CN1159454C - 制备化合物微阵列芯片的方法及由该方法制备的化合物微阵列芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备化合物微阵列芯片的方法，尤其是采用微反应池母板分步定位在片合成制备化合物微阵列芯片的方法，及由该方法制备的化合物微阵列芯片。

Description

制备化合物微阵列芯片的方法 及由该方法制备的化合物微阵列芯片

本发明是涉及制备化合物微阵列芯片的新方法，尤其是采用具有微反应池母板多次分步定位合成法制备化合物微阵列芯片的方法，及由该方法制备的化合物微阵列芯片。

化合物微阵列芯片是指在固体基片表面上制备一组由不同分子微单元组成的化合物阵列。化合物主要指生物大分子物质包括核酸如DNA、RNA、寡核苷酸等，多肽和蛋白质如酶、抗体、抗原等，以及其它人工合成的生物活性物质如PNA(肽核酸)等。当化合物具有核酸分子的性质时，化合物微阵列芯片又称之为基因芯片。

化合物微阵列芯片在生物检测、医学检测、药物筛选、基因序列分析和化合物库的合成等方面有着极其重要的意义。例如在生物学中，随着分子生物学的不断发展，特别是举世瞩目的人类基因组计划实施以来，有关核酸、蛋白质序列和结构的数据呈指数增长。而下世纪最富挑战性的工作就是人类基因组计划完成后，即在后基因时代，我们如何对大量的生物分子信息进行分析，找出其中规律，使生物学由实验上升到理论，从而更好地认识生命现象，并使医学治疗产生根本革命。现代医学正在从系统、器官、组织、细胞层次上的第二阶段医学”向“分子水平上的DNA→RNA→蛋白质，蛋白质与核酸相互作用，以及它们与环境相互作用层次上的第三阶段医学”转化。这种在分子层次上进行的基因诊断与基因治疗，将根本地认识疾病产生的根源，并将有希望根本认识和治疗包括癌症在内的重大疾病。这些生物学、医学的变革，一个根本的前提是大量基因序列的快速测定和分析。能否有效快速地进行大量基因测序与分析，影响到人类基因组计划的实施，从而影响生物学、医学的进一步发展。传统基因测序所采用的方法包括化学反应、凝胶电泳法等一系列繁复的步骤，这种方法花费时间较长，且需要繁复操作。尤其在大规模测序方面费时，并且不适宜便携化快速测序。在对传统基因测序方法进行改进的过程中，以基因芯片为代表的生物芯片技术应运而生。生物芯片技术是将生命科学研究中所涉及的许多不连续的分析过程，如样品制备，化学反应和分析检测等通过采用微电子，微机械等工艺集成到芯片中，使之连续化，集成化和微型化。这一技术的成熟和应用将在下个世纪的疾病诊断和治疗、新药开发、司法鉴定、生物医学研究、食品和环境等生命科学相关领域带来一场革命，为生物信息的获取及分析提供强有力的手段。

化合物微阵列芯片对于生命科学研究是非常重要和必要的。生物物质(如蛋白质、核酸等)的序列是通过芯片上的已知化合物分子阵列与被测定的生物分子之间的相互作用进行检测或测序。以核酸检测为例，其中包括首先在固相载体上制备寡核苷酸分子探针阵列，即化合物微阵列，然后使待测基因与寡核苷酸分子探针阵列进行杂交，通过计算机对杂交结果进行分析，获得待测基因序列的信息。而在基因芯片的制备中，其关键点在于寡核苷酸分子探针阵列的制备。

