KR20170016810A

KR20170016810A - 큰느타리버섯의 교배형 A4Bx 판별 PCR 프라이머

Info

Publication number: KR20170016810A
Application number: KR1020160181597A
Authority: KR
Inventors: 류재산; 김민근; 김희대; 박보경; 최용조
Original assignee: 경상남도
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2017-02-14
Also published as: KR101906683B1

Abstract

본 발명은 큰느타리버섯의 특이 교배형에만 DNA 단편이 증폭되는 큰느타리버섯의 교배형 판별을 위한 PCR 프라이머에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 큰느타리버섯의 교배형 A4Bx을 특이적으로 증폭하여 확인할 수 있는 방법을 제공하는 것에 그 하나의 목적과, 큰느타리버섯 교배형 A4Bx에서만 특이적으로 존재하는 DAN 단편을 제공하는 것에 또 하나의 목적과, 큰 느타리버섯의 교배형 A4Bx에 특이적으로 DNA가 증폭되도록 하는 방법을 제공하는 것에 또 다른 목적이 있다.
이상과 같이 구성되는 본 발명은 큰느타리버섯 교배형 A4Bx를 판정할 수 있는 특이 DNA단편을 확인하고, 이 특이 DNA단편을 검출할 수 있는 방법 및 특이 프라이머를 제공하여 큰느타리버섯 단핵균사의 교배형 A4Bx을 신속, 정확하게 판별할 수 있는 등의 효과를 제공하게 된다.
[색인어]
큰느타리버섯, 프라이머, 교배형, PCR(중합효소연쇄반응), 새송이버섯

Description

큰느타리버섯의 교배형 A4Bx 판별 PCR 프라이머{Specific PCR primers discriminating of mating type A4Bx in Pleurotus eryngii}

본 발명은 큰느타리버섯에서 유래한 단핵균사가 각기 다르게 가지고 있는 교배형(mating type)중에서 특정한 타입에만 DNA 단편이 증폭되는 큰느타리버섯 유래 단핵균사 교배형 판별을 위한 PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소연쇄반응) 프라이머에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 큰느타리버섯에서 단핵균사의 교배형인 A4Bx에만 특이하게 존재하여 PCR 반응시 합성되는 다형성 밴드를 분리 및 염기배열을 결정하여 큰느타리버섯 교배형 A4Bx를 가지는 단핵균사만을 정확하고 빠르게 검출할 수 있는 큰느타리버섯의 단핵균사 교배형 판별을 위한 PCR 프라이머에 관한 것이다.

큰느타리버섯(새송이)은 느타리버섯과에 속하는 백색부후균으로 주로 지중해 연안의 유럽대륙과 중동지역에서 연안의 반건조한 스텝기후지역에서 많이 발생하며, 유럽지역에서 1950년대에 재배에 관한 연구로 인공재배에 성공하였다. 맛과 향이 뛰어나고 대가 단단하여 저장기간이 긴 특징을 지니고 있고, 에르고스테롤이나 간암세포를 억제하는 활성을 지닌 다당류. 항산화활성, 항염증효과, Angiotensin converting enzyme 저해활성, 그리고 프로바이오틱 활성 등의 기능성 물질이 함유되어 건강식품으로써 주목받아 왔다. 국내생산량은 46,530(2015)톤으로 2005년 이래로 안정세를 보이고 있다(농림수산식품부. 2015특용작물생산실적, 2016). 전체 농산버섯 생산량 167,366톤의 28%를 차지하며, 수출량도 4,755톤 15,588불에 달하는 우리나라의 대표 버섯품목중의 하나이다. 현재 국내에 등록되어 있는 큰느타리버섯의 품종은 8종에 이르지만(국립종자원, http://www.seed.go.kr/), 국내시장과 권역별 수출시장 소비자의 취향에 맞는 다양한 품종의 개발이 필요한 상황이다.

