KR20020089391A - 호산균의 핵산 프라이머 및 호산균의 동정 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 음료 등의 검사체에 혼입하는 유해 호산균을 신속하고 또한 간편하게 검출 및 동정하는 기술이며, 서열 번호: 1∼14 중 어느 것으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머의 특정한 조합으로 이루어지는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR법에 의해서 검사체 중의 호산균을 검출하고, 동정하는 방법을 제공한다.
Description
액성이 산성 영역에 있는 음료, 예를 들면 과즙 쥬스, 유산균 음료 등에서는, 일반적으로 세균은 생육하기 어렵고, 따라서 생육하기 어려운 세균에 의하여 그들이 오염되는 문제는 없다. 그러나, 산성 영역에서 생육 가능한 호산균에 의한 오염, 특히 통상의 가열 살균 조작으로는 사멸(死滅)하기 어려운 내열성의 호산균에 의한 오염은, 중대한 문제가 된다.
종래부터, 이들 음료에 있어서 문제가 되는 호산균에 의한 오염의 검사법, 그를 위한 배지 등이 몇 가지 제안되었다. 예를 들면 일본 특개평8-140697호 공보에는, 내열성 호산균의 검출용 선택 배지 및 그 검출법이 개시되어 있다. 또한 일본 특개평8-140696호 공보에는, 과즙중에서 증식성을 가지는 내열성 호산균의 검출법이 제안되어 있다.
그러나, 이들 제안된 방법에 있어서의 균의 검출은, 어느 것도 균체의 지방산 조성의 분석 등의 생화학적 성상을 시험하는 방법에 의해 행해지고 있다. 이러한 성상 시험에는 시간과 손이 많이 가는 결점이 있다. 또한, 검출된 균체의 동정은, 일반적 생물학적 시험에 의해 행해지고 있고, 이 생물학적 시험에도 막대한 시간과 복잡한 공정, 조작이 필요하다.
최근, 상기 방법 대신에, 특정한 호산균에 관해서, 그 유전자의 염기 서열의 일부를 프라이머로서 이용하여 PCR법에 의해서 DNA 해석을 행하고, 음료 시료 중에 호산균이 혼입되어 있는지를 신속하고 간편하게 검출하는 방법이 제안되었다(일본 특개평10-234376호 공보 참조).
그러나, 이 방법에 이용되는 프라이머는, 하나의 내열성 호산균이 가지는 ω-시클로헥산 지방산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 핵산 서열의 일부를 가지는 것이다. 이 프라이머를 이용하는 방법으로 검출할 수 있는 균은, 상기 ω-시클로헥산 지방산 생합성에 관여하는 효소를 생산하는 능력을 가지는 균에 한정된다. 즉, 이 방법은, 호산균을 검출하는 방법이라기 보다는 오히려, 호산균인지 아닌지의 여부에 관계 없이, 특정한 효소 생산 능력을 가지는 균을 검출하는 방법이다. 그런데, 호산균과 상기 특정 효소의 생산 능력과는 직접 관련은 없다. 즉, 음료 등의 오염의 원인이 되는 호산균이 공통적으로 상기 특정 효소 생산 능력을 가지는 것은 아니다. 일반적으로 오염 원인이 되는 호산균의 대부분은, 상기 특정 효소 생산 능력을 갖고 있지 않다. 이와 같이, 상기 방법에 의한 검출 결과에서, 음식품의 오염에 의한 장해, 예를 들면 불쾌한 냄새 등의 발생을 예지할 수는 없다.
이상과 같이, 상기 제안된 방법은, 음료 등의 시료 중에 혼입하여, 이것을 오염시킬 우려가 있는 호산균의 검출법으로서는 부적절하다. 피검 음료 검사체가 안전한지의 여부(유해한 호산균에 의한 오염이 있는지의 여부)를 확인할 수는 없다. 더구나, 이 방법으로는 호산균에 속하는 종의 동정을 할 수 없다.
본 발명은, 호산균의 선택적 검출 방법 및 동정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 호산균(acidophilic bacteria; 好酸菌), 특히 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus)속에 속하는 호산균에 특이적인 서열을 가지는 핵산 프라이머, 및 상기 핵산 프라이머를 이용하여 상기 호산균을 동정(同定; identifying)하는 방법에 관한 것이다.
도 1은, 본 발명 프라이머 쌍을 이용한 호산균 동정 시험에 있어서의, PCR 산물의 전기 영동 결과를 도시한 도면이다.
도 2는, 본 발명 프라이머 쌍을 이용한 호산균 동정 시험에 있어서의, PCR 산물의 전기 영동 결과를 도시한 도면이다.
도 3은, 본 발명 프라이머 쌍을 이용한 호산균 동정 시험에 있어서의, PCR 산물의 전기 영동 결과를 도시한 도면이다.
