JP2007300829A - Ｄｎａマイクロアレイ等に供する検体の調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＤＮＡマイクロアレイ等での固相上のプローブとのハイブリダイゼーションに供する、ターゲット核酸の定量的な検出に適した検体の調製方法を提供すること。
【解決手段】３’末端にＴ以外の配列を有するオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写することで塩基長の一律なｃＤＮＡが得られ、検体であるｃＲＮＡの塩基長も揃い、標的核酸の存在量をより正確に反映したハイブリッド体形成が可能となる。さらにポリＡ配列を有する標識付きヌクレオチドを前記ｃＲＮＡにアニールさせる方法で標識することで、ｃＲＮＡ一分子に対し一単位の標識物質を付加することでハイブリッド体の量に比例した検出が可能となる。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＤＮＡマイクロアレイ等に供する検体の調製方法に関する。

ヒトゲノム計画に代表されるように各種の生物の遺伝子が解明され、生命活動のメカニズム、病気、体質等と遺伝子の関連が次々と調べられている。そして、遺伝子の有無やその存在量（発現量）を知ることで、例えば病気などのより詳細な特徴やタイピング、あるいは効果的な治療方法の選択などが可能となることがわかってきた。

検体に含まれている特定の遺伝子の有無やその存在量を調べる方法は、昔から多くの方法が考案されている。その中でも応用範囲が広く検出対象によらず適用可能な方法として、検出対象とする遺伝子あるいは核酸の特徴的な部分配列を選び、その部分配列の有無や量を調べることにより、その有無あるいは存在量を調べる方法が広く用いられている。具体的には、選び出された部分配列の相補鎖に相当する核酸配列（プローブ）を用意し、検体とプローブがハイブリダイゼーションすることを何らかの手段で検出することにより、検体中の核酸配列の有無を調べる方法である。

ハイブリダイゼーションを利用した特定の核酸の検出方法は、固相上での反応であるか、液相中での反応であるかを問わず用いることが可能である。例えば、固相上でハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブを固相上に固定または吸着させておき、その固相上に何らかの検出可能な標識物質により標識した検体を添加し、固相上からの標識物質の信号を測定することにより検出する方法が代表的である。中でもプローブをガラスや金属などの平面基板上に固定したチップ、あるいは微少粒子表面へ固定したビーズ等は代表的な固相ハイブリダイゼーションの形態である。固相上のハイブリダイゼーションが好まれる理由は、Ｂ／Ｆ分離が容易であること、検出領域を物理的に微小化でき高感度化が期待できること、複数種のプローブを物理的に隔離することにより同時多項目の検出が可能であることなどがある。さらには、固相ゆえにその取り扱いや応用が容易に出来るからである。

ところで、上記のようなハイブリダイゼーションを利用した特定の核酸の検出方法では、検体にあらかじめ標識をしておく必要がある。また、調べたい検体の絶対量が少ない場合、ハイブリダイゼーションで核酸を検出できるよう検体を増幅するステップも必要とする。

上記ハイブリダイゼーションを利用して遺伝子の発現量を調べる場合、細胞等の生体試料から抽出されたＲＮＡを検体として用いる場合が多い。ｍＲＮＡを増幅する方法としては一般的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法（ＩＶＴ法）が用いられる。この方法では、まず微量ＲＮＡに対し、ＲＮＡ合成酵素のプローモータ配列が付加されたプライマーを用いて逆転写反応により一本鎖のｃＤＮＡを合成する。さらにＤＮＡ合成酵素によって二本鎖ｃＤＮＡを調製後、ＲＮＡポリメラーゼで転写反応を行うことによってｃＲＮＡを合成する。材料となるリボ核酸が存在し、酵素が活性を持つ限り、ｃＤＮＡからＲＮＡが合成され続けるので、最終的には１分子のｃＤＮＡから約１００分子ほどのｃＲＮＡが生成する。増幅効率の点ではＰＣＲに劣るものの、ＩＶＴ法は検体中の遺伝子の発現プロファイルを保ったまま検体を増幅でき、網羅的な発現解析等には特に有効である。また、このＩＶＴ法を行う際に、標識付きヌクレオチドを添加しておくことによって標識物質を取り込むことができる。

ところで、多くのマイクロアレイの場合、プローブは５’末端に導入された物質を介して固相上に固定されている。従って、プローブとハイブリッド体を形成するｃＲＮＡの全塩基配列のうち、ハイブリッド部位より５’末端側は液相側、３’末端側は固相側に存在する。ハイブリッド部位から５’末端までの長さが長くなるほど、ハイブリッド体の安定性が低くなることが報告されている（非特許文献１を参照のこと）。