큰느타리의 육종을 하기 위해서는 자실체(버섯)에서 핵이 하나 있는 단포자를 채취, 발아시켜 단핵균사로 만들어 교배를 해야 하는데, 생물학적으로 불화합성 유전자가 존재하여 전체 교배조합의 1/4만이 실제로 버섯이 발생하는 교배가 이루어진다. 불화합성은 진화과정에서 근친간 교배를 차단하여 생물의 다양성을 추구하는 방법이다. 이러한 불화합성으로 말미암아 실제 교배가 일어나는 조합을 얻기 위하여 육종의 전단계로 교배형을 알기 위한 시험교배를 해보아야 해서 많은 시간(20일 이상)이 소요된다. 그런데, 특정 교배형에 특이적으로 증폭되는 핵산지문 기술을 사용하면 교배형 확인이 1일 이내로 줄어들 수 있다. 실제로 PCR에 의한 핵산의 다형화 현상을 이용하여 종의 분류나 특이 형질의 검출, 유연관계분석은 널리 알려진 핵산지문기술로 널리 사용된다.

무작위의 작은 프라이머를 이용하여 형질별로 다른 증폭밴드 패턴을 찾아내는 방법인, RAPD는 빠르고, 쉽고, 경제적이고, 우성의 특징으로 인핸 널리 사용되고 있는 방법인데, 단점은 재현성과 신뢰성이 떨어진다는 것이다. 이를 보완한 SCAR 마커기술이 개발되어 이를 보완하여 사용하고 있다. PCR 산물의 확인은 정제된 아가로스에서 전기를 사용하여 전개한 후, 염색시약(Safeview)으로 염색한 후 DNA 밴드를 검출하게 되고, 이 PCR 방법은 소량의 게놈유전자(10-50ng)으로도 정확하고 간단하게 생물의 다양한 형질을 확인할 수 있다.

기존에 버섯의 교배형을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머에 대한 특허는 큰느타리버섯의 교배형 판별을 위한 피시알 프라이머(특허번호10-0993814-0000) 가 있는데 이는 교배형 중 AxB3에 특이적으로 DNA의 다형화가 관찰되는 것이고, 국내공개특허 10-0639834-0000호에 기재된 "파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주 검출용D N A 분자표지인자"는 난균류이며 감자역병을 일으키는 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 교배형을 판별하는 기술이고, 표고버섯의 교배형, 품종 또는 계통 판별용 탐침 및 이를 이용한 판별방법(출원번호 10-2016-0003483)은 표고버섯의 교배형과 품종을 판별하는 DNA 프라이머에 관한 기술이다.

[특허1] 큰느타리버섯의 교배형 판별을 위한 피시알 프라이머 (등록번호 10-0993814-0000. 2010.11.1) [특허2] 파이토퓨쏘라 인페스탄스의 A1 교배형 균주 검출용D N A 분자표지인자(등록번호 : 10-0639834-0000, 2012.04.12) [특허3] 표고버섯의 교배형, 품종 또는 계통 판별용 탐침 및 이를 이용한 판별방법(출원번호 10-2016-0003483, 2016.01.12)

본 발명은 큰느타리버섯 단핵균사의 교배형 판별에 장시간이 소요되는 문제점들을 해결하기 위해 안출된 것으로, 큰느타리버섯 단핵균사의 교배형 A4Bx 을 특이적으로 증폭하여 확인할 수 있는 방법을 제공하는 것에 그 하나의 목적이 있다.

그리고, 본 발명은 큰느타리버섯 교배형 A4Bx에서만 특이적으로 존재하는 DAN 단편을 제공하는 것에 또 하나의 목적이 있다.

또한, 본 발명은 큰느타리버섯의 교배형 A4Bx에 특이적으로 DNA가 증폭되도록 하는 방법을 제공하는 것에 또 다른 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 큰느타리버섯 교배형 A4Bx에 특이성을 가지는 서열번호 1인 DNA 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 DNA 단편의 존재유무를 큰느타리버섯 단포자에서 유래한 단핵균사체에서 확인함으로써 큰느타리버섯 단핵균사 교배형 A4Bx을 판정하는 검정방법을 제공한다.

