CN110452970B - 一种基因融合的微流控检测设备及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基因融合的检测设备，具体涉及一种基因融合的微流控检测设备及其使用方法。本技术方案利用微流控技术对样本中的融合基因进行检测，该设备具有多重识别目的基因的功能，在实现高通量基因融合检测的同时降低了对复杂算法的需求以及降低了非特异性的探针杂交，检测过程更为简便快捷且具有更高的检测准确率和灵敏度。本设备适用于对融合基因进行检测，特别适合于对融合基因含量较低的样本进行检测。

Description

一种基因融合的微流控检测设备及其使用方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基因融合的检测设备，具体涉及一种基因融合的微流控检测设备及其使用方法。

背景技术

基因融合(gene fusion)是基因结构变异的一种，它是指基因组中一个基因的一个片段和另外一个基因的片段发生了融合。一般是一个原癌基因(癌症相关基因)和一个转录活跃的片段连接激活了原癌基因的表达。例如在非小细胞肺癌中EML4和ALK的融合等。融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连.并置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下。目前应用到基因融合检测的技术主要有：实时聚合酶链反应(RT-PCR)，荧光原位杂交(FISH)，免疫组织化学染色法(IHC)，新一代基因测序(NGS)，或这些方法的组合。RT-PCR存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点；FISH和IHC存在实验过程繁琐、实验结果的判读主观性大且需要有经验专家来判读等缺点；而NGS的数据分析量较大，导致测序费用较大和时间较长，并且NGS对仪器设备的要求也较高。并且上述几种方法均存在检测通量有限的缺点，均不能满足实际应用的需要。

为解决上述问题，科研人员将外显子微阵列芯片技术应用到了对基因融合的检测中(Exon Array Profiling Detects EML4-ALK Fusion in Breast,Colorectal,and Non–Small Cell Lung Cancers,Eva Lin,et al.,Mol Cancer Res September 1 2009(7)1466-1476)。在该技术方案中，外显子微阵列芯片将核酸探针有序地制作在基板表面，然后根据碱基互补配对原理，核酸探针与样品进行杂交反应，从而得到样品的序列和含量信息，具有高通量、并行性、微量化和自动化的特点。虽然外显子微阵列芯片技术克服了传统检测技术的缺点，但是仍然存在如下技术问题：(1)需要针对微阵列芯片设计复杂的算法来纠正分子杂交和自动化检测中的各种问题，对操作者的能力提出了更高的要求，给该技术的推广造成了障碍；(2)利用微阵列芯片进行基因融合检测，会产生大量的数据，对数据进行处理和分析会消耗较多的人力和物力；(3)由于微阵列芯片存在非特异性的探针杂交信号等问题，使得商业化的阵列芯片的检测准确性和灵敏度降低；(4)微阵列芯片需要昂贵的微阵列加工设备，造价昂贵。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因融合的微流控检测设备，该设备具有多重识别目的基因的功能，在实现高通量检测的同时降低了对复杂算法的需求以及降低了非特异性的探针杂交，检测过程更为简便快捷且具有更高的检测准确率和灵敏度。

为达到上述目的，本发明技术方案如下：

一种基因融合的微流控检测设备，融合基因包括相互连接的片段A和片段B，片段A和片段B分别位于融合位置上游和下游，所述片段B为野生型基因的一个DNA片段，野生型基因还包括片段B’，片段B’和片段B相互连接且分别位于断裂位点上游和下游，其特征在于，检测设备包括微流控芯片、捕获链、探针和PCR反应体系；

微流控芯片包括功能化的基板和微通道板，微通道板包括第一表面和与第一表面相对的第二表面，微通道板的第一表面上设置有至少两条不交叉的凹槽，在凹槽的两端设有贯穿第一表面和第二表面的通孔；微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合，微通道板和基板之间形成供流体流通的微通道阵列，微通道阵列由至少两条不交叉微通道组成，微通道板和基板之间可拆卸；

捕获链包括第一捕获链和第二捕获链，第一捕获链与片段A的正义链互补，第二捕获链与片段B’的正义链互补；捕获链由如下方法固定在基板上：将微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合，第一次形成微通道阵列，第一次形成的微通道阵列中的微通道包括Ⅰ类微通道和Ⅱ类微通道两部分；将含第一捕获链的溶液注入Ⅰ类微通道，并将含第二捕获链的溶液注入Ⅱ类微通道，使捕获链固定在基板上，在基板上形成捕获链条带，然后将微通道板从基板上拆卸；

PCR反应体系包括第一PCR反应体系和第二PCR反应体系，第一PCR反应体系用于获得第一PCR产物，第二PCR反应体系用于获得第二PCR产物；

第一PCR反应体系包括第一引物对，第二PCR反应体系包括第二引物对；第一引物对用于扩增融合基因片段，融合基因片段由相互连接的片段A和片段B组成；第二引物用于扩增野生型基因片段，野生型基因片段由相互连接的片段B和片段B’组成；

在基板上形成捕获链条带之后，第一PCR产物和第二PCR产物均用于与捕获链接触；第一PCR产物或第二PCR产物由如下方式与捕获链接触：将微通道板的第一表面与固定有捕获链条带的基板密封接合，第二次形成微通道阵列，第二次形成的微通道阵列中的微通道与捕获链条带之间形成交叉，交叉点为检测位点；在第二次形成的微通道阵列的微通道中注入单链化的第一PCR产物和/或单链化的第二PCR产物；第二次形成的微通道阵列的微通道包括Ⅰ’类微通道和Ⅱ’类微通道两部分；

探针为连接有报告分子的单链DNA，包括第一探针和第二探针；第一探针与片段A的正义链互补，第一探针同片段A的结合区域和第一捕获链同片段A的结合区域相异，第二探针与片段B的正义链互补；探针用于确认已被捕获链所捕获的靶片段，探针由如下方式与靶片段结合：首先，单链化的第一PCR产物和/或单链化的第二PCR产物均与捕获链在微通道中接触并充分反应；然后，在Ⅰ’类微通道中注射入第一探针，并在Ⅱ’类微通道注射入第二探针，使第一探针与第一捕获链所捕获的片段A的正义链接触，并使第二探针与第一捕获链或第二捕获链所捕获的片段B的正义链接触。

采用上述技术方案，技术原理如下：

将微通道板密封在基板上，形成微通道，可在微通道中注射捕获链溶液(含第一捕获链或第二捕获链的溶液，两种捕获链不同时出现在同一溶液中)，由于基板被功能化处理过，捕获链与基板接触，可被固定在基板上，形成两种捕获链条带，两种捕获链条带的形状和微通道一致,然后将微通道板和基板拆卸。再将微通道板密封在有条带的基板上，形成的微通道与两种捕获链条带均相交，交点为接下来的步骤中的检测位点。通过PCR对待测样品进行PCR扩增，使得待测样本中的目的基因的拷贝数增加，便于后续检测。将两种PCR产物分别注入微通道中，其中，PCR产物均经过单链化处理，如果使用对称PCR进行基因扩增，则需要对PCR产物进行变性处理；如果使用不对称PCR，则不需要变性处理，PCR产物中有大量单链DNA。使第一PCR产物与第一捕获链与第二捕获链接触，使第二PCR产物第一捕获链与第二捕获链接触，第一捕获链可以捕获待测融合基因的片段的正义链，第二捕获链可以捕获待测野生型基因的正义链。待测融合基因的片段的正义链和待测野生型基因的正义链均被固定在了基板上。在微通道中注射入第一探针或第二探针溶液，使第一探针与第一捕获链和第二捕获链所捕获的片段接触，使第二探针与第一捕获链和第二捕获链所捕获的片段接触。如果第一捕获链上捕获有待测融合基因片段A的正义链，第一探针就会结合在待测融合基因的片段A的正义链上，第二探针也会结合在待测融合基因的片段B的正义链上；如果第二捕获链上捕获有待测野生型基因的片段B的正义链，第二探针会结合在待测野生型基因的片段B的正义链上，而第一探针不会结合在待测基因Ⅱ的片段B的正义链上。通过检测探针上的报告分子，可获知样品中是否有融合基因的存在。