また、我々は、固相上に固定されたプローブとターゲット核酸とのハイブリッド体は、下記で定義するＬ１、Ｌ２において、Ｌ１≦Ｌ２の関係を満足すると安定するということを確認している。ここで、プローブとハイブリッド体を形成するターゲット核酸において、ハイブリッド部位より５’末端側のハイブリッド体を形成していない部位の塩基鎖長をＬ１とし、３’末端側のハイブリッド体を形成していない部位の塩基鎖長をＬ２とする。
監修；高木利久、編集；東京大学理学部生物情報科学学部教育特別プログラム「東京大学バイオインフォマティクス集中講義」羊土社

ＲＮＡの逆転写の際によく用いられるＴ７−ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２４プライマーはＴが２４塩基連続する配列を有し、これがｍＲＮＡ上のポリＡテイル部分とアニールする。ただし、ポリＡテイルの長さは数百塩基に及ぶこともあり、どの部分に結合するか確定できないため、合成後のｃＤＮＡのポリＴの塩基長、及びｃＤＮＡ全長は一律ではない。従って、このｃＤＮＡを鋳型として合成されるｃＲＮＡの５’末端のポリＵ配列も一律の長さにはならない。

従来のＩＶＴ法で調製したｃＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイに供した場合、５’末側のポリＵ配列の塩基長が一律にならず、同じｍＲＮＡ由来のｃＲＮＡであっても合成された塩基長がバラバラになっていた。更に、同じ細胞に由来するサンプルであっても、毎回同じようにｃＲＮＡを調製できず、ＤＮＡマイクロアレイで得られる結果の再現性に問題が生じる場合があった。

また、ｃＲＮＡ合成時に標識付きヌクレオチドを添加して標識物質を取り込ませる場合には、標識物質はランダムに取り込まれるために１分子辺りの標識量が一律にはならない。このため、ＤＮＡマイクロアレイに供して得られたシグナル値は検体中の量比を反映したものではなく、より厳密な定量を行う上での検討すべき課題であった。

従って、本発明は、上記問題点を解決すべく、検体の遺伝子発現量をより正確に定量するための検体調製方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため研究を重ねた結果、一定以上のポリＵ配列長が存在するようにｃＲＮＡを合成し、標識付きポリＡ配列をポリＵ配列にアニールさせることで、より精度の高い定量評価を行うことができる検体調製方法を提供できることを見出した。

すなわち、本発明の検体の調製方法は、固相上のプローブとのハイブリダイゼーションに供するターゲット核酸を含む検体の調製方法であって、
検体調製用試料としての３’末端にポリＡ配列を有するＲＮＡに対して、５’末端にｃＲＮＡ合成用プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程と、
前記一本鎖ｃＤＮＡに対し、ＤＮＡ合成酵素を付加して二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程と、
前記二本鎖ｃＤＮＡに対し、ＲＮＡポリメラーゼによりｃＲＮＡを合成する工程と、
標識が付加されたポリＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを前記ｃＲＮＡのポリＵ配列にアニールさせて検体ＲＮＡを得る工程と、を有することを特徴とする検体の調製方法である。

さらには、調製に利用できるｍＲＮＡ量が十分にある場合は、増幅工程を行わないでポリＴ配列長が揃ったターゲット核酸を含む検体を調製する方法も提供する。かかる検体の調製方法は、固相上のプローブとのハイブリダイゼーションに供するターゲット核酸を含む検体の調製方法であって、
検体調製用試料としての３’末端にポリＡ配列を有するＲＮＡに対して、５’末端に標識物質が付加されたオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行い、検体としての一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程を有し、
前記５’末端に標識物質が付加されたオリゴｄＴプライマーとして、互いに同じ塩基長を有し、３’末端の一配列以外は同じ配列であって、３’末端にＧ、Ｃ、Ａのいずれかをそれぞれ有する３種類の該オリゴｄＴプライマーが、互いに等濃度に調整されて該逆転写反応に用いられることを特徴とする検体の調製方法である。

本発明の検体調製法によれば、調製されたｃＲＮＡに対し、標識付きポリＡ配列オリゴヌクレオチドをアニールさせることにより、ＤＮＡマイクロアレイ等に供する検体として用いることができる。本発明によって調製された検体は、固相上のプローブと安定なハイブリッド体を形成し、さらに１分子のｃＲＮＡに対し１単位の標識物質が標識されているため、検体が持つＲＮＡの量比を反映した、より精度の高い定量評価を可能とするものである。

さらに、本発明によれば配列によらずポリＵ長が一律なｃＲＮＡを合成することができるので、更に精度の高い定量評価を可能とすることができる。

本発明による検体調製方法を更に詳しく説明する。

本発明による検体調製方法は、以下の各工程を有する。
（１）３’末端にポリＡ配列を有するＲＮＡに対して、５’末端にｃＲＮＡ合成用プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程。
（２）前記一本鎖ｃＤＮＡに対し、ＤＮＡ合成酵素を付加して二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程。
（３）前記の二本鎖ｃＤＮＡに対し、ＲＮＡポリメラーゼによりｃＲＮＡを合成する工程。
（４）標識が付加されたポリＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを前記ｃＲＮＡのポリＵ配列にアニールさせる工程。

