KR101919313B1 - 클로스트리디움 테타니의 동시 검출용 프라이머 세트, 이를 이용한 진단키트 및 진단방법 - Google Patents

클로스트리디움 테타니의 동시 검출용 프라이머 세트, 이를 이용한 진단키트 및 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파상풍의 원인균인 클로스트리디움 테타니 중 독소를 생성하는 독소형과 독소를 생성하지 않는 비독소형의 유전자를 중합효소연쇄반응으로 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 숙련되지 않은 검사자일지라도 중합효소연쇄반응을 통해 쉽게 비독소형 및 독소형 파상풍균을 동시에 진단할 수 있다.

Description

클로스트리디움 테타니의 동시 검출용 프라이머 세트, 이를 이용한 진단키트 및 진단방법{Primer set for the simultaneous detection of the toxigenic or nontoxigenic Clostridium tetani, diagnostic kit using the same and diagnostic method using the same}
본 발명은 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)의 동시 검출용 프라이머 세트, 이를 이용한 진단키트 및 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파상풍의 원인균인 클로스트리디움 테타니 중 독소를 가진 독소형과 독소가 없는 비독소형의 유전자를 중합효소연쇄반응으로 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 진단방법에 관한 것이다.
파상풍(Tetanus)은 가축의 거세, 분만 시 토양에 존재하는 클로스트리디움 테타니(파상풍균)가 창상감염되어 산생한 파상풍 독소에 의한 감염성 질환이다. 파상풍 독소는 체내에서 억제성 신경전달물질인 감마 아미노뷰티르산(GABA), 글리신(glycine) 등의 방출을 차단함으로서 근육에 지속적인 흥분 상태를 유발하며, 그 결과 전신 강직, 골격근의 발작적 경련을 특징으로 하며 근육 강직은 턱과 목에서 시작해 전신으로 퍼진다.
파상풍균은 그람 양성의 혐기성 간균으로 아포를 형성하며, 이 아포(spore)는 북채 모양을 하고 있으며, 토양, 분변 등 환경에 널리 분포하고 있다. 파상풍균 중 영양형 균주는 열 등에 약하나 아포형 균주의 경우에는 열, 소독제, 건조, 냉동, 방사선 등에 매우 저항성이 강하다 (JJ Farrar et al. Tetanus, J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000;69:292-301).
파상풍은 클로스트리디움 테타니가 상처부위를 통해 체내로 침입하는 것이 가장 일반적인 감염 경로이며, 특히 분변, 토양 중에 존재하는 파상풍균 아포가 깊게 찔린 상처를 통해 유입될 때 파상풍이 많이 유발될 수 있다. 즉, 깊은 상처는 혐기 조건의 형성이 쉬우며, 아포가 발아 및 증식하기 좋은 환경이기 때문이다 (Mellanby J, Green J. How does tetanus toxin act?, Neuroscience 1981, 6(3):281-300).
파상풍균은 감염 조직과 같은 혐기 조건에서 증식하면서 외독소인 tetanolysin과 tetanospasmin 등을 분비하는데, 상기 tetanolysin은 감염 부위를 둘러싼 조직에 국소적으로 상해를 주어 파상풍균의 증식에 적합한 환경을 만들며, 상기 tetanospasmin은 신경독소로 작용하여 파상풍 증상을 유발하게 한다. Tetanospasmin은 사람에서의 치사량이 2.5 ng/kg 정도로서 매우 강력한 독소이다(Cook TM et al. Tetanus：A review of the literature, Br J Anaesth 2001, 87(3):477-487).
비록 파상풍은 독특한 임상 증상으로 진단할 수 있으나, 일반적으로 파상풍 증상이 나타나더라도 파상풍균이 상처 부위에서 분리되지 않을 수 있으며, 파상풍 독소도 혈액에서 검출되지 않는 경우가 많다. 특히 감염 초기에는 독소가 검출되지 않기 때문에 실험실 검사로도 진단하기가 매우 어렵다. 아울러 파상풍과 유사한 증상을 유발하는 질병들이 많으므로(스트크리닌 중독, 중추신경계 감염 등) 이러한 질병들과의 감별 진단법이 필요하다.
