JP2001066304A - 核酸固定化基板 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡易な装置で作製可能な、核酸を担体上にそ
の長さに関係なく微小な点状に強固に固定化した核酸固
定化基板を提供する。 【解決手段】 基材と基材上に担持されたカルボジイミ
ド基またはイソシアネート基を有する化合物からなる担
体の複数箇所に、同一又は異なる核酸が前記カルボジイ
ミド基またはイソシアネート基を介して点状に、好まし
くは、直径が１０〜３０００μｍである円形状に、固定
された核酸固定化基板。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は核酸固定化基板に関
し、詳しくは、担体上に核酸を微小な点状に強固に固定
化した、ＤＮＡアレー等として有用な核酸固定化基板に
関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、ＤＮＡチップ、ＤＮＡアレー等に
用いられる、担体上に核酸を微小な点状に固定化した核
酸固定化基板を作製するには、次の２つの方法が主に用
いられている。

【０００３】ポリ−Ｌ−リジンをコートした基材を担
体として用いて物理吸着で核酸を固定する方法（WO9535
505（特表平10-503841号））。 基材上でＤＮＡを合成する方法（WO9710365）。

【０００４】しかし、上記の方法については、この方
法で作製された核酸固定化基板を用いてハイブリダイゼ
ーションを行った場合、特に操作過程で基板から核酸が
剥がれ落ち、結果として検出感度が下がったり、得られ
る結果にバラツキを生じ再現性の点で問題がある等の欠
点があった。さらに、の方法における核酸の固定化効
率について言えば、長い核酸は特に問題なく固定化でき
るが、オリゴマーなどの約３００ｍｅｒ以下の短い核酸
になると効率よく固定できないという欠点があった。

【０００５】また、上記の方法については、基材上で
ＤＮＡを合成するために特別な機械と試薬が必要であ
り、誰でも気軽にできるものではなかった。また、合成
できる核酸も２５ｍｅｒ程度までと限られていた。さら
に１０ｍｅｒより長い核酸については合成もそう容易な
ものではなかった。

【０００６】この様に、これまでの方法では、１０ｍｅ
ｒから３００ｍｅｒの核酸を固定化した核酸固定化基板
を作製することが非常に困難であるばかりか、それ以外
の長さの核酸の固定化についても、強固な固定ができな
かったり、簡易な装置での固定ができない等の問題があ
った。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、簡易な装置で作製可能な、核酸
を担体上にその長さに関係なく微小な点状に強固に固定
化した核酸固定化基板を提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、カルボジイミ
ド基を有する化合物が担持された基材からなる担体に核
酸をカルボジイミド基を介して固定化させれば、核酸を
担体上にその長さに関係なく微小な点状に強固に固定化
できること、および、イソシアネート基を有する化合物
が担持された基材からなる担体に核酸をイソシアネート
基を介して固定化させれば、核酸を担体上にその長さに
関係なく微小な点状に強固に固定化できることを見出
し、本発明の完成に至った。すなわち、本発明は以下の
通りである。

【０００９】（１）基材と基材上に担持されたカルボジ
イミド基を有する化合物からなる担体の複数箇所に、同
一又は異なる核酸が前記カルボジイミド基を介して点状
に固定された核酸固定化基板（以下、単に「カルボジイ
ミド担体」ということがある）。

【００１０】（２）前記点がほぼ円形であり直径が１０
〜３０００μｍである（１）の核酸固定化基板。

【００１１】（３）核酸の鎖長が１０〜３００ヌクレオ
チドである（１）の核酸固定化基板。

【００１２】（４）カルボジイミド基を有する化合物が
基材表面に共有結合を介して担持されている（１）の核
酸固定化基板。

【００１３】（５）核酸が固定化された点の数が基板１
ｃｍ²あたり１０〜１００００個である（１）の核酸固
定化基板。

【００１４】（６）基材と基材上に担持されたイソシア
ネート基を有する化合物からなる担体の複数箇所に、同
一又は異なる核酸が前記イソシアネート基を介して点状
に固定された核酸固定化基板（以下、単に「イソシアネ
ート担体」ということがある）。

【００１５】（７）前記点がほぼ円形であり直径が１０
〜３０００μｍである（６）の核酸固定化基板。

【００１６】（８）核酸の鎖長が１０〜３００ヌクレオ
チドである（６）の核酸固定化基板。

【００１７】（９）イソシアネート基を有する化合物が
基材表面に共有結合を介して担持されている（６）の核
酸固定化基板。

【００１８】（１０）核酸が固定化された点の数が基板
１ｃｍ²あたり１０〜１００００個である（６）の核酸
固定化基板。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。

【００２０】＜１＞担体 本発明の核酸固定化基板に用いる担体は、核酸を固定化
するためのものであり、基材と基材上に担持されたカル
ボジイミド基またはイソシアネート基を有する化合物
（以下、それぞれ、単に「カルボジイミド化合物」また
は「イソシアネート化合物」ということがある）からな
るものである。

【００２１】Ａ．カルボジイミド担体 （１）基材 本発明に用いられる基材は、上記担体の支持体としての
役割を果たすものであって、基本的に、溶剤不溶性であ
り、かつ常温もしくはその付近の温度範囲内（０〜１０
０℃）で固体又はゲル状であるものであれば特に制限さ
れない。なお、基材が溶剤不溶性であるとは、基材に後
述の様にしてカルボジイミド化合物が担持され、次いで
担体として核酸が固定化され、その後、例えばＤＮＡチ
ップ等として使用される際の各過程で用いられる水性溶
剤、有機溶剤等の各種溶剤に実質的に不溶性であること
をいう。

【００２２】この様な担体基材の材質として、具体的に
は、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セ
ラミック等が挙げられる。

【００２３】上記プラスチックとして具体的には、ポリ
エチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロ
ピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、
ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化
ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミドおよびア
クリル樹脂等が、無機高分子としては、ガラス、水晶、
カーボン、シリカゲル、およびグラファイト等が、金属
としては、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石
およびパラマグネット等の常温固体金属が、天然高分子
としては、セルロース、セルロース誘導体、キチン、キ
トサン、アルギン酸およびアルギン酸塩等が、セラミッ
クとしては、アパタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ
素、窒化ケイ素および炭化ホウ素等が例示できる。

【００２４】上記基材の形状としては、例えば、フィル
ム、平板、繊維等を挙げることができ、またその大きさ
については、特に制限はない。

【００２５】（２）カルボジイミド基を有する化合物 本発明に用いるカルボジイミド基を有する化合物として
は、例えば、特開昭５１−６１５９９号公報に開示され
ている方法や L. M. Alberino らの方法（J. Appl. Pol
ym. Sci., 21, 190 (1990) あるいは特開平２−２９２
３１６号公報に開示されている方法などによって製造す
ることができるポリカルボジイミドやウレアからの脱
水、チオウレアからの脱硫など一般的に用いられるカル
ボジイミドの製造法で合成されたモノカルボジイミド、
ジカルボジイミド等の低分子量のカルボジイミド等を挙
げることができる。

【００２６】上記ポリカルボジイミドは、具体的には、
有機ポリイソシアネート化合物からイソシアネートのカ
ルボジイミド化を促進する触媒（例えば３−メチル−１
−フェニル−２−ホスホレン−１−オキシド）の存在下
に製造することができるものである。

【００２７】ポリカルボジイミドの製造に用いる上記有
機ポリイソシアネート化合物としては、例えば、４，
４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、ｍ−
テトラメチルキシリレンジイソシアネート、２，４−ト
リレンジイソシアネート、２，６−トリレンジイソシア
ネート、２，４−トリレンジイソシアネートと２，６−
トリレンジイソシアネートの混合物、粗トリレンジイソ
シアネート、粗メチレンジフェニルジイソシアネート、
４，４’，４”−トリフェニルメチレントリイソシアネ
ート、キシレンジイソシアネート、ヘキサメチレン−
１，６−ジイソシアネート、リジンジイソシアネート、
水添メチレンジフェニルジイソシアネート、ｍ−フェニ
ルジイソシアネート、ナフチレン−１，５−ジイソシア
ネート、４，４’−ビフェニレンジイソシアネート、
４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート、３，
３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニルジイソシアネ
ート、３，３’−ジメチルジフェニルメタン−４，４’
−ジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートやこ
れらの任意の混合物を挙げることができる。

【００２８】上記ポリイソシアネート化合物又はそれら
の混合物のイソシアネート基をカルボジイミド化するこ
とによって重縮合が起こる。その際、適当な段階でモノ
イソシアネートの１種または２種以上を適当量加え、カ
ルボジイミド化合物の末端を封止することにより、分子
量（重合度）を調整することができる。また、モノイソ
シアネートは、重縮合反応の初めから適当量加えてもよ
い。このようなモノイソシアネートとしては、フェニル
イソシアネート、（オルト、メタ、パラ）−トリルイソ
シアネート、ジメチルフェニルイソシアネート、ｎ−ブ
チルイソシアネート、シクロヘキシルイソシアネート、
メチルイソシアネート等を例示することができる。重合
度は、ポリイソシアネート化合物等の濃度や反応時間に
よっても調整することができる。

