KR102062565B1

KR102062565B1 - 핵산의 검출 방법 및 핵산 검출 키트

Info

Publication number: KR102062565B1
Application number: KR1020147025234A
Authority: KR
Inventors: 후미오 나카무라; 요지 우에다; 다카후미 아리케
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2020-01-06
Also published as: JP6337470B2; CA2877236C; EP2865764B1; CA2877236A1; CN104271771A; KR20150031219A; EP2865764A4; US20150322483A1; EP2865764A1; BR112014032072A2; WO2013191197A1; US10443085B2; JPWO2013191197A1

Abstract

후염법(後染法)에서의 표지화 공정에 있어서 포획 프로브에 하이브리다이징한 표적 핵산의, 지지체로부터의 탈리(脫離)를 억제하고, 나트륨 이온을 사용하는 방법보다 저농도로 또한 동등 이상의 감도로 표적 핵산을 검출할 수 있는 핵산의 검출 방법이 개시되어 있다. 표적 핵산의 검출 방법은, (1) 포획 프로브와 표적 핵산을 하이브리다이징시켜 이중가닥 핵산을 형성하는 공정과, 형성된 이중가닥 핵산을, 표지체 및 농도 10 mM 이상의 2가의 금속 양이온을 포함하는 용액과 접촉시켜, 상기 이중가닥 핵산에 상기 표지체를 도입하는 공정과, 상기 이중가닥 핵산에 도입된 상기 표지체를 검출하는 공정을 포함한다.

Description

핵산의 검출 방법 및 핵산 검출 키트{METHOD FOR DETECTING NUCLEIC ACID AND NUCLEIC ACID DETECTION KIT}

본 발명은, 포획 프로브와 핵산의 하이브리다이제이션을 이용한 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.

각종 생물의 유전 정보 해석의 연구가 시작되고 있고, 인간 유전자를 비롯하여, 다수의 유전자와 그 염기 서열, 또한 유전자 서열에 코딩되는 단백질 및 이들 단백질로부터 2차적으로 만들어지는 당쇄에 대한 정보가 급속하게 밝혀지고 있다. 서열이 밝혀진 유전자, 단백질, 당쇄 등의 생체 고분자의 기능에 대해서는, 다양한 방법으로 조사할 수 있다. 주요한 것으로서는, 핵산에 대하여는 노던 블로팅, 또는 서던 블로팅과 같은, 각종 핵산/핵산 사이의 상보성(相補性)을 이용하여 각종 유전자와 그 생체 기능 발현의 관계를 조사할 수 있다. 단백질에 대해서는, 웨스턴 블로팅으로 대표되는, 단백질-단백질 사이의 반응을 이용하여 단백질의 기능 및 발현에 대하여 조사할 수 있다.

특히, 유전자 진단이나 병원균의 특정, 또는 일염기다형의 검출 등, 조사하고자하는 핵산(표적 핵산)을 검출하는 목적에는, 핵산으로 이루어지는 포획 프로브가 사용된다. 최근, 다수의 포획 프로브를 지지체에 고정한 DNA 칩이나 DNA 마이크로 어레이를 사용하여, 복수 종류의 표적 핵산의 동시 검출에 사용되고 있다. 구체적으로는, 지지체에 고정화된 포획 프로브와 표적 핵산을 접촉시켜, 포획 프로브와 표적 핵산과의 하이브리다이제이션의 유무에 의한 상보성을 조사함으로써 표적 핵산의 서열을 조사할 수 있다. 표적 핵산의 하이브리다이제이션은, 예를 들면, 표적 핵산에 표지체를 도입하고, 포획 프로브와 접촉한 후에, 그 표지체의 시그널을 검출하는 방법이 일반적으로 사용되고 있다.

표적 핵산로의 표지체의 도입 방법으로서, 포획 프로브와 하이브리다이징시키기 전에 도입하는 방법과, 하이브리다이제이션 후에 도입하는 방법이 있다. 이 중에서, 후자는 후염법(後染法)으로 불리우고, 하이브리다이징한 표적 핵산과 표지체를 접촉시켜 표지체를 도입하는 방법이며, 하이브리다이제이션 후에 표지체를 결합시키기 때문에, 비교적 큰 사이즈의 표지체를 사용할 수 있고, 또한, 검출 시그널 증폭을 위해 표지화 공정을 반복적으로 행할 수 있다(특허 문헌 1, 2). 그리고, 후염법의 표지화 공정에서는, 500∼1000 mM 정도의 고농도의 나트륨 이온 등의 1가의 금속 양이온을 함유하는 표지액을 사용하는 것이 알려져 있다.

한편, 2가의 금속 양이온은 각종 핵산 분해 효소를 활성화하는 물질인 것으로 알려져 있으므로, 하이브리다이제이션을 이용하는 핵산의 검출 방법 시에 적극적으로 사용하는 것은 기피되고 있으며, 후염법의 표지화 공정에 있어서도 2가의 금속 양이온을 사용하는 기술 사상은 알려져 있지 않다.

일본공개특허 제2011-188837호 공보 일본공개특허 제2003-52383호 공보

후염법에 의한 표적 핵산의 표지화에서는, 표적 핵산에 도입되지 않았던 표지체를 세정·제거할 필요가 있지만, 본 발명자가 종래의 후염법에 의한 지지체에 고정화한 포획 프로브에 하이브리다이징한 표적 핵산의 표지화에 대하여 검증한 결과, 표적 핵산으로 표지체를 도입 시 또는 표적 핵산에 도입되지 않았던 표지체를 세정·제거할 때 포획 프로브에 하이브리다이징한 표적 핵산이 박리하여 떨어지고, 그 결과, 검출 시그널이 저감되는 문제점이 발견되었다.