在基因融合中，原来野生型的基因发生断裂，发生断裂的位点被称为断裂位点(break point)，另一个基因的一个片段和该野生型基因的一个片段连在了一起，融合位置(fusion site)是上述两个片段相互连接和融合的位置，两个片段的连接方式可以是平端连接也可以是粘性末端连接。

有益效果：

(1)本检测设备具有三重识别靶基因的功能，极大地降低了检测中的错误信号，三重识别功能包括PCR体系对靶基因的筛选、捕获链对目的基因的筛选和探针对目的基因的筛选。在本方案中，先将捕获链固定在基板上形成捕获链条带，再引入PCR产物和探针，实现了多重筛选，提高检测准确度。相比于现有技术中的微阵列芯片，此技术方案中的检测设备灵敏度和准确性更高，可检测处于低浓度水平的目的基因。

(2)本检测设备可根据需要将捕获链固定在基板上，不同于现有技术中的微阵列芯片，微阵列芯片一般为商业化产品，是将探针固定在基板上，使用者不能够据实际需求进行设计，由于探针和目的基因的序列可能存在差异，导致错误信号的产生，本设备可以避免上述缺陷。

(3)微流控芯片的微通道相比于现有技术中的微阵列芯片，具有相对较大的表面积与体积比和较短的扩散距离，能够显著加快分析速度、提高检测效率、增强分析性能，并且能够加工大量的平行通道用于多样品分析。

(4)现有技术中，对融合基因的检测往往都是针对融合基因本身设计PCR引物和探针。但是在人体中的基因融合情况较为复杂，例如：融合基因在某一个体中含量为1％，而野生型的基因含量为99％。在这种情况下，如果只针对融合基因本身设计PCR引物和探针，会导致检测结果不能区分只含有野生型基因的样本和空白样本。在本方案中，使用第一PCR反应体系和第二PCR反应体系分别对融合基因上的一个片段和野生型基因上的一个片段进行扩增，再对扩增获得的片段使用探针进行检测，针对只含有野生型基因的样本，我们可以获取一个阳性信号，而空白样本中无荧光信号，从而将只含有野生型基因的样本和空白样本进行区分。在本方案中，仅Ⅲ类检测位点有荧光信号表示样品中只含野生型基因，而针对空白样本，所有检测位点均无荧光信号。本方案使得检测结果更为准确，极大地减少了假阳性，本技术方案可以应用于检测同时含有融合基因和野生型基因的样本，以及准确地区分空白样本和只含有野生型基因的样本。

进一步，所述第二探针的两端的碱基均为G；所述捕获链的3’端通过间隔物连接有氨基。

采用上述技术方案，发明人研究发现第二探针的两端的碱基均为G(G-clamp)可增强检测位点上的荧光信号。捕获链的3’端连接有氨基，在捕获链结合正义链(待测融合基因片段的正义链或待测基因B片段的正义链)之后，可以使得正义链向远离基板的方向伸出，便于正义链和探针的结合。

进一步，第一引物对包括第一正向引物和第一反向引物，在第一PCR反应体系中第一正向引物的用量大于第一反向引物的用量；第二引物对包括第二正向引物和第二反向引物，在第二PCR反应体系中第二正向引物的用量大于第二反向引物的用量。

采用上述技术方案，通过不对称PCR对靶基因进行扩增可获得更多的单链DNA，使得检测中产生的荧光信号更强。不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。

进一步，所述微通道板的材料为聚二甲基硅氧烷。

采用上述技术方案，聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)是一种疏水类的有机硅物料，被广泛应用于微流控芯片的制作。

进一步，功能化的基板为表面具有醛基化修饰的基板，所述基板为载玻片。

采用上述技术方案，经醛基功能化修饰的载玻片便于氨基修饰的核酸分子固定在载玻片上。

进一步，所述探针中的报告分子为生物素。

采用上述技术方案，生物素是较为常见的报告分子，技术成熟，可在检测过程中获得稳定的荧光信号。

进一步，所述片段A为人类EML4基因的一个DNA片段，所述野生型基因为人类ALK基因，所述片段B和片段B’的连接位置在ALK基因上的第20外显子上。

采用上述技术方案，EML4(棘皮动物微管相关蛋白样4)和ALK(间变性淋巴瘤激酶)的基因都位于人类2号染色体上，相隔约12兆碱基，因为染色体短臂内的反转而发生的基因融合。野生型ALK蛋白是跨细胞膜受体，如与配体结合，将引起野生型ALK蛋白二聚化，激活相关信号传导途径。由于EML4的存在，ALK不需要配体激活就可以发生二聚化，导致不受控制的配体非依赖性细胞增殖的出现，从而出现非小细胞肺癌(NSCLC)等病变。NSCLC是较为普遍的肺癌，因为它占所有肺癌病例的约80-85％，所以研究人类EML4基因和人类ALK基因、以及两基因形成的融合蛋白，对疾病检测和靶向治疗有重大意义。

进一步，所述融合基因为EML4-ALK融合基因变异体1，EML4-ALK融合基因变异体1由EML4的第1-13外显子和ALK的第20-29外显子融合形成。

采用上述技术方案，EML4-ALK融合基因至少有15种不同的变异体，变异体之间的差异都在于融合区域。其中最普遍的是变异体1,变异体2和变异体3，它们分别是ALK的外显子20和EML4外显子13之间的融合体(变异体1)，ALK的外显子20和EML4外显子20(之间的融合体变异体2)，ALK的外显子20和EML4外显子6之间的融合体(变异体3)。由于EML4-ALK基因融合变异体1以最高频率出现，以该变异体作为检测对象，对EML4-ALK融合基因引起的癌症的检测和靶向治疗有重大意义。；

进一步，第一捕获链为：5’-CTCCACCTGAGTCTCCA-3’-C₆-NH₂；

第二捕获链为：5’-GTCACCACAGAGAGGATCA-3’-C₆-NH₂；

第一探针为：Biotin-5’-CTCTACAGTAGTTTTGCTCC-3’；

第二探针为：Biotin-5’-GGCTTGCAGCTCCTG-3’；

第一正向引物为：5’-TGGAGACTCAGGTGGAG-3’；

第二正向引物为：5’-TGATCCTCTCTGTGGTGAC-3’；

第一反向引物和第二反向引物均为：5’-ATGGCTTGCAGCTCC-3’；

其中，Biotin为在序列的5’端使用生物素修饰；-C₆-NH₂为在序列的3’端通过C₆间隔物连接NH₂。

采用上述技术方案，上述引物对可以特异性的扩增出靶片段；上述探针和捕获链可以特异性地与靶片段结合，并获得较强的荧光信号便于检测进行。

进一步，一种基因融合的微流控检测设备的使用方法，融合基因包括相互连接的片段A和片段B，片段A和片段B分别位于融合位置上游和下游，所述片段B为野生型基因的一个DNA片段，野生型基因还包括片段B’，片段B’和片段B相互连接且分别位于断裂位点上游和下游，包括以下步骤：

步骤(1)制备微通道板和功能化的基板：微通道板包括第一表面和与第一表面相对的第二表面，微通道板的第一表面上设置有至少两条不交叉的凹槽，在凹槽的两端设有贯穿第一表面和第二表面的通孔；微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合，微通道板和基板之间形成供流体流通的微通道阵列，微通道阵列由至少两条不交叉微通道组成，微通道板和基板之间可拆卸；

