JP6982392B2 - 染色体又は遺伝子コピーの計数のための一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ - Google Patents

染色体又は遺伝子コピーの計数のための一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ Download PDF

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Description

本発明は、オリゴヌクレオチドプローブ、システム、キット、並びに前記プローブ及びシステムを染色体計数、核酸標的配列の検出（例えばゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ）、遺伝子コピー数の計数、及び／又は組織診断のために用いる方法に関する。
プローブは、様々な診断及び研究目的のために開発されてきた。染色体又は遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションは、構成遺伝子の異常（例えば微小欠失症候群、染色体転座、遺伝子増幅及び異数性症候群）、腫瘍性疾患、病原体感染を含む多くの疾患及び症候群に関連する染色体異常の検出を可能にしてきた。これらの領域における遺伝的変化の検出は、患者についての診断情報及び予後情報を提供し、場合によっては治療の決定を伝える。
ヒト１７番染色体（ＣＨＲ１７）及びヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）の二重検出及び計数は、乳がんのＨＥＲ２標的療法に適した患者を選択するために重要である（Wolff AC、et al.,J Clin Oncol 2007、25:118-145;Gruver AM、et al.、J Clin Pathol 2010 Mar;63(3):210-9)。しかし、そのような二重検出及び計数に使用されうる既存のプローブは、特異的かつ高感度な検出を得るために長いアッセイ時間を要することが知られている。
二本鎖ＣＨＲ１７セントロメアプローブは、典型的にはヒトＣＨＲ１７のアルファサテライトに対するｐ１７Ｈ８プラスミド配列から生成される。このヒトＣＨＲ１７のアルファサテライトは、１６のモノマーからなる〜２７００塩基対の高次反復単位を含有し、ＣＨＲ１７あたり５００〜１０００コピー存在する（Waye JS, et al., Molecular and Cellular Biology, Sept. 1986, p. 3156-3165）。二本鎖ＨＥＲ２プローブは、典型的には細菌人工染色体（ＢＡＣ）から生成され、ＨＥＲ２遺伝子にまで及ぶ(Dal Lago L, et al., Mol Cancer Ther 2006, 5:2572-2579; Gruver AM, et al., J Clin Pathol 2010 Mar; 63(3):210-9)。これらの二本鎖プローブは、他のヒト染色体のセントロメア領域と共通の反復配列を有する。したがって、これらのプローブへの重大な障害は、ノイズ生成反復エレメントである。すなわち、セントロメア領域へのプローブは、典型的には他の染色体セントロメアに対して有意な交差反応性を有する。このため、非特異的結合を減らすためにこれらのプローブと併せてブロッキングＤＮＡを用いることが必要となっている（Ｐｉｎｋｅｌ ａｎｄ Ｇｒａｙ、米国特許第５４４７８４１号参照）。これらのプローブを用いるアッセイは、それらの二本鎖の性質及びブロッキングＤＮＡとの要求される競合のために、十分なハイブリダイゼーションを得るには膨大なハイブリダイゼーションの時間、例えば約６〜１８時間を要する。この時間のかかる工程は低いハイブリダイゼーション効率を示しており、これは一つには二本鎖プローブの自己ハイブリダイゼーション、もう一つにはブロッキングＤＮＡとの競合によるものである。ＢＡＣプローブのライブラリーもまた、生成し維持するのが面倒で、精製にも手間がかかり、さらに汚染しやすい。この技術を用いたベンチマークとなる画期的アッセイがＮｉｔｔａらにより２００８年に開示されており、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のカタログ番号：７８０−４４２２のＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ Ｄｕａｌ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌとして現在市販されている（Nitta et al. Diagnostic Pathology, 3:41, 2008）。
最近、Ｍａｔｔｈｉｅｓｅｎ及びＨａｎｓｅｎ（Matthiesen SH, et al., PLoS One, 2012; 7(7), 2012）が、ＨＥＲ２及びＣＨＲ１７プローブの構造には何も変更せず、ハイブリダイゼーション緩衝液中でのエチレンカーボネート（ＥＣ）のホルムアミドへの置換がハイブリダイゼーション時間を短縮させたこと、かつブロッキングＤＮＡは必要ないことを主張した。この技術に基づいたＨＥＲ２ ＩＱＦＩＳＨ ｐｈａｒｍＤｘＴＭアッセイ（Ｄａｋｏ）が市場に導入された。有用な技術ではあるが、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に欠点がある。従来のＦＩＳＨの実施には専用の蛍光イメージングシステムと特定の専門知識を持つよく訓練された人材を必要とし、それがこのシステムをいくつかの臨床ワークフローと相容れなくさせている。さらに、明視野ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法と比べた場合、ＦＩＳＨ研究は、全体的組織構造の比較的限られた形態学的評価のみを提供し、経時的蛍光性検出シグナルの安定性を欠き、試験の総コストが高い。
クローンベースのプローブに関連する欠点を緩和するために、研究者らは、ゲノムＤＮＡのプローブを生成するための「特異的プライマー」の使用を提唱してきた（Navin et al., Bioinformatics 22:2437-2438 (2006)）。しかし、この方法は、多数の特異的増幅反応及び最初にハンズオンタイムでの下流での処理を要する点で煩雑で時間がかかる（Yamada et al., Cytogenet Genome Res. 1-7 (2010)も参照）。
いくつかの用途の場合、一本鎖プローブの使用は、二本鎖プローブの使用よりも明らかな利点を有する。例えば、一本鎖プローブは、一般に二本鎖プローブよりも高い感度を有する。なぜなら、変性二本鎖プローブの一部は復元してプローブのホモ二本鎖を形成し、それにより試験試料中のゲノム標的の捕捉が妨げられるからである（Taneja K et al., Anal Biochem, 166, 389-398 (1987), Lewis ME, et al., Peptides, 6 Suppl 2:75-87 (1985); Strachan T, Read AP, Human Molecular Genetics. 2nd edition. New York: Wiley-Liss (1999); Kourilsky P, et al., Biochimie, 56(9):1215-21 (1974))）。いくつかの研究室は、一本鎖プローブが二本鎖プローブよりも高いハイブリダイゼーション感度を呈することをすでに報告している（An SF, et al., Mol Cell Probes, 6(3):193-200 (1992); Hannon K, et al., Anal Biochem, 212(2):421-7 (1993); Cox KH, et al., Dev Biol., 101(2):485-502 (1984)）。
合成一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは、ゲノム標的の検出のために、主にＦＩＳＨで使用されている。例えば、２０１３年の米国人類遺伝学会議（American Society of Human Genetics 2013 Meeting (2013)）でのＢｅｒｇｓｔｒｏｍらのＦＦＰＥ組織における染色体再編成の検出のためのカスタムオリゴＦＩＳＨプローブの設計（Designing Custom Oligo FISH Probes for the Detection of Chromosomal Rearrangements in FFPE Tissues）は、蛍光標識を用いた数千の一意的な長い一本鎖オリゴヌクレオチドを含むＳｕｒｅＦＩＳＨプローブを報告した。このオリゴヌクレオチド配列は、染色体再編成を検出するための転座ブレークポイントの標的染色体領域にわたりタイル状に並ぶ。Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍが一本鎖プローブを開示しているが、該プローブはＣＨＲ１７に対するものではなかった。また、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍの参考文献はヒト集団においてＣＨＲ１７の多型を検出するための特異性及び堅牢性といったＣＨＲ１７プローブに関連する問題への解決策を何も示していないようである。さらに、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍの参考文献は、標的遺伝子の参照染色体に対する比率を計算するために標的プローブと参照ブローブが組み合わせて使用される、遺伝子コピ−数の計数のためのアッセイ（及びプローブ）は開示していない。
ゲノム標的に対する一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの使用はかなり限られている。例えば、米国特許第８４４５２０６号（Bergmann et al., 2012）は、ＨＥＲ２遺伝子の一部に対する（又はそれに相補的な）少なくとも１００の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブのセットについて記述している。この開示は、参照プローブ（例えばＣＨＲ１７）なしでのＨＥＲ２遺伝子標的の検出に限定されているようであり、この参照プローブは、Ｗｏｌｆｆ ＡＣらのＪ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００７，２５：１１８−１４５での教示からも明らかなように、ＨＥＲ２／ＣＨＲ１７比率が診断的に重要であることから遺伝子コピ−数評価に有用なものである。
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）アッセイは、一つの試料（例えば腫瘍試料）の、別の試料（例えば非腫瘍細胞試料又は組織試料などの参照試料）と比較した相対的なコピー数に関する情報を提供するために使用することができる。したがって、標的核酸のゲノムＤＮＡコピー数が参照試料と比較して増えているのか減っているのかを決定するためにＣＧＨを用いることができる。しかし、ＣＧＨは、特定のゲノムＤＮＡ又は染色体領域の正確なコピー数に関する情報は提供しない。
ＣＨＲ１７のゲノム標識化については、ｐ１７Ｈ８に由来する従来の４２−ｍｅｒオリゴヌクレオチドがＣＨＲ１７に特異的であることが証明された。しかし、４２−ｍｅｒ ＣＨＲ１７プローブと、本明細書に開示の好ましいオリゴマーＨＥＲ２プローブ（約１００ｂｐから約４００ｂｐまでの範囲）の大きさに有意な差異があるため、二重ＨＥＲ２−ＣＨＲ１７ ＩＳＨアッセイでは、異なるストリンジェンシー洗浄の温度下（ＨＥＲ２には７２℃、ＣＨＲ１７には５９℃）でＨＥＲ２及びＣＨＲ１７のシグナルを連続的に検出するための長い手順が必要となる。重要なことは、同程度のサイズの４２−ｍｅｒ ＣＨＲ１７プローブと一本鎖ＨＥＲ２プローブを用いた二重ＩＳＨ実験でも、このプローブセットの非両立性（図１４Ａ−Ｄ及び実施例２参照）を解決しなかったことである。さらに、たとえ４２−ｍｅｒ ＣＨＲ１７プローブと一本鎖ＨＥＲ２プローブ間の非両立性が解決されても、各個々のヒトはモノマーとそれに関連する変異体の異なる組み合わせを有しうるため、Ｎｉｔｔａの教示のようなアルファサテライトの１６のモノマーのうちの一つのモノマーのみに特異的な単一のオリゴヌクレオチドプローブ（例えば４２−ｍｅｒ ＣＨＲ１７プローブ）は、ヒト集団全体にわたってＣＨＲ１７を検出するのに十分ではないだろう（Waye JS and Willard HF, NAC1986; 14(17); Willard, H.F. et al, 1987, Genomics, 1; Warburton, P.E. and Willard, H.F., 1995, J. Mol. Evol., 41）。したがって、Ｎｉｔｔａの教示のような４２−ｍｅｒ ＣＨＲ１７プローブは、ヒト集団全体にわたって十分に堅牢ではないであろう。
一本鎖ＣＨＲ１７プローブを用いる魅力にもかかわらず、本分野の従事者らは、ＣＨＲ１７に十分特異的（例えばブロッキングＤＮＡの必要性を排除する程に十分に特異的）で、かつヒト集団全体にわたってＣＨＲ１７を検出する程に十分堅牢な、短い一本鎖ＣＨＲ１７プローブを作成するのは不可能だと考えていた。そのように考える理由の一つは、アルファサテライトＤＮＡの基本的な反復性がＣＨＲ１７に十分特異的で短いオリゴヌクレオチドを見出す可能性を極めて低くしていると信じられていたからである。例えば、Willard(Willard, H.F., 1985, Am J Hum Genet, 37; Willard, H.F., 1991, Curr Opin Genet Dev. 1)は、９９％に迫る類似性レベルを示した異なる高次反復単位内に同じモノマーの配列を見出した。さらに、他の染色体に対してかなり多くのオフターゲット・ヒットがあるようである。例えば、プラスミドｐ１７Ｈ８由来の１４のオリゴヌクレオチド配列（ＣＨＲ１７のセントロメア領域に高次反復単位を含む）は、いくつかの他の染色体（例えば１番、Ｘ、１１番、９番、２０番、２２番染色体等）に対して高い相同性を有することがバイオインフォマティクス研究により明らかにされた。各オリゴヌクレオチドの配列のうちの多くがＣＨＲ１７に対する高い相同性（８５〜１００％）を有していたにもかかわらず、多くのオフターゲット・ヒットも存在した。例えば、代表的なオリゴヌクレオチド（Ｍ２．１）は、２１のオンターゲット・ヒットを有したが、１番染色体にも３３のヒットがあり、別のオリゴヌクレオチド（Ｍ２．２）は、１８のオンターゲット・ヒットを有したが、Ｘ染色体にも１４のヒットがあった（図１５参照）。これらの結果は、ＣＨＲ１７のセントロメア領域が標的に対して十分に特異的な配列を含まないことを示唆している。実際、バイオインフォマティクスの観点からのセントロメア領域についての試験は、ブロッキングＤＮＡの使用なしに選択シグナルを提供することができるであろう、セントロメアに一意的に特異的なプローブを設計することは合理的ではなく、実現する見込みもないことを示している。