【００２９】また、この他にも末端封止剤としては、−
ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ等の官能
基を末端に有するアルキル基を有する化合物約１モル
と、芳香族ジイソシアネート２モルとの反応によって簡
便に製造できるイソシアネート末端化合物から誘導され
るものでもよい。

【００３０】上記有機イソシアネートのカルボジイミド
化を促進する触媒としては、種々のものを例示すること
ができるが、１−フェニル−２−ホスホレン−１−オキ
シド、３−メチル−１−フェニル−２−ホスホレン−１
−オキシド、１−エチル−２−ホスホレン−１−オキシ
ドやこれらの３−ホスホレン異性体などが収率その他の
面で好適である。

【００３１】上記ポリカルボジイミドの製造は、無溶媒
又は非反応性の有機溶媒中で行うものであり、本発明で
はこれらにより製造したポリカルボジイミドの一種又は
混合物をカルボジイミド化合物の一例として用いること
ができる。なお、これらのポリカルボジイミドは、部分
的に架橋したものであってもよい。

【００３２】他のカルボジイミド化合物、例えば、特開
昭６３−１７２７１８号公報及び特開昭６３−２６４１
２８号公報に記載されるような、分子構造内にポリオキ
シエチレン鎖を付加して成る親水性を付与されたタイプ
のカルボジイミド化合物も本発明に用いることができ
る。また、モノカルボジイミド化合物、ジカルボジイミ
ド化合物等の低分子量のカルボジイミド化合物も本発明
に用いることができるカルボジイミド化合物である。

【００３３】上記カルボジイミド化合物におけるカルボ
ジイミド基の反応性は高く、アルコール、アミン、チオ
ール、フェノール、カルボン酸等の有するほとんどの活
性水素基と反応するものであり、例えば、カルボン酸と
の反応は、下記(I)式のように進行し、アルコールとの
反応は下記(II)式のように進行し、アミノ基との反応は
(III)式のように進行する（Frederick Kurzer, K. Dour
aghi-Zadeh, ChemicalReviews, 67, 117-135, (1967)
および Andrew Williams, Ibrahim T. Ibrahim, Chemic
al Reviews, 81, 599-606, (1981)参照）。

【００３４】

【化１】 R'CO₂H + RN=C=NR → R'C(=O)OC(NHR)=NR ・・・(I) C₂H₅OH + C₆H₅N=C=NC₆H₅ → C₆H₅NHC(=NC₆H₅)OC₂H₅ ・・・(II) RN=C=NR + R'NH₂ → RNHC(=NR')NHR ・・・(III)

【００３５】したがって、本発明に用いる担体は、この
ようなカルボジイミド基の反応性を利用して核酸をカル
ボジイミド化合物を介して強固に固定できるのである。

【００３６】（３）担体 本発明に用いる核酸を固定化するための担体は、上記基
材と、該基材上に担持された、上記カルボジイミド化合
物よりなる。なお、本明細書でいう「担持」とは、担体
に核酸を固定化する際や核酸固定化基板をＤＮＡチップ
等として使用する際等に用いられる水性溶剤、有機溶剤
等の各種溶剤中で、基材からカルボジイミド化合物が実
質的に脱離しないことを意味する。

【００３７】本発明に用いられる担体において、上記カ
ルボジイミド化合物は上記基材上に担持される限り、単
に物理的な接着性を利用して担持されていてもよく、ま
た、化学的に共有結合等を介して担持されていてもよ
い。しかし、本発明に用いられる担体おいて、基材上へ
のカルボジイミド化合物の担持は共有結合を介して行わ
れることが好ましい。

【００３８】また、カルボジイミド化合物は、必要に応
じ、基材上の全面において担持されても、また、その一
部において担持されてもよい。

【００３９】上記カルボジイミド化合物が基材上に物理
的な接着性を利用して担持されている担体を製造する場
合に用いるカルボジイミド化合物としては、上記（２）
で説明したカルボジイミド化合物のうちの高分子化合物
を特に制限なく挙げることができる。また、その分子量
の範囲としては、１０００以上であり、１０００００以
下であることが好ましい。

【００４０】なお、例えば、上記（２）で説明した有機
ポリイソシアネート化合物からイソシアネートのカルボ
ジイミド化を促進する触媒の存在下に製造されたポリカ
ルボジイミドの中には、分子量が１０００に満たないも
のも存在するが、このようなポリカルボジイミドについ
ては、ポリカルボジイミドの両末端に、ウレア結合また
はウレタン結合を介して、ポリアルキレン、ポリオキシ
アルキレン、ポリウレタン、ポリアミドなどを導入し、
分子量を前記範囲に調整すればよい。

【００４１】上記物理的な接着性を利用して担体に担持
されるカルボジイミド高分子化合物は、いずれのタイプ
であっても、その分子中に２以上１００以下のカルボジ
イミド基を有しているものが好ましく、このカルボジイ
ミド高分子化合物においてカルボジイミド基の数が２未
満、すなわち１の場合は核酸を固定する能力に欠け、ま
た逆にカルボジイミド基の数が１０１以上の場合は性能
面では問題はないが、粘度が高すぎたり、溶液とするこ
とができない場合があり、基材上に担持させる際の取り
扱い性が悪化することがある。

【００４２】この様なカルボジイミド高分子化合物は、
上記基材に対して高い接着性を有するものであり、この
接着性を利用して基材に担持されるものである。なお、
前記カルボジイミド高分子化合物が基材上に物理的な接
着性を利用して担持される際の代表的な形態は皮膜であ
る。

【００４３】前記基材上に前記カルボジイミド高分子化
合物を被覆で担持させる方法としては、スプレー、浸
漬、ブラッシング、スタンプ、蒸着、フィルムコーター
を用いたコーティング等の公知の手段を採用することが
できる。

【００４４】次にカルボジイミド化合物を共有結合によ
り担持した担体について説明する。なお、本明細書にお
いて、共有結合を介して基材上、すなわち、基材表面に
担持されたカルボジイミド基を有する化合物という場合
の「カルボジイミド基を有する化合物」は、該化合物と
基材表面間に存在する共有結合部分からは独立した化合
物（実際には「基」であるが便宜上「化合物」の用語を
用いる）として定義されるものである。したがって、本
明細書において、基材上にカルボジイミド基を有する化
合物が共有結合を介して担持されている担体に関して
は、カルボジイミド基を有する化合物とは、基材表面と
の共有結合に関与する官能基を含まない化合物として説
明される。

【００４５】共有結合を介して担持されるカルボジイミ
ド化合物は、上記（２）に説明したいずれのタイプであ
ってもよい。また、上記担体が基材表面に共有結合を介
して有するカルボジイミド化合物は、その分子中に５〜
３０個のカルボジイミド基を有しているものが好まし
く、前記カルボジイミド基の個数はより好ましくは７〜
２０個である。前記カルボジイミド化合物におけるカル
ボジイミド基の数が５個以上、且つ３０個以下である
と、核酸を固定するために良好な能力が得られ、また、
溶液が適度な粘度となり取り扱いの点でも好ましい。

【００４６】上記基材の表面に共有結合を介して上記カ
ルボジイミド基を有する化合物を担持させた担体（以
下、「カルボジイミド化合物共有結合型担体」というこ
ともある）を得るには、例えば、担体とした際に核酸を
固定化するためのカルボジイミド基とそれ以外に基材表
面に共有結合するための官能基を有するカルボジイミド
化合物を、表面に上記カルボジイミド化合物が有する官
能基と共有結合可能な官能基を有する基材の官能基に、
適当な方法によって共有結合させればよい。

【００４７】より具体的には、カルボジイミド化合物共
有結合型担体は、２個以上のカルボジイミド基を有する
または１個以上のカルボジイミド基と１個以上のカルボ
ジイミド基以外の官能基を有する化合物を、表面にカル
ボジイミド基または前記カルボジイミド基以外の官能基
と共有結合可能な官能基を有する基材の官能基に、前記
化合物の有するカルボジイミド基の少なくとも１個を残
して共有結合させることにより得られる。

【００４８】上記カルボジイミド化合物共有結合型担体
を製造する際に用いる、２個以上のカルボジイミド基を
有するまたは１個以上のカルボジイミド基と１個以上の
カルボジイミド基以外の官能基を有する化合物として、
具体的には、上記（２）で挙げたカルボジイミド化合物
のうちの２個以上のカルボジイミド基を有する化合物お
よび１個以上のカルボジイミド基と１個以上のカルボジ
イミド基以外の官能基を有する化合物等が挙げられる。
さらに、上記（２）で挙げたカルボジイミド化合物に、
共有結合に供するための官能基、例えば、水酸基、イミ
ノ基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート基、
イソチオシアネート基等の官能基から選ばれる官能基を
適当な方法により導入した化合物を、上記カルボジイミ
ド化合物共有結合型担体の製造に用いることも可能であ
る。また、上記（２）で挙げたカルボジイミド化合物に
共有結合に供するための官能基としてさらにカルボジイ
ミド基を導入した化合物を、上記担体の製造に用いても
よい。カルボジイミド化合物にこの様な官能基を導入す
る方法については、従来公知の方法をとることができ
る。

