KR100353506B1 - 녹농균 동정 및 감염 진단용 프라이머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 녹농균 유전자에 특이적으로 결합하는 녹농균 동정 및 감염 진단용 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 이를 이용한 네스티드 중합효소연쇄반응(nested polymerase chain reaction)으로 녹농균을 동정하는 방법에 관한 것이다. 선정된 녹농균 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 센스 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 안티센스로 이루어진 프라이머이다. 이 프라이머는 진단대상의 혈액 또는 객담에 적용하여 녹농균의 검출 또는 감염 진단을 검증하고 녹농균을 동정하는데 사용될 수 있다.

Description

녹농균 동정 및 감염 진단용 프라이머{Primers for identification of Pseudomonas aeruginosa and diagnosis of Pseudomonas aeruginosa infection}
본 발명은 면역기능이 저하된 환자에게서 패혈증을 유발하는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의oprL유전자의 오픈 리딩 프레임 내의 염기서열에 특이적으로 결합하는 두 종의 신규한 올리고뉴클리오티드 프라이머에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 신규한 프라이머를 사용하여 네스티드 중합효소연쇄반응을 수행함으로써 녹농균 진단대상의 혈청 또는 객담등을 대상으로 단시간 내에 녹농균 감염을 진단하고, 녹농균을 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 네스티드 중합효소연쇄반응은 녹농균의oprL유전자의 오픈 리딩 프레임에만 특이적으로 반응하는 공지의 올리고뉴클리오티드 프라이머를 사용한 중합효소연쇄반응에 의해 일차적으로oprL유전자의 오픈 리딩 프레임을 증폭시킨 후, 상기 신규한 프라이머들을 사용하여 이차 중합효소연쇄반응을 실시할 수 있다.
녹농균은 중증의 화상, 췌낭포성 섬유종, 장기이식을 위한 면역억제제의 투여 또는 암치료 등에 의하여 면역체계가 저하된 환자에게 주로 감염되는 병원내 기회 감염균이다. 특히 췌낭포성 섬유종 환자의 90% 이상이 녹농균의 상습적인 폐 감염에 기인하는 폐조직 손상으로 인하여 사망하는 것으로 밝혀졌다. 중증의 화상이나 면역억제제를 투여받은 환자의 경우 녹농균에 의한 국소감염이 전신감염으로 이어져 결국 패혈증 쇼크를 야기하게 된다. 최근에는 녹농균이 요도감염 및 콘택트렌즈 사용자의 각막궤양에서도 검출되어 더욱 주목을 받게 되었다.
녹농균 감염 치료시 대부분이 항생제에만 의존하므로 항생제의 남용에 의한 내성균주가 지속적으로 출현하고 있으므로 기존의 상용 항생제에 의한 치료는 점점 더 어려워지고 있는 실정이다. 또한, 녹농균은 병원의 중환자실에 장기입원하고 있는 환자의 세균 감염에 기인한 패혈증에 의한 사망률의 주요 원인균으로 지목되고 있다. 따라서 녹농균감염에 의한 패혈증을 효과적으로 예방하기 위한 백신 및 감염에 의한 패혈증 치료제를 개발하려는 노력이 계속되어 왔다. 녹농균백신 개발을 위한 항원으로서는 세포외막표면에 존재하는 성분인 리포폴리사카라이드(LPS), 캡슐 폴리사카라이드(CPS) 및 세포외막단백질 등이 사용되었다. 일반적으로 백신 후보항원들은 동물에서의 안전성 및 유효성 실험을 거쳐 녹농균 감염예방을 위한 백신으로 개발되어 정상인에서의 안정성 및 면역원성이 확인되면 환자에게서 감염예방효능을 검증하게 된다. 종래 녹농균 백신의 임상시험에서 백신의 감염예방효능의 지표로서는 환자의 사망률 감소를 측정하였다. 그러나, 이와 같은 경우 환자의 사망이 직접적으로 녹농균 감염에 의한 것이라는 직접적인 증거가 없다. 또한 환자의혈액의 녹농균감염을 확인하기 위하여 환자의 혈액으로부터 미생물을 배양하는 방법이 사용되기도 하였으나 환자의 혈액에는 세균감염예방을 위하여 투여한 항생제가 고농도로 존재하므로 감염된 녹농균의 수가 적은 경우나 성장정지상태로 존재하는 경우에는 혈액배양법으로는 검출되지 않을 우려가 있었다. 이와 함께 미생물의 혈액배양법은 감염세균을 최종 동정하는데에 장시간이 소요되므로 환자를 적기에 치료하는 데에 장애가 되어 왔다.
