KR101413102B1 - 코클리오볼루스 미야베아누스 검출용 조성물 및 이를 이용한 코클리오볼루스 미야베아누스 검출방법 - Google Patents

코클리오볼루스 미야베아누스 검출용 조성물 및 이를 이용한 코클리오볼루스 미야베아누스 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코클리오볼루스 미야베아누스 검출용 조성물 및 이를 이용한 코클리오볼루스 미야베아누스 검출 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 코클리오볼루스 미야베아누스 검출을 위한 프라이머 세트와 코클리오볼루스 미야베아누스 정량 검출을 위한 프로브를 제공한다. 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브를 이용하면 코클리오볼루스 미야베아누스를 높은 민감도로 정확하고 신속하게 검출하는 것이 가능하고, 코클리오볼루스 미야베아누스에 의한 깨씨무늬병 진전 정도를 정량화하여 객관적으로 수치화할 수 있어, 농업에서 분자생물학적 예찰 시스템으로 정착될 것으로 기대된다.

Description

코클리오볼루스 미야베아누스 검출용 조성물 및 이를 이용한 코클리오볼루스 미야베아누스 검출방법{Composition for detecting Cochliobolus miyabeanus and method for detection of Cochliobolus miyabeanus using the same}
본 발명은 분자생물학적 수단을 이용해 코클리오볼루스 미야베아누스(Cochliobolus miyabeanus)를 검출하는 방법, 이에 이용되는 프라이머 및 프로브, 및 이를 포함한 조성물에 관한 것이다.
코클리오볼루스 미야베아누스(Cochliobolus miyabeanus)는 자낭균의 일종으로 벼를 비롯한 보리, 옥수수, 수수, 또는 조 등 화본과 식물에 기생한다. 분생포자의 생존기간은 종자에 기생하는 경우 약 2개월이며 균사는 약 3년으로 생육온도 폭이 넓어 한국에서는 균사상태로 월동하여 이듬해 1차 전염원이 된다.
코클리오볼루스 미야베아누스는 특히 깨씨무늬병(rice brown leaf spot)의 발병 원인으로서, 깨씨무늬병은 한국을 포함한 여러 나라의 벼 경작지에 막심한 피해를 주고 있다. 더욱이, 이 병은 고온성 병으로 지구 환경 격변에 더불어 병발이 증가하고 있으며, 저투입 농법의 보급에 따라 발병필지 면적이 급속히 증가하고 있다. 깨씨무늬병은 벼의 전생육기간에 거쳐 발병하지만 특히 벼 등숙기의 지엽을 선호하며 심하게 발병한 포장에서는 수확을 하더라도 백립중이나 천립중이 감소하고 벼 등숙상태가 불량해진다.
이에, 코클리오볼루스 미야베아누스를 검출할 용이하고 경제적인 방법의 개발이 시급하다. 그러나 코클리오볼루스 미야베아누스을 검출하여 깨씨무늬병을 정확하게 진단 및 예찰할 수 있는 분자생물학적 수단은 현재까지 개발된 바 없으며 육안 관찰에 의한 병 진단 및 병 발생량 측정이 가장 널리 사용되고 있다. 하지만, 육안으로 관찰될 정도로 병징이 진전되었다면, 깨씨무늬병이 확산되기에 충분한 정도의 초기전염원이 존재하고 있다고 볼 수 있으므로 병의 확산을 예방하기에는 어려운 상태로 간주해야 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
이에, 본 발명자들은 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 이용하여 코클리오볼루스 미야베아누스를 고감도로 검출할 수 있는 방법에 대해 연구하였다. 그 결과, 코클리오볼루스 미야베아누스에 특이적인 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트 및 프로브를 개발하였고, 이를 이용해 중합효소연쇄반응을 하면 다른 균은 배제하고 특이적으로 코클리오볼루스 미야베아누스를 높은 민감도로 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 뿐만 아니라 정량화하여 객관적으로 수치화할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 코클리오볼루스 미야베아누스에 특이적인 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 코클리오볼루스 미야베아누스 검출용 조성물 및 이를 이용한 코클리오볼루스 미야베아누스 검출방법을 제공하는데에 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 일 태양으로, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트, 이를 포함하는 코클리오볼루스 미야베아누스(Cochliobolus miyabeanus) 검출용 조성물, 및 이를 이용해 코클리오볼루스 미야베아누스를 검출하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 코클리오볼루스 미야베아누스를 검출하는 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다: 시료(sample)로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트를 이용해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계.