본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 음료 등의 검사체 중에 혼입될 우려가 있는 유해한 호산균의 유전자에 특이적인 염기 서열을 바탕으로 한 프라이머의 합성에 성공하고 또한, 상기 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해서, 검사체 중에 혼입하는 유해한 호산균을 신속하고 또한 간편하게 검출 및 동정할 수 있는 방법의 개발에도 성공하여, 여기에 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 14 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은, 호산균의 동정을 위한 프라이머 쌍이며, 하기 (1)∼(8)에 나타내는 어느 하나의 프라이머 쌍을 제공한다.
(1) 서열 번호: 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍
(2) 서열 번호: 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍
(3) 서열 번호: 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 5로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍
(4) 서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 7로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍
(5) 서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 8로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍
(6) 서열 번호: 9로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍
(7) 서열 번호: 11로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 12로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍
(8) 서열 번호: 13으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 14로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍.
또한 본 발명은, 상기 (1)∼(8)의 핵산 프라이머 쌍 중 적어도 1종을 이용하여, PCR법에 의해서, 검사체 내의 호산균, 특히 음료 내의 호산균, 더욱 상세하게는 알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius),알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris) 및 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스(Alicyclobacillus cycloheptanicus)중 적어도 어느 1종을 동정하는 방법을 제공한다. 상기 호산균의 동정 방법은, 더욱 상세하게는, 하기 (a)∼(c)의 양태를 포함하고 있다.
(a) 상기 (1), (2) 및 (6)에 기재된 프라이머 쌍의 적어도 1종을 이용하여, 알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스를 동정하는 양태
(b) 상기 (3) 및 (7)에 기재의 프라이머 쌍의 적어도 1종을 이용하여, 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스를 동정하는 양태
(c) 상기 (4), (5) 및 (8)에 기재의 프라이머 쌍의 적어도 1종을 이용하여, 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스를 동정하는 양태
특히, 본 발명은 한번의 PCR에 의해서, 상기 (a)∼(c)를 실시하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 본 발명 프라이머 쌍의 각각이, 어느 것도 동일 PCR 조건하에 상기 3종의 호산균 중 어느 것의 원하는 유전자 영역을 증폭시킬 수 있는 성능을 가진다는 것에 기초하고 있다. 이 방법에 있어서, 예를 들면 다공 플레이트 등을 이용하여 그 각 웰 중에, 상기 3종의 호산균에 각각 특이적인 3종의 본 발명 프라이머 쌍을 넣고, 동일 검사체를 PCR반응에 제공하면, 한번의 PCR반응에 의해서 3종의 호산균을 동시에 검출 및 동정할 수 있다. 이렇게 해서, 검사체 중에 혼입할 우려가 있는 유해한 호산균을 용이하고 또한 신속하게 확인할 수 있다. 즉, 이 방법에 의하면, 검사체가 오염되어 있는지의 여부를 용이하고 또한 신속하게 예지할 수 있다.
본 발명에 의한 동정 방법은, 검사체 중에 존재하는 호산균의 DNA가 본 발명 핵산 프라이머와 하이브리다이즈(hybrieize)하는지의 여부를 PCR법으로 조사함으로써, 검사체 중의 호산균(알리사이클로바실러스속의 특정 미생물)의 존재 여부를 결정한다.
본 명세서에 있어서의 아미노산, 펩티드, 염기 서열, 핵산 등의 약호에 의한 표시는, IUPAC-IUB의 규정〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕, 「염기 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 명세서 등의 작성을 위한 지침」(특허청편) 및 해당 분야에서의 관용 기호에 의한 표시법에 따르는 것으로 한다.
이하, 본 발명에 의한 핵산 프라이머, 프라이머 쌍 및 호산균의 동정 방법에 관해서 순차적으로 상술한다.
본 발명에 따른 핵산 프라이머는, 서열 번호: 1∼14로 표시되는 것 중 어느 것의 염기 서열로 이루어지는 것을 필수로 한다. 여기서, 각 서열 번호로 표시되는 염기 서열은, 기본적으로는, 호산균 16S 리보솜 RNA의 염기 서열의 부분 서열에 대응하고 있다.
본 발명자는, 각종 호산균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 착안하여, 이 유전자의 특정 부분의 염기 서열 또는 이것과 상동하는 염기 서열, 즉 상기 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열과 스트린젠트한(stringent) 조건에서 하이브리다이즈할 수 있는 염기 서열을 갖는 프라이머를 이용함으로써, 목적으로 하는 호산균을 특이적으로 동정하는 것이 가능해짐을 발견했다.
이 16S 리보솜 RNA 유전자는, 단백질 합성에 중요한 세포내 소기관인 리보솜의 구성 성분인 리보솜 RNA를 코드하는 유전자이며, 모든 미생물에 존재한다.