본 발명에서는 중합효소연쇄반응을 이용하여 혈액 시료내의 녹농균 감염을 진단하는 프라이머를 개발하였다. De Vos등은 중합효소연쇄반응을 이용한 진단방법을 이용하여 녹농균을 검출할 수 있었으며, 이 경우 피부 생검 시료로부터는 극미량의 녹농균 DNA도 효율적으로 검출할 수 있었다(J. of Clinic. Microbiol., June 1997, pp. 1295-1299).
또한, Gamble등은Bordetella pertussis의 검출을 위해서 네스티드 중합효소연쇄반응을 수행하였고 이 경우 역시 객담 시료로부터 미량의 녹농균 DNA도 효율적으로 검출할 수 있었다(J. of Clinic. Microbiol., Apr. 1996, pp. 810-815). Gamble 등의 방법에서도 프라이머의 특이성을 향상시키기 위해 네스티드 중합효소연쇄반응을 수행하였고, 1차 중합효소연쇄반응에서 증폭시킬 수 없는 극미량의 유전자 절편을 2차 중합효소연쇄반응을 통해 증폭할 수 있었으나 다량의 단백질이 존재하는 혈액 시료에는 적용이 힘든 단점이 있었다.
본 발명의 목적은, 녹농균에만 특이성을 보이는 중합효소연쇄반응을 하기 위한 프라이머를 합성하고, 이들 프라이머와 기지의 프라이머를 사용하며 감염의심 대상자 시료로부터 분리한 총 DNA를 템플레이트로 하는 중합효소연쇄반응 조건을 확립하는 것이다. 상기 목적은, 본 발명에 따라 녹농균oprL유전자의 DNA 염기서열 분석을 토대로 하여 가장 적합한 프라이머를 분석 선정하며, 대상시료로부터 미량의 세균 DNA도 손실하지 않는 방법을 확립하며, 위의 선정된 프라이머의 융점온도(Tm)를 고려하여 어닐링 온도를 조절하여 중합효소연쇄반응을 확립함에 의해 달성된다. 여기서 네스티드 중합효소연쇄반응의 2차 반응을 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 염기서열은 컴퓨터 프로그램 분석을 통해 선정할 수 있으며 이 때 녹농균외의 세균 DNA에는 반응하지 않는 특이 프라이머를 선정해야 한다. 또한, 시료의 총 DNA를 손실없이 분리정제하기 위해 Boom, R.등의 (J. of Clin. Microbiol., 1990, vol. 28, p. 495-503) 방법을 토대로 하여 간단한 정제법을 확립해야 한다.
도 1은 녹농균 세포외막단백질 OprL의 유전자 영역의 지도이다.
도 2는 혈액 내에 존재하는 녹농균의 검출한계를 구하기 위하여 정상인의 혈액에 여러 농도로 희석된 녹농균 균주 GN11189를 혼합하고 이로부터 녹농균 염색체 DNA를 분리정제하고 정제된 총 DNA를 템플레이트로 하여 프라이머 P3, P4로 일차 중합효소연쇄반응을 실시한 후(A) 다시 일차 반응물을 템플레이트로 하여 프라이머 P1, P2로 이차 중합효소연쇄반응을 실시하는 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시한 후(B)의 민감성을 보여 주는 전기영동사진이다.
도 3은 녹농균을 포함한 여러 그람 음성균에 대하여 프라이머 P3, P4 및 P1, P2를 사용하여 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시한 후의 특이성을 보여 주는 전기영동사진이다.
도 4는 본 발명의 네스티드 중합효소연쇄반응 방법을 사용하여 화상환자 및 녹농균 백신으로 접종한 화상환자로부터 채취한 혈액에서 녹농균 DNA를 검출한 결과를 보여 주는 전기영동사진이다.