본 발명자들은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트를 이용해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하면, 코클리오볼루스 미야베아누스를 특이적으로 고감도로 검출할 수 있음을 확인하였다.
이하, 상기 방법을 상세히 설명하면 하기와 같다.
본 발명에 따른 명세서에 있어서, 상기 "시료(sample)"에는 코클리오볼루스 미야베아누스에 감염되었을 것으로 예상되는 식물이라면 모두 포함될 수 있고, 상기 식물의 어느 부위에서든 채취할 수 있으며, 예를 들어 식물의 잎, 줄기 및 알곡 중 어느 하나에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 식물에는 바람직하게 화본과 식물이 포함될 수 있으며, 예를 들어 벼, 보리, 옥수수, 수수, 또는 조가 있으나 이에 제한되지 않으며, 가장 바람직하게 벼이다.
본 발명의 "DNA 추출"은 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있고, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명에 따른 명세서에 있어서, 상기 "프라이머"는 중합효소연쇄반응에서 이용되는 타깃 핵산에 인접해 있는 5'말단 서열 및 3'말단 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명에 따른 명세서에 있어서, "전방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 중합효소연쇄반응에 의해 증폭되는 유전자의 일정 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 서열번호 1의 전방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진다.
본 발명에서, 프라이머로써 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있으며, 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수도 있다.
본 발명에서, 프라이머 세트는 표적 서열에 혼성화되고, 표적 서열을 증폭할 수 있다. 본 발명에 따른 명세서에 있어서, 상기 "혼성화"는 DNA 주형과 비공유적으로 결합하는 것을 의미하며, 보다 상세하게는 프라이머가 DNA 증폭반응에서 본래의 기능을 할 수 있을 정도로 DNA 주형과 비공유적으로 결합되어 있는 상태를 의미하는 것이다. 즉, DNA 주형에 대하여 완전하게 왓슨/크릭 염기쌍을 이루는 것뿐만 아니라, 부분적으로 왓슨/크릭 염기쌍을 이루지 못한 부분이 있다 하더라도, 프라이머로 기능을 할 수 있을 정도로 DNA 주형에 대해 결합한 것을 의미한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 스키탈론 탈수 유전자(scytalone dehydratase; CmSCD1)를 표적 서열로 한다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 모든 코클리오볼루스 미야베아누스에 존재하되, 한개씩만 존재하는 스키탈론 탈수 유전자(scytalone dehydratase; CmSCD1)를 표적으로 하여 증폭시키므로, 코클리오볼루스 미야베아누스를 특이적으로 고감도로 검출할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용해 코클리오볼루스 미야베아누스를 포함한 7종의 진균을 대상으로 중합효소연쇄반응을 수행한 결과, 코클리오볼루스 미야베아누스에서만 증폭산물을 검출할 수 있었으며 그 외 진균에서는 증폭산물을 검출할 수 없어, 코클리오볼루스 미야베아누스만 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(도 2 참고).
프라이머 세트를 이용해 표적 핵산을 증폭하는 방법에는 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 가능하다.
상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 표적 핵산을 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명에서, 중합효소연쇄반응(PCR)액에는 상기 시료로부터 추출한 DNA를 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 포함한다. 중합효소연쇄반응액에는 DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합효소 조인자를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 예를 들어, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
중합효소연쇄반응은 변성(denaturation) 단계, 어닐링(annealing) 단계 및 신장(elongation) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다. 본 발명에 따른 명세서에서, "사이클"은 표적 핵산의 1 카피(copy)를 생성하는 과정을 의미한다. 상기 변성, 어닐링 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 특정의 범위로 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 상기 중합효소연쇄반응은 (i) (94)-(96)℃에서 (15)-(30)초간의 변성(denaturation) 과정 및 (ⅱ) (53)-(57)℃에서 (15)-(30)초간의 어닐링(annealing) 및 (iii) (68)-(72)℃에서 (15)-(30)초간신장(elongation)과정으로 이루어지는 1 사이클을 (20)-(40)회 반복 수행하는 단계를 포함한다.