또한, 본 발명자가 검토한 결과, 종래의 표지액에 포함되는 500∼1000 mM 정도의 고농도 나트륨 이온에 의해 표적 핵산이 박리하여 떨어지는 것을 어느 정도 억제할 수 있는 것을 발견하였지만, 시약량의 삭감이나 검출 감도 향상의 관점에서 나트륨 이온보다 저농도에서 표적 핵산이 박리하여 떨어지는 것을 동등 이상으로 억제할 수 있도록 하는 물질을 찾아내는 것이 과제였다.

즉, 본 발명의 목적은, 나트륨 이온 외에 후염법에서의 표지화 공정에 있어서 포획 프로브에 하이브리다이징한 표적 핵산의, 지지체로부터의 탈리(脫離)를 억제하도록 하는 물질을 발견하고, 나트륨 이온보다 저농도에서 또한 동등 이상의 감도로 표적 핵산을 검출할 수 있는 핵산의 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는 예의(銳意) 연구한 결과, 포획 프로브에 하이브리다이징한 표적 핵산의 표지화 공정에 있어서, 핵산의 하이브리다이제이션 공정에 있어서 기피되고 있던 2가의 금속 양이온을 포함하는 용액을 사용함으로써, 표적 핵산에 도입되지 않았던 표지체의 세정·제거 시의 표적 핵산의 탈리를 억제할 수 있고, 그 결과, 나트륨 이온을 사용하는 경우와 비교하여, 검출 시그널을 동등 이상으로 할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 하기의 (1)∼(13)으로 구성된다.

(1) 포획 프로브와 표적 핵산을 하이브리다이징시켜 이중가닥 핵산을 형성하는 공정과,

형성된 이중가닥 핵산을, 표지체 및 농도 10 mM 이상의 2가의 금속 양이온을 포함하는 용액과 접촉시켜, 상기 이중가닥 핵산에 상기 표지체를 도입하는 공정과,

상기 이중가닥 핵산에 도입된 상기 표지체를 검출하는 공정을 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.

(2) 상기 포획 프로브가 지지체에 고정화되어 있는, (1)에 기재된 방법.

(3) 상기 2가의 금속 양이온이 마그네슘 이온, 아연 이온, 망간 이온 및 칼슘 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1 종류인, (1) 또는 (2)에 기재된 방법.

(4) 상기 용액 중의 2가의 금속 양이온 농도가 50 mM 이상인, (1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(5) 상기 표지체가 형광체인, (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(6) 상기 표적 핵산으로의 상기 표지체의 도입이, 아비딘-비오틴 상호작용을 이용하여 행해지는, (1)∼(5) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(7) 상기 표적 핵산이 비오틴화되어 있고, 상기 표지체의 도입은, 표지 아비딘 또는 표지 스트렙토아비딘과 상기 표적 핵산 상의 비오틴을 상호작용시킴으로써 행해지는 (6)에 기재된 방법.

(8) 상기 표적 핵산으로의 표지체의 도입이, 상기 하이브리다이징한 이중가닥 핵산과 항원 항체 반응하는 표지된 항체 또는 그 항원 결합성 단편을, 상기 이중가닥 핵산과 항원 항체 반응시킴으로써 행해지는 (1)∼(5) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(9) 상기 포획 프로브와, 상기 표적 핵산을 하이브리다이징시키는 공정에 있어서는, 상기 포획 프로브는 지지체에 고정되어 있지 않은 유리(遊離) 상태에 있어, 상기 포획 프로브와 상기 표적 핵산이 하이브리다이징한 이중가닥 핵산을 지지체에 고정화하는, (1), (3)∼(7) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(10) 상기 이중가닥 핵산의 상기 지지체로의 고정화는, 상기 이중가닥 핵산과 항원 항체 반응하는, 지지체 상에 고정화된 항체 또는 그 항원 결합성 단편과 상기 이중가닥 핵산을 항원 항체 반응시킴으로써 행해지는 (9)에 기재된 방법.

(11) 포획 프로브 및 농도 10 mM 이상의 2가의 금속 양이온을 포함하는 시약을 포함하는, 핵산 검출 키트.

(12) 포획 프로브를 고정한 지지체 및 농도 10 mM 이상의 2가의 금속 양이온을 포함하는 시약을 포함하는, 핵산 검출 키트.

(13) 2가의 금속 양이온을 포함하는 상기 시약이, 상기 2가의 금속 양이온과 표지체를 포함하는 (11) 또는 (12)에 기재된 키트.

본 발명에 의하면, 포획 프로브에 하이브리다이징한 표적 핵산을 고감도로, 또한 양호한 재현성으로 검출할 수 있다.

본 발명의 검출 방법에 제공되는 표적 핵산으로서는, 예를 들면, 병원균이나 바이러스 등의 유전자나, 유전병의 원인 유전자 등 및 그 일부분 등이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 이들 표적 핵산을 포함하는 검체로서는, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 변, 골수액, 타액, 닦은 액, 각종 조직액 등의 체액이나, 각종 조직, 파라핀 포매 검체(FFPE) 및 그 절편, 각종 음식물 및 이들 희석물 등을 예로 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 피검 물질이 되는 표적 핵산은, 혈액이나 세포로부터 통상적인 법에 의해 추출한 핵산일 수도 있고, 검체로부터 추출한 DNA나 RNA 등을 사용할 수 있다. DNA로서는, 표지화 DNA, 바이러스 DNA, 세균, 곰팡이 등의 DNA, RNA를 역전사한 cDNA, 이들 중 일부인 단편 등을 사용할 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다. RNA로서는, 메신저 RNA(mRNA), 리보솜 RNA(rRNA), small RNA나 이들 중 일부인 단편 등을 사용할 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 화학적으로 합성한 DNA, 또는 RNA 등도 표적 핵산으로서 사용할 수 있다.

지지체는 슬라이드 유리나 수지 기판, 멤브레인(membrane), 비즈(beads) 등을 사용할 수 있다. 지지체의 재질은, 특별히 한정되지 않지만, 유리, 세라믹, 실리콘 등의 무기 재료, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 아세트산 셀룰로오스, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 실리콘 고무 등의 폴리머 등을 예로 들 수 있다.