なお、配列の表現に用いる「Ａ」、「Ｔ」、「Ｇ」及び「Ｃ」は、それぞれアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）である塩基を示す。

検査用の試料としては、検体調製方法の出発材料となるＲＮＡが含まれているものであれば特に限定なく利用できる。例えば真核生物等の生物種から抽出されたｍＲＮＡ、またはこのｍＲＮＡが含まれている核酸抽出物やｔｏｔａｌＲＮＡ等が好適に利用できるが人工的に合成したものであっても問題ない。試料中に含まれるＲＮＡは、１種でもよく、複数種が混合状態にあるものでもよい。

検体とは、ＤＮＡマイクロアレイ等の固相担体上に固定されたプローブとのハイブリダイゼーションに供する核酸検体である。これにはプローブと相補的な配列を有するターゲット核酸が含まれている（ただし、ターゲット核酸の有無を調べる検査では、ターゲット核酸が含まれない場合もある）。よって、本発明では、逆転写の増幅工程を有する調製を行う場合は検体はｃＲＮＡとなり、十分量のＲＮＡを出発材料として増幅工程を経ない調製を行う場合には検体はｃＤＮＡとなる。

ここで真核生物では、そのｍＲＮＡは、転写後の修飾として３’末端がポリＡテイルと呼ばれるポリアデニル酸（ポリＡ）鎖の付加を受けるため、３’末端にポリＡ配列を有している。このポリＡ配列の塩基長は通常約１００ｂｐ以上３００ｂｐ以下であるが、中には数百塩基に及ぶこともある。よって本発明の３’末端にポリＡ配列を有するＲＮＡとしては、真核生物である生物種から抽出されたｍＲＮＡを好適に用いることができる。また他の生物種のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ以外の生物由来のＲＮＡ、さらに人工的に合成されたＲＮＡも問題なく利用できる。また、３’末端のポリＡ配列の塩基長については特に限定されない。

ｃＲＮＡ合成用プロモーター配列とは、ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター配列であれば特に限定なく利用可能であるが、中でもＴ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーター等が好適に利用できる。ｃＲＮＡ合成の工程で使用するＲＮＡポリメラーゼが認識できるプロモータ配列が選択される。

５’末端にｃＲＮＡ合成用プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーは、ポリチミジル酸（ポリＴ）配列を有し、その５’末端に上記のｃＲＮＡ合成用プロモーター配列を有しているものであれば特に限定されない。ここで、このオリゴｄＴプライマーのポリＴの塩基長は、好ましくは１５ｍｅｒ以上４０ｍｅｒ以下である。対象とするＲＮＡにはＡが連続して１１塩基並ぶ配列も存在し、ポリＴの塩基長が１０前後ではｍＲＮＡのポリＡテイル以外の部分にまでアニールする恐れがあり、塩基長が短過ぎるとアニールさせるための温度条件設定が難しい。逆にポリＴの塩基長が長すぎても、Ｔｍ値が上昇するため、全長で特異的にアニールさせるためには厳密な実験条件の設定が必要となる。さらに、上記のオリゴｄＴプライマーとして、３’末端にＧ、Ｃ、Ａのいずれかをそれぞれ有する上記のオリゴｄＴプライマーから選択される少なくとも１種以上を用いることが好ましい。さらに、これら１種以上のオリゴｄＴプライマーが複数の場合は、互いに同じ塩基長を有し、３’末端のヌクレオチド以外は同じ配列を有していることが好ましい。これらのオリゴｄＴプライマーは、その３’末端にＴ以外の塩基があることによりＲＮＡのポリＡテイルの最上流部分にアニールすることになる。これにより、ＲＮＡのポリＡの塩基長に関わらずポリＴの塩基長の揃った一本鎖ｃＤＮＡを合成することが可能となる。さらに、５’末端にｃＲＮＡ合成用プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーとして、３’末端にＧ、Ｃ、Ａのいずれかをそれぞれ有する３種類の該オリゴｄＴプライマーが反応液において互いに等濃度になるように調整されて、逆転写反応に用いられることが好ましい。この反応液により逆転写反応を行うと、全てのｍＲＮＡに対応することができる。

そして、上記のような工程で合成した一本鎖ｃＤＮＡに対し、二本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによりｃＲＮＡを合成する。一本鎖ｃＤＮＡのポリＴの塩基長が揃っているために合成したｃＲＮＡのポリＵの塩基長も全て同じになる。このｃＲＮＡはＤＮＡマイクロアレイに好適に供することができる。

