JP2001149060A - 核酸固定化基板 - Google Patents

核酸固定化基板

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 基材上に核酸を簡便に効率よく導入すること
が可能であり且つ簡易な装置で作製可能な、核酸を担体
上にその長さに関係なく微小な点状に強固に固定化した
核酸固定化基板を提供する。 【解決手段】 基材と、この基材上に担持されたアルキ
ル化基を有する化合物とを有する担体の複数箇所に、同
一または異なる核酸が前記アルキル化基を介して点状に
固定化されたことを特徴とする核酸固定化基板。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸固定化基板に関
する。詳しくは、核酸を担体上に簡便かつ効率的に固定
化できる核酸固定化基板及びその製造方法、さらにそれ
を利用した分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡチップ等に用いられる、核酸等を
担体上に固定した核酸固定化基板を作製する方法として
は、次の２つの方法が主に用いられている。
【０００３】ポリ−Ｌ−リジン等をコートした基材を
担体として用いて物理吸着により核酸を固定化する方法
（特表平１０−５０３８４１号）。
【０００４】基材上でＤＮＡを合成する方法（ＷＯ９
７１０３６５）。
【０００５】しかし、上記方法のうち特表平１０−５０
３８４１号公報記載の方法を用いてハイブリダイゼーシ
ョンを行った場合、特に操作過程で基板から核酸が剥が
れ落ち、結果として検出感度が下がったり、得られる結
果にバラツキを生じ再現性が得られない等の欠点があっ
た。さらに、この方法では、長い核酸は固定化できる
が、オリゴマー等の約５０ｍｅｒ以下の短い核酸になる
と効率良く固定化できないという欠点があった。
【０００６】また、ＷＯ９７１０３６５公報記載の方法
においては、基材上でＤＮＡを合成するために極めて特
殊な機械と試薬が必要であり、誰でも気軽にできるとい
うものではなかった。さらに、合成できる核酸も２５ｍ
ｅｒ程度までに限られるという欠点があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、基材上に核酸を簡便に効率よく
導入することが可能であり且つ簡易な装置で作製可能
な、核酸を担体上にその長さに関係なく微小な点状に強
固に固定化した核酸固定化基板を提供することを課題と
する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため、アルキル化基を有する化合物が担持さ
れた基材からなる担体に核酸をアルキル化基を介して固
定化させれば、核酸を担体上にその長さに関係なく微小
な点状に強固に固定化できることを見出し、本発明の完
成に至った。
【０００９】すなわち本発明は、以下のとおりである。
【００１０】（１）基材と、この基材上に担持されたア
ルキル化基を有する化合物とを有する担体の複数箇所
に、同一または異なる核酸が前記アルキル化基を介して
点状に固定化されたことを特徴とする核酸固定化基板。
【００１１】（２）前記アルキル化基を有する化合物
は、窒素イペリットであることを特徴とする（１）の核
酸固定化基板。
【００１２】（３）前記担体は、下記一般式（Ｉ）で表
される構造を有することを特徴とする（１）または
（２）の核酸固定化基板。
【００１３】
【化４】Ｍ−Ｒn−Ｇ ・・・（Ｉ） ［式中、Ｍはアルキル化基を有する化合物を表す。Ｒ
は、−ＮＨ−、−ＣＨ2−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ
−、−Ｏ−、−Ｓ−、
【００１４】
【化５】 （Ｒ1は炭素数１〜２０の直鎖、環状若しくは分岐し
た、飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基を表す）、
【００１５】
【化６】 （Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数
１〜２０の直鎖若しくは分岐した、飽和若しくは不飽和
脂肪族炭化水素基または置換基を有してもよいシクロア
ルキル基、アリール基若しくはアラルキル基を表す。但
し、Ｒ2とＲ3のどちらか一方が水素原子である場合、他
方は炭素数１から２０までの直鎖若しくは分岐した、飽
和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基または置換基を有し
てもよいシクロアルキル基、アリール基若しくはアラル
キル基を表す。また、Ｒ2とＲ3が相互に結合して全体と
して酸素を含有してもよい含窒素複素環式基を形成して
もよい）、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＳＯ2−、
−ＮＨＣ(Ｓ)ＮＨ−及び−ＳＯ2ＮＨ−からなる群から
選ばれる官能基を表し、ｎは０〜２０の整数を表す。Ｒ
が複数個存在する場合、これらは互いに同一であっても
異なってもよい。Ｇは基材または基材に接着され得る高
分子を表す。］ （４）核酸を固定化するための担体であって、基材と、
この基材上に担持されたアルキル化基を有する化合物と
を有することを特徴とする担体。
【００１６】（５）基材とこの基材上に担持されたアル