포획 프로브란, 피험 시료에 포함되는 표적 핵산과 직접적으로, 선택적으로 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 표적 핵산을 검출하는 방법에 있어서는, 구체적으로는 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid), ENA(EthyleneBridged Nucleic Acid) 등의 핵산 유도체를 사용할 수 있다. 여기서 유도체란, 핵산의 경우, 형광체 등에 의한 표지화 유도체, 변형 뉴클레오티드(예를 들면, 할로겐, 메틸 등의 알킬, 메톡시 등의 알콕시, 티오, 카르복시메틸 등의 기를 포함하는 뉴클레오티드 및 염기의 재구성, 이중 결합의 포화, 탈아미노화, 산소 분자의 유황 분자로의 치환 등에 의해 변형된 뉴클레오티드 등)를 포함하는 유도체 등의 화학적으로 변형된 유도체를 의미한다.

특정한 염기 서열을 가지는 단일가닥 핵산은, 상기 염기 서열 또는 그 일부와 상보적인 염기 서열을 가지는 단일가닥 핵산과 선택적으로 하이브리다이제이션하여 결합하는 것으로, 본 발명에서 일컫는 포획 프로브에 해당한다. 본 발명에 사용하는 포획 프로브는, 시판 중인 것일 수도 있고, 또한, 살아있는 세포 등으로부터 얻어진 것일 수도 있다. 포획 프로브로서, 특히 바람직한 것은, 핵산이다. 이 핵산 중에서도, 올리고 핵산과 같은, 길이가 200 염기까지의 핵산은, 합성기로 인공적으로 용이하게 합성할 수 있다.

지지체에 포획 프로브를 고정화하는 방법으로서는, 지지체 상면부에서 포획 프로브를 합성하는 방법과, 사전에 합성해 둔 포획 프로브를 지지체 상면부에 적하 하여 고정시키는 방법이 알려져 있다. 지지체 상면부에서 포획 프로브를 합성하는 방법으로서는, Ronald 등의 방법(미국 특허 제5705610호 명세서), Michel 등의 방법(미국 특허 제6142266호 명세서), Francesco 등의 방법(미국 특허 제7037659호 명세서)이 있다. 이들 방법에서는 포획 프로브 합성 반응 시에 유기용매를 사용하므로, 담체는 유기용매에 대하여 내성이 있는 재질인 것이 바람직하고, 예를 들면, 일본특표 평10-503841호 공보에 기재된 방법을 사용하여 제작한 요철(凹凸) 구조를 가진 유리 지지체를 사용할 수 있다. 특히 Francesco 등의 방법에 있어서는 지지체의 이면(裏面)으로부터 광을 조사(照射)하여, 포획 프로브의 합성을 제어하므로, 지지체는 투광성을 가지는 재질인 것이 바람직하다. 포획 프로브를 지지체 상면부에 적하하여 고정시키는 방법으로서는, 히로타 등의 방법(일본 특허 제3922454호 명세서)이나 유리 캐필러리(capillary)를 사용할 수 있다. 유리 캐필러리의 일례로서는, 자작한 유리 캐필러리나 마이크로 피펫(pipet)(가부시키가이샤 마이크로 서포트 제조, MP-005) 등의 시판 제품을 사용할 수 있지만, 이들 방법으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명은, 포획 프로브와 표적 핵산을 하이브리다이징시키는 것에 의한 핵산의 검출 방법에 있어서, 포획 프로브에 하이브리다이징한 핵산을, 표지체 및 2가의 금속 양이온을 포함하는 용액과 접촉시킴으로써, 상기 하이브리다이징한 핵산에 표지체를 도입하는 것을 특징으로 한다. 이하, 하이브리다이제이션 공정과 표지체의 도입 공정에 대하여 설명한다.

포획 프로브와 표적 핵산의 하이브리다이제이션은, 그 자체를 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 포획 프로브와 표적 핵산의 하이브리다이제이션 시의 엄격함은, 온도, 염 농도, 프로브의 쇄 길이, 프로브의 뉴클레오티드 서열의 GC 함량 및 하이브리다이제이션 완충액 중의 카오트로픽제(chaotropic agent)의 농도 함수인 것이 알려져 있고, 예를 들면, Sambrook, J. et al.(1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에 기재된 조건 등을 사용할 수 있다. 엄격한 온도 조건은, 약 30℃ 이상이며, 통상, 10℃∼70℃ 정도이다. 그 외의 조건으로서는, 하이브리다이제이션 시간, 세정제(예를 들면, 도데실 황산 나트륨(SDS)의 농도, 및 캐리어(carrier) DNA의 존부(存否) 등이며, 이들 조건을 조합함으로써, 다양한 엄격함을 설정할 수 있다. 당업자는, 원하는 표적 핵산의 검출을 위해 준비한 포획 프로브로서의 기능을 얻기 위한 조건을 적절하게 결정하면 된다.

포획 프로브와 표적 핵산의 하이브리다이제이션은, 포획 프로브를 지지체에 고정화한 상태에서 행할 수도 있고, 또한, 하이브리다이제이션 후에 지지체에 고정화할 수도 있다. 하이브리다이제이션 후의 포획 프로브의 고정화 방법으로서, 예를 들면, 표적 핵산과 형성한 이중가닥에 특이적으로 결합하거나(항원 항체 반응함), 고상화한 항체 또는 그 항원 결합성 단편(Fab 단편이나 F(ab')₂ 단편) 등을 사용하여 행할 수 있다(하기 실시예 참조).

