KR100744699B1 - 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정 및 검출용 특이적프라이머 - Google Patents

인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정 및 검출용 특이적프라이머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정용 프라이머에 관한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머를 사용한 인삼점무늬병균의 진단방법은 농도가 5pg의 DNA 양으로 검출할 수 있고, 특이성이 뛰어나 인삼 생육 기간 중 수시로 식물체를 채취해 감염 여부를 확인할 수 있어 병 확산 방지와 조기 발제가 가능한 효과가 있다. 또한, 학문적으로도 형태적인 특성에 의존하고 있는 알타나리아 파낙스종 동정의 어려움을 쉽게 해결할 수 있을 것이다.
인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 균주, DNA, 중합효소연쇄반응, 프라이머

Description

인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정 및 검출용 특이적 프라이머{Specific primer for identifying and detecting Alternaria panax in Panax ginseng}
도 1은 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스(Alternaria panax)의 유알피 피씨알(URP-PCR)로부터 선발된 종 특이적인 DNA 단편의 염기서열과 알타나리아 파낙스의 특이적 검출을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 PanaxF와 PanaxR의 위치를 나타낸다.
도 2는 알타나리아 파낙스(Alternaria panax)으로부터 분리된 DNA를 주형 DNA로 하고 PanaxF와 PanaxR 프라이머쌍으로 PCR한 결과이다.
도 3은 알타나리아 파낙스(Alternaria panax) 유사종의 알타나리아, 다른 식물 병원균 및 인삼 잎으로부터 분리된 DNA를 주형 DNA로 하고 PanaxF와 PanaxR 프라이머쌍으로 PCR한 결과이다.
도 4는 주형 DNA의 양에 따른 PCR에 의한 PanaxF와 PanaxR 프라미어쌍의 증폭 민감도를 테스트한 결과이다.
도 5는 알타나리아 파낙스로부터 분리된 DNA를 유사종의 알타나리아, 다른 식물 병원균, 및 인삼 잎으로부터 분리된 DNA와 혼합한 후 이들에 대하여 PanaxF와 PanaxR을 프라이머쌍으로 하여 증폭시킨 결과이다.
도 6은 인삼점무늬병에 감염된 식물 조직으로부터 DNA를 분리하고 PanaxF와 PanaxR을 프라미어쌍으로 하여 증폭시킨 결과이다.
본 발명은 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정 및 검출용 특이적 프라이머에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스(Alternaria panax) 균주의 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드, 이들 올리오뉴클레오티드를 프라이머쌍으로 하여 증폭된 DNA 단편 및 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스의 작물체내 존재 여부를 특이적으로 신속 정확하게 분석할 수 있는 방법과 그 키트에 관한 것이다.
인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스는 잎, 엽병, 줄기 등에 발생하여 인삼에 경제적 피해를 일으키는 중요한 병원균의 하나로 인삼재배지역에 전국적으로 분포하고 있다. 인삼점무늬병균은 형태적으로 구별하기 어려운 유사한 알타나리아 속균들이 함께 존재하기 때문에 정확한 균 동정에 어려움을 겪고 있다.
최근 분자생물학을 이용한 다양한 방법의 균 분류 동정법에 등장하면서 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)와 ribosomal DNA의 염기서열을 바탕으로 한 알타나리아의 분류가 소개되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 안출된 것으로, 본 발명의 목적 은 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스(Alternaria panax) 균주의 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머를 이용하여 이병식물체로부터 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 균주를 신속하게 정확하게 검출 및 동정하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 이병식물체의 인삼점무늬병균의 감염 여부를 확인하기 위한 검출용 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 상기 목적은 인삼재배포장에서 URP-PCR을 통해 알타나리아 파낙스 특이적인 폴리뉴클레오티드 서열을 얻고, 상기 염기서열로부터 알타나리아 파낙스 특이적인 서열의 PCR 증폭을 위한 프라이머를 선별하고, 상기 프라이머를 이용하여 알타나리아속 균주와 기타 식물병원균 DNA에 대한 PCR를 실시하여 프라이머의 특이성, 민감도 및 알타나리아 파낙스의 감염 여부를 판단할 수 있는 상기 프라이머의 용도를 확인하고, 인삼점무늬병에 감염된 식물 조직을 이용하여 알타나리아 파낙스를 동정함으로써 달성하였다.