人们希望芯片的探针阵列空间分辨率高，并且合成工作量小，速度快，方法简单，成本低。目前，有两种制备寡核苷酸探针阵列的方法。一种是利用常规固相合成技术分别合成好需要的单个探针分子，然后利用喷打或印刷技术将不同的探针分子结合在基片上的不同位置，从而形成探针阵列。利用喷打或印制方法制备探针阵列很难达到较高的空间分辨率，并且在探针分子制备时为逐个合成，合成工作量大，耗时长，芯片的集成度小，成本高，不利于批量生产。而另一种方法则是美国Affymetrix公司提出的利用模板定域光化学反应，在基片上合成探针阵列。利用这种方法制备探针阵列可达到较高的空间分辨率(40×40μm²)，而且在片合成时为并行合成，合成速度快。但由于光化学反应产率较低，反应中副作用反应产物较多，使得合成探针序列正确率不高，而且需要具有特殊保护基团的试剂，成本较高，因此，在化合物微阵列芯片的制备中仍需要有更好的方法。

本发明的目的就是提供一种制备方法简单、可靠、空间分辨率高、正确率高、低成本的化合物微阵列芯片的制备方法，即采用微反应池母板多次分步定位合成法制备化合物微阵列芯片。

本发明人经长期广泛深入的研究，现已发现一种制备化合物微阵列芯片的新方法，该方法包括：

首先根据所需化合物的微阵列设计制备表面上有微反应池等结构的微反应池母板，然后根据预先的设计将微反应池母板压置于一块固体基片上，并使两者紧密结合，形成一微流体系统。在微流体系统中注入反应溶液，在与微反应池接触的固体基片表面上产生化学反应，把适合的化学基团连接在基片表面特定的位置。通过更换压置在固体基片上的微反应池母板，或者通过控制微反应池母板上的微流体阀门，可以控制化学反应在固体基片表面指定的位点上进行，连接上所需的化学基团，得到化合物微阵列芯片。本发明基于以上步骤得以完成。在上述方法中，用微反应池母板上的微结构构成的微反应池(包括沟槽)的位置，和/或通过改变微流体在反应池中的流动，和/或改变其化学反应条件，控制与微反应池接触的固体基片上化学反应。从而实现把特定化学的基因共价偶联在基片表面分子上，最后在基片上形成所需的化合物微阵列芯片。

本发明第一方面涉及的是制备化合物微阵列芯片的新方法，尤其是采用微反应池母板多次分步定位合成法制备化合物微阵列芯片的方法。

本发明再一方面涉及的是由本发明的方法制得的化合物微阵列芯片，尤其是高密度DNA微阵列芯片和高密度PNA微阵列芯片。

根据本发明，本发明方法的特征在于：(a)根据所需的化合物微阵列芯片设计和制备表面具有微反应池等结构的微反应池母板；(b)将(a)中制备的微反应池母板压置在待制备化合物微阵列的固体基片表面上，并和固体基片表面构成微流体系统。(c)将反应物和催化剂等溶液、清洗溶液，化学处理溶液分步引入母板和固体基片共同构成的微流体系统中，通过控制适当的反应条件，在和微反应池中的溶液接触的固体基片表面进行化学反应，连接上特定的化学基因。(d)接照设计的顺序，通过定位装置，将不同的(a)中制备的具有特定的微反应池分布的微反应池母板压置在同一个固体基片表面上，通过改变反应池的化学反应条件，和/或通过(a)中制备的微反应池母板上的微流体阀门控制反应池中的液体，可控地在固体基片表面上合成所需的化合物微单元阵列，并制备出相应的芯片。

本发明中所用术语微反应池母板是指一块表面上具有一系列分布的微反应池和/或带有微流体沟道及微阀等微流动结构的平板，它们与固体基片结合可构成微流体系统，可在固体基片表面的适当位置进行化学反应从而结合上特定的化学基团。

本发明中所述的化学基团举例讲有：氨基酸，带有核苷的化学基团聚合物单体等。

根据本发明的方法，其特征在于：(a)中微反应池母板是用光刻、腐蚀等方法在硅片等基片上加工成具有所设计的凹凸图案的模板，然后将液状聚合物原料引入到该模板上，等聚合固化后，将固化的聚合物从模板上揭下而制备的，或(a)中微反应池母板制备是用光刻腐蚀等方法直接在硅片等基片上加工成具有所设计的微结构而制备得到的，或(a)中微反应池母板是利用激光束，粒子束，或微刀具，按照所设计的图案，直接在基片上进行加工，制备得到的。

