KR100542385B1

KR100542385B1 - 생분자마이크로칩및그제조방법

Info

Publication number: KR100542385B1
Application number: KR1019980031456A
Authority: KR
Inventors: 박한오; 고한일
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 1998-08-03
Filing date: 1998-08-03
Publication date: 2006-04-28
Also published as: KR20000012892A

Abstract

본 발명은 생분자 마이크로칩 및 그 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 고체 표면상에 글라이시딜메타크릴레이트와 아크릴아미드를 중합반응시켜 겔을 형성하고, 아민기 DNA와 같은 생분자와 글라이시딜메타크릴레이트사이에 에폭시고리열림반응으로 안정된 공유결합을 형성시켜 제조된 생분자 마이크로칩 및 그 제조방법에 관한 것이다. 또한 DNA를 겔에 결합시킨후, 상보적인 PCR 산물 또는 올리고뉴클레오티드를 특이적으로 혼성하여 검출되는지 확인하였고 또한 그 민감도와 특이성을 조사하였다. 따라서, 본 발명의 생분자 마이크로칩을 혼성실험등에 사용하여 특이 유전자를 보다 신속히 검출할 수 있으며, 기존 혼성실험 등에 비하여 그 정차와 시간을 단축시킬 수 있으며, 아민기를 함유한 뉴클레오티드, 단백질, 항체등과 같은 생분자들을 겔 상에 붙일수 있으므로, 종래 DNA칩보다 넓은 분야에의 응용이 가능하며, DNA 시퀀싱, 유전변이와 다형현상연구에 보다 유용할 것이다