ＣＨＲ１７に十分に特異的な（例えばブロッキングＤＮＡの必要性を排除するのに十分な程特異的な）、短い一本鎖ＣＨＲ１７プローブを作成するのは不可能であると本分野の従事者が予想したもう一つの理由は、単一の（又は少数の）一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（複数可）の堅牢性の欠如である。上に開示の通り、ヒトＣＨＲ１７特異的アルファサテライトは１６のモノマーからなる高次反復単位を含有し、各個々のヒトはこれらのモノマー及びそれらに関連する変異体の異なる組み合わせを有しうる（Waye JS and Willard HF, Molecular and Cellular Biology, Sept. 1986, p. 3156-3165）。単一のオリゴヌクレオチドプローブ、例えば上記の４２ｍｅｒ又は少数のモノマーを含む少数のオリゴヌクレオチドでさえ、ヒト集団においてＣＨＲ１７の多型を検出する程十分に堅牢ではない（Waye JS, Willard HF., NAC1986; 14(17); Willard, H.F. et al, 1987, Genomics, 1; Warburton, P.E. and Willard, H.F., 1995, J. Mol. Evol., 41）。実際、単一のＣＨＲ１７特異的オリゴヌクレオチドプローブ（７９ｍｅｒ）は、ｐ１７Ｈ８プラスミド由来のプローブと同等の（又はより優れた）感度を示さなかった。特に、単一の７９ｍｅｒ ＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドは、市販のプローブ（ｐ１７Ｈ８プローブ）と比較した場合、０．７５μｇ／ｍＬ、６時間で６１．１％（１４８／２４２）と比べ、１μｇ／ｍＬ、１時間でわずか４１．５％（１１３／２７２）しか合格（シグナル強度≧２、範囲≧５０％、バックグラウンド＜２）しなかった。したがって、Ｃｈｒ１７オリゴヌクレオチド（単一の７９ｍｅｒ）は、市販のプローブ設計と同等の感度を示さなかった。
ＣＨＲ１７に十分に特異的な、短い一本鎖ＣＨＲ１７プローブを作成するのは不可能であると本分野の従事者が予想したもう一つの理由は、このようなオリゴヌクレオチドプローブの作成が非常に面倒であり、該製品の製造可能性がこれまで容易に知られていないためであった。特に、少なくとも６０ｋｂの標的にハイブリダイズしているプローブが１００万ｂｐのゲノム領域に及ぶためには、１２００もの一意的な５０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプローブが必要になる。１２００の一意的なプローブを製造し、それらを単一の試薬内で組み合わせることは、困難で、費用がかかり、規制の観点から新たな境地を開く。
ＣＨＲ１７に高度に特異的で、かつヒト集団において多型を構成するのに十分に堅牢である１４の一意的な一本鎖プローブのセットを作成し、合成した。これらの一本鎖プローブは、ＨＥＲ２の検出のための使用に十分に適合する。実際、これらの新たに見出されたオリゴヌクレオチドプローブは、本明細書に開示するアッセイにおいて本発明者らがブロッキングＤＮＡの使用を排除することができたほど高度に特異的である。さらに、驚くべきことに、これらのオリゴヌクレオチドプローブは、有意に短縮したハイブリダイゼーション時間を要求する、向上したハイブリダイゼーション効率を有することが見出された。ＣＨＲ１７に対するこれらの一本鎖オリゴヌクレオチドプローブはまた、従来利用可能なものより優れた個別計数可能な円形シグナルを可能にした。特に、この検出可能なシグナルは、様々なサイズ及び形状でシグナルを生成する傾向のあるニックトランスレーション法で標識された二本鎖プローブとは対照的である。
本発明のＣＨＲ１７に対する一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは、目的の標的遺伝子に対する一又は複数の標的プローブと組み合わせて使用してもよい。これは、組織診断にとって重要である、遺伝子コピー計数（例えば標的遺伝子の、それに対応する染色体に対する比率の決定）を可能にする。ＤＮＡコピー数の変化は、多くのタイプの細胞増殖性疾患（例えばがん）の顕著な特徴である。実際、一部の研究者は、これらがいくつかのがんの発病過程を促進すると考えられるという仮説を立てている。代表的な変化は、小規模な増幅及び欠失の他、大規模な染色体の増減を含む。ゲノムの不安定性ががん遺伝子の活性化及び／又は腫瘍抑制因子のサイレンシングを誘発しうることを考慮すると、ゲノム異常のマッピング領域は、がん関連遺伝子の同定に有用なツールである。このような情報（ゲノム異常）は、がんの診断に関する有用な情報又は予後支援としての有用な情報を提供する。上に述べたように、ＨＥＲ２はＣＨＲ１７上に見出される遺伝子であり、本発明はまた、ＣＨＲ１７検出と、上記の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを用いる計数とを組み合わせてＣＨＲ１７上のＨＥＲ２遺伝子を検出（及び遺伝子コピ−数を計数）するための一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの使用を特徴とする。
例示的な実施態様において、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのシステムは、染色体（例えばＣＨＲ１７）のコントロール領域に特異的なコントロールプローブを含みうる。このコントロールプローブは、約３時間以内、例えば１時間以内にホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された組織にハイブリダイズするように構成されている。いくつかの実施態様では、コントロールプローブは、複数の合成一本鎖オリゴヌクレオチドである。このシステムはまた、染色体の標的領域に特異的な標的プローブを特徴とし、該標的プローブもまた約３時間以内、例えば１時間以内にハイブリダイズするように構成されている。いくつかの実施態様では、コントロール領域はセントロメアである。標的領域は、遺伝子又は遺伝子座である。
さらに別の例示的な実施態様では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのシステムはＣＨＲ１７のコントロール領域に特異的なコントロールプローブを含み、コントロールプローブは少なくとも一の第一の標識で標識されており、コントロールプローブは３時間以内のハイブリダイゼーションの間に≧２の染色強度及び対照試料の総核数の≧５０％の染色範囲を得るように構成される。
いくつかの実施態様では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのシステムはＣＨＲ１７の標的領域に特異的な標的プローブ（例えばＣＨＲ１７上のＨＥＲ２遺伝子に特異的なＨＥＲ２プローブ）を特徴とし、該標的プローブは少なくとも一の標識で標識されており、かつ該標的プローブは３時間以内のハイブリダイゼーションの間に計数可能なシグナル及び対照試料の総核数の≧５０％の染色範囲を達成するように構成される。
他の例示的な実施形態において、組織試料のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための方法は、組織試料をコントロールプローブと接触させること、約３時間未満の時間条件下でコントロールプローブをコントロール領域にハイブリダイズさせること、該試料をすすいで非結合プローブを除去すること、及びハイブリダイズされたプローブの存在を検出することを含みうる。対照は、複数の一本鎖の標識された合成オリゴヌクレオチドを含みうる。一実施態様において、方法は、標識を認識し、プローブに関連するシグナルを増幅させる発色検出試薬を適用することをさらに含む。さらなる実施態様では、上記のシステムを用いた方法及びそれに関連するキットが開示される。
いくつかの例示的な実施態様では、細胞あたり二の明視野発色性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションシグナルを得るための方法は、単一の染色体のコントロール領域に特異的なコントロールプローブ（これはブロッキングＤＮＡの非存在下で明らかに非特異的に結合しないように選択されている）と複数の細胞を含有する組織試料を接触させること、該コントロールプローブを前記染色体のコントロール領域にハイブリダイズさせること、試料をすすいで非結合プローブを除去すること、及び細胞あたり二の明視野発色性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションシグナルを生成するために、ハイブリダイズされたプローブの存在を発色試薬を介して検出することを含みうる。
本開示の追加的な特徴は、目下理解されている本開示を実施するためのベストモードを例証する、以下の例示的な実施態様の詳細な説明を考慮すれば当業者には明らかになるであろう。
実例となる標識手法を示す開示のプローブの、標識位置を示す配列（配列番号１）及び構造図。 開示のプローブの配列（配列番号２）及び構造図。 市販のプローブ（ＨＥＲ２ＰＭＡ標識）と比較した、本明細書に開示のプローブのＨＥＲ２シグナル強度及び範囲を示すグラフ（Ａ）並びに（Ｂ）。 市販のプローブ（ＨＥＲ２ＰＭＡ標識）と比較した、本明細書に開示のプローブのＨＥＲ２シグナル強度及び範囲を示す顕微鏡写真（Ｃ）並びに（Ｄ）。 染色された乳房組織の顕微鏡写真。 染色された乳房組織の顕微鏡写真。 異なるハイブリダイゼーション条件に対するＨＥＲ２染色を示すグラフ。 特に試験されたオリゴヌクレオチドのＣｈｒ１７シグナル強度及びバックグラウンドを示すグラフ。 特に試験されたオリゴヌクレオチドのＣｈｒ１７シグナル強度及びバックグラウンドを示す顕微鏡写真。 二本鎖の市販プローブ製品と比較した、一本鎖プローブのＣｈｒ１７シグナル強度及び染色範囲を示すグラフ。 二本鎖の市販プローブ製品と比較した、一本鎖プローブのＣｈｒ１７バックグラウウド及び合格／不合格を示すグラフ。 特異性を示す、染色体中期スプレッドの染色の顕微鏡写真。 １１９６ ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの４８％、７２％、１００％使用時の強度、範囲及びバックグラウンドへの効果を示す一連のグラフ。 長いハイブリダイゼーション時間（例えば２時間及び６時間）と改善された染色強度との間に一貫性のある連関がないことを示す一連のグラフ。 ＤＩＳＨアッセイで染色された乳房組織の顕微鏡写真。 ＤＩＳＨアッセイで染色された乳房組織の顕微鏡写真。 ＤＩＳＨアッセイで染色された肺組織の顕微鏡写真。 ＤＩＳＨアッセイで染色された胃組織の顕微鏡写真。 ４２−ｍｅｒ ＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドプローブを用いたＣＨＲ１７の弱いシグナルを示すグラフ。 ３３．２％ホルムアミドで４２−ｍｅｒ Ｃｈｒ１７オリゴヌクレオチドプローブがｐ１７Ｈ８プローブよりもかすかな染色を有することと、濃度及びハイブリダイゼーション時間を増加させても３３．２％ホルムアミドでシグナルが増加しなかったことを示すグラフ（６時間ハイブリダイゼーション時間のどの点も先のデータのような結果にならなかったことは、１から６時間のハイブリダイゼーション時間には差異がないことを示唆している）。 ２２．８％ホルムアミドがより良好な４２−ｍｅｒのシグナルを生じさせることを示すグラフ。ただし、シグナルはＰＭＡよりもまだ弱い。 ＣＨＲ１７オリゴヌクレオチド（４２−ｍｅｒ）のストリンジェンシー洗浄の温度がＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ（６８〜７２℃）と一致しないことを示すグラフ。 ＣＨＲ１７のセントロメア領域において高次反復単位を含む１４のオリゴヌクレオチド配列が、他のいくつかの染色体（例えば１番、Ｘ、１１番、９番、２０番、２２番染色体等）と高い相同性を有していたことを示す。例えば、オリゴヌクレオチドＭ２．１は、２１のオンターゲット・ヒットを有したが、１番染色体にも３３のヒットがあった。また、オリゴヌクレオチドＭ２．２は、１８のオンターゲット・ヒットを有したが、Ｘ染色体にも１４のヒットがあった。 計数可能なシグナルを評価するために用いられる同心円及び単純閉曲線の例を示す。この概略図は、本明細書に記載の一般的に円形の形状を説明するのに役立つ。
配列
本明細書で提供される核酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２で定義されているような、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語を用いて示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補的鎖が表示されている鎖への参照により含まれることが理解される。提供された配列の場合：