포획 프로브와 하이브리다이징한 표적 핵산으로의 표지체의 도입 방법은, 그 자체가 주지의 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면, 표적 핵산에 표지체와 2가의 금속 양이온을 포함하는 용액을 접촉시킨 후 화학 반응이나 효소 반응이나 핵산 하이브리다이제이션 등으로 표지체를 도입하는 방법이나, 표적 핵산에 반응성 관능기를 화학 반응이나 효소 반응이나 핵산 하이브리다이제이션 등으로 도입하고, 그 관능기에 표지체와 2가의 금속 양이온을 포함하는 용액을 접촉시킨 후 표지체의 관능기와 반응시켜 도입하는 방법을 예로 들 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산에 효소 반응으로 아미노기를 가지는 핵산을 도입하고, 그 아미노기와 반응하는 숙신이미드기를 가지는 표지체와 반응시킴으로써, 표지체를 도입하는 것이 가능하다. 또한, 동일한 방법으로 비오틴을, 표적 핵산을 포함하는 이중가닥 핵산에 도입하고, 표지 한 아비딘 또는 스트렙토아비딘과 접촉시킴으로써, 아비딘-비오틴 반응을 통하여 표지체의 도입이 가능하게 된다. 또한, 표적 핵산과 프로브 핵산의 하이브리다이제이션에 의해 형성한 이중가닥 부분에 삽입하는 인터칼레이터형의 표지체를 접촉시킴으로써, 표지체를 도입할 수 있다. 또한, 이중가닥과 항원 항체 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편(Fab 단편이나 F(ab')₂ 단편) 등을 사용하여 행할 수 있다(하기 실시예 참조).

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 표지체로서는, 유기 형광 색소, 인광 색소, 양자 도트, 형광 단백질 등의 형광체나 방사성 동위체, 전자의 수수(授受)가 가능한 산화 환원종, 또한, 알칼리포스파타아제나 호스래디시퍼옥시다제 등의 효소가 결합한 것을 사용할 수 있다. 또한, 이들 표지체 중, 검출의 감도면이나 간편성을 고려하여 형광체를 바람직하게 사용할 수 있다.

유기 형광 색소로서는, 시아닌(시아닌 2), 아미노메틸쿠마린, 플루오로세인, 인도카르보시아닌(시아닌 3), 시아닌 3.5, 테트라메틸로다민, 로다민레드, 텍사스 레드, 인도카르보시아닌(시아닌 5), 시아닌 5.5, 시아닌 7, 오이스터, BODIPY계 색소 등을 들 수 있다. 또한, 인터칼레이터형 형광 색소로서는, 에티듐 브로마이드나 아크리딘 오렌지 등을 예로 들 수 있고, 형광성 단백질로서는, 피코에리트린(PE), 알로피코시아닌(APC), 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP) 등의 공지의 형광체를 예로 들 수 있다.

또한, 형광체로서 발광성을 가지는 반도체 미립자를 사용할 수도 있다. 이와 같은 반도체 미립자로서는, 예를 들면, 셀렌화 카드뮴(CdSe), 황화 카드뮴(CdS), 텔루르화 카드뮴(CdTe), 인듐 갈륨인(InGaP), 칼코파이라이트(chalcopyrite)계 미립자, 실리콘(Si) 등이 있다. 형광 시그널의 검출은, 형광 현미경이나 형광 스캐너 등에 의해 행할 수 있다.

후술하는 바와 같이, 이중가닥 핵산으로의 표지체 도입 후에는, 이중가닥 핵산에 도입되지 않았던 표지체를 세정·제거할 필요가 있고, 표지체의 세정·제거 시에 표지체가 도입된 이중가닥 핵산으로부터의 표적 핵산의 탈리를 억제하는 것이 검출 감도의 향상의 관점에서 중요하지만, 본 발명에서는, 표지체와 2가의 금속 양이온을 포함하는 용액을 사용하여 표지체를 도입함으로써, 표지체의 세정·제거에 의한 표적 핵산의 탈리를 현저하게 억제하는 것이 가능하게 된다.

2가의 금속 양이온이란, 용액 중에서 2개의 전자를 방출하여 2가의 양이온이 될 수 있는 원소·착체를 의미하고, 베릴륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 스트론튬 이온, 바륨 이온, 라듐 이온 등의 알칼리 토류 금속 이온이나 망간 이온, 코발트 이온, 아연 이온 등의 천이 금속으로 이루어지는 단원자 이온, 또한, 티오시아노 철(III) 이온, 테트라아민아연(II) 이온, 헥사아민니켈(II) 이온 등의 착체 이온을 예로 들 수 있다. 그 중에서도 물에 대한 용해성이나 환경 부하를 고려하면, 마그네슘 이온, 아연 이온, 망간 이온 및 칼슘 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1 종류 이상이 바람직하고, 이중가닥 핵산에 대한 결합 안정성을 고려하면 마그네슘 이온, 망간 이온이 특히 바람직하다.

전술한 용액 중의 2가의 금속 양이온 농도는 10 mM 이상이지만, 핵산의 검출 시그널 강도의 관점에서 50 mM 이상이 바람직하고, 100 mM 이상이 더욱 바람직하다. 또한, 시약량 삭감 및 용액 중에서의 금속 양이온의 석출에 의한 노이즈 증가를 고려하면, 500 mM 미만으로 하는 것이 바람직하다.

다음으로, 이중가닥 핵산에 도입되지 않았던 표지체를 세정 제거하는 것이 바람직하다. 이 세정 제거 공정 자체는 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 계면활성제(바람직하게는 Tween(상품명) 시리즈 등의 비이온성 계면활성제)를 포함하는 완충액(예를 들면, SSC 등의 시트르산 완충액)을 세정액로서 사용하고, 하이브리다이제이션의 온도보다 통상 3℃∼10℃ 정도 저온에서, 1분간∼10분간 세정을 행할 수 있다.