파상풍 진단은 균분리·동정에 의존하지 않는데 그 이유는 파상풍균은 파상풍 케이스의 약 30%에서만 그 병변부에서 생존해 있으며, 파상풍에 걸리지 않은 환자에서도 아포형 파상풍균이 분리될 수 있기 때문이다 (Epidemiology and Prevention of Vaccine Preventable Diseases, The Pink Book:Course Textbook 2015; 13th Edition).
이외에도 진단적 접근으로 토양, 장내용물, 분변 등에서 파상풍균을 검출하는 방법이 있다. 시료 배양 상층액을 마우스에 접종하여 독소를 확인하는 중화시험법이 많이 사용되고 있으며, 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하여 이를 주형 DNA로 사용하여 신경독소 유전자를 검출하는 중합효소연쇄반응 기법 또한 사용되고 있다. 이때 신경독소 유전자에 대한 중합효소연쇄반응 기법은 독소를 생성하는 파상풍균에 대한 검출 방법이다(Ganesh M et al. Detection of Clostridium tetani in human clinical samples using tetX specific primers targeting the neurotoxin, J Infect Public Health 2016, 9(1):105-109).
이에 파상풍이 걸리지 않은 사람이나 가축에서도 파상풍균이 검출될 수 있기 때문에 파상풍균의 존재여부 그리고 비독소형 및 독소형 파상풍균을 감별할 수 있는 다중 중합효소연쇄반응 기법이 필수적으로 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 가검물에서 파상풍균 존재유무를 확인함과 동시에 비독소형 및 독소형 파상풍균을 동시에 감별진단할 수 있는 특이적인 프라이머를 새롭게 제작하였고, 상기 프라이머를 이용하여 다중 중합효소연쇄반응을 실시함으로써 가축의 파상풍균을 신속정확하게 진단할 수 있도록 하였다.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 가축의 파상풍균 2종(비독소형과 독소형 파상풍균)을 동시에 신속정확하게 진단하고자 다중 중합효소연쇄반응에 사용되는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 독소형 및 비독소형 파상풍균을 동시에 검출하는 키트로서, 중합효소연쇄반응에 필요한 모든 시약이 1회 테스트 용량으로 혼합, 분주 및 건조되어 있어 숙련되지 않은 검사자일지라도 손쉽게 파상풍균을 진단할 수 있는 다중 중합효소연쇄반응 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 사용하여 손쉽게 파상풍균을 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 달성하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 비독소형 및 독소형 클로스트리디움 테타니의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 비독소형 및 독소형 클로스트리디움 테타니의 동시 검출용 진단키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 다중 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는, 비독소형 및 독소형 클로스트리디움 테타니를 동시에 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 프라이머 세트, 진단키트 및 진단방법을 이용하면 다중 중합효소연쇄반응으로 동물에서 급성 중독성 질병을 일으키는 파상풍균을 신속 간편하게 검출할 수 있을 뿐 아니라, 민감도와 특이도가 높아 시료 내에 미량의 파상풍균이 존재하더라도 특이적으로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 다중 중합효소연쇄반응 키트의 성능을 확인하기 위하여, 비독소형 및 독소형 파상풍균의 DNA를 이용한 다중 중합효소연쇄반응 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 의한 다중 중합효소연쇄반응 키트에 비독소형 및 독소형 파상풍균의 DNA를 이용하여 민감도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 문헌(Campbell JI et al. Microbiologic characterization and antimicrobial susceptibility of Clostridium tetani isolated from wounds of patients with clinically diagnosed tetanus, Am J Trop Med Hyg 2009, 80(5):827-831)에 보고된 파상풍균 독소 유전자 검출법으로 사용하고 있는 단일 중합효소연쇄반응의 민감도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 의한 다중 중합효소연쇄반응 키트의 특이도를 측정한 결과로서, 파상풍균과 유전적 상동성이 있는 균주를 이용하여 독소 유전자를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 클로스트리디움 테타니의 독소 생성 유무 감별을 위한 프라이머 세트, 즉 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 비독소형 및 독소형 클로스트리디움 테타니의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서, "프라이머"라 함은 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 프라이머는 파상풍균의 염색체(chromosome)에 위치하고 있는 표층막 단백질 유전자(surface-layer protein; GenBank accession No. AE015927.1), 플라스미드(plasmid)에 위치하고 있는 독소 유전자(tetanospasmin; GenBank accession No. AF528097.1)의 일부 또는 그 상보적인 염기서열의 일부를 포함하는 것으로서, 상기 2종의 염기서열 내에서 20개의 염기서열로 구성된다.
