KR20030038932A - 회전코팅법을 이용한 고체표면기질 상의 균일한 고분자층형성방법 - Google Patents

회전코팅법을 이용한 고체표면기질 상의 균일한 고분자층형성방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고체표면기질 상에 균일한 고분자층을 형성시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 친핵성 작용기가 존재하는 고체표면기질에 회전코팅법을 이용하여 다작용기 고분자화합물을 적용함으로써 균일한 다작용기 고분자층을 형성시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 저밀도, 불균일 단분자층의 문제점을 극복하여 고체표면기질에 고밀도의 작용기를 가진 고분자층을 균일하게 형성시킬 수 있다. 또한 상기와 같이 고밀도의 균일한 고분자층을 이용하여 우수한 검출감도를 갖는 바이오칩을 제공할 수 있다.

Description

회전코팅법을 이용한 고체표면기질 상의 균일한 고분자층 형성방법{The method of building polymeric layer on solid surface substrate using a spin coating method}
본 발명은 고체표면기질 상에 균일한 고분자층을 형성시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 친핵성 작용기가 존재하는 고체표면기질에 회전코팅법을 이용하여 다작용기 고분자화합물을 적용함으로써 균일한 다작용기 고분자층을 형성시키는 방법에 관한 것이다.
바이오칩 중 하나의 큰 분야인 DNA 칩은 핵산검출용 칩으로서, 1 cm2정도의 고체표면기질에 여러 종류의 DNA 프로브를 일정하게 배열하여 고정함으로써 제조한다. 여기에 미리 형광물질로 표식한 표적 DNA (또는 RNA) 를 포함하는 용액에 DNA칩을 반응시킨 후 세척하면 probe DNA는 상보적인 표적 DNA (또는RNA)를 혼성화 (hybridized)해서 표면에 남아, 칩 표면의 형광화상으로서 표적 DNA의 측정 가능하다. DNA 칩은 위와 같이 조작이 단순하고 자동화에 적절하고 더욱이 적은 시약 양으로 처리 가능하다는 점 등 DNA검출의 고속화 및 낮은 코스트화가 기대되고 있다.
또한 바이오칩 중 다른 하나인 단백질칩은 단백질을 부착한 microchip(단백질칩)으로서 여러 가지 질환을 대량으로 자동 진단하는데 주로 쓰일 수 있다. 이러한 단백질칩을 이용하면, 한 사람의 혈액을 수십 가지 질환에 대하여 동시에 진단할 수 있으며, 한 가지 질환에 대하여 수십∼수천명의 혈액을 동시에 빠른 속도로 진단할 수 있으며, 또한 수십가지 질환에 대하여 수십∼수천명의 혈액을 동시에 자동진단하는 것이 가능한 매우 획기적인 기술이다.
바이오칩을 제조하기 위해서는 용융 실리카 (fumed silica) 또는 실리콘 웨이퍼 등의 고체표면기질 상에 미리 제조한 생물질(DNA 프로브 혹은 단백질 프로브)을 고정하는 방법과 고체표면기질 상에 직접 생물질 합성하는 방법이 알려져 있다. 이와 같이 생물질을 고체표면기질 상에 고정시키기 위해 고체표면기질 상에 아민기(-NH2)나 티올기(-SH) 등을 갖는 작용기를 갖는 화합물을 고정시켜서 사용하여 왔는데 이는 이들 작용기가 DNA나 아미노산 화합물과 쉽게 반응하여 안정한 결합을 형성하기 때문이다.
예를 들어, 일반적으로 가장 많이 사용되고 있는 아미노실란 화합물을 적용시키는 경우, 기질 위에 고정하기는 비교적 간단하지만 작용기(-NH2)의 밀도가 높지않아 아미노 실릴화된 표면의 절대 아민기의 개수는 단위면적 100Å2당 3.5개 정도이다(Langmuir, 1996, 12, 4621). 그러나, 표면에 100 Å2당 3.5개 정도의 아민기 밀도를 갖는 고체 기질을 사용해서는 그 적용분야가 매우 제한적이므로 개선의 여지가 많다. 표면에 아민기를 갖는 고체 기질은 DNA 칩이나 바이오칩을 제조하는 기판으로 사용 가능하나, 표면에 100Å2당 3.5개의 아민 밀도를 갖는 기질은 표면에 DNA 올리고뉴클레오타이드를 붙이거나 효과가 다른 생분자들을 고정시킬 때 상호작용이 약해서 강하게 고정되지 못하게 되어 칩의 안정성이 좋지 못해 칩을 제조하기 어렵다. 또한 고정화되는 DNA probe의 양이 적어 검출정도(精度)가 낮은 문제점을 가지고 있다. 그러므로 기질 상에 높은 아민기 밀도를 갖는 분자층을 형성시키는 것은 바이오칩의 제조에 있어서 중요하다. 이러한 문제이외에도 아미노실란 화합물을 고농도로 기질 위에 도포할 경우 불균일한 분자층의 형성되어 검출물질과의 반응성이 극도로 제한된다.