다음으로, 이중가닥 핵산에 도입된 표지체를 검출한다. 검출 공정 자체는 주지의 방법에 의해 행할 수 있고, 이중가닥 핵산에 도입된 표지체의 시그널을 검출함으로써 가능하게 된다. 검출된 시그널은, 주변 노이즈와 비교된다. 구체적으로는, 포획 프로브가 고정되어 있는 위치로부터 얻어진 시그널 값과, 그 이외의 위치로부터 얻어진 시그널 값을 비교하고, 전자의 수치가 웃돌고 있는 경우에 표적 핵산이 검출된 것으로 한다. 시그널 값의 측정은, 각 표지에 대하여 주지의 방법에 의해 행할 수 있고, 이를 위한 장치도 다양하게 시판되고 있으므로, 시판 중인 측정 장치를 사용하여 용이하게 행할 수 있다. 예를 들면, 표지가 형광 표지인 경우에는, 시판 중인 DNA 칩 스캐너 등을 사용하여 용이하게 행할 수 있다. 그리고, 시그널 값을 측정함으로써, 표적 핵산의 정량(定量)도 가능하게 되는 경우가 있지만, 표적 핵산의 정량은, 필연적으로 표적 핵산의 검출을 수반하므로, 표적 핵산을 정량하는 경우에도, 본 발명의 검출 방법에 포함된다.

다음으로, 본 발명의 핵산의 검출 키트의 바람직한 실시형태에 대하여 설명한다. 본 발명의 핵산의 검출 키트는, 적어도 포획 프로브 및 2가의 금속 양이온을 포함하는 시약을 구비하고 있다. 2가의 금속 양이온을 포함하는 상기 시약은, 상기 2가의 금속 양이온과 표지체를 포함하는 시약인 것이 바람직하다. 또한, 포획 프로브는 지지체에 고정화되어 있어도 된다. 본 발명의 검출 키트에 포함되는 포획 프로브를 고정화한 지지체는, 상기 포획 프로브를 상기 지지체에 고정화한 것이다. 또한, 본 발명의 키트에 포함되는 2가의 금속 양이온을 포함하는 시약은 건조 상태일 수도 있고 용액 상태일 수도 있으며, 건조 상태인 경우는 그것을 용해하는 용매가 포함될 수 있다. 그 외에, 본 발명의 검출 키트에 포함될 수 있는 시약으로서는, 상기 표지체를 포함하는 시약, pH 조정용 시약, 계면활성화제, 표지체의 지지체로의 흡착 방지를 위한 단백질이나 핵산을 포함하는 시약 등을 예로 들 수 있고, 이들은 건조 상태일 수도 있고 용액 상태일 수도 있으며, 각각 독립된 시약일 수도 있고, 적절하게 혼합된 시약일 수도 있으며, 건조 상태인 경우는 이들을 용해하는 용매가 포함될 수 있다.

본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 의해 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

(1) DNA 칩의 제작

포획 프로브는 5' 말단에 아미노기 수식한 올리고 DNA를 오페론사에 위탁하여 합성하였다. 표 1에 포획 프로브의 염기 서열을 나타낸다. 이 포획 프로브를 도레이 가부시키가이샤에서 제조한 "3D-Gene" 기판(256주 기판)에 고정하여, 평가용 DNA 칩으로서 사용하였다.

(2) 표적 핵산의 조제

표적 핵산으로서, 포획 프로브와 상보적인 서열을 가지고, 5' 말단에 비오틴을 도입한 30 염기의 올리고 DNA(표 1)를 오페론사에 위탁하여 합성하였다. 표 1에 표적 핵산의 염기 서열을 나타낸다. 상기 올리고 DNA를 200 fmol/l이 될 때까지 1×하이브리다이제이션 용액(후술함)으로 희석하여 검체 DNA로 만들었다.

[표 1]

(3) 하이브리다이제이션

검체 DNA 5μl에 1×하이브리다이제이션 용액(1 중량% BSA(소 혈청 알부민), 5×SSC, 1 중량% SDS(도데실 황산 나트륨), 50 ng/ml 연어 정자 DNA의 용액, 5 중량% 덱스트란 황산나트륨, 30% 포름아미드)을 35μl 가하여, 하이브리다이제이션 용액으로 만들었다. 전체량을 DNA 칩에 주입하고, 32℃로 가온한 인큐베이터에 세팅하였다. 하이브리다이제이션은, "3D-gene"의 표준 프로토콜에 따라, 250 rpm으로 선회 교반하면서, 32℃에서 2시간 행하였다. 하이브리다이제이션 후, DNA 칩을 30℃로 가온한 세정액(0.5×SSC, 0.1 중량% SDS(도데실 황산나트륨)로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄약 주식회사)를 사용하여 건조하였다.

검체 DNA 표지화 시에 첨가하는 2가의 금속 양이온으로서, 마그네슘 이온을 첨가하였다. 1M의 염화 마그네슘6수화물을 검체 DNA 표지화를 위한 형광체 함유 완충액(50 ng/μl의 SAPE(스트렙토아비딘피코에리트린, 프로자임사 제조), 100 mM의 MES(2-모르폴리노에탄술폰산 나트륨), 0.05 중량%의 Tween20(상품명), 2 mg/ml의 BSA(소 혈청 알부민))에 첨가하여, 마그네슘 이온의 최종 농도가 각각 10, 20, 50, 100, 200, 300, 500 mM이 되도록 조정하여, 표지액으로 하였다. 그리고, MES 유래의 나트륨 이온 농도는 74 mM이었다. 이들 표지액을 DNA 칩 상에 적하하고, 35℃에서 5분간 인큐베이션했다. 30℃로 가온한 세정액(6×SSPE 완충액, 0.01 중량%의 Tween20(상품명))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄약 주식회사)를 사용하여 건조하였다. 표지가 종료된 DNA 칩은, DNA 칩 스캐너(도레이 가부시키가이샤 제조)를 사용하여 형광 시그널을 검출하였다. 스캐너의 설정은, 레이저 출력 100%, 포토 멀티플라이어의 전압 설정을 70%로 했다.