본 발명에서, 상기 프라이머들은 각 타겟별 정방향과 역방향으로 구성된 2 세트의 프라이머들이 혼합된 다중 중합효소연쇄반응 형태로 사용이 가능하다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 독소를 생성하지 않는 비독소형 파상풍균의 검출용일 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 독소형 파상풍균의 검출용일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여, 비독소형 및 독소형 파상풍균의 동시 검출을 위한 다중 중합효소연쇄반응 키트를 제공한다.
본 발명에서, "중합효소연쇄반응" 이라 함은 널리 사용되는 표준 방법으로서 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.
또한, 본 발명에서, "다중 중합효소연쇄반응" 이란 중합효소연쇄반응에 사용되는 프라이머 2 세트 이상이 하나의 증폭 반응에 사용되는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 키트에서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 독소 생성 유무에 관계없이 모든 파상풍균의 검출용일 수 있다.
본 발명의 상기 키트에서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 독소를 생성하는 파상풍균의 검출용일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 다중 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는, 비독소형 및 독소형 클로스트리디움 테타니를 동시에 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 진단방법에 있어서의 온도 및 시간은 독소형 파상풍균과 비독소형 파상풍균을 동일한 조건에서 서로 다른 프라이머를 이용하여 동시에 검출하기 위한 최적의 조건으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 진단방법은 상기 다중 중합효소연쇄반응 산물의 크기를 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 다중 중합효소연쇄반응 산물의 크기 분석은 이미 잘 알려진 아가로즈 젤 전기영동에 의하여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 알 수 있다.
즉, 프라이머 세트로서 상기 다중 중합효소연쇄반응 산물의 크기가 182 bp인 경우에는 독소를 생성하지 않는 비독소형 파상풍균, 상기 다중 중합효소연쇄반응 산물의 크기가 182 bp 및 853 bp인 경우에는 독소생성 파상풍균이 존재하는 것으로 진단하여 비독소형 및 독소형 파상풍균의 존재 유무를 검출할 수 있다.
본 발명의 상기 진단방법은 민감도가 높아 미량의 파상풍균 유전자가 시료 내에 존재한 경우에도 검출할 수 있는 특징을 지닌다.
또한, 문헌에 보고된 검사법은 독소를 생성하는 파상풍균 유전자만을 검출할 수 있는 한계가 있으나, 상기 진단방법은 독소 생성 유무에 관계없이 모든 파상풍균 유전자를 검출할 수 있어 비독소형 및 독소형 파상풍균 DNA를 30 pg 수준까지 동시에 검출할 수 있고, 검출 효율성 및 편리성을 현저히 높일 수 있다.
즉, 본 발명에 의한 진단방법은 비독소형 및 독소형 파상풍균을 검출하기 위해 단일 중합효소연쇄반응을 진행할 필요가 없으며, 한 번에 비독소형과 독소형 파상풍균의 존재 유무를 신속·정확하게 감별할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 파상풍균의 주형 DNA 수집, 추출
농림축산검역본부에서 보유하고 있는 비독소형 파상풍균, 독소형 파상풍균을 선택하여 주형 DNA를 추출하였다.
각각의 파상풍 균주를 Blood agar plate (BAP)에서 각각 37℃, 2일간 혐기 배양한 후, 다시 Trypticase-Peptone-Glucose-Yeast Extract(TPGY) broth에서 각각 37℃, 2일간 혐기배양한 후 수득한 균체를 95℃, 15분간 가열하여 게놈(genomic) DNA를 추출하였다.
<실시예 2> 프라이머의 제작
프라이머의 제작은 시퀀싱한 DNA 염기서열을 Bioedit 프로그램으로 정렬하고, Primer 5 프로그램을 이용하여 각 유전자별 특이적인 DNA 영역을 선발하여 프라이머로 제작하였는데, 그 결과를 하기 표 1의 비독소형 및 독소형 파상풍균 검출을 위한 유전자 프라이머에 나타내었다.
