KR102601797B1

KR102601797B1 - 뇌암의 진단용 조성물

Info

Publication number: KR102601797B1
Application number: KR1020200091623A
Authority: KR
Inventors: 이흥규; 김현철; 김현진
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2023-11-15
Also published as: KR20220012621A

Abstract

본 발명은 박테로이데스속 균주의 존재 및 증식 여부가 뇌암을 대표할 수 있으므로, 이와 같은 균주가 존재하는 수준을 검출함으로써 매우 손쉬운 방법으로 조기에 뇌암을 진단해낼 수 있다.

Description

뇌암의 진단용 조성물{A composition for diagnosing brain cancer}

본 발명은 뇌암의 진단용 조성물에 관한 것이다.

뇌암은 두개강 내에 발생된 모든 종양을 의미하며, 발생 위치에 따라 양성 종양도 악성종양처럼 예후가 좋지 않을 수 있으며, 재발의 위험성도 다른 장기에 발생되는 암에 비하여 높다. 이러한 뇌암은 원발성과 전이성 뇌암 2가지 종류로 나눌 수 있으며, 원발성의 경우에는 뇌 자체에서 시작된 것이며, 전이성의 경우에는 다른 장기로부터 뇌에 전이된 것을 의미한다.

뇌암의 일종인 다형성 교모세포종은 악성도가 매우 높은 종양으로, WHO의 기준에 따르면 가장 위험한 단계인 4단계에 해당하고, 수술과 화학요법 및 방사선 치료를 병용하여도 5년 이상 생존률이 1%를 겨우 넘는 수준이다. 평균적으로 암환자의 생존률이 30% 정도 증진되었지만, 교모세포종의 경우에는 뇌라는 장기의 특성상 현저히 낮은 1% 대의 생존률을 유지하고 있다. 뇌의 경우에는 혈액 뇌관문(Blood brain barrier; BBB)에 의해 면역관용기관으로 여졌으며, 특정 상황에서 면역 세포의 유출입이 일어나기는 하나, 여전히 3세대 항암 치료법인 면역 항암제를 사용한 치료에는 상당한 제한점이 존재한다. 이렇게, 뇌암의 경우에는 치료가 매우 어렵기 때문에, 이를 효율적으로 대처하기 위해서는 다른 암종에 비하여 진단이 조기에 이루어지는 것이 매우 중요하다. 그러나, 이와 같은 중요성에도 불구하고 특히 교모세포종의 경우에는 두통 또는 구역질과 같은 일상생활에서 흔하게 겪을 수 있는 흔한 증상만이 나타나기 때문에 환자 스스로 인지하여 내원하는 일반적인 과정을 통해서는 조기에 이를 진단하는 것을 불가능한 현실이다.

교모세포종과 같은 뇌암의 대표적인 진단 방법으로는 MRI(Magnetic Resonance Imaging) 촬영법이 존재한다. 그러나, 이와 같은 MRI 촬영법은 매우 고가이기 때문에, 낮은 발병 가능성이 있는 경우에 적용하기에는 진입 장벽이 매우 높다는 한계점이 존재한다. 나아가, MRI 촬영법의 경우에는 가돌리늄이라는 금속이 조영제에 들어가게 되는데, 이러한 조영제에 알러지 반응이 있는 경우에는 적용할 수 없을 뿐만 아니라, 다수 회 촬영을 하는 경우에는 이러한 금속이 몸에 축적되어 신장 질환이 유발될 수 있다.

한편, 사람의 몸은 성인을 기준으로 약 30조 개의 세포로 구성되어 있는데, 미생물의 경우, 사람에 따라 차이점이 존재하지만 적게는 상기 세포와 비교하여 2배에서 많게는 10배가량 더 많이 존재한다. 이와 같은 미생물이 존재하는 장기는 대부분 사람의 몸이 외부 환경에 노출되는 부위로서 대표적으로 피부와 위장관을 들 수 있다. 특히 장의 경우에는 장기 중에서도 특히 미생물이 많이 존재하기 때문에, 미생물과 다양한 질환의 상관관계에 대해 연구가 다수 진행되고 있다. 그러나, 장 이외의 다른 장기에서 미생물과의 상관관계에 대해서는 아직까지 그 연구가 미비한 실정이다.