步骤(2)PCR扩增：将待测样品置于PCR反应体系中对靶基因进行PCR扩增，PCR反应体系包括第一PCR反应体系和第二PCR反应体系，分别用于获得第一PCR产物和第二PCR产物；第一PCR反应体系用于扩增融合基因片段，融合基因片段由相互连接的片段A和片段B组成；第二PCR反应体系用于扩增野生型基因片段，野生型基因片段由相互连接的片段B和片段B’组成；

步骤(3)捕获链固定：捕获链包括第一捕获链和第二捕获链，第一捕获链与片段A的正义链互补，第二捕获链与片段B’的正义链互补；

将微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合，第一次形成微通道阵列，第一次形成的微通道阵列中的微通道包括Ⅰ类微通道和Ⅱ类微通道两部分；将含第一捕获链的溶液注入Ⅰ类微通道，并将含第二捕获链的溶液注入Ⅱ类微通道，使捕获链固定在基板上，在基板上形成捕获链条带，然后将微通道板从基板上拆卸；

步骤(4)捕获PCR产物正义链：将微通道板的第一表面与基板密封接合，第二次形成微通道阵列，第二次形成的微通道阵列中的微通道与捕获链条带之间形成交叉，交叉点为检测位点；在第二次形成的微通道阵列的微通道中注入单链化的第一PCR产物和/或单链化的第二PCR产物；第二次形成的微通道阵列的微通道包括Ⅰ’类微通道和Ⅱ’类微通道两部分；

步骤(5)探针杂交：探针为连接有报告分子的单链DNA，包括第一探针和第二探针，第一探针与片段A的正义链互补，第一探针同片段A的结合区域和第一捕获链同片段A的结合区域相异，第二探针与片段B的正义链互补；

首先，单链化的第一PCR产物和/或单链化的第二PCR产物均与捕获链在微通道中接触并充分反应；然后，在Ⅰ’类微通道中注射入第一探针，并在Ⅱ’类微通道注射入第二探针，使第一探针与第一捕获链所捕获的片段A的正义链接触，并使第二探针与第一捕获链或第二捕获链所捕获的片段B的正义链接触；

步骤(6)探测报告分子信号：报告分子为生物素，将链霉-Cy5注入Ⅰ’类微通道和Ⅱ’类微通道，使链霉-Cy5与生物素接触，然后显示检测位点上的荧光信号；

检测位点包括Ⅰ类检测位点、Ⅱ类检测位点、Ⅲ类检测位点和Ⅳ类检测位点；Ⅰ类检测位点为固定有第一捕获链和捕获的片段A的正义链、接触过第一探针的检测位点，Ⅱ类检测位点为固定有第一捕获链和捕获的片段A的正义链、接触过第二探针的位点，Ⅲ类检测位点为固定有第二捕获链和捕获的片段B的正义链、接触过第二探针的位点，Ⅳ类检测位点为固定有第二捕获链和捕获的片段B的正义链、接触过第一探针的位点；

当Ⅰ类检测位点和Ⅱ类检测位点上均有荧光信号时，待测样品中含有融合基因，当Ⅲ类检测位点有荧光信号但Ⅳ类检测位点上没有荧光信号时，待测样品中含有野生型基因。

采用上述技术方案，可实现利用本发明的检测设备对融合基因进行检测。通过微通道板在基板上固定方位的变换，可控制不同核酸分子的分布和杂交。结果展示方式较现有技术中的微阵列芯片更为简单，不用对结果进行复杂的统计分析，即可判定样品中是否有融合基因的存在。

附图说明

图1为实施例1中捕获链的固定化的流程图；

图2为实施例1中首先捕获PCR产物然后探针杂交的流程图；

图3为实施例1和实施例2的检测结果柱状图；

图4为实验例1的检测结果荧光图像；

图5为实验例1的检测结果柱状图；

图6为对比例1的检测结果荧光图像；

图7为对比例1的检测结果柱状图；

图8为对比例2的检测结果荧光图像；

图9为对比例2的检测结果柱状图。

具体实施方式

说明书附图中的附图标记包括：Ⅰ类微通道1、Ⅱ类微通道2、微通道板5、基板6、核酸条带10、Ⅰ’类微通道7、通孔8、Ⅱ’类微通道9、检测位点11

下面以检测EML4-ALK融合基因为例，对本技术方案进行详细说明：

小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)是两种主要类型的肺癌，NSCLC更为普遍，因为它占所有肺癌病例约80-85％。在NSCLC病例中，3-5％的病例是由EML4和ALK基因融合引起的，形成EML4-ALK融合基因。EML4(棘皮动物微管相关蛋白，echinodermmicrotubule-associated protein-like 4)和ALK(间变性淋巴瘤激酶，anaplasticlymphoma kinase)的基因都位于人类2号染色体上，相隔约12兆碱基，这两个基因的融合是由于短臂内的反转而发生的。EML4-ALK融合基因至少有15种不同的变异体，变异体之间的差异都在于融合区域。其中最普遍的是变异体1,变异体2和变异体3，它们分别是ALK的外显子20和EML4外显子13之间的融合体(变异体1)，ALK的外显子20和EML4外显子20(之间的融合体变异体2)，ALK的外显子20和EML4外显子6之间的融合体(变异体3)。由于EML4-ALK基因融合变异体1以最高频率出现，因此实施例1和2针对变异体1进行检测。其中，EML4-ALK基因融合变异体1序列请见SEQ ID NO.13(GenBank ID：AB274722.1)；野生型基因ALK序列请见SEQ ID NO.14(GenBank ID：NM_004304)。

实施例1：

1.PDMS板(微通道板的具体形式)的制备以及载玻片(基板的具体形式)的功能化

PDMS板的制备：在本实施例中微通道板采用PDMS板制成，所以在实施例中将微通道板进行了具体化，称为PDMS板。将弹性体与固化剂两种液体混合，得混合溶液，然后将混合溶液倒入模具,固化剂能将弹性体固化,并使其在模具中固化来合成PDMS板，制备的PDMS板有16个微通道。将含有16个微通道的PDMS板从模具中取出，在PDMS板上的每个微通道的两端处穿孔形成两个井(即权利要求中的通孔)，分别为加样井和加样井对面的井,该加样井用于注入样品溶液，加样井对面的井用于吸入样品溶液，以及为在微通道中流动提供动力。

载玻片的功能化：在本实施例中基板采用载玻片，所以在本实施例中对基板进行了具体化，称为载玻片。载玻片的尺寸为75cm×50cm。首先用100mL(由70mL 98％H₂SO₄和30mL 30％H₂O₂组成)的Piranha溶液(食人鱼溶液)清洗载玻片，清洗时间持续15min。完成清洗并待载玻片干燥后，将载玻片用APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)在乙醇的溶液(由2mLAPTES和98mL无水乙醇组成)在惰性N₂下处理20min。完成上述处理后，在120℃下加热载玻片。然后使载玻片与100ml戊二醛溶液反应60min，上述戊二醛溶液的制备方法为：将戊二醛溶于1×PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)，其中戊二醛在溶液中的质量分数为5重量％。

2.引物和探针的设计

EML4-ALK融合基因序列信息和野生型ALK基因序列信息获取自美国国家生物技术信息中心(NCBI)和欧洲核苷酸档案(ENA)数据库，对从两个机构获取的EML4-ALK融合基因序列信息和野生型ALK基因序列信息分别进行了比对，以确保序列准确性。

参见表1，在本实施例中共设计了两个核酸探针，EML4探针(第一探针的具体化形式)可以与EML4-ALK融合基因序列的EML4部分互补并结合，G-Clamp-ALK探针(第二探针的具体化形式，该探针的5’末端和3’末端的碱基均为G)可以与EML4-ALK融合基因序列的ALK部分和野生型ALK基因序列互补并结合。在本实施例中共设计了两个靶序列，分别为85-mer靶序列和55-mer靶序列。85-mer靶序列根据EML4-ALK融合基因序列(针对变异体1)设计，55-mer靶序列根据野生型ALK序列设计。EML4探针可以与85-mer靶序列结合，而EML4探针不能与55-mer靶序列结合,ALK探针可以与85-mer靶序列和55-mer靶序列结合。85-mer靶序列和55-mer靶序列均在5'末端连接有C₁₂连接子，C₁₂连接子再与一个氨基(NH₂)连接。靶序列(85-mer靶序列和55-mer靶序列)和探针(EML4探针和G-Clamp-ALK探针)从Integrated DNATechnologies(IDT)订购。