以上の工程をまとめた例を示す。まず、細胞から抽出されたｔｏｔａｌＲＮＡに対し、５’末端にＴ７のプロモーター配列を有し、２４塩基からなるオリゴｄＴ配列を有するオリゴ（ｄＴ）２４プライマーを用いて逆転写を行う。このオリゴ（ｄＴ）２４プライマーは、３’末端にＧ、Ｃ、Ａのいずれかがそれぞれ付加されたもののうち１種以上用意する。

上記の３種類のオリゴｄＴプライマーが互いに等濃度に調整された反応液を用いれば、全てのｍＲＮＡに対して逆転写を行うことができる。このプライマーセットが含まれた反応液を用いて逆転写された一本鎖ｃＤＮＡはポリＴ配列が２４ｍｅｒに揃ったものとなる。この処理は、細胞に限らずあらゆる生物種から回収されるＲＮＡや人工的に合成されたＲＮＡ等のポリＡテイルを含む全てのＲＮＡに対しても適用できる。

このようにして合成された一本鎖ｃＤＮＡに対し、ＤＮＡ合成酵素を作用させ、二本鎖ｃＤＮＡを合成し、精製する。その後Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡの合成を行う。この反応では、材料となるリボ核酸が存在し、酵素が活性を持つ限り、ｃＤＮＡからＲＮＡが合成され続けるので、最終的にはｃＤＮＡの量比を保ったまま、もとの約１００倍のｃＲＮＡが生成される。合成されたｃＲＮＡは精製後、ＤＮＡマイクロアレイに供する検体として用いることができる。

ＤＮＡマイクロアレイで検出するためには、検体に標識物質が付加されていることが必要である。そこで、ｃＲＮＡ溶液に対し、標識が付加されたポリＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを加え、ｃＲＮＡにアニールさせることにより検体に標識を行う。この工程は、ＩＶＴ増幅を利用する場合の本発明の検体調製方法における特徴点のひとつである。ｃＲＮＡのポリＵ配列に特異的にポリＡ配列オリゴヌクレオチドがアニールし、一分子のｃＲＮＡに対し、一単位の標識物質が付加されることになる。このように検体を調製することによって、例えばＤＮＡマイクロアレイで検出した場合に得られるシグナル値は検体中に含まれるターゲット核酸の量比（全体に占める割合）を反映したものとなる。

ここで、標識付きポリＡ配列オリゴヌクレオチドのポリＡの塩基長は、オリゴｄＴプライマーのポリＴの塩基長と同様に１５ｍｅｒ以上４０ｍｅｒ以下であることが好ましい。このポリＡのより好ましい塩基長は、逆転写時に用いたオリゴｄＴプライマーのポリＴの塩基長と同じ長さである。また、標識付きポリＡ配列オリゴヌクレオチドとして、５’末端にＧ、Ｃ、Ｔのいずれかをそれぞれ有するものから選択される少なくとも１種以上の該オリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。これら１種以上のオリゴヌクレオチドが複数である場合は、互いに同じ塩基長を有し、５’末端の一配列以外は同じ配列であることが好ましい。さらに５’末端にＧ、Ｃ、Ｔのいずれかをそれぞれ有する３種類の標識付きポリＡ配列オリゴヌクレオチドが互いに等濃度になるように調整されて、ｃＲＮＡとのアニールに用いられることが好ましい。これにより、ｃＲＮＡの５’末端側にあるポリＵ配列とハイブリッド体を形成し、ＲＮＡの塩基配列によらず全てのｃＲＮＡに対して同条件で標識を付加することが可能となる。このようにして調製された標識付きｃＲＮＡ検体によるＤＮＡマイクロアレイ上のプローブとのハイブリッド体は非常に安定しており、定量性・再現性共に優れた結果を得ることが可能である。

図１に、本発明によって調製された標識化ｃＲＮＡのイメージを示した。この操作は、ＤＮＡマイクロアレイに供する前のみならず、ＤＮＡマイクロアレイ上に検体を供した後、すなわちハイブリダイゼーション中に同時に行うことも可能である。なぜなら、本発明での標識化反応はマイクロアレイ上のプローブと検体中のターゲット核酸とのハイブリダイゼーションと同じ動作原理に基づくため、同時に行うことが可能なのである。また、この標識付きポリＡ配列オリゴヌクレオチドによる標識工程はハイブリダイゼーション後に行うことも可能である。ハイブリダイゼーション後に行うと、ＤＮＡマイクロアレイ上のプローブとハイブリッド体を形成したｃＲＮＡにのみ標識されるので、より効率的にかつ特異的に標識されるという利点もある。

標識物質としては、どのような標識物質でも特に制限なく本発明に用いることが可能であるが、一般に高感度な検出が可能な蛍光物質等を用いる。中でも、Ｃｙ３、Ｃｙ５を代表とするＣｙＤｙｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）は、核酸標識用の蛍光物質として良く用いられ、これらの蛍光物質は本発明においても有効である。また、ビオチン、およびアミノアリル系化合物等の核酸標識用物質も本発明の検体調製方法には有効である。