한 관점으로 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시된 센스 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 2의 염기서열로 표시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 구성되 프라이머를 제공한다:
이때, 상기 프라이머는 녹농균 유전자의oprL내의 염기 서열에 특이적으로 반응하는 것이 바람직하다. 또한 상기 프라이머는 녹농균 감염을 진단하는데 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 센스 및 안티센스는 이하 프라이머 P1, P2라 칭한다.
다른 관점으로, 본 발명은 녹농균 감염 또는 추정 환자로부터 채취된 혈액, 감염부위로부터 채취된 생검조직 또는 객담으로부터 총 DNA를 추출하고, 추출된 DNA에 대하여 프라이머 P1, P2를 사용하여 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시하고, 이로부터의 반응산물을 검출하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 녹농균 감염의 진단방법을 제공한다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 녹농균 감염 또는 추정 환자로부터 채취된 혈액, 감염부위로부터 채취된 생검조직 또는 객담으로부터 총 DNA를 추출하고, 추출된 DNA에 대하여 녹농균의oprL유전자의 오픈 리딩 프레임에만 특이적으로 반응하는 공지된 프라이머를 사용하여 1차 중합효소연쇄반응을 실시한 후 이로부터의 반응산물을 템플레이트로 하여 프라이머 P1, P2를 사용하여 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시하고, 이로부터의 반응산물을 검출하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 녹농균 감염의 진단방법을 제공한다.
본 발명에 따라 1차 중합효소연쇄반응에 사용되는 것으로서 녹농균의oprL유전자의 오픈 리딩 프레임에만 특이적으로 반응하는 프라이머는 공지된 것이며 예를 들면 서열번호 3의 센스 및 서열번호 4의 안티센스
가 포함된다(De Vos, D. et al., J. Clin. Microbiol. 1997, Vol. 35, 1295-1299). 본 명세서에서 공지된 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머 (서열번호 3 및 서열번호 4)는 "프라이머 P3, P4"로 칭한다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 녹농균 감염백신 접종자로부터 채취된 혈액, 감염부위로부터 채취된 생검조직 또는 객담으로부터 총 DNA를 추출하고, 추출된 DNA에 대하여 프라이머 P1, P2를 사용하여 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시하고, 이로부터의 반응산물을 검출하는 단계를 포함함을 특징으로 하여 녹농균 감염에 대한 백신의 방어 효능을 진단하는 방법을 제공한다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 녹농균 감염백신 접종자로부터 채취된 혈액, 감염부위로부터 채취된 생검조직 또는 객담으로부터 총 DNA를 추출하고, 추출된 DNA에 대하여 녹농균의oprL유전자의 오픈 리딩 프레임에만 특이적으로 반응하는 공지된 프라이머, 바람직하게는 프라이머 P3, P4를 사용하여 1차 중합효소연쇄반응을 실시한 후 이로부터의 반응산물을 템플레이트로 하여 프라이머 P1, P2를 사용하여 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시하고, 이로부터의 반응산물을 검출하는 단계를 포함함을 특징으로 하여 녹농균 감염에 대한 백신의 방어 효능을 진단하는 방법을 제공한다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 균주로부터 추출된 총 DNA에 대하여 프라이머 P1, P2를 사용하여 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시하고, 이로부터의 반응산물을 검출하는 단계를 포함함을 특징으로 하여 녹농균을 동정하는 방법을 제공한다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 균주로부터 추출된 총 DNA에 대하여 녹농균의oprL유전자의 오픈 리딩 프레임에만 특이적으로 반응하는 공지된 프라이머, 바람직하게는 프라미어 P3, P4를 사용하여 1차 중합효소연쇄반응을 실시하며, 이로부터의 반응산물을 템플레이트로 하여 프라이머 P1, P2를 사용하여 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시하고, 이로부터의 반응산물을 검출하는 단계를 포함함을 특징으로 하여 녹농균을 동정하는 방법을 제공한다.
도 1은 녹농균 세포외막단백질인 OprL의 유전자 영역의 지도이며, 프라이머 P3, P4는 각각oprL유전자의 오픈 리딩 프레임의 시작과 끝 부분에 반응하며 중합효소연쇄반응에 사용하였을 때 504-bp DNA 단편을 증폭하고 프라이머 P1, P2는oprL유전자의 오픈 리딩 프레임의 내부에 있는 염기서열과 반응하여 335-bp DNA 단편을 증폭시킨다. 화살표는oprL유전자의 오픈 리딩 프레임의 방향 및 범위를 가리킨다.