【００４９】また、上記カルボジイミド化合物共有結合
型担体を製造する際に用いる、表面にカルボジイミド基
または上記化合物の有するカルボジイミド基以外の官能
基と共有結合可能な官能基を有する基材としては、例え
ば、上記（１）で説明した基材表面に前記共有結合可能
な官能基を導入した基材が挙げられる。導入される官能
基としては、カルボジイミド基と共有結合可能な官能基
または上記化合物が有するカルボジイミド基以外の官能
基と共有結合可能な官能基であれば特に制限されない
が、具体的には、水酸基、イミノ基、アミノ基、カルボ
キシル基、カルボジイミド基等が挙げられる。これら官
能基は、上記カルボジイミド化合物の有する共有結合に
供する官能基に応じて適宜選択され、基材表面に導入さ
れる。

【００５０】また、基材表面にこの様な官能基を導入す
る方法については、基材の材質や導入する官能基によっ
て適当な方法が適宜選択される。さらに、官能基を導入
するのは、基材表面の全体であってもよいし、一部であ
ってもよい。

【００５１】例えば、ガラス基材の表面全体にアミノ基
を導入するには、３−アミノプロピルトリエトキシシラ
ン等のアミノ置換オルガノアルコキシシランを適当な溶
媒に溶解して得られた溶液に７０〜８０℃程度の温度条
件下でガラス基材を概ね２〜３時間浸漬した後、これを
取り出して溶液を水洗しさらに、１００〜１２０℃程度
で約４〜５時間加熱乾燥すればよい。

【００５２】また、ガラス基材にアミノ基以外の官能基
を導入する場合や、基材がガラス以外の材料からなる場
合においても、上記基材の説明で挙げた各種材料表面に
種々の官能基を導入することは、従来より一般に行われ
ていることであり、その方法も公知であるので、この様
な公知の方法を用いて基材表面への官能基の導入を行う
ことができる。

【００５３】さらに、上記（１）で挙げた基材のうちで
もプラスチック基材のなかには、基材表面に既に上記の
ような官能基を有するものもあり、この場合には基材表
面に官能基を導入することなしに、これをそのまま上記
カルボジイミド化合物共有結合型担体の製造に用いるこ
とが可能である。また、この様なプラスチック基材であ
ってもさらに官能基を導入して上記担体の製造に用いる
ことも可能である。

【００５４】本発明に用いるカルボジイミド化合物共有
結合型担体を製造するには、上記の様にして得られる２
個以上のカルボジイミド基を有するまたは１個以上のカ
ルボジイミド基と１個以上のカルボジイミド基以外の官
能基を有する化合物と、表面にカルボジイミド基または
前記カルボジイミド基以外の官能基と共有結合可能な官
能基を有する基材を適当な条件下で反応させ、前記基材
表面の官能基に前記化合物を、前記化合物の有するカル
ボジイミド基の少なくとも１個を残して共有結合させ
る。つまり、前記化合物が１個以上のカルボジイミド基
と１個以上のカルボジイミド基以外の官能基を有する化
合物である場合には、カルボジイミド基以外の官能基が
共有結合に供する様な反応条件で反応を行えばよい。ま
た、官能基としてカルボジイミド基のみを有する化合物
を用いる場合には、カルボジイミド基の全てが共有結合
に供されることのないような条件で反応を行えばよい。

【００５５】このようにして得られる、基材と基材上に
担持されたカルボジイミド化合物からなる、核酸固定化
のための担体は、前記カルボジイミド化合物の有するカ
ルボジイミド基の反応性を利用して、様々な種類や大き
さの核酸を強固に固定することができるものである。

【００５６】Ｂ．イソシアネート担体 （１）基材 本発明の核酸を固定化する担体に用いられる基材は、前
記担体の支持体としての役割を果たすものであって、溶
剤不溶性である。詳細には、本発明に用いる基材は、後
述の様に表面にイソシアネート基が導入され、ついで、
担体として核酸を固定化し、さらに、核酸を固定した状
態で生理化学的な生産、分析等に供されるが、これらの
各過程で用いられる水性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤に
実質的に不溶性である。本発明に用いる基材は、上記の
様に溶剤不溶性であって、基本的には、常温もしくはそ
の付近の温度範囲内（０〜１００℃）で固体又はゲル状
であるものであれば特に制限されない。この様な担体基
材の材質として、具体的には、プラスチック、無機高分
子、金属、天然高分子、セラミック等が挙げられる。

【００５７】プラスチックとして具体的には、ポリエチ
レン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレ
ン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリ
カルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニ
リデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミドおよびアクリ
ル樹脂などが、無機高分子としては、ガラス、水晶、カ
ーボン、シリカゲル、およびグラファイト等が、金属と
しては、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石お
よびパラマグネット等の常温固体金属が、天然高分子と
しては、セルロース、セルロース誘導体、キチン、キト
サン、アルギン酸およびアルギン酸塩等が、セラミック
としては、アパタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ
素、窒化ケイ素および炭化ホウ素等などを例示すること
ができる。

【００５８】上記基材の形状としては、例えば、フィル
ム、平板、粒子、成型品（ビーズ、ストリップ、マルチ
ウェルプレートのウェル、チューブ、メッシュ、連続発
泡フォーム、膜、紙、針、ファイバー、プレート、スラ
イドおよび細胞培養容器）、ラテックスを挙げることが
でき、またその大きさについては、当然であるが特に制
限はない。

【００５９】（２）担体の製造 本発明の核酸を固定化するための担体は、上記溶剤不溶
性の基材の表面にイソシアネート基を有するものであ
る。この様な本発明の担体を得るには、例えば、担体と
した際に核酸を固定化するためのイソシアネート基を上
記基材表面に適当な手段によって直接導入する方法や、
イソシアネート基を有する皮膜性の化合物を被覆等の手
段によって上記基材表面に担持させる方法、イソシアネ
ート基を有する化合物を上記基材表面に共有結合を介し
て担持させる方法等が挙げられる。

【００６０】例えば、上記方法の内でも、イソシアネー
ト基を有する皮膜性の化合物を被覆等によって基材表面
に担持させる方法として、具体的には、イソシアネート
基を有する皮膜性の化合物を必要に応じて適当な溶媒に
溶解し、得られた溶液をスプレー、浸漬、ブラッシン
グ、スタンプ、蒸着、フィルムコーター等の方法によっ
て基材表面の一部または全体に塗布し、さらに必要に応
じて乾燥させることで、被覆を施す等の手段が挙げられ
る。また、この様にして基材表面に被覆が可能なイソシ
アネート基を有する化合物として、具体的には、末端に
イソシアネート基を有するポリカルボジイミド類や、例
えば、イソシアネートプロピルトリエトキシシラン等の
イソシアネート基を有するトリアルコキシシラン等が挙
げられる。

【００６１】また、基材表面に共有結合によりイソシア
ネート基を有する化合物を担持させる方法として、具体
的には、イソシアネート基とそれ以外に基材表面に共有
結合するための官能基を有する化合物を、表面に前記化
合物が有する官能基と共有結合可能な官能基を有する基
材の官能基に、適当な方法によって共有結合させる方法
等が挙げられる。この様にして得られる本発明の、共有
結合によりイソシアネート基を有する化合物が溶剤不溶
性の基材表面に担持されてなる担体は、イソシアネート
基を有する化合物が共有結合を介して強固に基材表面に
担持されているものであり、耐久性等に優れる担体であ
る。

【００６２】さらに、上記共有結合によりイソシアネー
ト基を有する化合物を基材表面に担持させる方法とし
て、より具体的には、以下に説明する製造方法を挙げる
ことができる。

【００６３】この製造方法は、表面にイソシアネート基
を有する溶剤不溶性の基材からなる核酸を固定するため
の担体を製造する方法であって、２個以上のイソシアネ
ート基を有するまたは１個以上のイソシアネート基と１
個以上のイソシアネート基以外の官能基もしくはハロゲ
ン原子を有する化合物（以下、単に「イソシアネート化
合物」ということがある）を、表面にイソシアネート基
と共有結合可能なまたは前記イソシアネート基以外の官
能基もしくはハロゲン原子と共有結合可能な官能基を有
する溶剤不溶性の基材の官能基に、前記化合物の有する
イソシアネート基の少なくとも１個を残して共有結合さ
せる工程を含むことを特徴とするものである。

【００６４】上記の製造方法に用いるイソシアネート化
合物のうち、分子内に２個以上のイソシアネート基を有
する化合物として、具体的には、ヘキサメチレンジイソ
シアネート、トルエンジイソシアネート、テトラメチル
キシレンジイソシアネート、ナフタレンジイソシアネー
ト等が挙げられる。

【００６５】また、分子内に１個以上のイソシアネート
基と１個以上のイソシアネート基以外の官能基あるいは
ハロゲン原子を有する化合物のイソシアネート基以外の
官能基として、具体的には、水酸基、アミノ基、イミノ
基、カルボキシル基等の官能基が挙げられ、この様なイ
ソシアネート化合物として、具体的には、イソシアン酸
クロロメチルエステル、イソシアン酸クロロエチルエス
テル等が挙げられる。