参见表1，本实施例还包括了两个双链扩增模板(获取自gBlock genefragments)，分别为融合基因模板和野生型基因模板。融合基因模板包括EML4-ALK融合的序列(针对变异体1)。在本实施例中，还设计了两个正向引物和一个反向引物，因为两个序列的3'末端由相同的ALK野生型部分组成，所以只需设计一个反向引物。两个正向引物分别用于对融合基因模板和野生型基因模板进行扩增，两个正向引物分别为融合基因正向引物和野生型基因正向引物。本实施例还包括两个捕获链序列，分别为融合基因捕获链序列(第一捕获链的具体化形式)和野生型基因捕获链序列(第二捕获链的具体化形式)，融合基因捕获链序列为融合基因正向引物的互补链序列，野生型基因捕获链序列为野生型基因正向引物的互补链序列。在融合基因捕获链和野生型基因捕获链的3'端通过间隔物(本实施例中具体为C₆)连接有氨基(NH₂)，以使与捕获序列结合的序列朝远离载玻片表面的方向伸出。

使用MFOLD，IDT和NEB软件分析靶序列，引物和探针的Tm和发卡结构，以确保最佳杂交条件。

表1：靶序列、引物和探针的DNA序列。

3.探针有效性的检测

将85-mer靶序列和55-mer靶序列固定在功能化的载玻片上，再用G-Clamp-ALK探针和EML4探针检测上述两种靶序列。

用乙醇和水洗涤第一PDMS板并使其干燥，然后将其密封在功能化的载玻片上，第一次形成微通道阵列，第一次形成微通道阵列中的微通道包括Ⅰ类微通道(共8条)和Ⅱ类微通道(共8条)两部分；将含85-mer靶序列的溶液注入Ⅰ类微通道，并将含55-mer靶序列的溶液注入Ⅱ类微通道，使捕获链固定在基板上，在基板上形成捕获链条带，然后将微通道板从基板上拆卸。具体的操作方式如下，使用固定缓冲液将85-mer靶序列和55-mer靶序列分别稀释至25μM。固定缓冲液的配置方法为将NaCl和NaHCO₃溶于去离子水，其中，NaCl的终浓度为1.5M，NaHCO₃的终浓度为0.15M。将1μL稀释后的85-mer靶序列或55-mer靶序列注入第一PDMS板上的加样井中。用吸力施于加样井对面的井(两个井之间连接有微通道)中，将加样的井中的溶液吸入微通道中。酝酿1h后，使85-mer靶序列或55-mer靶序列产生反应并附着到功能化载玻片上，之后将溶液泵出通道。然后用固定缓冲液洗涤通道以除去任何过量的靶序列。接下来，从载玻片上移除第一PDMS板，将载玻片放入2.50mg/mL NaBH₄中，浸泡15min以将固定的靶序列上的亚胺还原成胺。然后用1×PBS洗涤载玻片并干燥，得到固定有85-mer靶序列和55-mer靶序列的载玻片，在载玻片上有若干条带相互平行的靶序列条带(85-mer靶序列或55-mer靶序列)。

得到固定有靶序列条带的载玻片后，将第二PDMS板密封在载玻片上，第二PDMS板上的微通道与载玻片上的靶序列条带垂直。第二次形成微通道阵列，第二次形成的微通道阵列中的微通道与捕获链条带之间形成交叉，交叉点为检测位点。第二次形成的微通道阵列的微通道包括Ⅰ’类微通道(共8条)和Ⅱ’类微通道(共8条)两部分。在Ⅰ’类微通道中注射入第一探针，并在Ⅱ’类微通道注射入第二探针。具体的操作方式如下，将ALK探针和EML4探针使用杂交缓冲液分别稀释至25nM，杂交缓冲液的配置方法为：将柠檬酸三钠和十二烷基硫酸钠(SDS)溶于去离子水，其中，柠檬酸三钠的终浓度为15mM，十二烷基硫酸钠的终浓度为0.1重量％。在第二PDMS板的井中加入1μL的25nM的EML4探针溶液或ALK探针溶液，将液体引入微通道中，使两种探针分别与85-mer靶序列或55-mer靶序列杂交。经1h酝酿后，从微通道中除去过量的溶液，随后用1×PBS洗涤微通道。然后，将1μL的50ng/mL链霉-Cy5溶液引入所有微通道中，并使其与两种探针上的生物素标记物结合15min，然后用含吐温的1×PBS溶液洗涤微通道。之后将第二PDMS板拆卸，拆卸第二PDMS板后的载玻片将用于荧光扫描。使用Typhoon Trio+可变模式成像仪对载玻片进行荧光扫描。如果生物素标记的两种探针能够与85-mer靶序列或55-mer靶序列杂交，则随后引入的链霉-Cy5将与生物素结合，会于检测位点产生Cy5的荧光。如果没有发生杂交，则不会有荧光。结果显示，探针的特异性和信号均较强，第一探针和第二探针能够较好的探测出靶序列。

4.EML4-ALK融合基因检测

在本步骤中，使用融合基因模板和野生型基因模板进行PCR扩增，使用固定在载玻片上的捕获链来固定PCR产物中的正义链，再使用用生物素标记的探针进行PCR产物中的正义链的检测。

(1)PCR扩增

分别对融合基因模板和野生型基因模板进行PCR扩增(本实施例是采用不对称PCR扩增方法)，在PCR反应体系中，反应液量为50μL,各种试剂的终浓度为1×PCR缓冲液，200μMdNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)、450nM正向引物(对融合基因模板进行PCR扩增采用融合基因正向引物；野生型基因模板进行PCR扩增采用野生型基因正向引物)、150nM反向引物。在PCR反应体系中加入10ng DNA模板(融合基因模板或野生型基因模板)和5U Taq DNA聚合酶。PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶购买自Applied Biological Materials和dNTP购买自ThermoScientific。在Techne 3Prime热循环仪上进行DNA扩增，热循环参数以3分钟94℃初始变性开始，然后进行30个循环的95℃(变性)，50℃(接合)和72℃(延伸)各30秒。PCR反应结束后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR扩增产物。纯化后，使用Nanodrop光谱仪分析获得260/230和260/280比率的DNA吸光度。如果260/230比率接近1.8并且260/280比率接近2.2，则认为PCR产物是纯的并且用于随后的实验中。在此步骤中获得融合基因不对称PCR产物和野生型基因不对称PCR产物。

(2)融合基因捕获链和野生型基因捕获链的固定化(流程图见图1)

首先，用乙醇和水洗涤第一PDMS板并使其干燥，然后将其密封在功能化的载玻片上。第一次形成微通道阵列，第一次形成微通道阵列中的微通道包括Ⅰ类微通道(共8条)和Ⅱ类微通道(共8条)两部分；将含融合基因捕获链的溶液注入Ⅰ类微通道，并将含野生型基因捕获链的溶液注入Ⅱ类微通道，使捕获链固定在基板上，在基板上形成捕获链条带，然后将微通道板从基板上拆卸。接下来，使用固定缓冲液将融合基因捕获链和野生型基因捕获链分别稀释至25μM。固定缓冲液的配置方法为将NaCl和NaHCO₃溶于去离子水，其中，NaCl的终浓度为1.5M，NaHCO₃的终浓度为0.15M。将1μL稀释后的融合基因捕获链或野生型基因捕获链注入第一PDMS板上的加样井中。用吸力施于加样井对面的井(两个井之间连接有微通道)中，将加样的井中的溶液吸入微通道中。酝酿1h后，使融合基因的捕获链或野生型基因的捕获链产生反应并附着到功能化载玻片上，之后将溶液泵出通道。然后用固定缓冲液洗涤通道以除去任何过量的捕获链。接下来，从载玻片上移除第一PDMS板，将载玻片放入2.50mg/mL NaBH₄中，浸泡15min以将固定的靶序列上的亚胺还原成胺。然后用1×PBS洗涤载玻片并干燥，得到固定有捕获链的载玻片。

