KR100487167B1 - 바이오칩 및 이의 제조방법 - Google Patents

바이오칩 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100487167B1
KR100487167B1 KR10-2002-0066359A KR20020066359A KR100487167B1 KR 100487167 B1 KR100487167 B1 KR 100487167B1 KR 20020066359 A KR20020066359 A KR 20020066359A KR 100487167 B1 KR100487167 B1 KR 100487167B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gel pad
gel
biochip
present
acrylamide
Prior art date
Application number
KR10-2002-0066359A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20040037744A (ko
Inventor
유석종
이재돈
이창준
박현
박한오
Original Assignee
(주)바이오니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)바이오니아 filed Critical (주)바이오니아
Priority to KR10-2002-0066359A priority Critical patent/KR100487167B1/ko
Publication of KR20040037744A publication Critical patent/KR20040037744A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100487167B1 publication Critical patent/KR100487167B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology

Abstract

본 발명은 새로운 바이오칩 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 아크릴아미드와 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드의 혼합용액에 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가하고, 고체표면상에서 상기 용액을 중합반응시켜 젤 패드를 형성한 후, 상기 젤 패드상에 아민기 함유 생분자를 공유결합시켜 제조한 바이오칩 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오칩은 열에 안정적이어서 혼성화반응시 안정성, 민감도 및 효율성이 매우 증가된다.