Description

생분자 마이크로칩 및 그 제조방법

본 발명은 생분자 마이크로칩 및 그 제조방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 폴리아크릴아미드 용액에 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가하여 중합된 겔에 아민기 함유 생분자 또는 아민기 함유 화합물을 공유결합시켜 안정된 결합을 지니도록 한 생분자 마이크로칩 및 그 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로, 올리고뉴클레오티드 또는 타겟 DNA 단편을 겔 또는 고체 표면에 고정 배치시키는 올리고뉴클레오티드의 혼성방법은 다양한 분야에 적용시킬 수 있는 기술이다. 최근 DNA 시퀀싱에 이러한 올리고뉴클레오티드 칩의 혼성 기술을 적용하는 많은 연구가 진행되고 있으며(Barinaga, M. (1991) Science 253 : 1489 ; Cantor, C.R., Mirzabekov, A. and Southern, E.(1992) Genomics 13, 1378 - 1383 ; Southern, E.M., Maskos, U. and Elder, J.K. (1992) Genomocs 13, 1008 - 1017 ; Lipshutz, R.J., Morris, D., Chee, M., Hubbell, E., Kozal, M.J., Shai, N., Shen, N., Yang, R. and Fodor, S.P.A. (1995) Biotechniques 19, 442-447), 그러한 DNA 배치는 여러 방법이 제시되고 있다. 크게 유리 표면에 올리고뉴클레오티드를 합성 하는 방법과 고체 표면 또는 겔 표면에 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정시키는 방법으로 나뉜다. 예를 들면 Southern과 그의 동료들은 유리표면에 올리고뉴클레오티드를 배치하는데 있어서 실리콘 러버 튜빙(silicone rubber tubing)들을 실리콘 러버 시멘트(silicone rubber cement)를 사용하여 유리판에 붙인 다음 합성시킬 유리판에 겹쳐 놓고 생성된 채널에 원하는 커플링 용액을 주입시켜 특이 부위에 합성시키고 나머지 차단(blocking)시킨 부위들은 그 튜빙을 회전 이동시켜 차례로 올리고뉴클레오티드를 합성시키는 방법을 개발하였다(Southern, E. M., Maskos, U. and Elder, J. K.(1992) Genomics 13, 1008-1017 ; Maskos, U. and Southern, E. M.(1992) Nucleic Acids Res. 20, 1675 - 1678 ; Maskos, U. and Southern, E. M.(1993) Nucleic Acids Res. 21, 2267 - 2268 ; Williams, J. C., Case-Green, S. C., Mir, K. U. and Southern, E. M.(1994) Nucleic Acids Res. 22, 1365 - l367). 주로 DNA 시퀀싱에 응용되는 감광식 올리고뉴클레오티드 합성의 도입으로 유리 표면에 직접 여러 올리고뉴클레오티드들을 합성시킬 수 있는 방법을 제시되어 있는바, 이 방법은 5' 수산기에 감광성 보호기들을 유도한 표면에 차광 마스크를 통해 방출된 빛으로 유리 수산기들을 형성시키고 보호된 데옥시뉴클레오시드를 결합하는 기술이다(Pease, A.C., Solas, D., Sullivan, E.J., Cronin, M.T., Holmes, C.P. and Fodor, S.P.A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5022-5026; Sapolsky, R.J. and Lipshutz, R.J. (1996) Genomics 33, 445-456; Hoheisel, J.D. (1997) Trendsin Biotechnology 15, 465-469; Afftmetrix corp). 러시아에서는 아미드기들을 히드라지드기로 치환하여 활성화시킨 폴리아크릴아미드와 결합시키기 위하여 소디움 퍼아이오다이트(NaIO₄₎로 3'-말단에 3-메틸우리딘을 지닌 올리고뉴클레오티드를 활성시켜 디알데히드기들을 형성시켜 겔에(100 X 100 X 20 um) 나열하는 마이크로칩이 개시되어 있다(Yershov, G.,Barsky, V., Belgovskiy, A., Kirillov, E., Kreindlin, E. , Ivanov, I., Parinov, S., Guschin, D., Drobishev, A., Dubiley, S., and Mirzabekov, A. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4913 - 4918 ; Parinov, S., Barsky, V., Yershov, G., Kirillov, E., Timofeev, E., Belgovsky, A. and Mirzabekov, A. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2998-3004). 또한 포스포르아미아미디트계(Phosphoramidite-based) 합성 방법으로 아민화된 폴리프로필렌 필름(PP-NH₂)에 올리고뉴클레오티드들을 고정시켜 나열하는 방법이 제시되었다(Matson, R.S., Rampal, J., Pentoney, S.L., Jr., Anderson, P.D. and Coassin, P.(1995) Analytical Biochemistry 224. 110-116). 또 다른 방법으로는 핵산 혼성화의 검출에서 3'-아미노 변형된 올리고뉴클레오티드들을 실리콘 칩 표면 위의 얇은 이산화규소(SiO₂) 필름에 결합시켜 고정하는 방법으로서, 3' 아미노 결합(linkage)과 3'-글리시드옥시프로필트리메톡시실란으로 처리되어 유도된 에폭시실란 단일층(monolayer)사이에 에폭시고리열림 반응으로 3'-아미노 변형된 올리고뉴클레오티드를 결합하는 방법이 개시되어 있다(Lamture, J.B., Beattie, K.L., Burke, B.E., Eggers, M.D., Ehrlich, D.J., Fowler, R., Hollis, M.A. Kosicki, B.B., Reich, R.K., Smith, S.R., Varma, R.S. and Hogan, M.E. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 2121-2125). 뿐만 아니라 일차 아민들이 존재하는 나일론 멤브레인에 동종폴리머(homopolymers; dTTP)로 테일링(tailing)한 올리고뉴클레오티드를 스폿트(spot)하고, UV 조사로 올리고뉴클레오타이드의 티민 염기를 활성시켜 공유결합을 유도하는 방법이 개시되었으며(Saiki, R.K., Walsh, P.S., Levenson, C.H. and Erlich, H.A. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6230-6234), 이를 개선한 아미노-링커를 붙인 올리고뉴클레오티드와 나일론막의 카르복실기들 사이에 아미드 결합으로 보다 안정한 결합 형성하고 혼성화 효율도 증가시킨 방법도 개시되어 있다(Zhang, Y., Coyne, M.Y., Will, S.G., Levenson, C.H. and Kawasaki, E.S. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 3929-3933). 이러한 방법들의 도입으로 개발되어진 일명 DNA 칩에 방사성표지 또는 비방사성 표지된 타겟 DNA를 가하여 혼성화하는 방법들은 DNA 시퀀싱 뿐만 아니라 RAS 점 돌연변이, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 결실과 여러 점 돌연변이를 검출하는데 성공적으로 적용되고 있으며 (Cantor, C.R., Mirzabekov, A. and Southern, E, (1992) Genomics 13, 1378-1383; Zhang, Y., Coyne, M.Y., Will, S.G., Levenson, C.H. and Kawasaki, E.S.(1991) Nucleic Acids Res. 19, 3929-3933; Hacia, J.J., Brody, L.C., Chee, M.S., Fodor, S.P.A. and Colliins, F.S. (1996) Nature Genetics 14, 441-447 ; Shoemaker, D.D., Lashkari, D.A., Morris, D., Mittmann, M. and Davis, R.W.(1996) Nature Genetics 14, 450-456; Sosnowski, R.G., Tu, E., Butler, W.F., 0'Connel, J.P. and Heller, M.J.(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1119-1123 ), 특히 유전 변이 검사와 유전다형현상 연구에도 이 방법이 크게 기여할 것으로 여겨지고 있다(Lipshutz, R.J., Morris, D., Chee, M., Hubbell, E., Kozal, M.J., Shai, N., Shen, N., Yang, R. and Fodor, S.P.A. (1995) Biotechniques 19, 442-447 ; Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W. and Brown, P.O. (1995) Science 270, 467-470 ; Chee, M., Yang, R., Hubbell, E., Berno, A., Huang, X.C., Stern, D., Winkler, J., Lock, D.J., Morris, M.S. and Fodor, S.P.A. (1996) Science 274, 610-614 ; DeRisi, J., Penland, L. and Brown, P.O. ; Bittner, M.L., Meltzer, P.S., Ray, M., Chen, Y., Su, Y.A. and Trent, J.M.(1996) Nature Genetics 14, 457-460). 또한 이러한 방법의 민감성, 단일성과 재현성은 감염 및 유전적 질병의 진단 뿐만 아니라 종양형성(neoplasias), HLA 타이핑(HLA typing)등의 변이 분석에 대하여 매우 이상적인 도구가 될 것으로 예상된다(Saiki, R.K., Walsh, P.S., Levenson, C.H. and Erlich, H.A.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6230-6234 ; Zhang, Y., Coyne, M.Y., Will,. S.G., Levenson, C.H. and Kawasaki, E.S.(1991) Nucleic Acids Res. 19, 3929-3933).