配列番号１〜１６は、プローブ（例えばヒト１７番染色体に対する、標識付きプローブ）の核酸配列の例である。
Ｉ．定義
特に説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を持つ。単数形の「ある（ａ、ａｎ）」及び「該（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を示さない限りは複数の指示対象を含む。同様に、「又は（ｏｒ）」という単語も、文脈が明らかに他を示さない限りは「及び」を含むことが意図される。「含む（comprising）」は「含む（including）」を意味する。よって、「Ａ又はＢを含む（comprising A or B）」は、「Ａを含む（including A）」か、又は「Ｂを含む（including B）」か、又は「Ａ及びＢを含む（including A and B）」を意味する。
本開示の実施態様の実施及び／又は試験のための適切な方法並びに材料は後述する。このような方法及び材料は例示であり、限定することを意図するものではない。本明細書に記載のものと類似又は同等の他の方法及び材料も使用することができる。例えば、本開示に関する技術分野でよく知られている従来の方法は、様々な一般的な参考文献及びより詳細な参考文献、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 199（及び２０００年までの増補版）；; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; 及びHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999等に記載されている。
本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体がすべての目的のために援用される。
本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料は、本開示の技術を実施又は試験するのに使用されうるが、適切な方法及び材料を下記に記載する。材料、方法、及び例は、単なる例示であって、限定を意図するものではない。
本開示の様々な実施態様の検討を容易にするために、以下の特定の用語の説明が提供される。
コンジュゲート、連結、結合：ある分子を別の分子に共有結合的に連結して、より大きな分子を作ること。例えば、二つのポリペプチドを一つの連続したポリペプチド分子にするか、又は質量タグ、ハプテン、核酸若しくは他の分子を共有結合的にｓｃＦｖ抗体などのポリペプチドに付着させるなど。
接触させること：二つ以上の部分の結合を可能にする配置、特に、例えば固体及び／又は液体の両形態での直接的物理的結合（例えば、スライドに付着させた生体試料などの生体試料が本明細書に開示の組成物を含む溶液などの組成物と接触するような配置）を指す。
検出する：例えば試料中の、（シグナル又は特定の抗原、タンパク質又は核酸などの）因子の有無を決定すること。いくつかの例では、これは、定量化及び／又は局在化、例えば細胞又は特定の細胞区画内での局在化をさらに含みうる。「検出すること」とは、標的分子が生体試料中に存在するかどうか決定するなどの、何かが存在するか存在しないかを決定する任意の方法を意味する。例えば、「検出すること」は、試料が特定の特性を示すかどうかを決定するために、視覚又は機械的装置を使用することを含みうる。ある例では、光学顕微鏡及び他の顕微鏡手段が、標的に結合しているか又は近位で標的に結合している検出可能な標識を検出するのに使用される。
検出可能な標識：組織試料などの試料中の標的分子などの標的の存在及び／又は濃度を示す、（視覚的、電子的又はその他の方法で）検出可能なシグナルを生産できる分子又は物質。標的に直接的に又は近位で結合可能な分子にコンジュゲートした場合、検出可能な標識は、標的の位置を突き止め及び／又は標的を定量化するのに使用されうる。これにより、試料中の標的の存在及び／又は濃度は、検出可能な標識によって生成されたシグナルを検出することによって検出されうる。検出可能な標識は、直接又は間接的に検出することができ、異なる分子にコンジュゲートされた複数の異なる検出可能な標識は、組み合わせて一又は複数の標識を検出するのに使用されうる。別々に検出されうる複数の検出可能な標識は、異なる標的に直接的に又は近位で結合する異なる分子とコンジュゲートし、試料中の複数の標的を検出するマルチプレックスアッセイを提供しうる。標識の具体的な、非限定的な例は、蛍光及び蛍光及び蛍光発生部分、発色部分、ハプテン、親和性タグ、及び放射性同位体を含む。標識は、直接的に検出可能（例えば光学的に検出可能）な場合もあり、間接的に検出可能（例えば検出可能になる一又は複数のさらなる分子との相互作用を介して）な場合もある。本明細書で開示されるプローブの文脈における例示的な標識については後述する。核酸を標識化するための方法、及び様々な目的に有用な標識の選択における指針は、例えばSambrook and Russell, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)及びAusubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987、最新版を含む）で論じられている。
ハプテン：抗体と特異的に結合できるが、典型的には担体分子との組み合わせでなければ免疫原性となることが実質的に不可能な分子、典型的には小分子。
ＨＥＲ２：ｖ−ｅｒｂ−ｂ２トリ赤芽球性白血病ウイルス性がん遺伝子ホモログ２（ＥｒｂＢ２）、ヒト上皮増殖因子受容体２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂ Ｂ２／ｎｅｕ、及び神経芽細胞腫／神経膠芽細胞腫由来がん遺伝子ホモログとしても知られており、ＧｅｎＢａｎｋ Ｇｅｎｅ ＩＤアクセッション番号２０６４。上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバー。Ｈｅｒ２は、リガンド結合ドメインを欠いており、それ自体でリガンドに結合することができないが、他のリガンド結合ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーと二量体化する。ＨＥＲ２の増幅及び／又は過剰発現は、乳がん及び卵巣がんを含むいくつかのタイプのがんで起こる。
Ｈｅｒ２核酸配列及びタンパク質配列は、公的に入手可能である。例えば、ＨＥＲ２遺伝子は、染色体 １７ｑ１２上に位置し、その配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１７．１０（３７８４４１６７−３７８８４９１５）で開示されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００５８６２、ＮＭ＿００４４４８、ＸＭ＿００５２５７１３９、及びＸＭ＿００５２５７１４０は、Ｈｅｒ２核酸配列を開示し、またＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００５８６２、ＮＰ＿００４４３９、ＸＰ＿００５２５７１９６、及びＸＰ＿００５２５７１９７は、Ｈｅｒ２タンパク質配列を開示し、これらのすべては２０１３年１０月４日にＧｅｎＢａｎｋより提供された通りに、参照により援用される。
ハイブリダイゼーション：ＤＮＡ、ＲＮＡの２本の鎖の相補的領域の間か、又はＤＮＡとＲＮＡとの間に塩基対を形成し、それによって二重鎖分子を形成すること。特定の度のストリンジェンシー度をもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション法の特質並びにハイブリダイズする核酸配列の組成及び長さに応じて変動する。一般に、ハイブリダイゼーション温度及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（Ｎａ＋濃度など）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーションを減少させる化学物質の存在（ホルムアミドなど）もまたストリンジェンシーを決定するであろう（Sadhu et al., J. Biosci., 6:817-821, 1984）。特定のストリンジェンシー度を得るためのハイブリダイゼーション条件に関する計算が、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (chapters 9 and 11）で論じられている。ＩＳＨのハイブリダイゼーション条件もまたLandegent et al., Hum. Genet., 77:366-370, 1987; Lichter et al., Hum. Genet.,80:224-234, 1988；及びPinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:9138-9142, 1988で論じられている。
単離された：「単離された」生体成分（例えば核酸分子、タンパク質又は細胞）は、調製物中のその他の生体成分、生物の細胞又は生物それ自体（ここでは他の染色体並びに染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質及び細胞などの成分が生じる）から実質的に分離又は精製されている。「単離された」核酸分子及びタンパク質は、標準的な精製方法により精製された核酸分子及びタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞において組換え発現により調製された核酸分子及びタンパク質、並びに化学的に合成された核酸分子及びタンパク質も包含する。いくつかの例では、本明細書に開示の核酸プローブは、単離された核酸プローブである。
リンカー：本明細書用いられる場合、リンカーは、二つの部分間に位置する分子又は原子の群である。例えば、質量タグコンジュゲートは、質量タグと特異的結合部分の間のリンカーを含みうる。典型的には、リンカーは二官能基であり、すなわちリンカーは各末端に官能基を含み、官能基は二つの部分にリンカーを結合させるために使用される。二つの官能基は、同じ、つまりホモ二官能性リンカーでも、又は異なっている、つまりヘテロ二官能性リンカーでもよい。
マルチプレックス、マルチプレックスした、マルチプレックスする：本発明の実施態様は、複数の異なるコンジュゲートを使用して、所望に応じて、試料中の複数の標的を実質的に同時に、又は逐次的に検出することを可能にする。マルチプレックスは、核酸一般、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質を個々にまたすべての組合せで同定及び／又は定量化することを含みうる。マルチプレックスはまた、その解剖学的文脈での細胞内の二又はそれ以上の遺伝子、メッセンジャー、及びタンパク質を検出することも含みうる。
プローブ：標的核酸分子（例えばゲノム標的核酸分子）とハイブリダイズすることが可能であり、標的にハイブリダイズした場合、直接的又は間接的に検出可能な核酸分子。したがって、プローブは、標的核酸分子の検出を、またいくつかの例では、その定量化を可能にする。特定の例において、プローブは、標的核酸分子の一意的に特異的な核酸配列に相補的な少なくとも二つのセグメントを含み、したがって、標的核酸分子の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズすることができる。一般的には、少なくとも一つのセグメント又は一つのセグメントの一部が標的核酸分子にハイブリダイズしてしまえば（そしてそのままであれば）、プローブの他の部分は、標的内の他の部分の同族結合部位とハイブリダイズすることを物理的に（必須ではないが）制約されうる（例えば、そのような他の部分はそれらの同族結合部位から遠く離れている）。ただし、プローブ中に存在する他の核酸分子は互いに結合することができ、したがってプローブからのシグナルを増幅する。プローブは、「標識核酸プローブ」と称されうる。これは、プローブが直接的又は間接的に検出可能な部分又は「標識」へ結合され、プローブを検出可能な状態にすることを示している。
試料：対象から得られる、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質又はこれらの組み合わせを含有する標本。例としては、染色体調製物、末梢血、尿、唾液、組織生検、細針吸引液、外科標本、骨髄、羊水穿刺試料、及び剖検材料を含むがこれらに限定されるものではない。一例では、試料は、ゲノムＤＮＡを含む。いくつかの例では、試料は、細胞遺伝学的調製物であり、例えば顕微鏡スライド上に配置することができる。特定の例では、試料は、そのまま使用するか、又は例えば固定する（ホルマリンを用いるなど）ことによって使用前に操作可能である。
配列同一性：二以上の核酸配列間の同一性（又は類似性）は、配列間の同一性又は類似性を単位として表される。配列同一性は、同一性パーセンテージを単位として測定され、該パーセンテージが高いほど、配列はより一致している。配列類似性は、類似性パーセンテージ（保存的アミノ酸置換を考慮に入れたもの）を単位ｔして測定され、該パーセンテージが高いほど、配列はより類似している。
比較のための配列アライメント法は、当該分野で周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res., 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences, 8:155-65, 1992; 及び Pearson et al., Meth. Mol. Bio., 24:307-31, 1994に記載されている。Altschulら、J. Mol. Biol., 215:403-10, 1990には、配列アラインメント法及び相同性計算の詳細な考慮事項が提示されている。
ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを含むいくつかの供給源から入手可能であり、配列解析プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘと接続して使用する場合は、インターネット上で利用可能である。追加情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトで見ることができる。
ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用することができ、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用することができる。比較した二つの配列が相同性を共有する場合、指定した出力ファイルには、アラインメントした配列として相同性領域が表示されるだろう。比較した二つの配列が相同性を共有しない場合、指定した出力ファイルには、アラインメントした配列が表示されないだろう。
ＢＬＡＳＴのようなアライメントツール（ＢＬＡＴ）もまた、核酸配列を比較するために使用されうる（る (Kent, Genome Res. 12:656-664, 2002）。ＢＬＡＴは、Ｋｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を含むいくつかの供給源から入手可能であり、また、インターネット上でも利用可能である（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）。
アラインメントされたら、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を数えることによって、マッチ数が決定される。配列同一性パーセントは、そのマッチ数を、同定された配列に示される配列の長さで除すか、又は区切られた長さ（例えば同定された配列に示される配列からの１００個の連続したヌクレオチド又はアミノ酸残基）で除した後、得られた値に１００を乗じることによって決定される。例えば、１５５４個のヌクレオチドを有する試験配列とアラインメントされたときに１１６６個のマッチを有する核酸配列は、試験配列と７５．０パーセント同一である（１１６６÷１５５４＊１００＝７５．０）。配列同一性パーセント値は、四捨五入して小数点第１位までの概数にされる。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、及び７５．１４は、７５．１に丸められ、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、及び７５．１９は、７５．２に丸められる。長さの値は、常に整数である。別の例では、同定された配列からの１５の連続したヌクレオチドと整列する２０のヌクレオチドからなる領域を含む標的配列は、次の通り、その同定された配列と７５パーセントの配列同一性を共有する領域を含む（すなわち、１５÷２０＊１００＝７５）。
対象：ヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば獣医学的対象）といった任意の多細胞性脊椎生物。
標的核酸配列又は標的核酸分子：核酸分子の定義された領域又は特定の部分、例えばゲノムの一部（遺伝子、又は目的の遺伝子を含有する哺乳動物のゲノムＤＮＡの領域など）。標的核酸配列が標的ゲノム配列である例において、このような標的は、（例えば正常細胞内で）染色体上のその位置により定義することができ、例えば細胞遺伝学的命名法に従い、染色体上の特定の位置への参照により；遺伝地図上の位置への参照により；仮想コンティグ又はアセンブルしたコンティグへの参照により；その特異的な配列又は機能により、その遺伝子名又はタンパク質名により；あるいはゲノムの他の遺伝子配列の中からそれを一意的に同定する他の任意の手段によって定義することができる。いくつかの例では、標的核酸配列は、哺乳動物のゲノム配列（例えばヒトゲノム配列）である。
いくつかの例において、標的核酸配列（例えばゲノム核酸配列）の変化は、疾患又は病態と「関連付け」られる。いくつかの例において、標的核酸配列の検出は、疾患又は病態に関して試料の状態を推定するために用いられうる。例えば、標的核酸配列は、二（又はそれ以上）の同定可能な形態で存在することができ、その第一の形態は疾患又は病態の非存在と相関関係があり、第二の（又は異なる）形態は疾患又は病態の存在と相関関係がある。この二の異なる形態は、例えばポリヌクレオチド多型により定性的に同定可能であり、かつ／又はこの二の異なる形態は、例えば細胞中に存在する標的核酸配列のコピー数により定量的に同定可能である。
一意的に特異的な配列：生物の半数体ゲノム中に一回だけ存在している核酸配列（例えば少なくとも２０ｂｐ（例えば少なくとも２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ又はそれ以上）。特定の実施態様において、一意的に特異的な核酸配列は、標的核酸と１００％の配列同一性を有し、かつ標的核酸を含む特異的な半数体ゲノム中に存在する他の任意の核酸配列に対して有意な同一性を全く有しない標的核酸の核酸配列である。
ベクター：ベクターにとって天然ではない、他の（「外来の」）核酸配列のための担体として働く任意の核酸。適切な宿主細胞に導入されると、ベクターは、それ自身（また、それによって、外来の核酸配列）を複製するか、又は外来核酸配列の少なくとも一部を発現しうる。一つの文脈において、ベクターは、直鎖状又は環状核酸であって、その中へ、複製（例えば生産）及び／又は標準的な組換え核酸技術（例えば制限消化）を用いて操作する目的のため、目的の核酸配列が導入（例えばクローニング）される）。ベクターは、宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列、例えば複製起点を含みうる。ベクターはまた、当該技術分野で知られている一又は複数の選択マーカー遺伝子及び他の遺伝子要素を含みうる。一般的なベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、人工染色体（例えばＢＡＣ、ＰＡＣ、ＨＡＣ、ＹＡＣ）、及びこれらのタイプのベクターの一以上の特徴を組み込むハイブリッドを含む。典型的には、ベクターは、標的核酸配列の挿入を容易にする１カ所又は複数の固有の制限部位（場合によってはマルチクローニングサイト）を含む。
ＩＩ．染色体計数のためのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのシステム
本開示は、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを使用する遺伝子標的（例えばＨＥＲ２）とセントロメア標的（例えばＣＨＲ１７）の同時検出のための自動明視野二重ＩＳＨアッセイを説明する。本アッセイの一態様は、セントロメアプローブと遺伝子プローブとの両立性を実現する特定のプローブの発見である。特に、遺伝子標的に対する一本鎖オリゴヌクレオチドプローブのプールと非常に両立性であるセントロメア標的に対する一本鎖オリゴヌクレオチドプローブのプールが見出された。セントロメアオリゴヌクレオチド配列は、ヒトのブロッキングＤＮＡ使用の必要性を回避するように選択される。これらのプローブは、二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＤＩＳＨ）アッセイにおいて用いた場合、市販の二本鎖プローブ製品と同等の染色性能を得た。しかし、一本鎖プローブは１時間以内でハイブリダイズする一方、二本鎖プローブは長時間（例えば６時間）を要した。この二つのプローブタイプは遺伝子状態の診断では高い一致が見られたものの、一本鎖プローブの方がより低いアッセイ不合格率を得た。未知の解析前の条件及び組織品質の標本で試験した場合、非常にかけ離れたハイブリダイゼーション時間（例えば１時間に対して６時間）を用いたとしても、一本鎖プローブの方が二本鎖プローブ よりも堅牢であることが証明された。
遺伝子コピ−数評価は、細胞遺伝学及び解剖病理学研究室の双方においてＩＳＨの主な用途である。例えば、ＨＥＲ２の遺伝子状態の決定には１７番染色体セントロメア（ＣＥＮ１７）の計数を使用する必要があるため、ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７比率を計算することができる。しかし、本願に一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ手法を利用するためには、いくつかの技術的ハードルを越える必要があった。第一に、ＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドプローブはＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ用のアッセイ条件に適応している必要があり、第二に、ＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドプローブは適切な感度のために十分に堅牢でなくてはならず、第三に、ＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドプローブはＣＨＲ１７セントロメアに対して十分に特異的でなければならず、したがってヒト胎盤ＤＮＡ又はＣｏｔ１ ＤＮＡなどのハイブリダイゼーション抑制試薬はまったく必要ない。
現在、市販のすべてのＨＥＲ２ ＩＳＨ アッセイは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）を原供給源として得られる二本鎖ＤＮＡの標識されたセグメントを用いる（HER2 FISH PHARMDX Kit Interpretation guide - breast cancer, PATHVYSIONHER2 DNA Probe Kit及びInterpretation Guide Ventana INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Assay参照）。ＢＡＣは、プローブとして（ＨＥＲ２ ＦＩＳＨ ＰＨＡＲＭＤＸ Ｋｉｔ、Ｄａｋｏ及びＰＡＴＨＶＹＳＩＯＮ ＨＥＲ２ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｋｉｔ、Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．）、又は物理学的減算若しくは反復配列の回避によってより特異的な配列を生成するためのテンプレートとして（SPOT-LIGHT HER2 CISH Kit, Life Technologies, Inc.及びINFORM HER2 Dual ISH assay, Ventana Medical Systems, Inc.）フルオロフォア分子で直接的に標識される。これらの二本鎖プローブは、標的に対する十分なハイブリダイゼーションを確実にするために、長いハイブリダイゼーション時間を要する（すなわち６時間〜１８時間）ことがよく知られている。この長いハイブリダイゼーション時間は、低いハイブリダイゼーション効率を示す。重要なことは、組織ベースのＩＳＨアッセイに関連するこの長い所要時間のために、診断を待たなければならない患者に対して悪影響があるということである。表１の基準は、特定のＤＩＳＨアッセイが許容可能か否かを評価するために通常用いられるものである。
Figure 0006982392
これらのアッセイの所要時間を短縮するために、ハイブリダイゼーション効率を向上させるいくつかのアプローチがなされてきた。ハイブリダイゼーション反応速度を加速するための一つのアプローチは、ハイブリダイゼーション緩衝液の組成を変更することであった。現在、ホルムアミドは、核酸鎖の融点及びアニーリング温度を下げるために常套的に使用される。該温度を下げることの利点は、より良好な組織形態を維持することである(McConaughy BL, et al., Biochemistry 8: 3289-3295 (1969)及びBlake RD, Delcourt SG, Nucleic Acids Res 24: 2095-2103 (1996）を参照。これらの開示の全内容は参照により本明細書に援用される）。しかし、ホルムアミドはハイブリダイゼーション速度を下げるため、十分なシグナル強度を得るためには長時間のハイブリダイゼーションが必要になる。最近、Matthiesen SH et al., PLoS One. 2012; 7(7に、ＦＩＳＨハイブリダイゼーション時間を１時間に短縮した効果と共に、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの代替としてエチレンカーボネート（ＥＣ）が報告された。新製品ＨＥＲ２ ＩＱＦＩＳＨ ＰＨＡＲＭＤＸ（Ｄａｋｏ）を支えるのがこの技術である。
もう一つのアプローチは、二本鎖プローブから一本鎖プローブへ切り替えることである。おそらく変性二本鎖プローブの一部が再生してホモ二本鎖プローブを形成し、それゆえ試験試料中のゲノム標的に対する二本鎖プローブによるハイブリダイゼーションが妨げられることから、一本鎖プローブは、二本鎖プローブよりも高い感度を有すると理解される（Taneja K and Singer RH, ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 166.389-398 (1987), Lewis ME, et al., Peptides. 6 Suppl 2:75-87 (1985) 及び Strachan T, Read AP. Human Molecular Genetics. 2nd edition. New York: Wiley-Liss (1999）参照）。