Description

바이오칩 및 이의 제조방법{Biochip and Process for Producing the Same}
본 발명은 새로운 바이오칩 및 이의 제조방법에 관한 것으로 구체적으로는 아크릴아미드와 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드의 혼합용액에 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가하고, 고체표면상에서 상기 용액을 중합반응시켜 젤 패드를 형성한 후, 상기 젤 패드상에 아민기 함유 생분자를 공유결합시켜 제조한 바이오칩으로서, 열에 안정적이며, 혼성화 안정성 및 민감도(sensitivity)가 증가된 바이오칩 및 이의 제조방법에 대한 것이다.
현재 DNA 칩 기술은 포스트 지노믹스 시대에 가장 보편적으로 사용하고 있는 실험방법으로 대량의 유전자에 대한 발현양상을 손쉽게 관찰할 수 있는 방법이다. 이를 사용하여 기존에 수많은 시간을 요하던 유전자 발현양상을 빠른 시간 안에 많은 유전자에 대해 관찰할 수 있는 장점이 있으며, 이는 유전자 전체의 조절 기작을 연구하는 데에 중요하다. 특히 최근에는 SNP를 비롯한 각종 유전형 분석에도 사용하고 있으며, 미생물에 대한 질병진단에도 이용되어지고 있다.
DNA 칩 제작에 대한 방법은 어피메트릭스(Affimatrix)사가 사용하는 사진식각방법(photolithographic method)을 사용하여 기판위에서 직접 합성하는 방법과 미리 합성한 올리고를 유리(glass) 혹은 유리 위의 지지체에 점적하여 고정하는 방법이 있다. 현재 많이 사용하고 있는 방법으로는 유리위에 작용기를 붙인 다음 올리고를 스팟팅(spotting)하는 방법 또는, 유리 위에 얇게 아크릴아미드 또는 아가로스 젤 패드를 형성한 다음 여기에 작용기를 도입하여 올리고뉴클레오티드를 스팟팅해서 고정화하는 방법이 제시되어 있다.
일반적으로, 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 단편을 젤 또는 고체 표면에 고정배치시켜서 혼성화하는 방법은 DNA 시퀀싱 등 다양한 분야에 적용될 수 있는데(Barinaga, M. (1991) Science 253:1489; Cantor, C.R., Mirzabekov, A. and Southern, E. (1992) Genomics 13, 1378-1383; Southern, E.M., Maskos, U. and elder, J.K. (1992) Genomics 13, 1008-1017; Lipshutz, R.J. et al., (1995) Biotechniques 19, 442-447), 일명 'DNA 칩'에 표지된 타겟 DNA를 가하여 혼성화시키는 방법은 DNA 시퀀싱 뿐만 아니라 RAS 점 돌연변이, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 결실 및 여러 점 돌연변이를 검출하는데 적용되고 있으며(Cnator, C.R., Mirzabekov, A. and Southern, E. (1992) Genomics 13, 1378-1383; Zhang, Y. et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19, 3929-3933; Hacia, J.J. et al., (1996) Nature Genetics 14, 441-447; Shoemaker, D.D. et al., (1996) Nature Genetics 14, 450-456; Sosnowski, R.G. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1119-1123), 유전변이 검사와 유전다형현상 연구에도 크게 기여할 것으로 예측되고 있다(Lipshutz, R.J. et al., (1995) Biotechniques 19, 442-447; Schena, M. et al., (1995) Science 270, 467-470; Chee, M. et al., (1996) Science 274, 610-614; DeRisi, J. et al., (1996) Nature Genetics 14, 457-460). 또한 이러한 DNA 칩의 민감성, 단일성 및 재현성을 이용하면 감염 및 유전적 질병의 진단뿐만 아니라 종양형성(neoplasias), HLA 타이핑(HLA typing) 등의 변이 분석에도 매우 유용하게 사용될 것으로 예상되고 있다(Saiki, R.K. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6230-6234; Zhang, Y. et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19, 3929-3933).
고체표면상에 DNA를 고정화하여 미세배열시키는 방법은 크게 다음과 같이 나누어질 수 있다.
1) 고체 표면상에서 직접 올리고뉴클레오티드를 합성하여 고정시키는 방법과,
2) 고체 표면 또는 고체표면상에 형성된 젤 상에 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정시키는 방법.
먼저 1)의 방법으로는 유리표면에 올리고뉴클레오티드를 고정 및 배치하기 위해서 실리콘 고무 튜브(silicone rubber tubing)를 실리콘 고무 시멘트(silicone rubber cement)를 사용하여 유리판에 붙인 다음 합성 시킬 유리판에 겹쳐 놓고 생성된 채널에 원하는 커플링 용액을 주입시켜 특이 부위에 합성시키고 나머지 차단(blocking)시킨 부위들은 그 튜빙을 회전 이동시킴으로써 차례로 올리고뉴클레오티드를 합성시키는 방법이 있다(Southern, E.M., Maskos, U. and Elder, J.K. (1992) Genomics 13, 1008-1017; Maskos, U. and Southern, E.M. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 1675-1678; Maskos, U. and Southern, E.M. (1993) Nucleic Acids Res. 21, 2267-2268; Williams, J. C., Case-Green, S.C., Mir, K.U. and Southern E.M. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1365-1367).