유리 표면에 직접적으로 포토리소그래픽(Photolithographic) 합성 또는 다른 합성방법에 의한 올리고뉴클레오티드 배치는 매우 어려운 고단위 기술이며, 앞으로도 보안해야할 문제를 갖고 있다. 이러한 문제로는 대표적으로 고체 표면에 얻어지는 산물이 비교적 낮아 특히 정량분석에 있어서는 적합하지 못하다. 그에 비해 본 발명의 겔을 이용한 DNA칩은 기존 방법으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 그 표면에 직접적으로 배치할 수 있기 때문에 요구되는 농도로 배치시킬 수 있다. 알려진 바로는 폴리아크릴아미드 겔은 50mM DNA 고정 수용 능력을 가지고 있으며 올리고뉴클레오티드 칩의 배치 및 혼성화에 있어서 실제적으로 DNA를 1.5마이크로몰 농도에서 1.5밀리몰 농도까지 사용할 수 있다(Yershov, G., Barsky, V., Belgovskiy, A., Kirillov, E., Kreindlin, E., Ivanov, I., Parinov, S., Guschin, D., Drobishev, A., Dubiley, S., and Mirzabekov, A. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4913-4918 ; Parinov, S., Barsky, V., Yershov, G., Kirillov, E., Timofeev, E., Belgovsky, A. and Mirzabekov, A. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2998-3004). 이것은 평방 40 X 40 X 20 마이크로미터당 0.5 내지 50fmol의 올리고뉴클레오티드와 부합한다. 이것은 유리표면의 2차원적 고정 능력보다 100배 이상높다(Yershov, G., Barsky, V. , Belgovskiy, A., Kirillov, E., Kreindlin, E., Ivanov, I., Parinov, S., Guschin, D., Drobishev, A., Dubiley, S., and Mirzabekov, A.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4913-4918). 그러므로 이 겔을 이용한 DNA칩은 상대적으로 적용시킬 분야가 넓고 제조하기가 간편한 이점이 있다.