キル化基を有する化合物とを含む、核酸を固定化するた
めの担体の製造方法であって、２個以上のアルキル化基
を有するまたは１個以上のアルキル化基と１個以上のア
ルキル化基以外の官能基とを有する化合物を、表面にア
ルキル化基または前記アルキル化基以外の官能基と共有
結合可能な官能基を有する基材の官能基に、前記化合物
の有するアルキル化基の少なくとも１個を残して共有結
合させる工程を含むことを特徴とする担体の製造方法。
【００１７】（６）基材とこの基材上に担持されたアル
キル化基を有する化合物とを含む、核酸を固定化するた
めの担体に、核酸を接触させる工程を含むことを特徴と
する核酸固定化基板の製造方法。
【００１８】（７）標識物質で標識した核酸を用いるハ
イブリダイゼーションによる核酸検出方法において、
（１）〜（３）のいずれかの核酸固定化基板を用いるこ
とを特徴とする核酸検出方法。
【００１９】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を詳
細に説明する。
【００２０】＜１＞担体 本発明の核酸固定化基板に用いる担体は、核酸を固定化
するためのものであり、基材と、基材上に担持された、
アルキル化基を有する化合物（以下、これを「アルキル
化試薬」ということがある）からなるものである。
【００２１】（１）基材 本発明に用いられる基材は、上記担体の支持体としての
役割を果たすものであって、基本的に、溶剤不溶であり
且つ常温若しくはその付近の温度範囲内（０〜１００
℃）で固体またはゲル状であるものであれば特に制限さ
れない。なお、基材が溶剤不溶性であるとは、基材に後
述のようにしてアルキル化試薬が担持され、ついで担体
として核酸が固定化され、その後、例えば、ＤＮＡチッ
プ等として使用される際の各過程で用いられる水性溶
剤、有機溶剤等の各種溶剤に実質的に不溶性であること
をいう。
【００２２】このような担体基材の材質として、具体的
には、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、
セラミック等が挙げられる。
【００２３】上記プラスチックとして具体的には、ポリ
エチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロ
ピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、
ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化
ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミドおよびア
クリル樹脂等が挙げられる。また、無機高分子として具
体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲルおよび
グラファイト等が挙げられる。金属として具体的には、
金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグ
ネットおよびアパタイト等が挙げられる。天然高分子と
しては、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸お
よびこれらの誘導体等が挙げられる。セラミックとして
具体的には、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ
素および炭化ホウ素等が挙げられる。
【００２４】上記基材の形状としては、例えば、フィル
ム、平板、繊維等を挙げることができ、またその大きさ
については特に制限はない。
【００２５】（２）アルキル化基を有する化合物 本発明に用いるアルキル化基は、置換反応または付加反
応によって他の化合物にアルキル基を導入する基をい
う。このようなアルキル化基を有する化合物は、アルキ
ル化試薬として用いられるものであり、例えば、ハロゲ
ン化アルキル、硫酸ジアルキル、芳香族スルホン酸アル
キルエステルおよびアルキル金属化合物等が挙げられ
る。
【００２６】このようなアルキル化試薬としては、窒素
イペリットを好ましく用いることができる。窒素イペリ
ットは、U.S. Pat.２１４１０９０、U.S. Pat.５２７３
９９１およびU.S. Pat.５３８７７０７号公報等に開示
されている方法等によって製造できる。
【００２７】窒素イペリットとして具体的には、ハロゲ
ン化アルキル−Ｎ−アルキルアミノベンゼン、ジハロゲ
ン化アルキル−Ｎ−アミノベンゼン、ハロゲン化アルコ
キシ−Ｎ−アルキルアミノベンゼン、ジハロゲン化アル
コキシ−Ｎ−アミノベンゼン、ハロゲン化アルキル−Ｎ
−アルコキシアミノベンゼン、ハロゲン化アルコキシ−
Ｎ−アルコキシアミノベンゼン、ハロゲン化アルキルフ
ェニルアミノベンゼン、ハロゲン化アルコキシ−Ｎ−ス
ルホニルアルキルベンゼン、ハロゲン化アルキル−Ｎ−
スルホニルアルコキシアミノベンゼン、ハロゲン化アル
キル−Ｎ−カルボキシアルキルアミノベンゼン、ハロゲ
ン化アルコキシ−Ｎ−カルボキシアルキルアミノベンゼ
ン及びハロゲン化アルコキシ−Ｎ−カルボキシアルコキ
シアミノベンゼン等が挙げられる。
【００２８】上記窒素イペリットは、基材またはアルキ
ル化基を基材に物理的に固定するための高分子化合物と
共有結合するために、他の官能基または原子を置換基と
して有していてもよい。このような置換基として、具体
