JP4635707B2 - 検出表面と該検出表面の作製方法、並びにプローブ物質の固定密度制御方法 - Google Patents

Description

本発明は、物質間の相互作用の検出技術に関する。より詳しくは、物質間の相互作用を高精度に検出するときに有用な検出表面、該検出表面の作製方法、並びに該検出表面に対するプローブ物質の固定密度制御技術に関する。

生物の遺伝子情報を分子レベルで解明しようという試みが盛んに行われ、人に関してはヒトゲノムプロジェクトの完了により、本来有している遺伝子構造が明らかになってきた。これに伴い、遺伝病の診断、治療のために遺伝子の変異を測定するだけでなく、どの時点でどのような遺伝子が発現しているかを測定する事が必要となってきている。

近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が開発され、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。

このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等の核酸鎖が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。

このＤＮＡチップを作製するための技術は、現在、半導体露光技術を利用したフォトリソグラフィー（photolithogrphy）、圧電技術（piezoelectric technology）などのインクジェッティング（ink-jetting）を利用した技術、メカニカルマイクロスポッティング(mechanical microspotting)などの技術を駆使して行われており、これらの技術には一長一短があるとされている。しかし、いずれの技術でも、試料の拡散や吸収が起こることがなく、かつ試料が微量で足りる等の理由から、表面が平滑で均一な非多孔性のガラス製又は合成樹脂製の基板表面を用いることを前提としている。

このＤＮＡチップは、概ね二つのタイプに大別できる。第１のタイプは、上記フォトリソグラフィーの技術を用いて、所定の基板上に直接オリゴヌクレオチドを合成していくものであり、アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）によるものが代表的である。この種のチップは、集積度は高いが、基板上でのＤＮＡ合成には限界があって、数十塩基程度の長さである。

第２のタイプは、「スタンフォード方式」とも称されるもので、先割れピンを用いて、予め用意されたＤＮＡを基板上に分注・固相化していくことによって作製されるものである。この種のチップは、集積度は前者に比べて低いが、１ｋｂ程度のＤＮＡ断片を固相化できるという利点がある。

しかしながら、いずれの手法でも、単位面積あたりの個々のプローブの密度は基板そのものの活性点の数できまり、特に後者の方法では、オリゴヌクレオチドを基板表面に固定するための濃度、反応時間でプローブ密度を制御する事は可能であるが、その再現性は低く、その結果ハイブリダイゼーションの有無を検出できても定量化が難しい。

このため、例えば、特許文献１には、基板に対するプローブ固定密度を制御するため、アミノ基にグルタルアルデヒド由来のアルデヒド基が導入されているアミノアルキルシランと、アミノ基を持たないアルキルシランの混合割合を選択することで、単位面積あたりのＤＮＡの固定化量を制御する技術が提案されている。
特開２００３-２７９５７２号公報（請求項１、段落番号００２０参照）。

本発明は、物質間の相互作用の定量化に適する検出表面や該検出表面に対するプローブ物質の固定密度の制御方法を提供することを主な目的とする。

本発明では、第一に、物質間の相互作用を進行させる反応場に臨む固相の表面であって、遊離アミノ基を有するアミノシラン化合物とアミノ基がブロック化されているアミノシラン化合物が、それぞれシランカップリング反応を介して、前記固相に所定割合で結合されている検出表面、並びに該検出表面が基板に設けられているセンサーチップを提供する。

ここで、前記固相は、例えば、水酸基（‐ＯＨ）を有する基板又はビーズを採用できる。また、相互作用に係るプローブ物質（例えば、核酸鎖）は、前記遊離アミノ基に対して、直接又は間接に結合することによって、前記固相に固定できる。なお、ブロックされたアミノ基は、プローブ物質を固定可能な活性点として機能しない。したがって、遊離アミノ基とブロックされたアミノ基の数的な比率を選択することにより、プローブ物質の単位面積当たりの固定密度を自由に調整することができる。

本発明では、第二に、相溶性を有する、遊離アミノ基を有するアミノシラン化合物とアミノ基がブロック化されたアミノシラン化合物とが混合された処理剤を用いて表面処理を施すことを特徴とする検出表面の作製方法を提供する。

本発明では、第三に、物質間の相互作用を進行させる反応場に臨む固相表面に、遊離アミノ基を有するアミノシラン化合物とアミノ基がブロック化されたアミノシラン化合物とを表面に存在させることにより、前記固相表面に対するプローブ物質の固定密度を制御する方法提供する。

ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。

「アミノシラン化合物」とは、シランＳｉＨ_４の水素原子が他の基に置換され、その置換基の一つにアミノ基を有し、かつ、ガラスや金属などの材料と化学結合する反応基（−ＯＲ、例えば、メトキシ基、エトキシ基など）を有し、前記材料の水酸基と酸塩基反応で化学結合する、いわゆるシランカップリング反応が可能な有機化合物であって、次の「化学式１」によりその化学構造を一般化できる。なお、特に示さないが、ジシランやトリシランを含むポリシランから誘導されたものも含む。

「ブロックされたアミノ基」とは、アミノ基の水素が、アルキル基などで置換されたものであり、ブロックされたアミノ基を有するアミノシラン化合物は、次の「化学式２」によりその化学構造を一般化でき、特に示さないがジシランやトリシランなどのポリシランから誘導されたものも含む。なお、下記化学式２のＲ_４,Ｒ_５は、環構造を形成していてもよい。

「検出表面」とは、物質間の相互作用を検出する目的で形成された固相表面及び該表面上の物質構成を含む概念であって、前記相互作用が進行する反応場に臨む面である。なお、この表面は、プローブ物質を固定化するのに適する表面処理が施される。

物質間の「相互作用」は、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く包含し、例えば、核酸鎖間のハイブリダイゼーション、タンパク質間の相互作用、抗原抗体反応、低分子-高分子間の相互作用などの物質間の化学的結合あるいは解離などを含み、狭く解釈されない。なお、「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。

「プローブ物質」は、当該物質と特異的に相互作用するターゲット物質を検出するための探り針（検出子）として機能する物質であり、本発明では、基板やビーズなどの固相表面に固定された状態で存在し、相互作用可能な標的物質を検出表面上で待ち受ける。

「核酸鎖」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を主に意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。

「センサーチップ」は、基板上に、物質間の相互作用を進行させることが可能な反応場を有し、かつ該相互作用を検出できるように構成されたもので、例えば、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）やたんぱくチップなどが含まれる。

本発明で用いる遊離アミノ基を有するアミノシラン化合物とブロックされたアミノ基を有するアミノシラン化合物は、互いに分子レベルで相溶性を有するため、固相基板と反応した際に、相分離した海島構造をとることはなく、分子レベルで活性点（プローブ固定に適する部位）の密度を制御することができる。その結果、プローブ固定密度をプローブ・ターゲットの組み合わせに最適な密度に制御することが可能となり、試料中のターゲット物質を定量的に測定することができる。

以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる方法の代表的な実施形態を例示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

図１は、本発明に係る検出表面、あるいは本発明に係るセンサーチップの要部である検出表面として利用できる固相表面の基本構成を説明するための図である。

まず、図１に示す符号Ｓは、本発明に係る検出表面を形成し得る基板やビーズなどの固相表面を表している。この固相表面Ｓは、表面に水酸基を有するガラスや金属などで形成された基板、ビーズなどの表面を示している。

このような構成の固相表面Ｓに、一般公知のシランカップリング反応により、二種類のアミノシラン化合物を結合させる。一つは、上記化学式１に示されたような化学構造を有する、遊離アミノ基を備えるアミノシラン化合物１であり、もう一種類は、上記化学式２に示されたような化学構造を有する、アルキル基などでブロックされたアミノ基を備えるアミノシラン化合物２（以下、ブロックアミノシラン化合物２と称する。）である。

このようなアミノシラン化合物は、いずれもシランカップリング剤（略称ＳＣＡ）と称される薬剤の範疇に入るもので、水と接すると、ケイ素原子Ｓｉに結合している-ＯＲ基が加水分解してシラノール（silanol）基（-Ｓｉ-ＯＨ）を生成する。このシラノール基は、自己縮合によって高分子化すると同時に、固相表面Ｓの水酸基と酸塩基反応で化学結合する（シランカップリング反応）。

本発明に係る検出表面は、アミノシラン化合物１とブロックアミノシラン化合物２を所望の割合で混合した表面処理剤を作製し、これを固相表面Ｓに接触させることによって作製できる。アミノシラン化合物１の遊離アミノ基（-NH₂）は、後述するプローブ物質を固定できる活性点として機能し、ブロックアミノシラン化合物２のブロックされたアミノ基は、前記活性点として機能しない。