이러한 기술하에, 본 발명자는 상기 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 겔을 이용한 생분자 마이크로칩을 제조하기 위하여 예의 노력한 결과, 폴리아크릴아미드 용액내에 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가하고, 고체 표면상에 글라이시딜메타크릴레이트와 아크릴아미드를 중합반응시켜 겔을 형성한후, 아민기 함유 DNA 또는 아민기 함유 화합물이 상기 겔상의 글라이시딜기와 안정한 공유결합을 이룸을 확인하고, 겔 상에 결합된 DNA와 상보적인 PCR 산물 또는 올리고뉴클레오티드를 특이적으로 혼성화하여 검출되는지 확인하고, 또한 검출의 민감도와 특이성을 조사하여 본 발명의 생분자 마이크로칩을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 폴리아크릴아미드 용액에 글라이시딜메타크릴레이트를 가하여 중합시켜 고체표면상에 겔을 제조하고, 여기에 아민기 함유 DNA와 같은 생분자 또는 아민기 함유 화합물을 공유결합시켜 안정된 결합을 지닌 생분자 마이크로칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 생분자 마이크로칩을 제조하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생분자 예를들면, DNA 마이크로칩에 DNA 또는 RNA탐침에 의한 혼성실험을 통하여 간편하고 신속하게 DNA를 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 고체표면상에서 폴리아크릴아미드 용액에 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가하여 중합반응시켜 겔을 형성하고, 여기에 아민기 함유 생분자 가령, 올리고뉴클레오티드 또는 아민기 함유 화합물을 공유결합시켜 안정된 결합을 지닌 생분자 마이크로칩 및 그 제조방법을 제공하는 것이다. 겔은 폴리아크릴아미드와 글라이시딜메타크릴레이트 단위체 중합반응에서 글라이시딜메타크릴레이트의 메타크릴기와 아크릴아미드의 아크릴기가 중합결합하여 형성된다. 이때 겔화 반응을 위해 폴리아클리아미드의 용액내에 겔화촉진제로서 N,N,N',N-테트라메틸렌디아민과 1O% 암모니움퍼설페이트를 적량 가한다. 그후, 생분자 가령, 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 링커로 아민기(NH₂)를 부착하고, 링커로 부착된 아민기(NH₂)와 글라이시딜메타크릴레이트의 글라이시딜가 에폭시(C₃H₆O_2-) 고리열림(ring opening)반응을 함으로써 올리고뉴클레오티드가 겔에 안정되게 결합하게 된다. 이 반응은 아민기가 붙어있는 거대분자들을 겔에 에폭시고리열림반응으로 매우 안정되게 결합시킬 수 있다.

겔 제조에 있어서 폴리아크릴아미드 용액에 아크릴아미드와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 비율은 90 내지 99.1 : 0.1 내지 10(w/v), 바람직하게는 99 : 1(w/v)로 하였는데, 이는 겔의 구멍 크기(pore size)를 비교적 크게 하여 겔에 올리고뉴클레오티드를 결합시키는 것을 용이하게 하였고, 혼성반응에서도 겔에 고정시킨 DNA와 그와 상동한 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 DNA가 혼성화되는 것을 용이하게 하였다. 상기 폴리아크릴아미드 용액은 최종농도 6 내지 10%, 바람직하게는 8%로 제조한다. 글라이시딜메타크릴레이트 사용량은 전체 폴리아크릴아미드 용액에 대하여 1 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가하였다. 혼성화된 산물을 검출하기 위하여, 탐침은 PCR을 사용하여 비오틴 또는 형광 표식 단일쇄 DNA를 제조하여 혼성화시킨 후 그 결과를 발색반응 또는 UV로 검출하였다. 또한 표식하지 않은 상동한 올리고 뉴클레오티드와 혼성화시켜 이중나선에 주로 염색되는 EtBr염색 방법으로 그 민감도와 특이성에 대한 실험을 수행하여 적어도 5pmol/㎕ 및 서로다른 세개의 올리고뉴클레오티드중 상보적인 하나를 특이적으로 검출할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 생분자 마이크로칩(biomolecular microchip)을 이용하면 기존 PCR 방법보다 특정 유전자를 신속하고 간단한 방법으로 검출할 수 있고, 뿐만아니라 DNA 시퀀싱, 유전변이와 다형현상 연구에 유용하리라 예상된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1 : 아민기 올리고뉴클레오티드 합성

글라이시딜메타크릴레이트를 첨가하여 제조한 겔에 올리고뉴클레오티드를 결합시키기 위해 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 아민-링커를 부착시킨 아민기 올리고뉴클레오티드를 DNA 합성기(퍼셉티브 바이오시스템즈 모델 8909/ 8909 ; (주) 바이오니아)상에서 합성하였다. 사용된 아민기 올리고뉴클레오티드의 염기배열은 다음과 같다.

IPRO2 : 5'-5CGGATAAATCCACTCTGGCTGC-3'

IPRO3 : 5'-5GTTATCACGGATCACAATGACGGCACTTAT-3'

FRA2-1 : 5'-5GAAGGTAGCGACTCGTATTAGTGAATACGA-3'

FRA2-2 : 5'-5GGCTACCATCAGGTACGTCTAATACTTCAT-3'

상기에서, 5는 아민기(NH₂)이다.

실시예 2 : 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가한 폴리아크릴아미드 겔의 제조

아크릴아미드와 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드의 비율을 99 : 1(w/w)로 하여, 최종농도 8%(w/v)의 폴리아크릴아미드 용액을 제조하였다. 글라이시딜메타크릴레이트의 양은 상기 전체 폴리아크릴아미드 용액에 대해 각각 1%(w/v), 2%(w/v), 3%(w/v), 4%(w/v), 5%(w/v)의 농도로 가하여 혼합기에 섞었다. 이어, 겔화촉진제로서 N,N,N',N-테트라메틸에틸렌디아민과 1O% 암모니움퍼설페이트를 상기 용액에 각각 4㎕/㎖와 10㎕/㎖씩 가하여 중합반응시켰다.