的には、水酸基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル
基、ハロゲン化アシル基、ハロゲン化アリル基、アシル
基、アリル基、カルボキシル基、スルホキシル基、ホス
ホニウム基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート基、
イソチオシアネート基、カルボジイミド基、チオール基
及びアミノ基等の官能基が挙げられる。
【００２９】上記置換基が形成される部位は、窒素イペ
リットによるアルキル化反応が阻害されない任意の部位
とすることができる。具体的には、アルキル化反応に関
与するアルキル化基および３級窒素原子以外の位置であ
る。上記置換基は、芳香族環に導入されることが好まし
い。
【００３０】（３）担体 本発明に用いる核酸を固定化するための担体は、上記基
材と、その基材上に担持された上記アルキル化試薬より
なる。なお、本発明でいう「担持」とは、担体に核酸を
固定化する際や核酸固定化基板をＤＮＡチップ等として
使用する際等に用いられる水溶性溶剤、有機溶剤等の各
種溶剤中で、基材からアルキル化試薬が実質的に脱離し
ないことを意味する。
【００３１】本発明に用いられる担体において、上記ア
ルキル化試薬は上記基材上に担持される限り、単に物理
的な接着性を利用して担持されていてもよく、また、化
学的に共有結合等を介して担持されていてもよい。しか
し、本発明に用いられる担体において、基材上へのアル
キル化試薬の担持は共有結合を介して行われることが好
ましい。
【００３２】また、アルキル化試薬は、必要に応じ、基
材上の全面において担持されても、また、その一部にお
いて担持されてもよい。
【００３３】上記アルキル化試薬が基材上に物理的な接
着性を利用して担持される場合には、上記アルキル化試
薬が共有結合によって高分子化合物に結合した化合物
（以下、「アルキル化試薬高分子化合物」ということも
ある）を用いることができる。このような化合物は、上
述したアルキル化試薬が高分子化合物に結合したもので
あれば、特に制限されないが、その分子量の範囲として
は、５００〜１００００００であることが好ましい。
【００３４】上記物理的な接着を利用して担体に担持さ
れるアルキル化試薬高分子化合物は、いずれのタイプで
あっても、その分子中に２〜１０００のアルキル化試薬
を有しているものが好ましく、このアルキル化試薬高分
子化合物においてアルキル化試薬の数が２未満、すなわ
ち１の場合は核酸を固定する能力に欠け、また逆にアル
キル化試薬の数が上記範囲より多すぎると、性能面では
問題ないが、粘度が高すぎたり、溶液とすることができ
ない場合があり、基材上に担持させる際の取り扱い性が
悪くなることがある。
【００３５】このような、アルキル化試薬高分子化合物
は、上記基材に対して高い接着性を有するものであり、
この接着性を利用して基材に担持されるものである。
尚、前記アルキル化試薬高分子化合物が基材上に物理的
な接着性を利用して担持される際の代表的な形態は皮膜
である。
【００３６】前記基材上に前記アルキル化試薬高分子化
合物を皮膜で担持させる方法としては、スプレー、浸
漬、ブラッシング、スタンプ、蒸着、フィルムコータを
用いたコーティング等の公知の方法を用いることができ
る。
【００３７】次にアルキル化試薬を共有結合により担持
した担体について説明する。
【００３８】共有結合を介して担持されるアルキル化試
薬は、上述したいずれのものも用いることができる。上
記担体が基材上に共有結合を介して有するアルキル化試
薬は、その分子中に３〜３００個のアルキル化試薬を有
しているものが好ましく、前記アルキル化試薬の数が３
〜３００個以下であると、核酸を固定化するために良好
な能力が得られ、また、溶液が適度な粘度となり、取り
扱いの点でも好ましい。
【００３９】上記基材の表面に共有結合を介して上記ア
ルキル化基を有する化合物を担持させた担体（以下、
「共有結合型担体」ということもある）を得るには、例
えば、担体とした際に核酸を固定化するためのアルキル
化基とそれ以外に基材表面に共有結合するための官能基
を有するアルキル化試薬を、表面に上記アルキル化試薬
が有する官能基と共有結合可能な官能基を有する基材の
官能基に、適当な方法によって共有結合させればよい。
【００４０】より具体的には、例えば、共有結合型担体
は、２個以上のアルキル化基を有するまたは１個以上の
アルキル化基と１個以上のアルキル化基以外の官能基を
有する化合物を、表面にアルキル化基または前記アルキ
ル化基以外の官能基と共有結合可能な官能基を有する基
材の官能基に、前記化合物の有するアルキル化試薬の少
なくとも１個を残して共有結合させることにより得られ
る。
【００４１】上記アルキル化試薬と共有結合しうる担体
を製造する際に用いる、２個以上のアルキル化基を有す
るまたは１個以上のアルキル化基と１個以上のアルキル
化基以外の官能基を有する化合物として、具体的には、
上記（２）で挙げたアルキル化試薬のうちの２個以上の
アルキル化基を有する化合物および１個以上のアルキル
化基と１個以上のアルキル化基以外の官能基を有する化
合物等が挙げられる。さらに、上記（２）で挙げたアル
キル化試薬に、共有結合に供するための前述の官能基を
適当な方法により導入した化合物を、上記共有結合型担
体の製造に用いることも可能である。また、上記（２）