본 발명의 일 목적은 뇌암의 진단용 조성물; 및 이를 포함하는 뇌암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 뇌암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구현 예에서는 뇌암의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 조성물은 박테로이데스속 균주를 검출하는 제제를 포함한다.

본 발명의 상기 "박테로이데스속 균주"는 그람 음성의 혐기성 박테리아로서, DNA 염기 구성은 40~48%가 G(구아닌) 및 C(시토신)으로 구성되어 있다.

본 발명의 상기 박테로이데스속 균주는 예를 들면, 박테로이데스 아시디파시엔스(Bacteroides acidifaciens), 박테로이데스 바르네시에스(Bacteroides barnesiaes), 박테로이데스 카에시갈리나럼(Bacteroides caecigallinarum), 박테로이데스 셀룰로실리티큐스(Bacteroides cellulosilyticus) 등일 수 있고, 바람직하게는 박테로이데스 아시디파시엔스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 박테로이데스속 균주가 정상 대조군, 또는 암이 증식되기 이전의 군과 비교하여 그 존재 수준이 감소된 경우, 뇌암이 발병되었거나, 또는 발병 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다.

본 발명의 상기 "뇌암"은 뇌조직이나 뇌를 싸고 있는 막으로부터 발생되는 원발성과, 두개골이나 그 주변 구조물 혹은 두부에서 멀리 떨어진 부위에서 뇌조직이나 뇌막으로 전이된 전이성을 모두를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 뇌암은 교모세포종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 "교모세포종"은 뇌의 교세포에서 발생한 종양 중 조직학적으로 핵의 비정형성, 유사분열상, 혈관 내피 세포의 증식, 괴사가 관찰되는 악성도가 가장 높은 종양이다. 악성 교모세포종은 전체 뇌종양의 12 내지 15%를 차지하고, 뇌 교종의 50 내지 60%를 차지하는, 뇌에 발생하는 단일 종양 중 가장 흔히 발생하는 종양이다. 이와 같은 교모세포종은 줄기세포 유사 암세포를 보유하고 있어, 치료 저항성이 매우 높기 때문에 치료 후 예후가 좋지 못하여 조기에 진단하는 것이 매우 중요하다. 본 발명을 이용하는 경우, 접근성이 쉬운 장내 미생물 분석에 기반하여 얻어진 상기 미생물의 비율로 조기에 교모세포종을 진단할 수 있으며, 개체에서 교모세포종의 진행 단계를 예측할 수 있다.

본 발명의 상기 박테로이데스속 균주를 검출하는 제제는 박테로이데스속 균주의 유전자, 예를 들면, 16S rRNA 등과 상보적으로 결합하여 이를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 것으로서, 바람직하게는, 프라이머, 프로브, LNA 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 박테로이데스 아시디파시엔스 균주를 검출하는 제제는 상기 박테로이데스 아시디파시엔스 균주의 16S rRNA, 예를 들면 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 16S rRNA에 상보적으로 결합하여 이를 효과적으로 증폭시켜 검출이 가능하도록 하는 것일 수 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 검출하는 제제는 하기 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

[서열번호 2]

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACnnnnnnnnTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'

[서열번호 3]

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATnnnnnnnnGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'

상기 서열번호 2 또는 서열번호 3의 n은 A(adenine), T(thymine), G(guanine) 및 C(cytosine)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 상기 "프라이머"는 목적하는 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 상기 프라이머는 서열번호 4 내지 19로 표시되는 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 정방향 프라이머와, 서열번호 20 내지 43으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 역방향 프라이머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 "프로브"는, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 예를 들면, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"는, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, 왓슨-크릭 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.

본 발명의 상기 "안티센스 뉴클레오티드"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.