실시예 3 : 유리 슬라이드 표면에 겔 고정화

현미경 슬라이드(76 X 26 mm) 표면에 결합 용액(Binding Solution ; 5㎕ 3- (트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트; 5㎕ 아세트산; 990㎕, 에틸알코올)을 처리하고 건조시켰다. 그 표면상에 중합시킨 폴리아크릴아미드 겔 용액을 가하여 글래스 코트 용액(Glass Coat Soluion, Sigma사)으로 처리시킨 슬라이드를 그 위에 덮고 2시간 이상 반응시켰다. 그후, 덮은 슬라이드를 분리시켜 20㎕이하의 두께로 글라이시딜메타크릴레이트가 첨가중합된 활성화된 폴리아크릴아미드 겔을 형성하였다.

실시예 4 : 활성화된 겔에 플루오레세인아민의 고정 및 분석

상기와 같이 활성화된 겔에서, 글라이시딜메타크릴레이트의 글라이시딜기와 아민기가 반응하여 안정한 결합으로 겔상에 고정되는가를 알기 위하여 0.5M 플루오레세인아민 용액에 0.1M 소듐 보레이트 pH9.5가 1:1로 혼합된 용액을 슬라이드 표면상의 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가한 겔과 첨가하지 않은 겔 상에 직경 5 X 5mm으로 스폿트하여 30분간 실온에서 반응시켰다. 그 후 물로 5분씩 세번 세척한 후, UV 투시기(transilluminator)를 이용하여 검색한 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이 글라시딜메타크릴레이트가 있는 겔에서만 형광이 검출된 것으로 보아 플루오레세인아민이 에폭시고리열림반응으로 안정되게 공유결합하여 고정되어 있음을 알 수 있다. 도 1에서 1 레인은 글라이시딜메타크릴레이트 첨가없이 제조된 겔에 플루오레세인아민을 고정시킨 경우로서 플루오레세인아민이 전혀 고정되지 않는 것을 알 수 있으며, 2 레인은 5%(w/v) 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가하여 제조된 겔에 플루오레세인아민을 고정시킨 경우로서, 플루오레세인아민이 고정되었음을 알 수 있었다.

실시예 5 : 활성화된 겔에 아민기 올리고뉴클레오티드와 PCR 산물의 고정화

상기 합성한 아민기 올리고뉴클레오티드 또는 예르시니아 게놈 DNA(Yersinia genomic DNA)의 inv 유전자로부터 얻어진 295 또는 129 염기쌍 PCR 산물을 소듐 보레이트(0.1M, pH9.3)에 1:1로 희석시킨 다음, 활성화된 폴리아크릴아미드 겔에 최고 직경 3 X 3mm로 스폿트하였다. 이때 PCR 산물은 100℃, 5분간 열처리한 다음, 바로 얼음 상에 식혀서 단일쇄 DNA로 만들어 스폿트하였다. 아민기 올리고뉴클레오티드 또는 PCR 산물의 고정화 반응을 실온 상에서 30분 동안 실행하고 물로 세척한후, 더 이상 아민기에 의한 에폭시고리열림반응을 방지하기 위해서 차단 용액인 1M 에탄올아민을 가하여 30분 동안 반응시킨 후 물로 5분씩 세번 세척하였다. 그 슬라이드를 완전히 말린 후, 다음 단계를 위해 4℃에 저장시켰다. 또한 EtBr 염색에 의한 올리고뉴클레오티드의 검출 민감도를 측정하기 위하여 아민기 올리고뉴클레오티드 FRA2-1을 0.5fmol까지 계열희석(serial dilution)하여 상기한 바와 같이 겔에 고정배치시키고 이 EtBr 검출방법의 특이성을 확인하기 위해 음성대조군으로서 두종류의 아민기 올리고뉴클레오티드 IPRO2와 FRA2-2를 겔에 고정시켰다.

