TWI394838B - 微生物檢測用之寡核苷酸與其陣列、微生物檢測器具、微生物檢測方法以及微生物檢測工具組 - Google Patents
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Description
本發明係有關微生物檢測用之寡核苷酸與其陣列、微生物檢測器具、微生物檢測方法以及微生物檢測工具組。
食品中混入有害微生物就會成為品質劣化之原因。例如麥芽酒精飲料中混入有害微生物時，會產生混濁或風味之劣變等。另外，例如啤酒中混入酒香酵母(德克酵母)屬(Brettanomyces(Dekkera))、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、釀造用酵母以外之酵母屬(Saccharomyces)等非釀造用酵母時，啤酒之品質降低，成為混濁或變味之原因。此等有害微生物之檢測方法，目前最普遍的方法係將作為對象之啤酒以膜濾器過濾後，在適當培養基中培養，然後將生長之菌落加以檢測。
又，該菌落是否為上述有害微生物之判斷方法，乃自菌落抽取DNA做為模板，使用對於上述有害微生物具有專一性之引子(primer)進行PCR，再利用電泳判定是否獲得PCR產物之方法(例如參照日本專利特開平7－289295號公報)。然而，此方法必須針對各種菌種使用多種引子進行複數次之PCR，故操作極為煩雜，於速度(迅速性)上有問題。另外，為縮短檢測時間，雖然可將多種引子混合在一個試管中而進行擴增反應，但是所使用引子之數目有限，依據微量試樣進行正確之判斷仍然有困難。
為解決上述問題，將各個菌種中普遍存在之基因之含有種專一性序列部分加以擴增而設計引子，擴增後，藉能辨識種專一性序列之限制酶切割擴增產物，再由電泳所得區帶大小鑑別屬於那一菌種之基因。然而，上述方法由於作為對象之全部菌種不一定有可供辨別之限制酶存在，又，所得擴增產物以多種限制酶分別切割以供於電泳，也必需極煩雜之操作，就迅速性、簡便性而言，大有問題。
更進而為解決上述課題，尚有使用種專一性之序列作為探針，藉由雜交作用判斷被檢測試樣中之DNA或RNA是否存在與其序列成為互補之序列的方法。
然而，藉上述雜交鑑別判斷之方法，對於非常近緣而DNA之同質性高之菌種，也頻繁發生誤為他種而雜交之交叉雜交之問題，產生正確鑑別菌種上之困難。
因此，急待研發藉由正確且簡便而迅速判斷特定微生物之存在之有無而鑑別菌種之方法。
特別是急須研發可使用於上述方法而不會產生交叉雜交之問題的專一性核酸探針。
本發明研究者為解決上述課題而努力研究，結果發現在麥芽酒精飲料之代表性污染微生物之ITS區域(即，微生物之18S核糖體RNA基因及25S核糖體RNA基因之間之間隔區域)相對應之鹼基序列中，存在有特定之屬或特定之種之專一性序列，藉由使用基於該鹼基序列之寡核苷酸作為探針，可迅速且正確地檢測及/或鑑定被檢測試樣中之目的之微生物，而完成本發明。
即，本發明提供下列所示寡核苷酸、用於檢測出被檢測試樣中之微生物之存在的寡核苷酸陣列、備有該等陣列之微生物檢測器具或工具組、以及被檢測試樣中微生物存在加以檢測出之方法。
(1)包括序列編號1至64之任一核酸序列之寡核苷酸。
(1a)由序列編號1至64之任一核酸序列而成的寡核苷酸。
(2)上述(1)或(1a)項所記載之寡核苷酸，其係作為用於檢測出被檢測試樣中微生物存在的探針。
(2a)上述(2)項所記載之寡核苷酸，其中，上述被檢測試樣係食品。
(2b)上述(2)項所記載之寡核苷酸，其中，上述被檢測試樣係麥芽酒精飲料。
(3)核酸序列係含有序列編號1至64中任一序列，對於選擇自下列(i)至(vii)群之微生物之一群所屬微生物之核酸互補鏈可以專一性雜交，或對於選擇自(i)至(vii)群之複數群之各自所屬微生物之核酸互補鏈可以專一性雜交之寡核苷酸：(i)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)所屬之微生物，(ii)異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)所屬之微生物，(iii)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)或貝酵母(Saccharomyces bayanus)所屬之微生物，(iv)異畢赤酵母(Pichia anomala)所屬之微生物，(v)烏孢拉有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)或季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniaspora guilliermondii)所屬之微生物，(vi)粗壯假絲酵母(Candida valida)或膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)所屬之微生物，以及(vii)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces (Dekkera)bruxellensis)或異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)所屬之微生物。
(4)一種寡核苷酸陣列，係用以檢測出被檢測試樣中微生物存在之寡核苷酸陣列，含有經固定於支持體且包括由序列編號1至64之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之至少一個寡核苷酸。
(4a)一種寡核苷酸陣列，係用以檢測出被檢測試樣中微生物存在之寡核苷酸陣列，含有經固定於支持體且由序列編號1至64之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之至少一個寡核苷酸。
(5)一種寡核苷酸陣列，其係用以檢測出被檢測試樣中微生物存在之寡核苷酸陣列，含有經固定於支持體且包括由下列(A)至(G)所成組群中選擇任一核酸序列之至少一個寡核苷酸，或其任意組合：(A)包括由序列編號1至6、8及10至14之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之至少一個寡核苷酸，(B)包括由序列編號15至22及25至29之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之至少一個寡核苷酸，(C)包括由序列編號30至43之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之至少一個寡核苷酸，(D)包括由序列編號44至52之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之至少一個寡核苷酸，(E)包括由序列編號53至56之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之至少一個寡核苷酸，(F)包括由序列編號57至64之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之至少一個寡核苷酸，(G)包括由序列編號7、9、23及24之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之至少一個寡核苷酸。
(5a)一種寡核苷酸陣列，其係用以檢測出被檢測試料中微生物存在之寡核苷酸陣列，含有經固定於支持體且由下列(A)至(G)所成組群中選擇任一核酸序列而成之至少一個寡核苷酸，或其任意組合所成者：(A)由序列編號1至6、8及10至14之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之至少一個寡核苷酸，(B)由序列編號15至22及25至29之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之至少一個寡核苷酸，(C)由序列編號30至43之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之至少一個寡核苷酸，(D)由序列編號44至52之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之至少一個寡核苷酸，(E)由序列編號53至56之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之至少一個寡核苷酸，(F)由序列編號57至64之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之至少一個寡核苷酸，(G)由序列編號7、9、23及24之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之至少一個寡核苷酸。
