CN101165486A - 微流控阵列蛋白质芯片及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微流控阵列蛋白质芯片及其使用方法。该蛋白质芯片包括微流控通道片层和芯片片基，两者中至少有一种由软基质制成，其特征在于该微流控通道片层包括两层，分别具有一组不同方向的第一微流控通道或第二微流控通道，其中第一微流控通道用于捕获探针的组装，另一与其交叉方向的第二微流控通道用于加入待测蛋白质样品和检测探针，该具有第一微流控通道的片层和第二微流控通道的片层按顺序与芯片片基相可逆性封合，在芯片上构建成二维的微点阵图形。本发明蛋白质芯片具有二维的微点阵图形，制作成本低，易于操作，可实现不同种类、不同浓度的靶蛋白在微流控蛋白质芯片上的快速分析，特别是定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质芯片领域，特别涉及一种具有二维结构的微流控阵列蛋白质芯片及其使用方法。
背景技术
随着蛋白质组学和分子诊断学的发展，作为一种迫切需要的微型化、集成化、高通量、快速高效的蛋白质分析技术，蛋白质芯片自诞生之始便引起了广泛而深切的关注。在蛋白质组学研究中，它可以取代二维电泳和双酵母杂交等传统研究方法，从而达到减少时间、降低费用和提高精确度等目的，并获得丰富的实验数据，使组学研究如虎添翼，实现快速推进。在分子诊断学方面，它只需很少量的样品(微升甚至纳升级)即可实现多个疾病标志物的同步分析，对于疾病可以起到早期诊断、分析病情、指导治疗、检测复发或转移及判断预后等多重作用，其将必然成为现代分子诊断学的重要平台。目前，蛋白质芯片已经取得了长足的研究进展，但一些关键因素仍然制约着蛋白质芯片走向真正的应用阶段，其中包括制作复杂、反应难以实时控制等。
目前，几乎所有微阵列蛋白质芯片都是通过自动点样法制作而成的，即通过自动点样仪将捕获探针分布在芯片基片上，并构成微阵列图形。其缺点是非常明显的，首先需要昂贵的自动点样仪器；其次，捕获探针在基片上的组装是在静态中实现的，连接反应效率很低，往往需要数小时乃至数十小时；再次，分布在芯片表面的含有捕获探针的试剂溶液为纳升级液体小滴，在较长的连接时间中必须进行湿度保护，以免转变为干态而无法实现捕获探针的组装。所以，如何应用简便的方法实现捕获探针在芯片表面的高效自组装一直是技术上的难点。蛋白质芯片分析系统的另一个重要环节是芯片反应的实时控制问题，因为很多复杂的生物样品，特别是蛋白质组学研究中获得的样品，往往含有成百上千中待检测的靶分子，而这些靶分子的数量不一，差距非常大，其浓度甚至会相差多个数量级。这将为常规蛋白质芯片的检测带来一个只能定性而不能定量的难题，因为一个确定的蛋白质芯片系统对靶蛋白的检测范围是固定而有限的，所以必须对原始样品通过反应控制实现有效的捕获并进行后续分析。
微流控技术是20世纪90年代发展起来的微全分析技术，已被应用于现代分析科学的多个领域，如各种基因分析用生物芯片制作(US2002/0123059、US2002/0127740、US2004/0248318、US2005/0196779、US2005/0221281)、单元免疫分析(CN1616967)和早期诊断系统(CN1514012)等，但在蛋白质芯片的制作及反应控制方面尚处于起步阶段。公开号为CN1635146的专利文献公开了一种一维的微流控阵列蛋白质芯片，其将微流控通道与芯片基片进行不可逆粘合，具有样品用量极微、不易污染、高通量、定量检测等优点；然而该蛋白质芯片的微通道需特殊结构(即阳模也需特殊制备)，捕获探针则需特殊微粒修饰，而且仍需点样组装；因此操作不够简便，自动化程度不高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、操作简便、可定量分析的二维微流控阵列蛋白质芯片及其使用方法。