根据本发明方法，其中微反应池母板(a)中还可以包括微阀、微泵，流入/流出微型流体通道等微型机电结构，通过电、磁、光、声、热等外界能量，可以控制微型泵、微型阀门的状态，从而可以控制液体在微型反应池中的流动。

根据本发明方法，其中用于制备(a)中微反应池母板的材料可以是单一材料，如硅、玻璃、橡胶等聚合物材料，也可以是在表面上再覆盖一层与所要制备固体微芯片基片表面接触性好，有一定弹性，不容易在接触基片界面上引起反应溶液泄漏的固体材料。

根据本发明方法，其中在(b)中，如反应母板上反应池是通透的，则母板定量压置在基片上后，需在反应母板上加上带有液体进出口的盖板，构成封闭的微流体系统。

根据本发明方法，其中在步骤(c)中，还可往(b)中获得的微反应池母板与固体基片表面形成的微流体系统中引入用于促进步骤(c)中微流体溶液中化合物连接到基片上的催化剂或生物酶。

根据本发明方法，其中在步骤(d)中，同一个基片上多次更换不同的微反应池母板，通过一个精确的机械压置装置，将一组不同的母板精确定位在同一个基片上，使微反应池母板的微反应池与基片表面不同的位置相吻合。在不同微反应池母板多次压置过程中，微反应池阵列的位置与芯片基底表面，可以是重叠的，也可以是不重叠的。

根据本发明方法，(d)中的微反应池母板中的反应池内可以包括电化学电极，温度控制等微小部件，通过控制反应条件，(如电、热、光、磁、机械等能量)，达到控制反应池中微量溶液与固体基片表面的化学反应。

根据本发明方法，其中步骤(b)-(d)是在真空或对步骤(b)和(d)无不良作用的气体中进行的，如其中所述气体可选用氮气、氩气。

根据本发明，更具体讲，微反应池母板的制备方法是用如光刻腐蚀方法，在如硅片基底上加工成具有所设计的凹凸图案的模板，然后将液状聚合物倾注在该模板上，待该聚合物固化后，将固化的聚合物从模板上揭下，该固化的聚合物表面就复制了原先模板上的凸凹图案，即制成本发明所述的微反应池母板。

根据本发明，本发明微反应池母板的另一种制备的方法是用如光刻腐蚀方法在如硅片基底上直接加工成具有所设计的微结构，成为发明所述的微反应池母板。

根据本发明，微反应池母板的第三种制备方法是利用激光束、粒子束(包括电子束或离子束)，或微刀具，在计算机控制下，按照设计的图案，直接在硅、玻璃、高分子材料等表面进行加工，制成本发明所述的微反应池母板。

根据本发明，微反应池母板，可以包括微液体流动所必需的沟槽和反应池。

根据本发明，在微反应母板引入反应物溶液的方法可以是通过加上一个密封罩，与固体基片一起构成一封闭的流体系统。反应溶液的注入通过注入口注入。也可以直接通过喷射(喷雾)的方法，将反应物直接透过微反应池母板喷在固体基片表面，进行化学反应。通过更换反应池分布不同的母板实现不同化合物微阵列的芯片的制备。

根据本发明，微反应池母板也可以包括阀和泵微反应池母板，通过控制这些微型阀和泵来控制微沟槽和微反应池中液体的流动，从而实现与芯片基片表面的位置可控原位合成。

根据本发明，在微反应池母板中可以制备一组微电板阵列，通过在微电极阵列上加上特定的电位分布，通过流体的电毛细现象和电动现象，控制溶液在微反应池母板中的运动，从而控制各微反应池中的化学反应。