なお、アミノシラン化合物１とブロックアミノシラン化合物２の混合割合は、プローブ物質の分子長、嵩高性、高次構造、相互作用の種類などを勘案して、目的の相互作用を効率よく進行させるのに好適な固定密度（単位面積あたりの固定密度）となるように、適宜選択、設計すればよい。

例えば、図２には、アミノシラン化合物１とブロックアミノシラン化合物２を、１：１の混合比（モル比）で充分に混合した表面処理剤によって処理された固相表面Ｓの構成が示されている。なお、図２中の符号３は、固相表面Ｓが臨む反応場を示しており、該反応場３において相互作用を進行させる（以下、同様）。

次に、図３は、図２に示された固相表面Ｓに存在するアミノシラン化合物１の遊離アミノ基に対して、介挿物質４を介して、プローブ物質５が結合された固相表面Ｓの構成が例示されている。介挿物質４は、固相表面Ｓとプローブ物質５を連結する役割の他に、その分子長を調整することにより、固相表面Ｓとプローブ物質５との間の距離を保持するためのスペーサとしての役割を発揮させることもできる。

なお、介挿物質４を用いずに、プローブ物質５に形成した末端カルボキシル基を直接アミノシラン化合物１の遊離アミノ基と結合（アミド結合）させるのは、自由である。

図３に示された実施形態では、介挿物質４の一例として、ジカルボン酸であるコハク酸（HOOC(CH₂)₂COOH）が選択されている。このコハク酸の一方のカルボキシル基（-COOH）は、アミノシラン化合物１の遊アミノ基とアミド結合（-NH-CO-）を形成し、他方のカルボキシル基は、プローブ物質５の一末端に形成されたアミノ基とアミド結合している（図３参照）。なお、介挿物質４は、コハク酸に限定されず、目的に応じて自由に選択可能である。

ここで、プローブ物質５は、検出目的の相互作用、より具体的には、ターゲットとなる物質に合わせて選択、あるいは設計すればよい。例えば、検出目的の相互作用がハイブリダイゼーションや転写応答反応などのような場合では、核酸鎖がプローブ物質５として選択され、その他の相互作用では、ペプチドやタンパク質などの生体物質や低分子化合物を選択することも可能である。

ここで、本発明で利用可能なアミノシラン化合物１を好適な例をいくつか挙げると、アミノメチルシラン、アミノエチルシラン、アミノプロピルシラン、アミノブチルシラン、アミノペンチルシランなどのようなアミノアルキルシラン群であって、一般式-ＯＲで示される加水分解基がケイ素原子Ｓｉに結合した構造のものである。一方、ブロックアミノ化合物２は、これらの化合物のアミノ基の水素原子が、例えば、メチル基、エチル基などのアルキル基やハロゲンや水酸基等を有するアルキル基、ベンゼンなどの芳香属化合物で置換されたものである。

以下、本発明を具体的な実施例により説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）。
１ｃｍ角に切断したシリコン基板を洗浄後、オゾン処理、過酸化水素水処理により表面を清浄化し、１２０度で３０分加熱乾燥した。続いて、トルエン中にアミノプロピルシラン及びジメチルアミノプロピルシラン（アミノ基がメチル基でブロックされている）の比率を変えた混合物をトルエンに対する体積比で２％添加し、洗浄した基板を浸漬した。５０度で３０分反応させた後、トルエン、水で洗浄後、アミノ基と反応するシアニン色素（Ｃｙ３）で染色し蛍光観察を行った。この結果を図４に示す。なお、図４の縦軸は蛍光強度であり、横軸には、アミノプロピルシラン（Ａ）とジメチルアミノプロピルシラン（Ｄ）の混合比が、１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、０：１００の場合が記載されている。

この実験は、プローブ物質が固定されてい状態で、アミノ基と反応する性質を有する蛍光色素からの蛍光強度を、アミノプロピルシランとジメチルアミノプロピルシランの比を変えて検証したものであり、図４に示されたこの実験の結果から、この基板表面では、遊離アミノ基（即ち、活性部位）の量が制御できることがわかる。