で挙げたアルキル化試薬に共有結合を供するための官能
基としてさらにアルキル化基を導入した化合物を、上記
共有結合型担体の製造に用いてもよい。アルキル化試薬
にこのような官能基を導入する方法については、従来公
知の方法をとることができる。
【００４２】なお、上記共有結合を供する官能基を導入
する位置は、アルキル化試薬のアルキル化反応が阻害さ
れない限り、特に制限されないが、上記アルキル化試薬
が窒素イペリットである場合には、上記官能基は芳香族
環に導入されることが好ましい。
【００４３】また、上記共有結合担体を製造する際に用
いる、表面にアルキル化基または上記化合物の有するア
ルキル化基以外の官能基と共有結合可能な官能基を有す
る基材としては、例えば、上記（１）で説明した基材表
面に前記共有結合可能な官能基を導入した基材が挙げら
れる。導入される官能基としては、アルキル化試薬と共
有結合可能な官能基または上記化合物が有するアルキル
化部分以外の官能基と共有結合可能な官能基であれば特
に制限されないが、具体的には、水酸基、イミノ基、ア
ミノ基、カルボキシル基、カルボジイミド基、アルデヒ
ド基等が挙げられる。これらの官能基は、上記アルキル
化試薬の有する共有結合に供する官能基に応じて適宜選
択され、基材表面に導入される。
【００４４】また、基材表面にこのような官能基を導入
する方法については、基材の材質や導入する官能基によ
って適当な方法が適宜選択される。さらに、官能基を導
入するのは、基材表面の全体であっても良いし、一部で
あってもよい。
【００４５】例えば、ガラス基材の表面全体にアミノ基
を導入するには、３−アミノプロピルトリエトキシシラ
ン等のアミノ置換オルガノアルコキシシランを適当な溶
媒に溶解して得られた溶液に７０〜８０℃程度の温度条
件下でガラス基材を概ね２〜３時間程度浸漬した後、こ
れを取り出して溶液を水洗し、さらに、１００〜１２０
℃程度で約４〜５時間加熱乾燥すればよい。また、上記
３−アミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基とア
ルキル化試薬のアルキル化部分以外の官能基を適当な溶
媒を用いて反応させ、直接ガラス基材の表面にアルキル
化試薬を導入してもよい。
【００４６】また、ガラス基材にアミノ基以外の官能基
を導入する場合や、基材がガラス以外の材料からなる場
合においても、上記基材の説明で挙げた各種材料表面に
種々の官能基を導入することは、従来より一般的に行わ
れていることであり、その方法も公知であるので、この
ような公知の方法を用いて基材表面への官能基の導入を
行うことができる。
【００４７】さらに、上記（１）で挙げた基材のうちで
もプラスチック基材の中には、基材表面に既に上記のよ
うな官能基を有するものもあり、この場合には基材表面
に官能基を導入することなしに、これをそのまま上記共
有結合担体の製造に用いることが可能である。また、こ
のようなプラスチック基材であってもさらに官能基を導
入して上記担体の製造に用いることも可能である。
【００４８】本発明に用いる共有結合担体を製造するに
は、上記のようにして得られる２個以上のアルキル化基
を有するまたは１個以上のアルキル化基と１個以上のア
ルキル化基以外の官能基を有する化合物と、表面にアル
キル化基または上記アルキル化基以外の官能基と共有結
合可能な官能基を有する基材を、適当な条件下で反応さ
せ、上記基材表面の官能基に前記化合物を、上記化合物
の有するアルキル化基の少なくとも１個を残して共有結
合させる。つまり、前記化合物が１個以上のアルキル化
基と１個以上のアルキル化基以外の官能基を有する化合
物である場合には、アルキル化基以外の官能基が共有結
合に供するような反応条件で反応を行えばよい。また、
官能基としてアルキル化基のみを有する化合物を用いる
場合には、アルキル化基の全てが共有結合に供されるこ
とないような条件で反応を行えばよい。
【００４９】このようにして得られる、基材と基材上に
担持されたアルキル化基を有する化合物からなる、核酸
固定化のための担体は、上記アルキル化基の有するアル
キル化基の反応性を利用して、様々な種類や大きさの核
酸を強固に固定することができるものである。
【００５０】本発明の核酸固定化基板に用いる担体は、
具体的には下記一般式（ｉ）で表される構造を有するこ
とが好ましい。
【００５１】
【化７】Ｍ−Ｒn−Ｇ ・・・（ｉ） 上記式（ｉ）において、Ｍは上記アルキル化基を有する
化合物であり、実際には上記基材または高分子化合物と
結合するための共有結合部分を有する基である。上記ア
ルキル化基を有する化合物が窒素イペリットである場合
には、上述したように、芳香族環に上記共有結合部分を
有することが好ましい。
【００５２】Ｒは、−ＮＨ−、−ＣＨ2−、−ＮＨＣＯ
−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、
【００５３】
【化８】 （Ｒ1は炭素数１〜２０の直鎖、環状若しくは分岐し
た、飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基を表す）、
【００５４】
【化９】 （Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数
１〜２０の直鎖若しくは分岐した、飽和若しくは不飽和
脂肪族炭化水素基または置換基を有してもよいシクロア