【００６６】上記の製造方法に用いる、表面にイソシア
ネート基と共有結合可能なまたは上記化合物の有するイ
ソシアネート基以外の官能基もしくはハロゲン原子と共
有結合可能な官能基を有する溶剤不溶性の基材として
は、例えば、上記＜１＞Ｂ（１）で説明した基材表面に
前記共有結合可能な官能基を導入した溶剤不溶性の基材
が挙げられる。導入される官能基としては、イソシアネ
ート基と共有結合可能な官能基または上記化合物が有す
るイソシアネート基以外の官能基もしくはハロゲン原子
と共有結合可能な官能基であれば特に制限されないが、
具体的には、水酸基、イミノ基、アミノ基、カルボキシ
ル基等が挙げられる。これら官能基は、上記イソシアネ
ート化合物の有する官能基に応じて適宜選択され、基材
表面に導入される。

【００６７】また、溶剤不溶性基材表面にこの様な官能
基を導入する方法については、基材の材質や導入する官
能基によって適当な方法が適宜選択される。さらに、官
能基を導入するのは、基材表面の全体であってもよい
し、一部であってもよい。

【００６８】例えば、ガラス基材の表面全体にアミノ基
を導入するには、３−アミノプロピルトリエトキシシラ
ン等のアミノ置換オルガノアルコキシシランを適当な溶
媒に溶解して得られた溶液に７０〜８０℃程度の温度条
件下でガラス基材を概ね２〜３時間浸漬した後、これを
取り出して溶液を水洗しさらに、１００〜１２０℃程度
で約４〜５時間加熱乾燥すればよい。

【００６９】また、ガラス基材にアミノ基以外の官能基
を導入する場合や、基材がガラス以外の材料からなる場
合においても、上記基材の説明で挙げた各種材料表面に
種々の官能基を導入することは、従来より一般に行われ
ていることであり、その方法も公知であるので、この様
な公知の方法を用いて基材表面への官能基の導入を行う
ことができる。

【００７０】さらに、上記＜１＞Ｂ（１）で挙げた基材
のうちでもプラスチック基材のなかには、基材表面に既
に上記のような官能基を有するものもあり、この場合に
は基材表面に官能基を導入することなしに、これをその
まま本発明の製造方法に用いることが可能である。ま
た、この様なプラスチック基材であってもさらに官能基
を導入して本発明に用いることも可能である。

【００７１】上記の製造方法においては、上記の様にし
て得られる２個以上のイソシアネート基を有するまたは
１個以上のイソシアネート基と１個以上のイソシアネー
ト基以外の官能基もしくはハロゲン原子を有する化合物
と、表面にイソシアネート基と共有結合可能なまたは前
記イソシアネート基以外の官能基もしくはハロゲン原子
と共有結合可能な官能基を有する溶剤不溶性の基材を適
当な条件下で反応させ、前記基材表面の官能基に前記化
合物を前記化合物の有するイソシアネート基の少なくと
も１個を残して共有結合させる。つまり、前記化合物が
１個以上のイソシアネート基と１個以上のイソシアネー
ト基以外の官能基もしくはハロゲン原子を有する化合物
である場合には、イソシアネート基以外の官能基もしく
はハロゲン原子が共有結合に供する様な反応条件で反応
を行えばよい。また、官能基としてイソシアネート基の
みを有する化合物を用いる場合には、イソシアネート基
の全てが共有結合に供されることのないような条件で反
応を行えばよい。

【００７２】このようにして得られる本発明の表面にイ
ソシアネート基を有する溶剤不溶性の基材からなる核酸
を固定化するための担体は、イソシアネート基の反応性
を利用して、様々な核酸を固定することができるもので
ある。また、イソシアネート基の反応性を示す例として
は、下記（III）に示す水酸基との反応、下記（IV）に
示すアミノ基との反応等が挙げられる。

【００７３】

【化２】

【００７４】＜２＞核酸固定化基板 本発明の核酸固定化基板は、上記基材と基材上に担持さ
れたカルボジイミド化合物またはイソシアネート化合物
からなる担体の複数箇所に、同一又は異なる核酸が前記
カルボジイミド基またはイソシアネート基を介して点状
に固定されたものである。

【００７５】本発明の核酸固定化基板において、担体に
核酸が点状に固定されるとは、担体の大きさに対して、
核酸固定化部位が複数箇所設けられる程度に十分小さい
ことをいう。前記点の形状は、特に制限されず、核酸固
定化基板の使用形態、用途等により適宜選択されうる。

【００７６】本発明の核酸固定化基板の点状の核酸固定
部位について、具体的には、上記点の形状がほぼ円形で
あり、直径が１０〜３０００μｍであるものが挙げられ
る。また、前記点のより好ましいサイズとして、直径５
０〜２０００μｍ程度が挙げられ、さらに好ましいサイ
ズとして、直径１００〜１５００μｍ程度が挙げられ
る。なお、形状がほぼ円形であるとは、その形状が真円
形に限らず楕円形等の円形に近い形状を特に制限なく含
むことをいい、例えば、楕円形においてその直径とは長
径と短径の平均値をいう。

【００７７】前記点のサイズについては、直径が１０μ
ｍ未満では検出が困難となる場合があり、直径が３００
０μｍを越えると単位面積あたりに適度な数の点を確保
することが困難となる場合がある。したがって、検出の
容易性や、所望の数の点を単位面積あたりに設けること
を考慮すれば、点のサイズを上記範囲とすることが好ま
しい。

【００７８】また、本発明の核酸固定化基板における点
状に固定化された核酸固定部位の数については特に制限
されず、核酸固定化基板の使用形態、用途等により適宜
選択されうるが、具体的には、前記核酸固定部位の数が
基板１ｃｍ²あたり１０〜１００００個程度、好ましく
は、５０〜３５０個程度である核酸固定化基板が挙げら
れる。さらに、本発明の核酸固定化基板における点状の
核酸固定部位の配置についても、核酸固定化基板の使用
形態、用途等により適宜選択されうるものである。

【００７９】本発明の核酸固定化基板に固定化される核
酸としては、天然または合成のＤＮＡ（オリゴヌクレオ
チドを含む）もしくはＲＮＡ（オリゴヌクレオチドを含
む）が特に制限なく挙げられる。本発明においては、特
にこれまで固定化が困難であった鎖長が１０〜３００ヌ
クレオチドである核酸についても、固定することが可能
である。また、固定化される核酸は１本鎖であっても、
２本鎖であっても構わない。さらに、本発明において
は、前記核酸として、通常、カルボジイミド基またはイ
ソシアネート基との反応性を有する官能基を有する核酸
が用いられる。上記本発明の核酸固定化基板において点
状に固定化されている核酸は同一であっても異なっても
よく、異なる核酸を用いる場合の各核酸の配置等につい
ては、得られる核酸固定化基板の使用形態、用途等によ
り適宜選択されうる。

【００８０】この様な核酸を上記担体に点状に固定する
には、担体上のカルボジイミド化合物またはイソシアネ
ート化合物が担持された部位に、適当な条件下で、微量
の核酸を所望の大きさの点状に供給することで、カルボ
ジイミド化合物またはイソシアネート化合物と核酸を接
触させ両者を反応させれば良い。担体に担持されたカル
ボジイミド化合物のカルボジイミド基またはイソシアネ
ート化合物のイソシアネート基と、核酸が有する水酸
基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基等との反応
により、核酸はカルボジイミド化合物またはイソシアネ
ート化合物と共有結合する。その結果、核酸は担体に固
定化される。

【００８１】具体的には、両者の接触反応において固定
される核酸の活性が維持されるように、通常、核酸は水
またはバッファー中に含まれるかたちで供給される。ま
た、接触の際の温度としてはやはり固定される核酸の活
性が損なわれないように、概ね０〜１００℃とすること
が好ましい。

【００８２】本発明において微量の核酸を、通常は、核
酸を含有する水またはバッファーを、担体に点状に供給
する手段として、ディスペンサーを用いる方法、ピンを
用いる方法、バブルジェット（登録商標）を用いる方法
等があるが、本発明がこれらに限定されるものではな
い。また、この様に溶液を微量に供給する装置は、一般
に市販されており、本発明においてもこれらを用いるこ
とが可能である。

【００８３】本発明の核酸固定化基板は、これを用いて
分析等を行う際に、上記固定化核酸以外の核酸等を接触
させる機会が多いが、担体に担持されたカルボジイミド
化合物の有する未反応カルボジイミド基またはイソシア
ネート化合物の有する未反応イソシアネート基に上記固
定化核酸以外の核酸等が非特異的に結合することを防ぐ
ために、上記の様にして点状に核酸を担体に固定化した
後に、過剰量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイ
ン、サケ精子ＤＮＡのようなブロッキング用途のハイブ
リダイゼーション反応で一般的に用いられる核酸等を担
体に接触させ、フリーのカルボジイミド基またはイソシ
アネート基をブロックしておくことが好ましい。