또는, 감광식 올리고뉴클레오티드 합성의 도입으로 유리 표면상에서 직접 올리고뉴클레오티드들을 합성시킬 수 있는 방법이 제시되어 있는 바, 이 방법은 5' 수산기에 감광성 보호기들을 유도한 표면에 차광 마스크를 통해 방출된 빛으로 유리 수산기들을 형성시키고 보호된 데옥시뉴클레오시드를 결합하는 기술이다(Pease, A.C. et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sca. USA 91, 5022-5026; Sapolsky, R.J. and Lipshutz, R.J. (1996) Genomics 33, 445-456; Hoheisel, J.D. (1997) trends in Biotechnology 15, 465-469; Affymetrix corp.).
두번째 2)의 방법으로는 아미드기들을 히드라지드기로 치환하여 활성화시킨 폴리아크릴아미드 겔을 제조하고 소디움퍼아이오다이트(NaIO4)로 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 3-메틸우리딘을 지니도록 활성화시켜 디알데히드기들을 형성시킨 후 젤(100X100X20㎛)과 결합시켜 배열하는 DNA 마이크로칩이 개시되어 있다(Yershov, G. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4913-4918; Parinov, S. et al., (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2998-3004). 다르게는 포스포르아미디트계(Phosphoramidite-based) 합성법을 이용하여 아민화된 폴리프로필렌 필름(PP-NH2)상에 올리고뉴클레오티드들을 고정시켜 배열하는 방법이 있다(Matson, R.S. et al., (1995) Analytical Biochemistry 224, 110-116). 또 다른 방법으로는 3'-아미노 변형된 올리고뉴클레오티드들을 실리콘 칩 표면 위의 얇은 이산화규소(SiO2) 필름에 결합시켜 고정하는 방법으로서, 3'-아미노기와 3'-글리시드옥시프로필트리메톡시실란으로 처리되어 유도된 에폭시실란 단일층(monolayer) 사이에 에폭시고리열림 반응에 의해 3'-아미노 변형된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법이 개시되어 있다(Lamture, J.B. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 2121-2125). 또 다른 방법으로는, 일차 아민이 존재하는 나일론 막에 동종폴리머(homopolymers; dTTP)로 테일링(tailing)한 올리고뉴클레오티드를 스팟팅(spotting)하고, UV를 조사하여 올리고뉴클레오티드의 티민 염기를 활성화시켜 공유결합을 유도하는 방법이 있으며(Saiki, R.K., Walsh, P.S., Levenson, C.H. and Erlich, H.A. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6230-6234), 이를 개선한 아미노-링커가 부착된 올리고뉴클레오티드와 나일론막의 카르복실기들 사이에 아미드 결합으로 보다 안정된 결합을 형성시켜 혼성화 효율을 증가시킨 방법도 개시되어 있다(Zhang, Y., et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19, 3929-3933).
DNA 칩 제작시 고체표면 상에 젤 패드를 형성하는 경우는 합성된 올리고뉴클레오티드를 그 표면에 직접적으로 배열할 수 있기 때문에 요구되는 농도로 배치시킬 수 있다. 알려진 바로는 폴리아크릴아미드 젤은 50mM DNA 고정 수용 능력을 가지고 있으며, 올리고뉴클레오티드 칩의 배치 및 혼성화에 있어서 실제적으로 DNA가 1.5μM 농도에서 1.5mM 농도까지 사용될 수 있는데(Yershov, G. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4913-4918; Parinov, S. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2998-3004), 이는 평방 40 X 40 X 20 ㎛당 0.5 내지 50fmol의 올리고뉴클레오티드와 부합된다. 이것은 유리표면의 2차원적 고정 능력보다 100배 이상 높다(Yershov, G. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4913-4918). 그러므로 젤 패드를 이용한 DNA 칩은 상대적으로 적용시킬 분야가 넓고 제조하기가 간편한 이점이 있었다. 
본 출원인에 의해 제시된 기존의 바이오칩 제조과정은 한국특허출원 제1998-31456호에 나타낸 바와 같이 아크릴아미드와 비스아크릴아미드 그리고 글라이시딜메타크릴레이트(GMA)를 혼합한 다음, 고체표면상에서 상기 혼합용액을 가하여 중합반응시켜 겔 패드를 형성한 후, 겔 패드상에 아민기 함유 생분자를 공유결합시켜 제조하였다.
그러나 상술한 바와 같이, 유리 표면에 직접적으로 포토리소그래픽(Photolithographic) 합성 또는 여타 다른 합성방법에 의해 올리고뉴클레오티드를 합성하면서 고정 및 배열하는 것은 매우 어려우며, 고체 표면상에서 얻어지는 산물이 비교적 적어 특히 정량분석 등에 있어서는 적합하지 못하다. 또한 종래의 젤을 이용하여 DNA 칩을 제작하는 경우에도 여전히 문제점을 가지고 있어 다양한 분야에의 응용이 불가능하고, 또한 젤상에서 실험할 경우 고온에서 혼성화 실험을 수행하면 젤이 붕괴되며 검출민감도에 문제점이 제기되어, 이에 대한 개선의 필요성이 절실한 실정이었다. 
이에 본 발명자는 상기 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라, DNA 칩 실험을 좀더 안정적으로 정확하게 수행하기 위하여, 기존의 폴리아크릴아미드 젤 제조방법을 개선하고 DNA 칩 실험에 최적화된 폴리아크릴아미드 젤을 제작하기 위하여 예의노력한 결과, 폴리아크릴아미드 젤을 만드는데 사용하고 있는 가교제(cross-linker)인 비스아크릴아미드를 대치할 수 있는 가교제(cross-linker)를 사용하였다.