중합효소연쇄반응은 정성적인 방법과 정량적인 검출방법으로 나눌 수 있고, 정성적인 PCR법은 구체적으로 screening, 유전자 특이적(gene-specific), 구조 특이적(construct-specific) 및 계통 특이적(event-specific) PCR 검출법으로 구분된다. 또한, 정량적인 PCR법 중 대표적인 것은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)법이다. 실시간 중합효소연쇄반응은 표적 서열 특이적 프라이머와 형광물질이 연결된 프로브를 이용하여 중합연쇄반응시 프로브로부터 형광체가 해리되어 형광발색의 양을 측정하여 표적 핵산의 양을 정량화하는 원리이다.
본 발명자들은 상기 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통해 시료 내 포함된 코클리오볼루스 미야베아누스를 정량화할 수 있음을 확인하였고, 특히 본 발명에 따른 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3으로 표시되는 프로브 세트를 이용함으로써 실시간 중합효소연쇄반응한 결과 300 femtogram(fg)까지 우수한 고감도로 코클리오볼루스 미야베아누스를 정량화할 수 있음을 확인하였다(도 3).
이에, 다른 양태로 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 프로브, 상기 프로브와 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 포함하는 코클리오볼루스 미야베아누스(Cochliobolus miyabeanus) 정량 검출용 조성물, 및 이를 이용해 코클리오볼루스 미야베아누스를 정량적으로 검출하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 코클리오볼루스 미야베아누스를 정량 검출하는 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 시료(sample)로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3으로 표시되는 형광물질로 표지된 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계, 및
(b) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 증폭산물에서의 형광신호를 측정하는 단계.
이하, 상기 방법을 상세히 설명하되, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 일 양태로서 코클리오볼루스 미야베아누스를 검출하는 방법에서의 시료, 시료로부터 DNA 추출, 중합효소연쇄반응액에 포함되는 성분, 반응 조건, 및 중합효소연쇄반응과 중복되는 설명은 생략한다.
본 발명에 따른 프로브는 서열번호 3으로 표시되고, 프로브로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있으며, 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수도 있다.
본 발명에서, 프로브는 표적 서열에 혼성화되고, 상기 "혼성화"는 DNA 주형과 비공유적으로 결합하는 것을 의미하며, 보다 상세하게는 프로브가 본래의 기능을 할 수 있을 정도로 DNA 주형과 비공유적으로 결합되어 있는 상태를 의미하는 것이다. 즉, DNA 주형에 대하여 완전하게 왓슨/크릭 염기쌍을 이루는 것뿐만 아니라, 부분적으로 왓슨/크릭 염기쌍을 이루지 못한 부분이 있다 하더라도, 프로브로 기능을 할 수 있을 정도로 DNA 주형에 대해 결합한 것을 의미한다.
본 발명에 따른 프로브는 스키탈론 탈수 유전자(scytalone dehydratase; CmSCD1)를 표적 서열로 한다.
본 발명에 따른 프로브는 실시간 중합효소연쇄반응에 이용될 수 있는바, TagMan　 프로브는 형광 리포터 분자 및 형광 소멸자를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 본 발명에 따른 명세서에 있어서, 상기 "TagMan　 프로브"는 PCR 어닐링 단계에서 DNA 주형에 특이적으로 혼성화되지만 프로브의 3'-말단에 형광 소멸자가 부착되어 있어서 빛을 주어도 형광을 발하지 못하다가, 신장 단계에서 DNA 중합효소가 가지고 있는 5→3 뉴클레아제(nuclease) 활성에 의해, 주형에 혼성화된 프로브가 분해되면 형광물질이 프로브로부터 분리되어 형광 소멸자에 의한 억제가 해제되고 형광을 발하게 된다. 따라서, 형광의 세기를 측정하게 되면 DNA의 양을 정량적으로 분석할 수 있게 된다.