(6)如上述(5)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，至少含有上述(A)項之寡核苷酸。
(7)如上述(6)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，上述微生物至少為布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)所屬之微生物。
(8)如上述(5)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，至少含有上述(B)項之寡核苷酸。
(9)如上述(8)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，上述微生物至少為異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)所屬之微生物。
(10)如上述(5)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，至少含有上述(C)項之寡核苷酸。
(11)如上述(10)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，上述微生物至少為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)或貝酵母(Saccharomyces bayanus)所屬之微生物。
(12)如上述(5)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，至少含有上述(D)項之寡核苷酸。
(13)如上述(12)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，上述微生物至少為異畢赤酵母(Pichia anomala)所屬之微生物。
(14)如上述(5)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，至少含有上述(E)項之寡核苷酸。
(15)如上述(14)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，上述微生物至少為烏孢拉孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)或季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniaspora guilliermondii)所屬之微生物。
(16)如上述(5)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，至少含有上述(F)項之寡核苷酸。
(17)如上述(16)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，上述微生物至少為粗壯假絲酵母(Candida valida)或膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)所屬之微生物。
(18)如上述(5)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，至少含有上述(G)項之寡核苷酸。
(19)如上述(18)項所記載之寡核苷酸陣列，其中，上述微生物至少為布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)或異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)所屬之微生物。
(20)如上述(4)至(19)項所記載之任一陣列，其中，上述被檢測試樣係食品。
(20a)如上述(4)至(19)項所記載之任一陣列，其中，上述被檢測試樣係麥芽酒精飲料。
(21)一種微生物檢測器具，其特徵為被檢測試樣中之微生物係從下列微生物群(i)至(vii)所成組群中：(i)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)所屬之微生物，(ii)異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)所屬之微生物，(iii)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)或貝酵母(saccharomyces bayanus)所屬之微生物，(iv)異畢赤酵母(Pichia anomala)所屬之微生物，(v)烏孢拉有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)或季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniaspora guilliermondii)所屬之微生物，(vi)粗壯假絲酵母(Candida valida)或膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)所屬之微生物，(vii)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)或異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)所屬之微生物，所選擇之一群微生物、或複數群中之任一群之微生物，該器具係用以檢測及/或鑑定該等微生物，該器具係備有一種支持體，該支持體係將對所選擇之一群所屬微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交的至少一個寡核苷酸、或對於所選擇之複數群各自所屬微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交的至少兩個寡核苷酸加以固定於支持體而成者。
(22)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(i)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係包括由序列編號1至6、8及10至14之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之寡核苷酸。
(22a)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(i)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係由序列編號1至6、8及10至14之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之寡核苷酸。
(23)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(ii)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係包括由序列編號15至22及25至29之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之寡核苷酸。
(23a)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(ii)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係由序列編號15至22及25至29之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之寡核苷酸。
(24)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(iii)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係包括由序列編號30至43之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之寡核苷酸。