ルキル基、アリール基若しくはアラルキル基を表す。但
し、Ｒ2とＲ3のどちらか一方が水素原子である場合、他
方は炭素数１から２０までの直鎖若しくは分岐した、飽
和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基または置換基を有し
てもよいシクロアルキル基、アリール基若しくはアラル
キル基を表す。また、Ｒ2とＲ3が相互に結合して全体と
して酸素を含有してもよい含窒素複素環式基を形成して
もよい）、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＳＯ2−、
−ＮＨＣ(Ｓ)ＮＨ−及び−ＳＯ2ＮＨ−等の２価の官能
基である。また、ｎは０〜２０の整数を表す。Ｒが複数
の官能基からなる場合、これら官能基は互いに同一であ
っても異なっていてもよい。
【００５５】このＲは、上述の２個以上のアルキル化基
を有するまたは１個以上のアルキル化基と１個以上のア
ルキル化基以外の官能基を有する化合物のアルキル基ま
たはアルキル基以外の官能基と、表面にアルキル化基ま
たは上記アルキル化基以外の官能基と共有結合可能な官
能基を有する基材の官能基とが共有結合することによっ
て生成される基である。このＲは、上記共有結合に直接
関与しない、予めアルキル化試薬に導入された他の官能
基や基材に導入された他の官能基を含むものであっても
よい。
【００５６】また、Ｇは基材または高分子化合物を表
す。上記物理的接着によりアルキル化試薬が基材に担持
される場合、Ｇは高分子化合物を表し、この高分子化合
物が基板上に接着されることにより担体が形成される。
【００５７】＜２＞核酸固定化基板 本発明の核酸固定化基板は、上記基材と基材上に担持さ
れたアルキル化剤とを有する担体の複数箇所に、同一ま
たは異なる核酸が前記アルキル化基を介して点状に固定
されたものである。
【００５８】本発明の核酸固定化基板において、担体に
核酸が点状に固定されるとは、担体の大きさに対して、
核酸固定化部位が複数箇所設けられる程度に充分小さい
ことをいう。前記点の形状は、特に制限されず、核酸固
定化基板の使用形態、用途等により適宜選択されうる。
【００５９】本発明の核酸固定化基板の点状の核酸固定
部位について、具体的には、上記点の形状がほぼ円形で
あり、直径が１０〜３０００μｍであるものが挙げられ
る。また、前記点のより好ましいサイズとして、直径５
０〜２０００μｍ程度が挙げられ、さらに好ましいサイ
ズとして、直径１００〜１５００μｍ程度が挙げられ
る。なお、形状がほぼ円形であるとは、その形状が真円
形に限らず楕円形等の円形に近い形状を特に制限なく含
むことをいい、例えば、楕円形においてその直径とは長
径と短径の平均値をいう。
【００６０】前記点のサイズについては、直径が１０μ
ｍ未満では検出が困難となる場合があり、直径が３００
０μｍを越えると単位面積当たりに適度な数の点を確保
することが困難となる場合がある。従って、検出の容易
性や、所望の数の点を単位面積当たりに設けることを考
慮すれば、点のサイズを上記範囲とすることが好まし
い。
【００６１】また、本発明の核酸固定化基板における点
状に固定化された核酸固定部位の数については特に制限
されず、核酸固定化基板の使用形態、用途等により適宜
選択されうるが、具体的には、前記核酸固定部位の数が
基板１ｃｍ2当たり１０〜１００００個程度、好ましく
は、５０〜３５０個程度である核酸固定化基板が挙げら
れる。さらに、本発明の核酸固定化基板における点状の
核酸固定部位の配置についても、核酸固定化基板の使用
形態、用途等により適宜選択されうるものである。
【００６２】本発明の核酸固定化基板に固定化される核
酸としては、天然または合成のＤＮＡ（オリゴヌクレオ
チドを含む。）もしくはＲＮＡ（オリゴヌクレオチドを
含む。）が特に制限無く挙げられる。また、固定化され
る核酸は１本鎖であっても、２本鎖であっても構わな
い。さらに、本発明においては、前記核酸として、通
常、アルキル化基との反応性を有する官能基を有する核
酸が用いられる。上記本発明の核酸固定化基板において
点状に固定化されている核酸は同一であっても異なって
もよく、異なる核酸を用いる場合の各核酸の配置等につ
いては、得られる核酸固定化基板の使用形態、用途等に
より適宜選択されうる。
【００６３】このような核酸を上記担体に点状に固定化
するには、担体上のアルキル化試薬が担持された部分
に、適当な条件下で、微量の核酸を所望の大きさの点状
に供給することで、アルキル化試薬と核酸を接触させ両
者を反応させればよい。担体に担持されたアルキル化試
薬のアルキル化基と、核酸が有するアミノ基、イミノ基
等との反応により、核酸はアルキル化試薬と共有結合す
る。核酸にチオール基が予め導入されている場合には、
上記アルキル化基とチオール基との反応によっても共有
結合が行われる。その結果、核酸は担体に固定化され
る。
【００６４】具体的には、例えば、両者の接触反応にお
いて固定化される核酸の活性が維持されるように、通
常、核酸は水またはバッファー中に含まれる形で供給さ
れる。また、接触の際の温度としては固定化される核酸
の活性が失われないように、概ね０〜１００℃とするこ
とが好ましい。
【００６５】本発明において微量の核酸を、通常は、核
酸を含有する水またはバッファーを、担体に点状に供給
する手段として、ディスペンサを用いる方法、ピンを用
