KR100639834B1 - 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 ａ1 교배형 균주 검출용ｄｎａ 분자표지인자 - Google Patents

파이토퓨쏘라 인페스탄스의 ａ1 교배형 균주 검출용ｄｎａ 분자표지인자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파이토퓨쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans)의 A1 교배형 균주 검출용 분자표지인자 및 A1 교배형 균주를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자웅이주균으로 유성생식을 위해 2가지 교배형을 갖는 감자 및 토마토 역병 병원균인 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출할 수 있는 서열번호 1로 기재되는 분자표지인자, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 프라이머 및 상기 분자표지인자 또는 프라이머를 이용하여 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 분자표지인자를 이용하면 기존의 형태학적 검사법에 비하여 짧은 시간 내에 경제적으로 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 정확하게 검출할 수 있기 때문에 감자 및 토마토 역병 병원균의 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

파이토퓨쏘라 인페스탄스의 Ａ1 교배형 균주 검출용 ＤＮＡ 분자표지인자{Molecular marker for the detection of A1 mating type of Phytophthora infestans}
도 1은 서열번호 8 및 서열번호 9로 기재되는 AFLP 프라이머 조합(E+AT / T+CTA)으로 A1 교배형 균주 특이 부위를 탐지하는 AFLP 프로파일을 나타낸 전기영동 사진이다.
도 2는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 프라이머로 서로 다른 교배형을 가진 역병 병원균의 PCR 반응 결과를 나타낸 전기영동한 사진(A)과 도트 하이브리디제이션 결과를 나타낸 사진이다(B).
화살표 : A1 교배형 균주 특이 밴드
도 3은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 프라이머로 A1 교배형 감자 및 토마토 역병 병원균과 다른 파이토퓨쏘라 속(Phytophthora species)과의 PCR 반응을 나타낸 전기영동 사진과(A)과 도트 하이브리디제이션 결과를 나타낸 사진이다(B).
화살표 : A1 교배형 균주 특이 밴드
도 4는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 프라이머로 A1 교배형 역병 병원균과 다른 병원성 균(fungi)과의 PCR 반응을 나타낸 전기영동 사진과(A) 도트 하이브리디제이션 결과를 나타낸 사진이다(B).
화살표 : A1 교배형 균주 특이 밴드
도 5는 A1 교배형 감자 및 토마토 역병 병원균의 게놈 DNA를 제한효소(Bam HⅠ, Ava Ⅰ, EcoR Ⅰ)로 처리한 후 A1 교배형 균주 특이 분자표지인자를 프로브로 사용하여 서던 블러팅한 결과 사진이다.
본 발명은 감자 및 토마토 역병 병원균을 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 감자 및 토마토 역병 병원균인 파이토퓨쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans)의 교배형 균주를 검출할 수 있는 분자표지인자 및 상기 분자표지인자를 이용하여 교배형 균주를 검출하는 방법에 관한 것이다.
과거에는 대부분의 균(fungi)을 분류하고 동정하기 위해 형태학적 관점에서 연구를 했지만 파이토퓨쏘라(Phytophthora)를 포함한 몇몇 속들의 경우 많은 어려움이 뒤따랐다. 그 후 분자 생물학적 관점에서의 첫 분류는 클레어(Clare, B. G. Nature. 1963, 200: 803-804)가 피티아세우스 균(Pythiaceous fungi)을 동정함에 있어 단백질과 동위효소(isozyme)의 전기영동을 이용하여 분류한 것으로부터 분자 생물학적 관점에서의 종 분류가 시작되었다.
최근에는 DNA 연쇄중합반응 (PCR; Polymerase Chain Reaction)의 발견과 고온에서도 DNA의 중합을 할 수 있는 내구력이 뛰어난 DNA 중합효소의 발견, 자동연쇄중합 반응기의 발명 등으로 진핵생물의 게놈 분석이 한층 용이해 졌는데, PCR을 이용한 기법들은 기존의 RFLP 방법의 단점을 보완할 수 있고 간편하기 때문에 식물이나 미생물의 분자표지인자 기술은 상당히 빠른 속도로 진보하고 있다. PCR을 이용한 분자표지인자 기법에는 여러 가지가 있는데 대표적인 방법들로는 RAPD(Ramdomly Amplified Polymorphic DNA), SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphism), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 등이 있다.
