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque el kit permite identificar a H. pylori a través del gen 16SADNr.
27. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque el kit permite la determinación de la calidad de
ADN, a través de la visualización del gen 16S ADNr Eub.
28. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N° 9, CARACTERIZADO porque el kit puede incluir agua ultrapura carente de nucleasas .
29. Un kit para detectar la presencia y la virulencia de una cepa de H. pylori en distintos tipos de muestras según reivindicación N°9, CARACTERIZADO porque el kit contiene un manual de uso.
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