【００８４】この様にして得られる本発明の核酸固定化
基板は、前記核酸が担体に非常に強固に担持されたもの
であり、ハイブリダイゼーション等で広く使用されてい
る洗浄法（界面活性剤を用いた洗浄法）によっても脱離
することがなく、これを用いて分析等を行った場合、再
現性、定量性に優れた分析が可能となる。また、本発明
の核酸固定化基板には、核酸が、鎖の数や長さに制限さ
れずに固定され得るので、同一基材上で種々の核酸を同
時に扱うことができる。これらのことから、本発明の核
酸固定化基板は、多数の核酸を用いてハイブリダイゼー
ション法により塩基配列を決定する技術、ＳＢＨ（sequ
encing by hybridization）法、ＳＨＯＭ（sequencing
by hybridization with oligonucleotide matrix）法等
に用いられるＤＮＡアレー等に優れた性能をもって適用
可能であるといえる。

【００８５】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。％は特記しない限り質量％である。

【００８６】

【製造例１】カルボジイミド化スライドガラスの調製 （１）カルボジイミド化合物溶液の製造 ４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート１
１７．９ｇとシクロヘキシルイソシアネート１２．５ｇ
をカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニル−
２−ホスホレン−１−オキシド）１．３ｇと共に窒素雰
囲気下、１８０℃で４日間反応させ、室温で粉末状のカ
ルボジイミド化合物（重合度１０、数平均分子量２４０
０）を得た。これを１０ｇ取り、ジクロロメタン２００
ｍｌに溶解させ、カルボジイミド化合物溶液を得た。

【００８７】（２）アミノ化スライドガラスの作製 蒸留水１８０ｍｌに１０％（ｖ／ｖ）３−アミノプロピ
ルトリエトキシシラン／エタノール溶液２０ｍｌを加え
よく撹拌した。そこに６ＮのＨＣｌを加え、ｐＨ３〜４
に調整した後、スライドガラス１５枚を浸漬し、７５℃
で２時間加熱処理した。加熱処理終了後、スライドガラ
スを溶液から引き上げ、蒸留水でよく洗い流した後、１
１５℃で４時間加熱乾燥して、アミノ化スライドガラス
を得た。

【００８８】（３）カルボジイミド化スライドガラスの
作製 上記（１）で得られたカルボジイミド化合物溶液２００
ｍｌに、上記（２）で得られたアミノ化スライドガラス
１５枚を浸漬し、すぐに引き上げて、６０℃で１時間加
熱乾燥した。次に、これらのスライドガラスをジクロロ
メタン２００ｍｌを用いて１０分間づつ２回洗浄した
後、４０℃で２時間乾燥してカルボジイミド化スライド
ガラスを得た。

【００８９】

【製造例２】イソシアネート化スライドガラスの調製 （１）アミノ化スライドガラスの作製 蒸留水１８０ｍｌに１０％（ｖ／ｖ）３−アミノプロピ
ルトリエトキシシラン／エタノール溶液２０ｍｌを加え
よく撹拌した。そこに６ＮのＨＣｌを加えｐＨ３〜４に
調整した後、スライドガラス１５枚を浸漬し、７５℃で
２時間加熱処理した。加熱処理終了後、スライドガラス
を溶液から引き上げ、蒸留水でよく洗い流した後、１１
５℃で４時間加熱乾燥しアミノ化スライドガラスを得
た。

【００９０】（２）イソシアネート化スライドガラスの
作製 ヘキサメチレンジイソシアネートの２．５％クロロホル
ム溶液に上記で得られたアミノ化スライドガラス１５枚
を浸漬し、すぐに引き上げた。次いで、クロロホルム２
００ｍｌによる１０分間の洗浄を２回行った後、４０℃
で２時間乾燥してイソシアネート化スライドガラスを得
た。

【００９１】

【実施例１】（１）カルボジイミド化スライドガラス上
への核酸の固定 大腸菌Ｏ−１５７の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番
号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
をプライマーとするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・
リアクション）によって、配列番号３に示す塩基配列を
有するＶＴ２遺伝子（ベロ毒素遺伝子）断片を増幅し
た。

【００９２】上記増幅産物を０．１ｐｍｏｌ／μｌにな
るように２Ｍ ＮａＣｌに溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
ＳＰＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製、
ａｒｒａｙｅｒ）を用い、上記製造例１で得られたカル
ボジイミド化スライドガラスの所定の位置に、前記ＤＮ
Ａ溶液を直径２００μｍで５００箇所にスポットした。
ＤＮＡをスポットしたカルボジイミド化スライドガラス
を乾燥機に入れ、３７℃で１５分間乾燥した。次いで、
３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む緩衝液Ａ
（０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ
７．５）、０．０５％トライトンＸ−１００）に浸し、
３７℃で１５分間乾燥した。次にスライドガラスをＴＥ
緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．２／１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）で洗浄した後、３７℃で１５分間乾燥し、核酸
（二本鎖ＤＮＡ）を固定化したカルボジイミド化スライ
ドガラスを得た。

【００９３】（２）ハイブリダイゼーション ＤＮＡを固定化したカルボジイミド化スライドガラスを
１００℃熱水中に１０分間浸漬し、氷冷水中に５分間浸
漬し、二本鎖ＤＮＡを変性させた。このスライドガラス
のＤＮＡを固定化した部分に、ハイブリダイゼーション
溶液３０μｌを載せ、スライドガラスをパラフィルムで
覆って、４２℃のウォーターバスで一晩加熱した。ハイ
ブリダイゼーション溶液の組成は以下の通りである。
尚、ビオチン化プローブは、前記オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて、ＶＴ２遺伝子を増幅することによっ
て作製した。これを熱変性させてプローブとした。

【００９４】〔ハイブリダイゼーション溶液の組成〕 5× SSC（SSC：1.5M NaCl、0.15Mクエン酸ナトリウム） 1× デンハーツ溶液（Denhardt's solution） 25mM リン酸ナトリウムバッファー（Na₂HPO₄、NaH₂PO₄含
有） ｐＨ６．５ 45% ホルムアミド 10ng/ml サケ（Ｓａｌｍｏｎ）精子ＤＮＡ 2pmol ビオチン化プローブ

【００９５】（３）ポストハイブリダイゼーション洗浄 ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスからパラ
フィルムを取り除き、ハイブリダイゼーション溶液を軽
く吸い取った後、以下の条件でポストハイブリダイゼー
ション洗浄を行い、非特異的に吸着したプローブを除去
した。

【００９６】〔ポストハイブリダイゼーション洗浄液及
び条件〕 第１段階：2× SSC、1% SDS； 室温、５分間、２回 第２段階：0.2× SSC、1% SDS； ４０℃、５分間、２
回 第３段階：2× SSC； 室温、５分間、１回

【００９７】（４）ハイブリダイゼーションの検出 ３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａ５０ｍｌに、上記ポストハイ
ブリダイゼーション洗浄後のスライドガラスを浸漬し、
室温で３０分間ブロッキングを行なった。次に、これら
をストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ・コ
ンジュゲート溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、３％ＢＳ
Ａを含む緩衝液Ａで原液を１０００倍希釈したもの）２
０ｍｌに浸漬し、室温で３０分間反応させた。次いで、
スライドガラスを緩衝液Ａ５０ｍｌに浸漬し、室温で５
分間放置した。これを２回繰り返し、ビオチンと結合し
なかったコンジュゲートを除去した。

【００９８】次に、スライドガラスを緩衝液Ｂ（０．１
Ｍ塩化ナトリウム／０．１Ｍトリス塩酸、ｐＨ９．５／
５０ｍＭ 塩化マグネシウム）３０ｍｌで１回洗浄し
た。最後に、スライドガラスを基質溶液（緩衝液Ｂの３
０ｍｌ＋ＢＣＩＰ溶液（５０ｍｇ ５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルホスフェート／９００ｍｌジメチ
ルホルムアミド）２５μｌ＋ＮＢＴ液（５０ｍｇ ニト
ロブルーテトラゾリウム／１．８ｍｌ ７０％エタノー
ル）５０μｌ）に浸漬し、室温で３時間放置し、発色反
応を行った結果、スライドグラス上のＤＮＡを固定した
位置に色素沈着（ハイブリダイゼーションシグナル）が
得られた。

【００９９】

【実施例２】（１）カルボジイミド化スライドガラス上
への核酸の固定 λＤＮＡ（約４８ｋｂ）を１００ｎｇ／μｌになるよう
に０．１Ｍ ＭｇＣｌ ₂に溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
ＳＰＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製、
ａｒｒａｙｅｒ）を用い、上記製造例１で得られたカル
ボジイミド化スライドガラスの所定の位置に、前記ＤＮ
Ａ溶液を直径２００μｍで５００箇所にスポットした。
ＤＮＡをスポットしたカルボジイミド化スライドガラス
を乾燥機に入れ、３７℃で１５分間乾燥した。次いで、
３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａに浸漬し、３７℃で１５分間
乾燥した。次にスライドガラスをＴＥ緩衝液で洗浄した
後、３７℃で１５分間乾燥し、核酸（ＤＮＡ）を固定化
したカルボジイミド化スライドガラスを得た。