최근에는 상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여, 고체표면기질 상에서 중합반응(polymerization)을 이용하여 가지형태 (hyper-branched)의 작용기를 형성함으로써 보다 높은 작용기 밀도를 갖는 분자층을 형성하는 방법에 대한 연구가 보고되고 있다(R.Jordan an A.Ulman, J.Am.Chem.Soc., 120, 243 (1998), H.J.Kim, J.H.Moon, and J.W.Park, J.Coll.Int.Sci, 227, 247, (2000)). 이러한 방법을 이용하면 하나의 작용기에서 다시 여러 개의 작용기가 형성될 수 있으므로 단분자층에 비해 높은 밀도의 작용기를 형성할 수 있다. 하지만 이러한 경우에는 중합반응이불규칙하게 일어나기 쉬워 균일층이 형성되기 어려우며, 중합반응이 숙련도를 요구하므로 아미노실란의 고정화와 마찬가지로 공정화가 어렵다. 또한 작용기의 밀도가 증가하였다 하더라도 중합반응이 균일하게 일어나지 않기 때문에 주 사슬(main chain) 사이에 존재하는 작용기가 많고, 이 경우 주 사슬의 입체 장애(steric hindrance)로 인해 크기가 큰 생물질이 접근하기가 어렵다. 따라서 실제로 모든 작용기에 생물질을 고정화시킬 수 없으므로 효율이 떨어지는 문제를 가지고있다.
이상에서 살펴본 바와 같이 종래에 고체표면기질 상에 친핵성 작용기를 도입시키는 방법은 크게 두 가지 문제점이 대두된다고 볼 수 있는데, 그 첫째는 고밀도의 작용기를 가진 화합물의 선택이고 둘째는 고체표면기질 상에서의 균일층 형성의 문제이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 회전코팅법을 이용하여 고체표면기질에 다작용기 고분자 화합물을 도입하는 경우, 고밀도의 균일한 고분자층을 형성하여 우수한 검출감도를 갖는 바이오칩을 제조할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 상기 언급한 저밀도, 불균일 단분자층의 문제점을 극복하기 위해 고체표면기질에 고밀도의 균일한 고분자층을 형성시키는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형성된 고밀도의 균일한 고분자층을 이용하여 우수한 검출감도를 갖는 바이오칩을 제공하는 데 있다.
도 1은 실시예 4 및 5에 사용된 4차 Starburst(PAMAM) 덴드리머의 구조를 나타낸다.
도 2는 실시예 4에서 형성된 용융 실리카 고체표면기질 상에 덴드리머 분자층을 실험예 1에서 형광분석한 결과를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 친핵성 작용기가 존재하는 고체표면기질에 회전코팅법을 이용하여 다작용기 고분자 화합물을 적용함으로써 고체표면기질 상에 균일한 다작용기 고분자층을 형성시키는 방법을 제공한다.
다작용기 고분자화합물이란 고밀도의 작용기를 갖는 가지구조 고분자 화합물을 의미한다. 상기 다작용기 고분자화합물은 고밀도의 아민기(-NH2), 고밀도의 히드록실기(-OH), 고밀도의 티올기(-SH)를 갖는 고분자 화합물인 것이 바람직하다. 또한 상기 다작용기 고분자화합물은 아민기, 히드록실기, 또는 티올기를 갖는 덴드리머, 또는 그 덴드리머의 실란 유도체일 수 있다. 덴드리머란 고밀도의 작용기를 최외각에 가지고 있는 입체적 구조의 고분자를 의미한다.
상기 고체 표면 기질로는 용융 실리카 또는 실리콘 웨이퍼와 같이 히드록실(-OH)기가 존재하는 기질이 사용된다.
상기 결합물질을 고체표면기질 위에 도포하기 위한 수단으로써 회전코팅법을 사용한다. 회전코팅 시 속도(rpm)는 100 내지 10000이며, 1000에서 5000rpm이 바람직하다. 본 발명에서 고체표면기질 위에 상기 결합물질을 도포하기 위한 수단으로 사용한 회전코팅법은 다음과 같은 장점이 있다.