为解决上述技术问题，本发明在芯片上设置两组方向可交叉的微流控通道(简称微通道)分别用于捕获探针的动态自组装，以及加入蛋白质样品和检测探针进行分析样品的实时反应控制。从而当蛋白质芯片完成分析过程之后，由捕获探针所构成的条带与样品条带呈交叉状，由此由各交叉点上样品与捕获探针和检测探针的反应所给出的信号将呈二维微方阵排列。为实现此目的，本发明的关键在于将含有上述两组微通道的片层按顺序先后与芯片基片进行可逆性封合，按常规，先将用于捕获探针组装的微通道片层与芯片基片进行可逆性封合，加入捕获探针待其在芯片上组装完毕后，去除该微通道片层，以便该用于加入蛋白质样品和检测探针的另一方向微通道片层与组装有捕获探针的芯片基片进行可逆性封合，通过后一组微通道进行分析样品的实时反应控制。
因此，本发明的微流控阵列蛋白质芯片，其包括微流控通道片层和芯片片基，两者中至少有一种由软基质制成，其特征在于该微流控通道片层包括两层，分别具有一组不同方向的第一微流控通道或第二微流控通道，其中第一微流控通道用于捕获探针的组装，另一与其交叉方向的第二微流控通道用于加入待测蛋白质样品和检测探针，该具有第一微流控通道的片层和第二微流控通道的片层按顺序与芯片片基相可逆性封合，在芯片上构建成二维的微点阵图形。
本发明微流控通道片层和芯片片基两者中至少有一种由软基质制成是为了避免可逆性封合时的渗漏液问题。其中，所说的“软基质”可为现有微流控通道片层或芯片片基常用的聚二甲基硅氧烷(PDMS)或类似柔软度的高分子聚合物材料。本发明按常规选用软基质聚二甲基硅氧烷为基材制成微流控通道，而芯片基片可为各种修饰或未修饰有利于结合生物分子的活性基团、诸如氨基、羧基、巯基等的玻片，这些玻片可为硅烷化、镀金玻片等商业化产品。
为更好地防止可逆性封合时的漏液，该微流控通道的厚度通常不低于3mm。更佳地，本发明的蛋白质芯片还具有一个能夹合微流控通道与芯片片基，使其相可逆性封合的夹合装置。本发明为操作简便，该夹合装置选用由两片有机玻璃组成的夹片，其中一片包含微流控管路出入通道。
更佳地，所述微流控通道的厚度一般不小于7mm，在此范围内，无需上述夹合装置一般也不发生漏液；而如厚度太厚，则操作笨重，在打用于在微通道中插入微流控管路，如进液和出液细管的进、出样孔时有一定困难，故通常不超过30mm。
为保证微流控通道的稳定及不变形，该单个微流控通道的宽度最好在5～2000μm范围。因为太窄，小于5μm，则可能出现纳米效应；反之，太宽则容易变形，所获取的微点及点阵呈不规则形状，导致检测结果出现偏差。本发明优选50～500μm，更优选50～100μm。
为构建规整的二维微点阵图形，本发明上述交叉方向优选垂直方向。
相应地，本发明上述微流控阵列蛋白质芯片的使用方法，其可以包括下列步骤：
①将具有一组第一微流控通道的片层与芯片基片进行可逆性封合，将不同的捕获探针通过不同的微流控通道加入芯片相应区域，在流动状态下实现其在芯片固液界面上的快速自组装，然后去除第一微流控通道的片层，用封闭液对芯片进行封闭，干燥；
②将具有一组与该第一微流控通道交叉方向的第二微流控通道的片层与步骤①得到的芯片基片进行可逆性封合，通过不同的微流控通道加入不同的样品以及不同或相同的检测探针，待芯片反应完毕后任选地去除第二微流控通道的片层；
③对步骤②反应后的芯片上的检测探针所给出的信号进行观察分析。
