JP3708567B2 - 生物学的に活性な物質を固定するための方法 - Google Patents
生物学的に活性な物質を固定するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3708567B2 JP3708567B2 JP19103594A JP19103594A JP3708567B2 JP 3708567 B2 JP3708567 B2 JP 3708567B2 JP 19103594 A JP19103594 A JP 19103594A JP 19103594 A JP19103594 A JP 19103594A JP 3708567 B2 JP3708567 B2 JP 3708567B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- diisocyanate
- solution
- carbodiimide
- active substance
- biologically active
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
- C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/545—Synthetic resin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/811—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an inorganic carrier
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
- Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
- Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
- Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent
Description
【０００１】
本発明は、生物学的に活性な物質を固定するための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物学的に活性な物質（以下、単に活性物質ということもある）、例えば夕ンパク、核酸、オリゴペプチド、オリゴヌタレオチド等を不溶性の担体に固定させたものは、その活性を利用するために有用であり、例えば、固定化酵素の生理化学工業的利用、抗体或いは抗原固定担体の免疫学的利用、核酸固定担体の診断薬としての利用等を挙げることができる。
【０００３】
そのため、活性物質を固定化する種々の方法が公表されていて、例えば酵素では、
１．ジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋試薬による基材結合法やＵｇｉ反応による基材結合法等のような酵素を架橋剤や縮合剤等を用いて化学結合させる方法（「固定化酵素」［千畑一郎編、講談社サイエンティフィク（１９８６）］第９−４１ページ参照）
２．イオン結合で固定する方法（「固定化酵素」第４１−４３ページ参照）
３．物理吸着で固定する方法（「固定化酵素」第４３−４５ページ参照）
等が知られている。
【０００４】
又、核酸では、
１．５’未端にチオール基を有する核酸とチオール基を含むビーズ状基材間のジスルフィド結合による固定（Ｐ．Ｊ．Ｒ．Ｄａｙ，Ｐ．Ｓ．Ｆｌｏｒａ，Ｊ．Ｅ．Ｆｏｘ，Ｍ．Ｒ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７８，７３５−７４０（１９９１）参照）等のような修飾基を導入した核酸を化学結合させる方法（尚、この範疇に属する他の方法については、Ｓｏｒｅｎ Ｒ．Ｒ，Ｍｅｔｔｅ Ｒ．Ｌ，Ｓｖｅｎｄ Ｅ．Ｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８，１３８−１４２（１９９１），Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｎ．Ｋ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｌ．Ｗ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｐ．Ｄ，Ｒａｃｈｅｌ Ｅ．Ｍ，Ｍａｒｙ Ｃ，Ｅｕｇｅｎｅ Ｌ．Ｂ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５，２８９１−２９０９（１９８７），Ａｌｌａｎ Ｊ．Ｍ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｒ．Ｂ，ＴｅｒｅｎｃｅＷ．Ｐ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９１，２７６−２７９（１９９０）Ｊ．Ａ，Ｒｕｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｓ．Ｕｒｅｄａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｒｕｅｓ，８，２７６−２７９（１９９０）等に記載されている。）
２．ニトロセルロース又はナイロン膜上にＵＶ照射或いは加熱処理により核酸を吸着固定（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅ ２．１０９−２．１１３ ａｎｄ ｐａｇｅ９．３６−９．４６）したり、マイクロプレート上に物理吸着させて固定（Ｇ．Ｃ．Ｎ．Ｐａｒｒｙ，Ａ．Ｄ．Ｂ．Ｍａｌｃｏｌｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１７，２３０−２３１（１９８９））する等の物理吸着で固定する方法
等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような従来方法には難点のあることが指摘されていた。例えば、化学結合による方法では、特殊試薬が必要で、それらの中には、例えばアジド、イソシアナートやＮａＢＨ ３ ＣＮ等のような有毒物質が含まれるばかりか、例えばペプチド結合を介して固定化しようとする場合は、活性物質或いは基材のどちらか一方にアミノ基を、残る片方にはカルボキシル基を導入する必要があり、更に、導入された官能基同士を縮合試薬で処理して固定化する行程を経なければならないというように、操作が複雑となることを避けられない。
【０００６】
又、化学結合では、例えばグルタルアルデヒドを架橋剤として使用するには、基材と活性物質の双方にアミノ基が存在しなければならないというように、基材自体に官能基が必要で、基材の選択が必要となる結果、固定に適した基材の選択が困難になり、加えて、例えば天然のＤＮＡや修飾基を持たない合成ＤＮＡ等の、反応性の乏しい官能基（末端リン酸基、末端ヒドロキシル基等）しか有しないものについては、化学反応による方法を用いることが困難であるというように、活牲物質に活性官能基が無い場合は固定できないという難点がある。
【０００７】
一方、物理吸着には、基材の吸着性能に固定化量が左右されたり、吸着した活性物質が脱離しやすく、活性物質が低分子（オリゴマー）の場合、基材との相互作用が弱いため吸着しにくいという難点があり、更に、核酸をナイロン膜やニトロセルロース膜に吸着固定する場合は、吸着密度も結合力も高いが、どちらの膜も強度がなく、破れやすいため、取り扱いに必要以上の注意が必要となってしまう。
【０００８】
本発明は上述した従来技術の難点を解消して、容易に活性物質を固定することができる方法を提供するためになされたものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために本発明が採用した生物学的に活性な物質を固定するための方法は、基材及び該基材上に担持されたカルボジイミド基を有する高分子化合物よりなる固定用の材料と、カルボジイミド基との反応性を有する生物学的に活性な物質を接触させる生物学的に活性な物質を固定するための方法であって、
（１）基材が、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子又はセラミックからなる群より選ばれたものであり、
（２）カルボジイミド基を有する高分子化合物が、分子内に２以上１００以下のカルボジイミド基を有すると共に、分子量が１０００以上１０００００以下であり、且つ、２，４−トリレンジイソシアネート、２，６−トリレンジイソシアネート、２，４−トリレンジイソシアネートと２，６−トリレンジイソシアネートの混合物、粗トリレンジイソシアネー卜、粗メチレンジフェニルジイソシアネート、４，４’，４”−トリフェニルメチレントリイソシアネート、キシレンジイソシアネート、ヘキサメチレン−１，６一ジイソシアネー卜、リジンジイソシアネート、水添メチレンジフェニルジイソシアネート、ｍ−フェニルジイソシアネート、ナフチレン−１，５−ジイソシアネート、４，４’−ビフェニレンジイソシアネート、ジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネー卜、３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニルジイソシアネート、３，３’−ジメチルジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートやこれらの混合物からなる群より選ばれた有機ポリイソシアネート化合物から、イソシアネートのカルボジイミド化を促進する触媒の存在下に製造することにより得られたものであり、
（３）生物学的に活性な物質が、カルボジイミド基と反応性を有する核酸である、
ことを特徴とするものである。
【００１０】
即ち、低分子カルボジイミド誘導体、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドやジ−ｐ−トルオイルカルボジイミドは、エステル及びペプチド等の合成における脱水縮合剤として従来より広く使用されていて、これらのカルボジイミド誘導体は、以下の反応式に示すように容易にカルボン酸と付加体を形成し、更にこの付加体がアルコール、アミン、カルボン酸等と尿素誘導体を放しつつ縮合し、それぞれ相当するエステル、アミド、酸無水物を生成するので、このような低分子カルボジイミド誘導体を活性物質の固定に使用することも考えられた。
【００１１】
【化１】
しかしながら、これら低分子のカルボジイミド誘導体は、縮合剤として開発されてきた試薬であって、溶剤に対する溶解性が付与されており、基材に適用し、該基材表面に担持させる使用目的に関しては、脱離しやすく、実用上使用できないことが判明した。そこで、本発明の発明者らは、カルボジイミド基を分子内に含む高分子のカルボジイミド化合物に着目し、鋭意研究を続けた結果、前記のような有機ポリイソシアネートより得られるカルボジイミド化合物が活性物質との反応性を有しているばかりでなく、様々な種類の基材との接着性が良いことを見い出し、本発明の完成に至った。
【００１２】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明で使用される基材としては、活性物質を固定するための支持体としての役割を果たすものであって、基本的には、水或いは溶剤又はそのどちらにも不溶性で且つ常温若しくはその付近の温度範囲内（０〜ｌ００℃）で固体であるもの、例えば、プラスチック、ガラス、金属、カーボン、天然高分子、セラミックが適している。
【００１４】
更に具体的には、
ブラスチック；
ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアクリル樹脂等
無機高分子；
ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル、及びグラファイト等
金属；
金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット及びアパタイト等の常温固体金属
天然高分子；
セルロース、セルロース誘導体、キチン、キトサン及びアルギン酸等
セラミック；
アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び炭化ホウ素等
等を例示することができる。
【００１５】
上記基材の形状としては、例えば、フィルム、板、粒子、成型品（ビーズ、ストリップ、マルチウエルプレートやそのウエル、組立式マルチウエルプレートの個々の単位、マルチウエルプレートのストリップウエル、チューブ、メッシュ、発泡フォーム、膜、紙、針、ファイバー、プレート、スライド及び細胞培養容器）を挙げることができ、又、その大きさについては、当然であるが特に制限はない。
【００１６】
一方、本発明で使用するカルボジイミド基を有する高分子化合物（以下、単にカルボジイミド化合物ということがある）としては、例えば、特開昭５１−６１５９９号公報に開示されている方法やL. M. Alberinoらの方法（J. Appl. Polym. Sci., 21, 190 (1990)）或いは特開平２−２９２３１６号公報に開示されている方法等によって製造することができるポリカルボジイミドを挙げることができる。即ち、有機ポリイソシアネート化合物からイソシアネートのカルボジイミド化を促進する触媒の存在下に製造することができるものである。
【００１７】
上記有機ポリイソシアネート化合物としては、例えば、２，４−トリレンジイソシアネート、２，６−トリレンジイソシアネート、２，４−トリレンジイソシアネートと２，６−トリレンジイソシアネートの混合物、粗トリレンジイソシアネー卜、粗メチレンジフェニルジイソシアネート、４，４’，４”−トリフェニルメチレントリイソシアネート、キシレンジイソシアネート、ヘキサメチレン−１，６一ジイソシアネー卜、リジンジイソシアネート、水添メチレンジフェニルジイソシアネート、ｍ−フェニルジイソシアネート、ナフチレン−１，５−ジイソシアネート、４，４’−ビフェニレンジイソシアネート、ジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネー卜、３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニルジイソシアネート、３，３’−ジメチルジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートやこれらの混合物を挙げることができる。
【００１８】
又、上記ポリカルボジイミドは、その分子量をモノイソシアネートの一種以上を用いることにより、重縮合をある段階で停止させる等して調整しつつ製造されたものでもよい。このようにしてポリカルボジイミドの末端を封止してその分子量を制御するためのモノイソシアネー卜としては、フェニルイソシアネート、（オルト、メ夕、パラ）−トリルイソシアネート、ジメチルフェニルイソシアネート、シクロヘキシルイソシアネート、メチルイソシアネート等を例示することができる。
【００１９】
又、容易に類推されることであるが、この他にも末端封止剤としては、−ＯＨ、−ＮＨ ２ 、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨアルキル末端を有する化合物約１モルと、芳香族ジイソシアネート２モルとの反応によって簡便に製造できるイソシアネート末端化合物から誘導されるものでもよい。
【００２０】
上記有機ポリイソシアネートのカルボジイミド化を促進する触媒としては、種々のものを例示することかできるが、１−フェニル−２−ホスホレン−１−オキシド、３−メチル−１−フェニル−２−ホスホレン−１−オキシド、１−エチル−２−ホスホレン−１−オキシドやこれらの３−ホスホレン異性体等が収率その他の面で好適である。
【００２１】