(3)探针杂交(流程图见图2)

得到固定有捕获链的载玻片后，将第二PDMS板密封在载玻片上，如图2所示，第二PDMS板上的微通道与载玻片上的捕获链条带垂直。在本步骤中，第二次形成微通道阵列，第二次形成的微通道阵列中的微通道与捕获链条带之间形成交叉，交叉点为检测位点。第二次形成的微通道阵列的微通道包括Ⅰ’类微通道(共8条)和Ⅱ’类微通道(共8条)两部分。在Ⅰ’类微通道中注射入EML4探针，并在Ⅱ’类微通道注射入G-Clamp-ALK探针。具体操作方式如下，将G-Clamp-ALK探针和EML4探针使用杂交缓冲液分别稀释至25nM，杂交缓冲液的配置方法为：将柠檬酸三钠和十二烷基硫酸钠(SDS)溶于去离子水，其中，柠檬酸三钠的终浓度为15mM，十二烷基硫酸钠的终浓度为0.1重量％。将融合基因不对称PCR产物和野生型基因PCR不对称产物用杂交缓冲液中分别稀释至19.6ng/μL和15.2ng/μL。将1μL的两种不对称PCR产物分别注入第二PDMS板上的井中，并将液体吸入对应的微通道，经过1h酝酿后，除去微通道中的液体，此时融合基因捕获链已经捕获到了不对称PCR产物中的融合基因的正义链，野生型基因捕获链已经捕获到了不对称PCR产物中的野生型基因的正义链。

然后在第二PDMS板的井中加入1μL的25nM的EML4探针溶液或G-Clamp-ALK探针溶液，将液体引入微通道中，使探针与融合基因的正义链或者野生型基因的正义链杂交。经1h孵育后，从微通道中除去过量的溶液，随后用1×PBS洗涤微通道。然后，将1μL的50ng/mL链霉-Cy5溶液引入所有微通道中，并使其与两种探针上的生物素标记物结合15min，然后用含吐温的1×PBS溶液洗涤微通道。之后将第二PDMS板剥离，剥离第二PDMS板后的载玻片将用于荧光扫描。使用Typhoon Trio+可变模式成像仪进行荧光扫描。如果生物素标记的两种探针能够与融合基因的正义链或者野生型基因的正义链杂交，则随后引入的链霉-Cy5将与生物素结合，会于检测位点产生Cy5荧光。如果没有发生杂交，则不会有荧光。

对荧光扫描结果进行分析，为了更准确地比较探针结合强度，将每个微流控检测位点的荧光信号进行标准化处理。每个微流控检测位点是指有条带的基板和第二PDMS板上的微通道之间形成的交叉点，即捕获链(融合基因捕获链或野生型基因捕获链)、正义链(融合基因的正义链或者野生型基因的正义链)和探针(EML4探针或ALK探针)都出现过的位置(位点)。如果微流控检测位点上的荧光信号强度大于20,000(或20×1000)的强度阈值，则认为是成功检测到了基因的荧光信号。融合基因不对称PCR产物的正义链与EML4和G-Clamp-ALK探针结合，而野生型不对称PCR产物的正义链仅与ALK探针结合。同样，两种探针的这种结合差异足以区分融合基因不对称PCR产物和野生型基因不对称PCR产物。图3为荧光信号强度柱状图(误差条显示3次测量的标准偏差)，asymmetric表示：不对称PCR，Fusion-EML4表示：捕获的片段A的正义链和第一探针的检测位点(Ⅰ类检测位点)；Fusion-ALK表示：捕获的片段A的正义链和第二探针的检测位点(Ⅱ类检测位点)；WT-EML4表示：捕获的片段B的正义链和第一探针的检测位点(Ⅳ类检测位点)；WT-ALK表示：捕获的片段B的正义链和第二探针的检测位点(Ⅲ类检测位点)。

实施例2

本实施例基本同实施例1，不同点在于在“4(1)PCR扩增”步骤中采用对称PCR，其中，正向引物(对融合基因模板进行PCR扩增采用融合基因正向引物；野生型基因模板进行PCR扩增采用野生型基因正向引物)和反向引物在50μL PCR反应体系中的终浓度(工作浓度)均为300nM。经对称PCR扩增，获得融合基因对称PCR产物和野生型基因对称PCR产物。在后续步骤中，使用本实施例中的经变性处理后的融合基因对称PCR产物和经变性处理后的野生型基因对称PCR产物，分别代替实施例1中的融合基因不对称PCR产物和野生型基因PCR不对称产物。其中，在“4(3)探针杂交”步骤中采用：将融合基因对称PCR产物和野生型基因PCR对称产物用杂交缓冲液中分别稀释至22.3ng/μL和22.1ng/μL。融合基因对称PCR产物和野生型基因对称PCR产物的变性处理的方法如下：95℃处理对称PCR产物5min，然后将对称PCR产物放置于冰上5min。

图3显示融合基因对称PCR产物的正义链与EML4和G-Clamp-ALK探针结合，而野生型基因对称PCR产物的正义链仅与G-Clamp-ALK探针结合。两种探针的结合差异足以区分融合基因对称PCR产物和野生型基因对称PCR产物。图3为荧光信号强度柱状图(误差条显示3次测量的标准偏差)，symmetric表示：对称PCR，Fusion-EML4表示：捕获的片段A的正义链和第一探针的检测位点(Ⅰ类检测位点)；Fusion-ALK表示：捕获的片段A的正义链和第二探针的检测位点(Ⅱ类检测位点)；WT-EML4表示：捕获的片段B的正义链和第一探针的检测位点(Ⅳ类检测位点)；WT-ALK表示：捕获的片段B的正义链和第二探针的检测位点(Ⅲ类检测位点)。

对比实施例1和实施例2，使用不对称PCR进行融合基因模板或野生型基因模板的扩增，比使用对称PCR可获得更强的荧光信号。

实验例1：探针有效性的检测(使用表1中的ALK探针进行检测)

1.PDMS板的制备以及载玻片的功能化(由于该步骤同实施例1中的“1.PDMS板的制备以及载玻片的功能化”，在此处省略描述)

2.引物和探针的设计

本实验例选取两个核酸探针：EML4探针和ALK探针(序列信息见表1)，ALK探针不带G钳(G-Clamp)，即该探针5’末端和3’末端的碱基均不为G。本实验例还选用了两个靶序列：85-mer靶序列和55-mer靶序列(序列信息见表1)。EML4探针和ALK探针、85-mer靶序列和55-mer靶序列均由人工合成，从Integrated DNA Technologies(IDT)订购。