본 발명에서, 프로브의 말단의 인접한 부위에 결합하는 형광성 리포터 분자는 예를 들어, 5-카복시플루오레세인 (5-carboxyfluorescein: 5-FAM), 6-카복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein: 6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (tetrachlorofluorescein: TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (hexachlorofluorescein: HEX) 및 2',7'-디메톡시(dimethoxy)-4',5'-디클로로 (dichloro)-6-카복시로다민(carboxyrhodamine: JOE)등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 형광 소멸자는 예를 들어, 블랙홀 켄처 다이 (black hole quencher dye; BHQ1), 테트라메틸(tetramethyl)-6-카복시로다민 (carboxyrhodamine: TAMRA), 테트라프로파노(tetrapropano)-6-카복시로다민(carboxyrhodamine: ROX), 시아닌 (cyanine), 안트로퀴논 (anthraquinone), 니트로티아졸 (nitrothiazole) 및 니트로이미다졸 (nitroimidazole) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 형광성 리포터 분자는 카복시플루오레세인(FAM), 형광 소멸자는 BHQ1를 사용하였다
본 발명에서, 상기 형광성 리포터 분자가 방출하는 형광의 상대적 증가가 PCR 도중에 실시간으로 모니터될 수 있다. 따라서, 상기 실시간 중합효소반응은 증폭산물을 실시간으로 모니터링하여 증폭산물의 정확한 정량이 가능하도록 하며, 형광의 세기를 측정하여 PCR 증폭산물의 양을 결정할 수 있다.
본 발명에서, 코클리오볼루스 미야베아누스를 정량적으로 검출하는 방법은 코클리오볼루스 미야베아누스의 감염정도를 이미 알고 있는 식물로부터 얻은 DNA 주형을 이용하여 표준곡선을 작성하는 단계 및 미지의 DNA 시료를 이용하여 측정된 형광 세기의 값을 상기 표준곡선에 대입하여 코클리오볼루스 미야베아누스의 스키탈론 탈수 유전자의 함량을 확인하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
실시간 중합효소연쇄반응은 변성(denaturation) 단계, 어닐링(annealing) 단계 및 신장(elongation) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 상기 중합효소연쇄반응은 (i) (94)-(96)℃에서 (15)-(30)초간의 변성(denaturation) 과정 및 (ⅱ) (53)-(57)℃에서 (15)-(30)초간의 어닐링(annealing) 및 (iii) (68)-(72)℃에서 (15)-(30)초간신장(elongation)과정으로 이루어지는 1 사이클을 (20)-(40)회 반복 수행하는 단계를 포함한다.
한편, 본 발명에 따른 코클리오볼루스 미야베아누스 (정량) 검출용 조성물 및 (정량적) 검출 방법은 코클리오볼루스 미야베아누스로 인해 발병하는 모든 병(disease), 증상(symptom) 또는 장애(disorder)를 진단 또는 예찰하기 위해 적용될 수 있다. 바람직하게, 깨씨무늬병을 진단 또는 예찰하기 위해 적용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브가 표적 서열로 하는 스키탈론 탈수 유전자는 코클리오볼루스 미야베아누스에 의한 깨씨무늬병 발병에 필수적인 병원성 관련 유전자이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브는 스키탈론 탈수 유전자를 표적으로 하는바, 스키탈론 탈수 유전자 존부를 검출하여 코클리오볼루스 미야베아누스 존부를 검출하며 이로써 깨씨무늬병을 진단 또는 예찰할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용하면 코클리오볼루스 미야베아누스를 높은 민감도로 정확하고 신속하게 검출하는 것이 가능하고, 코클리오볼루스 미야베아누스에 의한 깨씨무늬병 진전 정도를 정량화하여 객관적으로 수치화할 수 있어, 농업에서 분자생물학적 예찰 시스템으로 정착될 것으로 기대된다.
도 1은 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)에 이용한 프라이머 및 프로브의 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 CmSCD1_44F/CmSCD1_297R 프라이머를 이용해 중합효소연쇄반응을 수행한 증폭산물을 도시한 것이다. (M, Size marker; 1~5, Cochliobolus miyabeanus 균주들; 1, Cm94; 2, Cm85; 3, Cm50; 4, Cm36; 5, Cm1; 6, Alternaria brassicicola; 7, Botrytis cinerea; 8, Fusarium moniliforme; 9, Fusarium graminearum; 10, Magnaporthe oryzae race KI197; 11, Rhizoctonia solani; 12, soil DNA1; 13; soil DNA2).