根据本发明，在同一个基片上多次定位的化学反应位置，可以是重叠的，即在同一位置上进行多步化学反应，同时还可控制多步化学反应的顺序，避免产生相互或交叉化学反应；也可以不重叠，进行定点化学反应。在每次压置定位化学反应后，可对基片进行相应的清洗和化学处理，使之满足后续定位化学反应的要求。

根据本发明，在微反应池的定位化学反应过程中，可以通过基片或微反应池母板引入(超)声场，光能，热能，电场，磁场，光致声表面波，表面激元(共振)等物理作用能，控制或加速与微反应池对应的固体表面位置上的化学反应，也可以在微反应池母板与固体芯片基片表面构成的微流体系统中注入的化学反应物溶液中加入催化剂或生物酶，通过化学的方法加速微反应池对应的基片位置上的化学反应。整个微阵列芯片的制备过程须在真空或对化学反应惰性的气体如氮气、氩气等环境中进行。

制备化合物微阵列芯片需用的基片可以是硅，玻璃，陶瓷，金属，聚合物等无机或有机固体材料，以及在这些材料表面上修饰或组装的分子膜，其表面可以是致密的，也可以是多孔的。进一步讲，该基片可预先通过制备出微小的凹或凸的阵列(或表面)，从而在凹或凸表面上进行化合物微阵列制备。

根据本发明，本发明还涉及由本发明方法制备的化合物微阵列芯片，其中按本发明方法制备的化合物微阵列芯片具有高的空间分辨率，如用本发明方法制备DNA芯片的空间分辨率为30×30μm²，阵列的集成度高，如用本发明方法制备的DNA芯片的阵列数目可达6.5536×10⁴个(平方厘米)，正确率高，每步合成正确率在99.8％以上，20-mer寡核苷酸的总正确率在95％以上。随着微反应池母板以及相应的压置机械装置精度的提高，上述指标还可以大幅度提高。

附图说明：

图1是本发明中微反应池母板示意图。

图2是本发明提出的一种微反应池母板Fig2(a)它包括一种具有特定分布的通孔微反应池，它的底面与固体基片紧密接触，另一面与带有流入和流出口的密封罩Fig2(b)相连接，构成微流体系统。

图3是本发明中由微反应池母板4与固体基片7构成的微流体系统示意图。在与微反应池接触的固体基底表面可共价耦联分子A。

图4是本发明利用微流动系统母板与固体基片构成的微流量系统，通过更换不同微反应池分布的微反应池母板，将分别含有A、B、C、D四种化学反应物的溶液引入微流体系统中在基片表面上多次分步定位的化学反应制备得到的化合物微阵列示意图。

图5是制备二核苷酸全阵列的1号微反应池母板。

图6是制备二核苷酸全阵列的2号微反应池母板。

图7是制备二核苷酸全阵列的3号微反应池母板。

图8是制备二核苷酸全阵列的4号微反应池母板。

图9是制备二核苷酸全阵列的5号微反应池母板。

图10是制备二核苷酸全阵列的6号微反应池母板。

图11是制备二核苷酸全阵列的7号微反应池母板。

图12是制备二核苷酸全阵列的7号微反应池母板。

图13是基片上二核苷酸全阵列的示意图。

下面的实施则是对本发明的进一步说明，但其不意味着对本发明范围的任何限制。

实施例1，高密度DNA微阵列芯片的制备。

A.微反应池母板的制备。在干净的硅片上利用匀胶机涂布一层约20μm厚的光刻，胶置于所设计的光刻掩模板下，进行曝光和深度刻蚀。从而形成由一组通透微反应池组成的微反应池母板。微反应池的大小为30μm×30μm×300μm。在硅片的底部凸起表面上覆盖一层5μm厚的硅橡胶(PDMS)原料。此时微反应池母板即制成。