3.85-mer靶序列和55-mer靶序列的固定化

用乙醇和水洗涤第一PDMS板并使其干燥，然后将其密封在功能化的载玻片上。第一次形成微通道阵列中的微通道包括Ⅰ类微通道和Ⅱ类微通道两部分；将含85-mer靶序列的溶液注入Ⅰ类微通道，并将含55-mer靶序列的溶液注入Ⅱ类微通道，使捕获链固定在基板上，在基板上形成捕获链条带，然后将微通道板从基板上拆卸。具体操作方式为，使用固定缓冲液将85-mer靶序列和55-mer靶序列分别稀释至25μM。固定缓冲液的配置方法为将NaCl和NaHCO₃溶于去离子水，其中，NaCl的终浓度为1.5M，NaHCO₃的终浓度为0.15M。将1μL稀释后的85-mer靶序列或55-mer靶序列注入第一PDMS板上的井中。用吸力施于加样的井对面的井(两个井之间连接有微通道)中，将加样的井中的溶液拉入微通道中。孵育1h后，使85-mer靶序列或55-mer靶序列产生反应并附着到功能化载玻片上，之后将溶液泵出通道。然后用固定缓冲液洗涤通道以除去任何过量的捕获链。接下来，从载玻片上移除第一PDMS板，将载玻片放入2.50mg/mL NaBH₄中，浸泡15min以将固定的靶序列上的亚胺还原成胺。然后用1×PBS洗涤载玻片并干燥，得到固定有85-mer靶序列和55-mer靶序列的载玻片，在载玻片上有若干条相互平行的靶序列条带(85-mer靶序列或55-mer靶序列)。在本实验例中，载玻片上有三条85-mer靶序列条带和三条55-mer靶序列条带，六条靶序列条带两两平行。

4.探针杂交

得到固定有靶序列条带的载玻片后，将第二PDMS板密封在载玻片上，第二PDMS板上的微通道与载玻片上的靶序列条带垂直。第二次形成微通道阵列，第二次形成的微通道阵列中的微通道与捕获链条带之间形成交叉，交叉点为检测位点。第二次形成的微通道阵列的微通道包括Ⅰ’类微通道和Ⅱ’类微通道两部分。在Ⅰ’类微通道中注射入第一探针，并在Ⅱ’类微通道注射入第二探针。将ALK探针和EML4探针使用杂交缓冲液分别稀释至25nM，杂交缓冲液的配置方法为：将柠檬酸三钠和十二烷基硫酸钠SDS溶于去离子水，其中，柠檬酸三钠的终浓度为15mM，十二烷基硫酸钠的终浓度为0.1重量％。在第二PDMS板的井中加入1μL的25nM的EML4探针溶液或ALK探针溶液，将液体引入微通道中，使两种探针分别与85-mer靶序列或55-mer靶序列杂交。在本实验例中，在载玻片上又形成了三条ALK探针条带和三条EML4探针条带，共六条两两平行的探针条带，六条探针条带与六条靶序列条带相互垂直，探针条带和靶序列条带的交叉点为检测位点。经1h酝酿后，从微通道中除去过量的溶液，随后用1×PBS洗涤微通道。然后，将1μL的50ng/mL链霉-Cy5溶液引入所有微通道中，并使其与两种探针上的生物素标记物结合15min，然后用含吐温的1×PBS溶液洗涤微通道。之后将第二PDMS板剥离，剥离第二PDMS板后的载玻片将用于荧光扫描。使用Typhoon Trio+可变模式成像仪对载玻片进行荧光扫描。如果生物素标记的两种探针能够与85-mer靶序列或55-mer靶序列杂交，则随后引入的链霉-Cy5将与生物素结合，会于检测位点产生Cy5荧光。如果没有发生杂交，则不会有荧光。

图4显示的是本实验例的荧光图像，EML4探针和ALK探针都与85-mer靶序列杂交，而ALK探针，只能与55-mer靶序列杂交。两种探针结合靶序列的差异是可以用来区分85-mer靶序列或55-mer靶序列，85-mer靶序列代表的是EML4-ALK融合基因，55-mer靶序列代表的是野生型ALK基因。但是ALK探针产生的信号强度较低，不利于后续检测，需对ALK探针实行改进使其产生的荧光信号强度增加。图5显示的是荧光信号强度柱状图(误差条是9次测量的标准偏差)。

对比例1：探针的改进(表1中的ALK探针和G-Clamp-ALK探针之间的对比)

由于ALK探针产生的信号强度较低，对ALK探针进行改进，G-Clamp-ALK探针是两端带有G钳的ALK探针(见表1)。在本对比例中，对比ALK探针和G-Clamp-ALK探针的荧光强度。本对比例基本同实验例1，但增加一个G-Clamp-ALK探针。在载玻片上形成了三条85-mer靶序列条带，三条55-mer靶序列条带，共六条靶序列条带。在载玻片上形成了一条G-Clamp-ALK探针条带、一条ALK探针条带和一条EML4探针条带，共三条探针条带。三条探针条带与六条靶序列条带相互垂直，探针条带和靶序列条带的交叉点为检测位点。实验结果如图6和图7所示。图6显示的是本对比例的荧光图像，两端带有G钳的G-clamp-ALK探针与55-mer靶序列和85-mer靶序列均结合得更好。图7显示的是荧光信号强度柱状图(误差条显示3次测量的标准偏差)，G-clamp-ALK探针的信号强度大于ALK探针的信号强度。

对比例2：对EML4-ALK融合基因和野生型ALK基因的混合样本的检测

由于在不同的人体中，EML4-ALK融合基因的数量与野生型ALK基因的数量的比例(突变频率)是不同的，因此发明人进一步研究了本技术方案的检测方法可以检测到的最低突变频率。在本对比例中，将实施例1中的融合基因不对称PCR产物和野生型基因不对称PCR产物进行混合，模拟EML4-ALK融合基因的突变频率(突变发生频率)。在本对比例中，采用三种混合比，即野生型基因不对称PCR产物和融合基因不对称PCR产物的比率分别为：75:25、90:10和99:1，得到三种混合PCR产物。

本对比例的操作步骤基本同实施例1，参数上稍有不同在于：在探针杂交步骤中，G-Clamp-ALK探针和EML4探针的浓度增加至50nM，每种混合PCR产物在微通道的加入量为0.8μL，并且在微通道中加入两次同种混合PCR产物。对每一种混合PCR产物进行检测时，载玻片上有三条85-mer靶序列条带、三条55-mer靶序列条带、三条融合基因捕获链条带和三条野生型基因捕获链条带，共十二条两两平行的条带。载玻片上还有一条G-Clamp-ALK探针条带和和一条EML4探针条带，两条探针条带均与上述十二条条带相互垂直。

图8显示本发明的技术方案能够检测和区分99:1混合PCR产物中的融合基因和野生型基因，其中野生型基因不对称PCR产物的量仅为1％并且终浓度为0.25ng/μL。图8中的85-mer靶序列部分和55-mer靶序列部分均为内参。图9显示了对三种混合PCR产物检测的荧光信号强度条形图(误差条显示3次测量的标准偏差)。图9上方的星形表示满足检测阈值(实施例1中描述的20,000强度阈值)。从图9中可以看出，本法对所有三种混合PCR产物都进行了成功的检测和区分。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变异和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

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<110> 珠海澳加动力生物科技有限公司

<120> 一种基因融合的微流控检测设备及其使用方法

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agatgcgatc cagcggctct gggggcggca gcggtggtag cagctggtac ctcccgccgc 60