上記ポリカルボジイミドの製造は、無溶媒又は非反応性の有機溶媒中で行うものであり、本発明ではこれらにより製造したワニス状或いは固体状（粉末）のポリカルボジイミドの一種又は混合物をカルボジイミド化合物の一例として用いることができる。尚、これらのポリカルボジイミドは、基材との結合性を増加させるために、部分的に架橋するようにしてもよい。
【００２２】
他のカルボジイミド化合物、例えば特開昭６３−１７２７１８号公報及び特開昭６３−２６４１２８号公報に記載されるような、分子構造内にポリオキシエチレン鎖を付加してなる親水性を付与されたタイプのカルボジイミド化合物も本発明で使用することができる。
【００２３】
いずれのタイプであっても、本発明で使用するカルボジイミド高分子化合物は、その分子中に２以上１００以下のカルボジイミド基を有しているものであり、このカルボジイミド高分子化合物においてカルボジイミド基の数が２未満、即ち１の場合は生物学的に活性な物質を固定する能力に欠け、又、逆にカルボジイミド基の数が１０１以上の場合は性能面では問題はないが、粘度が高すぎたり、溶液とすることができない場合があり、基材上に担持させる際の取り扱い性が悪化してしまう。
【００２４】
又、本発明で使用するカルボジイミド高分子化合物の分子量の範囲としては、１０００以上であり、１０００００以下である。
【００２５】
尚、例えば、前記有機ポリイソシアネート化合物からイソシアネートのカルボジイミド化を促進する触媒の存在下に製造されたポリカルボジイミドの中には、分子量が１０００に満たないものも存在するが、このようなポリカルボジイミドについては、ポリカルボジイミドの両末端に、ウレア結合又はウレタン結合を介して、ポリアルキレン、ポリオキシアルキレン、ポリウレタン、ポリアミド等を導入し、分子量を前記範囲に調整すればよい。
【００２６】
すでに説明したように、上記カルボジイミド高分子化合物におけるカルボジイミド基の反応性は高く、アルコール、アミン、チオール、フェノール、カルボン酸等の有するほとんどの活性水素基と反応するのであり、前記カルボジイミド誘導体とカルボン酸との反応以外の反応を示せば、例えばアルコールとは、
【化２】
のように進行し、アミノ基とは、
【化３】
のように進行する（Frederick Kurzer, K. Douraghi-Zadeh, Chemical Reviews, 67, 117-135 (1967)及びAndrew Williams, Ibrahim T. Ibrahim, Chemical Reviews, 81, 599-606 (1981)参照）ので、本発明は、このような反応性を利用して活性物質を固定するのである。
【００２７】
本発明で使用する活性物質を固定するための材料は、上記基材と、該基材上に担持された、上記カルボジイミド化合物よりなり、該カルボジイミド化合物の前記基材に対する高い接着性を利用して担持させたものである。尚、ここでいう「担持」とは、水或いは溶媒中で脱離しないことを意味する。
【００２８】
カルボジイミド化合物は、必要に応じ、基材上の全面において担持されても、又、その一部において担持されていてもよく、その代表的な態様は皮膜である。
【００２９】
前記基材上に前記カルボジイミド化合物を担持させる方法としては、スプレー、浸漬、ブラッシング、スタンプ、蒸着、フィルムコー夕ーを用いたコーティング等の公知の手段を採用することができる。
【００３０】
このようにして得られた活性物質を固定するための材料は、カルボジイミド化合物の反応性を利用して、様々な活性物質を固定することができるものであり、このような活性物質としては、核酸を、更に具体的には、ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ＲＮＡを例示することができる。
【００３１】
上記活性物質を固定するための材料により、上記のような活性物質を固定するには、当該材料と活性物質とを接触させればよく、両者の接触は、活性物質の活性が維持されるように、水或いはバッファー中で行うことが好ましく、又、接触の際の温度としては、やはり活性物質の活性が損なわれないように、０〜１００℃とすることが好ましい。
【００３２】
このようにして得られた固定された活性物質は、該活性物質が基材に対し非常に強固に担持されたものであり、イムノアッセイの分野で広く使われている洗浄法（界面活性剤を用いた洗浄法）によっても脱離することがなく、固定化酵素の生理化学工業的利用、抗体或いは抗原固定担体の免疫学的利用、核酸固定担体の診断薬としての利用等の広い利用分野を有している。
【００３３】
尚、現段階では、活性物質の担持される機構（結合様式）は不明であるが、Frederick Kurzer, K. Douraghi-Zadeh, Chemical Reviews, 67, 117-135 (1967)に開示されているような、化学結合と物理吸着の両作用によるものと推測される。
【００３４】
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明する。
【００３５】
【実施例】
カルボジイミド化合物溶液１の製造例
４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート１１７．９ｇとシクロヘキシルイソシアネート１２．５ｇをカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニル−２−ホスホレン−１−オキシド）１．３ｇと共に窒素雰囲気下、１８０℃で４日間反応させ、室温で粉末状のカルボジイミド化合物（重合度１０、数平均分子量２４００）を得た。この１０ｇを取り、メタノール１００ｍｌに分散溶解させ、カルボジイミド化合物溶液１を得た。
【００３６】
カルボジイミド化合物溶液２の製造例
イソホロンジイソシアネー卜１９．９ｇとｎーブチルイソシアネー卜２．０ｇをカルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニル−２−ホスホレン−ｌ−オキシド）０．２ｇと共に窒素雰囲気下、１８０℃で３日間反応させ、室温で粉末状のカルボジイミド化合物（重合度１０、数平均分子量１９００）を得た。この１０ｇを取り、ジクロロメタン１００ｍｌに溶解し、カルボジイミド化合物溶液２を得た。
【００３７】
カルボジイミド化合物溶液３の製造例
２，４−トリレンジイソシアネート／２，６−トリレンジイソシアネートの混合物（混合割合＝８０：２０）７８．４ｇとフェニルイソシアネート１１．９ｇとをテトラクロロエチレン６１５ｇ中で、カルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニルホスホレン−１−オキシド）０．９ｇと共に窒素雰囲気下、７５℃で２４時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液３（重合度１０、数平均分子量１５００）を得た。
【００３８】
カルボジイミド化合物溶液４の製造例
４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート１１２．６ｇとフェニルイソシアネート１１．９ｇとをテトラヒドロフラン９２２．７ｇ中で、カルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホスホレン−１−オキシド）１．２ｇと共に窒素雰囲気下、７５℃で１６時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液４（重合度１０、数平均分子量２３００）を得た。
【００３９】
カルボジイミド化合物溶液５の製造例
ｍ−テトラメチルキシリレンジイソシアネート７００ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホスホレン−１−オキシド）１４ｇを窒素雰囲気下、１８０℃で１２時間反応させ、イソシアネート末端テトラメチルキシリレンカルボジイミド（重合度＝３）を得た。次いで、得られたカルボジイミド７４．６ｇと重合度６のポリ（オキシエチレン）モノメチルエーテル６３．６ｇを１００℃で４８時間反応させた。これを１０ｇ取り、５０℃で蒸留水９０ｇを徐々にカルボジイミド化合物溶液５（数平均分子量１４００）を得た。
【００４０】
カルボジイミド化合物溶液６の製造例
４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート１６２ｇをテトラヒドロフラン８８６ｇ中でカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホスホレン−１−オキシド）０．３３ｇと共に窒素雰囲気、リフラックス下で７時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液６（重合度６０、数平均分子量１３０００、ポリマー濃度１５重量％）を得た。
【００４１】
カルボジイミド化合物溶液７の製造例
ｍ−テトラメチルキシリレンジイソシアネート７００ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホスホレン−１−オキシド）１４ｇを窒素雰囲気下、１８０℃で１８時間反応させ、イソシアネート末端テトラメチルキシリレンカルボジイミド（重合度＝４）を得た。次いで、得られたカルボジイミド５０．２ｇと２−ジメチルアミノエタノール８．９ｇを８０℃で２４時間反応させた後、ｐ−トルエンスルホン酸メチル１８．６ｇを加え１時間反応させた。これに蒸留水６９９．３ｇを徐々に加え、カルボジイミド化合物溶液７（数平均分子量１６００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４２】
カルボジイミド化合物溶液８の製造例
イソホロンジイソシアネー卜２０ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニル−２−ホスホレン−ｌ−オキシド）０．２ｇを窒素雰囲気下、１８０℃で１８時間反応させ、イソシアネート末端イソホロンカルボジイミド（重合度＝４）を得た。次いで、得られたカルボジイミド７．５６ｇと３−ジメチルアミノ−ｎ−プロピルアミン２．０４ｇを８０℃で１時間反応させた後、ｐ−トルエンスルホン酸メチル３．７２ｇを加え、１時間反応させた。これに蒸留水１２０ｇを徐々に加え、カルボジイミド化合物溶液８（数平均分子量１４００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４３】
カルボジイミド化合物溶液９の製造例
４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート１１７．９ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニル−２−ホスホレン−ｌ−オキシド）１．２ｇを窒素雰囲気下、１８０℃で８時間反応させ、イソシアネート末端ジシクロヘキシルカルボジイミド（平均重合度＝２．４）を得た。次いで、得られたカルボジイミド７．８５ｇと重合度約６のポリ（オキシエチレン）モノメチルエーテル５．９２ｇを１００℃で４８時間反応させた。これに蒸留水１２４ｇを徐々に加え、カルボジイミド化合物溶液９（数平均分子量１３００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４４】
カルボジイミド化合物溶液１０の製造例
４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート１５ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニル−２−ホスホレン−ｌ−オキシド）０．１ｇをテトラヒドロフラン１４５ｇ中、窒素雰囲気下、７５℃で８時間反応させ、イソシアネート末端ジフェニルメタンカルボジイミド（重合度＝５）を得た。次いで、得られたカルボジイミド溶液に重合度約１０のポリ（オキシエチレン）モノメチルエーテル９．４４ｇを加え、７５℃で４８時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液１０（数平均分子量２１００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４５】
カルボジイミド化合物溶液１１の製造例
２，４−トリレンジイソシアネート／２，６−トリレンジイソシアネートの混合物（混合割合＝８０：２０）１３．９ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニルホスホレン−１−オキシド）０．１ｇをテトラヒドロフラン１５０ｇ中、窒素雰囲気下、７５℃で８時間反応させ、イソシアネート末端トリレンカルボジイミド（重合度＝４）を得た。得られたカルボジイミド溶液にヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム１．６２ｇを加え、７５℃で２４時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液１１（数平均分子量１０００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４６】
カルボジイミド化合物溶液１２の製造例
４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート２４ｇと平均分子量４００のポリエチレングリコール２０ｇをテトラヒドロフラン４４０ｇに加え反応させた。次に、カルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニルホスホレン−１−オキシド）０．２ｇを加え、窒素雰囲気下、７５℃で４８時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液１２（数平均分子量５３００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４７】
カルボジイミド化合物溶液１３の製造例
４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート５２．４ｇと１，４−ジアミノブタン８．８ｇをテトラヒドロフラン６２０ｇに加え反応させた。次に、カルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニルホスホレン−１−オキシド）０．５ｇを加え、窒素雰囲気下、７５℃で４８時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液１３（数平均分子量３７００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４８】
実施例１
（１）マイクロプレート上へのＤＮＡオリゴマーの固定。
ファージベクターＭ１３ｍｐ１８のｌａｃ’Ｚ領域中のマルチクローニングサイトの中から２９ｂａｓｅを選定し、ＤＮＡ合成機（MILLIPORE社製、Cyclone Plus DNA/RNA Synthesizer）により、以下の塩基配列のＤＮＡを合成した。この合成ＤＮＡの５’末端には、選択的にストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲートタンパクを結合するために、ビオチンフォスフォルアミダイト（MILLIPORE社製）を組み込んだ。尚、ビオチンフォスフォルアミダイトは、Ｂで示した。
塩基配列１
５’ＢＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ３’
【００４９】
ポリスチレン製の９６穴マイクロプレートのウェル５穴にカルボジイミド化合物溶液１の０．１ｍｌを加え、６０℃で１時問インキュベー卜した。ウェルをエタノールでよく洗浄し、６０℃で３０分乾燥した。ビオチン標識されたＤＮＡオリゴマー溶液（上記塩基配列１の１０ｐｍｏｌ／ｍｌ濃度の水溶液）０．１ｍｌをポリカルボジイミドで被覆されたウェルと被覆処理を施していないウェル（ブランク）のおのおの５穴づつに（試料番号１〜５）に分注し、３７℃で２時間固定した。固定化後、滅菌水０．３ｍｌで５、６回よく洗浄し、６０℃で３０分乾操した。保存は、冷暗所乾燥雰囲気中で行った。