1) 고체표면기반 위에 균일한 형태로 다작용기 고분자화합물의 고정이 가능하다,
2) 고체표면기반 위에 높은 밀도의 작용기 도입이 가능하다.
3) 고체표면기반 위에 생화학물질을 효과적으로 고정화할 수 있다.
4) 공정이 간단하고 제조 시간의 단축이 가능하다.
5) 복잡한 화학반응을 요구하지 않으므로 재현성이 높다.
6) 대량 생산이 가능하다.
7) 작용기 밀도의 조절이 간편하다.
8) 폐수 등의 환경오염 물질이 발생하지 않는다.
상기 방법을 보다 구체적으로 설명한다.
고체표면기질을 초음파 세척한 후 건조시킨다. 건조된 고체표면기질에 친핵성 작용기를 도입시킨다. 여기서 친핵성 작용기는 히드록실기, 티올기, 아민기를 포함하며 특히 히드록실기가 바람직하다. 친핵성 작용기를 도입시킨 후 고체표면기질을 세척하고 건조시킨다. 이와 같이 준비된 고체표면기질에 1-20중량%의 덴드리머 혹은 아민기가 존재하는 고분자 용액을 적하시키고 100 내지 10000, 바람직하게는 1000에서 5000rpm으로 약 30초 내지 1분 동안 회전코팅시킨다. 회전코팅 종료 후, 분자층이 형성된 고체표면기질을 건조시킨다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 방법으로 제조된 균일한 다작용기의 고분자층이 형성된 고체표면기질을 이용하여 제조되는 바이오칩을 제공한다. 상기의 방법으로 균일한 다작용기의 고분자층이 형성된 고체표면기질에 직접 혹은 링커분자를 경유하여 바이오 물질을 연결시켜 통상적인 방법으로 바이오칩을 제조한다. 상기 바이오 물질은 핵산(DNA, RNA 또는 PNA) 또는 단백질일 수 있다.
또한 본 발명은 상기의 방법으로 생성된 바이오칩을 이용하여 표적핵산 또는 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1
용융 실리카 고체표면기질 상에 덴드리머 분자층의 형성-1
[단계 1 : 고체표면기질세척 및 히드록실화 반응]
용융 실리카 고체표면기반을 황산과 30% 과산화수소수 용액 (7:3 (v:v), piranha 용액)에 침전시켜 1시간 이상 초음파 세척하였다. 건조한 고체표면기반을 50ml의 탈이온수-암모니아수-30% 과산화수소수 (5:1:1) 용액에 넣은 후 60℃에서 20분간 반응하였다. 히드록시화 반응 종료 후 고체표면기반을 탈이온수로 철저히 세척하고 진공건조기에서 건조하였다.
[단계 2 : 회전코팅 (spin coating)]
히드록시기가 존재하는 고체표면기질을 진공 척(vacuum chuck)에 고정한 후 20중량%의 2차 Starburst(PAMAM) 덴드리머가 용해된 메탄올 용액을 적가하고, 2000rpm에서 30초간 회전코팅을 수행하였다. 회전코팅 종료 후 덴드리머가 고정된 고체표면기질을 진공건조기에서 70℃를 유지하면서 3시간 동안 건조하였다.
실시예 2
용융 실리카 고체표면기질 상에 덴드리머 분자층의 형성-2
2차 Starburst(PAMAM) 덴드리머가 용해된 메탄올 용액의 덴드리머 농도를 5중량%로 하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
실시예 3
용융 실리카 고체표면기질 상에 덴드리머 분자층의 형성-3
2차 Starburst(PAMAM) 덴드리머가 용해된 메탄올 용액의 덴드리머 농도를 1중량%로 하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
실시예 4
용융 실리카 고체표면기질 상에 덴드리머 분자층의 형성-4
4차 Starburst(PAMAM) 덴드리머가 용해된 메탄올 용액의 덴드리머 농도를 10중량%로 하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
실시예 5
용융 실리카 고체표면기질 상에 덴드리머 분자층의 형성-5
4차 Starburst(PAMAM) 덴드리머가 용해된 메탄올 용액의 덴드리머 농도를 5중량%로 하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
실시예 6
용융 실리카 고체표면기질 상에 폴리에틸렌이민 분자층의 형성
폴리에틸렌이민(분자량 25000)이 용해된 메탄올 용액의 농도를 5중량%로 하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
실험예 1
상기 실시예 1 내지 5에서 제조된 덴드리머 분자층이 형성된 용융실리카 고체표면기질에 DNA를 고정한 후 형광검출법을 이용하여 그 성능을 알아보았다. 이하 실험방법은 일반적으로 수행되는 실험방법에 따랐다.