교배형에 관한 분자표지인자의 개발은 미국 저들슨 박사 연구팀에서 많은 연구를 하였다(Judelson HS, 1996, Mol Gen Genet 252: 155-161). 상기 연구에서는 RAPD 기법을 이용하여 감자역병원균의 A1 교배형 분자표지인자를 검출하여 분자표지인자가 후대에 어떻게 유전되는가를 보여주는지를 알아보았다. 또한 A1 교배형 마커를 클로닝하여 프로브로 사용하여 RFLP로 확인하였다. RAPD 방법에서는 게놈 DNA 2 ng에 10-nt 프라이머를 사용하여 총 25 ㎕ 반응물을 만들어, 1.0% 아가로스 젤 (TBE: 89 mM Tris, 89 mM H3BO3, 2 mM Na2EDTA)에서 5 V/㎝로 전기영동하여 다형성(Polymerphism)을 관찰하였다. 또한, RFLP 방법에서는 게놈 DNA 10 ㎍을 HindⅢ 제한효소로 절단하여 0.9% 아가로스 젤에 전기영동 후 나일론 막(nylon membrane) 에 DNA를 옮긴 후, 클로닝한 RAPD 밴드(Mat-A1)를 프로브로 사용하여 검출하였다.
RAPD는 PCR 기술을 사용하여 다형성을 검출하는 방법으로, 이는 기본적으로 간단하고 빠르며 아주 적은 양의 DNA를 필요로 한다. 또한 그것은 방사능을 사용하지 않고도 다량의 표본에 적용하기에 적합하다. RAPD 분석은 윌리엄 등(Williams, J.G.K. et al., Nucl. Acids Res. 1990, 18: 6531-6535.)과 웰스 및 맥크렐랜드(Welsh, J., and M. McClelland. Nucleic Acids Res. 1990, 18: 7213-7218)에 의해 개발된 방법으로서 염기의 수가 9-10개 정도의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 식물체의 게놈 DNA를 무작위로 PCR 증폭시킨 후 증폭된 산물을 전기영동하여 분석하는 방법으로 분석절차가 아주 간편하여 최근 수년간 많은 실험실에 사용하고 있는 방법이다. 그러나 이 방법은 재현성이 떨어지고 나타나는 마커는 우성으로서 F2 등의 분리 집단에서는 사용할 수 없다는 단점이 있다. 따라서, 재현성을 높이기 위해서는 PCR 프라이머를 선발시 3회 이상 재현이 되는 밴드들만을 골라서 마커를 선발하고 선발된 RAPD 마커들은 클로닝 후 서열분석을 수행하여 양끝 말단 염기서열을 가지고 프라이머의 길이가 약 20 mer 정도가 되도록 제작하여 STS(sequence tagged sites)로 전환하여 사용해야하는 번거로움을 가지고 있다.
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 방법은 RFLP의 재현성과 RAPD의 간편성이 합해진 방법이다. 분석방법은 주형의 게놈 DNA를 두 개의 상이 한 제한효소로(staggering cutters)로 절단 후 절단된 부위에 특이한 어댑터(adaptors)를 연결시킨 후 어댑터에 특이한 프라이머들을 가지고 PCR 증폭 후 폴리아크리아미드 젤로 분리하고 분석한다. 이때 사용되는 프라이머들은 어댑터 서열에 완전히 상보적인 5' 부위의 일정한 서열과 3' 부위의 선별 서열 부위로 구성되어 있다. 선별 서열의 염기구성에 따라 생성되는 DNA 밴드들이 달라서 분석 범위가 상당히 넓다. 이들은 각 개체간 변이가 아주 심하여 마커 개발에 아주 유용하다. 실제로 Lin 등(Lin, et al., Plant Mol. Biol. Rep. 1996, 14: 156-169)이 RFLP, RAPD, AFLP 등을 대두의 유전분리집단에 적용한 결과 AFLP 방법이 가장 유용한 것으로 나타났다.