【００５０】
（２）検出
ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲートのウェル表面への非特異的吸着を押さえる（ブロッキングする）ため、ＤＮＡ固定化処理を施したウェルに、３％ＢＳＡ溶液（3% Bovine Serum Albumin (BSA)/0.2M NaCl/01M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）０．２ｍｌを加え、３７℃で３０分インキュベー卜した。ＢＳＡ溶液を吸引除去後、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液（125pg/ml Streptavidin-Alkaline Phosphatase conjugate (CLONTECH製)/0.2M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）０．１ｍｌを加え、室温で３０分インキュベートした。ついで、洗浄液１（0.2M NaCl/0.1M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）０．３ｍｌで１０分づつ３回洗浄し、更に、洗浄液２（0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）０．３ｍｌで１回洗浄した後、基質溶液（1mg p-Nitrophenylphosphate disodium salt hexahydrate/0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）０．１ｍｌを加え、室温で２時間発色反応させた。２時間経過後、各ウェル中の溶液の吸光度を分光光度計を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００５１】
実施例２
（１）マイクロプレート上へのストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲートの固定
ポリスチレン製の９６穴マイクロブレートのウェル５穴（試料番号６〜１０）にカルボジイミド化合物溶液１の０．１ｍｌを加え、６０℃で１時間インキュベートした。ウェルをメタノールでよく洗浄し、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液（125pg/ml Streptavidin-Alkaline Phosphatase conjugate (CLONTECH製)/0.2M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）０．１ｍｌを加え、３７℃で３０分インキュベートした。
【００５２】
（２）検出
洗浄液１（０．２Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）０．３ｍｌで１０分づつ３回洗浄し、更に、洗浄液２（０．１Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ９．５／５０ｍｌＭｇＣｌ２）０．３ｍｌで１回洗浄した後、基質溶液（１ｍｇ ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ／０．１ＭＮａＣｌ／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ９．５／５０ｍｌ ＭｇＣｌ２）０．１ｍｌを加え、室温で２時間発色反応させた。２時間経過後、各ウェルについて視覚による発色判定を行うと共に、各ウェル中の溶液の吸光度を分光光度計を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００５３】
実施例３
基材としてのポリスチレン製マイクロプレート（SUMILON ELISA用９６Ｆプレートtype C（住友ベークライト社製、表面：カルボキシキ基）と、カルボジイミド化合物溶液５、７、８、９を用い、実施例１と同様の試験を行った。結果を表１に示す。
【００５４】
実施例４
基材としての、実施例３で使用したものと同様のポリスチレン製マイクロプレートと、カルボジイミド化合物溶液５、７、８、９を用い、実施例２と同様の試験を行った。結果を表１に示す。
【００５５】
実施例５
実施例１と同様の方法により、カルボジイミド化合物溶液１を被覆したマイクロプレートに０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）で希釈したＡＣＴＨペプチドオリゴマー（ペニンシュラ社製）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌを分注し、軽く浸透後、溶液を捨て、ペーパータオルで軽くふき、未固定のＡＴＣＨペプチドオリゴマーを排除した。この操作を３回繰り返した。ブロッキング液（１０％ＢＳＡを含む０．０１ＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０）０．２ｍｌをウェルに分注し、３７℃で３０分反応させた。ウェルの溶液を捨て、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを分注し、洗浄した。この操作を３回繰り返した。坑ＡＣＴＨマウスＩｇＧ（ＣＹＭＢＵＳバイオサイエンスリミテッド社製、１ｍｇ／ｍｌの５０％グリセロース溶液）を０．０１ＭのＨＥＰＲＳ（ｐＨ７．０）で１００倍に希釈した溶液０．１ｍｌをウェルに分注し、室温で３０分反応させた反応後、溶液を捨て、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを分注し、洗浄した。この操作を３回繰り返した。坑マウスＩｇＧヤギＩｇＧ−アルカリフォスファターゼコンジュゲート（Kirkegaaer & Perrラボラトリー社製、１ｍｇ／ｍｌの５０％グリセロース溶液）を０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０で１０００倍に希釈した溶液０．０１ｍｌを加え、室温で３０分反応させた。反応後、溶液を捨て０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを分注し洗浄した。この操作を３回繰り返した。ウェルに基質溶液（５０ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ１０．０）、５ｍＭＭｇＣｌ2、５ｍＭｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム）０．０１ｍｌを加え、３０℃で１時間反応させた。０．１Ｎ水酸ナトリウム水溶液０．２ｍｌを加え、反応を停止させた。吸光光度計で４０５ｎｍの吸収値を測定した。同様の操作を５個のウェル（試料番号１〜５）で行った。結果を表１に示す。
【００５６】
実施例６
ポリスチレンビーズ［Poly(styrene-2% divinyl benzene), 200-400mesh］５ｇをカルボジイミド化合物溶液１、２、３、４、６、１０、１１、１２、１３の希釈液（ＴＨＦで１０倍希釈）１００ｍｌに３０分間浸漬した後、６０℃で３時間乾燥し、カルボジイミド化合物被覆ビーズを得た。このカルボジイミド化合物被覆ビーズと被覆を施していないビーズ（ブランク）のそれぞれ１ｇを、実施例１で用いたビオチン標識ＤＮＡオリゴマー溶液１μｇ／１０ｍｌに３７℃で２時間浸漬後、ビーズをガラスフィルターでろ別し、蒸留水５００ｍｌで洗浄、乾燥し、ＤＮＡ固定ビーズを得た。次いで、実施例１と同様、ブロッキング、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート処理、洗浄を行ない、基質溶液３ｍｌに加え、２時間後の溶液の４０５ｎｍの吸光度を分光光度計を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００５７】
実施例７
実施例６と同様の方法で作成したカルボジイミド化合物被覆ビーズと被覆を施していないビーズ（ブランク）のそれぞれ１ｇを、実施例２で用いたストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液３ｍｌに室温で２時間浸漬後、ビーズをガラスフィルターでろ別し、蒸留水５００ｍｌで洗浄、乾燥し、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート固定ビーズを得た次いで、実施例２と同様に洗浄を行い、基質溶液３ｍｌに加え、２時間後の溶液の４０５ｎｍの吸光度を分光光度計を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００５８】
実施例８
（１）ＰＥＴフィルム上へのＤＮＡオリゴマーの固定
ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムを１ｃｍ×５ｃｍの長方形に切断し、このフィルム上にカルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１０〜１３の各々０．５ｍｌをスピンコーターで被覆した。このフィルムを８０℃で３０分乾燥し、カルボジイミド化合物で被覆したフィルムを得た。ビオチン標識されたＤＮＡオリゴマー溶液（塩基配列１のｌ００ｐｍｏｌ／ｍｌ濃度水溶液）ｌμｌをカルボジイミド化合物で被覆したフィルムと被覆処理を施していないフィルム（ブランク）におのおの３ドットづつブロットし、室温で１０分間固定した。
【００５９】
（２）検出
検出は、CLONTECH社のGENE-TECT Detection Systemを用い、操作は、そのDetection Protocolに従った。以下に説明する。
（ａ）ブロッキング
ハイブリバックにＤＮＡ固定フィルムを入れ、３％ＢＳＡ溶液２ｍｌを加え、３７℃、３０分インキュベートする。
（ｂ）ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲートの結合
ＢＳＡ溶液を吸引除去後、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液１ｍｌを加え、室温、３０分インキュベートする。
（ｃ）洗浄
洗浄液１（0.2M NaCl/0.1M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）の２ｍｌで１０分づつ３回洗浄する。
（ｄ）バッファー交換
洗浄液２（0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）の２ｍｌで１回置換する。
（ｅ）発色操作
基質溶液（洗浄液２（0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）の１ｍｌ＋ＢＣＩＰ溶液（50mg 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/900ml Dimethylformamide）３．２μｌ＋ＮＢＴ液（50mg Nitro Blue Tetrazolium/1.8ml 70% methanol）６．４μｌ）１ｍｌを加え、室温の暗所で３時間発色反応させる。
（ｆ）結果
結果を表２に示す。
【００６０】
実施例９
（ｌ）ＰＥＴ上へのストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートの固定
実施例３と同様の方法でカルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１０〜１３を被覆したフィルムに、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲート溶液（125pg/ml Streptavidin-Alkaline Phosphatase conjugate (CLONTECH製/0.2M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）をカルボジイミド化合物で被覆したフィルムと被覆処理を施していないフィルム（ブランク）におのおの３ドットづつブロットし、室温でｌ０分間固定した。
【００６１】
（２）検出
（ａ）洗浄
洗浄液１（0.2M NaCl/0.1M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）の２ｍｌでｌ０分づつ３回洗浄した。
（ｂ）バッファー交換
洗浄液２（0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）の２ｍｌでｌ回置換した。
（ｃ）発色操作
基質溶液（洗浄液２（0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）の１ｍｌ＋ＢＣＩＰ溶液（50mg 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/900ml Dimethylformamide）３．２μｌ＋ＮＢＴ液（50mg Nitro Blue Tetrazolium/1.8ml 70% ethanol）６．４μｌ）１ｍｌを加え、室温の暗所で３時間発色反応させた。
（ｄ）結果
結果を表２に示す。
【００６２】
実施例１０
（１）ガラス上へのＤＮＡオリゴマーの固定
実施例３と同様の方法でガラス表面にカルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１０〜１３を被覆し、実施例３と同様の方法によりＤＮＡを固定した。
（２）検出
実施例３と同様の方法により固定ＤＮＡを検出した。結果を表２に示す。
【００６３】
実施例１１
（１）ガラス上へのストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲー卜の固定
実施例３と同様の方法でガラス表面に１０％カルボジイミド化合物溶液１〜４６、１０〜１３を被覆し、実施例４と同様の方法によりストレプトアビジンアルカリホスファ夕ーゼコンジュゲートを固定した。
（２）検出
実施例４と同様の方法により固定ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュケートを検出した。結果を表２に示す。
【００６４】
実施例１２
（１）銅板上へのＤＮＡオリゴマーの固定
実施例３と同様の方法で銅板表面にｌ０％カルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１０〜１３を被覆し、実施例３と同様の方法によりＤＮＡを固定した。
（２）検出
実施例３と同様の方法により画定ＤＮＡを検出した。結果を表２に示す。
【００６５】
実施例１３
（１）銅板上へのストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲー卜の固定
実施例３と同様の方法で銅板表面にｌ０％カルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１０〜１３を被覆し、実施例４と同様の方法によりストレプトアビジンアルカリホスファ夕ーゼコンジュゲートを固定した。
（２）検出
実施例４と同様の方法により固定ストレプトアビジンアルカリホスファ夕ーゼコンジュゲートを検出した。結果を表２に示す。
【００６６】
尚、上記実施例８〜１３について、各々の基材上の被覆厚みを測定したところ０．５〜１μｍであった。又、各々の被覆表面の赤外吸収を測定したところ２１００ｃｍ−１付近のカルボジイミドに特有の吸収があり、基材上の被覆はカルボジイミド化合物であることが確かめられた。