본 발명의 상기 검출 제제는 본 발명의 상기 16s rRNA, 예를 들면 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 토대로, 상기 염기서열에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 뉴클레오티드 등을 통상의 기술자라면 쉽게 제작할 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에서는 본 발명의 상기 뇌암 진단용 조성물을 포함하는 뇌암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 뇌암 진단용 키트는 본 발명에 따른 상기 뇌암 진단용 조성물을 포함하기 때문에, 박테로이데스속 균주, 검출하는 제제, 뇌암, 교모세포종, 프라이머, 프로브 등과 관련된 내용은 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.

본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 예를 들면, 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머 쌍은 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 예를 들면 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 또는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에서는 뇌암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 박테로이데스속 균주가 존재하는 수준을 검출하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 상기 박테로이데테스속 균주가 존재하는 수준이 정상 대조군과 비교하여 감소된 경우, 뇌암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다.

본 발명의 상기 정보 제공 방법에서, 박테로이데스속 균주, 뇌암, 교모세포종 등과 관련된 내용은 앞서 진단용 조성물에 기재한 바와 동일하여, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.

본 발명의 상기 "목적하는 개체"는, 뇌암의 발병 여부가 불확실한 개체로, 질환의 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.

본 발명의 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 장 조직, 장 세포 및 분변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 장은 맹장, 결장 및 직장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 상기 장내 미생물이 존재하여 유전자를 추출할 수 있다면 그 종류에 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 정보 제공 방법에서, 상기 균주가 존재하는 수준을 검출하는 단계는 상기 균주를 검출하는 제제를 이용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 상기 균주를 검출하는 제제는 박테로이데스속 균주의 유전자, 예를 들면, 16S rRNA 등과 상보적으로 결합하여 이를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 것으로서, 바람직하게는, 프라이머, 프로브, LNA 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[서열번호 2]

[서열번호 3]

본 발명의 상기 "프로브"는, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 예를 들면, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 균주가 존재하는 수준을 검출하는 단계는 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 파이로시퀀싱(Pyrosequencing), 16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 검출 제제는 본 발명의 상기 16s rRNA, 예를 들면 서열번호 1포 표시되는 염기 서열을 토대로, 상기 염기 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 뉴클레오티드 등을 통상의 기술자라면 쉽게 제작할 수 있다.

도 1 및 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 이식 동물 모델에서 문(phylum) 수준의 장내 미생물 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 이식 모델에서 종 수준의 장내 미생물 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 교모세포종 세포주 이식 전(D0) 및 이식 후(D20)에서 박테로이데스 아시디파시엔스(Bacteroides acidifaciens)가 존재하는 수준의 변화를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6 및 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 편집 동물 모델에서 문 수준의 장내 미생물 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8 및 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 편집 동물 모델에서 종 수준의 장내 미생물 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 편집 동물 모델의 사육 2개월째(2) 및 5개월째(5)에서, 박테로이데스 아시디파시엔스가 존재하는 수준의 변화를 비교한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

[실시예 1] 동종 이식 동물 모델에서의 장내 미생물 변화 분석

교모세포종 세포주인 GL261를 마우스에 이식하는 방법을 통해 제작된 동종 이식 동물 모델을 이용하여 아래의 과정에 따라 미생물 변화를 분석하였다.

[1-1] 실험 방법

8주령 수컷 C57BL/6 마우스의 우반구에 2 × 10⁵개의 교모세포종 세포주(GL261)를 이소퓨렌(isoflurane) 가스와 산소가 1:1의 비율로 마우스에 공급되도록 한 마취 상태에서 주사하였다. 이때, 세포주의 주사는 마우스의 입이 위쪽을 향하게 두었을 때, 브레그마(bregma)를 기준으로 우측으로 2 mm, 위쪽으로 2 mm 지점에 3 mm 깊이로 진행하였다. 분변의 채취를 위해 마우스를 빈 케이지에 옮기고, 공간을 분리시켜주는 틀을 이용하여 각기 다른 곳에 마우스를 1시간 30분동안 격리하였다. 이후, 격리되어 있는 시간 동안 상기 마우스가 배설한 분변을 수득하여, -80℃냉동고에 보관하였다.

