JP6337470B2 - 核酸の検出方法および核酸検出キット - Google Patents
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Description
形成された二重鎖核酸を、標識体および濃度100mM以上の二価の金属カチオンを含む溶液と接触させて、該二重鎖核酸に該標識体を導入する工程と、
前記二重核酸に導入されなかった標識体を洗浄除去する工程と、
前記二重鎖核酸に導入された前記標識体を検出する工程とを含み、前記標識体が、核酸の後染め法に用いられる標識体である、標的核酸の検出方法。
(2)前記捕捉プローブが支持体に固定化されている、(1)に記載の方法。
(3)前記二価の金属カチオンがマグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオンおよびカルシウムイオンからなる群から選択される少なくとも1種類である、(1)または(2)に記載の方法。
(4)前記標識体が蛍光体である、(1)〜(3)のいずれか1項に記載の方法。
(5)前記標的核酸への前記標識体の導入が、アビジン−ビオチン相互作用を利用して行われる、(1)〜(4)のいずれか1項に記載の方法。
(6)前記標的核酸がビオチン化されており、前記標識体の導入は、標識アビジン又は標識ストレプトアビジンと前記標的核酸上のビオチンとを相互作用させることにより行われる(5)記載の方法。
(7)前記標的核酸への標識体の導入が、前記ハイブリダイズした二重鎖核酸と抗原抗体反応する標識された抗体又はその抗原結合性断片を、前記二重鎖核酸と抗原抗体反応させることにより行われる(1)〜(4)のいずれか1項に記載の方法。
(8)前記捕捉プローブと、前記標的核酸とをハイブリダイズさせる工程においては、前記捕捉プローブは支持体に固定されていない遊離の状態にあり、前記捕捉プローブと前記標的核酸とがハイブリダイズした二重鎖核酸を支持体に固定化する、(1)、(3)〜(6)のいずれか1項に記載の方法。
(9)前記二重鎖核酸の前記支持体への固定化は、該二重鎖核酸と抗原抗体反応する、支持体上に固定化された抗体又はその抗原結合性断片と前記二重鎖核酸とを抗原抗体反応させることにより行われる(8)記載の方法。
(1) DNAチップの作製
捕捉プローブは5’末端にアミノ基修飾したオリゴDNAをオペロン社にて委託合成した。表1に捕捉プローブの塩基配列を示す。この捕捉プローブを東レ株式会社製の“3D−Gene”基板(256柱基板)に固定して、評価用DNAチップとして用いた。
標的核酸として、捕捉プローブと相補的な配列を有し、5’末端にビオチンを導入した30塩基のオリゴDNA(表1)をオペロン社にて委託合成した。表1に標的核酸の塩基配列を示す。当該オリゴDNAを200fmol/lとなるまで1×ハイブリダイゼーション溶液(後述)で希釈して検体DNAとした。
検体DNA5μlに1×ハイブリダイゼーション溶液(1重量% BSA(ウシ血清アルブミン)、5×SSC、1重量% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、50ng/mlサケ精子DNAの溶液、5重量% デキストラン硫酸ナトリウム、30% フォルムアミド)を35μl加え、ハイブリダイゼーション溶液とした。全量をDNAチップに注入し、32℃で加温したインキュベータにセットした。ハイブリダイゼーションは、“3D−gene”の標準プロトコールに従い、250rpmで旋回撹拌をしながら、32℃で2時間行った。ハイブリダイゼーション後、DNAチップを30℃に加温した洗浄液(0.5×SSC、0.1重量% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム))で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー(和研薬)を用いて乾燥した。
検体DNA標識化の際に二価の金属カチオンを添加せず、検体DNA標識化のための蛍光体含有緩衝液(50ng/μl SAPE(ストレプトアビジンフィコエリスリン、プロザイム社)、100mM MES(2−モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩)、0.05重量% Tween20(商品名)、2mg/ml BSA(ウシ血清アルブミン))をそのまま標識液とした。なお、MES由来のナトリウムイオン濃度は74mMであった。この標識液をDNAチップ上に滴下し、35℃で5分間インキュベーションした。30℃に加温した洗浄液(6×SSPE、0.01重量% Tween20(商品名))で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー(和研薬)を用いて乾燥し、実施例1と同様の条件で蛍光シグナルを検出した。