Kourilsky P, et al., Biochimie. 56 (9): 1215-21 (1974)では、プレハイブリダイゼーション工程で溶液中の一本鎖ヌクレオチド（プローブとして利用可能）の割合が、競合鎖ヌクレオチドの量に半比例していることが見出された。本試験で開発された数学モデルは、相同競合がＤＮＡ標的ハイブリダイゼーションの強力な競合相手であることを明らかにした。いくつかの研究室は、一本鎖プローブが二本鎖プローブよりも高いハイブリダイゼーション感度を呈することを報告している（An SF, et al., Mol Cell Probes. Jun;6(3):193-200 (1992), Hannon K, et al,. Anal Biochem. Aug 1;212(2):421-7 (1993)、及びCox KH, et al., Dev Biol. Feb;101(2):485-502 (1984)参照）。特に、Ａｎらの著作は、ドットブロットハイブリダイゼーションにおいて、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識一本鎖プローブ が同じサイズの二本鎖ＤＩＧ ＰＣＲ標識プローブよりも感度が少なくとも二倍高く、同じサイズのニックトランスレーションされた二本鎖プローブよりも感度が１０倍高いことを実証した。ＩＳＨ用途では、一本鎖プローブはより感度が高く、すなわち同じサイズの二本鎖プローブよりも約二倍から４倍の数の感染細胞を検出した。さらに、ＩＳＨで同じサイズの二本鎖プローブよりもはるかに少ないバックグラウンド染色を呈した。一本鎖プローブはＩＳＨでの使用前に精製の必要がなかったが、それに対して二本鎖ＰＣＲプローブは精製を必要とし、そうでない場合には大量の非特異的バックグラウンド染色が存在した。さらに、Ｈａｎｎｏｎらは、ＤＩＧ標識一本鎖ＤＮＡプローブは、ＤＩＧ−二本鎖プローブを用いて得られた（画像解析プログラムによる）強度よりも強度が約２７％高いことを実証した。Cox KHら、Dev Biol. Feb;101(2):485-502 (1984)は、８倍多い一本鎖プローブが明らかな飽和状態で標的配列にハイブリダイズしたのに対し、二本鎖プローブとの観察されたハイブリダイゼーション反応は、使用可能な標的部位の飽和状態をかなり下回るレベルで終了したことを見出した。これは、ほとんどの二本鎖プローブが比較的早くＩＳＨ反応から除去されたことを意味した。上記の知見と一致して、本出願人らは、１時間ハイブリダイゼーションの一本鎖ＨＥＲ２／ＣＨＲ１７プローブが６時間ハイブリダイゼーションの二本鎖プローブと同等の染色性能を得たことを見出した。驚くべきことに、１時間ハイブリダイゼーションの一本鎖プローブはまた、扱いにくい組織のコホート（ＴＭＡ）に対する優れた堅牢性を実証した。本出願人らのデータは、一本鎖プローブが二本鎖プローブよりも高いハイブリダイゼーション効率を有する傾向があるという過去の観察と合致する。
特定の理論に限定されるわけではないが、本出願人らは、より容易に組織に浸透するという、一本鎖プローブのもう一つの利点も認識している。通常、二本鎖プローブは、酵素的ＤＮＡ合成反応において標識ｄＮＴＰを組み込むことにより標識される。標識プローブは、ＤＮａｓｅ処理又は機械的超音波処理によって、より小さな断片にサイズ変更される。標識ＩＳＨプローブの最適な長さは、Cox, et al., Dev Biol. Feb;101(2):485-502 (1984)及びHaase et al. (Haase, A. et al.のMethods in Virology(Maramorosch, K., and Koprowski, Eds), Vol. 7, pp. 189-226, Academic Press, San Diego, CA (1984)参照)によれば、典型的には１００〜４００ヌクレオチドである。しかし、標識プローブのサイズダウンプロセスの「ランダム」な性質は、大部分のプローブを正しいサイズの範囲内にするものの、多様なサイズの集団を生成する。オリゴヌクレオチド合成によって生成された一本鎖プローブは、特に扱いにくい（例えば過固定の）組織標本上で、大きな二本鎖プローブよりも良好に組織へ浸透する該プローブの能力を促進するような明確に定義された短めの長さを有する。本明細書に記載の一本鎖プローブは、扱いにくい組織のコホート（ＴＭＡ）で優れた染色を示し、これは部分的には短くかつ均一のプローブの良好な組織浸透力により説明されうる。
さらに、製造及び品質管理の観点から、正確な構造を有する一本鎖プローブは、オリゴヌクレオチド合成を用い、ＰＣＲ、ニックトランスレーション又は他のランダム合成法に基づいたアプローチと比較してより再現性良く製造される。
オリゴヌクレオチドプローブは、理想的には、標的と最大限に、非標的と最小限にハイブリダイズする( Li X, et al., Nucleic Acids Res., Oct 24; 33(19): 6114-23 (2005)参照)。溶液又はアレイベースのハイブリダイゼーションに適用可能なこれらの参照を検討することは適切でありうるが、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された組織でのゲノム標的へのハイブリダイゼーション速度は比較的高度に予測不可能である。この予測不可能性は、ヒト組織の、特に溶液又はアレイと比較して非常に複雑で可変性のある性質により付与されると理解される。マイクロアレイの用途では、非標的との７５％の同一性を示すか、あるいは１５−、２０−又は３５塩基ストレッチを有する５０−ｍｅｒのプローブが、Kane MD, et al., Nucleic Acids Res. Nov 15;28(22):4552-7 (2000)で交差反応を示した。非標的との８０％の同一性を有する６０−ｍｅｒのプローブは、Hughes TR, et al., Nat Biotechnol. Apr;19(4):342-7 (2001)で非標的に対する交差反応を示した。７０−ｍｅｒに関して同様の結果が、Wang X, Seed B., Bioinformatics.May 1;19(7):796-802 (2003)により示された。
Li X, et al., Nucleic Acids Res., Oct 24; 33(19): 6114-23 (2005)は、５０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを設計するための最適な選択、すなわち＜８７％の同一性、＜１７塩基の連続ストレッチ、及び＞２９ｋｃａｌ／ｍｏｌの自由エネルギーを提案したようである。各標的と９０％を超える同一性を有するプローブに対するシグナル強度が実質的に増加した一方、５０−ｍｅｒ及び７０−ｍｅｒのプローブの双方は、各標的と８５％未満の同一性を有する配列と最小限のクロスハイブリダイゼーションを有することが観察された(He Z, et al., Appl Environ Microbiol.Jul;71(7):3753-60 (2005）参照）。Ｈｅ Ｚらは、検討した条件下で、遺伝子特異的プローブが非標的と＜８５％の同一性を有するはずだと示唆した。
合成オリゴヌクレオチドプローブはメッセンジャーＲＮＡ ＩＳＨのために広く使用されてきたが、最近までゲノム標的には使用されていなかった（Bergstrom Lucas A, Ruvolo M, Kulkarni V, Chen S, Mullinax B, Venneri J, Barboza J, Happe S, Fulmer-Smentek S, Srinivasan M. Designing Custom Oligonucleotide FISH Probes for the Detection of Chromosomal Rearrangements in FFPE Tissues. 米国人類遺伝学会議2013(American Society of Human Genetics 2013 Meeting）参照）。Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍらは、数千のユニークなオリゴヌクレオチドを含むと理解される蛍光標識を有するＳｕｒｅＦＩＳＨプローブを報告した。このオリゴヌクレオチド配列は、染色体再編成を検出するための転座ブレークポイントの対象となる染色体領域にわたりタイル状になっていた。これらのプローブに対し、短いハイブリダイゼーション時間（７５分）が報告された。
１７番染色体 ＩＳＨの最も一般的な標的はセントロメア領域である。すべてのヒト染色体のセントロメア領域は、多様な縦列反復ＤＮＡファミリーであるアルファサテライトの異なる複数のサブセットによって特徴づけられる。アルファサテライトの基本単位は、分岐した１７１ｂｐモノマーであり、これにより高次の染色体特異的反復単位が組織化される。ヒト１７番染色体特異的アルファサテライトは、１１から１６のモノマー範囲の約１０００の多型の高次反復単位を含有する。１７番染色体アルファサテライトの主な形態は、１７番染色体あたり５００から１０００コピーで存在している、１６のモノマーからなる〜２７００塩基対の反復単位である。アルファサテライトＤＮＡクラスターはほとんどの場合最大４０％コンセンサス配列と異なるモノマー変異体を含有するため（Rosandi? M, Paar V, Glunci? M, Basar I, Pavin N, Croat Med J. 2003 Aug; 44(4):386-406）、ブロッキングＤＮＡは、他の染色体に共通する標的遺伝子座の中に含まれる配列を抑制するためにプローブに通常含まれる。本開示の一態様は、８０−ｍｅｒの一本鎖遺伝子プローブと同等の融解温度（Ｔｍ）範囲での、２７００塩基対の反復単位からの一本鎖オリゴヌクレオチドの発見である。特に、１７番染色体セントロメアに特異的な１４の特定の一本鎖オリゴヌクレオチドが、８０−ｍｅｒの遺伝子プローブを用いた遺伝子／セントロメアＤＩＳＨアッセイを確実に可能にしたことが見出された。１４のオリゴヌクレオチド配列は、１６のモノマーのうちの１０からのものであり、したがってそれらは集団におけるハプロタイプに特異的な配列変化を認識する確率を高める。
本明細書の例は、特に一本鎖オリゴヌクレオチドベースのＣＨＲ１７（又はＨＥＲ２／ＣＨＲ１７二重）ＩＳＨアッセイを説明するが、当業者であれば目的の任意の遺伝子／セントロメアの組み合わせに本明細書に開示の発見を適用することができるであろう。
ＩＨＣ及びＩＳＨ試験双方においてしばしば遭遇する困難は、組織が一般的に保存される方法に起因する。何十年もの間、診断病理学研究室の主力は、切片化され、ガラススライドにマウントされた、組織のホルマリン固定、パラフィン包埋ブロックであった。このような防腐剤中での固定は、アミノ酸及び核酸双方の巨大分子の架橋を生じさせる。これらの架橋成分は、標的核酸へのプローブの接近を許容して、抗体が対応する抗原を認識できるようにするためには除去されなければならない。抗原及び／又は核酸の「アンマスキング」は、典型的には複数の前処理、タンパク質消化、及び洗浄工程を使用して手作業で達成される。染色の前に、パラフィンが抗体又はプローブ結合を妨害しないようにパラフィンの完全な除去も必要とされる。脱パラフィンは、パラフィン系溶剤（例えばキシレン、キシレン代替品又はトルエン）である複数（例えば二又は三）の逐次の透徹試薬の使用によって達成されうる。
例示的な実施態様では、調製は細胞コンディショニングの工程を含む。細胞コンディショニングは、出典明示によりその主題事項が援用される米国特許第６８５５５５２号のTowne, et al. 「Automated immunohistochemical and in situ hybridization assay formulations」で詳細に論じられている例示的な細胞コンディショニング工程では、細胞コンディショニング試薬が適用され、試料が適切な時間の間、適切な温度で接触させられて、抗原標的及び／又は核酸標的が検出のために十分に発現されるようになる。本開示の一態様は、自動機器が、ユーザーの入力に応じて細胞コンディショニングの継続時間及び／又は温度を自動的に調整することができることである。細胞コンディショニングは、プロテアーゼ試薬を適用することをさらに含みうる。例示的には、プロテアーゼ処理は、生体試料にプロテアーゼ溶液を接触させる工程を伴いうる。プロテアーゼ処理は、細胞コンディショニングと同様に、標的抗原及び／又は標的核酸の発現を増加させることが意図されている。
例示的な細胞コンディショニング試薬は、核酸標的（ＩＳＨ）用としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶液を含む。接触は、約２から約９０分間、約９５℃の温度でなされうる。タンパク質標的（ＩＨＣ）では、細胞コンディショニング溶液はホウ酸緩衝液であってもよい。接触は、約２から約９０分間、約１００℃の温度でなされうる。考えられる試薬の部分的なリストが、 Analytical Morphology, Gu編., Eaton Publishing Co. (1997)の１〜４０頁にある。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び／又はエチレングリコールがコンディショニング溶液に含まれていてもよい。さらに、金属イオン又は他の物質をこれらの試薬に添加して、細胞コンディショニングの効果を高めてもよい。例示的な細胞コンディショニング溶液は、アリゾナ州ツーソンのヴェンタナメディカルシステムズ社から入手できる（Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＣＣ１） カタログ＃：９５０−１２４；Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ２（ＣＣ２） カタログ＃：９５０−１２３；ＳＳＣ（１０Ｘ） カタログ＃：９５０−１１０；ＵＬＴＲＡ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＵＬＴＲＡ ＣＣ１） カタログ＃：９５０−２２４；ＵＬＴＲＡ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＵＬＴＲＡ ＣＣ２） カタログ＃：９５０−２２３、Ｐｒｏｔｅａｓｅ １ カタログ＃：７６０−２０１８；Ｐｒｏｔｅａｓｅ ２ カタログ＃：７６０−２０１９；Ｐｒｏｔｅａｓｅ ３ カタログ＃：７６０−２０２０）。一実施態様では、免疫組織化学的結合試薬又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション結合試薬の適用は、細胞コンディショニング試薬の適用後で発色試薬の適用前に発生する。