그리고, 본 발명은 서열번호 2와 서열번호 3의 염기서열내의 일련의 20 mer와 18 mer를 포함하는 큰느타리버섯 단핵균사 교배형 A4Bx를 판정하는 검정용 프라이머를 제공한다.

이상과 같이 구성되는 본 발명은 큰느타리버섯 단핵균사의 교배형 A4Bx을 판정할 수 있는 특이 DNA단편을 확인하고, 이 특이 DNA단편을 검출할 수 있는 방법 및 특이 프라이머를 제공하여 큰느타리버섯 단핵균사의 교배형 A4Bx을 신속, 정확하게 판별할 수 있는 등의 효과를 제공하게 된다.

[도1] 무작위 프라이머 OPL-07열을 이용하여 큰느타리버섯 품종 큰느타리2호에서 유래한 단핵균사를 PCR하여 DNA다형성을 밴드를 관찰한 것인데, 30, 33, 37, 40은 교배형이 A3B3, 12,25,29, 32는 교배형이 A3B4, 7, 26,35,39,49는 교배형이 A4B3이고, 11, 15, 17, 21은 교배형이 A4B4이다. 크기가 약 520 bp(base pair)인 특이밴드가 교배형 A4Bx에만 나타나는 것을 알 수 있다.
[도2] 본 발명의 A4-locus-F와 A4-locus-R 프라이머의 쌍을 이용하여 큰느타리2호에서 나온 단핵균사중에서 교배형이 A4Bx인 단핵균사에서 나타나는 특이 밴드의 양상을 나타내는 것인데, 4,13,33,37은 교배형이 A3B3이고, 6,7,9,26은 교배형이 A4B3이고 12, 29, 34, 42는 교배형이 A3B4이고, 8, 10, 20, 22는 교배형이 A4B4이다. P5는 교배형이 A3B4이고 P6는 A4B3이며, D는 이핵균사로 두 교배형이 동시에 들어 있는 A3B4 × A4B3형이다. 특이밴드가 교배형 A4Bx에만 나타나는 것을 알 수 있다.
[도3] 본 발명의 A4-locus-F와 A4-locus-R 프라이머의 쌍을 이용하여 다른 계통 KNR2522, KNR2523, KNR2501에서 유래한 단핵균사에서 교배형 A4Bx에만 나타나는 특이 밴드의 양상을 나타낸 것이다. KNR2523(2)의 15, 34의 교배형은 A4B3, 24, 26은 A4B12이다. KNR2522(2)의 5, 21의 교배형은 A4B12이고, 7, 15는 A4B3이다. 특이밴드가 교배형 A4Bx에만 나타나는 것을 알 수 있다. KNR2501은 A5B4×A3B5의 교배형인데 어떤 특이밴드도 관찰되지 않았다.

본 발명은 큰느타리버섯 단핵균사의 교배형 A4Bx에 특이적인 DNA 단편의 증폭을 확인하였고, 이 특이적으로 증폭된 단편을 이용하여 디자인된 프라이머를 이용하여 큰느타리버섯 단핵균사 교배형 A4Bx의 검정방법을 제공하도록 구성되어 있다.

이때, 본 발명에서 큰느타리버섯 단핵균사 교배형 특이형 DNA 프라이머의 PCR 산물은 약 299 bp의 크기를 이루게 되고, 큰느타리버섯 단핵균사 교배형 A4Bx을 특이적으로 검정할 수 있는 방법을 제공하게 된다.

여기서, 효율적인 검정방법은 A4-locus-F와 A4-loci-R 프라이머를 PCR을 이용하여 증폭하여 2.1kb의 단편을 확인하는 것이다.

본 발명에서는 큰느타리버섯 A4Bx 교배형을 검출하는 특이 DNA 단편을 검정할 수 있는 방법을 제공하게 되고, 가장 효율적인 방법은 서열번호 2(A4-locus-F와 A4-loci-R)의 약 299 bp내의 단편을 이용하여 확인하는 것으로, PCR에 의한 방법이 가장 바람직하다.