B.基片上制备寡核苷酸探针阵列。将玻片清洗、干燥后，分别放入APTES(氨基丙基三乙氧基硅烷)的苯溶液中反应2小时，在苯中漂洗后再放入琥珀酸的苯溶液中反应1小时，从而在玻璃片表面形成羟基。整个基因芯片的制备过程均在氩气的保护之下进行。

把微反应池母板通过高精度对准装置压置固定于基片表面，然后将另一带有液体密封圈的外罩板压置在微反应池母板上，构成封闭的微流体系统。将其5’-OH已用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护的核苷酸例如dA-N-B₂和四唑(催化剂)的无水乙晴溶液注入封闭罩入口，并从封闭罩内腔流入母板上的微反应池。  通过四唑的作用，脱氧三磷酸腺苷的3’-OH共价偶联在基片上。在基片上引入压电超声振动源，通过超声波作用，加速该化学反应的速度。当核苷酸与固体基片上的活性基因的反应后，被共价连接在基片表面，乙腈溶液通过在母板与基片间的微液体沟道被排出微流体系统。接着用苯硫酚(或三氯乙酸)的乙腈溶液脱去基片上核苷酸5’-OH上的保护剂DMT，将5’-OH暴露。收集脱去的DMT液，调节至一定的体积，以DMT-Cl单体为标准液于495nm处检测DMT和光吸收值(OD值)，根据相邻二次OD值的比值，可以获得该层的合成产率。

将第一块母板取出，通过高精度对准装置，按照一定的顺序，将第二块母板压置固定于基片表面，重复上述过程，将不同的单核苷酸(如dC-N-B₂，dG-N-iBu，T)。在基片不同位置上重复上述过程，形成单核苷酸阵列。

重复上述压印过程，可键合上第二、三、……层核苷酸分子。合成至二十层(即20个碱基长度的寡核苷酸)后，用30％氨水处理基片，以去除碱基及磷酸上的保护基团。将芯片用水冲净，干燥封装保存。至此，基因芯片制备完毕。该芯片每个基因探针单元的尺寸为30×30μm²，在1cm²表面共有6.5536×10⁴个不同的基因探针；根据DMT的OD测量方法，该芯片每层的合成效率在99.8％以上，合成探针的正确率为95％以上；每一层的制备时间约为20分钟，完成整个芯片的合成时间约为6小时左右。

实施例2，高密度PNA微阵列芯片的制备。

肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)是一种带有碱基的寡聚N-2氨基乙基甘氨酸(N-(2-aminoethyl glycine)，是具有核苷酸性质的多肽类似物。PNA可以与序列互补的DNA、RNA以及PNA杂交，并且其杂交具有高的热稳定性和对错配的高灵敏性。在一定的条件下，可以识别单个碱基的错配。因此，利用PNA序列制备高密度基因阵列芯片，可以大大提高基因芯片的杂交准确性和灵敏度，具有十分重要的应用前景。

高密度PNA微阵列芯片的制备过程为：

A.微反应池母板的制备(同实施例1中A)

B.制备四种分别含有胸腺嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤和鸟嘌呤四种碱基可用于PNA序列合成的单体，即N-2菽丁氧羰基氨基乙基-N-胸腺嘧啶-1-乙酰甘氨酸(Gly-T)，N-2菽丁氧羰基乙基-N-胞嘧啶-1-乙酰甘氨酸(Gly-C)，N-2菽丁氧羰基乙基-N-腺嘌呤-1-乙酰甘氨酸(Gly-A)和N-2菽丁氧羰基乙基-N-鸟嘌呤-1-乙酰甘氨酸(Gly-G)。