파상풍균의 독소 유전자(Tetanospasmin; GenBank accession No. AF528097.1), 독소 생성 유무에 관계없이 파상풍균을 검출할 수 있는 표층막 단백질 유전자(Surface-layer protein; GenBank accession No. AE015927.1)의 염기서열 사이에서 20 bp, Tm 값이 48 ~ 52℃가 되도록 임의로 염기서열을 선택하여 정방향 및 역방향 프라이머를 제작하였다. 이때 Tm 값은 Primer 5 프로그램을 사용하여 체크하였다.
대상부위 염기서열 (5’→ 3’) 비고 크기
(bp)
표층막 단백질 AGATGGAGCATATTTGGATA 서열번호 1 182
CAATAGCTGTACTTACCAAG 서열번호 2
신경독소 TCATTTAGAACAATATGGCA 서열번호 3 853
TAAATCACGCAATTTTACTG 서열번호 4
<실시예 3> 다중 중합효소연쇄반응의 수행
제작된 프라이머를 이용하여 다중 중합효소연쇄반응을 수행하여 전기영동으로 증폭산물을 확인하였으며, 증폭산물이 가장 명확하게 나오는 조건을 설정하였다.
다중 중합효소연쇄반응의 수행은 Taq 폴리머라제, 서열번호 1~4의 프라이머 각 1 pmol, dNTP 0.25 nmol 등이 혼합되어 건조된 premix 키트에 주형 DNA를 첨가한 후 RNase free water를 이용하여 최종 20 ㎕가 되도록 조정하였다.
비독소형 및 독소형 파상풍균 검출을 위한 최적의 PCR 반응조건은 94℃, 3분간 초기화 반응, 94℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 연장 반응을 30회 반복한 뒤, 72℃에서 5분간 반응으로 설정되었다.
또한, 프라이머 제작시에 의도했던 DNA 증폭산물의 길이가 전기영동상 적절한 위치에 있는지 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, 비독소형 및 독소형 파상풍균 유전자를 각각 본 발명의 다중 중합효소연쇄반응 진단법에 적용한 결과, 모두 정확한 증폭산물이 확인되어 본 발명의 상기 세트로 가축의 급성 중독성 세균성 질병인 파상풍을 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
상기 도 1에서, 레인 M은 100 bp DNA ladder, 레인 1은 비독소형 파상풍균 유전자, 레인 2는 독소형 파상풍균 유전자, 레인 N은 음성 대조군(negative control)이다.
<실시예 4> 본 발명품과 기존 문헌과의 민감도 비교
보유 균주를 사용하여 본 발명의 다중 중합효소연쇄반응법과 기존에 보고된 단일 중합효소연쇄반응법(Campbell JI et al. Microbiologic characterization and antimicrobial susceptibility of Clostridium tetani isolated from wounds of patients with clinically diagnosed tetanus. Am J Trop Med Hyg 2009, 80(5): 827-831)의 민감도를 비교하였다.
민감도 측정은 파상풍균에서 추출된 주형 DNA를 증류수로 10진 단계 희석(3 ng ~ 300 fg)한 후, 각각 중합효소연쇄반응을 실시하였다.
도 2는 다중 중합효소연쇄반응 키트에 비독소형 및 독소형 파상풍균의 DNA를 이용하여 민감도를 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 레인 M은 100 bp DNA ladder, 레인 1 ~ 5는 비독소형 파상풍균 유전자의 DNA를 3 ng ~ 300 fg까지 각 레인별로 10진 단계로 희석하여 적용한 것이며, 레인 6 ~ 10은 독소형 파상풍균 유전자의 DNA를 3 ng ~ 300 fg까지 각 레인별로 10진 단계로 희석하여 적용한 것이다.
도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의한 상기 키트로 비독소형 및 독소형 파상풍균의 주형 DNA를 첨가하여 민감도를 측정한 결과, 비독소형 파상풍균의 주형 DNA는 3 pg, 독소형 파상풍균의 주형 DNA를 30 pg까지 검출이 가능함을 알 수 있었다.