그리고, 큰느타리버섯 A4Bx을 확인하기 위한 PCR에서 가장 중요한 것은 특정 부분을 증폭할 수 있는 프라이머이며, 본 발명에 있어 큰느타리버섯의 A4Bx 검정용 프라이머는 상기 큰느타리버섯 교배형A4Bx 특이 299 bp에 포함된 일련의 염기서열을 포함하는 단편 또는 299 bp를 포함하는 단편을 증폭할 수 있도록 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명의 큰느타리버섯 교배형A4Bx 검정용 프라이머는 서열번호 1의 염기서열을 이용하여 제조할 수 있으며, PCR의 결과를 충실하게 얻기 위해서는 일반적인 최적 프라이머의 제조방법을 근간으로 제조하는 것이 좋다.

이때, 최적의 방법으로 큰느타리버섯 교배형 검정용 프라이머는 18-20 mer를 포함하고, 프라이머내에 GC %가 45 내지 65 %인 것이 바람직한데, GC %가 45 미만인 경우 프라이머와 DNA간의 결합이 약한 문제가 있고, GC %가 65를 초과할 경우 프라이머와 DNA 간의 접촉이 어려운 문제점이 있다.

특히, 상기 프라이머는 서열번호 2의 A4-locus-F와 서열번호 3의 A4-loci-R 프라이머 한 쌍을 사용할 수 있다.

본 발명의 PCR을 이용한 큰느타리버섯의 교배형 A4Bx 검정방법은 상기 프라이머를 이용하여 이루어지며, PCR의 조건은 통상의 방법이 바람직하고, 프라이머의 특성에 따라 적절히 조절하여 실시가능하다.

여기서, PCR에 사용되는 시료는 큰느타리버섯 균사체가 적당하고, 상기 균사체 게놈 DNA를 분리하여 PCR하는 것이다.

본 발명의 큰느타리버섯 A4Bx 특이 DNA 단편은 다른 교배형의 균주에서는 검출되지 않아, A4Bx 교배형을 검정할 수 있는 마커로 이용할 수 있고, 또한 본 발명의 PCR 검정법으로 상기 큰느타리버섯 A4Bx 특이 DNA 단편을 신속하고도 정확하게 증폭시켜 큰느타리버섯 교배형 A4Bx을 쉽게 판별할 수 있도록 구성하게 된다.

본 발명의 본 발명의 이해를 돕기 위하여, 이하에서 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

(1) 큰느타리버섯의 A4Bx 교배형 특이 DNA 단편 검출

상업적으로 재배되는 큰느타리2호의 자실체를 발생시켜 단포자 100개를 분리하여 무작위로 20개를 선택한 후, 가능한 모든 조합으로 교배를 실시한 다음, 현미경으로 관찰하여 교배형에 따라 20개 균주의 교배형을 결정하였다.

이때, A3B3, A'3B4, A4B3, 그리고 A4B4와 같은 총 4개의 교배형을 선택하고, 각 교배형으로부터 4균주씩을 선택하여 실험재료로 사용하였다.

무작위 10-mer(Operon, USA) 프라이머를 이용하여 큰느타리버섯의 단핵균사를 교배형에 따라 4균주씩 준비하여 이를 대상으로 Random amplify DNA polymorphism(RAPD)를 실시하였다.

여기서, DNA를 분리하기 위하여 상기 버섯 균사들을 버섯완전배지(mushroom complete media)에 접종하여 25℃에서 5일 키운다. 균사를 무균적으로 채취하여 1X TE 완출용액 100㎕ 풀어주고 전자렌지(700W)에 "약" 모드로 1분간 반응 시킨 후, 상온에서 30초 식힌다은 같은 과정을 1회 더 반복한다. 냉동실(-20℃)에서 10분간 두었다가 원심 10,000rpm에서 5분 원심분리하고 상층액 1㎕를 PCR실험에 사용하였다.