본 발명은 폴리아크릴아미드 젤의 안정성과 이러한 젤로 제작된 바이오칩의 실험시 프로브(probe)와 시료(sample)간의 혼성화(hybridization) 반응을 안정화시킬 수 있는 바이오칩을 제공하는 데 있다. 즉, 기존 폴리아크릴아미드 젤 제작에 사용하고 있는 비스아크릴아미드(bisacrylamide)를 대신하는 가교제(cross-linker)를 사용하여 기존 아크릴아미드 젤 패드의 장점을 유지하면서 단점인 온도의 안정성과 혼성화의 안정성이 높은 바이오칩 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 아크릴아미드(acrylamide)와 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드(dihydroxylethylenbisacrylamide)의 혼합용액에 글라이시딜메타크릴레이트(glycidylmethacrylate)를 첨가하여 혼합하고, 고체표면상에서 상기 혼합용액을 중합하여 젤 패드를 형성한 후, 상기 젤 패드상에 아민기 함유 생분자 또는 아민기 함유 화합물을 공유결합시켜 제조된 바이오칩 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 생분자라 함은 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 의미하며, 상기 생분자는 특히 DNA 일 수 있다.
본 발명에서 디하이드록실에틸렌비스아크릴아미드는 다음과 같이 화학식 1로 표시되는 구조를 나타낸다.
본 발명의 방법은 아크릴아미드와 디히드록시에틸렌비스아크릴아미드 혼합용액에 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가하고, 고체표면상에서 상기 용액을 중합반응시켜 젤 패드를 형성한 다음, 상기 젤 패드상에 아민기 함유 생분자 또는 아민기 함유 화합물을 공유결합시켜 제조한다. 본 발명에서는 가교제로서 통상적으로 사용되는 비스아크릴아미드 대신에 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드를 사용한다. 본 발명에서는 이렇게 가교제(cross-linker)를 젤 패드 칩에 적합한 가교제로 대치함으로써 기존의 젤보다 더 친수성이 강해지며, 포어(pore) 크기를 늘리게 됨으로써 시료 DNA 혹은 RNA 들이 손쉽게 젤 안으로 이동할 수 있도록 도와준다. 또한 이렇게 함으로 인해 혼성화 반응시 수용액하의 높은 온도에서도 오랜 시간동안 안정적으로 젤이 붕괴되지 않고 구조를 유지할 수 있게 됨으로써 젤 패드 칩의 안정성이 매우 증가되었다.
이하 본 발명의 바이오칩 및 그 제조방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
아크릴아미드(acrylamide)와 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드(dihydroxylethylenbisacrylamide)를 90 내지 99.1: 0.1 내지 10(w/v), 바람직하게는 99:1(w/v)의 비율로 혼합하여, 최종농도 6 내지 10%, 바람직하게는 10%의 아크릴아미드 혼합용액을 제조한다. 이때 혼합 비율은 다음 단계에서 목적으로 하는 젤의 포어 크기에 따라서 사용자에 따라서 조절가능하다.
그 후, 상기 제조한 아크릴아미드 혼합용액에 글라이시딜메타크릴레이트(glycidylmethacrylate)를 첨가하여 혼합한다. 글라이시딜메타크릴레이트는 상기 아크릴아미드 전체 용액에 대하여 1 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가한다. 이때, 아크릴아미드와 글라이시딜메타크릴레이트 단위체가 중합반응하여 글라이시딜메타크릴레이트의 메타크릴기와 아크릴아미드의 아크릴기가 중합결합하게 된다. 경우에 따라서 겔화 촉진제를 가할 수 있는데, 겔화 촉진제로서 N,N,N',N-테트라메틸렌디아민과 10% 암모니움퍼설페이트가 적량 첨가될 수 있다.
상기 글라이시딜메타크릴레이트를 첨가시킨 용액을 고체표면위에 도말하여 중합반응시켜 얇은 젤 패드를 형성한다. 그 후, 아민기 함유 생분자를 상기 젤 패드상에 스팟팅하여 고정화시킨다. 상기 생분자를 겔상에 결합시키기 위해서 생분자의 5' 말단에 링커로 아민기(NH2)를 부착시키고, 링커로 부착된 아민기(NH2)와 젤 내의 글라이시딜메타크릴레이트의 글라이시딜기(C3H6O2-)가 에폭시고리열림(ring opening) 반응에 의해 생분자는 젤에 안정되게 공유결합된다. 이러한 반응에 의해 아민기가 붙어있는 거대분자들을 젤에 에폭시고리열림반응으로 매우 안정되게 결합시킬 수 있다.
본 발명의 바이오칩을 혼성화 실험 등에 사용하면 종래의 젤 패드에 바하여 열에 매우 안정하므로 혼성화 반응에 대한 안정성이 증가되며, 기존 혼성화 실험 등에 비하여 그 절차와 시간을 단축시킬 수 있으며, 혼성화 반응을 수행시 고온에서 젤이 붕괴 또는 파손되는 현상이 없어지므로 반복적인 실험이 필요없게 되며, 한번의 실험으로 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다.
이하, 실시예를 동하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험예 1 아민기 올리고뉴클레오티드 합성
본 발명의 젤 패드의 열에 대한 안정성과 혼성화의 효율을 관찰하기 위해 100개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 S. pombe의 유전자중 100개를 선정하여 25-35bp의 올리고뉴클레오티드를 자동 DNA 합성기를 이용하여 합성하였다. 합성한 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 젤 패드의 글라이시딜메타크릴레이트와 반응시키기 위해 5' 말단에 아민-링커를 부착시켰다.
실험예 2 혼성화용 올리고뉴클레오티드의 합성
실험예 1에서 합성된 아민 올리고뉴클레오티드의 혼성화 정도를 확인하기 위해 이에 상보적이며 TAMRA 형광물질이 부착된 올리고뉴클레오티드를 자동 DNA 합성기를 이용하여 합성하였다. 이때 5' 말단에는 TAMRA 형광물질을 부착시켰다.
실시예 1 바이오칩의 제조
디히드록실에틸렌비스아크릴아미드를 첨가한 폴리아크릴아미드 용액의 제조