また、本調製法の出発材料となるＲＮＡが贅沢な量で取得できる場合には、ＩＶＴ増幅を行わずに一本鎖ｃＤＮＡ合成のみでＤＮＡマイクロアレイに供することが可能である。その場合は、３’末端にポリＡ配列を有するＲＮＡに対して、５’末端に標識物質が付加されているオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行う。このオリゴｄＴプライマーとして、３’末端にＧ、Ｃ、Ａのいずれかをそれぞれ有する５’末端に標識物質が付加されているオリゴｄＴプライマーが、互いに等濃度に調整されて逆転写反応に用いられることが好ましい。この方法によって検体の遺伝子発現量をより正確に定量するための検体調製方法を提供することができる。これらのオリゴｄＴプライマーのポリＴの塩基長は１５ｍｅｒ以上４０ｍｅｒ以下であることが好ましい。さらにこれらのオリゴｄＴプライマーは互いに同じ塩基長を有し、３’末端の一配列以外は同じ配列であることが好ましい。

本発明の検体調製方法により合成されたｃＲＮＡと、固相上あるいは固相表面に固定されたプローブと、のハイブリダイゼーションによって二本鎖を形成させ、標識物質のシグナルを測定することによって、プローブとハイブリダイズしたｃＲＮＡを高感度に検出することができる。固相ハイブリダイゼーションを利用した高感度な検出デバイスとしては、様々な物質、形態が知られているが、本発明の検体調製方法は制限なく適用可能である。このうち、ガラス基板に核酸を固定化したＤＮＡマイクロアレイはその代表例であり、本発明の検体調製方法によって作成されたターゲット核酸の検出に特に好適である。固相に用いられる材質としてはその他にも、樹脂、金属、金属薄膜、繊維等がある。またその概観上の形態も、微粒子、光ファイバー先端、多孔質材料、繊維等がある。

固相へのプローブの結合様式としては吸着、化学結合等様々な方式が存在するが、いずれの結合様式でも、本発明のターゲット核酸の検出に適用可能である。例えば、イオン結合では、アミノ基をコートしてあるガラス基板或いは樹脂表面に対し、通常の核酸を供するだけでイオン的に結合させることができる。また、５’末端、３’末端にアミノ基、チオール基等の官能基を修飾した修飾オリゴヌクレオチドを用いて固定化することも可能である。例えばアミノ基を利用する場合、固相表面にアミノ基と効率的に反応するスクシイミド基をあらかじめ結合させておき、５’末端、もしくは３’末端にアミノ基を修飾したオリゴヌクレオチドを固相表面に供給する。これにより、容易に共有結合を形成させることができ、本発明のターゲット核酸を検出するためのプローブとして好適に用いることが可能である。またチオール基を用いる場合には、例えば固相にマレイミド基を結合させておくことにより、アミノ基の場合と同様、共有結合を容易に形成し、本発明のターゲット核酸を検出するためのプローブとして好適に用いることが可能である。

固相へのプローブの供給方法としては、インクジェット法によってＤＮＡ溶液を固相に印字する方法等がある。このインクジェット法で作製されたＤＮＡマイクロアレイは、プローブのスポットが小さいこと、固定されたプローブの濃度が均一であることが特長である。このＤＮＡマイクロアレイを用いた本発明の検体調製方法によるｃＲＮＡをハイブリさせた結果はより定量性・再現性の高い信頼できるものとなり、特に効果的である。

以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞ 胃癌標準細胞ＫＡＴＯＩＩＩの検体処理
（１）細胞からｔｏｔａｌＲＮＡの抽出
胃癌標準細胞ＫＡＴＯＩＩＩ（大日本製薬社）の懸濁液に、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮＡ抽出Ｋｉｔ，ＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒとＲＮＡ精製Ｋｉｔ，ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出、精製した。

まず細胞懸濁液（１ｘ１０⁶個／１００μｌ）にβメルカプトエタノールを含むＲＬＴ緩衝液を６００μｌ加え、混合液をＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒに添加した。１５０００ｒｐｍで１分間遠心後、抽出液に７０％エタノールを加えて、ＲＮｅａｓｙのカラムに添加した。１２０００ｒｐｍで１５秒遠心後、廃液を捨ててからカラムにＲＷ１緩衝液を７００μｌ添加した。１２０００ｒｐｍで１５秒遠心後、新しいチューブにカラムをセットし、ＲＰＥ緩衝液を５００μｌ添加した。１２０００ｒｐｍで２分間遠心後廃液を捨て、何も添加せずに１５０００ｒｐｍで１分間遠心した。新しいチューブにカラムをセットし、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを５０μｌ加えて１分間静置後、１２０００ｒｐｍで１分間遠心してＲＮＡを溶出した。