PCR 반응은 Accupower PCR premix(bioneer), 주형 gDNA 30 ng/ul, 무작위 프라이머 10pmol과 Mastercycler pro(Eppendorf)를 사용하여 실시하였고, 반응조건은 95 ℃에서 4분간 유지하여 DNA를 변성시키고, 연쇄반응을 35회(94 ℃, 1분(변성) → 37℃, 1분(재결합) → 72 ℃, 30초(DNA 중합) → 94℃, 1분(변성)) 실시하였다. PCR의 증폭산물을 0.7%의 아가로스 젤에서 전기영동하고, Safeview(iNtRON Biotechnology)로 염색하여 DNA 다양성 밴드를 UV로 조사하여 검출하였으며, Gel-Doc system(Bio-rad)으로 저장하고 인쇄하여 도1에 나타내었다.

도1의 M은 DNA 크기측정 마커(100bp plus DNA ladder, Bioneer)이고, 30, 33, 37, 40은 교배형이 A3B3, 12,25,29, 32는 교배형이 A3B4, 7, 26,35,39,49는 교배형이 A4B3이고, 11, 15, 17, 21은 교배형이 A4B4이다. 도1에 보이는 것과 같이, 실시예 1에서 사용한 큰느타리버섯 단핵균사는 교배형에 상관없이 다양한 크기와 강도의 DNA가 검출되었는데, 이들 단핵균사의 교배형에 상관없이 유전적 구성 서로 다르다는 것을 확인할 수 있다. 그리고, 교배형 A4B3와 A4B4에서 공통적인 크기의 DNA 밴드가 나왔으며 이는 약 520 bp의 크기로 검출 확인되었다.

(2) 클로닝

도1에서 나타난 약 520 bp 크기의 교배형 특이 밴드를 gel elution kit(GeneALL, Korea)로 아가로스로부터 분리 정제하고, pGEM-T Easy kit(Promega, USA)를 사용하여 벡터에 연결하여 넣고 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 이때, 특이밴드가 삽입된 형진전환체를 분리하기 위하여 0.5mM IPTG, 80㎍/㎖ X-gal, 그리고 ampicillin이 100㎍/㎖ 함유된 LB(Difco, USA) 고체배지에 도말하고, 16시간 배양하여 백색의 콜로니(colony)만을 분리하여 LB 액체배지 3ml에 16시간동안 1,300rpm으로 진탕배양 하였다. 교배형 특이 DNA단편(약 520 bp)이 pGEM-T Easy 벡터에 삽입되어있는지 확인하기 위하여 플라스미드를 분리하였고(GeneAll, Korea), 분리한 플라스미드를 제한효소 EcoR I으로 절단하여 삽입된 DNA단편이 약 520 bp로 확인하였다.

(3) 특이밴드 염기서열분석 및 교배형 특이 프라이머 제작

큰느타리버섯 교배형 A4Bx에 명료하고 재현성 있게 나타나는 마커를 만들기 위하여, 상기의 큰느타리버섯 교배형 특이 DNA 단편을 염기서열을 분석 하였다. pGEM-T Easy 벡터의 일반적인 서열분석용 프라이머 M13을 사용하여 양방향에서 염기서열을 분석하였으며, 이때 분석에 사용한 시약은 PRISM Ready Reaction Dye Terminator/primer cylcle sequencing kit(Perkin-Elmer, USA)이다. 총 10㎕ 반응액을 제품회사가 제공한 방법으로 PCR로 반응시킨 다음, 반응산물을 4%의 아크릴아마이드 젤에 전기영동 하여 ABI PRISMTM 377 DNA 서열분석기(Applied Biosystems, USA)으로 염기서열을 결정하였다.

해독된 약 520 bp의 특이밴드 염기서열을 기초로 프라이머 한 쌍을 작성하였으며, 프라이머 제작은 DNAMAN(Lynnon Biosoft, CANADA)을 사용하였다. 이 프라이머로 증폭될 밴드의 크기는 299 bp로 예상되었다. 20-mer 정방향 프라이머(A4-locus-F)는 서열번호 2번에 나타내었고, 18-mer 역방향 프라이머(A4-loci-R)는 서열번호 3번에 나타내었다.