또한, 본 발명의 네스티드 중합효소연쇄반응 방법은 녹농균 감염의 정확한 진단을 약 9-10 시간 이내에 완성한다. 따라서, 본 발명의 네스티드 중합효소연쇄반응 방법에 의해 제공되는 유전자 진단법은 녹농균 패혈증의 정확한 치료를 신속하게 이루어질 수 있도록 해주며 또한 세균학적 배양에 의한 통상적인 진단법의 민감성 및 정확성을 보충해 줄 수 있는 이점이 있다. 또한, 본 발명의 네스티드 중합효소연쇄반응 방법은 통상적인 세균학적 배양법에 의하여 검출할 수 없는 정지기 상태의 녹농균을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 통상적인 방법으로는 검증하기 어려운 녹농균 백신의 환자에서의 감염방어효능을 검증하는데 사용할 수 있다.
하기 실시예로 본 발명을 예시한다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예 1 환자 혈액으로부터의 총 DNA의 추출방법
환자의 전혈 400 ㎕에 현탁완충액 600 ㎕ [83 mM Tris-HCl (pH 8.3),1.6 mM EDTA (pH 8.5), 0.83% Tween 20]을 첨가하고, 잘 섞은 후에 100℃에서 10분간 가열하였다. 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 불용성 물질을 침전시키고, 상등액 600 ㎕를 취하였다. 이 용액에 20 ㎕의 프로티나제 K 용액 (20 mg/ml)을 가하고 2시간 동안 55℃ 수조에서 처리한 후에 10분간 끓여서 효소를 불활성화시켰다. 여기에 pH 7.5 트리스 완충용액으로 평형화된 1:1의 페놀:클로로포름용액을600 ㎕ 가하여 추출하고 원심분리 후 상등액 400 ㎕를 취하여 이소아밀알콜 1 ml과 40 ㎕의 소듐 아세테이트 (pH 5.2)를 가하고 침전시켰다. 원심분리후 DNA 팰렛을 10% 에탄올로 세척하고 10분간 건조시킨후 100 ㎕의 무균 증류수에 용해시켰다.
실시예 2 녹농균 음성혈청에 녹농균을 첨가한 후 총 DNA의 추출방법
건강한 사람의 전혈 400 ㎕에 현탁완충액 500 ㎕ (100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 2 mM EDTA (pH 8.5), 1% Tween 20)을 가하고 녹농균 GN11189 희석액 100 ㎕를 넣고 잘 섞은 후에 100℃에서 10분간 가열하였다. 녹농균 GN11189 희석액은 1X108cells/㎖농도로부터 적정 농도가 만들어지도록 희석을 수행하여 만들었다. 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 불용성 물질을 침전시키고, 상등액 600 ㎕를 취하였다. 이 용액에 20 ㎕의 프로티나제 K 용액 (20 mg/㎖)을 가하고 2시간 동안 55℃ 수조에서 처리한 후에 10분간 끓여서 효소를 불활화시켰다. 여기에 pH 7.5 트리스 완충용액으로 평형화된 1:1의 페놀:클로로포름용액을 600 ㎕ 가하여 추출하고 원심분리후 상등액 400 ㎕를 취하여 이소아밀알콜 1 ml과 40 ㎕의 소듐 아세테이트 (pH 5.2)를 가하고 침전시켰다. 원심분리후 DNA 팰렛을 10% 에탄올로 세척하고 10분간 건조시킨후 100 ㎕의 무균 증류수에 용해시켰다.