【００６７】
実施例１４
ろ紙（Whatman社製、ろ紙番号４２）をカルボジイミド溶液１、２、３、４、６、１１、１０、１２、１３の希釈液（ＴＨＦで２０倍希釈）に１０秒間浸漬した後、６０℃、３０分間乾燥し、カルボジイミド化合物被覆ろ紙を得た。このろ紙に、実施例３と同様の方法によりＤＮＡを固定し、検出した。結果を表２に示す。
【００６８】
実施例１５
実施例１４と同法により作成したカルボジイミド化合物被覆ろ紙に、実施例４と同法でストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを固定し検出した。結果を表２に示す。
【００６９】
実施例１６
ミクロフィルター（富士フィルム社製、ＦＲタイプ、孔径０．７μｍ）をカルボジイミド化合物溶液１、２、３、４、６、１０、１１、１２、１３の希釈液（ＴＨＦで２０倍希釈）１０秒間浸漬した後、６０℃で３０分間乾燥し、カルボジイミド化合物ブロックティングメンブレンを得た。このメンブレンを用い、サザンハイブリダイゼーションをMolecular Cloning 9.31-9.51(Molecular Cloning, a laboratory manual second edition, cold Spring Harbor Laboratory press 1989)に従って行った。
【００７０】
試験材料は、ＤＮＡ分子量マーカー（宝酒造社製、DNA MW Satndard Markers,λ-Hind III Digest）１μｇを１％アガロースゲル電気泳動で分画した後このメンブレンにキャピラリトランスファーした。次いで、λＤＮＡ（宝酒造社製、bacteriophage λcI 857 Sam7 NAs）を基に、 STRATAGENE社製、Random primer Briotinylation Kitを用いて作製したビオチン化プローブ０．５μｇをハイブリダイズした。尚、トランスファー後、ニトロセルロースメンブレンに行われるべーキングやナイロンメンブレンに行われているＵＶ照射という操作は、本カルボジイミド化合物コートメンブレンに対しては行われず、直ちにハイブリダイゼーションの操作に移行した。さらに、検出は、 STRATAGENE社製、Flash(登録商標） Detection Systemにより行った。その結果、アガロース電気泳動により分画されたフラグメントの電気泳動パターン通りのシグナルが、Ｘ線フィルムで検出された。
【００７１】
比較例１〜１５
カルボジイミド化合物を用いない他は各々実施例１〜１５と同様に処理して比較例とした。結果は表１、２の「未被覆」の項に示す。
【００７２】
比較例１７（従来法によるＤＮＡの検出）
（従来法であるグルタルアルデヒドを用いた修飾ＤＮＡの化学結合による固定化の例）
ファージベクターＭ１３ｍｐ１８のｌａｃ’Ｚ領域中のマルチクローニングサイトの中から２９ｂａｓｅを選定し、ＤＮＡ合成機（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、ＣｙｃｌｏｎｅＰｌｕｓ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｓｉｚｅｒ）により、以下の塩基配列のＤＮＡを合成した。この合成ＤＮＡの３’未端から２番目の配列の位置には、選択的にストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲートタンパクを結合するために、ビオチンフォスフォルアミダイト（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を、５’末端には、アミノリンカー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）組み込んだ。尚、ビオチンフォスファルアミダイトはＢで、アミノリンカーはＨ ２ Ｎ−で示した。
塩基配列２
５’Ｈ ２ Ｎ−ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＣＧＧ ＧＴＡ ＣＣＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＡＡＴ ＴＢＣ ３’
【００７３】
ポリスチレン製マイクロブレート（SUMILON ELISA用96FプレートType A（住友ベークライト社製、表面はアミノ基）の５穴に２％グルタルアルデヒド（電子顕微鏡グレード）溶液（２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）０を０．１ｍｌづつ分注し、室温で２時間放置した。水で２回洗浄後、アミノリンカー修飾−ビオチン標識ＤＮＡオリゴマー溶液（上記塩基配列２の１０ｐｍｏｌ／ｍｌ濃度水溶液溶液）０．１ｍｌを２％グルタルアルデヒド処理ウェル５穴（試料番号１〜５）に分注し、３７℃で２時間固定した。検出は上記実施例１で行った方法と同様の方法で行った。結果を表１に示す。
【００７４】
【表１】
【表２】
【００７５】
【発明の効果】
上記表１及び表２から明らかなように、本発明は、容易に生物学的に活性物質を固定することができ、取り扱いも簡単な材料、及び、容易に生物学的に活性物質を固定するための方法を提供する優れたものということができる。
本発明は、生物学的に活性な物質を固定するための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物学的に活性な物質（以下、単に活性物質ということもある）、例えば夕ンパク、核酸、オリゴペプチド、オリゴヌタレオチド等を不溶性の担体に固定させたものは、その活性を利用するために有用であり、例えば、固定化酵素の生理化学工業的利用、抗体或いは抗原固定担体の免疫学的利用、核酸固定担体の診断薬としての利用等を挙げることができる。
【０００３】
そのため、活性物質を固定化する種々の方法が公表されていて、例えば酵素では、
１．ジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋試薬による基材結合法やＵｇｉ反応による基材結合法等のような酵素を架橋剤や縮合剤等を用いて化学結合させる方法（「固定化酵素」［千畑一郎編、講談社サイエンティフィク（１９８６）］第９−４１ページ参照）
２．イオン結合で固定する方法（「固定化酵素」第４１−４３ページ参照）
３．物理吸着で固定する方法（「固定化酵素」第４３−４５ページ参照）
等が知られている。
【０００４】
又、核酸では、
１．５’未端にチオール基を有する核酸とチオール基を含むビーズ状基材間のジスルフィド結合による固定（Ｐ．Ｊ．Ｒ．Ｄａｙ，Ｐ．Ｓ．Ｆｌｏｒａ，Ｊ．Ｅ．Ｆｏｘ，Ｍ．Ｒ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７８，７３５−７４０（１９９１）参照）等のような修飾基を導入した核酸を化学結合させる方法（尚、この範疇に属する他の方法については、Ｓｏｒｅｎ Ｒ．Ｒ，Ｍｅｔｔｅ Ｒ．Ｌ，Ｓｖｅｎｄ Ｅ．Ｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８，１３８−１４２（１９９１），Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｎ．Ｋ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｌ．Ｗ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｐ．Ｄ，Ｒａｃｈｅｌ Ｅ．Ｍ，Ｍａｒｙ Ｃ，Ｅｕｇｅｎｅ Ｌ．Ｂ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５，２８９１−２９０９（１９８７），Ａｌｌａｎ Ｊ．Ｍ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｒ．Ｂ，ＴｅｒｅｎｃｅＷ．Ｐ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９１，２７６−２７９（１９９０）Ｊ．Ａ，Ｒｕｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｓ．Ｕｒｅｄａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｒｕｅｓ，８，２７６−２７９（１９９０）等に記載されている。）
２．ニトロセルロース又はナイロン膜上にＵＶ照射或いは加熱処理により核酸を吸着固定（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅ ２．１０９−２．１１３ ａｎｄ ｐａｇｅ９．３６−９．４６）したり、マイクロプレート上に物理吸着させて固定（Ｇ．Ｃ．Ｎ．Ｐａｒｒｙ，Ａ．Ｄ．Ｂ．Ｍａｌｃｏｌｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１７，２３０−２３１（１９８９））する等の物理吸着で固定する方法
等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような従来方法には難点のあることが指摘されていた。例えば、化学結合による方法では、特殊試薬が必要で、それらの中には、例えばアジド、イソシアナートやＮａＢＨ ３ ＣＮ等のような有毒物質が含まれるばかりか、例えばペプチド結合を介して固定化しようとする場合は、活性物質或いは基材のどちらか一方にアミノ基を、残る片方にはカルボキシル基を導入する必要があり、更に、導入された官能基同士を縮合試薬で処理して固定化する行程を経なければならないというように、操作が複雑となることを避けられない。
【０００６】
又、化学結合では、例えばグルタルアルデヒドを架橋剤として使用するには、基材と活性物質の双方にアミノ基が存在しなければならないというように、基材自体に官能基が必要で、基材の選択が必要となる結果、固定に適した基材の選択が困難になり、加えて、例えば天然のＤＮＡや修飾基を持たない合成ＤＮＡ等の、反応性の乏しい官能基（末端リン酸基、末端ヒドロキシル基等）しか有しないものについては、化学反応による方法を用いることが困難であるというように、活牲物質に活性官能基が無い場合は固定できないという難点がある。
【０００７】
一方、物理吸着には、基材の吸着性能に固定化量が左右されたり、吸着した活性物質が脱離しやすく、活性物質が低分子（オリゴマー）の場合、基材との相互作用が弱いため吸着しにくいという難点があり、更に、核酸をナイロン膜やニトロセルロース膜に吸着固定する場合は、吸着密度も結合力も高いが、どちらの膜も強度がなく、破れやすいため、取り扱いに必要以上の注意が必要となってしまう。
【０００８】
本発明は上述した従来技術の難点を解消して、容易に活性物質を固定することができる方法を提供するためになされたものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために本発明が採用した生物学的に活性な物質を固定するための方法は、基材及び該基材上に担持されたカルボジイミド基を有する高分子化合物よりなる固定用の材料と、カルボジイミド基との反応性を有する生物学的に活性な物質を接触させる生物学的に活性な物質を固定するための方法であって、
（１）基材が、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子又はセラミックからなる群より選ばれたものであり、
（２）カルボジイミド基を有する高分子化合物が、分子内に２以上１００以下のカルボジイミド基を有すると共に、分子量が１０００以上１０００００以下であり、且つ、２，４−トリレンジイソシアネート、２，６−トリレンジイソシアネート、２，４−トリレンジイソシアネートと２，６−トリレンジイソシアネートの混合物、粗トリレンジイソシアネー卜、粗メチレンジフェニルジイソシアネート、４，４’，４”−トリフェニルメチレントリイソシアネート、キシレンジイソシアネート、ヘキサメチレン−１，６一ジイソシアネー卜、リジンジイソシアネート、水添メチレンジフェニルジイソシアネート、ｍ−フェニルジイソシアネート、ナフチレン−１，５−ジイソシアネート、４，４’−ビフェニレンジイソシアネート、ジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネー卜、３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニルジイソシアネート、３，３’−ジメチルジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートやこれらの混合物からなる群より選ばれた有機ポリイソシアネート化合物から、イソシアネートのカルボジイミド化を促進する触媒の存在下に製造することにより得られたものであり、
（３）生物学的に活性な物質が、カルボジイミド基と反応性を有する核酸である、
ことを特徴とするものである。
【００１０】
即ち、低分子カルボジイミド誘導体、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドやジ−ｐ−トルオイルカルボジイミドは、エステル及びペプチド等の合成における脱水縮合剤として従来より広く使用されていて、これらのカルボジイミド誘導体は、以下の反応式に示すように容易にカルボン酸と付加体を形成し、更にこの付加体がアルコール、アミン、カルボン酸等と尿素誘導体を放しつつ縮合し、それぞれ相当するエステル、アミド、酸無水物を生成するので、このような低分子カルボジイミド誘導体を活性物質の固定に使用することも考えられた。
【００１１】
【化１】
【００１２】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明で使用される基材としては、活性物質を固定するための支持体としての役割を果たすものであって、基本的には、水或いは溶剤又はそのどちらにも不溶性で且つ常温若しくはその付近の温度範囲内（０〜ｌ００℃）で固体であるもの、例えば、プラスチック、ガラス、金属、カーボン、天然高分子、セラミックが適している。
【００１４】
更に具体的には、
ブラスチック；
ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアクリル樹脂等
無機高分子；
ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル、及びグラファイト等
金属；
金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット及びアパタイト等の常温固体金属
天然高分子；
セルロース、セルロース誘導体、キチン、キトサン及びアルギン酸等
セラミック；
アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び炭化ホウ素等
等を例示することができる。
【００１５】
上記基材の形状としては、例えば、フィルム、板、粒子、成型品（ビーズ、ストリップ、マルチウエルプレートやそのウエル、組立式マルチウエルプレートの個々の単位、マルチウエルプレートのストリップウエル、チューブ、メッシュ、発泡フォーム、膜、紙、針、ファイバー、プレート、スライド及び細胞培養容器）を挙げることができ、又、その大きさについては、当然であるが特に制限はない。
【００１６】
一方、本発明で使用するカルボジイミド基を有する高分子化合物（以下、単にカルボジイミド化合物ということがある）としては、例えば、特開昭５１−６１５９９号公報に開示されている方法やL. M. Alberinoらの方法（J. Appl. Polym. Sci., 21, 190 (1990)）或いは特開平２−２９２３１６号公報に開示されている方法等によって製造することができるポリカルボジイミドを挙げることができる。即ち、有機ポリイソシアネート化合物からイソシアネートのカルボジイミド化を促進する触媒の存在下に製造することができるものである。