ctctgttcgg agggtcgcgg ggcaccgagg tgctttccgg ccgccctctg gtcggccacc 120

caaagccgcg ggcgctgatg atgggtgagg agggggcggc aagatttcgg gcgcccctgc 180

cctgaacgcc ctcagctgct gccgccgggg ccgctccagt gcctgcgaac tctgaggagc 240

cgaggcgccg gtgagagcaa ggacgctgca aacttgcgca gcgcgggggc tgggattcac 300

gcccagaagt tcagcaggca gacagtccga agccttcccg cagcggagag atagcttgag 360

ggtgcgcaag acggcagcct ccgccctcgg ttcccgccca gaccgggcag aagagcttgg 420

aggagccaaa aggaacgcaa aaggcggcca ggacagcgtg cagcagctgg gagccgccgt 480

tctcagcctt aaaagttgca gagattggag gctgccccga gaggggacag accccagctc 540

cgactgcggg gggcaggaga ggacggtacc caactgccac ctcccttcaa ccatagtagt 600

tcctctgtac cgagcgcagc gagctacaga cgggggcgcg gcactcggcg cggagagcgg 660

gaggctcaag gtcccagcca gtgagcccag tgtgcttgag tgtctctgga ctcgcccctg 720

agcttccagg tctgtttcat ttagactcct gctcgcctcc gtgcagttgg gggaaagcaa 780

gagacttgcg cgcacgcaca gtcctctgga gatcaggtgg aaggagccgc tgggtaccaa 840

ggactgttca gagcctcttc ccatctcggg gagagcgaag ggtgaggctg ggcccggaga 900

gcagtgtaaa cggcctcctc cggcgggatg ggagccatcg ggctcctgtg gctcctgccg 960

ctgctgcttt ccacggcagc tgtgggctcc gggatgggga ccggccagcg cgcgggctcc 1020

ccagctgcgg ggccgccgct gcagccccgg gagccactca gctactcgcg cctgcagagg 1080

aagagtctgg cagttgactt cgtggtgccc tcgctcttcc gtgtctacgc ccgggaccta 1140

ctgctgccac catcctcctc ggagctgaag gctggcaggc ccgaggcccg cggctcgcta 1200

gctctggact gcgccccgct gctcaggttg ctggggccgg cgccgggggt ctcctggacc 1260

gccggttcac cagccccggc agaggcccgg acgctgtcca gggtgctgaa gggcggctcc 1320

gtgcgcaagc tccggcgtgc caagcagttg gtgctggagc tgggcgagga ggcgatcttg 1380

gagggttgcg tcgggccccc cggggaggcg gctgtggggc tgctccagtt caatctcagc 1440

gagctgttca gttggtggat tcgccaaggc gaagggcgac tgaggatccg cctgatgccc 1500

gagaagaagg cgtcggaagt gggcagagag ggaaggctgt ccgcggcaat tcgcgcctcc 1560

cagccccgcc ttctcttcca gatcttcggg actggtcata gctccttgga atcaccaaca 1620

aacatgcctt ctccttctcc tgattatttt acatggaatc tcacctggat aatgaaagac 1680

tccttccctt tcctgtctca tcgcagccga tatggtctgg agtgcagctt tgacttcccc 1740

tgtgagctgg agtattcccc tccactgcat gacctcagga accagagctg gtcctggcgc 1800

cgcatcccct ccgaggaggc ctcccagatg gacttgctgg atgggcctgg ggcagagcgt 1860

tctaaggaga tgcccagagg ctcctttctc cttctcaaca cctcagctga ctccaagcac 1920

accatcctga gtccgtggat gaggagcagc agtgagcact gcacactggc cgtctcggtg 1980

cacaggcacc tgcagccctc tggaaggtac attgcccagc tgctgcccca caacgaggct 2040

gcaagagaga tcctcctgat gcccactcca gggaagcatg gttggacagt gctccaggga 2100

agaatcgggc gtccagacaa cccatttcga gtggccctgg aatacatctc cagtggaaac 2160

cgcagcttgt ctgcagtgga cttctttgcc ctgaagaact gcagtgaagg aacatcccca 2220

ggctccaaga tggccctgca gagctccttc acttgttgga atgggacagt cctccagctt 2280

gggcaggcct gtgacttcca ccaggactgt gcccagggag aagatgagag ccagatgtgc 2340

cggaaactgc ctgtgggttt ttactgcaac tttgaagatg gcttctgtgg ctggacccaa 2400

ggcacactgt caccccacac tcctcaatgg caggtcagga ccctaaagga tgcccggttc 2460

caggaccacc aagaccatgc tctattgctc agtaccactg atgtccccgc ttctgaaagt 2520

gctacagtga ccagtgctac gtttcctgca ccgatcaaga gctctccatg tgagctccga 2580

atgtcctggc tcattcgtgg agtcttgagg ggaaacgtgt ccttggtgct agtggagaac 2640

aaaaccggga aggagcaagg caggatggtc tggcatgtcg ccgcctatga aggcttgagc 2700

ctgtggcagt ggatggtgtt gcctctcctc gatgtgtctg acaggttctg gctgcagatg 2760

gtcgcatggt ggggacaagg atccagagcc atcgtggctt ttgacaatat ctccatcagc 2820

ctggactgct acctcaccat tagcggagag gacaagatcc tgcagaatac agcacccaaa 2880

tcaagaaacc tgtttgagag aaacccaaac aaggagctga aacccgggga aaattcacca 2940

agacagaccc ccatctttga ccctacagtt cattggctgt tcaccacatg tggggccagc 3000

gggccccatg gccccaccca ggcacagtgc aacaacgcct accagaactc caacctgagc 3060

gtggaggtgg ggagcgaggg ccccctgaaa ggcatccaga tctggaaggt gccagccacc 3120

gacacctaca gcatctcggg ctacggagct gctggcggga aaggcgggaa gaacaccatg 3180

atgcggtccc acggcgtgtc tgtgctgggc atcttcaacc tggagaagga tgacatgctg 3240

tacatcctgg ttgggcagca gggagaggac gcctgcccca gtacaaacca gttaatccag 3300

aaagtctgca ttggagagaa caatgtgata gaagaagaaa tccgtgtgaa cagaagcgtg 3360

catgagtggg caggaggcgg aggaggaggg ggtggagcca cctacgtatt taagatgaag 3420

gatggagtgc cggtgcccct gatcattgca gccggaggtg gtggcagggc ctacggggcc 3480

aagacagaca cgttccaccc agagagactg gagaataact cctcggttct agggctaaac 3540

ggcaattccg gagccgcagg tggtggaggt ggctggaatg ataacacttc cttgctctgg 3600

gccggaaaat ctttgcagga gggtgccacc ggaggacatt cctgccccca ggccatgaag 3660

aagtgggggt gggagacaag agggggtttc ggagggggtg gaggggggtg ctcctcaggt 3720

ggaggaggcg gaggatatat aggcggcaat gcagcctcaa acaatgaccc cgaaatggat 3780

ggggaagatg gggtttcctt catcagtcca ctgggcatcc tgtacacccc agctttaaaa 3840

gtgatggaag gccacgggga agtgaatatt aagcattatc taaactgcag tcactgtgag 3900

gtagacgaat gtcacatgga ccctgaaagc cacaaggtca tctgcttctg tgaccacggg 3960

acggtgctgg ctgaggatgg cgtctcctgc attgtgtcac ccaccccgga gccacacctg 4020

ccactctcgc tgatcctctc tgtggtgacc tctgccctcg tggccgccct ggtcctggct 4080

ttctccggca tcatgattgt gtaccgccgg aagcaccagg agctgcaagc catgcagatg 4140

gagctgcaga gccctgagta caagctgagc aagctccgca cctcgaccat catgaccgac 4200

