CN2386439Y

CN2386439Y - 气动式pcr微阵列探针循环检测型生物芯片

Info

Publication number: CN2386439Y
Application number: CN 99229351
Authority: CN
Inventors: 何农跃; 陆祖宏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 1999-09-03
Publication date: 2000-07-05
Anticipated expiration: 2009-09-03

Abstract

本实用新型气动式PCR微阵列探针循环检测型生物芯片是涉及一种PCR与探针相结合的检测型生物芯片的新方案,是一种采用液体往复式流动方式多温区域聚合酶链反应基因选择性扩增,结合固相微探针阵列技术进行基因诊断的新型生物芯片。结构具有基片,其循环是基片上设有微反应器微沟槽,微沟槽两端以微孔采用并联方式分别连接到两公用沟槽,构成一个密闭系统,基片上设有变性、退火、延伸、杂交反应温区,每个微沟槽在杂交反应温区均设有微阵列探针,在基片反面设置有与微反应器微沟槽相互垂直沟槽,沟槽内设有加热片。

Description

气动式PCR微阵列探针循环检测型生物芯片

本实用新型气动式PCR微阵列探针循环检测型生物芯片是涉及一种PCR与探针相结合的检测型生物芯片的新方案，尤其是采用液体往复式流动方式多温度区域聚合酶链反应基因选择性扩增，结合固相微探针阵列技术进行基因诊断的新型生物芯片。

生物芯片主要是指通过平面微细加工技术及超分子自组装技术，在固体芯片表面构建的微分析单元和系统。生物芯片可把许多不同功能器件集成在一起，例如，生物样品的预处理，遗传物质的提取，特定基因片段的扩增，生物探针阵列以及毛细管电泳形成整体的微流体系统，以实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的筛选或检测。基因芯片是最重要的一类生物芯片，它集成了大量的密集排列的基因探针，能够在短时间内分析大量的基因，使人们可迅速地读取和分析生命的程序。

生物芯片在生物检测、医学检验、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的意义。例如在生物学中，随着分子生物学的不断发展，特别是举世瞩目的人类基因组计划实施以来，有关核酸、蛋白质序列和结构的数据呈指数增长。而下世纪最富挑战性的工作就是人类基因组计划完成后，即在后基因组时代，我们如何运用大量的生物分子信息服务于人类社会，并使医疗科学产生根本革命。在医学中，“系统、器官、组织、细胞层次上的第二阶段医学”正在向“基因水平上的，DNA→RNA→蛋白质→蛋白质与核酸相互作用，以及它们与环境相互作用水平上的第三阶段医学”转化。这种在分子层次上进行的基因诊断与基因治疗，将根本地认识疾病产生的根源，并将有希望根本认识和治疗包括癌症在内的重大疾病。这些生物学、医学的根本变革，一个根本的前提是基因序列的测定和分析。能否有效快速地进行基因测序与分析，将影响到人类基因组计划的实施，从而影响生物学、医学的进一步发展。传统基因测序所采用的方法包括化学反应、凝胶电泳法等一系列繁杂的步骤，这些方法花费时间较长，且操作繁复，尤其在大规模测序方面费时、并且不适宜便携化快速测序。在对传统基因测序方法进行改进的过程中，以基因芯片为代表的生物芯片技术应运而生。生物芯片技术是将生命科学研究中所涉及的许多不连续的分析过程，如样品制备，化学反应和分析检测等通过采用微电子，微机械等工艺集成到芯片中，使之连续化，集成化，微型化和自动化。这一技术的成熟和应用将在下世纪的疾病诊断和治疗、新药开发、司法鉴定、食品和环境等生命科学相关领域带来一场革命，为生物信息的获取及分析提供强有力的手段。

PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)作为一种选择性体外基因扩增的方法，由于在经25～35轮循环后就可使DNA分子增加到10⁶，多年来在科研和医学检验中得到广泛应用。但由于PCR存在假阳性等缺陷，自98年6月起已被国家卫生部禁止用于临床诊断。究其原因，其一是PCR过程中诸多实验条件(引物的设计、样本的制备、材料配比、反应时间、温度、循环周期等)造成的不稳定因素导致产生PCR的错误扩增。其二是，PCR过程的后续电泳检测方法仅可判断是不是得到特定长度的片段，而