（２）逆転写によるｃＤＮＡの合成、精製
ｃＲＮＡ合成用プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーを表１に示す４種類用意した。

表１に示したオリゴｄＴプライマーを１種または混合して、表２に示すような組成のオリゴｄＴプライマーセット（Ｍｉｘ１〜Ｍｉｘ４）を用意した。

（１）で調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液１１μｌに対し、オリゴｄＴプライマーセットＭｉｘ１〜Ｍｉｘ４をそれぞれ１μｌ加えたものを４本作製した。これらを７０℃で１０分間インキュベートし、表３の試薬を表記順に加え、４２℃で１時間逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。

更に、表４の試薬を表記順に加え、１６℃で２時間インキュベートし、二本鎖ｃＤＮＡをそれぞれ合成した。

最後にＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２μｌを加えて１６℃で５分間インキュベートし、両端の１本鎖の部分を二本鎖に調製した。

続いてＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ（ＰＬＧ）（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いて、ＤＮＡを精製した。二本鎖ｃＤＮＡ溶液１６０μｌに対し、等量のＰＣＩ（Ｐｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｌｃｈｏｌ＝２５：２４：１）（和光純薬社）を加え、よく混合し、ＰＬＧチューブにアプライし、１２０００ｒｐｍで２分間遠心を行った。上清を新しいチューブに移し、表５に示す通りに試薬を加え、４℃、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心を行った。

上清を除去し、８０％エタノール（−２０℃）を５００μｌ加え、更に４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心を行った。上清を除去した後に濃縮遠心し、乾燥粉末状のＤＮＡに超純水５０μｌを加えて溶解した。

（３）ｃＲＮＡの合成、精製
（２）で合成した４種の二本鎖ｃＤＮＡを用いてｃＲＮＡ合成を行った。ｃＲＮＡの合成にはＴ７ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いた。試薬を表６に表記した順で加え、３７℃で４時間インキュベートした。ｃＲＮＡの合成後、ＲＮＡ精製Ｋｉｔ，ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。合成したｃＲＮＡ溶液２０μｌに超純水８０μｌを加え、よく混合する。続いて、ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ（＋２−ＭＥ）（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔに付属）を３５０μｌ加え、更によく混合し、スピンダウンする。続いて１００％エタノールを２５０μｌ加え、ピペッティングにより混合し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉカラムにアプライし、１００００ｒｐｍで１５秒遠心を行う。下の液を再度カラムにアプライし、１００００ｒｐｍで１５秒遠心を行う。下の液を捨て、新しい２ｍｌチューブにカラムをセットし、ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥ（＋エタノール）（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔに付属）を５００μｌ加える。１００００ｒｐｍで１５秒遠心を行い、再度ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥ（＋エタノール）５００μｌを加え、１５０００ｒｐｍで２分遠心を行う。下の液を捨て、新しい１．５ｍｌチューブにカラムをセットし、超純水５０μｌを加え、１分間静置した後、１００００ｒｐｍで１分遠心を行って溶出し、ｃＲＮＡ溶液を得た。

（４）吸光度測定
合成したｃＲＮＡ溶液に関して吸光度を測定した。結果を表７に示す。測定での波長は２６０ｎｍを用いた。

＜実施例２＞ 標識化ｃＲＮＡの作製
（１）標識付きポリＡ配列オリゴヌクレオチドの準備
表８に示す配列をもつ標識付きポリＡ配列オリゴヌクレオチドを用意した。なお、標識物質にはＣｙ３を選び、５’末端に修飾させた。

表８に示した標識付きポリＡ配列オリゴヌクレオチドを１種または混合して、表９に示すような組成の標識付きポリＡ配列オリゴヌクレオチドのセット（Ｌ−Ｍｉｘ１〜Ｌ−Ｍｉｘ４）を用意した。

（２）標識化反応
実施例１で作製したｃＲＮＡ溶液に対し、表１０に示すように試薬を調製し、９２℃で５分保温した後、５５℃で３０分インキュベートした。なお、オリゴｄＴプライマーＭｉｘ１によるｃＲＮＡにはＬ−Ｍｉｘ１を、Ｍｉｘ２にはＬ−Ｍｉｘ２を、Ｍｉｘ３にはＬ−Ｍｉｘ３を、Ｍｉｘ４にはＬ−Ｍｉｘ４を使用した。

（２０×ＳＳＰＥ；３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ、０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）
（３）吸光度測定
（２）で標識を行った標識化ｃＲＮＡ溶液に対し、マイクロバイオスピンカラムＰ３０（ＢｉｏＲａｄ社製）、及びマイクロコンＹＭ−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で精製、濃縮を行ったのち、ｃＲＮＡ溶液が１００μｌになるようにメスアップを行った。そして、吸光度測定によりｃＲＮＡおよびＣｙ３の含有量を測量した。吸光度測定の波長はｃＲＮＡ量の測定には２６０ｎｍ、Ｃｙ３量の測定には５５０ｎｍを用いた。その結果を表１１に示す。