tacaacccca actactgctt tgctggcaag acctcctcca tcagtgacct gaaggaggtg 4260

ccgcggaaaa acatcaccct cattcggggt ctgggccatg gcgcctttgg ggaggtgtat 4320

gaaggccagg tgtccggaat gcccaacgac ccaagccccc tgcaagtggc tgtgaagacg 4380

ctgcctgaag tgtgctctga acaggacgaa ctggatttcc tcatggaagc cctgatcatc 4440

agcaaattca accaccagaa cattgttcgc tgcattgggg tgagcctgca atccctgccc 4500

cggttcatcc tgctggagct catggcgggg ggagacctca agtccttcct ccgagagacc 4560

cgccctcgcc cgagccagcc ctcctccctg gccatgctgg accttctgca cgtggctcgg 4620

gacattgcct gtggctgtca gtatttggag gaaaaccact tcatccaccg agacattgct 4680

gccagaaact gcctcttgac ctgtccaggc cctggaagag tggccaagat tggagacttc 4740

gggatggccc gagacatcta cagggcgagc tactatagaa agggaggctg tgccatgctg 4800

ccagttaagt ggatgccccc agaggccttc atggaaggaa tattcacttc taaaacagac 4860

acatggtcct ttggagtgct gctatgggaa atcttttctc ttggatatat gccatacccc 4920

agcaaaagca accaggaagt tctggagttt gtcaccagtg gaggccggat ggacccaccc 4980

aagaactgcc ctgggcctgt ataccggata atgactcagt gctggcaaca tcagcctgaa 5040

gacaggccca actttgccat cattttggag aggattgaat actgcaccca ggacccggat 5100

gtaatcaaca ccgctttgcc gatagaatat ggtccacttg tggaagagga agagaaagtg 5160

cctgtgaggc ccaaggaccc tgagggggtt cctcctctcc tggtctctca acaggcaaaa 5220

cgggaggagg agcgcagccc agctgcccca ccacctctgc ctaccacctc ctctggcaag 5280

gctgcaaaga aacccacagc tgcagagatc tctgttcgag tccctagagg gccggccgtg 5340

gaagggggac acgtgaatat ggcattctct cagtccaacc ctccttcgga gttgcacaag 5400

gtccacggat ccagaaacaa gcccaccagc ttgtggaacc caacgtacgg ctcctggttt 5460

acagagaaac ccaccaaaaa gaataatcct atagcaaaga aggagccaca cgacaggggt 5520

aacctggggc tggagggaag ctgtactgtc ccacctaacg ttgcaactgg gagacttccg 5580

ggggcctcac tgctcctaga gccctcttcg ctgactgcca atatgaagga ggtacctctg 5640

ttcaggctac gtcacttccc ttgtgggaat gtcaattacg gctaccagca acagggcttg 5700

cccttagaag ccgctactgc ccctggagct ggtcattacg aggataccat tctgaaaagc 5760

aagaatagca tgaaccagcc tgggccctga gctcggtcgc acactcactt ctcttccttg 5820

ggatccctaa gaccgtggag gagagagagg caatggctcc ttcacaaacc agagaccaaa 5880

tgtcacgttt tgttttgtgc caacctattt tgaagtacca ccaaaaaagc tgtattttga 5940

aaatgcttta gaaaggtttt gagcatgggt tcatcctatt ctttcgaaag aagaaaatat 6000

cataaaaatg agtgataaat acaaggccca gatgtggttg cataaggttt ttatgcatgt 6060

ttgttgtata cttccttatg cttctttcaa attgtgtgtg ctctgcttca atgtagtcag 6120

aattagctgc ttctatgttt catagttggg gtcatagatg tttccttgcc ttgttgatgt 6180

ggacatgagc catttgaggg gagagggaac ggaaataaag gagttatttg taatgactaa 6240

Claims (9)

1.一种基因融合的微流控检测设备，融合基因包括相互连接的片段A和片段B，片段A和片段B分别位于融合位置上游和下游，所述片段B为野生型基因的一个DNA片段，野生型基因还包括片段B’，片段B’和片段B相互连接且分别位于断裂位点上游和下游，其特征在于，检测设备包括微流控芯片、捕获链、探针和PCR反应体系；

微流控芯片包括功能化的基板和微通道板，微通道板包括第一表面和与第一表面相对的第二表面，微通道板的第一表面上设置有至少两条不交叉的凹槽，在凹槽的两端设有贯穿第一表面和第二表面的通孔；微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合，微通道板和基板之间形成供流体流通的微通道阵列，微通道阵列由至少两条不交叉微通道组成，微通道板和基板之间可拆卸；所述功能化的基板为表面具有醛基化修饰的基板；

捕获链包括第一捕获链和第二捕获链，第一捕获链与片段A的正义链互补，第二捕获链与片段B’的正义链互补；捕获链由如下方法固定在基板上：将微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合，第一次形成微通道阵列，第一次形成的微通道阵列中的微通道包括Ⅰ类微通道和Ⅱ类微通道两部分；将含第一捕获链的溶液注入Ⅰ类微通道，并将含第二捕获链的溶液注入Ⅱ类微通道，使捕获链固定在基板上，在基板上形成捕获链条带，然后将微通道板从基板上拆卸；

PCR反应体系包括第一PCR反应体系和第二PCR反应体系，第一PCR反应体系用于获得第一PCR产物，第二PCR反应体系用于获得第二PCR产物；

第一PCR反应体系包括第一引物对，第二PCR反应体系包括第二引物对；第一引物对用于扩增融合基因片段，融合基因片段由相互连接的片段A和片段B组成；第二引物用于扩增野生型基因片段，野生型基因片段由相互连接的片段B和片段B’组成；

在基板上形成捕获链条带之后，第一PCR产物和第二PCR产物均用于与捕获链接触；第一PCR产物或第二PCR产物由如下方式与捕获链接触：将微通道板的第一表面与固定有捕获链条带的基板密封接合，第二次形成微通道阵列，第二次形成的微通道阵列中的微通道与捕获链条带之间形成交叉，交叉点为检测位点；在第二次形成的微通道阵列的微通道中注入单链化的第一PCR产物和/或单链化的第二PCR产物；第二次形成的微通道阵列的微通道包括Ⅰ’类微通道和Ⅱ’类微通道两部分；

探针为连接有报告分子的单链DNA，包括第一探针和第二探针；第一探针与片段A的正义链互补，第一探针同片段A的结合区域和第一捕获链同片段A的结合区域相异，第二探针与片段B的正义链互补；探针用于确认已被捕获链所捕获的靶片段，探针由如下方式与靶片段结合：首先，单链化的第一PCR产物和/或单链化的第二PCR产物均与捕获链在微通道中接触并充分反应；然后，在Ⅰ’类微通道中注射入第一探针，并在Ⅱ’类微通道注射入第二探针，使第一探针与第一捕获链所捕获的片段A的正义链接触，并使第二探针与第一捕获链或第二捕获链所捕获的片段B的正义链接触。

2.根据权利要求1所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，所述第二探针的两端的碱基均为G；所述捕获链的3’端通过间隔物连接有氨基。

3.根据权利要求2所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，第一引物对包括第一正向引物和第一反向引物，在第一PCR反应体系中第一正向引物的用量大于第一反向引物的用量；第二引物对包括第二正向引物和第二反向引物，在第二PCR反应体系中第二正向引物的用量大于第二反向引物的用量。

4.根据权利要求3所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，所述微通道板的材料为聚二甲基硅氧烷。

5.根据权利要求4所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，所述基板为载玻片。

6.根据权利要求5所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，所述探针中的报告分子为生物素。

7.根据权利要求1-6中任一项权利要求所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，所述片段A为人类EML4基因的一个DNA片段，所述野生型基因为人类ALK基因，所述片段B和片段B’的连接位置在ALK基因上的第20外显子上。

8.根据权利要求7所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，所述融合基因为EML4-ALK融合基因变异体1，EML4-ALK融合基因变异体1由EML4的第1-13外显子和ALK的第20-29外显子融合形成。

9.根据权利要求8所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，

第一捕获链为：5’-CTCCACCTGAGTCTCCA-3’-C₆-NH₂；

第二捕获链为：5’-GTCACCACAGAGAGGATCA-3’-C₆-NH₂；

第一探针为：Biotin-5’-CTCTACAGTAGTTTTGCTCC-3’；

第二探针为：Biotin-5’-GGCTTGCAGCTCCTG-3’；

第一正向引物为：5’-TGGAGACTCAGGTGGAG-3’；

第二正向引物为：5’-TGATCCTCTCTGTGGTGAC-3’；

第一反向引物和第二反向引物均为：5’-ATGGCTTGCAGCTCC-3’；

其中，Biotin为在序列的5’端使用生物素修饰；-C₆-NH₂为在序列的3’端通过C₆间隔物连接NH₂。