실험제조예 : 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 탐침 제조

상기 올리고뉴클레오티드와 PCR 산물을 겔에 고정 배치시킨 후 혼성실험을 하였다. 이때 탐침으로는 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 PCR증폭으로 제조된 산물을 사용하였다. 모든 PCR 증폭반응은 20㎕ PCR PreMix(1U, 열안정성 DNA 폴리머라제; 250uM, 각 dNTP; 50mM, Tris-HCl, pH8.3; 40mM, KCl; 1.5mM, MgCl₂; 안정화제; loading dye; (주)바이오니아)를 사용하였다. 상보적인 염기 배열을 포함하고 있는 예르시니아(Yersinia) inv 유전자의 295 염기쌍 비오틴 표식 단일쇄 DNA 단편을 제조하기 위해 2pmol의 IPRO2 센스 프라이머와 20pmol의 KINV4 안티센스 프라이머(5'-CGTGAAATTAACCGTCACACT-3'), 및 1μM 비오틴-11-dUTP(베링거 만하임)를 첨가한 PreMix PCR Kit을 사용하여 비대칭 PCR 반응을 수행하였다. 이때 주형 예르시니아 게놈 DNA의 양은 1Ong을 상용하였다. 마찬가지로, 형광 표식 단일쇄 DNA 탐침을 제조하기 위해 2pmol의 IPRO3 센스 프라이머와 20pmol의 KINV4 안티센스 프라이머, 및 3nmole의 아메르샴 플루오로그린(Amersham FluoroGreen; Fluorescein-11-dUTP)을 첨가하여 비대칭 PCR반응을 수행하여 129 염기쌍 형광 표식 단일쇄 DNA 단편을 제조하였다. 이때 주형 예르시니아 DNA양은 1Ong을 사용하였다. 모든 PCR 조건은 94℃, 30초; 57℃, 60초; 72℃ 1분 30초로 30회 반복 시행하였고 예비변성(Pre-denaturation)과 최종신장(Last-extension)은 각각 94℃에서 5분, 72℃에서 5분간 수행하였다.

실시예 6 : 비오틴 표식 단일쇄 DNA 탐침 (295 염기)을 이용한 혼성실험

비대칭 PCR을 이용하여 제조된 20㎕ 비오틴 표식 단일쇄 PCR 용액을 95℃, 5분간 열처리하여 탐침으로 사용하였다(도 2 참조). 295 염기 단일쇄 DNA O.5㎕, 1 ㎕ PCR 용액 및 최종농도 0.5nmol 및 1nmol의 22 염기 올리고뉴클레오티드(IPRO2)를 겔 상에 고정시키고 난 뒤, 5㎖의 혼성화 완충용액(5XSSC, 1% 차단시약, 0.1% N-라우로일사코신, 0.02% SDS)을 넣고 42℃에서 1시간 이상 예비혼성화시켰다. 여기에 제조된 비오틴 표식 단일쇄 PCR 용액을 첨가하고, 상온에서 하룻밤 혼성화시켰다. 혼성화시킨 후 슬라이드를 2XSSC, 0.1% SDS로 5분씩 2회, O.1XSSC, 0.1% SDS로 5분씩 2회, 1M 말레산, 0.15M NaCl로 10분간 세척하였다. 스트렙트아비딘-AP(Streptavidin-AP) 접합체를 첨가한 알칼리성 인산완충용액(150mM NaCl, 100mM Tris-HCl, pH7.5)중에서 슬라이드를 약 1시간동안 반응시키고 세척한 후, NBT, BCIP를 첨가하여 발색반응시킴으로써 혼성된 스폿트를 검출하였다. 도 2에 나타낸바와 같이 PCR 산물을 스폿트한 경우에는 스폿트된 위치는 확인이 되나 발색감도가 약하고 스폿트 모양이 꼬리처럼 튕겨져 나가는 현상이 관찰되며, 올리고뉴클레오티드를 스폿트한 경우는 거의 스폿트 위치를 확인하기에는 발색감도가 약함이 관찰되었다. 도 2에서 1과 2 레인은 0.5㎕, 3과 4 레인은 1㎕의 295 염기 단일쇄 DNA를, 5와 6 레인은 각각 1nmol과 0,5nmol의 IPRO2를 나타낸다. 또한 스트렙트아비딘-AP를 이용한 발색 방법은 실험 단계가 길고 세척하는 횟수가 많아 본 발명의 생분자칩에 사용하기에는 불편하였다.