【００１７】
上記有機ポリイソシアネート化合物としては、例えば、２，４−トリレンジイソシアネート、２，６−トリレンジイソシアネート、２，４−トリレンジイソシアネートと２，６−トリレンジイソシアネートの混合物、粗トリレンジイソシアネー卜、粗メチレンジフェニルジイソシアネート、４，４’，４”−トリフェニルメチレントリイソシアネート、キシレンジイソシアネート、ヘキサメチレン−１，６一ジイソシアネー卜、リジンジイソシアネート、水添メチレンジフェニルジイソシアネート、ｍ−フェニルジイソシアネート、ナフチレン−１，５−ジイソシアネート、４，４’−ビフェニレンジイソシアネート、ジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネー卜、３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニルジイソシアネート、３，３’−ジメチルジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートやこれらの混合物を挙げることができる。
【００１８】
又、上記ポリカルボジイミドは、その分子量をモノイソシアネートの一種以上を用いることにより、重縮合をある段階で停止させる等して調整しつつ製造されたものでもよい。このようにしてポリカルボジイミドの末端を封止してその分子量を制御するためのモノイソシアネー卜としては、フェニルイソシアネート、（オルト、メ夕、パラ）−トリルイソシアネート、ジメチルフェニルイソシアネート、シクロヘキシルイソシアネート、メチルイソシアネート等を例示することができる。
【００１９】
又、容易に類推されることであるが、この他にも末端封止剤としては、−ＯＨ、−ＮＨ ２ 、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨアルキル末端を有する化合物約１モルと、芳香族ジイソシアネート２モルとの反応によって簡便に製造できるイソシアネート末端化合物から誘導されるものでもよい。
【００２０】
上記有機ポリイソシアネートのカルボジイミド化を促進する触媒としては、種々のものを例示することかできるが、１−フェニル−２−ホスホレン−１−オキシド、３−メチル−１−フェニル−２−ホスホレン−１−オキシド、１−エチル−２−ホスホレン−１−オキシドやこれらの３−ホスホレン異性体等が収率その他の面で好適である。
【００２１】
上記ポリカルボジイミドの製造は、無溶媒又は非反応性の有機溶媒中で行うものであり、本発明ではこれらにより製造したワニス状或いは固体状（粉末）のポリカルボジイミドの一種又は混合物をカルボジイミド化合物の一例として用いることができる。尚、これらのポリカルボジイミドは、基材との結合性を増加させるために、部分的に架橋するようにしてもよい。
【００２２】
他のカルボジイミド化合物、例えば特開昭６３−１７２７１８号公報及び特開昭６３−２６４１２８号公報に記載されるような、分子構造内にポリオキシエチレン鎖を付加してなる親水性を付与されたタイプのカルボジイミド化合物も本発明で使用することができる。
【００２３】
いずれのタイプであっても、本発明で使用するカルボジイミド高分子化合物は、その分子中に２以上１００以下のカルボジイミド基を有しているものであり、このカルボジイミド高分子化合物においてカルボジイミド基の数が２未満、即ち１の場合は生物学的に活性な物質を固定する能力に欠け、又、逆にカルボジイミド基の数が１０１以上の場合は性能面では問題はないが、粘度が高すぎたり、溶液とすることができない場合があり、基材上に担持させる際の取り扱い性が悪化してしまう。
【００２４】
又、本発明で使用するカルボジイミド高分子化合物の分子量の範囲としては、１０００以上であり、１０００００以下である。
【００２５】
尚、例えば、前記有機ポリイソシアネート化合物からイソシアネートのカルボジイミド化を促進する触媒の存在下に製造されたポリカルボジイミドの中には、分子量が１０００に満たないものも存在するが、このようなポリカルボジイミドについては、ポリカルボジイミドの両末端に、ウレア結合又はウレタン結合を介して、ポリアルキレン、ポリオキシアルキレン、ポリウレタン、ポリアミド等を導入し、分子量を前記範囲に調整すればよい。
【００２６】
すでに説明したように、上記カルボジイミド高分子化合物におけるカルボジイミド基の反応性は高く、アルコール、アミン、チオール、フェノール、カルボン酸等の有するほとんどの活性水素基と反応するのであり、前記カルボジイミド誘導体とカルボン酸との反応以外の反応を示せば、例えばアルコールとは、
【化２】
【化３】
【００２７】
本発明で使用する活性物質を固定するための材料は、上記基材と、該基材上に担持された、上記カルボジイミド化合物よりなり、該カルボジイミド化合物の前記基材に対する高い接着性を利用して担持させたものである。尚、ここでいう「担持」とは、水或いは溶媒中で脱離しないことを意味する。
【００２８】
カルボジイミド化合物は、必要に応じ、基材上の全面において担持されても、又、その一部において担持されていてもよく、その代表的な態様は皮膜である。
【００２９】
前記基材上に前記カルボジイミド化合物を担持させる方法としては、スプレー、浸漬、ブラッシング、スタンプ、蒸着、フィルムコー夕ーを用いたコーティング等の公知の手段を採用することができる。
【００３０】
このようにして得られた活性物質を固定するための材料は、カルボジイミド化合物の反応性を利用して、様々な活性物質を固定することができるものであり、このような活性物質としては、核酸を、更に具体的には、ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ＲＮＡを例示することができる。
【００３１】
上記活性物質を固定するための材料により、上記のような活性物質を固定するには、当該材料と活性物質とを接触させればよく、両者の接触は、活性物質の活性が維持されるように、水或いはバッファー中で行うことが好ましく、又、接触の際の温度としては、やはり活性物質の活性が損なわれないように、０〜１００℃とすることが好ましい。
【００３２】
このようにして得られた固定された活性物質は、該活性物質が基材に対し非常に強固に担持されたものであり、イムノアッセイの分野で広く使われている洗浄法（界面活性剤を用いた洗浄法）によっても脱離することがなく、固定化酵素の生理化学工業的利用、抗体或いは抗原固定担体の免疫学的利用、核酸固定担体の診断薬としての利用等の広い利用分野を有している。
【００３３】
尚、現段階では、活性物質の担持される機構（結合様式）は不明であるが、Frederick Kurzer, K. Douraghi-Zadeh, Chemical Reviews, 67, 117-135 (1967)に開示されているような、化学結合と物理吸着の両作用によるものと推測される。
【００３４】
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明する。
【００３５】
【実施例】
カルボジイミド化合物溶液１の製造例
４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート１１７．９ｇとシクロヘキシルイソシアネート１２．５ｇをカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニル−２−ホスホレン−１−オキシド）１．３ｇと共に窒素雰囲気下、１８０℃で４日間反応させ、室温で粉末状のカルボジイミド化合物（重合度１０、数平均分子量２４００）を得た。この１０ｇを取り、メタノール１００ｍｌに分散溶解させ、カルボジイミド化合物溶液１を得た。
【００３６】
カルボジイミド化合物溶液２の製造例
イソホロンジイソシアネー卜１９．９ｇとｎーブチルイソシアネー卜２．０ｇをカルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニル−２−ホスホレン−ｌ−オキシド）０．２ｇと共に窒素雰囲気下、１８０℃で３日間反応させ、室温で粉末状のカルボジイミド化合物（重合度１０、数平均分子量１９００）を得た。この１０ｇを取り、ジクロロメタン１００ｍｌに溶解し、カルボジイミド化合物溶液２を得た。
【００３７】
カルボジイミド化合物溶液３の製造例
２，４−トリレンジイソシアネート／２，６−トリレンジイソシアネートの混合物（混合割合＝８０：２０）７８．４ｇとフェニルイソシアネート１１．９ｇとをテトラクロロエチレン６１５ｇ中で、カルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニルホスホレン−１−オキシド）０．９ｇと共に窒素雰囲気下、７５℃で２４時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液３（重合度１０、数平均分子量１５００）を得た。
【００３８】
カルボジイミド化合物溶液４の製造例
４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート１１２．６ｇとフェニルイソシアネート１１．９ｇとをテトラヒドロフラン９２２．７ｇ中で、カルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホスホレン−１−オキシド）１．２ｇと共に窒素雰囲気下、７５℃で１６時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液４（重合度１０、数平均分子量２３００）を得た。
【００３９】
カルボジイミド化合物溶液５の製造例
ｍ−テトラメチルキシリレンジイソシアネート７００ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホスホレン−１−オキシド）１４ｇを窒素雰囲気下、１８０℃で１２時間反応させ、イソシアネート末端テトラメチルキシリレンカルボジイミド（重合度＝３）を得た。次いで、得られたカルボジイミド７４．６ｇと重合度６のポリ（オキシエチレン）モノメチルエーテル６３．６ｇを１００℃で４８時間反応させた。これを１０ｇ取り、５０℃で蒸留水９０ｇを徐々にカルボジイミド化合物溶液５（数平均分子量１４００）を得た。
【００４０】
カルボジイミド化合物溶液６の製造例
４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート１６２ｇをテトラヒドロフラン８８６ｇ中でカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホスホレン−１−オキシド）０．３３ｇと共に窒素雰囲気、リフラックス下で７時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液６（重合度６０、数平均分子量１３０００、ポリマー濃度１５重量％）を得た。
【００４１】
カルボジイミド化合物溶液７の製造例
ｍ−テトラメチルキシリレンジイソシアネート７００ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホスホレン−１−オキシド）１４ｇを窒素雰囲気下、１８０℃で１８時間反応させ、イソシアネート末端テトラメチルキシリレンカルボジイミド（重合度＝４）を得た。次いで、得られたカルボジイミド５０．２ｇと２−ジメチルアミノエタノール８．９ｇを８０℃で２４時間反応させた後、ｐ−トルエンスルホン酸メチル１８．６ｇを加え１時間反応させた。これに蒸留水６９９．３ｇを徐々に加え、カルボジイミド化合物溶液７（数平均分子量１６００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４２】
カルボジイミド化合物溶液８の製造例
イソホロンジイソシアネー卜２０ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニル−２−ホスホレン−ｌ−オキシド）０．２ｇを窒素雰囲気下、１８０℃で１８時間反応させ、イソシアネート末端イソホロンカルボジイミド（重合度＝４）を得た。次いで、得られたカルボジイミド７．５６ｇと３−ジメチルアミノ−ｎ−プロピルアミン２．０４ｇを８０℃で１時間反応させた後、ｐ−トルエンスルホン酸メチル３．７２ｇを加え、１時間反応させた。これに蒸留水１２０ｇを徐々に加え、カルボジイミド化合物溶液８（数平均分子量１４００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４３】
カルボジイミド化合物溶液９の製造例
４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート１１７．９ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニル−２−ホスホレン−ｌ−オキシド）１．２ｇを窒素雰囲気下、１８０℃で８時間反応させ、イソシアネート末端ジシクロヘキシルカルボジイミド（平均重合度＝２．４）を得た。次いで、得られたカルボジイミド７．８５ｇと重合度約６のポリ（オキシエチレン）モノメチルエーテル５．９２ｇを１００℃で４８時間反応させた。これに蒸留水１２４ｇを徐々に加え、カルボジイミド化合物溶液９（数平均分子量１３００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４４】
カルボジイミド化合物溶液１０の製造例
４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート１５ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニル−２−ホスホレン−ｌ−オキシド）０．１ｇをテトラヒドロフラン１４５ｇ中、窒素雰囲気下、７５℃で８時間反応させ、イソシアネート末端ジフェニルメタンカルボジイミド（重合度＝５）を得た。次いで、得られたカルボジイミド溶液に重合度約１０のポリ（オキシエチレン）モノメチルエーテル９．４４ｇを加え、７５℃で４８時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液１０（数平均分子量２１００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４５】
カルボジイミド化合物溶液１１の製造例
２，４−トリレンジイソシアネート／２，６−トリレンジイソシアネートの混合物（混合割合＝８０：２０）１３．９ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニルホスホレン−１−オキシド）０．１ｇをテトラヒドロフラン１５０ｇ中、窒素雰囲気下、７５℃で８時間反応させ、イソシアネート末端トリレンカルボジイミド（重合度＝４）を得た。得られたカルボジイミド溶液にヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム１．６２ｇを加え、７５℃で２４時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液１１（数平均分子量１０００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４６】
カルボジイミド化合物溶液１２の製造例
４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート２４ｇと平均分子量４００のポリエチレングリコール２０ｇをテトラヒドロフラン４４０ｇに加え反応させた。次に、カルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニルホスホレン−１−オキシド）０．２ｇを加え、窒素雰囲気下、７５℃で４８時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液１２（数平均分子量５３００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４７】