いる方法、バブルジェットを用いる方法等があるが、本
発明がこれらに限定されるものではない。また、このよ
うに溶液を微量に供給する装置は、一般に市販されてお
り、本発明においてもこれらを用いることが可能であ
る。
【００６６】本発明の核酸固定化基板は、これを用いて
分析等を行う際に、上記固定化核酸以外の核酸等を接触
させる機会が多いが、担体に担持されたアルキル化試薬
の有する未反応アルキル化基に上記固定化核酸以外の核
酸等が非特異的に結合することを防ぐため、上記のよう
にして点状に核酸を担体に固定化した後に、過剰量のウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、サケ精子ＤＮ
Ａ等を担体に接触させ、フリーのアルキル化基をブロッ
クしておくことが好ましい。
【００６７】このようにして得られる本発明の核酸固定
化基板は、前記核酸が担体に非常に強固に担持されたも
のであり、ハイブリダイゼーション等で広く使用されて
いる洗浄方法（界面活性剤を用いた洗浄方法）によって
も脱離することがなく、これを用いて分析等を行った場
合、再現性、定量性に優れた分析が可能となる。また、
本発明の核酸固定化基板は、核酸が、鎖の数や長さに制
限されずに固定され得るので、同一基板上で種々の核酸
を同時に取り扱うことができる。これらのことから、本
発明の核酸固定化基板は、多数の核酸を用いてハイブリ
ダイゼーション法により塩基配列を決定する技術、ＳＢ
Ｈ（Sequencing by Hybridization）法、ＳＨＯＭ（Seq
uencing by Hybridization with Oligonucleotide Matr
ix）法等に用いられるＤＮＡチップ等に優れた性能を持
って適用可能であるといえる。
【００６８】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。
【００６９】〈製造例〉 （１）アルキル化試薬の製造 オキシ塩化リン２２．３ｇにヒドロキシエチルメチルア
ニリン２０ｇを４５℃にて徐々に加え、９０℃にて１時
間攪拌した。０℃に冷却後、これにＮ−メチルホルムア
ニリド、オキシ塩化リン及びベンゼンの１：１：０．５
の混合物８７．３ｇを徐々に加え、３５℃にて３時間攪
拌した。この反応混合物に氷を加え冷却し、４Ｎの水酸
化ナトリウムを用いて中和後、ベンゼンを用いて抽出し
た。この抽出物を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィ
ー（展開溶媒：トルエン）にて精製して、ｐ−Ｎ−クロ
ロエチル−Ｎ−メチルアミノベンズアルデヒドを得た。
ＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
【００７０】［ＮＭＲスペクトルデータ］ １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ=3.10(s,3H)、δ=3.65
(m,2H)、δ=3.75(m,2H)、δ=6.70(d,2H)、δ=7.75(d,2
H) 、δ=9.75(s,1H) （２）アミノ化スライドガラスの作製 蒸留水１８０ｍｌに１０％（ｖ／ｖ）３−アミノプロピ
ルトリエトキシシラン／エタノール溶液２０ｍｌを加え
よく攪拌した。そこに６ＮのＨＣｌを加え、ｐＨ３〜４
に調整した後、スライドガラスを１５枚浸漬し、７５℃
で２時間加熱処理した。加熱処理終了後、スライドガラ
スを溶液から引き上げ、蒸留水でよく洗い流した後、１
１５℃で４時間加熱処理して、アミノ化スライドガラス
を得た。
【００７１】〈実施例〉 （１）アルキル化試薬化スライドガラスの作製 上記製造例の（１）で得られたアルキル化試薬１．２５
ｇをメタノール２５ｍｌに溶解し、シアン化水素ホウ素
ナトリウムを徐々に加え攪拌した。次いで、上記製造例
の（２）で得られたアミノ化スライドガラスを５枚浸漬
し、室温にて１８時間攪拌した。これらのスライドガラ
スをメタノール５００ｍｌに浸漬し、室温にて３０分間
攪拌した。さらに、これらを３７℃にて３０分間乾燥し
て、アルキル化試薬化スライドガラスを得た。
【００７２】（２）アルキル化試薬化スライドガラス上
への核酸の固定 配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
（２１mer）を、１００ｎｇ/μｌになるように２ＭＮａ
Ｃｌに溶解し、ＤＮＡ溶液とした。ＳＰＢＩＯ（日立ソ
フトウェアエンジニアリング（株）社製）を用い、上記
（１）で得られたアルキル化試薬化スライドガラスの所
定の位置に、前記ＤＮＡ溶液を５００箇所にスポットし
た。これを乾燥機に入れ、３７℃にて１５分間乾燥し
た。次いで、３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む
緩衝液Ａ（０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス塩
酸（ｐＨ７．５）、０．０５％トライトンＸ−１００）
に浸し、３７℃にて１５分間乾燥した。次に、このスラ
イドガラスをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ
７．２/１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、３７℃にて１５