실시예 7 : 형광 표식 단일쇄 DNA 탐침 (129 염기)을 이용한 혼성실험

형광 표식 단일쇄 DNA 탐침을 이용한 혼성 실험을 하기 위해서 슬라이드상에 1nmol의 IPRO3 올리고뉴클레오티드를 고정시킨 후, 탐침으로 제조된 20 마이크로리터의 PCR 용액을 첨가한 최종 200㎕ 1X 혼성화 완충용액을 슬라이드상에 가하여 상온에서 30분간 반응시킨 후, 혼성화 완충용액으로 5분씩 3회 세척하였다. 형광반응을 검사하기 위해 형광 현미경(eplfluorescence microscope; excitation = 490nm, emission=520nm) 또는 UV 투시기를 사용하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 1 레인은 세척전 글라이시딜메타크릴레이트의 첨가없이 제조된 겔, 2 레인은 역시 세척전 글라이시딜메타크릴레이트의 첨가없이 제조된 겔. 또한 3 레인은 세척후 글라이시딜메타크릴레이트의 첨가없이 제조된 겔을 나타낸 경우이고, 4 레인은 세척후 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가하여 제조된 겔을 나타낸 경우이다. 예상대로 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가한 겔에 DNA가 고정되었으며, 세척 한 후에도 안정된 결합으로 고정되는 것이 입증되었다. 그 뿐만 아니라, 비오틴 표식 단일쇄 DNA 탐침을 이용한 혼성실험 보다 형광 표식 단일쇄 DNA 탐침을 이용한 실험이 혼성된 스폿트를 검출하기 위해서는 발광 감도가 더 강하고 안전성이 높다는 것을 알 수 있으며 세척 단계를 줄여 시간도 단축 시킬 수 있었다.

실시예 8 : 글라이시딜 농도에 따른 올리고뉴클레오티드의 고정율

글라이시딜메타크릴레이트의 농도에 따른 올리고뉴클레오티드의 고정율을 알기 위한 실험으로서, 1% 내지 5%의 다양한 글라이시딜메타크릴레이트 농도로 제조된 상기한 바와 같은 겔에 FRA2-1 올리고뉴클레오티드를 고정시키고, 상보적인 올리고뉴클레오티드 FRA2-1-2 (5'-TCGTATTCACTAATACGAGTCGCTACCTT C-3')를 1X혼성화 완충용액에 최종농도 10pmol로 제조하여 슬라이드상에 가하였다. 실온에서 30분간 반응시킨 다음, 1X 혼성화 완충용액으로 5분씩 3번 세척하였다. 그 후, 0.1X 혼성화 완충용액중의 최종농도 1mM EtBr용액을 제조한 다음, 그 용액을 슬라이드에 가하여 20분간 염색하고 물로 여러번 세척하였다. 혼성된 올리고뉴클레오티드는 UV투시기를 사용하여 검출하였다. 그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 1%의 글라이시딜메타크릴레이트 농도에서도 올리고뉴클레오티드를 고정시킬 수 있음을 알 수 있었다. 대조군으로서 혼성시키지 않았던 올리고뉴클레오티드를 EtBr로 염색하여 검출해 본 결과, EtBr이 단일쇄 DNA에 제대로 삽입이 되지 않는 성질때문에 혼성된 DNA와 혼성되지 않은 DNA를 비교할 수 있었다. 도 4에서 1 레인은 올리고뉴클레오티드(FRA2-1)를 고정시킨 후, 혼성시키지 않고 EtBr로 검출한 것이고, 2 레인은 동일하게 고정시킨후, 상보적 올리고뉴클레오티드(FRA2-1-2)로 혼성시킨후 EtBr로 염색하여 검출한 사진이다.