【０１００】（２）ハイブリダイゼーション ＤＮＡを固定化したカルボジイミド化スライドガラスを
１００℃の熱水中に１０分間浸漬し、氷冷水中に５分間
浸漬し、二本鎖ＤＮＡを変性させた。このスライドガラ
スのＤＮＡを固定化した部分に、ハイブリダイゼーショ
ン溶液５０μｌを載せ、スライドガラスをパラフィルム
で覆って、４２℃のウォーターバスで一晩加熱した。ハ
イブリダイゼーション溶液の組成は以下の通りである。
尚、ビオチン化プローブは、ＥｃｏＲＩで消化したλＤ
ＮＡを、カルボビオチン（日清紡績（株）製）を用いて
ビオチン化することによって作製した。

【０１０１】〔ハイブリダイゼーション溶液の組成〕 5× SSC（SSC：1.5M NaCl、0.15Mクエン酸ナトリウム） 1× デンハーツ溶液（Denhardt's solution） 10% デキストラン 45% ホルムアミド 10ng/ml サケ精子ＤＮＡ 1pmol ビオチン化プローブ

【０１０２】（３）ポストハイブリダイゼーション洗浄 ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスからパラ
フィルムを取り除き、ハイブリダイゼーション溶液を軽
く吸い取った後、以下の条件でポストハイブリダイゼー
ション洗浄を行い、非特異的に吸着したプローブを除去
した。

【０１０３】〔ポストハイブリダイゼーション洗浄条
件〕 第１段階：2× SSC、1% SDS；室温、５分間、２回 第２段階：0.2× SSC、1% SDS；４８℃、５分間、２回 第３段階：2× SSC；室温、５分間、１回

【０１０４】（４）ハイブリダイゼーションの検出 ３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａ５０ｍｌに、上記ポストハイ
ブリダイゼーション洗浄後のスライドガラスを浸漬し、
室温で３０分間ブロッキングを行なった。次に、これら
をストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジ
ュゲート溶液（３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａで原液を２０
００倍希釈したもの）４５ｍｌに浸漬し、室温で３０分
間反応させた。次いで、スライドガラスを緩衝液Ａ５０
ｍｌに浸漬し、室温で５分間放置した。これを２回繰り
返し、ビオチンと結合しなかったコンジュゲートを除去
した。

【０１０５】次に、スライドガラスを緩衝液Ｂ３０ｍｌ
で１回洗浄した。最後に、基質溶液（緩衝液Ｂ２０ｍｌ
＋ＢＣＩＰ溶液１８μｌ＋ＮＢＴ液５０μｌ）に浸漬
し、室温で３時間放置し、発色反応を行った結果、スラ
イドグラス上のＤＮＡを固定した位置に色素沈着が得ら
れた。

【０１０６】

【実施例３】（１）カルボジイミド化スライドガラス上
への核酸固定 配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
（２１ｍｅｒ）を、１００ｎｇ／μｌになるように２Ｍ
ＮａＣｌに溶解し、ＤＮＡ溶液とした。ＳＰＢＩＯ
（日立ソフトウェアエンジニアリング社製、ａｒｒａｙ
ｅｒ）を用い、上記製造例１で得られたカルボジイミド
化スライドガラスの所定の位置に、前記ＤＮＡ溶液を直
径２００μｍで５００箇所にスポットした。対照とし
て、プローブに対して相補性を有しないＤＮＡ（ｔｅ
ｔ）の溶液（１００ｎｇ／μｌ）を、カルボジイミド化
スライドガラスの所定の位置に１００箇所スポットし
た。ＤＮＡをスポットしたカルボジイミド化スライドガ
ラスを乾燥機に入れ、３７℃で１５分間乾燥した。次い
で、３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａに浸し、３７℃で１５分
間乾燥した。次に、スライドガラスをＴＥ緩衝液で洗浄
した後、３７℃で１５分間乾燥し、核酸（一本鎖ＤＮ
Ａ）を固定化したカルボジイミド化スライドガラスを得
た。

【０１０７】（２）ハイブリダイゼーション ＤＮＡを固定化したカルボジイミド化スライドガラスの
ＤＮＡを固定化した部分に、ハイブリダイゼーション溶
液５０μｌを載せ、スライドガラスをパラフィルムで覆
って、４２℃のウォーターバスで一晩加熱した。ハイブ
リダイゼーション溶液の組成は以下の通りである。尚、
ビオチン化プローブは、実施例１で用いたビオチン化プ
ローブと同じものを使用した。

【０１０８】〔ハイブリダイゼーション溶液の組成〕 3× SSC 10% デキストラン 1pmol ビオチン化プローブ

【０１０９】（３）ポストハイブリダイゼーション洗浄 ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスからパラ
フィルムを取り除き、ハイブリダイゼーション溶液を軽
く吸い取った後、以下の条件でポストハイブリダイゼー
ション洗浄を行ない、非特異的に吸着したプローブを除
去した。

【０１１０】〔ポストハイブリダイゼーション洗浄条
件〕 第１段階：2× SSC、0.1% SDS；室温、５分間、２回 第２段階：0.2× SSC、0.1%SDS；４０℃、５分間、２回 第３段階：2× SSC；室温、５分間、１回

【０１１１】（４）ハイブリダイゼーションの検出 ３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａ５０ｍｌに浸し、室温で３０
分間ブロッキングを行った。次に、ストレプトアビジン
アルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液（３％Ｂ
ＳＡを含む緩衝液Ａで原液を２０００倍希釈したもの）
４５ｍｌに浸し、室温で３０分間反応させた。次に、ス
ライドガラスを緩衝液Ａ５０ｍｌに浸し、室温で５分間
放置した。これを２回繰り返し、ビオチンと結合しなか
ったコンジュゲートを除去した。次にスライドガラスを
緩衝液Ｂ３０ｍｌで１回洗浄した。最後に基質溶液（緩
衝液Ｂ２０ｍｌ＋ＢＣＩＰ溶液１８μｌ＋ＮＢＴ液３６
μｌに浸し、室温で３時間放置し、発色反応を行った結
果、スライドグラス上の配列番号２に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドを固定化した位置にのみ色素沈
着が得られ、ｔｅｔを固定化した位置には色素沈着は検
出されなかった。

【０１１２】

【実施例４】（１）カルボジイミド化スライドガラス上
への核酸固定 配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
（２１ｍｅｒ）を、１００ｎｇ／μｌになるように２Ｍ
ＮａＣｌに溶解し、ＤＮＡ溶液とした。ＳＰＢＩＯ
（日立ソフトウェアエンジニアリング社製、ａｒｒａｙ
ｅｒ）を用い、上記製造例１で得られたカルボジイミド
化スライドガラスの所定の位置に、前記ＤＮＡ溶液を直
径２００μｍで５００箇所スポットした。対照として、
プローブに対して相補性を有しないＤＮＡ（ｔｅｔ）を
１００箇所スポットした。ＤＮＡをスポットしたカルボ
ジイミド化スライドガラスを乾燥機に入れ、３７℃で１
５分間乾燥した。次いで、３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａに
浸し、３７℃で１５分間乾燥した。ＴＥ緩衝液で洗浄し
た後、３７℃で１５分間乾燥し、核酸（一本鎖ＤＮＡ）
を固定化したカルボジイミド化スライドガラスを得た。

【０１１３】（２）ハイブリダイゼーション ＤＮＡを固定化したカルボジイミド化スライドガラスの
ＤＮＡを固定化した部分に、ハイブリダイゼーション溶
液５０μｌを載せ、スライドガラスをパラフィルムで覆
って、４２℃のウォーターバスで一晩加熱した。ハイブ
リダイゼーション溶液の組成は以下の通りである。尚、
ビオチン化プローブは、実施例１で用いたビオチン化プ
ローブと同じものを使用した。

【０１１４】〔ハイブリダイゼーション溶液の組成〕 3× SSC 10% デキストラン 1pmol ビオチン化プローブ

【０１１５】（３）ポストハイブリダイゼーション洗浄 ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスからパラ
フィルムを取り除き、ハイブリダイゼーション溶液を軽
く吸い取った後、以下の条件でポストハイブリダイゼー
ション洗浄を行ない、非特異的に吸着したプローブを除
去した。

【０１１６】〔ポストハイブリダイゼーション洗浄条
件〕 第１段階：2×SSC、0.1% SDS；室温、５分間、２回 第２段階：0.2× SSC、0.1% SDS；４０℃、５分間、２
回 第３段階：2× SSC；室温、５分間、１回

【０１１７】（４）ハイブリダイゼーションの検出 ３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａ５０ｍｌに浸し、室温で３０
分間ブロッキングを行った。次に、ストレプトアビジン
アルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液（３％Ｂ
ＳＡを含む緩衝液Ａで原液を２０００倍希釈したもの）
４５ｍｌに浸し、室温で３０分間反応させた。次に、ス
ライドガラスを緩衝液Ａ５０ｍｌに浸し、室温で５分間
放置した。これを２回繰り返し、ビオチンと結合しなか
ったコンジュゲートを除去した。次に、スライドガラス
を緩衝液Ｂ３０ｍｌで１回洗浄した。最後に基質溶液
（緩衝液Ｂ２０ｍｌ＋ＢＣＩＰ溶液１８μｌ＋ＮＢＴ液
３６μｌに浸し、室温で３時間放置し、発色反応を行っ
た結果、スライドグラス上の配列番号２に示す塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを固定化した位置にのみ色
素沈着が得られ、ｔｅｔを固定化した位置には色素沈着
は検出されなかった。