A. oligonucleotide의 고정
상기 실시예 1 내지 5에서 제조된 덴드리머가 도입된 고체표면기질을 60℃에서 3시간 건조한 후 N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide-N-succinimidyl-4-maleimidobutyrate (이하 GMBS) 용액에서 3시간(실온) 동안 반응하였다. 그리고 나서 3'말단에 SH가 수식되어있고 5' 말단에 Cy3가 수식된 아래의 probe를 spotting용액 (10 mM HEPES, 5 mM EDTA, pH 6.6)에 녹인 후DMSO (40 % (v/v))를 첨가 후, 덴드리머가 도입된 고체표면기질 위에 각각 24개의 spotting을 해서 pattern화 하였다. 결과치로서 각 spot의 형광세기(fluorescence intensity)의 평균치와 S.D. (standard deviation, 표준편차), C.V.(Coefficient of Variance)를 계산하였다. 실험결과를 표 1에 나타내었다.
A) TTAATAGCCCTAGCCTTAACCCT
B) CTTCTACCACTAATGCCAACTGTGGCAAT
C) TTAATAGCCCTAGCCCTAACCCT
B. DNA의 혼성화 (hybridization)
5'말단에 SH가 수식 되어 있는 상기 A), B), C) oligonucleotide를 상기와 같은 방법으로 pattern화 한 후, 그 중 B)와 상보적인관계를 가지는 oligonucleotide의 5' 말단에 Cy3를 수식한 probe를 가지고 hybridization용액(300 mM NaCl, 20 mM sodium phosphate, 2 mM EDTA, 7 mM SDS, pH 7.4)를 가지고 60℃에서 3시간 혼성화하였다. 결과치로서 각 spot의 형광세기(fluorescence intensity)의 평균치와 S.D. (standard deviation, 표준편차), C.V.(Coefficient ofVariance)를 계산하였다. 실험결과를 표 2에 나타내었다.
실험예 2
상기 실시예 6에서 제조된 폴리에틸렌이민 분자층이 형성된 용융실리카 고체표면기질을 이용하여 상기 실험예 1의 B와 같이 하였다. 그 실험결과를 표 3에 나타내었다.
실시예 덴드리머 농도(중량% 메탄올) S.D. 형광강도 C.V.
1 20 2133.81 58870.6 3.624
2 5 960.77 59400.1 1.617
3 1 2487.5 42819.6 5.869
4 10 3245.5 49323.92 6.579
5 5 2769.1 50567.72 5.47
실시예 덴드리머 농도(중량% 메탄올) S.D. 형광강도 C.V.
1 20 828.28 3084.06 26.85
2 5 352.63 2031.82 17.36
3 1 4019.23 9648.9 41.65
4 10 246.28 1510.37 16.3
5 5 1566.45 4031.65 38.85
실시예 폴리에틸렌이민 농도(중량% 메탄올) S.D. 형광강도 C.V.
6 5 10472.5473 16267.26 64.37
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 저밀도, 불균일 단분자층의 문제점을 극복하여 고체표면기질에 고밀도의 작용기를 가진 고분자층을 균일하게 형성시킬 수 있다. 또한 상기와 같이 고밀도의 균일한 고분자층을 이용하여 우수한 검출감도를 갖는 바이오칩을 제공할 수 있다.

Claims (7)

  1. 친핵성 작용기가 존재하는 고체표면기질에 회전코팅법을 이용하여 다작용기 고분자 화합물을 적용함으로써 고체표면기질 상에 균일한 다작용기 고분자층을 형성시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 다작용기 고분자화합물은 고밀도의 아민기(-NH2), 고밀도의 히드록실기(-OH), 고밀도의 티올기(-SH)를 갖는 고분자 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 다작용기 고분자 화합물은 아민기, 히드록실기, 또는 티올기를 갖는 덴드리머, 또는 그 덴드리머의 실란 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 다작용기 고분자 화합물은 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친핵성 작용기는 히드록시기, 티올기, 아민기인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 다작용기 고분자층이 형성된 고체표면기질에 바이오 물질을 고정시킴으로써 제조되는 바이오칩.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 바이오 물질은 핵산(DNA, RNA 또는 PNA) 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 바이오칩.
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