한편, 감자 및 토마토 역병 병원균인 파이토퓨쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans)는 자웅이주균으로 유성생식을 위해 2가지 교배형(mating type; A1, A2)을 필요로 한다. 1992년 이전에는 A1 계통만이 흔했는데 1990년대 말부터 A1과 A2 교잡형이 모두 널리 분포하게 되었다. 서로 다른 교배형을 가진 역병 병원균은 방제하는 약제와 시용량이 서로 다르기 때문에 병발생시 조기진단으로 방제 노력과 비용을 감소하는 것이 절실하게 필요로 한다.
이에, 본 발명자들은 감자 및 토마토 역병 병원균인 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 교배형 균주의 형태학적 구분의 어려움 및 재현성이 떨어진 RFLP 및 RAPD 방법을 극복하기 위하여 AFLP 방법을 이용하여 감자 및 토마토 역병 병원균인 파이토 퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출할 수 있는 분자 표지인자를 개발하였고, 상기 분자 표지인자를 이용하여 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 손쉽게 검출할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주 검출용 분자표지인자 및 상기 분자표지인자를 이용하여 A1 교배형 균주를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주 검출용 분자표지인자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분자표지인자를 이용하여 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주 검출용 분자표지인자를 제공한다.
본 발명의 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주 검출용 분자표지인자는 A1 교배형 균주만을 특이적으로 검출할 수 있고, A2 교배형 균주 및 다른 종의 파이토퓨쏘라 속 균주에서는 검출되지 않는다.
본 발명의 분자표지인자는 서열번호 1로 기재되고, 상기 분자표지인자는 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주에만 존재하는 서열이다. 서열번호 1의 일부 또는 전체 서열을 프로브로 사용할 수 있고, 상기 프로브를 이용하면 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주만을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주 검출용 분자표지인자는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 프라이머이다. 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하면 A1 교배형 균주에서만 특이적으로 밴드가 검출되고, 상기 밴드의 유무를 확인함으로써 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분자표지인자를 이용하여 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출하는 방법을 제공한다.
서열번호 1의 일부 또는 전체 서열을 프로브로 이용하여 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출할 수 있다. 상기 분자표지인자는 서던 블러팅, 도트 하이브리디제이션 등의 가능한 모든 분자생물학적 기법에 적용할 수 있으며, 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주만을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 프라이머로 PCR을 수행하여 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출할 수 있다. 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하면 170 bp 부위에서 밴드가 검출되고, 상기 밴드의 유무를 확인함으로써 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)를 수행하여 그 중에서 서열번호 8 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머 조합에서 A1 교배형 균주에서만 특이적인 밴드가 검출되는 것을 관찰하였다(도 1 참조). 상기 A1 교배형 균주에만 나타나는 특이적인 절편을 벡터에 클로닝하고 염기서열을 분석하여, A1 교배형 균주만을 검출할 수 있는 서열번호 1로 기재되는 분자표지인자를 개발하였으며, 서열번호 2로 기재되는 INF-1 프라이머 및 서열번호 3으로 기재되는 INF-2 프라이머를 제작하였다. 본 발명에서는 상기 A1 교배형 균주에만 나타나는 특이적인 절편 및 상기 절편에서 유래한 프라이머를 사용하여 A1 교배형 균주만을 특이적으로 검출하였다.
본 발명의 실시예에서는 같은 속(屬)에 속하는 역병원균에 분자표지인자의 존재여부를 관찰하기 위해서 A1 교배형 역병 병원균 균주와 다른 종의 역병 병원균 또는 식물체의 다른병을 일으키는 균(fungus)을 대상으로 PCR 및 도트 하이브리디제이션 반응을 수행한 결과, 파이토퓨쏘라 인페스탄스 A1 교배형 균주만을 특이적으로 검출하고 A2 교배형 균주, 종이 다른 파이토퓨쏘라 속 균주 및 다른 균(fungus)에서는 상기 분자표지인자가 검출되지 않는 것을 알 수 있었다(도 2 내지 도 4 참조).
또한, 본 발명의 실시예에서는 본 발명의 분자표지인자가 게놈 DNA 안에서 몇 개의 카피수로 존재하는지 여부를 확인한 결과, A1 교배형 균주에서만 1개의 카피수만(약 1.6 kbp 사이즈) 존재하는 것을 알 수 있었다(도 5 참조).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 균주 배양 및 게놈 DNA 추출
본 발명자들은 대한민국에서 수집한 감자 및 토마토역병 병원균을 공시재료로 하여 실험하였다. 균주의 A1 및 A2 교배형은 형태학적 검사법으로 V8 고체 배지상에 서로 다른 교배형 균주를 치상하고 난포자의 형성유무를 관찰하여 분리 동정하였다.