(24a)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(iii)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係由自序列編號30至43之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之寡核苷酸。
(25)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(iv)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係包括由序列編號44至52之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之寡核苷酸。
(25a)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(iv)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係由序列編號44至52之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之寡核苷酸。
(26)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(v)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係包括由序列編號53至56之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之寡核苷酸。
(26a)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(v)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係由序列編號53至56之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之寡核苷酸。
(27)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(vi)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係包括序列編號57至64之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之寡核苷酸。
(27a)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(vi)所屬群之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係由序列編號57至64之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之寡核苷酸。
(28)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(vii)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係包括由序列編號7、9、23及24之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列之寡核苷酸。
(28a)如上述(21)項所記載之器具，其中，對於上述(vii)群所屬之微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交之寡核苷酸，係由序列編號7、9、23及24之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列而成之寡核苷酸。
(29)如上述(21)至(28a)項所記載之任一項之器具，其特徵為：上述支持體表面上具有碳二醯亞胺基或異氰酸基，藉由該碳二醯亞胺基或異氰酸基與上述寡核苷酸或加成於寡核苷酸末端之連接子(linker)，加以反應而形成共價鍵，使上述寡核苷酸固定於支持體上。
(30)一種微生物檢測方法，其係用以進行被檢測試樣中微生物之檢測、或被檢測試樣中微生物所屬群之鑑定、或被檢測試樣中微生物之檢測及該微生物所屬群之鑑定之方法，其特徵為包括下列步驟：調製被檢測試樣中微生物之核酸的核酸調製步驟，及以該核酸作為模板而調製標識探針的探針調製步驟，及使用上述(1)至(3)項中所記載之任一之寡核苷酸、上述(4)至(20)項中任一項所記載之寡核苷酸陣列、或上述(21)至(29)項中任一項所記載之器具，使固定於支持體表面之寡核苷酸和上述標識探針進行雜交的雜交步驟，及檢測雜交訊號的訊號檢測步驟。
(31)如上述(30)項所記載之方法，其中，上述被檢測試樣係食品。
(31a)如上述(30)項所記載之方法，其中，上述被檢測試樣係麥芽酒精飲料。
(32)一種工具組，其係用以實施上述(30)至(31a)項中任一項所記載之方法的微生物檢測工具組，包含上述(1)至(3)項中任一項所記載之寡核苷酸、上述(4)至(20)項中任一項所記載之陣列、或上述(21)至(29)項中任一項所記載之器具。
(33)如上述(32)項所記載之工具組，其中，尚包括上述雜交步驟及訊號檢測步驟中所使用之試劑。
(34)如上述(32)或(33)項所記載之工具組，其中，尚包括上述探針調製步驟及/或上述核酸調製步驟中所使用之試劑。
依據本發明，在將被檢測試樣中微生物加以檢測及/或鑑定之方法中，提供可將交叉雜交之問題抑制在最小範圍的寡核苷酸探針。
依據本發明相關之微生物檢測用寡核苷酸陣列或微生物檢測器，因為藉由使用基於作為對象之微生物所屬之種或屬之專一性鹼基序列的寡核苷酸，使該寡核苷酸和源自於被檢測試樣之核酸進行雜交，而檢測及/或鑑定被檢測試樣中之微生物，所以可正確且簡便地進行微生物之檢測及/或鑑定。
又，藉由使用在基板表面含有基於複數之微生物種或屬之專一性鹼基序列的寡核苷酸的陣列，可進行全面網羅性檢測。
更進之，本發明相關之微生物檢測工具組由於含有上述微生物檢測用寡核苷酸陣列、或微生物檢測器具、及需要之試劑，所以可提供良好之操作功能，比起以往更能簡便地進行微生物之檢測及/或鑑定。
本發明之一種態樣係提供含有序列編號1至64之任一核酸序列之寡核苷酸(參照表1－1及表1－2)。此等寡核苷酸可作為用以檢測出被檢測試樣中微生物存在的探針。上述被檢測試樣以食品為佳，其中以麥芽酒精飲料為更佳。
使用本發明之寡核苷酸可檢測出被檢測試樣中之微生物如下：(i)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)所屬之微生物，(ii)異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)所屬之微生物，(iii)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)或貝酵母(Saccharomyces bayanus)所屬之微生物，(iv)異畢赤酵母(Pichia anomala)所屬之微生物，(v)烏孢拉有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)或季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniaspora guilliermondii)所屬之任一微生物，(vi)粗壯假絲酵母(Candida valida)或膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)所屬之任一微生物，以及(vii)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)或異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)所屬之任一微生物。
又，本發明在另一種態樣中，提供用以檢測出被檢測試樣中微生物存在的寡核苷酸陣列。該寡核苷酸陣列包含經固定於支持體，且包括由序列編號1至64之核酸序列所成組群中選擇任一核酸序列的至少一個寡核苷酸。
本發明中，可作為用以檢測及/或鑑定被檢測試樣中微生物的探針而使用之寡核苷酸，如下述可依據種或屬而分群。本發明相關之微生物檢測用之寡核苷酸陣列或微生物檢測器具中，至少有一個以上之寡核苷酸固定在支持體之表面。
(A)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)所屬微生物之相對應於ITS區域之鹼基序列中，基於該同種之專一性序列的寡核苷酸，乃含有序列編號1至6、8及10至14所示鹼基序列之寡核苷酸。