특이 프라이머의 큰느타리2호 유래 단핵균사의 교배형 판별 능력 검증

실시예 1에서 제작한 프라이머 A4-locus-F와 A4-locus-R이 큰느타리2의 단핵균사에서 명료하고 재현성 있게 특이 밴드가 증폭되는지 확인하기 위하여 4가지 교배형을 가진 16개의 단핵균사에 적용하였다. 단핵균사들을 실시예 1의 방법으로 DNA를 분리한 다음 30ng의 게놈 DNA에 대하여 PCR을 실시하였다. PCR의 반응시 총 반응액은 10 ㎕이고, 0.2 mM dNTP(Fermentas, USA), 0.25 unit의 내열성 DNA 중합효소(SolGent, Korea)를 완충용액(2.5 mM Tris-HCl (pH 8.2), 1.5 mM MgCl2)와 20 pmol A4-locus-F, 20 pmol A4-loci-R 프라이머를 포함하고 있는 조성액이다.

PCR은 Mastercycler pro(Eppendorf)를 사용하여 실시하였고, 반응조건은 98 ℃에서 30초간 유지하여 DNA를 변성시키고, 연쇄반응을 35회(98 ℃, 10초(변성) → 70℃, 15초(재결합) → 72 ℃, 10초(DNA 중합) → 98℃, 10초(변성)) 실시하고 마지막으로 72℃에서 10분간 최종 합성을 실시하였다. 반응산물을 1.0%의 아가로스 젤에서 전기영동하고, Safeview(iNtRON Biotechnology)로 염색하여 DNA 다양성 밴드를 UV로 조사하여 검출하였으며, Gel-Doc system(Bio-rad)으로 저장하고 인쇄하여 도2에 나타내었다.

도2에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 A4-locus-F와 A4-locus-R 프라이머의 쌍은 큰느타리2호에서 나온 단핵균사 중에서 교배형이 A4Bx인 단핵균사에서만 299 bp의 특이 밴드를 나타내었다. 4, 13, 33, 37은 교배형이 A3B3이고, 6, 7, 9, 26은 교배형이 A4B3이고 12, 29, 34, 42는 교배형이 A3B4이고, 8, 10, 20, 22는 교배형이 A4B4인데, 6, 7, 9, 26, 8, 10, 20, 22에서만 특이서열이 증폭되었다. P5는 교배형이 A3B4이라 특이밴드가 나타나지 않았고, P6는 A4B3이라 특이밴드가 나타났으며, D는 이핵균사로 두 교배형이 동시에 들어있는 A3B4 × A4B3형이라 특이밴드가 관찰되었다.

특이 프라이머의 다른 계통 유래 단핵균사의 교배형 판별 능력 검증

실시예 1에서 제작한 프라이머 A4-locus-F와 A4-locus-R이 큰느타리2호외의 다른 큰느타리버섯 계통에서 유래한 단핵균사의 A4Bx의 교배형에 정상적으로 작동되는지 확인하기 독일 DSM에서 분양받은 큰느타리 균주 KNR2522(2), KNR2523(2)와 농촌진흥청에서 분양받은 KNR2501(2)을 검정 실험에 사용하였다. KNR2522(2)와 KNR2523(2)은 A4B3, A4B12, A12B3, A12B12의 4가지 교배형을 가지고, 자실체를 발생시켜 단포자를 채취하여 20개를 무작위로 선택하여 표준 교배균주와 교배하여 고유의 교배형별로 2개 균주씩을 선발하였다. KNR2501(2)은 교배형을 A3B5, A3B4, A5B5, A5B4를 가지는데 동일한 방법으로 교배형별로 2균주씩 선발하여 실험에 사용하였다.