カルボジイミド化合物溶液１３の製造例
４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート５２．４ｇと１，４−ジアミノブタン８．８ｇをテトラヒドロフラン６２０ｇに加え反応させた。次に、カルボジイミド化触媒（３−メチル−ｌ−フェニルホスホレン−１−オキシド）０．５ｇを加え、窒素雰囲気下、７５℃で４８時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液１３（数平均分子量３７００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。
【００４８】
実施例１
（１）マイクロプレート上へのＤＮＡオリゴマーの固定。
ファージベクターＭ１３ｍｐ１８のｌａｃ’Ｚ領域中のマルチクローニングサイトの中から２９ｂａｓｅを選定し、ＤＮＡ合成機（MILLIPORE社製、Cyclone Plus DNA/RNA Synthesizer）により、以下の塩基配列のＤＮＡを合成した。この合成ＤＮＡの５’末端には、選択的にストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲートタンパクを結合するために、ビオチンフォスフォルアミダイト（MILLIPORE社製）を組み込んだ。尚、ビオチンフォスフォルアミダイトは、Ｂで示した。
塩基配列１
５’ＢＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ３’
【００４９】
ポリスチレン製の９６穴マイクロプレートのウェル５穴にカルボジイミド化合物溶液１の０．１ｍｌを加え、６０℃で１時問インキュベー卜した。ウェルをエタノールでよく洗浄し、６０℃で３０分乾燥した。ビオチン標識されたＤＮＡオリゴマー溶液（上記塩基配列１の１０ｐｍｏｌ／ｍｌ濃度の水溶液）０．１ｍｌをポリカルボジイミドで被覆されたウェルと被覆処理を施していないウェル（ブランク）のおのおの５穴づつに（試料番号１〜５）に分注し、３７℃で２時間固定した。固定化後、滅菌水０．３ｍｌで５、６回よく洗浄し、６０℃で３０分乾操した。保存は、冷暗所乾燥雰囲気中で行った。
【００５０】
（２）検出
ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲートのウェル表面への非特異的吸着を押さえる（ブロッキングする）ため、ＤＮＡ固定化処理を施したウェルに、３％ＢＳＡ溶液（3% Bovine Serum Albumin (BSA)/0.2M NaCl/01M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）０．２ｍｌを加え、３７℃で３０分インキュベー卜した。ＢＳＡ溶液を吸引除去後、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液（125pg/ml Streptavidin-Alkaline Phosphatase conjugate (CLONTECH製)/0.2M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）０．１ｍｌを加え、室温で３０分インキュベートした。ついで、洗浄液１（0.2M NaCl/0.1M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）０．３ｍｌで１０分づつ３回洗浄し、更に、洗浄液２（0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）０．３ｍｌで１回洗浄した後、基質溶液（1mg p-Nitrophenylphosphate disodium salt hexahydrate/0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）０．１ｍｌを加え、室温で２時間発色反応させた。２時間経過後、各ウェル中の溶液の吸光度を分光光度計を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００５１】
実施例２
（１）マイクロプレート上へのストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲートの固定
ポリスチレン製の９６穴マイクロブレートのウェル５穴（試料番号６〜１０）にカルボジイミド化合物溶液１の０．１ｍｌを加え、６０℃で１時間インキュベートした。ウェルをメタノールでよく洗浄し、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液（125pg/ml Streptavidin-Alkaline Phosphatase conjugate (CLONTECH製)/0.2M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）０．１ｍｌを加え、３７℃で３０分インキュベートした。
【００５２】
（２）検出
洗浄液１（０．２Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）０．３ｍｌで１０分づつ３回洗浄し、更に、洗浄液２（０．１Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ９．５／５０ｍｌＭｇＣｌ２）０．３ｍｌで１回洗浄した後、基質溶液（１ｍｇ ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ／０．１ＭＮａＣｌ／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ９．５／５０ｍｌ ＭｇＣｌ２）０．１ｍｌを加え、室温で２時間発色反応させた。２時間経過後、各ウェルについて視覚による発色判定を行うと共に、各ウェル中の溶液の吸光度を分光光度計を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００５３】
実施例３
基材としてのポリスチレン製マイクロプレート（SUMILON ELISA用９６Ｆプレートtype C（住友ベークライト社製、表面：カルボキシキ基）と、カルボジイミド化合物溶液５、７、８、９を用い、実施例１と同様の試験を行った。結果を表１に示す。
【００５４】
実施例４
基材としての、実施例３で使用したものと同様のポリスチレン製マイクロプレートと、カルボジイミド化合物溶液５、７、８、９を用い、実施例２と同様の試験を行った。結果を表１に示す。
【００５５】
実施例５
実施例１と同様の方法により、カルボジイミド化合物溶液１を被覆したマイクロプレートに０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）で希釈したＡＣＴＨペプチドオリゴマー（ペニンシュラ社製）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌを分注し、軽く浸透後、溶液を捨て、ペーパータオルで軽くふき、未固定のＡＴＣＨペプチドオリゴマーを排除した。この操作を３回繰り返した。ブロッキング液（１０％ＢＳＡを含む０．０１ＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０）０．２ｍｌをウェルに分注し、３７℃で３０分反応させた。ウェルの溶液を捨て、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを分注し、洗浄した。この操作を３回繰り返した。坑ＡＣＴＨマウスＩｇＧ（ＣＹＭＢＵＳバイオサイエンスリミテッド社製、１ｍｇ／ｍｌの５０％グリセロース溶液）を０．０１ＭのＨＥＰＲＳ（ｐＨ７．０）で１００倍に希釈した溶液０．１ｍｌをウェルに分注し、室温で３０分反応させた反応後、溶液を捨て、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを分注し、洗浄した。この操作を３回繰り返した。坑マウスＩｇＧヤギＩｇＧ−アルカリフォスファターゼコンジュゲート（Kirkegaaer & Perrラボラトリー社製、１ｍｇ／ｍｌの５０％グリセロース溶液）を０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０で１０００倍に希釈した溶液０．０１ｍｌを加え、室温で３０分反応させた。反応後、溶液を捨て０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを分注し洗浄した。この操作を３回繰り返した。ウェルに基質溶液（５０ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ１０．０）、５ｍＭＭｇＣｌ2、５ｍＭｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム）０．０１ｍｌを加え、３０℃で１時間反応させた。０．１Ｎ水酸ナトリウム水溶液０．２ｍｌを加え、反応を停止させた。吸光光度計で４０５ｎｍの吸収値を測定した。同様の操作を５個のウェル（試料番号１〜５）で行った。結果を表１に示す。
【００５６】
実施例６
ポリスチレンビーズ［Poly(styrene-2% divinyl benzene), 200-400mesh］５ｇをカルボジイミド化合物溶液１、２、３、４、６、１０、１１、１２、１３の希釈液（ＴＨＦで１０倍希釈）１００ｍｌに３０分間浸漬した後、６０℃で３時間乾燥し、カルボジイミド化合物被覆ビーズを得た。このカルボジイミド化合物被覆ビーズと被覆を施していないビーズ（ブランク）のそれぞれ１ｇを、実施例１で用いたビオチン標識ＤＮＡオリゴマー溶液１μｇ／１０ｍｌに３７℃で２時間浸漬後、ビーズをガラスフィルターでろ別し、蒸留水５００ｍｌで洗浄、乾燥し、ＤＮＡ固定ビーズを得た。次いで、実施例１と同様、ブロッキング、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート処理、洗浄を行ない、基質溶液３ｍｌに加え、２時間後の溶液の４０５ｎｍの吸光度を分光光度計を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００５７】
実施例７
実施例６と同様の方法で作成したカルボジイミド化合物被覆ビーズと被覆を施していないビーズ（ブランク）のそれぞれ１ｇを、実施例２で用いたストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液３ｍｌに室温で２時間浸漬後、ビーズをガラスフィルターでろ別し、蒸留水５００ｍｌで洗浄、乾燥し、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート固定ビーズを得た次いで、実施例２と同様に洗浄を行い、基質溶液３ｍｌに加え、２時間後の溶液の４０５ｎｍの吸光度を分光光度計を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００５８】
実施例８
（１）ＰＥＴフィルム上へのＤＮＡオリゴマーの固定
ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムを１ｃｍ×５ｃｍの長方形に切断し、このフィルム上にカルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１０〜１３の各々０．５ｍｌをスピンコーターで被覆した。このフィルムを８０℃で３０分乾燥し、カルボジイミド化合物で被覆したフィルムを得た。ビオチン標識されたＤＮＡオリゴマー溶液（塩基配列１のｌ００ｐｍｏｌ／ｍｌ濃度水溶液）ｌμｌをカルボジイミド化合物で被覆したフィルムと被覆処理を施していないフィルム（ブランク）におのおの３ドットづつブロットし、室温で１０分間固定した。
【００５９】
（２）検出
検出は、CLONTECH社のGENE-TECT Detection Systemを用い、操作は、そのDetection Protocolに従った。以下に説明する。
（ａ）ブロッキング
ハイブリバックにＤＮＡ固定フィルムを入れ、３％ＢＳＡ溶液２ｍｌを加え、３７℃、３０分インキュベートする。
（ｂ）ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲートの結合
ＢＳＡ溶液を吸引除去後、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液１ｍｌを加え、室温、３０分インキュベートする。
（ｃ）洗浄
洗浄液１（0.2M NaCl/0.1M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）の２ｍｌで１０分づつ３回洗浄する。
（ｄ）バッファー交換
洗浄液２（0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）の２ｍｌで１回置換する。
（ｅ）発色操作
基質溶液（洗浄液２（0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）の１ｍｌ＋ＢＣＩＰ溶液（50mg 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/900ml Dimethylformamide）３．２μｌ＋ＮＢＴ液（50mg Nitro Blue Tetrazolium/1.8ml 70% methanol）６．４μｌ）１ｍｌを加え、室温の暗所で３時間発色反応させる。
（ｆ）結果
結果を表２に示す。
【００６０】
実施例９
（ｌ）ＰＥＴ上へのストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートの固定
実施例３と同様の方法でカルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１０〜１３を被覆したフィルムに、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲート溶液（125pg/ml Streptavidin-Alkaline Phosphatase conjugate (CLONTECH製/0.2M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）をカルボジイミド化合物で被覆したフィルムと被覆処理を施していないフィルム（ブランク）におのおの３ドットづつブロットし、室温でｌ０分間固定した。
【００６１】
（２）検出
（ａ）洗浄
洗浄液１（0.2M NaCl/0.1M Tris HCl, 0.05% Triton-X-100）の２ｍｌでｌ０分づつ３回洗浄した。
（ｂ）バッファー交換
洗浄液２（0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）の２ｍｌでｌ回置換した。
（ｃ）発色操作
基質溶液（洗浄液２（0.1M NaCl/0.1M Tris HCl, pH9.5/50ml MgCl2）の１ｍｌ＋ＢＣＩＰ溶液（50mg 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/900ml Dimethylformamide）３．２μｌ＋ＮＢＴ液（50mg Nitro Blue Tetrazolium/1.8ml 70% ethanol）６．４μｌ）１ｍｌを加え、室温の暗所で３時間発色反応させた。
（ｄ）結果
結果を表２に示す。
【００６２】
実施例１０
（１）ガラス上へのＤＮＡオリゴマーの固定
実施例３と同様の方法でガラス表面にカルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１０〜１３を被覆し、実施例３と同様の方法によりＤＮＡを固定した。
（２）検出
実施例３と同様の方法により固定ＤＮＡを検出した。結果を表２に示す。
【００６３】
実施例１１