所定量の塩化ナトリウムを蛍光体含有緩衝液(50ng/μl SAPE(ストレプトアビジンフィコエリスリン、プロザイム社)、100mM MES(2−モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩)、0.05重量% Tween20(商品名)、2mg/ml BSA(ウシ血清アルブミン))に添加した溶液を用意した。この際、ナトリウムイオンの終濃度が500または1000mMとなるように調整し、標識液とした。これら標識液をDNAチップ上に滴下し、35℃で5分間インキュベーションした。30℃に加温した洗浄液(6×SSPE、0.01重量% Tween20(商品名))で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー(和研薬)を用いて乾燥し、実施例1と同様の条件で蛍光シグナルを検出した。
(1) 二重鎖DNAの融解温度(Tm)測定
検体DNAの標識化の際に二価の金属カチオンを添加することによって検出シグナルが改善するメカニズムとして、単にハイブリダイゼーション時の塩濃度の上昇によって捕捉プローブと検体DNAのハイブリダイゼーションで形成される二重鎖DNAの安定性が増す、すなわち、単にTmが上昇することによるものである可能性が予想された。そこで、カチオン添加条件下での二重鎖DNAの二重鎖安定性を評価するため、様々なカチオン濃度下での二重鎖DNAのTmの測定を行った。
検体DNA標識化の際に添加する二価の金属カチオンとして、カルシウムイオン、マンガンイオンまたは亜鉛イオンを添加した。1M 塩化カルシウム二水和物、1M 塩化マンガン水溶液、1M 塩化亜鉛水溶液を蛍光体含有緩衝液(50ng/μl SAPE(ストレプトアビジンフィコエリスリン、プロザイム社)、100mM MES(2−モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩)、0.05重量% Tween20(商品名)、2mg/ml BSA(ウシ血清アルブミン))に添加して、カルシウムイオン、マンガンイオンの終濃度がそれぞれ100もしくは500mMとなるように調整したものを標識液とした。これら標識液をDNAチップ上に滴下し、35℃で5分間インキュベーションした。30℃に加温した洗浄液(6×SSPE、0.01重量% Tween20(商品名))で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー(和研薬)を用いて乾燥し、実施例1と同様の条件で蛍光シグナルを検出した。
本実施例では二価金属カチオンを添加することによる検出シグナルのばらつきの検証を行った。検体DNA標識化の際に添加する二価の金属カチオンとして、マグネシウムイオンを添加した。1M 塩化マグネシウム六水和物を検体DNA標識化のための蛍光体含有緩衝液(50ng/μl SAPE(ストレプトアビジンフィコエリスリン、プロザイム社)、100mM MES(2−モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩)、0.05重量% Tween20(商品名)、2mg/ml BSA(ウシ血清アルブミン))に添加して、マグネシウムイオンの終濃度が100mMとなるように調整し、標識液とした。なお、MES由来のナトリウムイオン濃度は74mMであった。これら標識液をDNAチップ上に滴下し、35℃で5分間インキュベーションした。30℃に加温した洗浄液(6×SSPE緩衝液、0.01重量% Tween20(商品名))で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー(和研薬)を用いて乾燥した。標識済みのDNAチップは、DNAチップスキャナー(東レ株式会社製)を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力100%、フォトマルチプライヤーの電圧設定を70%にした。DNAチップ内の検出シグナルのばらつきの指標CV値を表6に示す。なお、CV値は、(4つのスポットの標準偏差)/(4つスポットのシグナル平均値)×100で算出した。
比較例1と同様の方法で検体DNAのハイブリダイゼーションおよび標識化を行った。DNAチップ内の検出シグナルのばらつきの指標CV値を表6に示す。CV値の算出は実施例3と同様の方法で行った。
所定量の塩化ナトリウムを蛍光体含有緩衝液(50ng/μl SAPE(ストレプトアビジンフィコエリスリン、プロザイム社)、100mM MES(2−モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩)、0.05重量% Tween20(商品名)、2mg/ml BSA(ウシ血清アルブミン))に添加した溶液を用意した。この際、ナトリウムイオンの終濃度が1000mMとなるように調整し、標識液とした。これら標識液をDNAチップ上に滴下し、35℃で5分間インキュベーションした。30℃に加温した洗浄液(6×SSPE、0.01重量% Tween20(商品名))で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー(和研薬)を用いて乾燥し、実施例1と同様の条件で蛍光シグナルを検出した。DNAチップ内の検出シグナルのばらつきの指標CV値を表6に示す。CV値の算出は実施例3と同様の方法で行った。