실시예 3 녹농균 음성혈청에 여러 그람음성균을 첨가한 후 총 DNA의 추출방법
건강한 사람의 전혈 400 ㎕에 현탁완충액 500 ㎕ (100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 2 mM EDTA (pH 8.5), 1% Tween 20)을 가하고 최종 1.0x108cells/ml 농도가 되도록 적절히 희석되어진P. aeruginosaGN11189,P. aeruginosaPAO1,S. aureus,K. pneumonia,E. cloace,S. marcescens,E. coliJ5 각각의 희석액 100 ㎕를 넣고 잘 섞은 후에 100℃에서 10분간 가열하였다. 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 불용성 물질을 침전시키고, 상등액 600 ㎕를 취하였다. 이 용액에 20 ㎕의 프로티나제 K 용액 (20 mg/㎖)을 가하고 2시간 동안 55℃ 수조에서 처리한 후에 10분간 끓여서 효소를 불활성화시켰다. 여기에 pH 7.5 트리스 완충용액으로 평형화된 1:1의 페놀:클로로포름용액을 600 ㎕ 가하여 추출하고 원심분리후 상등액 400 ㎕를 취하여 이소아밀알콜 1 ml과 40 ㎕의 소디움 아세테이트 (pH 5.2)를 가하고 침전시켰다. 원심분리후 DNA 팰렛을 10% 에탄올로 세척하고 10분간 건조시킨 후 100㎕의 무균 증류수에 용해시켰다.
실시예 4 네스티드 중합효소연쇄반응(PCR) 조건의 확립
녹농균 GN11189 균주의oprL유전자의 염기서열중 타 그람음성균의 염기서열과 비교하여 특이성을 갖는 한 쌍의 특정 프라이머 P1과 P2를 선정하고, 알려진 프라이머 P3과 P4 (De Vos, D. et al., J. Clin. Microbiol. 1997, Vol. 35, pp.1295-1299)와 함께 DNA합성기로 합성하였다. PCR 싸이클러로는 퍼킨 엘커 DNA 써멀 싸이클러 480을 사용하였고, 반응 혼합물중의 각 성분의 농도를 조절하면서 최적의 PCR 조건을 확립하였다 (Innis, M. A. et al., 1989. Optimization of PCRs; pp. 3-12, PCR protocols, Academic Press, Inc., San Diego, California). 어닐링 온도는 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 계산된 융점 온도를 기준으로 조절하였다. 1차 중합효소연쇄반응은 반응혼합물의 전체 용량 50 ㎕ 중 2.5 U의 Taq DNA 폴리머라제와 250 μM씩의 dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP 각각을 함유한 바이오니어 K-2011 아큐파워 PCR 프리믹스 튜브 (바이오니어, 한국)에 10㎕의 상기 총 DNA 추출물을 넣은 후 프라이머 P3과 P4를 0.5 μM로 첨가한 후, 무균 증류수를 가하여 총 반응액의 용량을 50 ㎕로 조절하여 수행하였다. 반응 혼합물이 증발되는 것을 막기 위하여 50 ㎕의 광유를 반응액 위에 가하였다. 1단계 반응으로 반응 혼합물을 94℃에서 3분 동안 변성시켜 주형 DNA가 완전히 해리되도록 한 후 , 2단계 반응으로 55℃에서 40초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 신장, 94℃에서 40초 동안 변성을 총 25회 실시하였다. 25회 후에 72℃에서의 신장 단계를 7분간 수행하여 합성중간물의 적절한 연장을 보장하였다. 네스티드 중합효소연쇄반응을 위하여 1차반응의 반응혼합물 5 ㎕를 수거하여 템플레이트로 사용하였으며 프라이머 P1과 P2를 상기의 프리믹스 키트에 첨가하였다. 오류 양성을 판정하기 위하여 주형 DNA를 제외한 반응 혼합물의 모든 성분에 있어서 동일한 음성 대조군 및 양성 대조군을 매 실험마다 사용하였다.
실시예 5 PCR 산물의 검출
네스티드 중합효소연쇄반응 수행후 합성물의 15 ㎕ 분취물을 ㎖당 1.5% 아가로즈 겔상에서 전기영동하였다. 겔은 표준 DNA 크기 마커(1 kb 래더, 깁코 BRL)와 함께 50V하에 트리스-아세트산-EDTA(TBE) 완충액에서 전개하였고 에티듐 브로마이드로 염색하였다.