結果からわかるように、Ｍｉｘ１がＲＮＡ量当たりのＣｙ３量が最も多い。一方で、Ｍｉｘ２からＭｉｘ４まではＲＮＡ量当たりのＣｙ３量がほぼ同じである。

本発明の標識方法では、標識量はポリＵの存在量に依存する。従来のオリゴｄＴプライマーを用いた場合（Ｍｉｘ１）は、ポリＵの長さが長いものもあり、標識量は多くなると予想される。その一方で、一分子のｃＲＮＡ当たりの標識量が１であったり２またはそれ以上になる場合もあり、標識量がｃＲＮＡ分子量を反映しない。本発明の末端にＧ、Ｃ、Ａを付加したプライマーを用いた場合（Ｍｉｘ２からＭｉｘ４）では標識率はやや落ちるものの、全てほぼ同じ値を示しており、標識量がｃＲＮＡ分子量を反映していることが示された。

＜実施例３＞ ＤＮＡマイクロアレイの作製
（１）プローブの設計及び合成
ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ）とＡＣＴＢ（ａｃｔｉｎ ｂｅｔａ）の２種の遺伝子に着目し、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定するためのプローブを設計した。これら２種の遺伝子はともに胃がん標準細胞ＫＡＴＯ ＩＩＩにおいて高い発現があることが知られている。設計した部分塩基配列を特異的に認識できるよう、配列、ＧＣ％、融解温度（Ｔｍ値）に充分配慮して設計を行った。このプローブ設計においては、ｃＲＮＡ鎖がプローブとハイブリダイゼーションし、プローブとハイブリッド体を形成する。設計されたプローブの塩基配列を表１２に示す。

（２）ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ（Ｗ×Ｌ×Ｔ）：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩、洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、ガラス基板を取り出し、軽く純水で漱いだ後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間、ガラス基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の洗浄済石英ガラス基板を用意した。

（３）表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済石英ガラス基板を、このシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、ガラス基板の両面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、窒素ブロー乾燥したガラス基板を、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させた。このカップリング剤処理により、ガラス基板表面に、シランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。

一方、ＥＭＣＳ（同仁化学研究所社製）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ＥＭＣＳは、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）である。ベーク終了後、カップリング剤処理済ガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理間に、カップリング剤処理済ガラス基板の表面に導入されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のジメチルスルホキシドとエタノールの混合溶媒を用いて洗浄し、さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。

（４）プローブ用ＤＮＡの合成
上記（１）で設計したプローブを合成した。

プローブＤＮＡは、上記の表面にマレイミド基が導入されガラス基板に対して共有結合させるため、定法に従って、５’末端にチオール化処理を施した。その後、ＤＮＡ合成時における副反応を避けるために、保護を施している保護基を脱保護し、さらにＨＰＬＣ精製および脱塩処理を施した。

得られたプローブＤＮＡは、純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）５μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。

（５）ＢＪプリンターによるプローブＤＮＡ吐出、および基板表面への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、分注したプローブＤＮＡを上記の混合溶媒に規定濃度（１０μＭ）となるように溶解した。得られたプローブＤＮＡ溶液を、バブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０ キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。

なお、前記バブルジェットプリンターは、平板へのインクジェット印刷が可能なように改造を施したものである。また、該改造バブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ｐｌのＤＮＡ溶液液滴を、約１２０μｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。

続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、ガラス基板表面に、プローブＤＮＡ溶液のスポッティング操作をおこなった。ＤＮＡマイクロアレイ１枚あたり、各プローブごとに１６スポットの吐出が行われるよう印字のパターンを予め作成し、インクジェット印字した。目的のパターンにＤＮＡ溶液のスポッティングが確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間常温で加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させた。

（６）洗浄
加湿チャンバー内における３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により、ガラス基板表面に残った未反応のプローブＤＮＡを洗い流した。ガラス基板表面に、各ＤＮＡチップ当たり１６スポットに所定の一本鎖プローブＤＮＡが、それぞれ固定された、ＤＮＡマイクロアレイ型ＤＮＡチップを得た。

＜実施例４＞ハイブリダイゼーション反応
実施例３で作製したＤＮＡマイクロアレイと、実施例２で調製した標識化ｃＲＮＡを用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。

（１）ハイブリダイゼーション
実施例１で得たｃＲＮＡ溶液Ｍｉｘ１〜Ｍｉｘ４に対し、実施例２の通りに標識化ｃＲＮＡを作成した。ただし、標識用試薬は表１３で示すように調整した。９２℃５分で保温した後、５５℃で３０分インキュベートし、標識化ｃＲＮＡ溶液を得た。これを、そのままハイブリダイゼーション溶液とした。すなわち、ハイブリダイゼーション溶液の濃度は下記に示すとおりである。

＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６×ＳＳＰＥ／１０％ ホルムアミド／０．０５％ ＳＤＳ／標識化ｃＲＮＡ
（６×ＳＳＰＥの組成は、ＮａＣｌ ９００ｍＭ、ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ ６ｍＭ、ｐＨ：７．４）

水切りしたＤＮＡマイクロアレイを、ハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットした。上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、表１４に示す手順・条件でハイブリダイゼーション反応を行った。

（２）蛍光測定
ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡマイクロアレイについてＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ｂ）を用いて、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。

輝度の算出にあたっては、ＤＮＡマイクロアレイ上、プローブＤＮＡのスポットの無い部分において観測される蛍光強度をバックグランド値として、各スポットからの見かけの蛍光強度より、バックグランド値を差し引いた値を、蛍光強度の実測値とした。

（３）結果
表１５にＣＥＡ及びＡＣＴＢの蛍光強度の実測値を示す。

表１５の結果より、本発明の検体調製方法がＤＮＡマイクロアレイに供するのに適していることが示された。更に、本発明による標識方法ならばより厳密な定量が可能となることが示唆された。

本発明によって調製された標識化ｃＲＮＡを示す図である。

Claims (11)

1. 固相上のプローブとのハイブリダイゼーションに供するターゲット核酸を含む検体の調製方法であって、
   検体調製用試料としての３’末端にポリＡ配列を有するＲＮＡに対して、５’末端にｃＲＮＡ合成用プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程と、
   前記一本鎖ｃＤＮＡに対し、ＤＮＡ合成酵素を付加して二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程と、
   前記二本鎖ｃＤＮＡに対し、ＲＮＡポリメラーゼによりｃＲＮＡを合成する工程と、
   標識が付加されたポリＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを前記ｃＲＮＡのポリＵ配列にアニールさせて検体ＲＮＡを得る工程と、
   を有することを特徴とする検体の調製方法。
2. 前記５’末端にｃＲＮＡ合成用プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーのポリＴの塩基長が、１５ｍｅｒ以上４０ｍｅｒ以下であることを特徴とする請求項１に記載の検体調製方法。
3. 前記５’末端にｃＲＮＡ合成用プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーとして、３’末端にＧ、Ｃ、Ａのいずれかをそれぞれ有するものから選択される少なくとも１種以上の該オリゴｄＴプライマーを用いることを特徴とする請求項１または２に記載の検体調製方法。
4. 前記５’末端にｃＲＮＡ合成用プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーとして、３’末端にＧ、Ｃ、Ａのいずれかをそれぞれ有する３種類の該オリゴｄＴプライマーが、互いに等濃度に調整されて前記逆転写反応に用いられることを特徴とする請求項３に記載の検体調製方法。
5. 前記標識が付加されたポリＡ配列を有するオリゴヌクレオチドのポリＡの塩基長が、１５ｍｅｒ以上４０ｍｅｒ以下であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の検体調製方法。
6. 前記標識が付加されたポリＡ配列を有するオリゴヌクレオチドのポリＡの塩基長が、前記５’末端にｃＲＮＡ合成用プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーのポリＴの塩基長と同じ長さであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の検体調製方法。
7. 前記標識が付加されたポリＡ配列を有するオリゴヌクレオチドとして、５’末端にＧ、Ｃ、Ｔのいずれかをそれぞれ有するものから選択される少なくとも１種以上の該オリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の検体調製方法。
8. 前記標識が付加されたポリＡ配列を有するオリゴヌクレオチドとして、５’末端にＧ、Ｃ、Ｔのいずれかをそれぞれ有する３種類の該オリゴヌクレオチドが、互いに等濃度に調整されて前記ｃＲＮＡのポリＵ配列とのアニーリングに用いられることを特徴とする請求項７に記載の検体調製方法。
9. 前記標識が付加されたポリＡ配列を有するオリゴヌクレオチドの標識物質が蛍光物質であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の検体調製方法。
10. 前記蛍光物質がＣｙ３またはＣｙ５である請求項９に記載の検体調製方法。
11. 固相上のプローブとのハイブリダイゼーションに供するターゲット核酸を含む検体の調製方法であって、
    検体調製用試料としての３’末端にポリＡ配列を有するＲＮＡに対して、５’末端に標識物質が付加されたオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行い、検体としての一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程を有し、
    前記５’末端に標識物質が付加されたオリゴｄＴプライマーとして、互いに同じ塩基長を有し、３’末端の一配列以外は同じ配列であって、３’末端にＧ、Ｃ、Ａのいずれかをそれぞれ有する３種類の該オリゴｄＴプライマーが、互いに等濃度に調整されて前記逆転写反応に用いられることを特徴とする検体の調製方法。
    

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