(B)異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)所屬微生物之相對應於ITS區域之鹼基序列中，基於該同種之專一性序列的寡核苷酸，乃含有序列編號15至22及25至29所示鹼基序列之寡核苷酸。
(C)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)或貝酵母(Saccharomyces bayanus)所屬之微生物之相對應於ITS區域之鹼基序列中，基於該同種之專一性序列的寡核苷酸，乃含有序列編號30至43所示鹼基序列之寡核苷酸。
(D)異畢赤酵母(Pichia anomala)所屬之微生物之相對應於ITS區域之鹼基序列中，基於該同種之專一性序列的寡核苷酸，乃含有序列編號44至52所示鹼基序列之寡核苷酸。
(E)烏孢拉有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)或季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniaspora guilliermondii)所屬之微生物之相對應於ITS區域之鹼基序列中，基於該同種之專一性序列的寡核苷酸，乃含有序列編號53至56所示鹼基序列之寡核苷酸。
(F)粗壯假絲酵母(Candida valida)或膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)所屬之微生物之相對應於ITS區域之鹼基序列中，基於該同種之專一性序列的寡核苷酸，乃含有序列編號57至64所示鹼基序列之寡核苷酸。
藉由使用將上述(A)至(F)項所記載之寡核苷酸固定在支持體(例如基板)表面而得之本發明之微生物檢測用寡核苷酸陣列或微生物檢測器具，可將食品中之污染菌，特別是麥芽酒精飲料(啤酒)、雜酒(發泡酒)、香甜酒(Liqueur)類、低酒精飲料(例如酒精成分未達1%之麥芽發酵飲料、啤酒風味飲料)中之污染菌加以全面網羅性檢測及/或鑑定。
又，上述寡核苷酸之外，使用將下述(G)項所記載之寡核苷酸固定在上述基板表面之本發明之寡核苷酸陣列或微生物檢測器具，可將食品中之污染菌加以全面網羅性檢測及/或鑑定。
(G)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)或異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)所屬微生物之相對應於ITS區域之鹼基序列中，基於該同種之專一性序列的寡核苷酸，乃含有序列編號7、9、23及24所示鹼基序列之寡核苷酸。
表1－1及表1－2中，顯示序列編號1至64之序列及藉相對應之微生物而命名之寡核苷酸名稱(Oligo Name)。又，本發明中所使用之控制組之寡核苷酸等序列(下文中詳述)示於表1－3中。
又，本發明也提供檢測及/或鑑定被檢測試樣中微生物之方法，該方法之特徵為包括下列步驟：調製被檢測試樣中微生物核酸的核酸調製步驟；以該核酸作為模板調製標識探針的調製探針步驟；使用上述本發明相關之微生物檢測用寡核苷酸陣列或微生物檢測器具，使固定在支持體表面之寡核苷酸與上述標識探針之間進行雜交的雜交步驟；以及檢測雜交訊號的訊號檢測步驟。
本發明之微生物檢測方法所使用之被檢測試樣以食品為佳，其中以麥芽酒精飲料等飲料為最適用。
又，本發明也提供微生物檢測工具組，該工具組代表性上係為了實施本發明有關微生物檢測方法而使用，包括上述本發明之微生物檢測器具。尤以含有雜交步驟、訊號檢測步驟、探針調製步驟、調製核酸步驟中所使用之試劑為理想。
本發明之實施形態更詳細說明如下。又，本發明不侷限於該實施形態範圍。
本發明相關之用以檢測及/或鑑定被檢測試樣中微生物的寡核苷酸陣列或器具中，乃將基於作為對象之微生物所屬之種或屬之專一性鹼基序列的寡核苷酸固定在如基板等支持體表面，藉該寡核苷酸與源自於被檢測試樣之核酸之間的雜交而檢測及/或鑑定被檢測試樣中的微生物。
本發明相關之檢測器具所使用之支持體，只要可使寡核苷酸得以安定固定即可。例如可列舉以聚碳酸酯或塑膠等合成樹脂、玻璃等所構成之基板，但是並非限定於此等範圍。支持體之形態亦無特別限制，例如板狀、膜狀等基板皆可適用。
又，使寡核苷酸結合於支持體之方法，可使用該領域工作者周知之方法(例如可參考日本專利特許公表2003－530861；日本專利特許公表2004－526402等所記載之順序)。在本發明相關之微生物檢測用寡核苷酸陣列或微生物檢測器具中，上述支持體表面具有碳二醯亞胺基或異氰酸基，以藉由該碳二醯亞胺基或異氰酸基與上述寡核苷酸或加成於寡核苷酸末端之連接子之間之反應而形成共價鍵為較佳。
固定於本發明相關之寡核苷酸陣列或微生物檢測器具之支持體表面的寡核苷酸，只要為基於檢測對象之微生物所屬之種或屬之專一性鹼基序列的寡核苷酸即可。藉由該寡核苷酸和源自於被檢測試樣之核酸之間雜交的成立，可檢測出被檢測試樣中所含目的之種或屬所屬之微生物。基於上述檢測對象微生物所屬之種或屬之專一性鹼基序列的寡核苷酸，下文中簡稱為「寡捕獲者(capture oligo)」。
上述專一性鹼基序列，從檢測對象之微生物之基因體(genome)鹼基序列找出屬或種之專一性鹼基序列即可，以從檢測對象微生物之核糖體RNA基因相對應之鹼基序列找出為較佳。其中，已知微生物之18S核糖體RNA基因和25S核糖體RNA基因之間之間隔區域(ITS區域)具有多數之屬或種之專一性鹼基序列，故以從相對應於ITS區域之DNA序列中找出屬或種之專一性鹼基序列為特佳。ITS區域之鹼基序列可從GenBank、EMBL、DDBJ等資料庫等取得。
寡捕獲者可基於上述種或屬之專一性鹼基序列而設計，因此，可為上述種或屬之專一性鹼基序列本身，在其與由檢測對象微生物所調製之核酸專一性雜交能成立之條件下，例如亦可包含數個鹼基之取代、缺失、插入及/或加成等變異。變異位置並無特別限制。
寡捕獲者之長度(鹼基數)雖並無特別限制，但是過短時雜交之檢測困難，太長時會容許非專一性雜交發生。本發明研究者就寡捕獲者之最適長度加以研究，標準長度定為12至24鹼基，其中以13至22鹼基為較佳。唯並非侷限於上述範圍，例如比此範圍較短數個鹼基者(例如8鹼基、9鹼基、10鹼基、11鹼基)，或較長數個鹼基者(例如25鹼基、26鹼基、27鹼基、28鹼基等)亦可。鹼基長度主要取決於序列特性(特定鹼基含有率，相同鹼基重複情形)，結合性良好者於短鏈也可有專一性雜交，本發明研究者亦確認這種情況。
當寡捕獲者具有妨害其與源自於被檢測試樣之核酸之間之雜交的髮夾結構、環結構或其他立體結構時，藉由將構成寡捕獲者之1個或1個以上之核苷酸以肌苷(inosine)或跟任一核苷酸均不配對之核酸所取代，就可解除該立體結構。
寡捕獲者之合成方法並無特別限制，依據周知方法(例如參考Maniatis,T.et al,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)所記載方法等)合成即可。一般而言，可使用市販之DNA合成儀器進行化學合成。
本發明相關之寡核苷酸陣列或微生物檢測器具中，並非僅有基於上述檢測對象微生物所屬之種或屬之專一性鹼基序列的寡核苷酸，除此之外，再以將所謂控制組寡捕獲者(Control．Capture Oligo)固定於支持體表面為較佳。控制組寡捕獲者包括陽性控制組寡捕獲者及陰性控制組寡捕獲者(參照表1－3)。陽性控制組寡捕獲者係用於判斷在下述探針調製步驟中擴增反應是否順利進行、雜交是否順利進行。陰性控制組寡捕獲者係用於確認未產生非專一性雜交，亦即確認未產生偽陽性雜交。此等陽性控制組寡捕獲者及陰性控制組寡捕獲者固定在支持體表面的微生物檢測用陣列或器具亦包括於本發明中。
陽性控制組寡捕獲者只要是基於由檢測對象微生物所調製之探針所含的鹼基序列而設計者即可。又，同時將複數之檢測對象微生物使用同一微生物檢測器具加以檢測時，雖可針對各檢測對象微生物而設計其陽性控制組寡捕獲者，但亦可基於由複數之檢測對象微生物所調製之探針所共通的鹼基序列而設計。在全部檢測對象微生物所調製之探針並無共通鹼基序列時，分成若干群而設計其陽性控制組寡捕獲者即可。或設計引子序列部分為相同而與對象微生物之序列不同的人工序列，亦可將該序列之一部分做為陽性控制組寡捕獲者。以上述人工序列作為模板而調製探針(於本發明說明書中稱呼此等探針為控制組探針)，藉由添加由被檢測試樣所調製之探針，即可查證雜交之專一性。又，上述探針詳述於後。
陰性控制組寡捕獲者，係在陽性控制組寡捕獲者之鹼基序列中，以具有含1鹼基以上且未達該序列所具有鹼基數之20%範圍內之人為之鹼基取代的鹼基序列之方式而設計為佳。進行鹼基取代之鹼基數目係以其與雜交條件之關係而決定，選擇不會使源自於檢測對象微生物之探針產生雜交的鹼基數即可。