本実施例では、支持体に固定していない捕捉プローブに標的核酸がハイブリダイズした、DNA・RNA二重鎖を標識する検出試薬1に塩化マグネシウムを添加することで検出感度が向上するか検証を行った。DNA・RNA二重鎖を形成させることでHPV(ヒトパピローマウイルス)を検出するハイブリッドキャプチャー2(商品名、キアゲン社)を用いて本発明の効果を検証した。ハイブリッドキャプチャー2(商品名)は、HPVのDNAに、相補RNAをハイブリダイズさせた後、DNA・RNA二重鎖を認識する抗体を用いて、基材上にキャプチャー(捕捉)する。さらに標識ずみDNA・RNA二重鎖を認識する抗体を結合させることで標識し、検出する原理である。標識反応時に塩化マグネシウム溶液を添加することで、検出感度が向上するか検証した。ハイブリッドキャプチャー2(商品名)の反応は、添付マニュアルに従って実施した。
検体DNAとして、ヒトパピローマウイルスのゲノムDNAがクローニングされた組み替えプラスミドpHPV16をヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入し用いた。pHPV16は全長16,600塩基対であった。pHPV16が1amol含まれるように調整した検体溶液、及び0.01amol含まれるように調整した検体溶液に、検体抽出試薬25μlを添加した。ボルテックスミキサーで撹拌した後、65℃に設定したウォーターバスで45分間反応させた。
マニュアルに従って調整したプローブ液25μlに、検体75μlを添加し、ロータリーシェーカー(1100rpm)で 約3 分間振とう攪拌させた。次に65℃のハイブリオーブン内で60分間反応させた。
ハイブリダイゼーション反応溶液100μlを、キャプチャープレートのウェルに移し、ロータリーシェーカー(1,100rpm)を用いて25℃で60分間振とうし、反応させた。反応後、上清を取り除いた。
検出試薬1(アルカリフォスファターゼ標識抗DNA・RNA複合体マウスモノクローナル抗体)75μlを分注し、25℃で30分間反応させた。このとき、検出試薬1に塩化マグネシウムが終濃度100mMになるように添加したもの(Mg有り)と添加しなかったもの(Mgなし)を用意し、それぞれ反応に用いた。反応後、洗浄液で洗浄し、検出試薬2(disodium 2-chloro-5-(4-methoxyspiro{1,2-dioxethane-3,2'-(5'-chloro)tricycle[3.3.11]decan}-4-yl)-1-phenyl phosphatase溶液)を添加し、25℃で15分間反応させた。反応後、発光量はルミノメーターを用いて測定した。検出結果を表7に示した。
Claims (9)
- 捕捉プローブと標的核酸をハイブリダイズさせて二重鎖核酸を形成する工程と、
形成された二重鎖核酸を、標識体および濃度100mM以上の二価の金属カチオンを含む溶液と接触させて、該二重鎖核酸に該標識体を導入する工程と、
前記二重核酸に導入されなかった標識体を洗浄除去する工程と、
前記二重鎖核酸に導入された前記標識体を検出する工程とを含み、前記標識体が、核酸の後染め法に用いられる標識体である、標的核酸の検出方法。 - 前記捕捉プローブが支持体に固定化されている、請求項1に記載の方法。
- 前記二価の金属カチオンがマグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオンおよびカルシウムイオンからなる群から選択される少なくとも1種類である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記標識体が蛍光体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸への前記標識体の導入が、アビジン−ビオチン相互作用を利用して行われる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸がビオチン化されており、前記標識体の導入は、標識アビジン又は標識ストレプトアビジンと前記標的核酸上のビオチンとを相互作用させることにより行われる請求項5記載の方法。
- 前記標的核酸への標識体の導入が、前記ハイブリダイズした二重鎖核酸と抗原抗体反応する標識された抗体又はその抗原結合性断片を、前記二重鎖核酸と抗原抗体反応させることにより行われる請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記捕捉プローブと、前記標的核酸とをハイブリダイズさせる工程においては、前記捕捉プローブは支持体に固定されていない遊離の状態にあり、前記捕捉プローブと前記標的核酸とがハイブリダイズした二重鎖核酸を支持体に固定化する、請求項1、3〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記二重鎖核酸の前記支持体への固定化は、該二重鎖核酸と抗原抗体反応する、支持体上に固定化された抗体又はその抗原結合性断片と前記二重鎖核酸とを抗原抗体反応させることにより行われる請求項8記載の方法。
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