本发明使用方法的步骤①包括将聚二甲基硅氧烷(PDMS)等软基质材料制备分别含有两组微流控通道阵列的片层，一组微流控通道为横向，另一组为纵向，单个通道宽度为5～2000微米，采用将一方向的微通道片层与芯片基片进行可逆性封合；在正压或负压等动力驱使下(如通过微量注射泵，流速可控制在0.5～1000微升/小时)，使不同的捕获探针通过不同的微通道进入芯片特定区域，并在流动状态下实现其在芯片固液界面上的快速自组装；其中捕获探针为各种可与蛋白质分子特异性结合的生物分子，如免疫球蛋白、核酸适体(aptamer)，融合蛋白、蛋白质复合体等；除去该方向的微流控通道片层，对芯片进行封闭，干燥等处理后，用于后续蛋白质芯片的分析。
步骤②则包括将另一交叉方向，如垂直方向的微通道片层与上述组装有捕获探针的芯片进行可逆性封合；使不同的样品和相同(或不同)的检测探针进入不同的微流控通道，并在动力驱使下(如通过微量注射泵，流速可控制在0.5～1000微升/小时)进入芯片反应区域；每种样品中所包含的靶蛋白分子将会在流经相对应的捕获探针所在区域时被捕获，并在与检测探针结合后给出与靶蛋白浓度相应的荧光信号强度；其中检测探针为各种发色或发光物质标记的可与靶蛋白结合的配体分子，如免疫球蛋白、核酸适体(aptamer)，融合蛋白、蛋白质复合体等。而第二微流控通道片层可根据检测方法任选地除去，如采用金银显影法定性观测分析结果时无需除去微流控片层。
在步骤③中，当蛋白质芯片完成分析过程之后，由捕获探针所构成的条带与样品条带呈垂直交叉状，所以由各交叉点上样品与捕获探针和检测探针的反应所给出的信号将呈微方阵排列，如图1所示。这样，对于各样品所含靶蛋白的浓度可以按照其所在芯片上的定位位置与信号强度进行定量分析，从而可同时获取多组样品中的各种靶蛋白的含量数据。
本发明中将聚二甲基硅氧烷(PDMS)等软基质材料制备含有微流控通道片层的方法可参考现有技术，如[Duffy，DC等，《Analytical Chemistry》第70卷(1998年)第4974页]。
而通过微通道加样(包括捕获探针、待测样品和检测探针等)的方式也可参考现有技术，如上述背景技术内容中提及的专利文献；其中，该加样的压力或其它动力以不造成微通道变形、渗液，而又使液体均匀分布芯片上为宜，其根据微通道的宽度、厚度、加样液体的种类、浓度等而有所变化。如微通道的厚度越厚、加样液体浓度越低，则加样压力可越大，即流速越快；反之，则则加样压力可越小，即流速越慢。
至于捕获探针在芯片上的组装时间、封闭、干燥，以及加入待测样品和检测探针后芯片的反应时间、洗涤、观察分析等步骤均可参考现有技术，如文献[Song，S-P等，《Analytica Chimica Acta》第510卷(2004)第147页]。
显然，本发明的微流控阵列蛋白质芯片应用微流控技术同时实现捕获探针的自组装及样品的后续反应控制，无疑将降低制作成本，并提高芯片的捕获性能和操控能力，从而使生物芯片技术向“芯片实验室(Lab-on-a-chip)”的发展迈进重要一步。本发明的蛋白质芯片具有二维的微点阵图形，易于操作，可实现不同种类、不同浓度的靶蛋白在微流控蛋白质芯片上的快速分析，特别是定量分析。
附图说明
图1为本发明微流控阵列蛋白质芯片组装有两层在芯片中心区域呈垂直交叉状微通道的PDMS基片的示意图。
图2为本发明一实施例的微流控阵列蛋白质芯片的检测结果。
图3为本发明另一实施例的微流控阵列蛋白质芯片的检测结果。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
下列实施例中阳模硅片购自中科院上海微系统研究所，PDMS预塑体及单体均购自美国DOWCORNING公司(PDMS预塑体中单体与固化剂的比例为10/1)，微型塑管为深圳市凯思特精工塑料有限公司产品，微量注射泵(WZS-50F2)为浙江大学医学仪器有限公司产品。
实施例1