檢測對象微生物並無特別限制，從目的之被檢測試樣中適度選擇欲檢測之微生物即可。例如可列舉混入食品中而可能污染該食品之微生物。食品中混入有害微生物在公共衛生上成為極嚴重問題。又，啤酒或發泡酒所代表之麥芽酒精飲料中，混入有害微生物時，會成為濁變或風味劣變等品質劣變之原因，所以極期待開發出迅速且正確檢測及/或鑑定此等有害微生物之方法。
將包含麥芽酒精飲料之食品加以污染的微生物，特別以真菌而言，可列舉為酒香酵母(德克酵母)屬(Brettanomyces(Dekkera))、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、釀造用酵母以外之釀酒酵母屬(Saccharomyces)所屬之微生物。又，以屬於酒香酵母(德克酵母)屬之真菌種而言，可列舉為布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)、異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)。又，就屬於釀造用酵母以外之酵母屬(Saccharomyces)之真菌種而言，可列舉為例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、貝酵母(Saccharomyces bayanus)。
又，污染食品之真菌種除了上述之外，尚可列舉異畢赤酵母(Pichia anomala)、烏孢拉有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)、季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniaspora guilliermondii)、粗壯假絲酵母(Candida valida)、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)。唯檢測對象微生物並非侷限於此等範圍。
用以檢測及/或鑑定上述例舉之微生物的寡捕獲者，例如可列舉為源自於布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)、異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、貝酵母(Saccharomyces bayanus)、異畢赤酵母(Pichia anomala)、烏孢拉有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)、季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniaspora guilliermondii)、粗壯假絲酵母(Candida valida)、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)的寡核苷酸中，基於各微生物種之專一性序列的寡核苷酸。具體而言，可列舉為含有序列編號1至64所示任一鹼基序列的寡核苷酸，唯非侷限於此等範圍。
本發明相關之微生物檢測器具之固定於支持體(例如基板)表面的寡捕獲者，只要是能和由對象微生物所調製之探針成立雜交者，並無特別限制。因此，本發明之寡核苷酸，可僅由序列編號1至64所示之任一鹼基序列所構成，亦可含有序列編號1至64所示之任一鹼基序列以外之序列。含有序列編號1至64所示之任一鹼基序列以外之序列的寡捕獲者，可列舉為對於序列編號1至64所示之各鹼基序列之5’側或3’側或其雙方，具有基於各自之ITS區域之鹼基序列加以延伸而成之鹼基序列的寡核苷酸。本發明中亦包含將此等寡核苷酸固定於支持體表面的微生物檢測器具。
一個支持體上所固定之寡捕獲者至少為一種類以上，並無特別之上限。一般而言，檢測混入試樣中之微生物時，以藉由一個基板就能全面網羅性地檢測出被檢測試樣中可檢測之微生物，就操作之簡便性及檢測之迅速性之觀點而言，較為理想。因此，本發明相關之微生物檢測器具，亦以一個支持體上固定有複數之相對應於目的微生物之種或屬之寡捕獲者而構成的所謂微陣列型之器具為最佳。例如當被檢測試樣為麥芽酒精飲料時，以支持體表面固定有相對應於酒香酵母(德克酵母)屬(Brettanomyces(Dekkera))、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)等所屬之微生物之寡捕獲者為佳。
寡核苷酸於支持體(例如基板)表面之固定方法並無特別限制，可適度選擇周知方法而採用。例如可利用物理性吸附，電結合或分子共價結合等一般性雜交方法中所使用之方法。本發明相關之微生物檢測器具中，使用表面上具有碳二醯亞胺基或異氰酸基之基材(參考美國專利之US 5,908,746，日本專利特開平8－23975號公報)而固定為佳。寡核苷酸可以陣列狀或矩陣狀而點樣(Spot)在支持體上。
點樣寡核苷酸之際，寡核苷酸之點樣量過少時，無法充分確保寡核苷酸和探針之間之反應性而產生判斷上之困難。又，高聚集度之點樣在技術上有其問題，同時成本較高，再者，使用探針之螢光標識或化學顯色等檢測雜交訊號之方法需要更為精密而昂貴之檢測裝置(例如掃描器)。因此，寡核苷酸以直徑10至1,000 μ m之大小固定在基板表面為佳。寡核苷酸於基板上之點樣方法並無特別限制。例如可藉由使用點樣機將寡核苷酸溶液點樣在基板上而實施。據此，寡核苷酸溶液通常以幾乎為圓形狀而點樣。固定寡捕獲者於支持體之方法，尚可參考日本專利特開2002－65274號公報(例如段落[0062]至[0066]之記載)等。
本發明相關之微生物檢測方法係包含調製被檢測試樣中微生物核酸的調製核酸步驟、以該核酸為模板而調製標識探針的調製探針步驟、基於對象微生物所屬之種或屬之專一性序列之寡核苷酸和上述標識探針之間進行雜交的雜交步驟、檢測雜交訊號的訊號檢測步驟，以檢測及/或鑑定被檢測試樣中之微生物為目的之方法。本檢測方法之雜交步驟中，可使用本發明相關之由序列編號1至64之任一核酸序列所構成(或含其而成)之一個以上之寡核苷酸、微生物檢測用寡核苷酸陣列、或微生物檢測器具。藉由使用本發明之寡核苷酸、寡核苷酸陣列或微生物檢測器具，可簡便、迅速且正確而全面網羅性地進行檢測及/或鑑定。又，本檢測方法中之被檢測試樣以食品為佳。就各步驟分別詳細說明如下：
此係調製被檢測試樣中之微生物之核酸的步驟。由被檢測試料中調製核酸之方法，例如可適當選擇周知之核酸之調製方法而使用。例如DNA之調製可依照R－F.Wang所介紹方法而抽取(Molecular and Cellular Probes(2000)14,1－5)。此方法雖屬於標準之調製方法，尚有很多替代方法，可採用任一方法。另外，亦可使用市售之工具組。
此係使用上述調製核酸步驟所得之核酸作為模板而調製標識探針的步驟。該探針例如可藉由如含有寡捕獲者及陽性控制組寡捕獲之核酸擴增而製成，核酸擴增方法之例如可列舉為藉由PCR而擴增DNA之方法、或依據試管中轉錄(in vitro transcription)之方法而擴增RNA之方法等，唯非侷限於此等方法。
例如藉PCR調製標識探針時，PCR所用引子設計為含有互補於寡捕獲者及陽性控制組寡捕獲者之鹼基序列。又，在可雜交之範圍內，探針長度可長於或短於寡捕獲者或陽性控制組寡捕獲者。為獲得標識探針，可預先將PCR所用引子加以標識。另外，藉由標識PCR之基質(去氧核苷三磷酸)亦可得到標識探針。或亦可在PCR結束後標識探針。標識物質並無特別限制，例如可使用螢光物質、半抗原、放射性物質等與一般之雜交作用中所使用之探針為相同之標識物質。具體而言，可列舉螢光素(FITC)、玫瑰紅(Rhodamine)、藻紅素(PE)、德克薩斯紅(Texas Red)、花青苷系螢光色素等螢光物質；生物素(BIOTIN)、地谷新配質(Dig)、二硝苯基(DNP)、螢光素等半抗原等。
雜交步驟係基於對象微生物所屬之種或屬之專一性序列之寡核苷酸(例如由序列編號1至64之任一核酸序列所構成(或含有該核酸序列而成)之一個以上的寡核苷酸)和上述標識探針之間進行雜交的步驟。該雜交步驟可在固定有上述寡核苷酸之膜上而進行。或是可使用本發明相關之微生物檢測用寡核苷酸陣列或微生物檢測器具。藉由使用該微生物檢測用陣列或器具，可簡便、迅速且正確而全面網羅性地進行檢測及/或鑑定。雜交步驟所使用之方法並無特別限制，可適當選擇周知之核酸雜交方法而使用。茲就雜交方法之具體之一例舉示如下：在由標準檸檬酸食鹽水溶液(SSC，即Standard Saline Citrate)等鹽溶液、硫酸十二烷酯鈉(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)等阻斷溶液及用以促進融合反應之添加劑所構成的融合液中，加入標識探針。當探針為雙股鏈時藉加熱等而進行變性。在基板上添加數μ l之標識探針液後，進行數小時之加熱操作(通常為37至50℃)，使固定在基板上之寡核苷酸和標識探針之間形成雜交體。之後，基板上加入5×SSC或3M之氯化四甲基銨並加熱(通常為37至50℃)，從基板上剝離未形成專一性雜交體之標識探針，選擇性地只留存專一性雜交體於基板上。