无法确定其具体序列。其三，PCR反应与检测是两个分立的过程，操作繁琐且增加了污染的机会。因此，对于检测条件和设备有限的中、小医院，PCR的检测的准确性受到了很大的影响。此外，当前的PCR扩增过程对于操作人员的技术水平和素质有很高的要求。

生物(基因)芯片近年来一直是国际上的一个研究热点，并正以惊人的速度向前发展。美国等国际上已有多家公司进入生物芯片领域，研究出把PCR与DNA阵列相集成的生物芯片。这些系统通常在芯片上制备一个PCR微反应池，通过控制微反应的温度循环，进行基因的扩增。接着将扩增后的基因引入杂交池中，与固相微阵列探针杂交，进行检测。美国Affymetrix公司则把PCR微反应池进一步制备成微流体管道。但目前用于科学研究和医学检验的芯片大多是一个或若干个独立器件。尽管已有将PCR技术与芯片检测合为一体的报导，但其特点是整个PCR过程在一个微反应池中进行，因而，需要对器件的同一部位反复地升温降温，这将无法对PCR结果进行动态跟踪和实时定量分析。而且由于升温降温需要一定的时间，延长了工作时间。

本发明的目的是针对目前PCR技术与芯片检测存在不足之处提供一种PCR微阵列探针循环检测型生物芯片，这是一种控制PCR反应溶液在不同温度区域进行往复式流动扩增的新方案，并将PCR技术与基因微阵列探针技术合为一体，构成一个集成型生物芯片，既可简化操作步骤，缩短PCR时间，提高效率，又可将反应体系与外界进行严密有效隔离，并使PCR扩增一探针杂交检测过程一体化，将PCR循环中的变性、退火、延伸过程与微阵列探针芯片构成一个整体，可以将变性、退火、延伸和杂交四个步骤的温度分别控制在恒定温度，从而可避免反复的升温降温过程及由于温控的误差带来的影响。

气动式PCR微阵列探针循环检测型生物芯片是采取以下方案实现的：气动式PCR微阵列探针循环检测生物芯片，具有基片，基片上设置有微反应器微沟槽，这些微沟槽两端微孔采用并联方式分别连接到两公用沟槽，基片A分为变性、退火、延伸，杂交反应4个温度区，每个微沟槽在杂交反应区都有微阵列探针，在基片A的反面设有与微反器微沟槽相垂直的四个沟槽，沟槽内设有加热片。基片外部覆盖有透明材料层。

本发明提出了一种控制PCR反应溶液在不同温度区域进行往复式流动扩增的新方案，并将PCR技术与基因微阵列探针技术合为一体，构成一个集成型生物芯片，其中微阵列可以是高密度或低密度的、点样制备或原位合成的、单功能或多功能的。既可简化操作步骤，缩短PCR时间，提高效率，又可将反应体系与外界进行严密有效的隔离，并使PCR扩增-探针杂交检测过程芯片一体化，不需进行电泳分析，而是直接检测杂交信号并给出的检测结果。由于探针杂交具有特异性，因而可以排除假阳性缺陷。更重要的是，将PCR循环中的变性、退火、延伸过程与微阵列探针芯片构成一个整体，可以将变性、退火、延伸和杂交四个步骤的温度分别控制在恒定温度，从而可避免反复的升温降温过程及由于温控的误差带来的影响。由于采用了往复式流动PCR扩增技术与杂交检测一体化技术，每一组芯片单元的尺寸大大减小，从而可把几十组或上百组芯片单元集成在一个芯片板上，同时可进行多种生物样品的检测。由于本发明将PCR过程与微阵列探针芯片构成一个往复式循环体系，不仅可在多次PCR循环后检测结果，更可十分方便地跟踪检测PCR每一个循环的效率，从而获得线性的PCR结果，并进行动态定量分析，真正可达到快速、准确、自动化、无污染。

以下将结合附图对本实用新型作进一步的说明。

气动式PCR微阵列探针循环检测型生物芯片是采取以下方案实现的：气动式PCR微阵列探针循环检测生物芯片具有基片A，基片上设置有微反应器微沟槽，这些微沟槽两端微孔采用并联方式分别连接到两公用沟槽，基片A分为变性、退火、延伸，杂交反应4个温度区，每个微沟槽在杂交反应区都有微阵列探针，在基片A的反面设有与微反器微沟槽相垂直的四个沟槽，沟槽内设有加热片。基片外部覆盖有透明材料层。