아크릴아미드와 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드의 비율을 99:1(w/v)로 하여, 최종농도 10%(w/v)의 아크릴아미드 혼합용액을 제조하였다. 상기 혼합용액에 글라이시딜메타크릴레이트를 전체 용액에 대해 1%(w/v)의 농도로 가하여 혼합기에 섞었다. 이어, 겔화촉진제로서 N,N,N', N-테트라메틸에틸렌디아민과 10% 암모니움퍼설페이트를 상기 용액에 각각 4ul/ml와 10ul/ml씩 가하여 혼합하였다.
슬라이드글래스 표면상에 젤 패드 형성
슬라이드글래스(76x26mm) 표면을 수세한 후 결합용액(binding solution; 5ul 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트, 5ul 아세트산, 990ul 에틸알코올)을 처리하여 건조시켰다. 그 후 슬라이드글래스 표면상에 상기 혼합용액을 15㎕ 가한 후 글래스 코트 용액(Glass Coat Solution, Sigma사)으로 처리시킨 슬라이드글래스를 덮고 2시간 이상 중합반응시켰다. 그 후, 덮은 슬라이드를 분리시켜 20㎛이하 두께의 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드가 첨가중합된 폴리아크릴아미드 젤 패드를 형성하였다.
젤 패드에 생분자의 고정
상기 실험예 1에서 합성된 올리고뉴클레오티드 용액(10nM)을 소듐 보레이트 완충액(0.1M, pH9.3)에 1:1로 희석시킨 다음, 상기 단계에서 제조된 폴리아크릴아미드 젤 패드에 스팟 직경이 약 300㎛이 되도록 스팟팅하여 미세배열(microarray)하여 칩을 제작하였다. 아민기 올리고뉴클레오티드의 고정화 반응을 실온 상에서 16시간 동안 실행하고 물로 세척한 후, 더 이상 아민기에 의한 에폭시고리열림반응을 방지하기 위해서 차단 용액(0.1M 소듐보레이트, 10% DMSO, 1M 에탄올아민)을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 10% DMSO 용액으로 10분간 세척하였다. 슬라이드를 완전히 말린 후, 다음 단계를 위해 4℃에 저장하였다.
실시예 2
칩의 젤 패드의 내열성 실험
실시예 1에서 제작된 칩의 젤 패드와 대조군으로서 종래의 칩의 젤 패드에 대한 내열성 실험을 수행하였다. 종래의 칩의 젤 패드는 한국특허출원 1998-0031456호에 제시된 방법에 따라서 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드를 사용하여 젤 패드 칩을 제작하였다. 이렇게 제작된 젤 패드 칩을 혼성화 완충액(1M NaCl, 1mM EDTA(pH8.0), 5mM Sodium phosphate(pH7.0)) 중에서 60℃로 16시간을 방치한 후에 확인하였다. 이 결과를 사진촬영하여 도 1에 나타내었다. 도 1은 본 발명의 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드를 사용한 젤 패드와 종래의 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드를 사용한 젤 패드의 내열성 실험에 대한 결과 사진이다. 도 1에 제시된 바와 같이, 종래의 젤 패드(왼쪽 슬라이드글래스)의 경우에는 혼성화 완충액중에서 60도로 16시간을 경과하게 되면 젤이 붕괴되는 현상이 발생하였으나, 본 발명의 젤 패드(오른쪽 슬라이드글래스)의 경우에는 48시간이 지나서도 안정적으로 젤 패드 구조를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3
혼성화에 따른 영향
실시예 1에서 제작된 젤 패드에 실험예 1에서 제작된 100개의 아민 올리고뉴클레오티드를 400㎛ 간격으로 스팟팅하여 미세배열하여 칩을 제작하였다. 대조군으로서 실시예 2에 제시된 종래 방법에 따라 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드를 사용하여 제작된 젤 패드를 이용하여 동일하게 스팟팅하여 칩을 제작하였다. 제작된 칩을 16시간 동안 고정화 반응을 수행한 후, 상기 실시예 1에 제시된 차단용액을 이용하여 블록킹 작업을 수행하였다. 혼성화 반응을 위해 칩에 고정화된 올리고뉴클레오티드와 상보적인 염기서열을 지닌 실험예 2에서 제작된 TAMRA 표지된 올리고뉴클레오티드를 5pM 농도로 1X 혼성화 완충액(1M NaCl, 0.1% Tween 20) 20㎕를 준비한다. 본 발명의 칩과 종래의 칩에 각각 20㎕의 혼성화 완충액을 넣은 후 혼성화 챔버에서 60℃에서 1시간동안 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화 반응이 끝난 후, 0.1X 혼성화 완충액 40ml로 10분간 40도에서 세척하였다. 세척 후 물기를 제거한 후 칩 스캐너(GenePix 4000B)를 이용하여 칩을 스캐닝하여 형광 값을 측정하였다. 그 결과를 도 2와 도 3으로 나타내었다.
도 2는 종래의 메틸렌비스아크릴아미드를 사용한 칩의 젤 패드의 혼성화에 따른 영향에 대한 결과 사진이고, 도 3은 본 발명의 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드를 사용한 칩의 젤 패드의 혼성화에 따른 영향에 대한 결과 사진이다.
도 3에 나타낸 바와 같이 종래의 칩(도 2)에 비해 본 발명의 칩이 형광 이미지가 높게 나타났으며, 100개의 올리고뉴클레오티드에 대한 형광 값의 평균을 냈을 때 종래의 칩에 비하여 본 발명의 칩이 약 2배 이상의 높은 형광 값을 나타냈다(도 4 참조). 따라서, 본 발명의 칩이 종래의 칩에 비하여 형광 검출 민감도가 높으며, 칩의 안정성 및 효율성이 매우 높음을 알 수 있다.
본 발명은 기존의 젤 패드를 기반으로 한 바이오칩에 비하여 젤의 안정성이 증가됨으로써 바이오 칩을 이용한 실험 수행 시 젤 패드의 안정성 문제를 해결하고 혼성화 실험의 효율성, 검출 민감도 및 안정성을 증진시키는 바이오 칩을 제공함으로써 바이오칩 실험에 유용하게 이용되어질 수 있다.
도 1은 본 발명의 젤 패드와 종래의 젤 패드의 내열성 실험에 대한 결과 사진이다.
도 2는 종래의 젤 패드에 대한 혼성화에 따른 영향에 대한 결과 사진이다.
도 3은 본 발명의 젤 패드에 대한 혼성화에 따른 영향에 대한 결과 사진이다.
도 4는 본 발명의 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드를 사용한 젤 패드와 종래의 메틸렌비스아크릴아미드를 사용한 젤 패드에 대한 혼성화 영향에 대한 형광 값에 대한 그래프이다.

Claims (5)

  1. 아크릴아미드 : 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드가 90내지99.9 : 0.1내지10(w/v)로 혼합되는 아크릴아미드와 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드의 혼합용액에, 글라이시딜메타크릴레이트를 상기 전체 혼합용액내에 1 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가하여 혼합하는 단계;
    고체표면상에서 상기 용액을 중합반응시켜 젤 패드를 제조하는 단계;
    상기 젤 패드상에 아민기 함유 생분자를 공유결합시키는 단계로 이루어지는 바이오칩의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 생분자는 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 바이오칩의 제조방법.
  5. 아크릴아미드 : 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드가 90내지99.9 : 0.1내지10(w/v)로 혼합되는 아크릴아미드와 디히드록실에틸렌비스아크릴아미드의 혼합용액에, 글라이시딜메타크릴레이트를 상기 전체 혼합용액내에 1 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가하여 혼합하고, 고체표면상에서 상기 용액을 중합반응시켜 젤 패드를 형성한 후, 상기 젤 패드상에 아민기 함유 생분자를 공유결합시켜 제조한 바이오칩.
KR10-2002-0066359A 2002-10-30 2002-10-30 바이오칩 및 이의 제조방법 KR100487167B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0066359A KR100487167B1 (ko) 2002-10-30 2002-10-30 바이오칩 및 이의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0066359A KR100487167B1 (ko) 2002-10-30 2002-10-30 바이오칩 및 이의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20040037744A KR20040037744A (ko) 2004-05-07
KR100487167B1 true KR100487167B1 (ko) 2005-05-03

Family

ID=37336026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2002-0066359A KR100487167B1 (ko) 2002-10-30 2002-10-30 바이오칩 및 이의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100487167B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000012892A (ko) * 1998-08-03 2000-03-06 박한오 생분자 마이크로칩 및 그 제조방법
US20020106659A1 (en) * 2000-07-11 2002-08-08 Kamelia Karlou-Eyrisch Superparamagnetic bead polymers

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000012892A (ko) * 1998-08-03 2000-03-06 박한오 생분자 마이크로칩 및 그 제조방법
US20020106659A1 (en) * 2000-07-11 2002-08-08 Kamelia Karlou-Eyrisch Superparamagnetic bead polymers

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Current Opinion in Chemical Biology 5:40-45, 2001 *
J Biomater Sci Polym Ed. 11(8):817-31, 2000 *
초록, Biomaterial, Vol.21, No.5, pp.441-7, 2000.3. *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20040037744A (ko) 2004-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Guschin et al. Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA, and protein microchips
US6858713B1 (en) Chemically modified biological molecules and methods for coupling biological molecules to solid support
US6589726B1 (en) Method and apparatus for in situ synthesis on a solid support
JP4890411B2 (ja) アドレス可能アレイでのリガーゼ検出反応を用いた核酸配列の相違の検出
US7695910B2 (en) Method for manufacturing hydrogel biochip by using star-like polyethylene glycol derivative having epoxy group
Gabig et al. An introduction to DNA chips: principles, technology, applications and analysis
Dufva Introduction to microarray technology
WO2001070641A1 (en) Polymer coated surfaces for microarray applications
JP4184089B2 (ja) 基板、調製及び使用
LeProust et al. Characterization of oligodeoxyribonucleotide synthesis on glass plates
Hackler et al. Development of chemically modified glass surfaces for nucleic acid, protein and small molecule microarrays
US7687259B2 (en) Method for noncovalently immobilizing a biomolecule on a solid substrate and microarray produced according to the method
CA2335377C (en) Bio-molecular microchip and manufacturing process thereof
KR100487167B1 (ko) 바이오칩 및 이의 제조방법
JP4635707B2 (ja) 検出表面と該検出表面の作製方法、並びにプローブ物質の固定密度制御方法
Zlatanova et al. Gel-immobilized microarrays of nucleic acids and proteins: production and application for macromolecular research
KR100542385B1 (ko) 생분자마이크로칩및그제조방법
RU2157385C1 (ru) Способ изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов
KR20030020232A (ko) 에폭시기를 갖는 방사형 폴리에틸렌글리콜 유도체를이용한 하이드로 젤 바이오칩의 제조방법
KR100498288B1 (ko) 핵산 마이크로어레이 및 이의 제조방법
US20190085390A1 (en) Flow cells having reactive surfaces for nucleic acid sequence analysis
US20190060860A1 (en) High-density nucleic acid arrays on polyester substrates
JP4054499B2 (ja) 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ
Nguyen et al. DNA Microarray Applications
Stich Biochips

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130403

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140401

Year of fee payment: 10

LAPS Lapse due to unpaid annual fee