雜交作用為避免交叉雜交之發生，以在嚴格(stringent)之雜交作用條件下進行為較佳。所謂「嚴格之雜交作用條件」係指該條件下探針經雜交於作為其目標之局部序列，但對於其他序列或可鑑定出差異之其他序列，就實質上不會發生雜交之條件。該嚴格條件取決於序列，並隨環境條件而異。序列愈長、愈高溫下，愈發生專一性雜交。一般而言，嚴格條件在規定的離子強度及pH之下，選擇為比特定序列之熱融解溫度(Tm)約低5℃。Tm係指於規定的離子強度、酸鹼值(pH)及核酸濃度之下，與目標序列互補之探針中之50%以平均狀態雜交於目標序列的溫度。一般而言，由於作為目標之序列會存在過多，所以在Tm下，探針之50%在平衡狀態下為目標所占有。代表性之嚴格條件係於pH7.0至8.3下、鈉或其他鹽之濃度至少在約0.01至1.0M、又溫度在短探針(例如10至50核苷酸)，至少約為30℃的條件。嚴格條件也可藉由添加甲醯胺等不安定化藥劑而達成。
本發明說明書中所謂「專一性雜交」或「可專一性雜交」係意指其序列存在於DNA或RNA之複合體混合物中時，在嚴格條件下對於特定之核苷酸序列或序列群，分子會實質上或僅與其結合、雙股鏈化或雜交。一般而言，已知核酸可藉由提升溫度，或藉由減少含有該核酸之緩衝液之鹽濃度而使其變性。在低嚴格條件(例如低溫度及/或高鹽濃度)下，雜交雙股鏈(例如DNA：DNA、RNA：RNA或RNA：DNA)經緩慢地冷卻再配對之序列即使在並非完全互補時，也可以形成。因此，雜交之專一性在低嚴格條件下會減少。相反地，高嚴格條件下(例如高溫度或低鹽濃度)下，要順利進行雜交必須要求盡量減少錯配(miss match)。
對於本業者而言，應理解雜交條件可依任意的嚴格性程度而獲得之方式加以選擇。例舉之形態之一乃在低嚴格性下，例如以6×SSPE－T於37℃下(0.005% Triton X－100)進行雜交，使雜交確實完成。然後，為去除錯配雜交雙股鏈，在高嚴格性(例如以1×SSPE－T於37℃下)下進行洗淨操作。可在逐漸提高之嚴格性下(例如以0.25×SSPE－T於37℃至50℃下)實施連續洗淨，直至獲得所期待之雜交專一性等級為止。嚴格性可藉由添加甲醯胺等藥劑而提升。雜交專一性可藉由將對於所存在之各種控制組(例如表現等級控制組、標準化控制組、錯配控制組、其他)之雜交作用與對於測試探針之雜交作用加以比較而評估。
有關雜交條件之最適化之各種方法係同業者所周知(例如參考P.Tijssen編，生化學及分子生物學實驗技術，第24卷，藉核酸探針之雜交作用(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology.Vol.24；Hybridization With Nucleic Acid Probes)，1993年，Elsevier公司出刊，N.Y.)。
訊號檢測步驟係判斷上述雜交步驟中雜交有無成立的步驟，一般和上述雜交步驟連續進行。
雜交體(hybfid)檢測步驟中所採用之方法，取決於導入至上述調製探針步驟中所調製成的探針中的標識物質。亦即，檢測雜交體要使用導入至探針中之螢光物質、半抗原等標識物質。因此，適度選擇用以檢測導入至所使用探針中之標識物質的周知方法而進行即可。
例如使用半抗原時，將含有辨識半抗原之蛋白質或結合於該蛋白質之蛋白質與鹼性磷酸酶或辣根過氧化酶等之結合體(酵素接合物)的溶液加至基板上，在室溫下反應數十分鐘。又，在該半抗體和酵素接合物之間進行結合反應之前，將固定有寡核苷酸之區域以外之基板區域，使用酪蛋白等蛋白質完全覆蓋，而可阻止酵素接合物和基板間之非專一性吸附反應。此係將寡核苷酸固定後，藉由添加酪蛋白等蛋白質之溶液於基板上，在室溫放置數十分鐘而可進行。酵素接合物和探針中之半抗原間的結合反應結束後，將未與半抗原結合之酵素接合物，以含有界面活性劑之適當緩衝液洗淨而去除。據此，基板上僅殘存與探針中之半抗原結合的酵素接合物。
雜交體之視覺化(visualization)，只有於僅存在半抗原和酵素接合物結合體時添加能形成不溶性化合物之化合物。該不溶性化合物之生成，可藉酵素反應擴增而成為可視化。以該添加化合物而言，當酵素接合物中之酵素係鹼性磷酸酶時，可使用硝基藍四唑氯(NBT)和5－溴－4－氯－3－吲哚磷酸－對甲苯胺鹽(BCIP)；當酵素為辣根過氧化酶時，可使用3,3’,5,5’－四甲基聯苯胺(TMB)等。
在將寡捕獲者固定之位置，藉由看見雜交體之色素沈澱或螢光顯色等雜交訊號，而進行被檢測試樣中所含微生物種之鑑定。亦即，檢測出雜交訊號時，就表示該訊號所在位置上經點樣之寡核苷酸所相對應之微生物含於被檢測試樣中。又，在陽性控制組寡捕獲者之位置確認到訊號時，可確認本試驗正常發揮其功能，而在陰性控制組寡捕獲者之位置未確認有信號時，可確知雜交在適當條件下進行。
本發明相關之微生物檢測工具組係為了實施上述本發明相關之微生物檢測方法的工具組。因此，只要可實施本發明相關之微生物檢測方法，工具組所包含之構成並無特別限定。
本發明之微生物檢測工具組，其典型者包含由本發明之序列編號1至64之任一核酸序列所構成(或含有該核酸序列而成)的一個以上之寡核苷酸、本發明相關之微生物檢測用寡核苷酸陣列、或微生物檢測器具。藉由包含此等物質之工具組可簡便、迅速且正確而全面網羅性地進行檢測及/或鑑定。又，本微生物檢測工具組中以包含上述雜交步驟及訊號檢測步驟所使用之試劑為較佳。雜交步驟所使用之試劑，例如可列舉標準檸檬酸食鹽水(SSC)等鹽溶液、硫酸十二烷酯鈉(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)等阻斷溶液、用以促進融合反應之添加劑等；而訊號檢測步驟所使用之試劑，例如可列舉能辨識半抗原之蛋白及酵素間的結合體(酵素接合物)或NBT、BCIP、TMB等顯色基質等，唯非侷限於此等範圍，適當選擇適切之試劑以適合目的用途而構成工具組即可。
本發明之微生物檢測工具組以包含上述調製探針步驟所使用之試劑為較佳，再以包含上述調製核酸步驟所使用之試劑為更佳。調製探針步驟所使用之試劑，例如可列舉PCR用緩衝液、耐熱性DNA合成酶、去氧核苷三磷酸混合液等；而調製核酸步驟所使用之試劑，例如可列舉溶菌用緩衝液、DNA回收用管柱、DNA抽取用緩衝液等。唯非侷限於上述範圍，適度選擇適切之試劑以適合目的而構成工具組即可。
藉由使用本發明相關之工具組(例如含有本發明相關之微生物檢測用陣列或器具及各步驟中所使用之試劑)，可在收到被檢測試樣後約6小時之間即可實施被檢測試樣中所含微生物之檢測及/或鑑定。
本發明之寡核苷酸可作為用以檢測及/或鑑定被檢測試樣中之微生物的探針而使用。該對象之微生物包括下列項目所屬之微生物：(1)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)，(2)異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)，(3)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)或貝酵母(Saccharomyces bayanus)。
又，本發明中之檢測對象微生物尚包括下列項目所屬微生物：(4)異畢赤酵母(Pichia anomala)，(5)烏孢拉有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)或季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniaspora guilliermondii)，或(6)粗壯假絲酵母(Candida valida)或膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)。
本發明相關之寡核苷酸、微生物檢測用寡核苷酸陣列、微生物檢測器具、微生物檢測方法以及微生物檢測工具組之用途，祇要是需要判定微生物之用途，並無特別限制，皆可使用。具體而言，例如因微生物之污染而對品質造成重大影響的各種工業製品之製造工程中，在有需要對於從該工業製品或其製造環境所分離之微生物加以迅速且正確地檢測及/或鑑定時為適於使用。