도 2는 정상인의 혈액에 녹농균 균주 GN11189를 혼합하고 이로부터 녹농균 염색체 DNA를 포함하는 총 DNA를 분리정제하고 정제된 총 DNA를 템플레이트로 하여 프라이머 P3, P4로 일차 중합효소연쇄반응을 실시한 후(레인 A) 다시 일차 반응물을 템플레이트로 하여 프라이머 P1, P2로 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시한 후(레인 B)의 민감성을 보여 주는 전기영동사진이다. 레인 A는 1 kb 래더 DNA 마커를, 레인 B로부터 G는 녹농균 균주 GN11189를 각각 1x104cells/ml, 1x105cells/ml, 5x102cells/ml, 2.5x102cells/ml, 1.25x102cells/ml 및 6.25x101cells/ml 농도로 함유하는 희석물로부터 정제된 총 DNA를 템플레이트로 하여 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 나타낸다.
도 3은 녹농균을 포함한 여러 그람 음성균에 대하여 프라이머 P3, P4 및 P1, P2를 사용하여 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시한 후의 민감성을 보여 주는 전기영동사진이다. 레인 A는 1 kb 래더 DNA 마커, 레인 B는 음성 대조군, 레인 C로부터 I는 각각P. aeruginosaGN11189,P. aeruginosaPAO1,S. aureus,K. pneumonia,E. cloacae,S. marcescens,E. coliJ5를 1.0x108cells/ml 농도로 함유하는 희석물로부터 정제된 총 DNA를 템플레이트로 하여 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 네스티드 중합효소연쇄반응 방법을 사용하여 화상환자(218번) 및 녹농균 백신으로 접종한 화상환자(302번 및 310번)로부터 채취한 혈액에서 녹농균 DNA를 검출한 대표적인 결과를 보여 주는 전기영동사진이다. 레인 A는 1 kb 래더 DNA 마커, 레인 B 내지 F는 각각 백신을 접종한 날로부터 0일, 7일, 14일, 21일, 28일째 되는 날 채취한 환자 혈청 시료로부터의 PCR 산물을 나타낸다.
네스티드 중합효소연쇄반응의 특이성 및 민감성
네스티드 중합효소연쇄반응의 산물은 프라이머 P3, P4 및 프라이머 P1, P2 각각의 예상 크기 504bp와 335bp의 DNA 밴드를 보여주었다. 여러 녹농균 임상균주 및 패혈증을 일으키는 여러 그람음성균을 정상인의 혈액과 혼합하고 이로부터 정제한 DNA로 동일한 조건의 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시하여 프라이머의 특이성을 시험한 결과, 녹농균 균주는 모두 뚜렷한 표적 밴드를 보인데 반하여 다른 속 및 종의 세균은 음성으로 나타나 본 발명의 방법이 녹농균에 특이성을 갖음을 확인할 수 있었다.
프라이머의 민감성은 연속적으로 희석된 녹농균 GN11189를 정상인의 혈액과 혼합하고 이로부터 분리한 염색체 DNA로 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시하여 검사하였다. 최적 조건하에서 네스티드 중합효소연쇄반응방법에 의한 녹농균의 검출한계는 5x102cells/ml로 나타나 본 발명의 방법은 매우 민감함을 확인할 수 있었다.
화상환자의 감염 진단 및 녹농균 백신 접종자에서의 감염방어효능 검증을 위한 네스티드 중합효소연쇄반응의 적용
가양성 및 오염을 최소화하기 위하여 전-중합효소연쇄반응 준비, 가열 주기, 및 후-중합효소연쇄반응 프로세싱을 표준 프로토콜(Dieffenback, C. W. et al., 1995. Setting up a PCR laboratory, p. 7-16, PCR primer: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press)에서 권장하는 데로 별도의 방에서 별도의 도구로 실시하였다. 가양성 및 가음성은 매 단계마다 음성 대조군과 양성대조군을 사용하여 엄격히 배제시켰다. 프로토콜을 병원에 입원한 화상환자 4명 및 녹농균백신을 접종받은 화상환자 20명으로부터 채취된 혈액 표본에 적용하였다. 화상환자 4명 모두에서 335bp 표적 밴드가 뚜렷하게 증폭되었으며, 이 결과는 본 발명의 프로토콜이 녹농균의 감염진단에 있어 임상 표본에 성공적으로 작용한다는 것을 보여 주었다. 반면에 녹농균 백신을 접종받은 화상환자의 혈액표본의 분석결과 0.5 mg 투여군에서는 초기 3명의 환자에게서 녹농균이 검출되었으나 백신 3회 투여 후 1주일째에는 어느 환자에서도 녹농균이 검출되지 않았다. 1.0 mg의 백신을 투여한 환자에서는 최종일 (21일)에 단 한 명의 환자에서만 녹농균이 검출되었다. 상기의 대조군 환자 혈액의 검사결과와 비교해볼 때, 이 실험결과는 본 발명의 프로토콜이 녹농균의 감염진단 뿐 아니라 녹농균 백신에 의한 감염방어효과를 신속하고 민감하게 검증하는데에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 이 비교결과는 하기 표 1에 기술된 바와 같다.