도 3은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3의 프로브를 이용해 실시간 중합효소연쇄반응을 한 결과를 도시한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.
실시예 1. 깨씨무늬병 특이적 프라이머 및 프로브 제작 (도 1)
깨씨무늬병원균에 특이적으로 한 copy씩 존재하는 CmSCD1 유전자(Cochliobolus miyabeanus scytalone dehydratase 1 gene; CmSCD1 , Genebank Accession AB100172)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 CmSCD1_44F (5'-catgtgtgcagtaaagtgactc-3': 서열번호 1)/CmSCD1_297R (5'-aaccccctcctcaagac-3' : 서열번호 2)를 제조하였다.
또한, Probe_CmSCD1 (5`-FAM-acaagatatgggaggcgatgccag-BHQ1-3`: 서열번호 3)라 명명한 프로브를 제작하였다. 본 발명의 실시간 CmSCD1 증폭의 정량적 신뢰도를 증가시키기 위하여 Taqman® probe를 두 프라이머 사이의 염기서열을 기반으로 제작하였다.
Taqman® probe는 Expedite 8909 DNA/PNA 합성기 (PerSeptive Biosystems 사)를 이용하여 1 μmole 스케일로 트리틸-온 (trityl-on) 상태로 상기 합성기의 사용 매뉴얼에 따라 합성하였다. 3'-말단에 인접하여 도입되는 BHQ1 형광 소멸자는 BHQ가 CPG (controlled pore glass)에 부착되어 있는 3'-BHQ1-CPG (Glen Research사; 1-Dimethoxytrityloxy-3-[O-(N-carboxy-(tetramethyl-rhodamine)-3-aminopropyl)]-propyl-2-O-succinoyl-long chain alkylamino-CPG)를 사용하고, 5' -말단에 인접하여 도입되는 FAM은 5-플루오레세인 포스포라미디트 (Glen Research사; [(3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-6-carboxyamidohexyl]-1-O-(2-cyanoethyl)- (N,N-diisopropyl)-phospharamidite)를 사용하였다.
또한, 각각의 염기는 dA bz, dC bz, dG dmf 및 T 포스포라미디트 (ABI 사)를 사용하였다. 5' 위치의 FAM의 축합의 경우에는 3분 동안의 축합 시간을 설정하였다 (일반적인 축합 시간은 1분). 프로브의 합성이 완료된 다음, 고체 지지물과 보호기는 티부틸아민:메탄올:증류수 (1:1:2)의 혼합물을 사용하여 65℃에서 3 시간 동안 가열하여 분리하였고, 반응이 완료된 최종 용액을 동결 건조하였다. 이어, 잔사를 1 ㎖의 100 mM 트라이에틸암모니움 아세테이트 (triethyl ammonium acetate, pH 7, 이하 'TEAA'라 한다) 용액에 용해하고, 이를 역상 고질 크로마토그래피 (Hamilton PRP1, 300 mm x 7 mm, 18-38 % 아세토나이트릴/100 mM TEAA, pH 7, 260 nm 및 560 nm에서 UV로 모니터)로 정제하였다. 원하는 분획을 동결 건조하고 1 ㎖의 증류수를 두 번 첨가하여 용해하고, 이를 다시 동결 건조하여 잔류하는 TEAA 염을 완전히 제거하였다. 그런 다음, 잔사에 1 ㎖의 증류수를 가한 후 이 용액을 70℃에서의 UV 흡광도 값으로 정량하였다. 농도 계산을 위한 자연 누클레오티드의 흡광 계수는 다음과 같다: dAMP, 15200; dCMP, 7700; TMP, 8830: dGMP, 11500; FAM, 20958; 및 BHQ, 31980. 올리고머의 구성은 효소분해 (알칼린 포스파타제 및 스낵 베놈 포스포디에스터라아제) 후 HPLC (Hewlett Packard, ODS hypersil, C-18; 20 mM K 2 HPO 4 , pH 5.6(A), MeOH(B), 100% A:40% B, 20 분) 및 레이져 탈착 질량 분석으로 확인하였다. 최종적으로 합성된 올리고 누클레오티드는 5'-FAM-aaggaaaggccatcgttgaagatg-BHQ1-3' (서열번호: 3)이다.