成為判定對象之微生物之來源的上述工業製品，典型者例如可列舉食品、飲料、醫藥品．試劑．醫藥外用品、使用後拋棄性醫療用器具等，唯並無特別限制。本發明在上述例舉之工業製品中以應用於食品為佳。食品中更具體而言，例如可列舉麵包、甜點類(亦包括冷凍甜點等)、家常菜類食品、乳製品、穀類食品、豆腐．油炸豆腐類、麵類、飯盒類、調味料、小麥粉或食用肉類等農產加工品、補助營養用食品(supplement，即增補劑等)、長期保存食品(罐頭、冷凍食品、殺菌袋裝食品等)等，唯並無特別限制。
在本發明中，上述例舉之食品裡，尤其可列舉啤酒、發泡酒、香甜酒類、低酒精飲料(例如酒精含量未達1%之麥芽發酵飲料)、啤酒風味飲料等飲料，唯並無特別限制。
本發明並非侷限於上述各種實施形態，在申請專利範圍內可做各種變更，即使是將不同實施形態所分別揭示之技術方法加以適當組合而成的實施形態亦包括在本發明之技術範圍內。
按照所定方法，使用寡核苷酸合成儀(Perkin－elmer Applied biosystems公司製品)合成寡核苷酸，實施去保護基後予以乾燥。使用10mM Tris－HCl(pH7.5)．1mM EDTA(乙二胺四乙酸)緩衝液溶解該寡核苷酸乾燥物，調製100pmd/μ l之寡核苷酸溶液。本實施例中所使用之全部寡核苷酸皆依據上述方法而合成。所合成之寡核苷酸之鹼基序列以序列編號1至69表示。其中，序列編號1至64為寡捕獲者，序列編號65為陰性控制組寡捕獲者，序列編號66至67為引子，序列編號68為控制組探針，而序列編號69係對於控制組探針之陽性控制組寡捕獲者。寡捕獲者寡核苷酸(capture－oligo－nucleotide)使用上述合成儀在5’－末端結合胺基，引子係於5’－末端結合生物素。
對於10 μ l之5’末端具有胺基之寡核苷酸溶液混合以10 μ l之微點樣溶液(TeleChem International公司製品)，分法於微量滴定盤(Greiner Laboratory公司製品)上。在點樣機之規定位置配置碳二醯亞胺樹脂處理載玻片Carbostation(日清紡績公司製品)，然後啟動點樣機。點樣結束後，以源自於熱水之水蒸汽接觸載玻片數秒鐘，然後照射紫外光600mJ。再度曝露於水蒸汽數秒鐘之後，放置載玻片於加熱板上而去除水分。在室溫下將載玻片浸漬於含有3%牛血清白蛋白(BSA)之100mM Tris－HCl(pH7.5)．100mM NaCl．0.1% Triton X－100中30分鐘，加以阻斷處理。然後，用10mM Tris－CHl(pH7.5)．1mM EDTA緩衝液洗淨。在室溫下乾燥載玻片，然後以乾燥狀態保存於冷暗處待使用。第1圖(A)顯示本實施例中實際使用固定於微生物檢測器具之基板上之寡核苷酸的配置情形。
檢測用之微生物有酒香酵母屬2種、酵母屬4種、假絲酵母屬2種、畢赤酵母屬2種、有孢漢遜酵母屬2種等合計11種類之微生物。所用檢體微生物示於表2。
由在最適合於上述各種微生物之培養條件下所培養之菌液，使用基因體DNA純化套組(Edge Bio Systems公司製品，型錄編號No.#85171)分別調製各微生物之基因組DNA。
以所得各種微生物之DNA作為模板藉由PCR調製探針核酸。PCR反應液之組成為Taq聚合酶：1單位，生物素化引子(序列編號66及67)：各10pmol，反應用緩衝液(10×)：5 μ l，dNTP：各10nmol，模板DNA：100ng，再加入無菌蒸餾水使總量成為50 μ l。使用熱循環機(Thermal cycler)在95℃下保持3分鐘之後，再以95℃：30秒鐘，55℃：15秒鐘，72℃：1分鐘之反應進行30循環，最後在72℃下保持5分鐘而結束反應。
又，設計引子序列部分為相同而異於對象微生物之序列的人工序列，以此做為控制組探針。以此作為模板進行PCR，而調製成生物素化控制組探針。PCR反應液之組成，除了模板DNA改為lng以外，皆如同上述。又，反應溫度及循環數亦同上述。探針不進行精製，直接利用該PCR反應液為探針溶液，使用在下述雜交步驟中。
加入3 μ l之上述探針核酸溶液、生物素化控制組探針溶液1 μ l、與ArrayIt Unihyb雜交溶液(TeleChem Internation公司製品)16 μ l並予混合，然後在100℃下加熱處理1分鐘之後，浸在冰中5分鐘。取得全量之該探針核酸溶液，乘載於固定有寡捕獲者寡核苷酸之基板，其上載以蓋玻片。放入保濕箱中，在設定為37℃之恆溫器中靜置120分鐘。取出基板，迅速於室溫下浸漬於2×SSC溶液(2×SSC：0.033M氯化鈉，0.033M檸檬酸鈉)，去除蓋玻片，浸漬於保溫在37℃之2×SSC中5分鐘。
從2×SSC取出基板，安裝於離心機(Beckman公司製品)以2,000rpm離心1分鐘。繼而用Vectasta Elite ABC套組(Vector公司製品)製作抗生物素蛋白－生物素化過氧化酶複合物，滴加1.4ml在基板上，靜置於室溫下30分鐘。然後，在PBS(10mM磷酸鈉(pH7.5)，0.9%氯化鈉)中洗淨。使用過氧化酶用TMB基質套組(VECTOR公司製品)製作顯色溶液，滴加1.4ml在基板上，靜置於室溫下30分鐘。用蒸餾水洗淨基板而終止顯色反應。
使用EPSON公司製品之掃描機GT－8700F及其透射型設備，將進行雜交之區域以600dpi掃描，用肉眼確認掃描影像有無顯色。第1圖(B)顯示該掃描影像之一例的布魯塞爾德克酵母之掃描影像。又，第1圖(A)顯示寡核苷酸在基板上之配置。
作為檢測對象之11種微生物之結果各自示於表3至13。各表中以「○」表示確認顯色之點樣，「－」示未能確認顯色之點樣。由表3至13可知所有情形下，在控制組探針，可看到其陽性控制組寡捕獲者(序列編號69)有顯色，而陰性控制組寡捕獲者無顯色，確認擴增及雜交步驟皆正常發揮功能。藉此也確認由微生物調製之核酸亦獲得擴增。又，下述結果之說明中，陽性控制組寡捕獲者(序列編號69)之顯色不包括其中。
表3示布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母之結果。布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母僅在16處之布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母檢測用寡捕獲者(序列編號1至14及23、24)確認其顯色(參照第1圖)。同樣地，表4示異(德克酵母)酒香酵母之結果。異(德克酵母)酒香酵母僅在17處之異(德克酵母)酒香酵母檢測用寡捕獲者(序列編號7、9及15至29)確認其顯色。表5示釀酒酵母之結果。釀酒酵母僅在14處之酵母檢測用寡捕獲者(序列編號30至43)確認其顯色。表6示糖化酵母之結果。糖化酵母僅在14處之酵母檢測用寡捕獲者(序列編號30至43)確認其顯色。表7示巴斯德酵母之結果。巴斯德酵母係在14處之酵母檢測用寡捕獲者(序列編號30至43)之至少5處以上確認其顯色。表8示貝酵母之結果。貝酵母在14處之酵母檢測用寡捕獲者(序列編號30至43)之至少5處以上確認其顯色。表9示異畢赤酵母之結果。異畢赤酵母僅在9處之異畢赤酵母檢測用寡捕獲者(序列編號44至52)確認其顯色。表10示烏孢拉有孢漢遜酵母之結果。烏孢拉有孢漢遜酵母僅在4處之烏孢拉有孢漢遜酵母及季也蒙有孢漢遜酵母檢測用寡捕獲者(序列編號53至56)確認其顯色。表11示季也蒙有孢漢遜酵母之結果。季也蒙有孢漢遜酵母僅在4處之烏孢拉有孢漢遜酵母及季也蒙有孢漢遜酵母檢測用寡捕獲者(序列編號53至56)確認其顯色。表12示粗壯假絲酵母之結果。粗壯假絲酵母僅在8處之粗壯假絲酵母及膜醭畢赤酵母檢測用寡捕獲者(序列編號57至64)確認其顯色。表13示膜醭畢赤酵母之結果，膜醭畢赤酵母僅在8處之粗壯假絲酵母及膜醭畢赤酵母檢測用寡捕獲者(序列編號57至64)確認其顯色。
上述結果係表示作為檢測試樣而使用之各微生物中，僅在固定有各微生物專一性之寡捕獲者的點樣確認顯色，而完全不確認非專一性之顯色。因此，確認本實施例中所製成之微生物檢測器具係可將表2所示之微生物依據種專一性加以檢測出的微生物檢測器具。
本發明係提供可將被檢測試樣中混入之微生物以簡便操作，而迅速且正確地判定之微生物檢測器具、微生物檢測方法及微生物檢測工具組。因此，本發明可應用於食品製造業，飲食產業、藥品產業等之衛生管理、工程管理、品質管理等用途。
第1圖表示實施例中所使用本發明相關之微生物檢測器具之基板上所固定之寡核苷酸之配置(A)，以及使用本發明相關之微生物檢測器具而檢測布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)之結果(B)。
<110> 三得利公司 日新坊工業公司 大阪大學
<120> 微生物檢測用之寡核苷酸與其陣列、微生物檢測器具、微生物檢測方法以及微生物檢測工具組