图1是气动式PCR微阵列探针检测型芯片主视图。

图2是气动式PCR微阵列探针检测型芯片左视图。

参照附图1、2，气动式PCR微阵列探针检测型芯片，具有基片A，在基片A上开有微沟槽1，2，3，4……n，这些微沟槽两端以微孔采用并联方式分别连接到两公用沟槽G₁、G₂，基片A分为4个温度区，变性温区T1、退火温区T2、延伸温区T3、杂交反应温区T4。分别对应于PCR过程的变性、退火、延伸及杂交反应的温度。每个微沟槽在T4区内都有微阵列探针P，在基片A的反面开有与上述微沟槽相互垂直的四个沟槽B、C、D、E，沟槽内设有加热片，分别加热各温区。PCR反应溶液事先注入微沟槽中，然后以一透明薄膜覆盖密封，有微沟槽的基片A及基片A上覆盖的透明材料构成芯片。微沟槽连接有气压控制阀F₁、F₂。微阵列探针是采用原位合成或通过点样方法制备，低密度或高密度，单功能或多功能的阵列式探针。在同一基片上可以集成多个用于测量不同样品PCR阵列型芯片。使用时，试样a、b、c、d……n由注射器或其它进样器穿透薄膜注入PCR反应溶液中，然后以玻片压紧固定。轻摇混匀后，即可开始PCR反应，由通过控制阀F₁、F₂控制气体F₁、F₂的压力差驱动PCR溶液1，2……n在微沟槽内往复运动。通过气动控制反应体系溶液首先在T1区进行变性，然后迅速移到T2区进行退火，再移到T3区进行延伸；延伸后迅速回到T1区开始第二个循环，或先移到T4区进行杂交反应后再移到T1开始第二个循环。如此继续循环过程，直到获得所有结果。

实施实例1(线性定量分析)：参见附图1、2，多功能的多种肝炎病毒的PCR微阵列探针循环检测型生物芯片的使用。将一组预处理所得病人血清透过密封膜分别注入附图2、3中PCR微阵列探针循环检测型生物芯片中的微沟槽1，2，3，……n中的PCR溶液中，然后用玻璃板压紧，并用夹子将玻璃板与整个芯片固定在一起，轻摇混匀。通过气体控制把样品移到T1区(94℃)变性30秒，然后迅速移到T2(45℃)区退火30秒，然后移到T3区(72℃)延伸15秒，再移到T4区与微阵列探针杂交。检测PCR循环效率。随后移到T1区开始第二个PCR循环，如此进行循环30次。可得到每一个PCR循环的效率，并进行定量分析监控。检测杂交信号并给出结果。

实施实例2(不作线性定量分析)。参见附图1，探针为高密度的乙型肝炎病毒的PCR微阵列探针循环检测型生物芯片，检测单点突变的芯片的使用。取病人血样(经预处理后)，1，2，……n透过薄膜注入图2中微沟槽1，2……n中的两个小铁块之间的PCR溶液中，用玻璃板压紧，并用夹子将玻璃板与整个芯片固定在一起，再将芯片嵌入到自行设计的PCR仪中的4个加热元件上。然后通过控制气压将样品移到T1区(94℃)变性30秒，再移到T2区(45℃)退火30秒，再移到T3区(72℃)延伸15秒，然后迅速移到T1区，开始第二个PCR循环，30次PCR循环后，移到T4区与微阵列探针杂交。检测杂交信号并给出结果。

Claims

1.一种气动式PCR微阵列探针循环检测型生物芯片，具有基片，其特征在于基片上设置有微反应器微沟槽、沟槽两端以微孔采用并联方式分别连接到两公用沟槽，基片上设有变性、退火、延伸、杂交反应温区，每个微沟槽在杂交反应温区均设有微阵列探针，在基片反面设置有与微反应器微沟槽相垂直沟槽。

2.根据权利要求1所述的气动式PCR微阵列探针循环检测型生物芯片，其特征是微沟槽连接有气压控制阀。

3.根据权利要求1所述的气动式PCR微阵列探针循环检测型生物芯片，其特征是基片反面与微反应器微沟槽相互垂直沟槽内设有加热片。

4.根据权利要求1所述的气动式PCR微阵列探针循环检测型生物芯片，其特征是微阵列探针是采用原位合成或通过点样方法制备、低密度或高密度、单功能或多功能的阵列式探针。