도 3은 문헌(Campbell JI et al. Microbiologic characterization and antimicrobial susceptibility of Clostridium tetani isolated from wounds of patients with clinically diagnosed tetanus, Am J Trop Med Hyg 2009, 80(5):827-831)에 보고된 파상풍균 독소 유전자 검출법으로 사용하고 있는 단일 중합효소연쇄반응의 민감도를 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 레인 M은 100 bp DNA ladder, 레인 1 ~ 5는 독소형 파상풍균 유전자의 DNA를 3 ng ~ 300 fg까지 각 레인별로 10진 단계로 희석하여 적용한 것이다.
도 3에서는 Campbell 등이 제안한 파상풍 PCR법을 재현한 것으로서, 812 bp의 특이 증폭산물이 30 pg까지 검출이 가능하였다.
따라서 이러한 비교실험을 종합하면, 기존 검사법은 독소형 파상풍균만을 검출할 수 있는 한계가 있으나, 본 발명품은 비독소형 및 독소형 파상풍균을 pg 수준까지 동시에 검출할 수 있었고, 검출 효율성과 사용 편리성이 월등히 개선되었다.
즉, 한번에 2종의 파상풍균을 신속·정확하게 검출할 수 있으며, 모든 시약이 1회 테스트 용량에 맞추어 혼합, 분주, 건조되어 있어 보관 및 안정성이 우수하여 산업상 이용가능성이 높다고 할 수 있다.
<실시예 5> 유전적 상동성이 높은 균주 등을 이용한 본 키트의 특이도 검사
파상풍균과 유전적 상동성이 있는 균주의 주형 DNA를 추출하여 본 키트의 특이도를 조사한 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4는 파상풍균과 유전적 상동성이 높은 균주를 본 발명품에 적용한 결과를 나타낸 것으로서, 레인 M은 100 bp DNA ladder, 레인 1은 음성 대조군(negative control), 레인 2는 Clostridium botulinum type B, 레인 3은 Clostridium botulinum type D, 레인 4는 Clostridium perfringens type A, 레인 5는 Listeria monocytogenes, 레인 6는 Clostridium septicum, 레인 7은 Clostridium tetani(비독소형), 레인 8은 Clostridium tetani(독소형)이다.
도 4에서 보는 바와 같이, 파상풍균을 제외한 나머지 균종에 대해서는 특이적인 반응이 관찰되지 않았으며, 파상풍균에 대해서만 특이적으로 비독소형 및 독소형 파상풍균을 정확하게 검출할 수 있어, 본 키트가 파상풍균의 독소형 감별에 유용함을 알 수 있었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 의한 프라이머 세트, 진단키트 및 진단방법을 이용할 경우, 다중 중합효소연쇄반응으로 동물에 치명적인 파상풍균을 신속간편하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 민감도와 특이도가 높아 시료 내에 미량의 파상풍균이 존재하더라도 특이적으로 검출할 수 있어, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.
<110> Animal and Plant Quarantine Agency <120> Primer set for the simultaneous detection of the toxigenic or nontoxigenic Clostridium tetani, diagnostic kit using the same and diagnostic method using the same <130> 10851 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of surface layer protein <400> 1 agatggagca tatttggata 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of surface layer protein <400> 2 caatagctgt acttaccaag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of tetanospasmin <400> 3 tcatttagaa caatatggca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of tetanospasmin <400> 4 taaatcacgc aattttactg 20

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 비독소형 및 독소형 클로스트리디움 테타니의 동시 검출용 프라이머 세트로서,
    상기 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 독소 생성 유무에 관계없이 모든 클로스트리디움 테타니를 검출하기 위한 표층막 단백질(surface-layer protein) 유전자 검출용이고,
    상기 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 독소생성 클로스트리디움 테타니를 검출하기 위한 신경독소(tetanospasmin) 유전자 검출용인, 비독소형 및 독소형 클로스트리디움 테타니의 동시 검출용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 비독소형 및 독소형 클로스트리디움 테타니의 동시 검출용 진단키트.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항의 프라이머 세트를 사용하여 다중 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는, 비독소형 및 독소형 클로스트리디움 테타니를 동시에 검출하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
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