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Claims (19)
- 一種寡核苷酸陣列，其係用以檢測出被檢測試樣中微生物存在的寡核苷酸陣列，其特徵為具備經固定於支持體之下列(A)及(B)之任意組合，該(A)及(B)為：(A)用以檢測出布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)之由序列編號1至6、8及10至14之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的至少一個寡核苷酸，以及(B)用以檢測出異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)之由序列編號15至22及25至29之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的至少一個寡核苷酸。
- 如申請專利範圍第1項之寡核苷酸陣列，其中，上述被檢測試樣係食品。
- 如申請專利範圍第1項之寡核苷酸陣列，係用以檢測出釀酒酵母、糖化酵母、巴斯德酵母或貝酵母之寡核苷酸陣列，其中，尚包括(C)包含有由序列編號30至43之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的至少一個寡核苷酸，且該寡核苷酸經固定於支持體。
- 如申請專利範圍第1項之寡核苷酸陣列，係用以檢測出異畢赤酵母之寡核苷酸陣列，其中，尚包括(D)包含有由序列編號44至52之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的至少一個寡核苷酸，且該寡核苷酸經固定於支持體。
- 如申請專利範圍第1項之寡核苷酸陣列，係用以檢測出烏孢拉有孢漢遜酵母或季也蒙有孢漢遜酵母之寡核苷酸陣列，其中，尚包括(E)包含有由序列編號53至56之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的至少一個寡核苷酸，且該寡核苷酸經固定於支持體。
- 如申請專利範圍第1項之寡核苷酸陣列，係用以檢測出粗壯假絲酵母或膜醭畢赤酵母之寡核苷酸陣列，其中，尚包括(F)包含有由序列編號57至64之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的至少一個寡核苷酸，且該寡核苷酸經固定於支持體。
- 如申請專利範圍第1項之寡核苷酸陣列，係用以檢測出布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母或異(德克酵母)酒香酵母之寡核苷酸陣列，其中，尚包括(G)包含有由序列編號7、9、23及24之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的至少一個寡核苷酸，且該寡核苷酸經固定於支持體。
- 一種微生物檢測器具，係用以檢測及/或鑑定被檢測試樣中之微生物為從下列微生物群(i)至(vii)所成組群中所選擇之一群微生物、或複數群中任一群之微生物的器具，(i)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母所屬之微生物，(ii)異(德克酵母)酒香酵母所屬之微生物，(iii)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、巴斯德酵母 (Saccharomyces pastorianus)或貝酵母(Saccharomyces bayanus)所屬之微生物，(iv)異畢赤酵母(Pichia anomala)所屬之微生物，(v)烏孢拉有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)或季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniaspora guilliermondii)所屬之微生物，(vi)粗壯假絲酵母(Candida valida)或膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)所屬之微生物，以及(vii)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)或異(德克酵母)酒香酵母(Brettanomyces(Dekkera)anomala)所屬微生物，其中，該器具係備有支持體，該支持體係固定有對於所選擇之複數群各自所屬微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交的至少兩個寡核苷酸而成者，且其中，該器具包括包含有由序列編號1至6、8及10至14之核酸序列所成組群中選擇之一個或複數個核酸序列的寡核苷酸、與包含有由序列編號15至22及25至29之核酸序列所成組群中選擇之一個或複數個核酸序列的寡核苷酸。
- 如申請專利範圍第8項之器具，其中，尚包括包含有由序列編號30至43之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的寡核苷酸探針。
- 如申請專利範圍第8項之器具，其中，尚包括包含有由 序列編號44至52之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的寡核苷酸探針。
- 如申請專利範圍第8項之器具，其中，尚包括包含有由序列編號53至56之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的寡核苷酸探針。
- 如申請專利範圍第8項之器具，其中，尚包括包含有由序列編號57至64之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的寡核苷酸探針。
- 如申請專利範圍第8項之器具，其中，尚包括包含有由序列編號7、9、23及24之核酸序列所成組群中選擇之任一核酸序列的寡核苷酸探針。
- 如申請專利範圍第8項之器具，其中，上述支持體表面具有碳二醯亞胺基(carbodimide)或異氰酸基，藉由該碳二醯亞胺基或異氰酸基與上述寡核苷酸探針或附加於寡核苷酸末端之連接子(linker)反應形成共價鍵，而使上述寡核苷酸探針固定於該支持體。
- 一種微生物檢測方法，其係用以進行被檢測試樣中微生物之檢測及/或被檢測試樣中微生物所歸屬之群之鑑定、或被檢測試樣中微生物之檢測及該微生物所歸屬之群之鑑定之方法，其特徵為包括下列步驟：調製被檢測試樣中微生物核酸的核酸調製步驟；以該核酸作為模板而調製標識探針的探針調製步驟；使用申請專利範圍第1項之寡核苷酸陣列、或申請 專利範圍第8項之器具，使固定於支持體表面之寡核苷酸探針和上述標識探針進行雜交的雜交步驟；及自上述雜交檢測雜交訊號的訊號檢測步驟。
- 如申請專利範圍第15項之方法，其中，上述被檢測試樣係食品。
- 一種微生物檢測工具組，其係用以實施申請專利範圍第15項之方法的微生物檢測工具組，包括一種寡核苷酸陣列，其中，該寡核苷酸陣列包括包含有由序列編號1至64之核酸序列所成組群中選擇之核酸序列之寡核苷酸，且該寡核苷酸固定於支持體、或一種器具，係用以檢測、鑑定被檢測試樣中之微生物為從下列微生物群(i)至(vii)所成組群中所選擇之一群微生物、或複數群中任一群之微生物的器具，(i)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母所屬之微生物，(ii)異(德克酵母)酒香酵母所屬之微生物，(iii)釀酒酵母、糖化酵母、巴斯德酵母或貝酵母所屬之微生物，(iv)異畢赤酵母所屬之微生物，(v)烏孢拉有孢漢遜酵母或季也蒙有孢漢遜酵母所屬之微生物，(vi)粗壯假絲酵母或膜醭畢赤酵母所屬之微生物，以及(vii)布魯塞爾(德克酵母)酒香酵母或異(德克酵母)酒香酵母所屬微生物， 其中，該器具係備有支持體，該支持體係固定有對所選擇之一群微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交的至少一個寡核苷酸探針、或對於所選擇之複數群各自所屬微生物之核酸之互補鏈可專一性雜交的至少兩個寡核苷酸探針，且其中，該寡核苷酸探針或探針係包含有由序列編號1至64之核酸序列所成組群中選擇之核酸序列者。
- 如申請專利範圍第17項之工具組，其中，尚包括上述雜交步驟及訊號檢測步驟中所使用之試劑。
- 如申請專利範圍第17項之工具組，其中，尚包括上述探針調製步驟及/或上述核酸調製步驟中所使用之試劑。
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