퀴아젠 사의 QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit를 이용하여, 제조사가 제공하는 방법에 따라 microbial DNA를 상기 분변 샘플로부터 분리하였다. 이렇게 추출된 DNA는 16s rRNA 유전자의 V3(Variable regions 3)에서 V4 영역이 증폭될 수 있도록, 상기 분변 샘플로부터 분리된 DNA를 주형으로 하기 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 여기서, 상기 V3 및 V4 영역은 미생물의 16s rRNA 유전자 서열의 영역 중, 미생물마다 차이를 보이는 영역을 의미한다. 구체적으로, PCR 수행에 사용된 프라이머 서열은 표 2에 기재된 바와 같다.

서열번호	특징	염기 서열
서열번호 2	341F	5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-nnnnnnnn-TCGTCGGCAGCGTC-AGATGTGTATAAGAGACAG-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'
서열번호 3	805R	5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-nnnnnnnn-GTCTCGTGGGCTCGG-AGATGTGTATAAGAGACAG-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'
서열번호 2 또는 3의 프라이머 서열에서 n은 A, T G 및 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있음.

서열번호	염기 서열
서열번호 4	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC TCT CTA TTC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 5	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT ATC CTC TTC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 6	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACG TAA GGA GTC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 7	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACA CTG CAT ATC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 8	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACA AGG AGT ATC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 9	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC TAA GCC TTC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 10	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC GTC TAA TTC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 11	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTC TCC GTC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 12	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CGA CTA GTC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 13	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT TCT AGC TTC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 14	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA GAG TTC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 15	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACG CGT AAG ATC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 16	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC TAT TAA GTC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 17	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACA AGG CTA TTC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 18	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACG AGC CTT ATC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 19	AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT TAT GCG ATC GTC GGC AGC GTC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG
서열번호 20	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT TCG CCT TAG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 21	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CTA GTA CGG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 22	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT TTC TGC CTG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 23	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT GCT CAG GAG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 24	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT AGG AGT CCG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 25	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CAT GCC TAG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 26	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT GTA GAG AGG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 27	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CAG CCT CGG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 28	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT TGC CTC TTG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 29	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT TCC TCT ACG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 30	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT TCA TGA GCG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 31	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CCT GAG ATG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 32	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT TAG CGA GTG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 33	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT GTA GCT CCG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 34	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT TAC TAC GCG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 35	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT AGG CTC CGG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 36	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT GCA GCG TAG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 37	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CTG CGC ATG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 38	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT GAG CGC TAG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 39	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGC TCA GTG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 40	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT GTC TTA GGG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 41	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT ACT GAT CGG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 42	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT TAG CTG CAG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC
서열번호 43	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT GAC GTC GAG TCT CGT GGG CTC GG GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG GACTACHVGGGTATCTAATCC

상기 PCR 과정을 통해 증폭이 완료된 생산물을 1%의 아가로스 겔에 전기영동한 뒤, 겔 독 시스템(Gel Doc system; BioRad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 밴드를 확인하고, 클린PCR(CleanPCR, CleanNA)을 이용하여 추가 정제 과정을 수행하였다. 그런 다음, 상기 마우스들로부터 얻어진 증폭 및 정제된 DNA를 동일한 농도로 섞은(Pooling) 뒤에 DNA 7500 chip을 이용하여 BIoanaylzer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA, USA)으로 분석 품질 상태를 확인하였다.

이후, Illumian MiSeq Sequencing system (Illumina, USA)을 이용하여, Chunlab, Inc. (Seoul, Korea)에서 제공되는 방법에 따라, 품질 상태가 좋은 증폭 및 정제된 DNA를 대상으로 시퀀싱을 진행하였다. 시퀀싱 과정이 완료되면, 로우 데이터(raw data) 값은 Trimmomatic ver. 0.32에 의해 시퀀싱 품질에 대한 검증이 수행되도록 하였으며, Q25보다 낮은 점수가 나온 결과 값들은 걸러질 수 있도록 하였다.