또한, 균주의 게놈 DNA를 추출하기 위해 액체 배양 배지를 사용하였다. 쉐이킹 인큐베이터를 이용하여 20℃에서 10일간 배양한 균사체를 필터링하고 막자사발과 액체질소를 가지고 곱게 마쇄하였다. 마쇄한 균사 2~5 g을 15 ㎖의 추출 버퍼(50 mM Tris, 50 mM EDTA, 10% SDS, 1% 2-mercaptoethanol, pH 8.0)에 희석한 후 65℃의 항온수조기에서 1시간 동안 열을 가하고 동량의 페놀:클로로포름:이소프로판올 = 25:24:1 으로 처리한 후, 이어 13,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고 난 후 상층액과 동량의 클로로포름:이소프로판올 = 24:1을 섞어 다시 원심분리하고 상층액을 추출하였다. 추출한 상층액은 미리 차갑게 한 2.5 부피의 100% 에탄올을 가지고 DNA를 침전시킨 후 70% 에탄올을 가지고 세척하였다. 이후 건조시킨 DNA는 TE 버퍼(10 mM Tris, 2 mM EDTA pH 8.0)에 녹였다.
<실시예 2> AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)를 통한 다형성 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 교배형을 판정하기 위한 AFLP 반응을 수행하였다.
(1) 게놈 DNA 2 ㎍을 EcoRⅠ으로 37℃에서 16시간 동안 제한효소 처리한 후 Tru9Ⅰ 으로 65℃에서 16시간 동안 각각 제한효소 처리를 하였다.
(2) 제한효소로 처리된 게놈 DNA는 T4 DNA 라이게이즈(ligase)와 0.5 μM EcoRⅠ/Tru9Ⅰ 어댑터로 14℃에서 12시간 라이게이션(ligation)시켰고, 라이게이션된 DNA는 1:10 으로 희석하였다.
(3) 서열번호 4로 기재되는 EcoRⅠ-0 및 서열번호 5로 기재되는 Tru9Ⅰ-0 프라이머를 이용하여, 희석된 라이게이션된 DNA 5 ㎕에 1X 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 8.8, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1% Triton X 100), 200 μM dNTP, 1 유니트 Taq DNA 폴리머라제(DynazymeTM)를 첨가하여 94℃ 30초, 60℃ 1분, 72℃ 1분을 1 사이클로 최종 20회 반복하고 반응을 종료하여 전증폭(Pre-amplification)을 수행하고 PCR 산물은 1:50으로 희석하였다.
(4) 재증폭(Re-amplification) PCR 반응은 희석된 DNA 5 ㎕에 1×버퍼 (10 mM Tris-HCl, pH 8.8, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1% Triton X 100), 200 μM dNTP, 1 유니트 Taq DNA 폴리머라제(DynazymeTM) 0.5 μM 농도의 서열번호 6으로 기재되는 EcoRⅠ-2 프라이머 및 서열번호 7로 기재되는 Tru9Ⅰ-3 프라이머를 첨가하여 최초 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃ 1분을 첫 사이클을 시작하여 다음 사이클부터는 어닐링(annealing) 온도를 1℃씩 감소시키면서 11 사이클을 반복한 뒤 마지막으로 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분을 23회 반복하고 반응을 종료하였다.
(5) 증폭된 PCR 산물과 3×염료(dye)는 1:3으로 희석하여 6% 변형 폴리아크릴아미드 젤(acryamide : bisacrylamide(19:1), 7.5 M urea, 1×TBE(0.8 M Tris-HCl, pH 8.3, 0.89 M boric acid, 0.02 M EDTA, pH 8.0)에 80 W에서 2시간 40분 정도 전기영동 후 은염색(silver staining)을 수행하였다.