（実施例２）。
実施例１と同様に、アミノシランとジメチルアミノシランの比を変えてシランカップリング処理を行った後、コハク酸無水物１００mgを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液に基板を浸漬し、５０度２時間アミド化反応を行った。その後、基板を洗浄し１００ｍｌの水に５ｇのエチレンジクロライド（ＥＤＣ）、Ｎヒドロキシコハク酸イミド５ｇを溶解した反応液を用い活性エステルを形成した。

続いて、アミノ末端を有する合成ＤＮＡオリゴマー（塩基配列：CATTTCTTACATCTCCCAAACATCCCTCAC）を純水に溶解し（濃度１０uM）、加湿下８０度で１時間反応させた（１ｍｍスポット）。ハイブリダイゼーションは、プローブ物質として用いた前記ＤＮＡオリゴマーと相補鎖となるターゲット合成ＤＮＡオリゴマー（塩基配列：GTGAGGGATGTTTGGGAGATGTAAGAAATG）の３'末端に蛍光色素Ｃｙ３を標識したものを用いた。HEPESバッファー中１ｎＭに調整したターゲット含有溶液を先に作製した基板上に１０μＬ液盛し、加湿下６５度で４時間反応させた。反応後、バッファーで洗浄し、蛍光色素Ｃｙ３の蛍光を顕微鏡で観察した。その結果を図５に示す。

図５の結果からわかるように、プローブ物質である前記ＤＮＡオリゴマーの固定密度に対応して、リニアに蛍光強度が増加している。従ってこのプローブ固定密度範囲に設定すると、ターゲットＤＮＡオリゴマーは、立体障害の影響を受け難くなるため、ハイブリダイゼーションが効率良く進行することがわかる。

本発明は、ハイブリダイゼーションなどの物質間の相互作用を進行させ、この相互作用を検出するために使用される表面として利用できる。より具体的には、相互作用に係わるプローブ物質の固定密度を制御できる検出表面や該検出表面を有するセンサーチップ技術、相互作用の高精度な定量化技術として利用できる。

本発明に係る検出表面、あるいは本発明に係るセンサーチップの要部である検出表面として利用できる固相表面の基本構成を説明するための図である。 アミノシラン化合物（１）とブロックアミノシラン化合物（２）を１：１の混合比（モル比）で充分に混合した表面処理剤によって処理された固相表面（Ｓ）の構成を示す図である。 アミノシラン化合物（１）の遊離アミノ基に、介挿物質（４）介して、プローブ物質５が結合された固相表面（Ｓ）の構成を示す図である。 実施例１の蛍光強度測定結果を示す図面代用グラフである。 実施例２の蛍光強度測定結果を示す図面代用グラフである。

符号の説明

１ 遊離アミノ基を有するアミノシラン化合物
２ 遊離アミノ基がブロックされたアミノシラン化合物（ブロックアミノ化合物）
３ 反応場
４ 介挿物質
５ プローブ物質
Ｓ 固相表面

Claims (8)

1. 物質間の相互作用を進行させる反応場に臨む固相の表面を有する基板であって、
   遊離アミノ基を有するアミノシラン化合物とアミノ基がブロック化されたアミノシラン化合物が、それぞれシランカップリング反応を介して、前記固相に所定割合で結合されている検出表面を有する基板。
2. 前記固相は、水酸基を有することを特徴とする請求項１記載の基板。
3. 前記相互作用に係るプローブ物質が、前記遊離アミノ基に直接又は間接に、結合されていることを特徴とする請求項１記載の基板。
4. 前記プローブ物質は、核酸鎖であり、
   前記相互作用は、ハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載の基板。
5. 請求項１記載の基板を有するセンサーチップ。
6. 物質間の相互作用を進行させる反応場に臨む固相の表面を有するビーズであって、
   遊離アミノ基を有するアミノシラン化合物とアミノ基がブロック化されたアミノシラン化合物が、それぞれシランカップリング反応を介して、前記固相に所定割合で結合されている検出表面を有するビーズ。
7. 相溶性を有する、遊離アミノ基を有するアミノシラン化合物とアミノ基がブロック化されたアミノシラン化合物とが混合された処理剤を用いて表面処理を施すことを特徴とする検出表面の作製方法。
8. 物質間の相互作用を進行させる反応場に臨む固相表面に、遊離アミノ基を有するアミノシラン化合物とアミノ基がブロック化されたアミノシラン化合物とを表面に存在させることにより、前記固相表面に対するプローブ物質の固定密度を制御する方法。

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