EzBioCloud 16S rRNA 데이터베이스를 바탕으로 분류 할당(taxonomic assignment)을 진행하고, 97% 유사도를 기준으로 종 수준의 판별이 이뤄지도록 하였으며, 그보다 낮은 유사도의 경우에는 더 높은 단계의 계통에서 OTU(Operational taxonomic unit)가 정의될 수 있도록 하였다. 즉, De novo 방법과 라이브러리에 근거한 Closed-reference 방법을 모두 사용하는 Open-reference 방법을 사용하였다. 이와 같은 결과 값을 기초로, 알파 다양성(ACE, Chao1, Jackknnife, Shannon, NPShannnon, Simpson 지수와 Phylogenetic diversity)을 산출하고, 샘플 간의 차이를 시각화 하기 위해 Generalized UniFrac 알고리즘을 통해 베타 다양성을 산출하였다.

[1-2] 실험 결과

도 1 및 도 2에서 보는 바와 같이, 교모세포종 세포주를 이식하기 전(D0 DW)에는 분변에 존재하는 장내 미생물의 계통에 다양성이 존재하였다(도 1). 그러나, 교모세포종 세포주를 이식하고 20일이 지난 후(D20 DW)에는 분변에 존재하는 장내 미생물이 문(phylum) 수준에서 박테로이데테스(Bacteroidetes)문과 프로테오박테리아(Probacteria)문이 줄어들었으며, 반대로 퍼미큐테스(Firmicutes)문 및 베루코미크로비오타(Verrucomicrobiota)문이 증가되었다(도 2).

도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이, 교모세포종 세포주를 이식하기 전(D0 DW)에는 분변에 존재하던 박테로이데스 아시디파시엔스가(도 3), 교모세포종 세포주 이식 후 20일째(D20 DW)에는 거의 존재하지 않았다(도 4).

또한, 도 5에서 보는 바와 같이, 교모세포종 세포주를 이식하기 전(D0)에는 4 정도의 수준으로 분변에 존재하던 박테로이데스 아시디파시엔스가 교모세포종 세포주 이식 후(D20)에는 0 정도의 수준으로 현저하게 감소되었다.

상기 결과를 통해 분변과 같은 생물학적 시료에서 박테로이데스 아시디파시엔스가 존재하는 수준이 정상 대조군과 비교하여 감소되는 경우 뇌암, 특히 교모세포종을 매우 높은 정확도로 진단할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 2] 유전자 편집 동물 모델에서의 장내 미생물 변화 분석

CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여, 교모세포종에서 자주 발견되는 유전자의 돌연변이를 유도하는 방법을 통해 제작된 유전자 편집 동물 모델을 이용하여 아래의 과정에 따라 미생물 변화를 분석하였다.

[2-1] 실험 방법

EGFRⅶ 돌연변이 마우스의 새끼가 태어나면, 하루 안에 상기 마우스의 새끼의 뇌에 CRISPR-Cas9 시스템이 암호화되어 있는 벡터를 전기 천공법(Electroporation)을 통해 형질전환 하였다. 이때, 람다(lambda)에서 눈을 잇는 선을 3등분하였을 때 가장 가까운 지점에 주사하였다. 상기 벡터 전달이 완료되면, EGFRⅶ 돌연변이 폼이 생성되게 되고, 이에 따라 p53 및 Pten의 발현이 억제되어 종양 억제 기능이 사라지게 되며, 결국 4달 내지 5달쯤 상기 마우스에 교모세포종이 발생되었다(Nature (2018) 560:240-247 참고).

상기 교모세포종이 발생된 마우스는 육안으로 관찰하여, 암의 크기가 작을 때인 2달 및 암의 크기가 큰 때인 5달에 각각 분변을 얻었다.