<실시예 3> A1 교배형 균주 특이적인 분자표지인자를 이용한 검출
AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 기법은 전체 60개의 프라이머 조합 가운데 서열번호 8로 기재되는 E+AT 프라이머 및 서열번호 9로 기재되는 T+CTA 프라이머 조합에서 A1 교배형 균주에서만 특이적인 밴드가 검출되었다(도 1, 표 1).
번호 병 원 균 균 주 번 호 교배형
M 1kb Plus DNA Ladder
1 Phytophthora infes tans YY-8 A1
2 P. infestans YY-9 A1
3 P. infestans YY-11 A1
4 P. infestans YY-12 A1
5 P. infestans Na1-2 A2
6 P. infestans Na1-5 A2
7 P. infestans Na2-1 A2
특이적으로 A1 교배형 균주에만 나타나는 절편(YY-8)은 pGEM-T 이지(easy) 벡터에 클로닝하고 염기서열 분석을 통해 서열을 밝힌 후(201 bp), Mat-A1 특이 프라이머인 서열번호 2로 기재되는 INF-1 프라이머 및 서열번호 3으로 기재되는 INF-2 프라이머를 제작하였다.
상기에서 제작한 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 INF 프라이머를 가지고 A1 교배형 균주 특이 부위를 확인하기 위한 PCR 반응은 감자역병원균 게놈 DNA 10 ng, dNTP 200 μM, 서열번호 2로 기재되는 정방향 프라이머(INF-1)와 서열번호 3으로 기재되는 역방향 프라이머 (INF-2) 각각 0.1μM, Taq 폴리머라제 1 유니트, 10×버퍼, 그리고 dH2O로 조성하여 총 20 ㎕의 반응산물을 가지고, 95℃에서 5분 동안 예열한 후 94℃ 1 min, 57℃ 1 min, 72℃ 2 min을 45회 반복한 다음 72℃에서 10 min 확장하는 조건으로 PCR을 수행하였다.
또한, 목적으로 하는 유전자 배열을 함유하는지를 확인하는 도트 하이브리디제이션(Dot hybridization)은 PCR 반응으로 생산된 PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하여 100 V로 3시간 동안 전기영동 시킨 후 UV 상에서 확인과정을 거쳐 나일론 막에 전이시켰다. 전이시킨 막을 표준 하이브리디제이션 용액(5X SSC, 0.02% SDS, 0.1% N-lauroylsarcosine, 1% blocking regent)과 60℃에서 1시간 동안 프리하이브리디제이션시킨 다음 기존의 버퍼를 제거하고, 프로브 30 ㎕와 표준 하이브리디제이션 용액으로 60℃에서 12시간 하이브리디제이션하였다.
프로브 제작은 클로닝한 플라스미드 DNA(YY-8)를 추출하여 주형 DNA로 사용하여 DNA 10 ng, 서열번호 10으로 기재되는 M13F 프라이머 및 서열번호 11로 기재되는 M13R 프라이머 0.5 μM, 10X 버퍼, 5 유니트 Taq 폴리머라제, 0.1 mM dGTP, dCTP, dATP, 0.09 mM dTTP, 1 mM digoxigenin-dUTP(Boehringer Mannhein, Germany)을 총 100 ㎕로 하여 94℃에서 1분 30초, 50℃에서 1분 30초, 72℃에서 2분을 한 과정으로 하여 25번 반복한 후, 72℃에서 4분간 반응하여 PCR-라벨링 산물을 조성하였다.
검출과정은 항-DIG-AP(Alkaline Phosphatase) 접합 항체를 첨가하여 발색시키는 방법으로 혼성화한 막을 세척(Maleic acid buffer, 0.3% Tween 20)에서 5분 정도 씻은 후, 1X 블로킹 용액 100 ㎖에서 30분 동안 정치시켰다. 1X 블로킹 용액에 항-DIG-AP 접합체를 첨가하여 30분 동안 막을 정치시키고 세척완충용액(Maleic acid buffer, 0.3% Tween 20)에서 15분 동안, 검출 버퍼(0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5)에서 5분 동안 흔들어준 후, NBT/BCIP 버퍼(0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5 NBT/BCIP)에서 5분 동안 흔들어준 뒤에 막을 염색하였다.
Mat-A1 특이 부위를 확인하기 위한 PCR 반응과 도트 하이브리디제이션은 3가지 방법으로 나누어서 실행하였다.