1、以分布有光刻蚀图形的硅片为阳模，以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为基材，制作包含20条横向微流控通道(通道宽度100微米，厚度为3mm)的PDMS基片，即微流控通道片层；PDMS基片与模具剥离后，用打孔机(直径1mm)在微通道的末端标识处打孔(直径0.6-0.8mm)作为进、出样孔，这些孔用于在微通道中插入微流控管路，如进液和出液细管。
2、用两片经过常规方法加工(其中任一片含有微流控管路通道，该通道为进液和出液细管穿行所用，位置与图1中PDMS通道片层的进、出样孔相对应。)的有机玻璃作为夹片，将含有横向微通道的PDMS基片与作为芯片基片的硅烷化的玻片(美国CEL公司)进行可逆封合，并将芯片通过用于进、出液的微型塑管与微量注射泵相连。
3、将浓度为10μg/ml的6种鼠源免疫球蛋白组装液(美国FITZGERALD公司产品)用微量注射泵以10微升/小时的速度通过上述微流控通道流过芯片中心区域，30分钟后剥离该层PDMS基片，用封闭液(含有2％牛血清白蛋白和1％Tween20的磷酸盐缓冲液)对芯片进行封闭，在相对湿度40％的环境下干燥24小时，备用。
实施例2
1、以分布有光刻蚀图形的硅片为阳模，以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为基材，制作包含50条纵向微流控通道(通道宽度50微米，厚度为5mm)的PDMS基片；PDMS基片与模具剥离后，用打孔机微通道的末端标识处打孔。
2、按实施例1步骤2中类似的方法用两片经过加工的有机玻璃作为夹片，将含有纵向微通道的PDMS基片与作为芯片基片的镀金玻片(生产厂商，GENEFLUIDICS公司产品)进行可逆封合，并将芯片通过微型塑管与微量注射泵相连。
3、将9种靶蛋白核酸适体组装液1-9号(浓度依次为：1×10-10M、5×10-10M、1×10-9M、5×10-9M、1×10-8M、5×10-8M、1×10-7M、5×10-7M、1×10-6M，核酸适体为上海生工生物工程公司)以10微升/小时的速度通过微流控通道流过芯片中心区域，45分钟后剥离该层PDMS基片，用封闭液对芯片进行封闭，在相对湿度40％的环境下干燥24小时，备用。
实施例3
1、按实施例1步骤1的方法制备20条纵向微流控通道(通道宽度100微米，厚度为7mm)的PDMS基片，将该含有纵向微通道的PDMS基片与实施例1所得免疫球蛋白组装芯片进行可逆封合，并将芯片通过微型塑管与微量注射泵相连。如图1所示，组装在微流控阵列蛋白质芯片上的两层微通道在芯片中心区域呈垂直交叉状。
2、将9组浓度(10nM)相同的包含有羊抗鼠免疫球蛋白(生产厂商，美国FITZGERALD公司产品)的15nm纳米金标记物的样品溶液(羊抗鼠免疫球蛋白在纳米金颗粒表面自组装而成，方法参见Nam，JM等，《Science》第301卷第1884页)以2微升/小时的速度通过微流控通道流过芯片中心区域，15分钟后剥离PDMS基片，用含有2％Tween20的磷酸缓冲液洗涤。
3、将芯片放置在光学显微镜下观察并成像，获得纳米金发色信号标识的微方阵图形，如图2所示。其中横向为6种鼠源免疫球蛋白捕获探针所在条带，纵向为9组羊抗鼠免疫球蛋白的15nm纳米金标记物的样品溶液流经条带，两个方向的条带垂直交叉，构成信号均一的微方阵图形。
实施例4：
1、按实施例2步骤1的方法制备50条横向微流控通道(通道宽度100微米，厚度为5mm)的PDMS基片，用两片按实施例1步骤2中类似的方法经过加工的有机玻璃作为夹片，将横向微通道与实施例2所得靶蛋白核酸适体组装芯片进行可逆封合，并将芯片通过微型塑管与微量注射泵相连。如图1所示，组装在微流控阵列蛋白质芯片上的两层微通道在芯片中心区域呈垂直交叉状。