단핵균사들을 실시예 2의 방법과 동일하게 gDNA를 분리하고 PCR반응을 실시하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도3에 보이는 것과 같이 본 발명의 A4-locus-F와 A4-locus-R 프라이머의 쌍은 다른 계통 KNR2522(2), KNR2523(2), KNR2501(2)에서 유래한 단핵균사에서 교배형 A4Bx에만 나타나는 특이 밴드의 양상을 나타내었다. KNR2523(2)의 15, 34의 교배형은 A4B3, 24, 26은 A4B12이다. KNR2522(2)의 5, 21의 교배형은 A4B12이고, 7, 15는 A4B3이다. 특이밴드가 교배형인 A4Bx인 KNR2522(2) 15, 24, 26, 34와 KNR2523(2) 5, 7, 25, 32에만 나타나는 것을 알 수 있다. KNR2501에서 유래한 단핵균사는 교배형인 A4Bx인 단핵균사가 없으므로 어떤 특이밴드도 관찰되지 않았다.

따라서, A4-locus-F와 A4-locus-R 프라이머는 큰느타리버섯 단핵균사 중 교배형 A4Bx에서만 특이적으로 증폭되어 검출되어 신속, 정확한 큰느타리버섯 단핵균사 교배형 A4Bx 판별 프라이머로 활용가능하다.

상기의 결과로써 본 발명의 방법으로 큰느타리버섯 단핵균사에서 유래한 균사체에서 직접 큰느타리버섯의 단핵균사 교배형A4Bx을 판별할 수 있게 되어, 경제적이고 빠른 확인이 가능하게 되었다.

이와 같이, 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시예에 관해 설명하였으나, 이는 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다.

그러므로, 본 발명의 실질적인 범위는 상술된 실시예에 의해 한정되어져서는 안되며, 후술하는 청구범위 뿐만 아니라 청구범위와 균등한 구성에 의해 정해져야 함은 당연하다.

서열번호 1은 실시예 1에서 분리한 큰느타리 교배형 A4Bx 특이 서열이고, 이 염기서열을 근간으로 안정된 밴드가 합성되도록 20mer의 정방향 프라이머(서열번호 2)와 18mer의 역방향 프라이머(서열번호 3)를 작성하였다.
서열번호 2는 A4-locus-F프라이머이고, 서열번호 3은 A4-locus-R 프라이머 서열이다.

<110> Gyeongsangnam-do <120> Specific PCR primers discriminating of mating type A4Bx in Pleurotus eryngii <130> A4 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 299 <212> DNA <213> Pleurotus eryngii <400> 1 aatcacggga agatctggtg tcgttattgg cttgggtacg ggtctgtctg gtgtatactg 60 cttgacacaa tgctgacatt gtccagtgct tcatcttcgt ccggaatgtc gccaaaccac 120 tgtcgacgac gccctacgca tcgctcgcgc tgagcttttc gttctttctt gctgcgggac 180 tttctctagc ttggaggata tgggattctg aagtcaacta tgttgctgcg ctgcttaatc 240 tcgttcatct ggcattatcg ggtgctttca catgggtggc aaggcgggaa ccctaccac 299 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Pleurotus eryngii <400> 2 aatcacggga agatctggtg 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Pleurotus eryngii <400> 3 gtggtagggt tcccgcct 18

Claims

큰느타리버섯 교배형 A4Bx에 특이성을 가지는 서열번호 1의 DNA 단편.
서열번호 2와 서열번호 3의 한 쌍의 프라이머 세트
청구항 1의 서열번호 1의 DNA 단편의 존재유무를 큰느타리버섯 균사체에서 확인함으로써 큰느타리버섯 교배형 A4Bx를 판별하는 검정방법
청구항 3에 있어서,
상기 검정방법은 제2항에 따른 서열번호 2와 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하고, 상기 프라이머와 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 이용하여 PCR 하는 것인 큰느타리버섯 교배형 A4Bx를 판별하는 검정방법
청구항 4에 있어서,
상기 큰느타리버섯 단핵균사 교배형 검정용 프라이머는 서열번호 2와 서열번호 3인 큰느타리버섯 교배형 A4Bx 판정용 프라이머