음료 중에 혼입될 우려가 있는 유해 호산균인 알리사이클로바실러스속 미생물에 관해서도, 상기 16S 리보솜 RNA 유전자 자체는 알려져 있다. 예를 들면 알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius, ATCC27009)에 관해서는, EMBL/GenBank 데이터 베이스에, Accession Number X60742로서 등록된 DSM446주 유래의 1548bp가 알려져 있다〔Int. J. Syst. Bacteriol., 42 (2), 263-269 (1992)〕. 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris)에 관해서는, 홋카이도 대학의 야마자키 교수의 박사 논문에도 거론한 기탁균 ATCC49025의 16S 리보솜 RNA(1522bp)가 알려져 있다. 또한, 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스(Alicyclobacillus cycloheptanicus, ATCC49028)에 관해서는, EMBL/GenBank 데이터 베이스에, Accession Number X51928로서 등록된 1537bp가 알려져 있다〔Curr. Microbiol., 21, 325-327 (1990)〕.
이들 16S 리보솜 RNA는, 종(species) 특이적이며, 따라서, 이 RNA 중의 특정한 부분 서열은, 상기 음료인 어떤 검사체 중에 혼입될 우려가 있는 유해 호산균의 동정에 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명 핵산 프라이머의 설계에 관해서는, 증폭하는 영역의 길이를 100∼2000bp 정도로 하고, 프라이머의 길이는, 적어도 10mer, 바람직하게는 13∼30mer 정도, 더욱 바람직하게는 13∼23mer 정도로 하는 것이 좋다.
더욱, 2종의 프라이머 쌍의 Tm값(「신판 바이오 실험 일러스트레이티드 혼토니 후에루 PCR」나카야마 히로기저, 슈쥰샤, 25페이지(1998년 6월 1일 제2판 발행))에 가능한 한 근접시키는 것이, 증폭의 재현성을 높이기 위해서 바람직하다. 프라이머의 염기 서열은, 가능한 한 유전자의 염기 서열에 일치시키는 것이, 증폭하는 유전자 영역에의 특이한 결합성의 향상을 위해 바람직하지만, 프라이머의 염기 서열이 완전히 유전자의 염기 서열과 일치할 필요는 없다. 1 또는 수 개의 염기가 다른 프라이머의 경우에도, 유전자의 원하는 염기 서열을 증폭시켜 호산균의 동정을 수행할 수 있다. 그 예로서는, 예를 들면, 염기 서열: 3 및 염기서열: 8 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 각 프라이머를 예시할 수 있다.
본 발명 프라이머는, 상기의 조건을 고려하여, 공지의 수단에 의해서 간단히 합성할 수 있다. 예를 들면 포스포르아미다이트(phosphoramidite)법 또는 트리에스테르법에 의해서 화학 합성할 수 있다. 또한, 시판의 자동 올리고뉴클레오티드 합성 장치, 예를 들면 퍼킨 엘머(perkin-Elmer)사제 등의 자동 DNA 합성 장치를 이용하여, β-시아노에틸 합성법을 이용하여 합성할 수도 있다.
두 가닥 단편은, 화학 합성한 한 가닥 생성물을 이용하여, 먼저 그 상보쇄를 합성하고, 이어서 적당한 조건하에서 상기 상보쇄를 한 가닥 생성물과 어닐링시키던지, 또는 상기 한 가닥 생성물에, 적당한 프라이머 서열 및 DNA 폴리머라아제를 이용하여, 상보쇄를 부가함으로써 얻을 수 있다.
이렇게 해서 수득하는 본 발명 프라이머는, 특정 호산균의 16S 리보솜 RNA의 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리드다이즈하는 DNA로서 규정할 수 있다. 여기서, 스트린젠트한 조건이란, 프라이머가 이용되는 통상의 조건을 들 수 있다. 이 조건으로서는, 0.1% SDS를 포함하는 0.2 ×SSC 중, 50℃의 조건 및 0.1% SDS를 포함하는 1 ×SSC 중, 60℃의 조건을 들 수 있다.
본 발명 핵산 프라이머의 염기 서열의 구체적인 예로서는, 서열 번호: 1∼14에 표시되는 것을 들 수 있다. 여기서, 서열 번호: 1의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius) DSM446의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열(Accession Number X60742, 1548bp)의 161-180번째의 염기 서열에 상당한다. 또한, 서열 번호: 3의 서열은, 상기 서열 중 그 3번째의 A를 G로 치환한 것이다.
서열 번호: 2의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스 (Alicyclobacillus acidocaldarius) DSM446의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열(Accession Number X60742,1548 bp)의 591-611번째의 염기 서열의 상보쇄 서열에 상당한다.
서열 번호: 4의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) ATCC49025의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열(1522bp)의 172-192번째의 염기 서열에 상당한다.
서열 번호: 5의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) ATCC49025의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열(1522bp)의 587-609번째의 염기 서열의 상보쇄 서열에 상당한다.
서열 번호: 6의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스(Alicyclobacillus cycloheptanicus)의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열(Accession Number X51928, 1537bp)의 186-207번째의 염기 서열에 상당한다.