分間乾燥し、二本鎖ＤＮＡを固定したアルキル化試薬化
スライドガラスを得た。
【００７３】（３）ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション検出に用いるプローブとして、
前記配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドをビオチン標識したものを用いた。
【００７４】上記スライドガラスのＤＮＡを固定化した
部分に、ハイブリダイゼーション溶液［３×ＳＳＣ（Ｓ
ＳＣ：１．５ＭＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウ
ム）、１０％デキストラン、１ｐｍｏｌビオチン化プロ
ーブ］３０μｌをのせ、４２℃のウォーターバスで１晩
加熱した。
【００７５】（４）ポストハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスからハイ
ブリダイゼーション溶液を軽く吸い取り、以下の条件で
ポストハイブリダイゼーション洗浄を行い、非特異的に
吸着したプローブを除去した。
【００７６】［ポストハイブリダイゼーション洗浄液お
よび条件］ 第１段階：２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ； 室温、５分間、
２回 第２段階：０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ； ４０℃、５
分間、２回 第３段階：２×ＳＳＣ； 室温、５分間、１回 （５）ハイブリダイゼーションの検出 ３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａ５００ｍｌに、上記ポストハ
イブリダイゼーション洗浄後のスライドガラスを浸漬
し、室温で３０分間ブロッキングを行った。次に、スト
レプトアビジン−アルカリホスファターゼ・コンジュゲ
ート溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、３％ＢＳＡを含む
緩衝液Ａで原液を２０００倍に希釈したもの）４５ｍｌ
に浸し、室温で３０分間反応させた。次に、スライドガ
ラスを緩衝液Ａ５０ｍｌに浸し、室温で５分間放置し
た。これを２回繰り返し、ビオチンと結合しなかったコ
ンジュゲートを除去した。
【００７７】次に、スライドガラスを緩衝液Ｂ３０ｍｌ
で１回洗浄した。最後に基質溶液（緩衝液Ｂ２０ｍｌ、
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
（ＢＣＩＰ）溶液１８μｌ、ニトロブルーテトラゾリウ
ム（ＮＢＴ）溶液３６μｌ）に浸し、室温で３時間放置
し、発色反応を行った。その結果を表１に示す。
【００７８】［緩衝液Ａの組成］ ０．２Ｍ ＮａＣｌ ０．１Ｍ トリス塩酸（ｐＨ７．５） ０．０５％ トライトンＸ−１００ ［緩衝液Ｂの組成］ ０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．１Ｍ トリス塩酸（ｐＨ９．５） 〈比較例〉 （１）ポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス上への核
酸固定 配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
（２１mer）を、１００ｎｇ/μｌになるように０．２×
ＳＳＣに溶解し、ＤＮＡ溶液とした。ＳＰＢＩＯ（日立
ソフトウェアエンジニアリング（株）社製）を用い、ポ
リ−Ｌ−リジンコートスライドガラス（シグマ社製）の
所定の位置に、前記ＤＮＡ溶液を５００箇所にスポット
した。これをチャンバーに入れ、室温にて２時間反応し
た。次いで、減圧乾燥機で８０℃にて、２時間乾燥させ
た。スライドガラスを０．１％ＳＤＳで洗浄した後、ブ
ロッキング溶液（無水コハク酸１ｇ、ｎ−メチル−ピロ
リドン１００ｍｌ、０．２Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ
８．０）１００ｍｌ）に室温で１０分間浸漬した後、蒸
留水で４回洗浄し、核酸を固定化したポリ−Ｌ−リジン
コートスライドガラスを得た。
【００７９】（２）ハイブリダイゼーション 実施例の（２）において、アルキル化試薬化スライドガ
ラスの代わりに比較例の（１）で作製したポリ−Ｌ−リ
ジンコートスライドガラスを使用した以外は、実施例の
（２）と同様に処理した。
【００８０】（３）ポストハイブリダイゼーション 実施例の（３）において、アルキル化試薬化スライドガ
ラスの代わりに比較例の（２）で作製したポリ−Ｌ−リ
ジンコートスライドガラスを使用した以外は、実施例の
（３）と同様に処理した。
【００８１】（４）ハイブリダイゼーションの検出 実施例の（４）において、アルキル化試薬化スライドガ
ラスの代わりに比較例の（３）で作製したポリ−Ｌ−リ
ジンコートスライドガラスを使用した以外は、実施例の
（４）と同様に処理した。
【００８２】
【表１】 ○：シグナルが均一かつ明瞭に現れた △：一部のシグナルが不均一または不明瞭に現れた ×：大部分のシグナルが不均一または不明瞭に現れた 表１の結果から、本発明の核酸の検出方法によれば、核
酸の検出が高感度かつ明瞭なシグナルとしてあらわれる
ことがわかる。
【００８３】
【発明の効果】本発明により、ＤＮＡが安定に固定化さ