비교예 1

검체 DNA 표지화 시에 2가의 금속 양이온을 첨가하지 않고, 검체 DNA 표지화를 위한 형광체 함유 완충액(50 ng/μl의 SAPE(스트렙토아비딘피코에리트린, 프로자임사), 100 mM의 MES(2-모르폴리노에탄술폰산 나트륨), 0.05 중량%의 Tween20(상품명), 2 mg/ml의 BSA(소혈청 알부민))을 그대로 표지액으로 하였다. 그리고, MES 유래의 나트륨 이온 농도는 74 mM였다. 이 표지액을 DNA 칩 상에 적하하고, 35℃에서 5분간 인큐베이션했다. 30℃로 가온한 세정액(6×SSPE, 0.01 중량%의 Tween20(상품명))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄약 주식회사)를 사용하여 건조하고, 실시예 1과 동일한 조건 하에서 형광 시그널을 검출하였다.

참고예 1

소정량의 염화 나트륨을 형광체 함유 완충액(50 ng/μl의 SAPE(스트렙토아비딘피코에리트린, 프로자임사), 100 mM의 MES(2-모르폴리노에탄술폰산 나트륨), 0.05 중량%의 Tween20(상품명), 2 mg/ml의 BSA(소혈청 알부민))에 첨가한 용액을 준비하였다. 이 때, 나트륨 이온의 최종 농도가 500 또는 1000 mM가 되도록 조정하고, 표지액으로 하였다. 이들 표지액을 DNA 칩 상에 적하하고, 35℃에서 5분간 인큐베이션했다. 30℃로 가온한 세정액(6×SSPE, 0.01 중량%의 Tween20(상품명))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄약 주식회사)를 사용하여 건조하고, 실시예 1과 동일한 조건 하에서 형광 시그널을 검출하였다.

실시예 1, 비교예 1 및 참고예 1의 결과를 표 2에 나타내었다. 실시예 1과 비교예 1의 결과로부터, 검체 DNA의 표지화 시약에 마그네슘 이온을 첨가함으로써 검출 시그널이 상승하였다. 또한, 실시예 1과 참고예 1의 결과로부터, 검체 DNA의 표지화 시약에 마그네슘 이온을 첨가한 경우에는 나트륨 이온을 첨가한 경우보다 저농도에서 동등 이상의 검출 시그널이 관찰되었고, 특히, 마그네슘 이온의 농도가 50 mM 이상에서 검출 시그널이 대폭 개선되는 것을 알았다. 그리고, 포획 프로브가 고정화되어 있지 않은 스폿의 검출 시그널(노이즈)은 230∼270이었다.

[표 2]

참고예 2

(1) 이중가닥 DNA의 융해 온도(Tm) 측정

검체 DNA의 표지화 시에 2가의 금속 양이온을 첨가함으로써 검출 시그널이 개선되는 메카니즘으로서, 단지 하이브리다이제이션 시의 염 농도의 상승에 의해 포획 프로브와 검체 DNA의 하이브리다이제이션에 의해 형성되는 이중가닥 DNA의 안정성이 증가하는, 즉 단지 Tm의 상승에 의한 가능성이 예상되었다. 이에, 양이온 첨가 조건 하에서의 이중가닥 DNA의 이중가닥 안정성을 평가하기 위하여, 다양한 양이온 농도 하에서 이중가닥 DNA의 Tm을 측정하였다.

Tm 측정 용액은 100 mM의 MES 500μl에 1M의 염화 마그네슘6수화물 수용액을 첨가하여 마그네슘 이온의 최종 농도가 각각 0, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 500 mM이 되도록 조정한 것, 100 mM의 MES 그 자체, 100 mM의 MES 500μl에 5 M의 염화 나트륨을 첨가하고, 나트륨 이온의 최종 농도가 500, 1000 mM이 되도록 조정한 것을 준비하였다. 각각의 Tm 측정 용액에, 표 3에 기재된 1 mM의 올리고 1과 올리고 2(올리고 1과 올리고 2의 서열은 상보적임)의 합성 DNA를 최종 농도가 2μM이 되도록 첨가하여 이중가닥 DNA를 형성하였다. 측정 용액 중의 이중가닥 DNA의 Tm 측정은, Tm 해석 시스템(가부시키가이샤 시마즈 제작소 제조, TMSPC-8) 및 자외 가시 근적외 분광 광도계(가부시키가이샤 시마즈 제작소 제조, UV-1650PC)에 의해 행하였고, 8연(連) 마이크로 멀티 셀(광로 길이 10 ㎜)을 사용하여 측정(측정 온도 범위는 20∼95 ℃, 승온(昇溫) 속도는 1.0℃/min.)하여 얻어진 데이터를 해석 소프트웨어(우가부시키가이샤 시마즈 제작소 제조, Lab Solution)를 사용하여 적분법에 의해 결정했다.

[표 3]

다양한 양이온 농도 하에서의 Tm 측정의 결과를 표 4에 나타내었다. 이 결과로부터 마그네슘 이온을 첨가하고 있지 않은 경우와 비교하여, 마그네슘 이온을 첨가함으로써 Tm이 상승하고 있었지만, 마그네슘 이온의 농도가 10 mM 이상에서 거의 Tm이 변화하지 않으며, 또한, 나트륨 이온을 500 mM, 1000 mM을 첨가했을 때도, 마그네슘 이온을 10 mM 이상 첨가했을 때와 동등한 Tm인 것도 알았다. 즉, 2가의 금속 양이온을 첨가함으로써 이중가닥 DNA의 Tm값은 어느 정도 상승하지만, Tm값의 상승이 검출 시그널의 개선에 기여하는 것은 아닌 것으로 밝혀졌다.