본 발명은 알타나리아 파낙스에 특이적인 게놈 DNA 단편의 분리단계; 알타나리아 파낙스 동정에 사용될 수 있는 프라이머 선별단계; 상기 프라이머를 이용한 PCR 실시단계; 및, 인삼점무늬병에 감염된 식물 조직을 이용한 알타나리아 파낙스 감염 여부 동정단계로 구성된다.
본 발명 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스(Alternaria panax) 진단용 프라이머는 다음의 단계별로 제작하였다.
제 1단계: 알타나리아 파낙스에 특이적인 게놈 DNA 단편의 분리
알타나리아 파낙스에 특이적인 게놈 DNA 단편을 분리하고자, 먼저 국내 인삼재배포장으로부터 분리한 알타나리아 파낙스, 알타나리아 알타나타, 알타나리아 태뉴시마, 및 다른 식물병원균을 분리하였고, 그로부터 DNA을 분리하고 URP-05프라이머를 이용하여 URP-PCR을 실시하였다(i-cycler(BIO-RAD, USA)의 매뉴얼에 따라 실시함). 그 결과 1295bp의 단편의 알타나리아 파낙스에만 특이적인 밴드를 얻었다. 이 단편의 염기서열을 결정한 결과가 도 1 및 서열목록 서열번호 1에 기재하였다.
제 2단계: 알타나리아 파낙스 동정에 사용할 수 있는 프라이머 선별
위에서 얻은 1295bp의 단편으로부터 알타나리아 파낙스에 특이적인 단편을 더욱 세밀하게 분리하고자 서열목록 서열번호 1의 서열을 바탕으로 primer1_www.cgi v 0.2 프로그램을 이용하여 프라이머를 설계하였다. 그 결과 프라이머쌍 PanaxF: 5‘-ATAGCAGCACAGGTCAATCT-3'와 PanaxR: 5'-CTTTTCCGAAAGCTGAGTA-3'이 적절한 프라이머로 선택되었다.
제 3단계: PanaxF 와 PanaxR 프라이머쌍을 이용한 PCR 반응
표 1에서 제시한 수종의 곰팡이들의 게놈 DNA를 추출한 후 선발한 PanaxF와 PanaxR을 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 그 결과 알타나리아 파낙스의 게놈 DNA 를 사용한 경우에만 대략 470bp의 단편이 증폭되는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 PanaxF와 PanaxR 프라이머쌍을 이용함으로써 알타나리아 파낙스의 존재를 동정해낼 수 있음을 구체적으로 뒷받침한다.
본 발명의 작물의 알타나리아 파낙스 감염 여부를 확인하는 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(1) 감염된 작물의 일부 또는 시험하고자 하는 균주로부터 PCR을 수행하기 위한 표본제조과정;
(2) 서열목록 서열번호 2와 3에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 과정; 및
(3) 470bp 단편의 증폭 여부를 확인하는 과정.
본 발명의 작물의 알타나리아 파낙스 감염 여부를 확인하는 다른 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(1) 감염된 작물의 일부 또는 시험하고자 하는 균주로부터 핵산을 추출하여 표본을 제조하는 과정; 및
(2) 제1항의 폴리뉴클레오티드 또는 제4항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 혼성화 여부를 확인하는 과정을 포함함.
본 발명은 적어도 하나의 용기에 서열목록 서열번호 1에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 서열목록 서열번호 2 및 3에 기재된 프라이머 또는 서열목록 서열번호 4에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 작물의 병원균 감염 여부를 확인할 수 있는 검출용 키트를 이용하여 작물의 알타나리아 파낙스 감염 여부를 확인할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용은 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 알타나리아 파낙스에 특이적인 게놈 DNA 단편의 분리
알타나리아 파낙스에 특이적인 게놈 DNA 단편을 분리하고자, 먼저 국내 인삼재배포장으로부터 분리한 알타나리아 파낙스, 알타나리아 알타나타, 알타나리아 태뉴시마, 및 다른 식물병원균을 분리하였고, 그로부터 DNA을 분리하고 URP-05프라이머를 이용하여 URP-PCR을 실시하였다(i-cycler(BIO-RAD, USA)의 매뉴얼에 따라 실시함). 그 결과 1295bp의 단편의 알타나리아 파낙스에만 특이적인 밴드를 얻었다. 이 단편의 염기서열을 결정한 결과가 도 1 및 서열목록 서열번호 1에 기재하였다.