（１）ガラス上へのストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲー卜の固定
実施例３と同様の方法でガラス表面に１０％カルボジイミド化合物溶液１〜４６、１０〜１３を被覆し、実施例４と同様の方法によりストレプトアビジンアルカリホスファ夕ーゼコンジュゲートを固定した。
（２）検出
実施例４と同様の方法により固定ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュケートを検出した。結果を表２に示す。
【００６４】
実施例１２
（１）銅板上へのＤＮＡオリゴマーの固定
実施例３と同様の方法で銅板表面にｌ０％カルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１０〜１３を被覆し、実施例３と同様の方法によりＤＮＡを固定した。
（２）検出
実施例３と同様の方法により画定ＤＮＡを検出した。結果を表２に示す。
【００６５】
実施例１３
（１）銅板上へのストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲー卜の固定
実施例３と同様の方法で銅板表面にｌ０％カルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１０〜１３を被覆し、実施例４と同様の方法によりストレプトアビジンアルカリホスファ夕ーゼコンジュゲートを固定した。
（２）検出
実施例４と同様の方法により固定ストレプトアビジンアルカリホスファ夕ーゼコンジュゲートを検出した。結果を表２に示す。
【００６６】
尚、上記実施例８〜１３について、各々の基材上の被覆厚みを測定したところ０．５〜１μｍであった。又、各々の被覆表面の赤外吸収を測定したところ２１００ｃｍ−１付近のカルボジイミドに特有の吸収があり、基材上の被覆はカルボジイミド化合物であることが確かめられた。
【００６７】
実施例１４
ろ紙（Whatman社製、ろ紙番号４２）をカルボジイミド溶液１、２、３、４、６、１１、１０、１２、１３の希釈液（ＴＨＦで２０倍希釈）に１０秒間浸漬した後、６０℃、３０分間乾燥し、カルボジイミド化合物被覆ろ紙を得た。このろ紙に、実施例３と同様の方法によりＤＮＡを固定し、検出した。結果を表２に示す。
【００６８】
実施例１５
実施例１４と同法により作成したカルボジイミド化合物被覆ろ紙に、実施例４と同法でストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを固定し検出した。結果を表２に示す。
【００６９】
実施例１６
ミクロフィルター（富士フィルム社製、ＦＲタイプ、孔径０．７μｍ）をカルボジイミド化合物溶液１、２、３、４、６、１０、１１、１２、１３の希釈液（ＴＨＦで２０倍希釈）１０秒間浸漬した後、６０℃で３０分間乾燥し、カルボジイミド化合物ブロックティングメンブレンを得た。このメンブレンを用い、サザンハイブリダイゼーションをMolecular Cloning 9.31-9.51(Molecular Cloning, a laboratory manual second edition, cold Spring Harbor Laboratory press 1989)に従って行った。
【００７０】
試験材料は、ＤＮＡ分子量マーカー（宝酒造社製、DNA MW Satndard Markers,λ-Hind III Digest）１μｇを１％アガロースゲル電気泳動で分画した後このメンブレンにキャピラリトランスファーした。次いで、λＤＮＡ（宝酒造社製、bacteriophage λcI 857 Sam7 NAs）を基に、 STRATAGENE社製、Random primer Briotinylation Kitを用いて作製したビオチン化プローブ０．５μｇをハイブリダイズした。尚、トランスファー後、ニトロセルロースメンブレンに行われるべーキングやナイロンメンブレンに行われているＵＶ照射という操作は、本カルボジイミド化合物コートメンブレンに対しては行われず、直ちにハイブリダイゼーションの操作に移行した。さらに、検出は、 STRATAGENE社製、Flash(登録商標） Detection Systemにより行った。その結果、アガロース電気泳動により分画されたフラグメントの電気泳動パターン通りのシグナルが、Ｘ線フィルムで検出された。
【００７１】
比較例１〜１５
カルボジイミド化合物を用いない他は各々実施例１〜１５と同様に処理して比較例とした。結果は表１、２の「未被覆」の項に示す。
【００７２】
比較例１７（従来法によるＤＮＡの検出）
（従来法であるグルタルアルデヒドを用いた修飾ＤＮＡの化学結合による固定化の例）
ファージベクターＭ１３ｍｐ１８のｌａｃ’Ｚ領域中のマルチクローニングサイトの中から２９ｂａｓｅを選定し、ＤＮＡ合成機（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、ＣｙｃｌｏｎｅＰｌｕｓ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｓｉｚｅｒ）により、以下の塩基配列のＤＮＡを合成した。この合成ＤＮＡの３’未端から２番目の配列の位置には、選択的にストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲートタンパクを結合するために、ビオチンフォスフォルアミダイト（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を、５’末端には、アミノリンカー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）組み込んだ。尚、ビオチンフォスファルアミダイトはＢで、アミノリンカーはＨ ２ Ｎ−で示した。
塩基配列２
５’Ｈ ２ Ｎ−ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＣＧＧ ＧＴＡ ＣＣＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＡＡＴ ＴＢＣ ３’
【００７３】
ポリスチレン製マイクロブレート（SUMILON ELISA用96FプレートType A（住友ベークライト社製、表面はアミノ基）の５穴に２％グルタルアルデヒド（電子顕微鏡グレード）溶液（２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）０を０．１ｍｌづつ分注し、室温で２時間放置した。水で２回洗浄後、アミノリンカー修飾−ビオチン標識ＤＮＡオリゴマー溶液（上記塩基配列２の１０ｐｍｏｌ／ｍｌ濃度水溶液溶液）０．１ｍｌを２％グルタルアルデヒド処理ウェル５穴（試料番号１〜５）に分注し、３７℃で２時間固定した。検出は上記実施例１で行った方法と同様の方法で行った。結果を表１に示す。
【００７４】
【表１】
【発明の効果】
上記表１及び表２から明らかなように、本発明は、容易に生物学的に活性物質を固定することができ、取り扱いも簡単な材料、及び、容易に生物学的に活性物質を固定するための方法を提供する優れたものということができる。
Claims (3)
- 基材及び該基材上に担持されたカルボジイミド基を有する高分子化合物よりなる固定用の材料と、カルボジイミド基との反応性を有する生物学的に活性な物質を接触させる生物学的に活性な物質を固定するための方法であって、
（１）基材が、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子又はセラミックからなる群より選ばれたものであり、
（２）カルボジイミド基を有する高分子化合物が、分子内に２以上１００以下のカルボジイミド基を有すると共に、分子量が１０００以上１０００００以下であり、且つ、２，４−トリレンジイソシアネート、２，６−トリレンジイソシアネート、２，４−トリレンジイソシアネートと２，６−トリレンジイソシアネートの混合物、粗トリレンジイソシアネー卜、粗メチレンジフェニルジイソシアネート、４，４’，４”−トリフェニルメチレントリイソシアネート、キシレンジイソシアネート、ヘキサメチレン−１，６一ジイソシアネー卜、リジンジイソシアネート、水添メチレンジフェニルジイソシアネート、ｍ−フェニルジイソシアネート、ナフチレン−１，５−ジイソシアネート、４，４’−ビフェニレンジイソシアネート、ジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネー卜、３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニルジイソシアネート、３，３’−ジメチルジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートやこれらの混合物からなる群より選ばれた有機ポリイソシアネート化合物から、イソシアネートのカルボジイミド化を促進する触媒の存在下に製造することにより得られたものであり、
（３）生物学的に活性な物質が、カルボジイミド基と反応性を有する核酸である、
ことを特徴とする生物学的に活性な物質を固定するための方法。 - カルボジイミド基を有する化合物が、基材上の全面或いはその一部に担持されている請求項１に記載の生物学的に活性な物質を固定するための方法。
- カルボジイミド基を有する化合物が、皮膜として担持されている請求項２に記載の生物学的に活性な物質を固定するための方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19103594A JP3708567B2 (ja) | 1994-07-20 | 1994-07-20 | 生物学的に活性な物質を固定するための方法 |
| EP95110838A EP0710666B1 (en) | 1994-07-20 | 1995-07-11 | Material used for immobilization of biologically active substance and method for immobilization of said substance using said material |
| DE69526479T DE69526479T2 (de) | 1994-07-20 | 1995-07-11 | Stoff für die Immobilisierung von biologisch-aktiver Substanz und Verfahren zur Immobilisierung von dieser Substanz unter Gebrauchnahme selbigen Stoffes |
| US09/009,541 US6017742A (en) | 1994-07-20 | 1998-01-20 | Immobilization of biologically active substances on a carrier containing a carbodiimide group-containing polymer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19103594A JP3708567B2 (ja) | 1994-07-20 | 1994-07-20 | 生物学的に活性な物質を固定するための方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0823975A JPH0823975A (ja) | 1996-01-30 |
| JP3708567B2 true JP3708567B2 (ja) | 2005-10-19 |
Family
ID=16267817
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19103594A Expired - Fee Related JP3708567B2 (ja) | 1994-07-20 | 1994-07-20 | 生物学的に活性な物質を固定するための方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6017742A (ja) |
| EP (1) | EP0710666B1 (ja) |
| JP (1) | JP3708567B2 (ja) |
| DE (1) | DE69526479T2 (ja) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3517031B2 (ja) * | 1995-06-09 | 2004-04-05 | 日清紡績株式会社 | 生物学的活性物質の分析法 |
| GB9727126D0 (en) * | 1997-12-22 | 1998-02-25 | Zeneca Ltd | Process |
| JPH11189666A (ja) | 1997-12-26 | 1999-07-13 | Showa Sangyo Co Ltd | 多糖類成形体に耐水性を付与する方法 |
| DE69932164D1 (de) * | 1998-04-28 | 2006-08-10 | Inex Pharmaceuticals Corp | Polyanionische polymere mit verbesserter fusogenfähigkeit |
| US6986902B1 (en) | 1998-04-28 | 2006-01-17 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Polyanionic polymers which enhance fusogenicity |
| JP3445501B2 (ja) | 1998-09-04 | 2003-09-08 | 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 | シート状部材積層体及びシート状プローブ保持体の製造方法 |
| US20010055762A1 (en) * | 1998-10-11 | 2001-12-27 | Osamu Suzuki | Carrier for immobilizing biologically active substance |
| DE19908525C2 (de) * | 1999-02-26 | 2001-05-31 | Inst Chemo Biosensorik | Wasserlösliches Copolymer und Verwendung hiervon |
| US7011940B1 (en) | 1999-04-14 | 2006-03-14 | Medical Discovery Partners Llc | Quality control for cytochemical assays |
| EP1063301A3 (en) * | 1999-06-21 | 2002-02-27 | Nisshinbo Industries, Inc. | Substrate carrying immobilised nucleic acid molecules |
| JP2001149060A (ja) | 1999-11-29 | 2001-06-05 | Nisshinbo Ind Inc | 核酸固定化基板 |
| JP2001281246A (ja) * | 2000-01-26 | 2001-10-10 | Nisshinbo Ind Inc | 固定化核酸及び核酸の検出法 |
| EP1130120A3 (en) * | 2000-01-26 | 2004-02-04 | Nisshinbo Industries, Inc. | Method for separating and collecting nucleic acids |
| KR20030029928A (ko) * | 2000-09-06 | 2003-04-16 | 도요 고한 가부시키가이샤 | 표면처리층이 형성된 고체 지지체 |