서열 번호: 7의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스 (Alicyclobacillus cycloheptanicus)의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열(Accession Number X51928, 1537bp)의 583-603번째의 염기 서열의 상보쇄 서열에 상당한다.
서열 번호: 8은, 상기 서열 번호: 7의 11-14번째의 cccg를 ttc로 치환한 염기 서열이다.
서열 번호: 9의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스 (Alicyclobacillus acidocaldarius) DSM446의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열(Accession Number X60742, 1548bp)의 168-180번째의 염기 서열에 상당한다.
서열 번호: 10의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스 (Alicyclobacillus acidocaldarius) DSM446의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열(Accession Number X60742, 1548bp)의 591-605번째의 염기 서열의 상보쇄 서열에 상당한다.
서열 번호: 11의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) ATCC49025의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열(1522bp)의 176-192번째의 염기 서열에 상당한다.
서열 번호: 12의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) ATCC49025의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기서열(1522bp)의 587-606번째의 염기 서열의 상보쇄 서열에 상당한다.
서열 번호: 13의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스 (Alicyclobacillus cycloheptanicus)의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열(Accession Number X51928, 1537bp)의 191-207번째의 염기 서열에 상당한다.
서열 번호: 14의 염기 서열은, 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스 (Alicyclobacillus cycloheptanicus)의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열(Accession Number X51928, 1537bp)의 583-595번째의 염기 서열의 상보쇄 서열에 상당한다.
본 발명 방법에 이용할 수 있는 상기 프라이머의 조합(포워드프라이머와 리버스프라이머의 프라이머 쌍)으로서는, 상기 (1)∼(8)에 기재의 각 프라이머 쌍을 예시할 수 있다.
본 발명 프라이머 쌍의 이용에 의하면, 검사체 중의 DNA의 증폭의 유무를 확인함으로써, 호산균(Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris및Alicyclobacillus cycloheptanicus)을 검출하여, 동정할 수 있다.
본 발명 검사법에 있어서, 검사체로서는, 대표적으로는 음료를 예시할 수 있다. 다른 검사체로서는, 토양, 야채, 고기, 과자 등을 예시할 수 있다. 이들 검사체는, 미리 적당한 배지로 배양하여 수득된 콜로니로부터 조균(釣菌)하여 피검균(被檢菌)을 분리해 두는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에 의하면, 먼저, 상기에서 분리된 피검균에서 공지의DNA 추출법, 예를 들면 페놀추출법 등에 의해, DNA를 추출하여 시료로 한다. 상기 DNA 시료의 일부에 특정한 조건하에서 본 발명 프라이머 쌍과 DNA 합성 효소를 작용시켜 PCR 반응을 행한다. 이것에 의해서, DNA 시료중의 어느 특정한 유전자 영역이 증폭되기 때문에, 수득하는 PCR 반응액을, 예를 들면 전기영동법 등에 제공하여, 증폭된 DNA를 사이즈별로 분리하여, DNA 증폭 산물의 존재를 확인한다.
이렇게 해서, 본 발명 방법에 의하면, 기대되는 사이즈의 DNA 증폭 산물의 존재의 유무를 조사함으로써, 검사체 중에 호산균이 혼입하는지의 여부를 판정할 수 있다. 또한, 상기 DNA 증폭 산물의 염기 서열을 결정하여, 호산균의 해당 유전자 영역의 염기 서열과 비교함으로써, 보다 신뢰성이 높은 검출 및 동정이 가능해진다.
또한, 상기 PCR 반응은, 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다(예를 들면 Science, 230, 1350 (1985) 참조).
또한, 증폭시킨 DNA 단편의 단리(單離) 정제도, 통상적인 방법, 예를 들면 겔전기영동법 등에 의행 행할 수 있다.
본 발명 프라이머 및 상기 단리 정제된 DNA 단편의 염기 서열의 결정도, 통상적인 방법, 예를 들면 디데옥시법〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕, 맥섬-길버트(Maxam-Gilbert)법〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕등에 따라서 행할 수 있다. 또한 이 염기 서열의 결정은, 간편하게는 시판의 시퀀스 키트 등을 이용하여 행할 수도 있다.
본 발명 프라이머는, 이것을 프로브(probe)로서 이용하여, DNA 하이브리다이제이션(hybridization)법에 의해서, 호산균을 동정할 수도 있다. 이 방법은, 예를 들면, 검사체로부터 DNA 시료를 상기와 같은 방법으로 조제하고, 폴리아미드제 멤브레인(membrane) 등에 흡착, 고정하여, 비오틴 등으로 표식한 프로브와 하이브리다이제이션시킴으로써 실시할 수 있다. 이 방법에 의하면, 피검 DNA 시료가 프로브와 상보적이면, 상기 멤브레인 등의 위에 두 가닥이 형성되고, 이 두 가닥의 표식 활성을 측정함으로써, 검정중의 호산균을 동정할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해, 실시예를 든다.