실시예 2: 알타나리아 파낙스 DNA에 대한 PanaxF 및 PanaxR 프라이머쌍을 이용한 PCR 반응
PanaxF: 5'-ATAGCAGCACAGGTCAATCT-3'와 PanaxR: 5'-CTTTTCCGAAAGCTGAGTA-3'을 프라이머쌍으로 이용하여 표 1에 제시된 수종의 곰팡이 분리균주 및 인삼에 대하여 다음과 같은 방법으로 DNA를 분리하였다. 동결건조된 균사체 및 조직 소량을 파쇄한 뒤 400㎕의 extract buffer[200mM Tris-HCl(pH8.0), 200mM NaCl, 30mM EDTA, 0.5%SDS]에 현탁하고 proteinase K 50㎕을 첨가, 37℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. 여기에 2×CTAB solution[2% CTAB(w/v), 100mM Tris-HCl(pH8.0), 20mM EDTA(pH8.0), 1.4M NaCl, 1% PVP(polyvinylpyrrolidone)]을 첨가하여 섞은 뒤 chloroform:isoamyl alcohol(24:1)로 추출하고 원심분리하여 얻은 상등액에 0.7volume의 isopropanol을 첨가하여 DNA를 얻었다. TE buffer에 DNA를 녹이고 RNase A를 첨가한 뒤 정량하여 4℃에 보관하였다. PCR을 행하기 위한 조건은 다음과 같다. 즉, preheating을 95℃에서 10분 한 후 95℃ 40초, 58℃ 40초, 72℃ 1분에서 각각 30회 반복하고 이후 72℃에서 15분 동안 반응을 수행하였다. 반응산물은 총 volume을 50㎕로 하고 template DNA 10ng, 각각의 프라이머 25pmol, 250μM dNTP, 10mM Tris-HCl(pH9.0), 40mM KCl, 1.5mM MgCl2 및 2.5U의 Taq-DNA polymerase을 첨가하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 여러 숙주에서 분리한 알타나리아 파낙스 15개의 균주 모두에서 470bp의 밴드가 증폭되었다.
본 발명에 사용된 알타나리아 파낙스 및 기타균주
병원균 균주번호 숙주 분리지역
Alernaria panax CNU-3010 CNU-3017 CNU-3028 CNU-3161 CNU-3175 CNU-3231 CNU-3269 CNU-3382 CNU-3405 CNU-3546 CNU-3578 CNU-APG4 CNU-APG5 CNU-AP0407 CNU-AP0408 Kalopanax pictus Aralia elata Acanthopanax senticos Aralia elata Aralia continentalis Aralia continentalis Acanthopanax koreanum Echinopanax horrium Panax ginseng Panax ginseng Panax ginseng Panax ginseng Panax ginseng Panax ginseng Panax ginseng 충남 부여 충남 부여 충남 금산 대전 KT&G 대전 KT&G 대전 KT&G 충남 금산 경북 울릉도 충남 금산 충남 금산 충남 금산 충남 금산 충남 금산 충남 금산 충남 금산
A. tenuissima IMI-79630 CNU-A005 - Panax ginseng 알려지지 않음 충남 금산
A. alternata CNU-SS703 IMI-89343 CNU-N1701 Panax ginseng - - 충남 금산 알려지지 않음 전남
Rhizotonia solani - Panax ginseng 대전
Botrytis cinerea - Panax ginseng 대전
Colletotrichum gloeosporioide - Panax ginseng 충남 금산
Phytophthora cactorum - - 대전
Pythium sp . - Panax ginseng 대전
실시예 3: 알타나리아속 및 기타 식물병원균 DNA에 대한 PanaxF 와 PanaxR 프 라이머쌍의 특이성 확인 시험
알타나리아 파낙스(Alternaria panax)와 형태적으로 유사한 알타나리아 알타나타(A. alternata), 알타나리아 태뉴시마(A. tenuissima) 및 기타 식물병원균 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 파이토프쏘라 카토럼(Phytophthora cactorum), 피씨움 종(Pythium sp .) 및 콜렉토트리큠 글레오스토리데스(Colletotrichum gloeosporioide) 및 인삼 잎으로부터 DNA를 얻고 PanaxF와 PanaxR 프라이머쌍을 이용해 위와 동일한 방법으로 PCR 증폭을 실시하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 알타나리아 파낙스(Alternaria panax)가 들어있는 시료(레인 1)에서만 470bp의 PCR 산물이 증폭되는 것을 확인할 수 있었다. 