장내 미생물의 분리 및 시퀀싱 분석은 상기 [1-1] 실험방법에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행하였다.

[2-2] 실험 결과

도 6 및 도 7에서 보는 바와 같이, 유전자 편집을 통해 교모세포종을 유도한지 5달째 되었을 때, 2달째와 비교하여 박테로이데테스문이 존재하는 수준이 감소하고(도 6), 퍼미큐테스문이 존재하는 수준이 증가되었다(도 7).

도 8 및 도 9에서 보는 바와 같이, 교모세포종 유도 2달 째에는 매우 높은 수준으로 존재하던 박테로이데스 아시디파시엔스가(도 8), 교모세포종 유도 5달 째에는 그 수준이 현저하게 감소되었다(도 9).

또한, 도 10에서 보는 바와 같이, 상기 동물 모델의 분변에 박테로이데스 아시디파시엔스가 존재하는 수준은 2달째 평균 10 이상인 반면, 5달째에는 평균 5 이하로 감소되었다.

상기 결과를 통해 박테로이데스 아시디파시엔스가 존재하는 수준이 정상 대조군과 비교하여 감소되는 경우 뇌암, 특히 교모세포종을 매우 높은 정확도로 진단할 수 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> A composition for diagnosing brain cancer <130> PDPB204114 <160> 43 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1451 <212> DNA <213> Bacteroides sp. <400> 1 gatgaacgct agctacaggc ttaacacatg caagtcgagg ggcagcatga aagtttgctt 60 gcaaactttt gatggcgacc ggcgcacggg tgagtaacac gtatccaacc tgcctcatac 120 tcggggatag cctttcgaaa gaaagattaa tacccgatgt catagtccta ccgcatgatg 180 ggattattaa agaatttcgg tatgggatgg ggatgcgttc cattagttag ttggcggggt 240 aacggcccac caagacaacg atggataggg gttctgagag gaaggtcccc cacattggaa 300 ctgagacacg gtccaaactc ctacgggagg cagcagtgag gaatattggt caatggacga 360 gagtctgaac cagccaagta gcgtgaagga tgactgccct atgggttgta aacttctttt 420 atatgggaat aaaatgttcc acgtgtggga ttttgtatgt accatatgaa taaggatcgg 480 ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggaggatccg agcgttatcc ggatttattg 540 ggtttaaagg gagcgtaggt ggattgttaa gtcagttgtg aaagtttgcg gctcaaccgt 600 aaaattgcag ttgaaactgg cagtcttgag tacagtagag gtgggcggaa ttcgtggtgt 660 agcggtgaaa 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Claims

박테로이데스(Bacteroides)속 균주를 검출하는 제제를 포함하는 뇌암 진단용 조성물로서,
상기 뇌암은 교모세포종인 것인, 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 박테로이데스속 균주는 박테로이데스 아시디파시엔스(Bacteroides acidifaciens)인 것인, 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 진단용 조성물은 장 조직, 장 세포 및 분변으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 생물학적 시료에서 검출하는 것인, 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 검출하는 제제는 프라이머, 프로브, LNA 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 진단용 조성물.
삭제
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 포함하는 뇌암 진단용 키트.
목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 박테로이데스속 균주가 존재하는 수준을 검출하는 단계;를 포함하는 뇌암 진단을 위한 정보 제공 방법으로서,
상기 뇌암은 교모세포종인 것인, 정보 제공 방법.
제7항에 있어서,
상기 박테로이데스속 균주가 존재하는 수준이 정상 대조군과 비교하여 감소된 경우, 뇌암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 것인, 뇌암 진단을 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서,
상기 박테로이데스속 균주는 박테로이데스 아시디파시엔스(Bacteroides acidifaciens)인 것인, 정보 제공 방법.
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제7항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 장 조직, 장 세포 및 분변으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 정보 제공 방법.
제7항에 있어서,
상기 균주가 존재하는 수준을 검출하는 단계는 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 파이로시퀀싱(Pyrosequencing), 16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 정보 제공 방법.