例示的な実施態様では、該方法はすすぎ試薬を適用することを含む。本明細書に記載の様々な工程の合間に、また本明細書に記載のシステムの一部として、すすぎ工程が先の工程からの未反応残留試薬を除去するために加えられうる。すすぎ工程は、混合を伴って又は混合を伴わないで予め決められた温度で予め決められた時間、試料上にすすぎ試薬を維持することを含むインキュベーションをさらに含みうる。このすすぎ工程に適した条件は、様々な工程間で異なっていてもよい。例示的なすすぎ試薬は、アリゾナ州ツーソンのヴェンタナメディカルシステムズ社から入手可能である（Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｘ） カタログ＃：９５０−３００；Ｓｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ Ｗａｓｈ（１０ｘ） カタログ＃：８６０−０１５）。
アリゾナ州ツーソンのヴェンタナメディカルシステムズ社から入手可能である例示的な自動システムは、ＳＹＭＰＨＯＮＹ（登録商標）Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ＃：９００−ＳＹＭ３、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｌｉｄｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃：Ｎ７５０−ＢＭＫＸＴ−ＦＳ、Ｎ７５０−ＢＭＫＵ−ＦＳ、ＶＥＮＴＡＮＡ、及びＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ自動化スライド染色装置を含む。これらのシステムは、放射状に配置されたスライドを支持する回転カルーセルを含むマイクロプロセッサ制御システムを用いている。ステッパモータがカルーセルを回転させ、スライド上方に位置する一連の試薬ディスペンサーのうちの一つの下に各スライドを配置する。スライド及び試薬ディスペンサー上のバーコードは、コンピュータの適切なプログラミングによって、様々な組織試料のそれぞれについて異なる試薬処理を行うことができるように、ディスペンサーとスライドのコンピュータ制御された位置決めを可能にする。
Ａ．１７番染色体
前述のように、１７番染色体（ＣＨＲ１７）ＩＳＨのコントロール領域の最も一般的な標的は、セントロメア領域である。すべてのヒト染色体のセントロメア領域は、多様な縦列反復ＤＮＡファミリーであるアルファサテライトの異なる複数のサブセットによって特徴づけられる。アルファサテライトＤＮＡクラスターはほとんどの場合最大４０％コンセンサス配列と異なるモノマー変異体を含有するため、ブロッキングＤＮＡは、他の染色体に共通する標的遺伝子座の中に含まれる配列を抑制するためにプローブに通常含まれる。
本出願人らは、１時間以内のハイブリダイゼーションでブロッキングＤＮＡの使用なしで、許容可能なシグナル強度レベル及びバックグラウンドレベルを得た、１７番染色体のコントロールプローブコントロール領域（セントロメア領域）に対する一本鎖プローブを設計した（実施例１の表３を参照）。例えば、該プローブは、２以上の染色強度及び核の５０％以上の染色範囲を得るように構成されている。本出願人らは、同じく１時間以内のハイブリダイゼーションでブロッキングＤＮＡの使用なしで、許容可能なシグナル強度レベル及びバックグラウンドレベルを得た、ＨＥＲ２遺伝子座の近傍及び内部の標的領域に対する一本鎖プローブも設計した。
製造及び品質管理の観点から、正確な構造を有する一本鎖プローブは、オリゴヌクレオチド合成を用い、ＰＣＲ、ニックトランスレーション又は他のランダム合成法に基づいたアプローチと比較してより再現性良く製造される。コスト分析の観点から、ＤＮＡをブロックする必要がないプローブは、より安価なアッセイを提供する。
本開示は、染色体のコントロール領域、例えば染色体のセントロメア標的に特異的なコントロールプローブを特徴とする、ＩＳＨためのシステムを説明している。検出される染色体は、１７番染色体又はその他の任意の適切な染色体．でありうる。コントロールプローブは、対照試料に適用された場合、３時間以内に２以上染色強度及び核数の５０％以上の染色範囲を得るように構成されている（例えば上記の表１参照）。いくつかの実施態様では、本発明は、３時間以内に核数の≧５５％の染色範囲、例えば核数の≧６０％、核数の≧６５％、核数の≧７０％、核数の≧７５％、核数の≧８０％、核数の≧８５％、核数の≧９０％を達成する。
いくつかの実施態様では、ＦＩＳＨのためのシステムは、対応する染色体上の（例えば標的遺伝子を検出するための）標的領域に特異的な標的プローブも特徴とする。
いくつかの実施態様では、コントロールプローブは、第一の複数（例えば複数の単一プローブ、プローブのセット又はプールのような異なる複数のプローブ）の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを含む。複数のプローブの一又は複数は、配列番号３〜１６からなる群より選択される配列を含みうる（下記の表３を参照）。いくつかの実施態様では、この一又は複数の第一のプローブは、表３の配列（配列番号３〜１６）のうちの一つの配列の切断型例えば少なくとも３０個の連続ｂｐ、少なくとも３５個の連続ｂｐ、少なくとも４０個の連続ｂｐ、少なくとも４５個の連続ｂｐ、少なくとも５０個の連続ｂｐ、少なくとも５５個の連続ｂｐ、少なくとも６０個の連続ｂｐ、少なくとも６５個の連続ｂｐ、少なくとも７０個の連続ｂｐ、少なくとも７５個の連続ｂｐ等）を含む。いくつかの実施態様では、この一又は複数の第一のプローブは、表３の配列（配列番号３〜１６）と少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。この複数の第一の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは、ヒト１７番染色体のコントロール領域の一部に一意的にかつ特異的にハイブリダイズするように構成されているため、その他の染色体又はその一部は明らかに標識されない。
本明細書で使用される場合、配列番号３〜１６の使用への言及は、配列番号３〜１６の相補配列の使用も含みうる。
いくつかの実施態様では、該プローブは、コントロール領域内の２〜１６の異なる部分を標的とする。いくつかの実施態様では、該プローブは、コントロール領域内の４〜１６の異なる部分を標的とする。いくつかの実施態様では、該プローブは、コントロール領域内の６〜１６の異なる部分を標的とする。いくつかの実施態様では、該プローブは、コンｔのロール領域内の８〜１６の異なる部分を標的とする。いくつかの実施態様では、該プローブは、コントロール領域内の１０〜１６の異なる部分を標的とする。いくつかの実施態様では、該プローブは、コントロール領域内の１２〜１６の異なる部分を標的とする。いくつかの実施態様では、該プローブは、コントロール領域内の１４〜１６の異なる部分を標的とする。いくつかの実施態様では、該プローブは、コントロール領域内の２〜１２の異なる部分を標的とする。いくつかの実施態様では、該プローブは、コントロール領域内の４〜１２の異なる部分を標的とする。いくつかの実施態様では、該プローブは、コントロール領域内の６〜１２の異なる部分を標的とする。いくつかの実施態様では、該プローブは、コントロール領域内の８〜１２の異なる部分を標的とする。いくつかの実施態様では、該プローブは、コントロール領域内の１０〜１２の異なる部分を標的とする。
いずれの理論又は機構にも本発明を限定することは望まないが、該プローブは、１７番染色体の多型の少なくとも６０％、１７番染色体の多型の少なくとも７０％、１７番染色体の多型の少なくとも８０％、１７番染色体の多型の少なくとも９０％、１７番染色体の多型の少なくとも９５％、１７番染色体の多型の少なくとも９９％等を同定することができると考えられる。いくつのモノマーを、１７番染色体の多型の少なくとも６０％、１７番染色体の多型少なくとも７０％、１７番染色体の多型少なくとも８０％、１７番染色体の多型少なくとも９０％、１７番染色体の多型の少なくとも９５％、１７番染色体の多型少なくとも９９％等を同定するのに十分であるように探索する必要があるのかは、明らかではない。
第一の複数の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは、様々な長さで構成されてもよい。例えば、いくつかの実施態様では、該プローブはそれぞれ４０〜１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、該プローブはそれぞれ５０〜１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、該プローブはそれぞれ６０〜１１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、該プローブはそれぞれ４０〜１２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、該プローブはそれぞれ少なくとも４０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、該プローブはそれぞれ少なくとも５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、該プローブはそれぞれ少なくとも６０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、該プローブはそれぞれ少なくとも７０個のヌクレオチドを含む。
本発明はまた、染色体の制御（例えばＣＨＲ１７の制御）のために染色された複数の核を伴うスライドを特徴とする。該スライドは、一又は複数の上記のシステム（例えばプローブ）と接触していてもよい。該スライドは、細胞中に存在する１７番染色体セントロメア領域の数を示す計数可能なシグナルを特徴とし、例えば細胞は通常、ＣＨＲ１７セントロメアのコピーを二つ示すはずである。
いくつかの実施態様では、核の５０％超が染色体の計数可能なシグナルを有する。計数可能なシグナルは、一般的に円形である。図１６に示すようにこの円形を定義することができる。図１６では、円形は第一の領域内に収まる単純閉曲線であり、この第一の領域は内側の円の円上及び外側、並びに外側の同心円の円上及び内側にあり、この内側の円は内半径（Ｒｉｎ）を有し、この外側の円は外半径（Ｒｏｕｔ）を有し、ここで単純閉曲線は半径Ｒｓｉｍｐｌｅを有し、Ｒｉｎ≦Ｒｓｉｍｐｌｅ≦Ｒｏｕｔであり、またＲｉｎはＲｏｕｔの≧５０％である。単純閉曲線は、それ自体と交差せず、開始点と同じ点で終わる曲線である。
いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の４０％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の５０％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の５５％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の６０％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の６５％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の７０％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の７５％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の８０％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の８５％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の９０％以上である。
いくつかの実施態様では、核の６０％超が染色体の計数可能なシグナルを有する。いくつかの実施態様では、核の７０％超が染色体の計数可能なシグナルを有する。いくつかの実施態様では、核の８０％超が染色体の計数可能なシグナルを有する。いくつかの実施態様では、核の９０％超が染色体の計数可能なシグナルを有する。核は、組織切片プロセスが細胞のその部分を破壊した場合、細胞のその部分が二のスライドに分割される場合、又は細胞のその部分が丸ごと別のスライドにある場合には、計数不可能でありうる。また、核は、組織状態がその特定の結合部位へのプローブの浸透を妨げる（すなわち、細胞がプローブに十分に接近できない）場合、又はＤＮＡの標的領域が実質的に劣化している場合には、計数可能でありうる。
いくつかの実施態様では、染色シグナルで覆われている表面面積の和が計算され、１００％の値が割り当てられ、その表面面積の和の少なくとも５０％は個別の丸い（又は円形の）シグナルに由来する。
図１６に示すように円形を定義することができる。図１６では、円形は第一の領域内に収まる単純閉曲線であり、この第一の領域は内側の円の円上及び外側、並びに外側の同心円の円上及び内側にあり、この内側の円は内半径（Ｒｉｎ）を有し、この外側の円は外半径（Ｒｏｕｔ）を有し、ここで単純閉曲線は半径Ｒｓｉｍｐｌｅを有し、Ｒｉｎ≦Ｒｓｉｍｐｌｅ≦Ｒｏｕｔであり、またＲｉｎはＲｏｕｔの≧５０％である。
いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の５０％以上である。いくつかの実施態様では、前記表面面積の６０％超が、個別のラウンドシグナルに由来する。いくつかの実施態様では、前記表面面積の７０％超が、個別のラウンドシグナルに由来する。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の６０％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の７５％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の９０％以上である。
いくつかの実施態様では、外半径は、約０．２５〜０．６７５μｍである。いくつかの実施態様では、外半径は、約０．２〜０．７５μｍである。いくつかの実施態様では、外半径は、約０．１５〜１μｍである。いくつかの実施態様では、計数可能なシグナルの平均外半径は、約０．２〜０．７５μｍである。いくつかの実施態様では、計数可能なシグナルの平均外半径は、約０．５μｍ未満の標準偏差を有する。いくつかの実施態様では、計数可能なシグナルの平均外半径は、約０．２５μｍ未満の標準偏差を有する。
いくつかの実施態様では、計数可能なラウンドシグナルは単一粒径である。本明細書で使用される場合、「単一粒径の」ラウンドシグナルの集団は、互いのプラス又はマイナス１５％以内のＲｓｉｍｐｌｅを有する。いくつかの実施態様では、「単一粒径の」ラウンドシグナルの集団は、互いのプラス又はマイナス１０％以内のＲｓｉｍｐｌｅを有する。いくつかの実施態様では、「単一粒径の」ラウンドシグナルの集団は、互いのプラス又はマイナス５％以内のＲｓｉｍｐｌｅを有する。
Ｂ．標的遺伝子（ＨＥＲ２）
いくつかの実施態様では、ＦＩＳＨのためのシステムは、対応する染色体上の（例えば標的遺伝子を検出するための、遺伝子コピー計数のための）標的領域に特異的な標的プローブも特徴とする。
この標的領域は、ＨＥＲ２遺伝子座（又は近傍のヌクレオチド）を含みうる。本明細書で開示されるのは、ヒトＨＥＲ２遺伝子に対するプローブである（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の項参照）。下記の実施例１で詳細に説明するように、ＨＥＲ２標的プローブは、ヒト１７番染色体のヌクレオチド３５，０２７，９７９と３５，３５５，５１６の間の領域に特異的である。
いくつかの実施態様では、標的プローブは、第二の複数（例えば複数の単一プローブ、プローブのセット又はプールのような異なる複数のプローブ）の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを含む。この第二の複数の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは対応する染色体の標的領域の一部に一意的にかつ特異的にハイブリダイズするように構成されているため、その他の遺伝子又は染色体又はそれらの一部は明らかに標識されない。
本発明はまた、１７番染色体のコントロール領域を可視化する手段を特徴とする。いくつかの実施態様では、１７番染色体のコントロール領域を可視化する手段は、プローブに特異的な検出試薬とプローブを接触させる工程を含む。検出試薬は当該技術分野でよく知られている。例えば、検出試薬は、抗体又は他のプローブを含むことができ、これがコントロールプローブに結合する。検出試薬は、プローブの第一の標識を可視化する分子（例えば酵素、基質、タグ）を含んでもよい。検出試薬は、プローブを可視化するのに有効な複数の試薬（例えば複数の抗体、酵素、基質、色素原等）を含んでもよい。いくつかの実施態様では、検出試薬は発色性である。追加の検出試薬（標識、タグ、酵素、基質、色素原、抗体等）が本明細書でさらに開示される。本発明はまた、１７番染色体のコントロール領域を可視化する手段を特徴とし、ここで、プローブ（例えば第一の標識）は検出試薬により可視化され、第一の標識の可視性は１７番染色体のコントロール領域を示唆する。標識されたプローブの可視化の手段は、当業者によく知られている。例えば、いくつかの実施態様では、１７番染色体のコントロール領域を可視化する手段は、顕微鏡（例えば明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、倒立顕微鏡）を含む。いくつかの実施態様では、１７番染色体のコントロール領域を可視化する手段は、照度計を含む。いくつかの実施態様では、１７番染色体のコントロール領域を可視化する手段は、放射分析検出器（例えばガンマカウンター等）を含む。いくつかの実施態様では、１７番染色体のコントロール領域を可視化する手段は、分光計を含む。いくつかの実施態様では、１７番染色体のコントロール領域を可視化する手段は、リアルタイムＰＣＲ機器を含む。いくつかの実施態様では、１７番染色体のコントロール領域を可視化する手段は、シンチレーション及び／又は発光カウンターを含む。いくつかの実施態様では、１７番染色体のコンｔのロール領域を可視化する手段は、測色計を含む。１７番染色体のコントロール領域を可視化するその他の手段は、当該技術分野で知られている。
Ｃ．キット
一又は複数のオリゴヌクレオチドプローブ（例えば配列番号３〜１６のうちの一又は複数）を含むキットも開示される。例えば、キットは、本明細書に記載の少なくとも一のプローブ（例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のプローブ）又は少なくとも一のプローブセット（例えば少なくとも１、２、３、４又は５のプローブセット）を含みうる。一例では、このキットは、例えば配列番号３〜１６の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又はすべて（又は配列番号３〜１６と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％同一である配列、又は配列番号３〜１６の切断型）のプローブを含む。その他の例では、該プローブ（又は該プローブセット）は、単一の容器に入っている。
キットはまた、（例えばｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションにより）プローブを検出するための、又は検出可能に標識されたプローブを製造するための、一又は複数の試薬を含んでもよい。例えば、キットは、一又は複数の緩衝液、標識ｄＮＴＰ、標識酵素（例えばポリメラーゼ）、プライマー、ヌクレアーゼを含まない水、及び標識プローブを製造するための使用説明書の他に、開示の核酸プローブ又はプローブセットのうちの少なくとも一を含みうる。他の例では、該キットは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施するための緩衝液及び他の試薬の他に、一又は複数の開示の核酸プローブ（非標識又は標識されている）を含む。例えば、一又は複数の非標識プローブがキットに含まれる場合、特異的検出剤（例えば蛍光性、発色性、発光性及び／又はラジオメトリック）及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを実施するための他の試薬、例えばパラフィン前処理緩衝液、プロテアーゼ及びプロテアーゼ緩衝液、プレハイブリダイゼーション緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄緩衝液、対比染色料、封入剤又はこれらの組み合わせの他に、標識試薬もキットに含まれうる。いくつかの例では、このようなキットの構成要素は別々の容器内に存在する。キットは場合によって、プローブのハイブリダイゼーション及びシグナルを評価するための対照スライド（例えば陽性又は陰性対照）をさらに含みうる。
ある例では、該キットはアビジン、抗体、及び／又は受容体（又は他の抗リガンド）を含む。一又は複数の検出剤（一次検出剤及び、任意選択的に、二次、三次又は追加の検出試薬）は、例えばハプテン又はフルオロフォア（蛍光色素又は量子ドットなど）で標識されている。いくつかの例では、検出試薬は、異なる検出可能な部分（例えば異なる蛍光色素、スペクトル的に識別可能な量子ドット、異なるハプテン等）で標識されている。例えば、キットは、異なる標的核酸（例えば本明細書に開示の任意の標的核酸）に対応し、ハイブリダイズすることができる二以上の核酸プローブ又はプローブセットを含みうる。第一のプローブ又はプローブセットは、第一の検出可能な標識（例えばハプテン、フルオロフォアなど）で標識することができ、第二のプローブ又はプローブセットは、第二の検出可能な標識で標識することができ、また任意の追加の（例えば第三、第四、第五、第六の）プローブ又はプローブセットは追加の検出可能な標識で標識することができる。他の検出スキームが可能ではあるが、第一、第二、及びそれに続く任意のプローブ又はプローブセットは、異なる検出可能な標識で標識することができる。プローブ（単数又は複数）がハプテンのような間接的に検出可能な標識で標識されている場合、該キットは、いくつか又はすべてのプローブ用の検出剤（例えば標識されたアビジン、抗体又は他の特異的結合剤）を含みうる。一実施態様では、該キットは、マルチプレックスＩＳＨに適したプローブ及び検出試薬を含む。
一例では、該キットはまた、標識（例えば酵素、フルオロフォア又は蛍光ナノ粒子）にコンジュゲートした抗体などの抗体コンジュゲートを含む。いくつかの例では、該抗体は、ＰＥＧ、６Ｘ−Ｈｉｓ、ストレプトアビジン又はＧＳＴのようなリンカーを介して標識にコンジュゲートしている。
検出可能な標識及び標識方法
本明細書に開示のプローブは、例えば目的のプローブ／核酸配列（又は領域）の検出を可能にするために、一又は複数の標識（例えば少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６等）を含みうる。Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などの様々な用途において、核酸プローブは標識（例えば検出可能な標識）を含む。「検出可能な標識」は、試料中のプローブ（特に結合又はハイブリダイズドプローブ）の存在又は濃度を示す検出可能なシグナルを生成するために使用されうる分子又は物質である。したがって、標識された核酸分子は、試料中の（標識された一意的で特異的な核酸分子に結合又はハイブリダイズされる）標的核酸の存在又は量（例えば遺伝子コピ−数）の指標を提供する。例が示されているものの、本開示は、特定の標識の使用に限定されるものではない。
一又は複数の核酸分子（例えば開示のプローブ）に関連する標識は、直接的に又は間接的に検出することができる。標識は、光子（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数、及び紫外線周波数の光子を含む）の吸収、発光及び／又は散乱を含む既知の又はまだ見出されていない任意の機構によって検出することができる。検出可能な標識は、着色、蛍光、リン光、及び発光分子並びに物質、検出可能な差異を提供するために（例えば無色の物質を着色物質に変換することにより若しくはその逆により、又は沈殿物を生成するか若しくは試料濁度を上げることにより）一つの物質を別の物質に変換する触媒（酵素など）、抗体結合相互作用により検出することができるハプテン、並びに常磁性及び磁性分子又は物質を含む。
検出可能な標識の特定の例は、蛍光分子（又は蛍光色素）を含む。多くの蛍光色素が当業者に知られており、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから選択することができる。核酸分子（例えば一意的に特異的な結合領域）に付着（例えば化学的にコンジュゲート）することができる特定のフルオロフォアの例は、Nazarenko et al.の米国特許第５８６６３６６号に提供され、例えば４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン及び誘導体、例えばアクリジン及びアクリジンイソシアネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニラミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン及び誘導体、例えばクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ １２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルコウルアリン（７−ａｍｉｎｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（Ｃｏｕｍａｒｉｎ １５１）；シアノシン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’、５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体、例えばエオシン及びエオシンイソチオシアネート；エリスロシン及び誘導体、例えばエリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体、例えば５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、及びＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）；２’、７’−ジフルオロフルオレセイン（ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（登録商標））；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロン；オルト−クレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体、例えばピレン、ピレンブチレート、及びスクシンイミジル １−ピレンブチレート；Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ）；ローダミン及び誘導体、例えば６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体である。