실시예 1
(1) 시험균
하기 표 1 기재의 각 기탁균을 시험균으로 하였다.
| 종(species) | 주(strain) |
| A. acidocaldarius | IFO15652 (type strain) |
| A. acidoterrestris | ATCC49025 (type strain) |
| A. cycloheptanicus | IFO15310 (type strain) |
| B. subtilis | ATCC6633 |
| B. coagulans | IAM1115 (type strain) |
| B. stearothermophilus | IAM1035 |
| Cl. sporogenes | IAM19235 |
(2) DNA 용액의 조제
각 시험균으로부터 인스타진 DNA 정제 매트릭스(InstaGene DNA Purification Matrix, Bio-Rad사 제)를 이용하여, 제조사의 매뉴얼에 따라서, DNA 용액을 조제했다. 즉, 균체 1 루프를 멸균수(sterilized water) 800㎕에 현탁하고, 원심 분리(10000 G, 10분)하여, 상청을 제거하여 침전(균체)을 분리하는 세정 조작을, 한번 더 반복했다. 이어서, 수득한 침전(균체)에, 인스타진 DNA 퓨어리피케이션 매트릭스 200㎕을 첨가하고, 56℃로 30분간 인큐베이트한 후, 교반(Vortex 사용)하고, 펄펄 끓이는(8분) 것으로 균을 용해시켜 DNA 용액을 조제했다.
(3) 본 발명에 따른 프라이머의 설계 및 합성
알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius)의 16S 리보솜 RNA 유전자(Accession Number X60742(EMBL/GenBank database)〔Int. J. Syst. Bacteriol., 42 (2), 263-269 (1992)〕, 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris)의 16S 리보솜 RNA 유전자(홋카이도대학 야마자키 조교수의 박사 논문) 및 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스 (Alicyclobacillus cycloheptanicus)의 16S 리보솜 RNA 유전자(Accession Number X51928 (EMBL/GenBank database)〔Curr. Microbiol., 21, 325-327 (1990)〕의 염기 서열로부터, 하기 표 2에 기재의 본 발명 프라이머를 설계하고, 합성하였다. 상기 합성에는, 자동 DNA 합성 장치(퍼킨 엘머(perkin-Elmer)사제)를 사용했다.
| 종 | 프라이머 | 염기 서열 | Tm(℃) |
| A. acidocaldarius | 포워드 프라이머 | 서열 번호: 1 | 61.6 |
| A. acidocaldarius | 리버스 프라이머 | 서열 번호: 2 | 57.6 |
| A. acidocaldarius | 포워드 프라이머 | 서열 번호: 3 | 63.6 |
| A. acidoterrestris | 포워드 프라이머 | 서열 번호: 4 | 57.6 |
| A. acidoterrestris | 리버스 프라이머 | 서열 번호: 5 | 54.2 |
| A. cycloheptanicus | 포워드 프라이머 | 서열 번호: 6 | 59.5 |
| A. cycloheptanicus | 리버스 프라이머 | 서열 번호: 7 | 63.3 |
| A. cycloheptanicus | 리버스 프라이머 | 서열 번호: 8 | 57.6 |
(4) PCR법에 의한 호산균의 동정
(4-1) PCR 반응액의 조제
하기 표 3의 조성에 따라서, 각 시약 및 상기 (2)에서 조제한 각 DNA 용액을, 0.2 ml 튜브(다카라 슈조사제)에 첨가하여 PCR 반응액을 조제했다. 이들의 조작은 빙상(氷上)에서 행했다.
| 성분 | 첨가량(㎕/25㎕) | 최종 농도 |
| 5 U/㎕ TaKaRa Taq | 0.25 | 1.25 U/25㎕ |
| 10 ×PCR buffer(MgCl2free) | 2.5 | 1배 농도 |
| 25 mM MgCl2 | 2 | 2 mM |
| 2.5 mM dNTP 혼합물 | 2 | 200 μM |
| 4 pmol/㎕ 포워드 프라이머 | 2 | 320 nM |
| 4 pmol/㎕ 리버스 프라이머 | 2 | 320 nM |
| DNA template | 1 | - |
| 멸균 증류수 | 13.25 | - |
| 합계 | 25 | - |
(4-2) PCR 법
상기 (4-1)에서 조제한 반응액을 넣은 각 튜브를 서멀 사이클(TaKaRa PCR Thermal Cycler MP, 다카라 슈조사 제)내의 히트 블록에 세팅하고, 하기 표 4에 기재된 온도 조건으로 PCR 반응을 행하였다. 즉, 94℃ 4분의 열 변성 공정을 행한 후, 94℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 1분의 사이클을 29회 수행하고, 마지막으로 94℃ 30초, 60℃ 30초, 및 72℃ 5분의 처리를 행하였다.