실시예 9: EtBr 염색에 의한 올리고뉴클레오티드의 혼성의 민감도 및 특이성

상기와 바와 같은 방법을 사용하여 혼성화의 특이성과 민감도에 대한 실험을 수행하였다 도 5에 나타낸 바와 같이, 슬라이드상에 최종농도 500pmol/㎕ 내지 0.5fmol/㎕ 올리고뉴클레오티드(FRA2-1)를 나열하고(도 5의 A 참조), 동시에 비상보적인 IPRO2와 FRA2-2 각각 50Opmol/㎕과 50pmol/㎕을 스폿트하였다(도 5의 B 참조). FRA2-1에 상보적인 FRA2-1-2 올리고뉴클레오티드를 그 슬라이드에 혼성화시켜 EtBr로 염색하여 검출한 결과, 5pmol/㎕의 올리고뉴클레오티드까지 검출되었고, 50pmol/㎕까지는 특이적으로 혼성된 DNA를 검출할 수 있었다. 비상보적인 올리고뉴클레오티드에서도 스폿트이 보이지만 빛의 밝기를 정량적으로 비교분석한 결과, OD의 값이 현저하게 낮게 나왔다. 500pmol/㎕인 경우, 상보적인 올리고뉴클레오티드의 OD 값은 2,645(FRA2-1)인데 반하여, 비상보적인 올리고뉴클레오티드들의 OD 값은 각각 610(IPRO2), 744(FRA2-2)이다. 50pmol/㎕인 경우의 FRA2-1의 OD 값은 1,148이고 IPRO2와 FRA2-2는 각각 478, 320으로 나타났다(Imager I에 의해 나타난 영상을 1D Main program으로 측정; (주) 바이오니아). 도 5에서 A는 민감도 조사로서, a-1: 올리고뉴클레오티드 FRA2-1 50Opmol/㎕, a-2:50 pmol/㎕, a-3: 5pmol/㎕, b-1: 0.5pmol/㎕, b-2: 50fmol/㎕, b-3: 5fmol/㎕, c-1: 0.5fmol/㎕, c-2: 비상보적 올리고뉴클레티드 FRA2-2 50Opmol/㎕, c-3: 비상보적 올리고뉴클레티드 IPRO2 50Opmol/㎕을 나타내고, B는 특이성조사로서, a-1: FRA2-1 50Opmol/㎕, a-2: FRA2-1 50pmol/㎕, b-1: IPRO2 50Opmol/㎕, b-2: IPRO2 50pmol/㎕, c-1: FRA2-2 50Opmol/㎕, c-2 : FRA2-2 50pmol/㎕을 나타낸다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 아민기 함유 생분자를 겔 상에 고정시키기 위해 글라이시딜메타크릴레이트를 폴리아크릴아마이드에 가하여 중합반응시켜 고체표면상에 겔 상태로 형성함으로써, 생분자내의 아민기와 글라이시딜메타크릴레이트의 글라이시딜기가 에폭시고리열림반응으로 안정된 결합을 이룰 수 있었다. 따라서, 본 발명의 생분자 마이크로칩을 혼성 실험 등에 사용하여, 목적으로 하는 특이 유전자를 보다 신속히 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 기존 혼성실험 등에 비해서 그 절차와 시간을 단축 시킬 수 있다. 또한, 이러한 방법을 이용하여 아민기가 붙어 있는 뉴클레오티드, 단백질, 항체등과 같은 생분자들을 겔 상에 붙일 수 있으므로 종래의 DNA 칩보다 넓은 분야에의 응용이 가능하며, DNA 시퀀싱, 유전변이 및 다형현상연구에 보다 유용할 것이다.

도 1은 본 발명의 겔에 플루오레세인아민의 고정 여부를 나타내는 도이다.

도 2는 PCR 산물과 올리고뉴클레오티드 IPRO2를 활성화된 겔에 고정시킨 후, 비오틴 표식 단일쇄 DNA 탐침(probe)을 이용하여 혼성화(hybridization)시킨 결과를 나타내는 도이다.

도 3은 올리고뉴클레오티드 IPRO3를 활성화된 겔에 고정시킨 후, 형광 표식 단일쇄 DNA 탐침을 이용하여 혼성시킨 결과를 나타내는 도이다.

도 4는 글라이시딜메타크릴레이트 농도에 따른 올리고뉴클레오티드 FRA2-1의 고정율을 나타내는 도이다.

도 5는 EtBr 염색에 의한 올리고뉴클레오티드 혼성의 민감도 및 특이성을 조사한 사진 및 정량분석이다.

Claims

제 1 항에 있어서, 상기 폴리아크릴아미드 용액은 90 내지 99.9 : 0.1 내지 10(w/w)로 혼합된 아크릴아미드와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드, 및 겔화촉진제를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 생분자 마이크로칩의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 고체표면이 유리표면인 것을 특징으로 하는 생분자 마이크로칩의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 생분자는 DNA, RNA, 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생분자 마이크로칩의 제조방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 생분자는 특히 DNA인 것을 특징으로 하는 생분자 마이크로칩의 제조방법.
폴리아크릴아미드 용액을 제조하고,

고체 표면상에서 상기 폴리아크릴아미드 용액내에 글라이시딜메타크릴레이트를 전체 폴리아크릴아미드 용액내에 1 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가하여 중합반응시켜 겔을 제조하고,

상기 겔상의 글라이시딜기와 아민기 함유 생분자 또는 아민기 함유 화합물을 에폭시고리열림 반응시켜 안정된 공유결합을 형성시키는 것으로 이루어지는 생분자마이크로칩의 제조방법.
폴리아크릴아미드 용액을 제조하고,

고체 표면상에서 상기 폴리아크릴아미드 용액내에 글라이시딜메타크릴레이트

를 전체 폴리아크릴아미드 용액내에 1 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가하여 중합반응시켜 겔을 제조하고,

상기 겔상의 글라이시딜기와 아민기 함유 생분자 또는 아민기 함유 화합물을 에폭시고리열림 반응시켜 제조된 생분자마이크로칩.