그 외의 알타나리아 알타나타(A. alternata)(레인 2~4), 알타나리아 태뉴시마(A. tenuissima) (레인 5~6), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)(레인 7), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)(레인 8), 콜렉토트리큠 글레오스토리데스(Colletotrichum gloeosporioide)(레인 9), 파이토프쏘라 카토럼(Phytophthora cactorum)(레인 10), 피씨움 종(Pythium sp .)(레인 11) 등의 다른 진균성 식물병원균 및 인삼(레인 12)에서는 증폭된 DNA 밴드를 검출할 수 없었다.
이러한 사실로부터 증폭된 단편이 실제로 알타나리아 파낙스에만 특이적으로 존재하는 서열이라는 점을 더욱 구체적으로 확인할 수 있었다.
실시예 4: PanaxF 와 PanaxR 프라이머쌍의 민감도 시험
DNA 시료양에 따른 PCR에 의한 PanaxF와 PanaxR 프라이머쌍의 증폭 민감성 정도를 측정하였다. 본 발명에 따른 알타나리아 파낙스(Alternaria panax)의 게놈 DNA 양을 레인 1에서 레인 13까지 각각 40ng, 20ng, 10ng, 5ng, 1ng, 500pg, 200pg, 100pg, 50pg, 10pg, 5pg, 1pg, 500fg 까지 조절한 다음, 여기에 PanaxF와 PanaxR 프라이머쌍을 연속적으로 반응시켜 확인하였으며 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 상기 프라이머쌍을 이용하였을 때 11 레인(5pg)까지 명확하게 증폭산물이 나타난 것을 볼 수 있었고, 이를 미루어 최저 검출 수준은 5pg임을 알 수 있었다.
실시예 5: 유사종의 알타나리아 , 식물병원균 및 인삼 DNA 혼합액으로부터 알타나리아 파낙스의 특이적 검출
알타나리아 파낙스와 형태적으로 유사한 알타나리아 알타나타(A. alternata), 알타나리아 태뉴시마(A. tenuissima) 및 기타 식물병원균 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 파이토프쏘라 카토럼(Phytophthora cactorum), 피씨움 종(Pythium sp .) 및 콜렉토트리큠 글레오스토리데스(Colletotrichum gloeosporioide) 및 인삼 잎으로부터 DNA를 얻고, 이들을 알타나리아 파낙스의 DNA와 같은 비율로 혼합한 후 PanaxF와 PanaxR 프라이머를 이용해 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 PCR 증폭을 실시하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 알타나리아 파낙스(레인 1), 알타나리아 파낙스와알타나리아 알타나타(A. alternata)(레인 2), 알타나리아 파낙스와 알타나리아 태뉴시마(A. tenuissima)(레인 3), 알타나리아 파낙스와 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)(레인 4), 알타나리아 파낙스와 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)(레인 5), 알타나리아 파낙스와 파이토프쏘라 카토럼(Phytophthora cactorum)(레인 6), 알타나리아 파낙스와 피씨움 종(Pythium sp .)(레인 7), 알타나리아 파낙스와 콜렉토트리큠 글레오스토리데스(Colletotrichum gloeosporioide)(레인 8), 알타나리아 파낙스, 알타나리아 알타나타(A. alternata)와 알타나리아 태뉴시마(A. tenuissima)(레인 9), 알타나리아 파낙스와 인삼 잎으로부터 DNA(레인 10)중 알타나리아 파낙스가 들어있는 시료에서 470bp의 PCR 산물이 증폭되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 본 발명의 프라이머쌍을 사용함으로써 알타나리아 파낙스의 감염여부를 명확하게 판단할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 6: 인삼점무늬병에 감염된 식물 조직을 직접 이용한 알타나리아 파낙스의 동정방법
인삼점무늬병에 감염된 식물조직으로부터 직접 알타나리아 파낙스의 검출이 가능한지 알아보았다. 인삼점무늬병 이병 조직, 탄저병 이병 조직과 건전조직의 일부를 잘라 PanaxF와 PanaxR 프라이머를 사용하여 위에 기술한 조건으로 PCR 증폭을 실시하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 탄저병 이병 조직(레인 8)과 건전부위의 조직(레인 9)은 증폭 결과가 나타나지 않았지만 인삼점무늬병 이병 조직(레인 1~7)에서는 정확하게 470bp의 증폭 산물을 확인할 수 있었다.