| 공정 | 온도(℃) | 공정1 | 공정2 | 공정3 |
| 시간 | 시간 | 시간 | ||
| 열 변성 | 94 | 4분 | 30초 | 30초 |
| 어닐링 | 60 | - | 30초 | 30초 |
| 신장 반응 | 72 | - | 1분 | 5분 |
| 사이클수 | 1 | 29 | 1 |
또한, 각 프라이머 쌍으로서는, (A) 서열 번호: 1의 프라이머와 서열 번호: 2의 프라이머의 조합, (B) 서열 번호: 3의 프라이머와 서열 번호: 2의 프라이머의 조합, (C) 서열 번호: 4의 프라이머와 서열 번호: 5의 프라이머의 조합, (D) 서열 번호: 6의 프라이머와 서열 번호: 7의 프라이머의 조합 및 (E) 서열 번호: 6의 프라이머와 서열 번호: 8의 프라이머의 조합을 각각 사용했다. 또한, 시험은, 첫번째에 상기 (A), (C) 및 (D)의 각 프라이머 쌍을 이용하여 실시하고, 두번째에 상기 (B), (C) 및 (E)의 각 프라이머 쌍을 이용하여 실시했다.
(4-3) 전기 영동
PCR 반응 종료 후, 반응액 25㎕에 6 ×Loading buffer(다카라 슈조사제) 5㎕을 첨가하고, 그 6㎕을 1.5% 아갈로스겔(Agarose LO3, 다카라 슈조사제, 1 ×TBE buffer)로써 전기 영동시켰다(영동 장치; Mupid, 코스모 바이오사제 사용).
(4-4) 관찰
전기 영동 후, 겔을 1μg/ml 에티디움 브로마이드로 20분간 염색하고, 물로 10분간 세정했다. 이 겔에 대하여, 자외선(Mini-Transiluminator, Bio-Rad)하에서 영동 패턴을 관찰하고, 폴라로이드 사진을 촬영했다.
(4-5) 결과
영동 결과(촬영 사진)를, 도 1 및 도 2에 도시한다.
도 1은, 첫번째의 결과(프라이머 쌍으로서 상기 (A), (C) 및 (D)의 조합을 사용)이며, 도 2는 두번째의 결과(프라이머 쌍으로서 상기 (B), (C) 및 (E)의 조합을 사용)이다. 도 1 및 도 2에 있어서의 각 레인은 다음과 같다.
도 1:
레인 M 분자량 마커
레인 1A. acidocaldarius
레인 2A. acidoterrestris
레인 3A. cycloheptanicus
레인 4B. subtilis
레인 5B. coagulans
레인 6B. stearothermophilus
레인 7Cl. sporogenes
도 2:
레인 M 분자량 마커
레인 1A. cycloheptanicus
레인 2A. acidoterrestris
레인 3A. acidocaldarius
레인 4B. subtilis
레인 5B. coagulans
레인 6B. stearothermophilus
레인 7Cl. sporogenes
상기 사진 결과에 기초하여, 각 프라이머 쌍의 이용과 각 시험균을 검출할 수 있는지의 여부(+; 검출, -; 검출되지 않음)와의 관계를 조사했다. 그 결과를 하기 표 5에 나타낸다.
| 균종 | 프라이머 쌍 | |||||
| (A) | (C) | (D) | (B) | (C) | (E) | |
| A. acidocaldarius | + | - | - | + | - | - |
| A. acidoterrestris | - | + | - | - | + | - |
| A. cycloheptanicus | - | - | + | - | - | + |
| B. subtilis | - | - | - | - | - | - |
| B. coagulans | - | - | - | - | - | - |
| B. stearothermophilus | - | - | - | - | - | - |
| Cl. sporogenes | - | - | - | - | - | - |
도 1, 도 2 및 표 5에 나타낸 결과로부터, 본 발명 프라이머 쌍의 이용에 의해서, 알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스(Alicyclobacillusacidocaldarius), 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris) 및 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스(Alicyclobacillus cycloheptanicus)의 3종의 시험균의 경우에, 약 450bp, 430bp 및 400bp의 목적 염기 길이의 PCR 산물이 각각 생성되고, 그 이외의 유사한 종(近種)의 경우에는, PCR 산물의 생성은 확인할 수 없음이 밝혀졌다.
이것으로부터, 본 발명 프라이머 쌍의 어느 하나의 이용에 의해서, 상기 3종의 호산균의 어느 것이 확실하게 검출 및 동정할 수 있음을 알았다.
또한, 상기 시험은, 동일 PCR 조건하에서 행해지는 점에서, 3종의 호산균의 각각에 특이적인 3종의 본 발명 프라이머 쌍을 병용하면, 한번의 PCR 반응에 의해서 동시에 이들 3종의 호산균을 검출 및 동정할 수 있음이 분명하다. 이 점에서, 본 발명 방법에 의하면, 검사체중에 혼입할 우려가 있는 유해 호산균을 선택적으로, 더구나 용이하고 또한 신속하게 동정할 수 있고, 이렇게 해서 이들 호산균에 의한 검사체의 오염을 예지할 수 있는 것이 분명하다.