[표 4]

실시예 2

검체 DNA 표지화 시에 첨가하는 2가의 금속 양이온으로서, 칼슘 이온, 망간 이온 또는 아연 이온을 첨가하였다. 1 M의 염화 칼슘 2수화물, 1 M의 염화 망간 수용액, 1 M의 염화 아연 수용액을 형광체 함유 완충액(50 ng/μl의 SAPE(스트렙토아비딘피코에리트린, 프로자임사), 100 mM의 MES(2-모르폴리노에탄술폰산 나트륨), 0.05 중량%의 Tween20(상품명), 2 mg/ml의 BSA(소혈청 알부민))에 첨가하여, 칼슘 이온, 망간 이온의 최종 농도가 각각 100 또는 500 mM이 되도록 조정한 것을 표지액으로 하였다. 이들 표지액을 DNA 칩 상에 적하하고, 35℃에서 5분간 인큐베이션했다. 30℃로 가온한 세정액(6×SSPE, 0.01 중량%의 Tween20(상품명))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄약 주식회사)를 사용하여 건조하고, 실시예 1과 동일한 조건 하에서 형광 시그널을 검출하였다.

검출 결과를 표 5에 나타내었다. 실시예 1에서의 마그네슘 이온과 마찬가지로, 칼슘 이온 또는 망간 이온을 첨가한 경우라도, 2가의 금속 양이온을 첨가하지 않는 경우(비교예 1)와 비교하여 검출 시그널이 개선되었다. 또한, 참고예 1에서 나타낸 나트륨 이온의 농도가 500 또는 1000 mM인 경우와 비교하여도 현저한 시그널 개선을 나타낸다. 그리고, 포획 프로브가 고정화되어 있지 않은 스폿의 검출 시그널(노이즈)은 230∼270이었다.

[표 5]

실시예 3

본 실시예에서는 2가 금속 양이온을 첨가하는 것에 의한 검출 시그널의 불균일의 검증을 행하였다. 검체 DNA 표지화 시에 첨가하는 2가의 금속 양이온으로서, 마그네슘 이온을 첨가하였다. 1 M의 염화 마그네슘6수화물을 검체 DNA 표지화를 위한 형광체 함유 완충액(50 ng/μl의 SAPE(스트렙토아비딘피코에리트린, 프로자임사), 100 mM의 MES(2-모르폴리노에탄술폰산 나트륨), 0.05 중량%의 Tween20(상품명), 2 mg/ml의 BSA(소혈청 알부민))에 첨가하여, 마그네슘 이온의 최종 농도가 100 mM이 되도록 조정하고, 표지액으로 하였다. 그리고, MES 유래의 나트륨 이온 농도는 74 mM였다. 이들 표지액을 DNA 칩 상에 적하하고, 35℃에서 5분간 인큐베이션했다. 30℃로 가온한 세정액(6×SSPE 완충액, 0.01 중량%의 Tween20(상품명))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄약 주식회사)를 사용하여 건조하였다. 표지가 종료된 DNA 칩은, DNA 칩 스캐너(도레이 가부시키가이샤 제조)를 사용하여 형광 시그널을 검출하였다. 스캐너의 설정은, 레이저 출력 100%, 포토 멀티플라이어의 전압 설정을 70%로 했다. DNA 칩 내의 검출 시그널의 편차의 지표 CV값을 표 6에 나타내었다. 그리고, CV값은, (4개의 스폿의 표준 편차)/(4개 스폿의 시그널 평균값)×100에 의해 산출하였다.

비교예 3

비교예 1과 동일한 방법으로 검체 DNA의 하이브리다이제이션 및 표지화를 행하였다. DNA 칩 내의 검출 시그널의 편차의 지표 CV값을 표 6에 나타내었다. CV값의 산출은 실시예 3과 동일한 방법에 의해 행하였다.

참고예 3

소정량의 염화 나트륨을 형광체 함유 완충액(50 ng/μl의 SAPE(스트렙토아비딘피코에리트린, 프로자임사), 100 mM의 MES(2-모르폴리노에탄술폰산 나트륨), 0.05 중량%의 Tween20(상품명), 2 mg/ml의 BSA(소혈청 알부민))에 첨가한 용액을 준비하였다. 이 때, 나트륨 이온의 최종 농도가 1000 mM이 되도록 조정하고, 표지액으로 하였다. 이들 표지액을 DNA 칩 상에 적하하고, 35℃에서 5분간 인큐베이션했다. 30℃로 가온한 세정액(6×SSPE, 0.01 중량%의 Tween20(상품명))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄약 주식회사)를 사용하여 건조하고, 실시예 1과 동일한 조건 하에서 형광 시그널을 검출하였다. DNA 칩 내의 검출 시그널의 편차의 지표 CV값을 표 6에 나타내었다. CV값의 산출은 실시예 3과 동일한 방법에 의해 행하였다.

표 6에서 마그네슘 100 mM을 첨가한 경우, 마그네슘을 첨가하지 않은 경우나 나트륨1000 mM을 첨가한 경우를 비교하여, CV값이 현저하게 개선되고 있는 것을 나타낸다. 즉 스폿 사이의 편차가 개선되어 있는 것을 나타낸다.

[표 6]

실시예 4, 비교예 4

본 실시예에서는, 지지체에 고정하고 있지 않은 포획 프로브에 표적 핵산이 하이브리다이징한, DNA·RNA 이중가닥을 표지하는 검출 시약 1에 염화 마그네슘을 첨가함으로써 검출 감도가 향상되는지에 대하여 검증했다. DNA·RNA 이중가닥을 형성함으로써 HPV(인간유두종 바이러스)를 검출하는 하이브리드 캡쳐 2(상품명, 키아겐사)를 사용하여 본 발명의 효과를 검증했다. 하이브리드 캡쳐 2(상품명)는, HPV의 DNA에, 상보 RNA를 하이브리다이징시킨 후, DNA·RNA 이중가닥을 인식하는 항체를 사용하여, 기재(基材) 상에 캡쳐(포착)한다. 나아가서는 표지 완료 DNA·RNA 이중가닥을 인식하는 항체를 결합시킴으로써 표지하고, 검출하는 원리이다. 표지 반응 시에 염화 마그네슘 용액을 첨가함으로써, 검출 감도가 향상되는지에 대하여 검증했다. 하이브리드 캡쳐 2(상품명)의 반응은, 첨부 매뉴얼에 따라서 실시하였다.