<실험예 1> A1 교배형 균주 및 A2 교배형 균주의 검출
본 발명자들은 서로 다른 교배형을 가진 파이토퓨쏘라 인페스탄스 균주(표 2)를 가지고 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 A1 교배형 특이적인 프라이머로 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하였다.
그 결과, 170 bp의 밴드가 A1 교배형 역병원 균주에서만 증폭되는 것을 관찰할 수 있었다(도 2의 A). 또한, 증폭된 산물을 가지고 프로브와 함께 도트 하이브리디제이션을 수행한 결과 역시 A1 교배형 균주에서만 같은 크기에서 시그널이 검출하는 것을 관찰할 수 있었다(도 2의 B).
번호 병 원 균 균 주 번 호 교배형
M 1kb Plus DNA Ladder
1 Phytophthora infestans Na1-2 A2
2 P. infestans Na1-5 A2
3 P. infestans Na2-1 A2
4 P. infestans KAW-40 A2
5 P. infestans KAW-63 A2
6 P. infestans RDA-2 A2
7 P. infestans DGY1-2 A2
8 P. infestans DGY2-4 A2
9 P. infestans DGY3-2 A2
10 P. infestans DGY3-4 A2
11 P. infestans DGY3-12 A2
12 P. infestans DGY3-17 A2
13 P. infestans 20B02 A2
14 P. infestans YY-8 A1
15 P. infestans YY-9 A1
16 P. infestans YY-11 A1
17 P. infestans YY-12 A1
18 P. infestans YY-19 A1
19 P. infestans YY-27 A1
20 P. infestans KC-5 A1
21 P. infestans KJ-2 A1
22 P. infestans KR-3 A1
23 P. infestans WS2-1 A1
24 P. infestans WS2-3 A1
25 P. infestans WS4-1 A1
26 P. infestans WS6-16 A1
27 P. infestans WS9-1 A1
<실험예 2> P. 인페스탄스 A1 교배형 균주 및 파이토퓨쏘라 속 균주의 검출
두 번째로 같은 속(屬)에 속하는 역병원균에 분자표지인자의 존재여부를 관찰하기 위해서 A1 교배형 역병 병원균 균주와(positive control) 7종의 역병 병원균을 대상으로 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하였다(표 3).
그 결과, P. 인페스탄스 A1 교배형 균주에서만 170 bp 사이즈 밴드가 검출되었고, 다른 피토프토라 속의 균주에서는 PCR 밴드가 검출되지 않았다(도 3의 A). 프로브와 함께한 도트 하이브리디제이션 실험 역시 P. 인페스탄스 Mat-A1 균주만이 강한 시그널이 검출된 것을 확인할 수 있었다(도 3의 B).
번호 병 원 균 균 주 번 호 교배형
M 1kb Plus DNA Ladder
1 Phytophthora infestans YY-8 A1
2 P. infestans YY-9 A1
3 P. megasperma 40401 -
4 P. sojae 40412 -
5 P. cactorum 40174 -
6 P. cinnamomi 40182 -
7 P. citricola 40184 -
8 P. cryptogea 40189 -
9 P. capsici 40157 -
10 P. capsici 96CC7116 -
<실험예 3> P. 인페스탄스 A1 교배형 균주 및 다른 균의 검출
본 발명자들은 식물체의 다른병을 일으키는 균(fungus)에서 본 발명의 분자표지인자의 출현도를 실험하였다. 실험 재료로는 P. 인페스탄스 A1 교배형 균주와 13개의 다른 종의 병원균을 대상으로 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하였다(표 4).
그 결과, P. 인페스탄스 A1 교배형 균주에서만 170 bp 사이즈의 강한 밴드가 검출되었으며, 다른 균에서는 밴드가 검출되지 않았다(도 4의 A). 또한, 도트 하이브리디제이션 수행시에도 P. 인페스탄스 A1 교배형 균주에서만 시그널이 검출되는 같은 실험결과를 볼 수 있었다(도 4의 B).