실시예 2
(1) 시험균
상기 표 1 기재의 각 기탁균을 시험균으로 했다.
(2) DNA 용액의 조제
실시예 1의 (2)와 같이 하여 DNA 용액을 조제했다.
(3) 본 발명 프라이머의 설계 및 합성
알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius)의 16S 리보솜 RNA 유전자(Accession Number X60742(EMBL/GenBank database)〔Int. J. Syst. Bacteriol., 42 (2), 263-269 (1992)〕, 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris)의 16S 리보솜 RNA 유전자(홋카이도 대학 야마자키 조교수의 박사 논문) 및 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스 (Alicyclobacillus cycloheptanicus)의 16S 리보솜 RNA 유전자(Accession Number X51928 (EMBL/GenBank database)〔Curr. Microbiol., 21, 325-327 (1990)〕의 염기 서열로부터, 하기 표 6 기재의 본 발명 프라이머를 설계하고, 합성했다. 상기 합성에는, 자동 DNA 합성 장치(퍼킨 엘머(perkin-Elmer)사제)를 사용했다.
| 종 | 프라이머 | 염기 서열 | Tm(℃) |
| A. acidocaldarius | 포워드 프라이머 | 서열 번호: 9 | 53.0 |
| A. acidocaldarius | 리버스 프라이머 | 서열 번호: 10 | 51.2 |
| A. acidoterrestris | 포워드 프라이머 | 서열 번호: 11 | 49.8 |
| A. acidoterrestris | 리버스 프라이머 | 서열 번호: 12 | 49.3 |
| A. cycloheptanicus | 포워드 프라이머 | 서열 번호: 13 | 49.8 |
| A. cycloheptanicus | 리버스 프라이머 | 서열 번호: 14 | 53.0 |
(4) PCR법에 의한 호산균의 동정
(4-1) PCR 반응액의 조제
상기 표3의 조성에 따라서, 각 시약 및 상기 (2)에서 조제한 각 DNA 용액을, 0.2 ml 튜브(다카라 슈조사제)에 첨가하여 PCR 반응액을 조제하였다. 이들의 조작은 빙상에서 행하였다.
(4-2) PCR법
상기 (4-1)에서 조제한 반응액을 넣은 각 튜브를 서멀 사이클러(TaKaRa PCRThermal Cycler MP, 다카라 슈조사제) 내의 히트 블록에 셋팅하고, 상기 표 4에 기재의 온도 조건으로 PCR 반응을 행했다.
또한, 각 프라이머 쌍으로서는, (F) 서열 번호: 9의 프라이머와 서열 번호: 10의 프라이머의 조합, (G) 서열 번호: 11의 프라이머와 서열 번호: 12의 프라이머의 조합 및 (H) 서열 번호: 13의 프라이머와 서열 번호: 14의 프라이머의 조합을 사용했다.
(4-3) 전기 영동 및 관찰
PCR 반응 종료후, 반응액 25㎕에 6 ×Loading buffer(다카라 슈조사제) 5㎕을 첨가하고, 그 6㎕을 1.5% 아갈로스 겔(Agarose LO3, 다카라 슈조사제, 1 ×TBE buffer)로써 전기 영동시켰다(영동 장치; Mupid, 코스모바이오사제 사용).
전기 영동후, 겔을 1μg/ml 에티디움 브로마이드로 20분간 염색하고, 물로 10분간 세정했다. 이 겔에 대해서, 자외선(Mini-Transiluminator, Bio-Rad)하에서 영동 패턴을 관찰하여, 폴라로이드 사진을 촬영했다.
(5) 결과
영동 결과(촬영 사진)을, 도 3에 도시한다.
도 3은, 프라이머 쌍으로서 상기 (F), (G) 및 (H)의 조합을 사용한 결과를 좌에서부터 순차로 각각 도시한 것이며, 각 레인은 도 1에서의 그것과 같다.
상기 사진 결과에 기초하여, 각 프라이머 쌍의 이용과 각 시험균을 검출할 수 있는지의 여부(+; 검출, -; 검출 되지 않음)와의 관계를 조사했다. 그 결과를 하기 표 7에 나타낸다.
| 균종 | 프라이머 쌍 | ||
| (F) | (G) | (H) | |
| A. acidocaldarius | + | - | - |
| A. acidoterrestris | _ | + | - |
| A. cycloheptanicus | - | - | + |
| B. subtilis | - | - | - |
| B. coagulans | - | - | - |
| B. stearothermophilus | - | - | - |
| Cl. sporogenes | - | - | - |
도 3 및 표 7에 나타낸 결과로부터, 본 발명 프라이머 쌍의 각각의 이용에 의해서, 알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris) 및 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스(Alicyclobacillus cycloheptanicus)의 3종의 시험균의 각각의 경우에, 약 450bp, 430bp 및 400bp의 목적 염기 길이의 PCR 산물이 생성되는 것을 알았다. 또한, 이들 이외의 유사한 종에서는, PCR 산물의 생성은 확인할 수 없는 것도 밝혀졌다. 이러한 점에서, 본 발명에 따른 프라이머의 이용에 의해서, 상기 3종의 호산균 각각을 선택적으로 검출 및 동정할 수 있음을 알았다.