れた核酸固定化基板が提供される。本発明の基板には、
核酸が、鎖の数や長さに制限されずに固定され得るの
で、同一基材上で種々の核酸を同時に取り扱うことがで
きる。さらに、本発明の基板は光、熱、空気中の水分等
にも安定であるため、保存安定性に優れている。
【００８４】また、核酸を共有結合により強固に担体に
結合させているため、再現性、定量性に優れたＤＮＡチ
ップ等としての用途に有効な核酸固定化基板となり得
る。
【００８５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 日清紡績株式会社 <120> 核酸固定化基板 <130> P-6727 <141>1999-11-29 <160> 1 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 gttacccaca taccacgaat c 21
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 FB02 FB07 FB15 4B024 AA11 AA19 AA20 CA04 CA09 HA14 HA19 4B029 AA07 FA15 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR13 QR32 QR55 QR66 QR84 QS02 QS34 QX02

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 基材と、この基材上に担持されたアルキ
    ル化基を有する化合物とを有する担体の複数箇所に、同
    一または異なる核酸が前記アルキル化基を介して点状に
    固定化されたことを特徴とする核酸固定化基板。
  2. 【請求項２】 前記アルキル化基を有する化合物は、窒
    素イペリットであることを特徴とする請求項１記載の核
    酸固定化基板。
  3. 【請求項３】 前記担体は、下記一般式（Ｉ）で表され
    る構造を有することを特徴とする請求項１または２記載
    の核酸固定化基板。 【化１】Ｍ−Ｒn−Ｇ ・・・（Ｉ） ［式中、Ｍはアルキル化基を有する化合物を表す。Ｒ
    は、−ＮＨ−、−ＣＨ2−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ
    −、−Ｏ−、−Ｓ−、 【化２】 （Ｒ1は炭素数１〜２０の直鎖、環状若しくは分岐し
    た、飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基を表す）、 【化３】 （Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数
    １〜２０の直鎖若しくは分岐した、飽和若しくは不飽和
    脂肪族炭化水素基または置換基を有してもよいシクロア
    ルキル基、アリール基若しくはアラルキル基を表す。但
    し、Ｒ2とＲ3のどちらか一方が水素原子である場合、他
    方は炭素数１から２０までの直鎖若しくは分岐した、飽
    和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基または置換基を有し
    てもよいシクロアルキル基、アリール基若しくはアラル
    キル基を表す。また、Ｒ2とＲ3が相互に結合して全体と
    して酸素を含有してもよい含窒素複素環式基を形成して
    もよい）、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＳＯ2−、
    −ＮＨＣ(Ｓ)ＮＨ−及び−ＳＯ2ＮＨ−からなる群から
    選ばれる官能基を表し、ｎは０〜２０の整数を表す。Ｒ
    が複数個存在する場合、これらは互いに同一であっても
    異なってもよい。Ｇは基材または基材に接着され得る高
    分子を表す。］
  4. 【請求項４】 核酸を固定化するための担体であって、
    基材と、この基材上に担持されたアルキル化基を有する
    化合物とを有することを特徴とする担体。
  5. 【請求項５】 基材とこの基材上に担持されたアルキル
    化基を有する化合物とを含む、核酸を固定化するための
    担体の製造方法であって、 ２個以上のアルキル化基を有するまたは１個以上のアル
    キル化基と１個以上のアルキル化基以外の官能基とを有
    する化合物を、表面にアルキル化基または前記アルキル
    化基以外の官能基と共有結合可能な官能基を有する基材
    の官能基に、前記化合物の有するアルキル化基の少なく
    とも１個を残して共有結合させる工程を含むことを特徴
    とする担体の製造方法。
  6. 【請求項６】 基材とこの基材上に担持されたアルキル
    化基を有する化合物とを含む、核酸を固定化するための
    担体に、核酸を接触させる工程を含むことを特徴とする
    核酸固定化基板の製造方法。
  7. 【請求項７】 標識物質で標識した核酸を用いるハイブ
    リダイゼーションによる核酸検出方法において、請求項
    １〜３のいずれか一項に記載の核酸固定化基板を用いる
    ことを特徴とする核酸検出方法。
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