【０１１８】

【実施例５】（１）カルボジイミド化スライドガラス上
への核酸の固定 大腸菌Ｏ−１５７の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番
号１及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
をプライマーとするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・
リアクション）によって、配列番号５に示す塩基配列を
有するＶＴ２遺伝子（ベロ毒素遺伝子）断片を増幅し
た。

【０１１９】上記増幅産物を０．１ｐｍｏｌ／μｌにな
るように２Ｍ ＮａＣｌに溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
ＳＰＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製、
ａｒｒａｙｅｒ）を用い、上記製造例１で得られたカル
ボジイミド化スライドガラスの所定の位置に、前記ＤＮ
Ａ溶液を直径２００μｍで１０００箇所にスポットし
た。ＤＮＡをスポットしたカルボジイミド化スライドガ
ラスを乾燥機に入れ、３７℃で１５分間乾燥した。次い
で、３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａに浸し、３７℃で１５分
間乾燥した。次にスライドガラスをＴＥ緩衝液で洗浄し
た後、３７℃で１５分間乾燥し、核酸（二本鎖ＤＮＡ）
を固定化したカルボジイミド化スライドガラスを得た。

【０１２０】（２）ハイブリダイゼーション ＤＮＡを固定化したカルボジイミド化スライドガラスを
１００℃熱水中に１０分間浸漬し、氷冷水中に５分間浸
漬し、二本鎖ＤＮＡを変性させた。このスライドガラス
のＤＮＡを固定化した部分に、ハイブリダイゼーション
溶液３０μｌを載せ、スライドガラスをパラフィルムで
覆って、４２℃のウォーターバスで一晩加熱した。ハイ
ブリダイゼーション溶液の組成は以下の通りである。
尚、ビオチン化プローブは、前記オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて、ＶＴ２遺伝子を増幅することによっ
て作製した。これを熱変性させてプローブとした。

【０１２１】〔ハイブリダイゼーション溶液の組成〕 5× SSC（SSC：1.5M NaCl、0.15Mクエン酸ナトリウム） 1× デンハーツ溶液（Denhardt's solution） 25mM リン酸ナトリウムバッファー（Na₂HPO₄、NaH₂PO₄含
有） ｐＨ６．５ 45% ホルムアミド 10ng/ml サケ精子ＤＮＡ 2pmol ビオチン化プローブ

【０１２２】（３）ポストハイブリダイゼーション洗浄 ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスからパラ
フィルムを取り除き、ハイブリダイゼーション溶液を軽
く吸い取った後、以下の条件でポストハイブリダイゼー
ション洗浄を行い、非特異的に吸着したプローブを除去
した。

【０１２３】〔ポストハイブリダイゼーション洗浄液及
び条件〕 第１段階：2× SSC、1% SDS； 室温、５分間、２回 第２段階：0.2× SSC、1% SDS； ４０℃、５分間、２
回 第３段階：2× SSC； 室温、５分間、１回

【０１２４】（４）ハイブリダイゼーションの検出 ３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａ５０ｍｌに、上記ポストハイ
ブリダイゼーション洗浄後のスライドガラスを浸漬し、
室温で３０分間ブロッキングを行なった。次に、これら
をストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ・コ
ンジュゲート溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、３％ＢＳ
Ａを含む緩衝液Ａで原液を１０００倍希釈したもの）２
０ｍｌに浸漬し、室温で３０分間反応させた。次いで、
スライドガラスを緩衝液Ａ５０ｍｌに浸漬し、室温で５
分間放置した。これを２回繰り返し、ビオチンと結合し
なかったコンジュゲートを除去した。

【０１２５】次に、スライドガラスを緩衝液Ｂ３０ｍｌ
で１回洗浄した。最後に、スライドガラスを基質溶液
（緩衝液Ｂの３０ｍｌ＋ＢＣＩＰ溶液２５μｌ＋ＮＢＴ
液５０μｌ）に浸漬し、室温で３時間放置し、発色反応
を行った結果、スライドグラス上のＤＮＡを固定した位
置に色素沈着が得られた。

【０１２６】

【実施例６】実施例１の（１）において、カルボジイミ
ド化スライドガラスの代わりに、製造例２で得られたイ
ソシアネート化スライドガラスを用いた以外は、実施例
１の（１）と同様にして、核酸を固定化したイソシアネ
ート化スライドガラスを得た。

【０１２７】

【実施例７】実施例２の（１）において、カルボジイミ
ド化スライドガラスの代わりに、製造例２で得られたイ
ソシアネート化スライドガラスを用いた以外は、実施例
２の（１）と同様にして、核酸を固定化したイソシアネ
ート化スライドガラスを得た。

【０１２８】

【実施例８】実施例３の（１）において、カルボジイミ
ド化スライドガラスの代わりに、製造例２で得られたイ
ソシアネート化スライドガラスを用いた以外は、実施例
３の（１）と同様にして、核酸を固定化したイソシアネ
ート化スライドガラスを得た。

【０１２９】

【実施例９】実施例１の（１）において、ＤＮＡをスポ
ットしたカルボジイミド化スライドガラスを乾燥機に入
れ、３７℃で１５分間乾燥する工程の代わりに、カルボ
ジイミド化スライドガラスに紫外線（２５４ｎｍ）を１
２０ｍＪ／ｃｍ²照射した以外は、実施例１の（１）と
同様にして、核酸を固定化したカルボジイミド化スライ
ドガラスを得た。

【０１３０】

【実施例１０】実施例６において、ＤＮＡをスポットし
たイソシアネート化スライドガラスを乾燥機に入れ、３
７℃で１５分間乾燥する工程の代わりに、イソシアネー
ト化スライドガラスに紫外線（２５４ｎｍ）を１２０ｍ
Ｊ／ｃｍ²照射した以外は、実施例６と同様にして、核
酸を固定化したイソシアネート化スライドガラスを得
た。

【０１３１】

【比較例１】（１）ポリ−Ｌ−リジンコートスライドガ
ラス上への核酸固定 配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
（２１ｍｅｒ）を、１００ｎｇ／μｌになるように０．
２×ＳＳＣに溶解し、ＤＮＡ溶液とした。ＳＰＢＩＯ
（日立ソフトウェアエンジニアリング社製、ａｒｒａｙ
ｅｒ）を用い、ポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス
（シグマ社製）の所定の位置に、前記ＤＮＡ溶液を直径
２００μｍで５００箇所スポットした。対照として、プ
ローブに対して相補性を有しないＤＮＡ（ｔｅｔ）を１
００箇所スポットした。ＤＮＡをスポットしたポリ−Ｌ
−リジンコートスライドガラスをチャンバーに入れ、室
温で２時間反応した。次いで、減圧乾燥機で８０℃、２
時間乾燥させた。スライドガラスを０．１％ＳＤＳで洗
浄した後、ブロッキング溶液（無水コハク酸；１ｇ、Ｎ
−メチル−ピロリドン；１００ｍｌ、０．２Ｍホウ酸ナ
トリウム、ｐＨ８．０；１００ｍｌ）に室温で１０分間
浸した後、蒸留水で４回洗浄し、核酸を固定化したポリ
−Ｌ−リジンコートスライドガラスを得た。

【０１３２】（２）ハイブリダイゼーション ＤＮＡを固定化したポリ−Ｌ−リジンコートスライドガ
ラスのＤＮＡを固定化した部分に、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液５０μｌを載せ、スライドガラスをパラフィル
ムで覆って、４２℃のウォーターバスで一晩加熱した。
ハイブリダイゼーション溶液の組成は以下の通りであ
る。尚、ビオチン化プローブは、実施例１で用いたビオ
チン化プローブと同じものを使用した。

【０１３３】〔ハイブリダイゼーション溶液の組成〕 3× SSC 10% デキストラン 1pmol ビオチン化プローブ

【０１３４】（３）ポストハイブリダイゼーション洗浄 ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスからパラ
フィルムを取り除き、ハイブリ溶液を軽く吸い取った
後、以下の条件でポストハイブリダイゼーション洗浄を
行ない非特異的に吸着したプローブを除去した。

【０１３５】〔ポストハイブリダイゼーション洗浄条
件〕 第１段階：2× SSC、0.1% SDS；室温、５分間、２回 第２段階：0.2× SSC、0.1% SDS；４０℃、５分間、２
回 第３段階：2× SSC；室温、５分間、１回

【０１３６】（４）ハイブリダイゼーションの検出 ３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａ５０ｍｌに浸し、室温で３０
分間ブロッキングを行った。次に、ストレプトアビジン
アルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液（３％Ｂ
ＳＡを含む緩衝液Ａで原液を２０００倍希釈したもの）
４５ｍｌに浸し、室温で３０分間反応させた。次に、ス
ライドガラスを緩衝液Ａ５０ｍｌに浸し、室温で５分間
放置した。これを２回繰り返し、ビオチンと結合しなか
ったコンジュゲートを除去した。次に、スライドガラス
を緩衝液Ｂ３０ｍｌで１回洗浄した。最後に基質溶液
（緩衝液Ｂ２０ｍｌ＋ＢＣＩＰ溶液１８μｌ＋ＮＢＴ液
３６μｌ）に浸し、室温で３時間放置し、発色反応を行
った結果、色素沈着は得られなかった。