2、将7组靶蛋白(美国FITZGERALD公司产品)呈浓度梯度(10-12～10-8g/L)的样品溶液1-7号(浓度依次为：1×10-12g/L、5×10-12g/L、1×10-11g/L、5×10-11g/L、1×10-10g/L、5×10-10g/L、1×10-9g/L、1×10-8g/L)以不同速度通过微流控通道流过芯片中心区域。1-7号样品各微通道的流速分别为：1.0微升/小时、1.2微升/小时、1.4微升/小时、1.6微升/小时、1.8微升/小时、2.0微升/小时、2.2微升/小时。
3、15分钟后将包含有靶蛋白对应抗体的荧光素标记物的样品溶液(浓度为50μg/mL，SIGMA公司产品)以2微升/小时的速度通过微流控通道流过芯片中心区域，5分钟后剥离PDMS基片，用含有2％Tween20的磷酸缓冲液液洗涤。
4、将芯片放置在荧光显微镜下观察并成像，获得荧光信号标识的微方阵图形，如图3所示。其中纵向从左至右是为1-9号9靶蛋白核酸适体所在条带(10-10～10-6M)，横向从上至下为7组呈浓度梯度(10-12～10-8g/L)的靶蛋白样品溶液流经条带，两个方向的条带垂直交叉，构成信号不均一的微方阵图形。
Claims (10)
1.一种微流控阵列蛋白质芯片，其包括微流控通道片层和芯片片基，两者中至少有一种由软基质制成，其特征在于该微流控通道片层包括两层，分别具有一组不同方向的第一微流控通道或第二微流控通道，其中第一微流控通道用于捕获探针的组装，另一与其交叉方向的第二微流控通道用于加入待测蛋白质样品和检测探针，该具有第一微流控通道的片层和第二微流控通道的片层按顺序与芯片片基相可逆性封合，在芯片上构建成二维的微点阵图形。
2.如权利要求1所述的微流控阵列蛋白质芯片，其特征在于该微流控通道片层由软基质聚二甲基硅氧烷制成，该微流控通道片层的厚度不低于3mm。
3.如权利要求2所述的微流控阵列蛋白质芯片，其特征在于其还具有一个夹合微流控通道片层与芯片片基，使其相可逆性封合的夹合装置。
4.如权利要求3所述的微流控阵列蛋白质芯片，其特征在于该夹合装置由两片有机玻璃组成，其中一片包含微流控管路出入通道。
5.如权利要求2所述的微流控阵列蛋白质芯片，其特征在于该微流控通道片层的厚度为7～30mm。
6.如权利要求1所述的微流控阵列蛋白质芯片，其特征在于该单个微流控通道的宽度为5～2000μm。
7.如权利要求1～6任一项所述的微流控阵列蛋白质芯片，其特征在于所述的交叉方向为垂直方向。
8.如权利要求1～6任一项所述的微流控阵列蛋白质芯片的使用方法，其包括下列步骤：
①将具有一组第一微流控通道的片层与芯片基片进行可逆性封合，将不同的捕获探针通过不同的微流控通道加入芯片相应区域，在流动状态下实现其在芯片固液界面上的快速自组装，然后去除第一微流控通道的片层，用封闭液对芯片进行封闭，干燥；
②将具有一组与该第一微流控通道交叉方向的第二微流控通道的片层与步骤①得到的芯片基片进行可逆性封合，通过不同的微流控通道加入不同的样品以及不同或相同的检测探针，待芯片反应完毕后任选地去除第二微流控通道的片层；
③对步骤②反应后的芯片上的检测探针所给出的信号进行观察分析。
9.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于通过微量注射泵以0.5～1000微升/小时的流速将所述捕获探针、样品和检测探针通过微流控通道注入芯片。
10.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于所述捕获探针为各种可与待测蛋白质分子特异性结合的生物分子，所述检测探针为各种发色或发光物质标记的可与待测蛋白质结合的配体分子；所述生物分子或配体分子选自免疫球蛋白、核酸适体、融合蛋白和蛋白质复合体。
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