따라서, 감염이 의심되는 인삼의 조직을 사용하여 본 발명 프라이머쌍으로 PCR을 수행함으로써 알타나리아 파낙스에 의한 감염 여부를 쉽게 확인할 수 있음을 알 수 있었다.
상기 실시예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정용 프라이머에 관한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머를 사용한 인삼점 무늬병균의 진단방법은 농도가 5pg의 DNA 양으로 검출할 수 있고, 특이성이 뛰어나 인삼 생육 기간 중 수시로 식물체를 채취해 감염 여부를 확인할 수 있어 병 확산 방지와 조기 발제가 가능한 효과가 있다. 또한, 학문적으로도 형태적인 특성에 의존하고 있는 알타나리아 파낙스종 동정의 어려움을 쉽게 해결할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 작물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 유알피 피시알(URP-PCR)에 의해 선발되며, 서열목록 서열번호 1에 기재된, 인삼점무늬병 진단용 프라이머로 사용됨을 특징으로 하는 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스(Alternaria panax) 종 특이적인 폴리뉴클레오티드.
  2. 서열목록 서열번호 2와 3에 기재된, 알타나리아 파낙스(Alternaria panax)의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR 증폭에 사용되는 프라이머.
  3. 삭제
  4. 알타나리아 파낙스(Alternaria panax)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열목록 서열번호 2와 3에 기재된 프라이머를 사용하여 중합연쇄반응(PCR)을 수행하였을 때 증폭되는 470bp 중 서열번호 2와 3에 기재된 프라이머 서열의 증폭된 서열을 제외한 서열번호 4에 기재된 알타나리아 파낙스(Alternaria panax) 특이적 폴리뉴클레오티드.
  5. 작물의 알타나리아 파낙스(Alternaria panax) 감염 여부를 확인하는 방법에 있어서,
    (1) 감염된 작물의 일부 또는 시험하고자 하는 균주로부터 PCR을 수행하기 위한 표본제조과정;
    (2) 서열목록 서열번호 2와 3에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 과정; 및
    (3) 470bp 단편의 증폭 여부를 확인하는 과정을 포함함을 특징으로 하는 작물의 알타나리아 파낙스(Alternaria panax) 감염 여부를 확인하는 방법.
  6. 작물의 알타나리아 파낙스(Alternaria panax) 감염 여부를 확인하는 방법에 있어서,
    (1) 감염된 작물의 일부 또는 시험하고자 하는 균주로부터 핵산을 추출하여 표본을 제조하는 과정; 및
    (2) 제1항의 폴리뉴클레오티드 또는 제4항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 혼성화 여부를 확인하는 과정을 포함함을 특징으로 하는 작물의 알타나리아 파낙스 (Alternaria panax) 감염 여부를 확인하는 방법.
  7. 적어도 하나의 용기에 제1항 기재의 폴리뉴클레오티드 또는 서열목록 서열번호 2와 3에 기재된 프라이머 또는 제4항 기재의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함함을 특징으로 하는 작물의 알타나리아 파낙스(Alternaria panax) 감염 여부를 확인하기 위한 검출용 키트.
KR1020050108145A 2005-11-03 2005-11-11 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정 및 검출용 특이적프라이머 KR100744699B1 (ko)

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