C.基片上制备PNA探针阵列。将玻片清洗，干燥后，分别放入APTES苯溶液中反应2小时，从而在玻璃片表面形成氨基。整个基因芯片的制备过程均在氮气保护下进行的。按照设定的程序，将第一块微反应池母板用精密对准的机械装置紧紧压置基片表面上，再将带有液体密封圈的外罩板压置在微反应池母板上，构成封闭的微流体系统。将含有碱基的PNA合成单体，例如Gly-A，以及五氟苯酯的溶液，通过五氟苯酯激活基片上的化学基团，使Gly-A的C端化学键合在基片上。在基片上引入压电超声振动源，通过超声波作用，加速该化学反应的速度。再更换不同的微反应池母板，分别注入含不同碱基的PNA单体如Gly-T，Gly-G，Gly-C和五氟苯酯混合溶液，重复上述过程，形成单层单碱基PNA阵列，当第一层合成完毕后，用水合茚三酮法测定第一层的耦合率。重复上述压印过程，可键合上第二、三……层PNA单体分子。合成至二十层(即二十个碱基长度的寡聚准肽链)后，用30％NaOH水溶液处理基片，以去除碱基及磷酸上的保护基团。将芯片用水冲净，干燥封装保存。至此，PNA基因芯片制备完毕。

该芯片每个基因探针单元大小为30×30μm²，在1cm²表面具有6.5536×10⁴个不同基因探针，根据水合茚三酮法测量，该芯片每层的合成效率在99.9％以上，合成探针的正确率为98％以上。每一层的制备时间约为1小时，完成整个芯片合成时间约为24小时左右。

Claims (14)

1.一种制备化合物微阵列芯片的方法，其特征在于(a)根据所需的化合物微阵列芯片设计和制造有特定微化学反应池分布母板，(b)将(a)中制备含有若干微化学反应池的母板压置在一个基片上，形成定点微化学反应系统，(c)在(b)中形成的定点微化学反应系统中引入含有化合物单体的溶液，在与微反应池接触的基片表面上产生化学反应，(d)通过更换母板，或通过控制母板微化学反应池中液体的流动，实现基片表面化学反应的定点控制，在基片上形成所需的含有不同化合物微单元的微阵列芯片。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：(a)中微反应池母板是用光刻或腐蚀方法在基片上加工成具有所设计的凹凸图案的模板，然后将液状聚合物原料倾注在该模板上，待聚合固化后，将固化的聚合物从模板上揭下而制备的。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：(a)中微反应池母板制备是用光刻或腐蚀方法在基片上直接加工成具有所设计的凹凸或通透的模板。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：(a)中微反应池母板利用激光束，粒子束，或微刀具，按照所设计的图案，直接在材料表面进行加工，制备得到的。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：(a)中微反应池母板中含有或不含有微型阀或电极的微机械和电动机构。

6.根据权利要求1的方法，其中在(b)中，微反应池母板上反应池是通透的，微反应池母板压置在基片上后，在微反应池母板上加上带有液体进出口的盖板。

7.根据权利要求1的方法，其中在(c)中，往(a)中制备的微反应池母板中加入用于促进(c)中化合物单体连接到基片上的催化剂或生物酶。

8.根据权利要求1的方法，其特征在于：在(d)中，同一个基片上多次压置微化学反应池的所在的化学反应位置，可以是重叠的，也可以彼此不重叠。

9.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其中在(c)中，通过往基片或微反应池母板上引入声、光、热、电或磁的能量，控制反应池位置上的化学反应。

10.根据权利要求1-4任一所述的方法，其中(b)-(d)是在真空或对步骤(b)和(c)和(d)无不良作用的气体中进行的。

11.权利要求1的方法，其中所述基片是选自硅，玻璃，陶瓷，金属，聚合物的无机或有机固体材料，其表面上修饰或组装的分子膜表面是致密或多孔的或在上述材料上预先制备出微小的凹或凸表面的基片。

12.根据权利要求1-4任一的方法得到的化合物微阵列芯片。

13.权利要求12的化合物微阵列芯片是DNA微阵列芯片。

14.权利要求12的化合物微阵列芯片是PNA微阵列芯片。

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