| US6852492B2 (en) * | 2001-09-24 | 2005-02-08 | Intel Corporation | Nucleic acid sequencing by raman monitoring of uptake of precursors during molecular replication |
| EP1486561B1 (en) * | 2001-12-26 | 2013-12-04 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe medium |
| US20060263884A1 (en) * | 2003-01-21 | 2006-11-23 | Hammerstedt Roy H | Use of passageways through porous membranes |
| US7534621B2 (en) | 2003-02-07 | 2009-05-19 | Canon Kabuhsiki Kashia | Method of producing probe medium and method of immobilizing probe using probe medium |
| US6861251B2 (en) * | 2003-02-24 | 2005-03-01 | Pritest, Inc. | Translucent solid matrix assay device for microarray analysis |
| JP3954522B2 (ja) * | 2003-04-18 | 2007-08-08 | 日清紡績株式会社 | 生物学的活性物質を固定化した素子 |
| JP4367901B2 (ja) | 2003-06-20 | 2009-11-18 | キヤノン株式会社 | スポット・パターン暗号化機能を具えるスポッター、ならびにスポット・パターン暗号化に対応した検出装置 |
| US8367324B2 (en) | 2003-11-17 | 2013-02-05 | Canon Kabushiki Kaisha | Method for judging change in probe-bearing substrate, probe-bearing substrate and detecting apparatus |
| CN1926245A (zh) | 2004-02-25 | 2007-03-07 | 三得利株式会社 | 细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒 |
| US20060258875A1 (en) * | 2005-05-10 | 2006-11-16 | Clementine Reyes | Methods for manufacturing supported nanocatalysts and methods for using supported nanocatalysts |
| JP4697944B2 (ja) * | 2005-06-10 | 2011-06-08 | キヤノン株式会社 | 非特異吸着を低減するプローブ固定担体の製造方法 |
| JP4789518B2 (ja) * | 2005-06-30 | 2011-10-12 | キヤノン株式会社 | 製造条件付きプローブ固定担体を用いた標的物質の検出方法ならびにそのための装置、キット及びシステム |
| US8097229B2 (en) * | 2006-01-17 | 2012-01-17 | Headwaters Technology Innovation, Llc | Methods for manufacturing functionalized inorganic oxides and polymers incorporating same |
| US20070218038A1 (en) * | 2006-03-17 | 2007-09-20 | Pegasus Biologics, Inc. | Stabilized, sterilized collagen scaffolds with active adjuncts attached |
| JP2007304043A (ja) * | 2006-05-15 | 2007-11-22 | Canon Inc | プローブ固定担体の製造方法 |
| US8889373B2 (en) | 2010-08-12 | 2014-11-18 | Eastman Chemical Company | Enzyme catalyst immobilized on porous fluoropolymer support |
| CN102323409B (zh) * | 2011-01-17 | 2014-03-05 | 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 | 一种病毒感染检测方法 |
| US8778456B2 (en) * | 2011-08-30 | 2014-07-15 | Basf Se | Coating composition including high molecular weight polycarbodiimide, method of preparing same, and method of preparing coating on a substrate |
| PL2751154T3 (pl) | 2011-08-30 | 2020-02-28 | Basf Se | Polikarbodiimid o wysokiej masie cząsteczkowej i sposób jego wytwarzania |
| US10058502B2 (en) | 2015-12-31 | 2018-08-28 | L'oreal | Nail polish compositions |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3929733A (en) | 1974-10-02 | 1975-12-30 | Upjohn Co | Polycarbodiimides from 4,4{40 -methylenebis(phenyl isocyanate) and certain carbocyclic monoisocyanates |
| CA1099844A (en) * | 1976-10-08 | 1981-04-21 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Silane-terminated polycarbodiimide |
| US4289853A (en) * | 1977-10-03 | 1981-09-15 | Illinois Water Treatment Company | High loading of immobilized enzymes on activated carbon supports |
| JPS6014909A (ja) * | 1983-07-06 | 1985-01-25 | Bridgestone Corp | 吸着材 |
| DE3643241C2 (ja) * | 1985-03-29 | 1990-07-26 | Nisshinbo Industries, Inc., Tokio/Tokyo, Jp | |
| US4757014A (en) * | 1985-11-08 | 1988-07-12 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Immobilization of biologically active protein on a polymeric fibrous support |
| US4820863A (en) | 1986-03-31 | 1989-04-11 | Union Carbide Corporation | Surface active polycarbodiimides |
| KR930003015B1 (ko) | 1986-12-30 | 1993-04-16 | 유니온 카바이드 코포레이션 | 계면활성 폴리카보디이미드 |
| JP2769852B2 (ja) | 1989-05-02 | 1998-06-25 | 日清紡績株式会社 | 高分子量ポリカルボジイミド溶液及びその製造方法 |
| JPH0354109A (ja) * | 1989-07-21 | 1991-03-08 | Nisshinbo Ind Inc | 活性炭及びその製造方法 |
| ATE159745T1 (de) * | 1989-08-21 | 1997-11-15 | Mag Georg Mayrhofer & Co Ohg | Immobilisierung von molekülen durch verwendung von radioderivatisierten polymeren |
| JP3188959B2 (ja) * | 1992-08-10 | 2001-07-16 | 日清紡績株式会社 | ポリカルボジイミド樹脂の製造方法 |
| US5350800A (en) * | 1993-01-19 | 1994-09-27 | Medtronic, Inc. | Method for improving the biocompatibility of solid surfaces |
| US5416193A (en) * | 1993-04-30 | 1995-05-16 | Pfizer Inc. | Coupling reagent and method |
-
1994
- 1994-07-20 JP JP19103594A patent/JP3708567B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-07-11 EP EP95110838A patent/EP0710666B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-11 DE DE69526479T patent/DE69526479T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-01-20 US US09/009,541 patent/US6017742A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69526479T2 (de) | 2002-11-07 |
| DE69526479D1 (de) | 2002-05-29 |
| EP0710666B1 (en) | 2002-04-24 |
| EP0710666A1 (en) | 1996-05-08 |
| US6017742A (en) | 2000-01-25 |
| JPH0823975A (ja) | 1996-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3708567B2 (ja) | 生物学的に活性な物質を固定するための方法 | |
| JP3517031B2 (ja) | 生物学的活性物質の分析法 | |
| EP1787120B1 (en) | Alleviation of non-specific binding in microarray assays | |
| US5622826A (en) | Method for immobilization of molecules on platinum solid support surfaces | |
| US4954444A (en) | Enzyme immobilization and bioaffinity separations with perfluorocarbon polymer-based supports | |
| US7638464B2 (en) | Three dimensional format biochips | |
| US20030134294A1 (en) | Method for immobilizing a biologic in a polyurethane-hydrogel composition, a composition prepared from the method, and biomedical applications | |
| EP1779113A1 (en) | Microarrays utilizing hydrogels | |
| WO2006023324A1 (en) | Protein microarrays | |
| EP1328810B1 (en) | Three dimensional format biochip | |
| Wu et al. | Comparison of hydroxylated print additives on antibody microarray performance | |
| WO2004056846A2 (en) | Special film-coated substrate for bio-microarray fabrication and use thereof | |
| JP4197279B2 (ja) | 生体由来物検出用基板及びその製造方法 | |
| US20050100951A1 (en) | 3D format biochips and method of use | |
| Braatz et al. | A new hydrophilic polymer for biomaterial coatings with low protein adsorption | |
| EP1001267A2 (en) | Carrier for immobilizing biologically active substance | |
| JP2001066304A (ja) | 核酸固定化基板 | |
| AU2002246918B9 (en) | Three dimensional biochip | |
| AU2002246918B8 (en) | Three dimensional biochip | |
| JP2000146978A (ja) | 生物学的活性物質の固定化用担体 | |
| AU2002246918A1 (en) | Three dimensional biochip |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040622 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040823 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041207 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050308 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050506 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050613 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20050616 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050719 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050804 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |