RU2157385C1 - Способ изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов - Google Patents
Способ изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2157385C1 RU2157385C1 RU99115635/04A RU99115635A RU2157385C1 RU 2157385 C1 RU2157385 C1 RU 2157385C1 RU 99115635/04 A RU99115635/04 A RU 99115635/04A RU 99115635 A RU99115635 A RU 99115635A RU 2157385 C1 RU2157385 C1 RU 2157385C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- unsaturated
- oligonucleotides
- water
- monomers
- copolymerization
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и касается способа изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органических полимерных гелях, получаемых полимеризацией непредельных мономеров. Такие микрочипы могут найти применение в молекулярной биологии и биотехнологии, при секвенировании и картировании ДНК, в генетическом анализе, при детектировании мутаций, в медицине и для других приложений. Описывается способ изготовления микрочипа на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органическом геле, приготовленном путем сополимеризации непредельных производных олигонуклеотидов с ненасыщенными мономерами, причем водно-солевые растворы, содержащие ненасыщенные мономеры, модифицированные непредельными фрагментами олигонуклеотиды и компонент каталитической системы, индуцирующей полимеризацию, растворимый только в воде, наносят на стеклянную подложку в виде микрокапель и проводят сополимеризацию мономеров погружением сформированной матрицы в не смешивающийся с водой органический растворитель, содержащий растворенный другой компонент каталитической системы. Технический результат - упрощение способа изготовления микрочипов с высокой плотностью элементов матрицы. 5 з.п. ф-лы, 2 ил.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и касается способа изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органических полимерных гелях, получаемых полимеризацией непредельных мономеров. Такие микрочипы могут найти применение в молекулярной биологии и биотехнологии, при секвенировании и картировании ДНК, в генетическом анализе, при детектировании мутаций, в медицине и для других приложений.
Известны способы изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов. Эти способы используют либо олигонуклеотидный синтез непосредственно на поверхности матрицы [Fodor S.P.A., Read J.L., Pirrung M.C., Stryer L., Lu. A.T., and Solas D. (1991) Science 251, 767-773], либо иммобилизацию предварительно синтезированных олигонуклеотидов на микроматрице, модифицированной функциональными группами [Timofeev E. N. , Kochetkova S.V., Mirzabekov A.D., and Florentiev V.L. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 3142-3148].
Известен также способ изготовления олигонуклеотидных микрочипов с помощью фотоинициируемой сополимеризации модифицированных непредельными фрагментами олигонуклеотидов с акриламидом и N,N'-метиленбисакриламидом [Василисков В.А., Тимофеев Э.Н., Суржиков С.А., Дробышев А.Л., Шик В.В., Мирзабеков А.Д. (1998) Молекулярная биология. 32, 923-925]. В соответствии с этим способом готовят растворы индивидуальных модифицированных олигонуклеотидов, содержащие также акриламид, N,N'- метиленбисакриламид, солевой буфер, глицерин, тетраметилэтилендиамин и метиленовый синий, где глицерин служит для повышения вязкости раствора, а метиленовый синий является источником радикалов, генерируемых при облучении смеси светом. В качестве модифицированных олигонуклеотидов используют их аллильные производные. Полученные растворы используют при изготовлении микрочипов по следующей методике. Растворы олигонуклеотидов, разделенные физически с помощью перегородок (спейсеров), помещают между двумя стеклами, одно из которых (верхнее) является маской, и под прозрачными окошками маски проводят одновременную фотоинициируемую полимеризацию растворов, расположенных в разных зонах.
Описанный способ изготовления олигонуклеотидных микрочипов имеет следующие недостатки, а именно:
1) необходимость проведения многочисленных циклов полимеризации растворов олигонуклеотидов;
2) сложность обеспечения герметичности зон при использовании многочисленных спейсеров;
3) возможность взаимного загрязнения элементов матрицы;
4) необходимость изготовления масок;
5) способ не обеспечивает изготовление микрочипа с высокой плотностью элементов матрицы.
1) необходимость проведения многочисленных циклов полимеризации растворов олигонуклеотидов;
2) сложность обеспечения герметичности зон при использовании многочисленных спейсеров;
3) возможность взаимного загрязнения элементов матрицы;
4) необходимость изготовления масок;
5) способ не обеспечивает изготовление микрочипа с высокой плотностью элементов матрицы.
В основу изобретения положена задача упрощения способа изготовления микрочипов с высокой плотностью элементов матрицы.
Задача решена тем, что изобретением предлагается способ изготовления микрочипа на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органическом геле, приготовленном путем сополимеризации непредельных производных олигонуклеотидов с ненасыщенными мономерами, причем водно-солевой раствор, содержащий ненасыщенные мономеры, модифицированные непредельными фрагментами олигонуклеотиды и компонент каталитической системы, индуцирующей полимеризацию, растворимый только в воде, наносят на стеклянную подложку в виде микрокапель и проводят сополимеризацию мономеров погружением сформированной матрицы в не смешивающийся с водой органический растворитель, содержащий растворенный другой компонент каталитической системы.
Предпочтительно в качестве одного из ненасыщенных мономеров использовать акриламид.
Олигонуклеотиды, модифицированные непредельными фрагментами, могут содержать одну или несколько групп общей формулы R1R2C=CR3R4, где R1, R4 = H или алкил C1-С3, R2 = (CH2)n-O-Y и R3 = (CH2)n-O-Y, n=1-6, X и Y = фосфодиэфирные группы, связывающие непредельные фрагменты с соседними нуклеотидными звеньями или соседними непредельными фрагментами, или одна из групп X или Y представляет собой атом водорода, которые вводят в олигонуклеотид в ходе стандартного фосфорамидитного олигонуклеотидного синтеза с использованием фосфорамидитов общей формулы R5R6C=CR7R8, где R5,R8 = H или алкил C1-C3, R6 = (CH2)n-O-Р(OCH2CH2CN)(N(С3H7)2)2, n= 1-6, R7 = -(CH2)n-O-DMT, n=1-6 (DMT = 4,4'-диметокситритил).
Желательно в качестве инициатора полимеризации использовать систему персульфат аммония - тетраметилэтилендиамин (TEMED), в которой персульфат аммония является компонентом, растворимым только в воде, а TEMED растворим и в воде и в не смешивающемся с водой органическом растворителе.
Целесообразно в качестве органического растворителя использовать гексан.
Предпочтительно для нанесения раствора в виде микрокапель использовать струйное подающее устройство, позволяющее с высокой скоростью распределять микрообъемы большого числа растворов по плоской поверхности.
Предлагаемый способ позволяет в одну стадию изготовить микрочип с высокой плотностью элементов матрицы, что необходимо для параллельных манипуляций с тысячами проб нуклеиновых кислот, что дает возможность использовать микрочипы для картирования генома, скрининга клонов, диагностики вирусных и бактериальных инфекций, секвенирования.
Высокая плотность элементов матрицы обеспечивается нанесением растворов в виде микрокапель.
Способ осуществляется следующим образом.
Стекло, используемое в качестве подложки для проведения полимеризации, обрабатывают реагентом, который модифицирует поверхность стекла ненасыщенными группами. Таким реагентом может являться, например, N-[3-(триэтоксисилил)пропил] акриламид, [3-(триэтоксисилил)пропил] (мет)акрилат, аллилтриэтоксисилан и другие.
Водно-солевые растворы, содержащие ненасыщенные мономеры, модифицированные непредельными фрагментами олигонуклеотиды, глицерин и персульфат аммония, наносят на подготовленное описанным выше образом стекло в виде микрокапель требуемого размера (определяемого задаваемой плотностью элементов матрицы) с помощью наносящего устройства, такого как, например, микропипетка, пиновый наноситель, струйный принтер и др. с образованием матрицы мономеров заранее заданной топологии. Каждая микрокапля содержит индивидуальный олигонуклеотид с присоединенным к нему непредельным фрагментом, способный к химически индуцированной сополимеризации с другими ненасыщенными мономерами.
Полученную матрицу погружают в органический растворитель, который не смешивается с растворами мономеров и обладает меньшей, чем у воды плотностью (что препятствует смешиванию растворов мономеров) и который содержит TEMED в качестве другого компонента каталитической системы, индуцирующей радикальную сополимеризацию мономеров. В результате диффузии инициатора полимеризации (TEMED) из органического растворителя в микрокапли происходит одновременная полимеризация всех элементов олигонуклеотидной матрицы, в результате чего получают микрочип с заданной топологией матрицы.
Микрочип, изготовленный описанным способом, представляет собой жесткую подложку, например, стекло, на которой расположены олигонуклеотиды, иммобилизованные в гель путем сополимеризации ненасыщенных мономеров (фиг. 1) и образующие матрицу с заданной топологией и плотностью ее элементов.
Изобретение поясняется конкретным примером его выполнения и фигурами, где
на фиг. 1 представлена схема химически индуцируемой иммобилизации олигонуклеотидов,
на фиг. 2 - использование микрочипа для гибридизации.
на фиг. 1 представлена схема химически индуцируемой иммобилизации олигонуклеотидов,
на фиг. 2 - использование микрочипа для гибридизации.
Пример 1. Способ изготовления микрочипа химически индуцируемой сополимеризацией олигонуклеотидов.
Микрокапли раствора, содержащего 5% смеси акриламид - N,N'- метиленбисакриламид (19:1), 0,1 М натрий фосфатный буфер, pH 7,0, 40% глицерин, 0,05% персульфата аммония, и 0,3 мМ олигонуклеотида, модифицированного непредельными фрагментами, объемом 0,2 микролитра наносят микродозатором на поверхность стекла. Стекло предварительно обрабатывают [(3-триэтоксисилил)пропил] метакрилатом. Сформированную матрицу растворов погружают в 80 мл 0,5% раствора TEMED в гексане. Полимеризация обычно занимает 1 час при комнатной температуре. Полученный микрочип отмывают водой в течение 1 часа при 60oC и высушивают. Контроль иммобилизации осуществляют, наблюдая связывание комплементарного флюоресцентно меченного олигонуклеотида (фиг. 2).
Claims (6)
1. Способ изготовления микрочипа на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органическом геле, приготовленном путем сополимеризации непредельных производных олигонуклеотидов с ненасыщенными мономерами, отличающийся тем, что водно-солевые растворы, содержащие ненасыщенные мономеры, модифицированные непредельными фрагментами олигонуклеотиды и компонент каталитической системы, индуцирующей полимеризацию, растворимый только в воде, наносят на стеклянную подложку в виде микрокапель и проводят сополимеризацию мономеров погружением сформированной матрицы в несмешивающийся с водой органический растворитель, содержащий растворенный другой компонент каталитической системы.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве одного из ненасыщенных мономеров используют акриламид.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве инициатора полимеризации, растворимого и в воде, и в органическом растворителе, используют тетраметилэтилендиамин.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют гексан.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве одного из компонентов раствора, наносимого в виде микрокапли, используют глицерин.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что олигонуклеотиды, модифицированные непредельными фрагментами, содержат одну или несколько групп общей формулы
R1R2С=СR3R4,
где R1, R4 = Н или алкил С1-С3;
R2 = (СН2)n-О-Х;
R3 = (СН2)n-О-Y, n = 1 - 6, Х и Y = фосфодиэфирные группы, связывающие непредельные фрагменты с соседними нуклеотидными звеньями или соседними непредельными фрагментами, или одна из групп Х или Y представляет собой атом водорода, которые вводят в олигонуклеотид в ходе стандартного фосфорамидитного олигонуклеотидного с использованием фосфорамидитов общей формулы
R5R6С = СR7R8,
где R5, R8 = Н или алкил С1-С3;
R6 = (СН2)n-О-Р(ОСН2СН2СN)(N(С3Н7)2)2, n = 1 - 6;
R7 = -(СН2)n-О-DMT, n = 1 - 6, DMT-4,4'-диметокситритил.
R1R2С=СR3R4,
где R1, R4 = Н или алкил С1-С3;
R2 = (СН2)n-О-Х;
R3 = (СН2)n-О-Y, n = 1 - 6, Х и Y = фосфодиэфирные группы, связывающие непредельные фрагменты с соседними нуклеотидными звеньями или соседними непредельными фрагментами, или одна из групп Х или Y представляет собой атом водорода, которые вводят в олигонуклеотид в ходе стандартного фосфорамидитного олигонуклеотидного с использованием фосфорамидитов общей формулы
R5R6С = СR7R8,
где R5, R8 = Н или алкил С1-С3;
R6 = (СН2)n-О-Р(ОСН2СН2СN)(N(С3Н7)2)2, n = 1 - 6;
R7 = -(СН2)n-О-DMT, n = 1 - 6, DMT-4,4'-диметокситритил.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU99115635/04A RU2157385C1 (ru) | 1999-07-19 | 1999-07-19 | Способ изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU99115635/04A RU2157385C1 (ru) | 1999-07-19 | 1999-07-19 | Способ изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2157385C1 true RU2157385C1 (ru) | 2000-10-10 |
Family
ID=20222833
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU99115635/04A RU2157385C1 (ru) | 1999-07-19 | 1999-07-19 | Способ изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2157385C1 (ru) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003010203A1 (fr) * | 2001-07-25 | 2003-02-06 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Procede de preparation et composition de formulations destinees a l'immobilisation des macromolecules biologiques dans des hydrogels et son utilisation dans la fabrication de biopuces |
WO2003033539A1 (fr) * | 2001-10-16 | 2003-04-24 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Composition pour immobilisation par polymerisation de macromolecules biologiques et procede de fabrication correspondant |
WO2003033691A1 (fr) * | 2001-10-19 | 2003-04-24 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Micropuce cellulaire et son utilisation dans un procede d'analyse de cellules vivantes |
US7271895B2 (en) | 2004-04-09 | 2007-09-18 | Institute For Roentgen Optics | Fluorescent sensor on basis of multichannel structures |
RU2453606C2 (ru) * | 2010-07-16 | 2012-06-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" | Способ расширенного скрининга предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям и биочип для осуществления этого способа |
-
1999
- 1999-07-19 RU RU99115635/04A patent/RU2157385C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. В.А. ВАСИЛИСКОВ и др. Метод получения микрочипов с помощью сополимеризации с акриламидом. Молекулярная биология. - 1988, т.32, N 5, с.923 - 925. 2. * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003010203A1 (fr) * | 2001-07-25 | 2003-02-06 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Procede de preparation et composition de formulations destinees a l'immobilisation des macromolecules biologiques dans des hydrogels et son utilisation dans la fabrication de biopuces |
WO2003033539A1 (fr) * | 2001-10-16 | 2003-04-24 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Composition pour immobilisation par polymerisation de macromolecules biologiques et procede de fabrication correspondant |
EP1437368A4 (en) * | 2001-10-16 | 2004-10-27 | Inst Molekulyarnoi Biolog Im V | COMPOSITION FOR POLYMERIZING IMMOBILIZATION OF BIOLOGICAL MOLECULES AND METHOD FOR PRODUCING THIS COMPOSITION |
US7846656B2 (en) | 2001-10-16 | 2010-12-07 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im.V.A. Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Composition for polymerizing immobilization of biological molecules and method for producing said composition |
WO2003033691A1 (fr) * | 2001-10-19 | 2003-04-24 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Micropuce cellulaire et son utilisation dans un procede d'analyse de cellules vivantes |
US7271895B2 (en) | 2004-04-09 | 2007-09-18 | Institute For Roentgen Optics | Fluorescent sensor on basis of multichannel structures |
RU2453606C2 (ru) * | 2010-07-16 | 2012-06-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" | Способ расширенного скрининга предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям и биочип для осуществления этого способа |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6180770B1 (en) | Nucleic acid-containing polymerizable complex | |
US5763263A (en) | Method and apparatus for producing position addressable combinatorial libraries | |
US6692912B1 (en) | Nucleic acid-containing polymerizable complex | |
Guschin et al. | Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA, and protein microchips | |
Vasiliskov et al. | Fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization | |
RU2206575C2 (ru) | Композиция для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях, способ приготовления композиции, биочип, способ проведения пцр на биочипе | |
US6300137B1 (en) | Method for synthesizing a specific, surface-bound polymer uniformly over an element of a molecular array | |
US20050196760A1 (en) | Dual phase multiplex polymerase chain reaction | |
US6656725B2 (en) | Method of fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization | |
EP0877821A1 (en) | A rapid method to detect duplex formation in sequencing by hybridization methods | |
DE102007008499B4 (de) | Verfahren zur Immobilisierung von Hydrogelen über unmodifizierten Polymermaterialien, Biochip auf Basis von unmodifizierten Polymermaterialien und Verfahren zu seiner Herstellung | |
RU2216547C2 (ru) | Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления | |
RU2157385C1 (ru) | Способ изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов | |
EP4007655A1 (en) | Flow cells | |
US6423552B1 (en) | Method for the preparation of compound micro array chips and the compound micro array chips produced according to said method | |
RU2157377C1 (ru) | Способ иммобилизации модифицированных непредельными фрагментами олигонуклеотидов путем сополимеризации | |
CN1159454C (zh) | 制备化合物微阵列芯片的方法及由该方法制备的化合物微阵列芯片 | |
EP1458907A2 (en) | Combinatorial synthesis on arrays | |
US20240091731A1 (en) | Devices and methods for multiplexing chemical synthesis | |
KR100352171B1 (ko) | 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법 및 그방법에 의하여 제조되는 올리고뉴클레오타이드 어레이 | |
KR100348868B1 (ko) | 고분자 광산발생제를 이용한 고체기질 위에서의 염기함유 올리고머 합성방법 | |
WO2004002995A1 (en) | Phosphoramidites for coupling oligonucleotides to [2 + 2] photoreactive groups | |
KR100487167B1 (ko) | 바이오칩 및 이의 제조방법 | |
US20030232343A1 (en) | Methods for testing reagent distribution in reaction chambers | |
KR20210120822A (ko) | 시퀀싱 키트 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040720 |
|
NF4A | Reinstatement of patent | ||
PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20080408 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130720 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20140627 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180720 |