(1) 검체의 조제

검체 DNA로서, 인간유두종 바이러스의 게놈 DNA가 클로닝된 유전자 재조합 플라스미드 pHPV16을 휴먼 사이언스 연구 자원 뱅크로부터 구입하여 사용하였다. pHPV16은 전체 길이 16, 600 염기쌍이었다. pHPV16이 1 amol 포함되도록 조정한 검체 용액, 및 0.01 amol 포함되도록 조정한 검체 용액에, 검체 추출 시약 25μl를 첨가하였다. 보텍스 믹서(vortex mixer)로 교반한 후, 65℃로 설정한 워터 배스(water bath)에서 45분간 반응시켰다.

(2) 하이브리다이제이션

매뉴얼에 따라 조정한 프로브액 25μl에, 검체 75μl를 첨가하고, 로터리 쉐이커(1100 rpm)로 약 3분간 진탕 교반시켰다. 다음으로, 65℃의 하이브리다이제이션 오븐 내에서 60분간 반응시켰다.

(3) 하이브리드 캡쳐(상품명)

하이브리다이제이션 반응 용액 100μl를, 캡쳐 플레이트의 웰로 옮기고, 로터리 쉐이커(1,100 rpm)를 사용하여 25℃에서 60분간 진탕하여, 반응시켰다. 반응 후, 상청액을 제거하였다.

검출 반응

검출 시약 1(알칼리포스파타아제 표지 항DNA·RNA 복합체 마우스 모노클로날 항체) 75μl를 분주(分株)하고, 25℃에서 30분간 반응시켰다. 이 때, 검출 시약 1에 염화 마그네슘이 최종 농도 100 mM가 되도록 첨가한 것(Mg 있음)과 첨가하지 않은 것(Mg 없음)을 준비하고, 각각 반응에 사용하였다. 반응 후, 세정액으로 세정하고, 검출 시약 2(disodium 2-chloro-5-(4-methoxyspiro{1,2-dioxethane-3,2'-(5'-chloro)tricycle[3.3.11]decan}-4-yl)-1-phenyl phosphatase 용액)를 첨가하고, 25℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후, 발광량은 루미노미터를 사용하여 측정하였다. 검출 결과를 표 7에 나타내었다.

그 결과, 마그네슘을 첨가한 경우, 첨가하지 않은 경우와 비교하여, 발광 시그널이 향상되는 것을 알았다. 그리고, 동시에 측정한 음성 컨트롤군의 발광 시그널은 3730이었다. 이상과 같이, 하이브리드 캡쳐 2(상품명)의 검출 반응에 있어서, 마그네슘을 첨가하는 것이, 감도 향상에 유효한 것을 나타낸다.

[표 7]

[산업상 이용 가능성]

본 발명은, 유전자 진단이나 병원균의 특정, 또는 1염기 다형의 검출 등의 핵산의 검출에 이용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc. <120> Method for detection of nucleic acid, and kit for detection of nucleic acid <130> PF490-PCT <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> amino modified <400> 1 gtcattatgt gctgccatat ctacttcaga 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> biotinylated base <400> 2 tctgaagtag atatggcagc acataatgac 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 1 <400> 3 gtcattatgt gctgccatat ctacttcaga 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 2 <400> 4 tctgaagtag atatggcagc acataatgac 30

Claims

포획 프로브(capture probe)와 표적 핵산을 하이브리다이징시켜 이중가닥(double stranded) 핵산을 형성하는 공정;
형성된 이중가닥 핵산을, 표지체 및 농도 100 mM 내지 500 mM 의 2가의 금속 양이온을 포함하는 용액과 접촉시켜, 상기 이중가닥 핵산에 상기 표지체를 도입하는 공정; 및
상기 이중가닥 핵산에 도입된 상기 표지체를 검출하는 공정
을 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 포획 프로브가 지지체에 고정화되어 있는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 2가의 금속 양이온이 마그네슘 이온, 아연 이온, 망간 이온 및 칼슘 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1 종류인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표지체가 형광체인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 핵산으로의 상기 표지체의 도입이, 아비딘-비오틴 상호 작용을 이용하여 행해지는, 방법.
제5항에 있어서,
상기 표적 핵산이 비오틴화되어 있고, 상기 표지체의 도입은, 표지 아비딘 또는 표지 스트렙토아비딘과 상기 표적 핵산 상의 비오틴을 상호 작용시킴으로써 행해지는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 핵산으로의 표지체의 도입이, 상기 하이브리다이징한 이중가닥 핵산과 항원 항체 반응하는 표지된 항체 또는 그 항원 결합성 단편을, 상기 이중가닥 핵산과 항원 항체 반응시킴으로써 행해지는, 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 포획 프로브와, 상기 표적 핵산을 하이브리다이징시키는 공정에 있어서, 상기 포획 프로브는 지지체에 고정되어 있지 않은 유리(遊離) 상태에 있고, 상기 포획 프로브와 상기 표적 핵산이 하이브리다이징한 이중가닥 핵산을 지지체에 고정화하는, 방법.
제8항에 있어서,
상기 이중가닥 핵산의 상기 지지체로의 고정화는, 상기 이중가닥 핵산과 항원 항체 반응하는, 지지체 상에 고정화된 항체 또는 그 항원 결합성 단편과 상기 이중가닥 핵산을 항원 항체 반응시킴으로써 행해지는, 방법.
포획 프로브 및 농도 100 mM 내지 500 mM 의 2가의 금속 양이온을 포함하는 시약을 포함하는, 제1항의 핵산 검출 방법에 사용되는 핵산 검출 키트.
포획 프로브를 고정한 지지체 및 농도 100 mM 내지 500 mM 의 2가의 금속 양이온을 포함하는 시약을 포함하는, 제1항의 핵산 검출 방법에 사용되는 핵산 검출 키트.
제10항 또는 제11항에 있어서,
2가의 금속 양이온을 포함하는 상기 시약이, 상기 2가의 금속 양이온과 표지체를 포함하는, 키트.
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