호산균에 의한 오염의 우려가 있는 음료 등을 검사체로 하여 상기 시험을 행하고, 그 때, 예를 들면 다공 플레이트 등을 이용하여 그 각 웰 중에, 3종의 호산균의 각각에 특이적인 3종의 본 발명 프라이머 쌍을 넣고 동일 검사체를 PCR 반응에 제공하면, 한번의 PCR 반응에 의해서 3종의 호산균을 동시에 검출 및 동정할 수 있다. 이 점에서, 본 발명 방법에 의하면, 검사체의 호산균에 의한 오염을 용이하고 신속하게 판정할 수 있음이 분명하다.
본 발명은, 호산균에 특이적인 핵산 프라이머를 제공한다. 본 발명에 따른 프라이머를 이용함으로써, 음료 등의 검사체의 오염 원인균인 호산균을 선택적으로, 더구나 용이하고 신속하게 검출 및 동정할 수 있다.
Claims (30)
- 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 14 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 5로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 7로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 8로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 9로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 11로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 12로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 13으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 서열 번호: 14로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머.
- 호산균을 동정하기 위한 프라이머 쌍에 있어서,(1) 서열 번호: 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(2) 서열 번호: 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(3) 서열 번호: 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 5로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(4) 서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 7로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(5) 서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 8로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(6) 서열 번호: 9로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(7) 서열 번호: 11로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 12로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍, 및(8) 서열 번호: 13으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 14로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 쌍.
- 제16 항에 있어서,서열 번호: 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머인프라이머 쌍.
- 제16 항에 있어서,서열 번호: 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머인프라이머 쌍.
- 제16 항에 있어서,서열 번호: 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 5로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머인프라이머 쌍.
- 제16 항에 있어서,서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 7로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머인프라이머 쌍.
- 제16 항에 있어서,서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 8로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머인프라이머 쌍.
- 제16 항에 있어서,서열 번호: 9로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머인프라이머 쌍.
- 제16 항에 있어서,서열 번호: 11로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 12로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머인프라이머 쌍.
- 제16 항에 있어서,서열 번호: 13으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 14로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머인프라이머 쌍.
- 검사체 중의 호산균을 동정하는 방법에 있어서,(1) 서열 번호: 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(2) 서열 번호: 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(3) 서열 번호: 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 5로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(4) 서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 7로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(5) 서열 번호: 6로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 8로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(6) 서열 번호: 9로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍,(7) 서열 번호: 11로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 12로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍, 및(8)서열 번호: 13으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 14로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 법을 실시하는 호산균의 동정 방법.
- 제25 항에 있어서,호산균이 알리사이클로바실러스·아시도칼다리어스(Alicyclobacillus acidocaldarius)이며, 사용되는 프라이머 쌍이 (1) 서열 번호: 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍, (2) 서열 번호: 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍, 및 (6) 서열 번호: 9로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인호산균의 동정 방법.
- 제25 항에 있어서,호산균이 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris)이며, 사용되는 프라이머 쌍이 (3) 서열 번호: 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 5로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍, 및 (7) 서열 번호: 11로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 12로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인호산균의 동정 방법.
- 제25 항에 있어서,호산균이 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스(Alicyclobacillus cycloheptanicus)이며, 사용되는 프라이머 쌍이 (4) 서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 7로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍, (5) 서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 8로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍 및 (8) 서열 번호: 13으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 14로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인호산균의 동정 방법.
- 제25 항에 있어서,호산균이 알리사이클로바실러스·아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 알리사이클로바실러스·아시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris) 및 알리사이클로바실러스·사이클로헵타니커스(Alicyclobacillus cycloheptanicus)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종이며, 사용되는 프라이머 쌍이 하기 3그룹1그룹: (1) 서열 번호: 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍, (2) 서열 번호: 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍, 및 (6) 서열 번호: 9로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍2그룹: (3) 서열 번호: 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 5로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍 및 (7) 서열 번호: 11로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 12로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍3그룹: (4) 서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 7로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍, (5) 서열 번호: 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 8로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍 및 (8) 서열 번호: 13로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와 서열 번호: 14로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산 프라이머와의 프라이머 쌍의 각각에 속하는 적어도 1종씩인호산균의 동정 방법.
- 제25 항에 있어서,검사체가 음료인호산균의 동정 방법.
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