【０１３７】

【比較例２】（１）ポリ-Ｌ-リジンコートスライドガラ
ス上への核酸固定 配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
（２１ｍｅｒ）を、１００ｎｇ／μｌになるように０．
２×ＳＳＣに溶解し、ＤＮＡ溶液とした。ＳＰＢＩＯ
（日立ソフトウェアエンジニアリング社製、ａｒｒａｙ
ｅｒ）を用い、ポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス
（シグマ社製）の所定の位置に、前記ＤＮＡ溶液を直径
２００μｍで５００箇所スポットした。対照として、プ
ローブに対して相補性を有しないＤＮＡ（ｔｅｔ）を１
００ｓｐｏｔ、スポットした。ＤＮＡをスポットしたポ
リ−Ｌ−リジンコートスライドガラスをチャンバーに入
れ、室温で２時間反応した。次いで、減圧乾燥機で８０
℃、２時間乾燥させた。次にスライドガラスを０．１％
ＳＤＳで洗浄した後、ブロッキング溶液（無水コハク
酸；１ｇ、Ｎ−メチル−ピロリドン；１００ｍｌ、０．
２Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ ８．０；１００ｍｌ）に
室温で１０分間浸した後、蒸留水で４回洗浄し、核酸を
固定化したポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラスを得
た。

【０１３８】（２）ハイブリダイゼーション ＤＮＡを固定化したポリ−Ｌ−リジンコートスライドガ
ラスのＤＮＡを固定化した部分に、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液５０μｌを載せ、パラフィルムで覆って、４２
℃のウォーターバスで一晩加熱した。ハイブリダイゼー
ション溶液の組成は以下の通りである。尚、ビオチン化
プローブは、実施例１で用いたビオチン化プローブと同
じものを使用した。

【０１３９】〔ハイブリダイゼーション溶液の組成〕 3×SSC 10% デキストラン 1pmol ビオチン化プライマー

【０１４０】（３）ポストハイブリダイゼーション洗浄 ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスからパラ
フィルムを取り除きハイブリダイゼーション溶液を軽く
吸い取った後、以下の条件でポストハイブリダイゼーシ
ョン洗浄を行ない非特異的に吸着したプローブを除去し
た。

【０１４１】〔ポストハイブリダイゼーション洗浄条
件〕 第１段階：2× SSC、0.1% SDS；室温、５分間、２回 第２段階：0.2× SSC、0.1% SDS；４０℃、５分間、２
回 第３段階：2× SSC；室温、５分間、１回

【０１４２】（４）検出 ３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａ５０ｍｌに浸し、室温で３０
分間ブロッキングを行った。次に、ストレプトアビジン
アルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液（３％Ｂ
ＳＡを含む緩衝液Ａで原液を２０００倍希釈したもの）
４５ｍｌに浸し、室温で３０分間反応させた。次に、ス
ライドガラスを緩衝液Ａ５０ｍｌに浸し、室温で５分間
放置した。これを２回繰り返し、ビオチンと結合しなか
ったコンジュゲートを除去した。次にスライドガラスを
緩衝液Ｂ３０ｍｌで１回洗浄した。最後に基質溶液（緩
衝液Ｂ２０ｍｌ＋ＢＣＩＰ溶液１８μｌ＋ＮＢＴ液３６
μｌに浸し、室温で３時間放置し、発色反応を行った結
果、色素沈着は得られなかった。

【０１４３】

【発明の効果】本発明により、ＤＮＡが安定に固定化さ
れた核酸固定化基板が提供される。本発明の基板には、
核酸が、鎖の数や長さに制限されずに固定され得るの
で、同一基材上で種々の核酸を同時に扱うことができ
る。

【０１４４】また、核酸を共有結合により強固に担体に
結合させているため、再現性、定量性に優れたＤＮＡチ
ップとしての用途に有効な核酸固定化基板となり得る。

【０１４５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 日清紡績株式会社(Nisshinbo Industries, Inc.) <120> 核酸固定化基板 <130> P-7605 <150> JP 11-173966 <151> 1999-06-21 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 1 aaatgggtac tgtgcctgtt a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 2 gttacccaca taccacgaat c 21 <210> 3 <211> 1254 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 aaatgggtac tgtgcctgtt actgggtttt ccttcggtat cctattcccg ggagtttatg 60 atagactttt cgacccaaca aagttatgtc tcttcgttaa atagtatacg gacagagata 120 tcgacccctc ttgaacatat atctcagggg accacatcgg tgtctgttat taaccacacc 180 ccaccgggca gttattttgc tgtggatata cgagggcttg atgtctatca ggcgcgtttt 240 gaccatcttc gtctgattat tgagcaaaat aatttatatg tggctgggtt cgttaatacg 300 gcaacaaata ctttctaccg tttttcagat tttacacata tatcagtgcc cggtgtgaca 360 acggtttcca tgacaacgga cagcagttat accactctgc aacgtgtcgc agcgctggaa 420 cgttccggaa tgcaaatcag tcgtcactca ctggtttcat catatctggc gttaatggag 480 ttcagtggta atacaatgac cagagatgca tccagagcag ttctgcgttt tgtcactgtc 540 acagcagaag ccttacgctt caggcagata cagagagaat ttcgtcaggc actgtctgaa 600 actgctcctg tgtatacgat gacgccggga gacgtggacc tcactctgaa ctgggggcga 660 atcagcaatg tgcttccgga gtatcgggga gaggatggtg tcagagtggg gagaatatcc 720 tttaataata tatcggcgat actgggcact gtggccgtta tactgaattg tcatcatcag 780 ggggcgcgtt ctgttcgcgc cgtgaatgaa gagagtcaac cagaatgtca gataactggc 840 gacaggcccg ttataaaaat aaacaataca ttatgggaaa gtaatacagc tgcagcgttt 900 ctgaacagaa agtcacagtt tttatataca acgggtaaat aaaggagtta agtatgaaga 960 agatgtttat ggcggtttta tttgcattag tttctgttaa tgcaatggcg gcggattgcg 1020 ctaaaggtaa aattgagttt tccaagtata atgagaatga tacattcaca gtaaaagtgg 1080 ccggaaaaga gtactggacc agtcgctgga atctgcaacc gttactgcaa agtgctcagt 1140 tgacaggaat gactgtcaca attaaatcca gtacctgtga atcaggctcc ggatttgctg 1200 aagtgcagtt taataatgac tgaggcataa cctgattcgt ggtatgtggg taac 1254 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 4 agccacatat aaattatttt g 21 <210> 5 <211> 285 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 aaatgggtac tgtgcctgtt actgggtttt ccttcggtat cctattcccg ggagtttatg 60 atagactttt cgacccaaca aagttatgtc tcttcgttaa atagtatacg gacagagata 120 tcgacccctc ttgaacatat atctcagggg accacatcgg tgtctgttat taaccacacc 180 ccaccgggca gttattttgc tgtggatata cgagggcttg atgtctatca ggcgcgtttt 240 gaccatcttc gtctgattat tgagcaaaat aatttatatg tggct 285

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 塩畑 奈美子 千葉県千葉市緑区大野台１−２−３ 日清 紡績株式会社研究開発センター内 (72)発明者 松村 嘉之 千葉県千葉市緑区大野台１−２−３ 日清 紡績株式会社研究開発センター内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 基材と基材上に担持されたカルボジイミ
   ド基を有する化合物からなる担体の複数箇所に、同一又
   は異なる核酸が前記カルボジイミド基を介して点状に固
   定された核酸固定化基板。
2. 【請求項２】 前記点がほぼ円形であり直径が１０〜３
   ０００μｍである請求項１記載の核酸固定化基板。
3. 【請求項３】 核酸の鎖長が１０〜３００ヌクレオチド
   である請求項１記載の核酸固定化基板。
4. 【請求項４】 カルボジイミド基を有する化合物が基材
   表面に共有結合を介して担持されている請求項１記載の
   核酸固定化基板。
5. 【請求項５】 核酸が固定化された点の数が基板１ｃｍ
   ²あたり１０〜１００００個である請求項１記載の核酸
   固定化基板。
6. 【請求項６】 基材と基材上に担持されたイソシアネー
   ト基を有する化合物からなる担体の複数箇所に、同一又
   は異なる核酸が前記イソシアネート基を介して点状に固
   定された核酸固定化基板。
7. 【請求項７】 前記点がほぼ円形であり直径が１０〜３
   ０００μｍである請求項６記載の核酸固定化基板。
8. 【請求項８】 核酸の鎖長が１０〜３００ヌクレオチド
   である請求項６記載の核酸固定化基板。
9. 【請求項９】 イソシアネート基を有する化合物が基材
   表面に共有結合を介して担持されている請求項６記載の
   核酸固定化基板。
10. 【請求項１０】 核酸が固定化された点の数が基板１ｃ
    ｍ²あたり１０〜１００００個である請求項６記載の核
    酸固定化基板。