네스티드 중합효소연쇄반응을 이용한 혈액 시료에 존재하는P. aeruginosa검출.
투약 그룹 환자번호 PCR 결과
0 일 7 일 14 일 21 일 28 일
투약 없음 215218305312320 NT a NT--- NT++-+ +++-+ +++-+ ++++NT
0.5 mg 투약 212213301302303304309311316317 NTNT-+------ NTNT+---+--- NT--------- ---------- ----NT-----
1.0 mg 투약 209211214216217306308310313314315 NTNTNTNTNT------ NTNTNTNT---+-++ NTNT---++---- ----+------ ----+---NT--
aNT, 조사되지 않음.
+, 녹농균이 검출됨
-, 녹농균이 검출안됨
이들 대조군의 화상환자 및 녹농균 백신이 접종된 화상환자는 모두 세균감염을 예방하기 위하여 항생제를 투여받았으므로 이들 화상환자의 혈액을 세균배양법으로 검사하였을 때 어느 환자의 혈액에서도 녹농균이 검출되지 않았다.
환자의 혈액 표본으로부터 최종결과를 얻는데 까지 걸린 총 시간은 9-10시간이었다. 혈액표본으로부터 DNA를 추출하는데 필요한 시간은 약 4-5시간이었으며, 2회의 중합효소연쇄반응과 전기영동에 5시간 가량이 소요되었다.

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 센스 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 2의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 균주로부터 총 DNA를 추출하고, 추출된 DNA에 대하여 녹농균의 oprL 유전자의 오픈리딩 프레임에만 특이적으로 반응하는 프라이머를 사용하여 1차 중합효소연쇄반응을 실시하고 이로부터의 반응산물을 템플레이트로 하여 제 1항에 따른 프라이머로 네스티드 중합효소연쇄반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 녹농균의 동정방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 녹농균의 oprL 유전자의 오픈리딩 프레임에만 특이적으로 반응하는 프라이머가 서열번호 3의 센스 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 4의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머인 것을 특징으로 하는 녹농균의 동정방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 녹농균 유전자의 oprL 내의 염기서열에 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 프라이머.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 녹농균 동정 및 녹농균 감염을 진단하는데 사용됨을 특징으로 하는 프라이머.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5599665A (en) * 1993-12-21 1997-02-04 Mcw Research Foundation Pseudomonas aeruginosa nucleic acids encoding exoenzyme S activity and use thereof in detecting pseudomonas aeruginosa infection
WO1998050557A1 (en) * 1997-05-02 1998-11-12 University Of Guelph Proteins involved in the synthesis and assembly of core lipopolysaccharide of pseudomonas aeruginosa
JPH10304896A (ja) * 1992-07-07 1998-11-17 Fuso Yakuhin Kogyo Kk 感染症診断用プローブ
KR100288868B1 (ko) * 1998-07-23 2001-05-02 고영진 참다래궤양병균동정용프로브및프라이머와이를이용한참다래궤양병진단방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10304896A (ja) * 1992-07-07 1998-11-17 Fuso Yakuhin Kogyo Kk 感染症診断用プローブ
US5599665A (en) * 1993-12-21 1997-02-04 Mcw Research Foundation Pseudomonas aeruginosa nucleic acids encoding exoenzyme S activity and use thereof in detecting pseudomonas aeruginosa infection
WO1998050557A1 (en) * 1997-05-02 1998-11-12 University Of Guelph Proteins involved in the synthesis and assembly of core lipopolysaccharide of pseudomonas aeruginosa
KR100288868B1 (ko) * 1998-07-23 2001-05-02 고영진 참다래궤양병균동정용프로브및프라이머와이를이용한참다래궤양병진단방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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