실시예 2. 증폭산물의 검출
코클리오볼루스 미야베아누스(Cochliobolus miyabeanus) 외에 논에 흔히 존재하는 진균인 Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Fusarium graminearum, Magnaporthe oryzae, Rhizoctonia solani를 준비하였다. 모든 균주는 PDbroth, 25℃, 150 rpm, 암조건에서 3일간 증식시켰으며 수거한 균사체는 마쇄하여 이로부터 본체 DNA를 얻었다.
프라이머 CmSCD1_44F/CmSCD1_297R를 이용하여 상기 본체 DNA를 증폭시킨 결과, 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 깨씨무늬병균주로부터 동일한 크기의 증폭산물이 검출됨을 확인할 수 있었다(도 2의 L1-L5 참고).
그러나, 그외에 Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Fusarium graminearum, Magnaporthe oryzae, Rhizoctonia solani의 본체 DNA를 상기 프라이머를 이용해 증폭시킨 경우에는, 어떠한 증폭산물도 확인할 수 없었다(도 2의 L6-L13).
실시예 3. CmSCD1 유전자 클로닝
정량의 신뢰도를 측정하기 위하여 CmSCD1 유전자를 클로닝하여 증폭모본으로 이용하였는바, 프라이머 CmSCD1_44F/CmSCD1_297R를 이용해, 코클리오볼루스 미야베아누스(C. miyabeanus ) Cm94 균주의 본체 DNA를 대상으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 (i) 95℃에서 30초간의 변성(denaturation) 과정 및 (ⅱ) 55℃에서 30초간의 어닐링(annealing) 및 (iii) 72℃에서 30초간신장(elongation)과정으로 이루어지는 1 사이클을 20회 반복 수행하는 단계를 포함한다. 그 결과 수득한 254 bp 크기의 증폭산물을 pGEM-T easy vector에 제작사의 실험방법에 의거하여 클로닝하였다. M13 프라이머(5-gttgggtaacgccaggg-3: 서열번호 4)를 이용한 염기서열 분석 결과, 모든 염기서열이 오차 없이 증폭되어 증폭산물이 CmSCD1의 한 부분임을 확인하였다.
실시예 4. 프로브 / 프라이머를 이용한 깨씨무늬병균 정량 방법 개발
Taqman®　 probe 및 CmSCD1 유전자 특이적 프라이머를 이용한 시스템의 감도를 본체 DNA 수준에서 검정하였다. 본체 DNA의 PCR 혼합액 내 농도를 12.5 ng에서 0.125 femtogram까지 희석시킨 후 상기 Taqman®　 probe/primer를 이용한 real time PCR을 동일한 조건에서 수행하였다. 실험 결과, 이 시스템은 약 300 femtogram의 본체 DNA까지 측정할 수 있었다(도 3). Taqman real time PCR 반응 조건은 (i) 95℃에서 30초간의 변성(denaturation) 과정 및 (ⅱ) 55℃에서 30초간의 어닐링(annealing) 및 (iii) 72℃에서 30초간 신장(elongation)과정으로 이루어지는 1 사이클을 40회 반복 수행하는 단계를 포함한다.
<110> Rural development administration <120> Composition for detecting Cochliobolus miyabeanus and <130> P10-240 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CmSCD1_44F <400> 1 catgtgtgca gtaaagtgac tc 22 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CmSCD1_297R <400> 2 aaccccctcc tcaagac 17 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_CmSCD1 <400> 3 acaagatatg ggaggcgatg ccag 24

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  4. 시료(sample)로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3으로 표시되는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계를 포함하는, 코클리오볼루스 미야베아누스(Cochliobolus miyabeanus)를 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 방법은 깨씨무늬병 진단 또는 예찰을 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 코클리오볼루스 미야베아누스를 검출하는 방법.
  6. (a) 시료(sample)로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3으로 표시되는 형광물질로 표지된 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계, 및
    (b) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 증폭산물에서의 형광신호를 측정하는 단계를 포함하여 코클리오볼루스 미야베아누스를 정량적으로 검출하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 깨씨무늬병 진전 정도를 수치화하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 시료는 벼의 잎, 줄기, 및 알곡으로 이루어진 군에서 선택된 1이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
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