번호 병 원 균 균 주 번 호 교배형
M 1kb Plus DNA Ladder
1 Phytophthora infestans KC-5 A1
2 P. infestans KJ-2 A1
3 Colletotrichum gloeosporioides 40804 -
4 C. circinans 40641 -
5 C. acutatum 40700 -
6 C. higginsianum 40807 -
7 C. coccodes 40010 -
8 Fusarium moniliforme MA03201 -
9 F. oxysporum F41 -
10 Pseudomonas sp. Soil 4 -
11 Plasmodiophora brassicae CH11 -
12 Aspergillus niger - -
13 Rhizoctonia solani RS-1 -
14 Hypocrea nigrcans - -
15 Trichoderma virens EP1-14 -
<실험예 4> 게놈 DNA 카피 수의 확인
본 발명에서 개발한 분자표지 인자가 게놈 DNA 안에서 몇 개의 카피수로 존재하는지 여부를 확인하기 위해서 A1 교배형 4개 균주와 A2 교배형 4개 균주를 제한효소 BamHⅠ, Ava Ⅰ 및 EcoR Ⅰ으로 각각 37℃ 에서 16시간 동안 제한처리 후, 0.8% 아가로스 젤에서 16시간 동안 천천히 전기영동하고, 상기 실시예 3에 기재된 도트 하이브리디제이션 방법과 동일하게 하이브리디제이션을 수행하였다.
그 결과, A1 교배형 균주들에서만 1개의 카피수로(대략 1.6 kbp) 검출되는 것을 확인할 수 있었다(도 5).
번호 병 원 균 균 주 번 호 교배형
M 1kb Plus DNA Ladder
1 Phytophthora infestans YY-8 A1
2 P. infestans WS9-1 A1
3 P. infestans KC-C A1
4 P. infestans YY-19 A1
5 P. infestans Na1-2 A2
6 P. infestans Na1-5 A2
7 P. infestans KAW-40 A2
8 P. infestans DGY3-4 A2
본 발명의 분자표지인자를 이용하여 감자 및 토마토 역병 병원균인 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출하는 방법은 기존의 형태학적 검사법에 비하여 시간 및 비용을 절약할 수 있는 장점이 있으며, 재현성이 적은 RAPD 방법에 비하여 보다 정확히 A1 교배형 균주만을 검출할 수 있다. 이와 같이 손쉽게 A1 또는 A2 교배형 균주를 구분한다면, 다른 교배형을 가진 역병 병원균은 방제하는 약제와 시용량이 서로 다르기 때문에 병발생시 조기진단으로 방제 노력과 비용을 감소시킬 수 있다.
<110> Kangwon National University <120> Molecular marker for the detection of A1 mating type of Phytophthora infestans <130> 3p-06-31B <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> molecular marker for the detection of A1 mating type of Phytophthora infestans <400> 1 aagctatact gggacagggt cgacacggaa actggcgagg accgcttacg caagctggga 60 ggtggtcgga agcataaatt ggtcccatat gagtcccgtg tttttactac gatatatgct 120 tatgtgaggg caatgcgtgc tcattttcgg gcgttctttc gtattaccac 170 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INF-1 primer <400> 2 aagctatact gggacagggt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INF-2 primer <400> 3 gcgttctttc gtattaccac 20 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI-0 primer <400> 4 gactgcgtac caattc 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tru9I-0 primer <400> 5 gatgagtcct gagtaa 16 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI-2 primer <400> 6 gactgcgtta ccaattcat 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tru9I-3 primer <400> 7 gatgagtcct gagtaacta 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E+AT primer <400> 8 gactgcgtta ccaattcat 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T+CTA primer <400> 9 gatgagtcct gagtaacta 19 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F primer <400> 10 cgccagggtt ttcccagtca cgac 24 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R primer <400> 11 tcacacagga aacagctatg ac 22

Claims (6)

  1. 서열번호 1로 기재되는 파이토퓨쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans)의 A1 교배형 균주 검출용 분자표지인자.
  2. 삭제
  3. 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주 검출용 프라이머.
  4. 제 1항의 분자표지인자 전체를 프로브로 이용하여 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 3항의 프라이머로 PCR을 수행하여 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주를 검출하는 방법.
KR1020030054040A 2003-08-05 2003-08-05 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 ａ1 교배형 균주 검출용ｄｎａ 분자표지인자 KR100639834B1 (ko)

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