他の適切なフルオロフォアは、約６１７ｎｍで発光するチオール反応性ユーロピウムキレート（Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem., 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem., 274:3315-22, 1999）、並びにＧＦＰ、リサミンＴＭ、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン、及びキサンテン（Lee et al.の米国特許第５８００９９６号に記載）及びその誘導体を含む。例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手可能なものなど、当業者に知られているその他のフルオロフォアも使用することができ、これには、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）シリーズの染料（例えば米国特許第５６９６１５７号、第６１３０１０１号、及び第６７１６９７９号に記載）、ＢＯＤＩＰＹシリーズの染料（例えば米国特許第４７７４３３９号、第５１８７２８８号、第５２４８７８２号、第５２７４１１３号、第５３３８８５４号、第５４５１６６３号、及び第５４３３８９６号に記載のようなジピロメテンホウ素ジフルオリド染料）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（米国特許第５１３２４３２号に記載のスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）、及びＭａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（米国特許第５８３０９１２号）が含まれる。上記の蛍光色素に加えて、蛍光標識は、半導体ナノ結晶などの蛍光ナノ粒子、例えば量子ドットであってもよい。追加の標識は、例えば放射性同位体（３Ｈなど）、金属キレート（放射性金属イオン又はＧＤ３＋のような常磁性金属イオンのＤＯＴＡキレート及びＤＰＴＡキレートなど）、及びリポソームを含む。
核酸分子（例えば本開示のプローブ）と共に使用することができる検出可能な標識は、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−ラクタマーゼも含む。検出可能な標識が酵素を含む場合、発色性化合物、蛍光性化合物又は発光性化合物は、検出可能なシグナルを生成する酵素と組み合わせて使用することができる（多くのこのような化合物が、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている）。発色性化合物の特定の例は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ファーストブルー、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β-ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β-Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、及びテトラゾリウムバイオレットを含む。
あるいは、酵素は、金属組織検出スキームにおいて使用することができる。例えば、銀ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法は、ハイブリダイズされたゲノム標的核酸配列の同定及び局在化のための金属組織検出スキームを伴う。金属組織検出法は、水溶性金属イオン及び酵素のレドックス不活性な基質と組み合わせて、アルカリホスファターゼなどの酵素を使用することを含む。該基質は、酵素によりレドックス活性剤に変換され、該レドックス活性剤は金属イオンを還元し、それにより検出可能な沈殿物が形成される（例えば米国特許第７６３２６５２号参照）。金属組織検出法は、やはり検出可能な沈殿物を形成するために、水溶性金属イオン、酸化剤、及び還元剤と併せてオキシドレダクターゼ酵素を使用することも含む（例えば米国特許第６６７０１１３号参照）。
非限定的な例では、本開示の核酸プローブは、ハプテン分子（例えば芳香族ニトロ化合物（２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）など）、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等）に共有結合的に付着したｄＮＴＰで標識される。本開示のプローブを標識するのに適した追加のハプテンは、ニトロピラゾール、３−ヒドロキシキノキサリン、チアゾールスルホンアミド、ニトロケイ皮酸、ロテノン、７−（ジエチルアミノ）クマリン−３−カルボン酸、ベンゾジアゼピン又はベンゾフランハプテンを含む（例えば、参照により本明細書に援用される国際特許出願公開第２０１２／００３４７６号を参照）。（例えば標識プローブへの組み込みを容易にするために）ハプテン及び他の標識をｄＮＴＰにコンジュゲートするための方法は、当該技術分野でよく知られている。手順の例については、例えば米国特許第５２５８５０７号、第４７７２６９１号、第５３２８８２４号、及び第４７１１９５５号を参照のこと。実際に、多くの標識ｄＮＴＰが、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から市販されている。標識は、リン酸（例えばα、β又はγリン酸）又は糖などのｄＮＴＰ上の任意の位置で直接的に又は間接的にｄＮＴＰに付着しうる。
標識核酸分子の検出は、ゲノム標的核酸に結合したハプテン標識核酸分子を一次抗ハプテン抗体と接触させることによって得ることができる。一例では、一次抗ハプテン抗体（例えばマウス抗ハプテン抗体）が、酵素で直接的に標識される。別の例では、酵素にコンジュゲートした二次抗種抗体（例えばヤギ抗マウスＩｇＧ抗体）が、シグナル増幅のために使用される。発色性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）においては発色性基質が添加され、ＳＩＳＨの場合には、参照の特許／出願で概説されるように、銀イオン及び他の試薬が添加される。
いくつかの例では、プローブは、酵素（重合）反応を使用して一又は複数の標識されたｄＮＴＰを組み込むことにより標識される。例えば、（例えばプラスミドベクターに組み込まれた）本開示の核酸プローブは、（例えばビオチン、ＤＮＰ、ジゴキシゲニン等を使用する）ニックトランスレーションによって、又はターミナルトランスフェラーゼによるランダムプライマー伸長（例えば３’末端テーリング）によって標識されうる。いくつかの例では、核酸プローブは、ＤＮＡポリメラーゼＩのデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）に対する比率が出発物質の１００％超を生産するように改良されている改良ニックトランスレーション反応によって標識される。特定の例では、このニックトランスレーション反応は、ＤＮＡポリメラーゼＩをＤＮａｓｅ Ｉに対して少なくとも約８００：１、例えば少なくとも２０００：１、少なくとも４０００：１、少なくとも８０００：１、少なくとも１００００：１、少なくとも１２０００：１、少なくとも１６０００：１、例えば約８００：１から２４０００：１の比率で含み、また、該反応は、実質的に等温度、例えば約 １６℃から２５oＣ（例えば室温）で一晩（例えば約１６〜２２時間）実施される。プローブセットにプローブが含まれる場合（例えば複数のプラスミド、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のプラスミド）、該プラスミドは、標識反応（例えばニックトランスレーション又は改良ニックトランスレーション）を実施する前に等モル比で混合されてもよい。
他の例では、化学標識法も用いられうる。多くの試薬（ハプテン、フルオロフォア、及び他の標識ヌクレオチドを含む）並びに他のキットが、本開示の核酸プローブを含む核酸の酵素標識用に市販されている。当業者には明らかであるように、上に開示された標識及び検出方法のいずれも、（例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応における使用のための）プローブを標識化する文脈において適用可能である。例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＭＵＬＴＩＰＲＩＭＥ（登録商標）ＤＮＡ標識システム、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手可能な種々の特異的な試薬及びキット又は他の任意の類似の試薬及びキットが本明細書に開示の核酸を標識するために使用されうる。特定の例において、本開示のプローブは、直接的又は間接的に、ハプテン、リガンド、蛍光部分（例えばフルオロフォア又は半導体ナノ結晶）、発色性部分又は放射性同位体で標識されうる。例えば、間接的な標識化の場合、標識は、リンカー（例えばＰＥＧ又はビオチン）を介して核酸分子に付着しうる。プローブ核酸分子を標識するために使用されうる追加の方法が、米国特許第７５４１４５５号に提供されている。
Ｅ．染色体計数のためのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法
本発明はまた、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを用いる遺伝子標的及び染色体（例えば染色体のセントロメア標的）の検出のための、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイ、例えば明視野ＩＳＨアッセイを特徴とする。例えば、方法は、染色体（例えば１７番染色体）のコントロール領域に特異的なコントロールプローブと組織試料を接触させることを含み、ここでコントロールプローブは少なくとも一の第一の標識で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドプローブである。コントロールプローブは、対照試料に適用した場合に、３時間以内に≧２の染色強度及び核の≧５０％の染色範囲を得るように構成されてもよい。該方法は、約３時間未満（例えば≦約２．５時間、≦約２時間、≦約 １．５時間又は≦約１時間）の時間条件下でコントロールプローブをコントロール領域にハイブリダイスすること、試料をすすいで非結合プローブを除去すること、及びハイブリダイズされたプローブの存在を検出することをさらに含む。
いくつかの実施態様において、本方法は、染色体のコントロール領域（例えばＨＥＲ２）に特異的なコントロールプローブと組織試料を接触させることをさらに含み、ここでコントロールプローブは少なくとも一の第二の標識で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドプローブである。
いくつかの実施態様において、該方法は、第一の標識を認識する発色性検出試薬を適用すること、及び前記第一の標識に関連するシグナルを増幅させることをさらに含む。該方法は、本明細書に記載の一又は複数のプローブ（例えば配列番号３〜１６）又はシステムの使用を特徴としうる。
ゲノム特異的なブロッキングＤＮＡ（例えばヒトＤＮＡ、例えば全ヒト胎盤ＤＮＡ又はＣｏｔ−１ＴＭＤＮＡ）は、ヒトゲノム標的核酸と相補的なプローブを利用する場合に反復ＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションを抑制するために、又は高度に相同の（しばしば同じ）オフ・ターゲット配列へのプローブのハイブリダイゼーションを妨ぐために、ハイブリダイゼーション溶液（例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用）中に通常含まれる。ゲノム特異的なブロッキングＤＮＡの非存在下で標準的プローブを用いるハイブリダイゼーションでは、「無反復」プローブを使用する場合であっても、許容できないほど高レベルのバックグラウンド染色（例えば非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションのような非特異的結合）が、通常存在する。本開示の核酸プローブは、ブロッキングＤＮＡの非存在下でも、低減されたバックグラウンド染色を示す。特定の例では、本開示のプローブを含むハイブリダイゼーション溶液は、ゲノム特異的なブロッキングＤＮＡ（該プローブがヒトゲノム標的核酸に相補的である場合、例えば全ヒト胎盤ＤＮＡ又はＣｏｔ−１ＴＭＤＮＡ）を含まない。この利点は、核酸プローブに含まれる標的配列の一意的に特異的な性質に由来し、各標識プローブ配列は、同族の一意的に特異的なゲノム配列にしか結合しない。これは、ＩＳＨ法のシグナル対ノイズ比の劇的な増加をもたらす。
このように、本明細書中のいくつかの方法は、ブロッキングＤＮＡの使用を免れうる。しかし、いくつかの実施態様では、ブロッキングＤＮＡを使用してもよい。いくつかの実施態様では、ある量のブロッキングＤＮＡｉが使用されるが、その量は、非特異的結合の特定のパーセント、例えば５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％未満だけを遮断するのに十分な量である。
非特異的結合の特定のパーセント（例えば５０％）以下を遮断するのに十分なブロッキングＤＮＡの量を決定するために、以下の試験が実施されうる。Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを設定し、染色体のコントロール領域に特異的な二本鎖コントロールプローブと組織試料を（ゼロから連続的に、徐々に増加する量のブロッキングＤＮＡと組み合わせて）接触させ、二本鎖コントロールプローブをコントロール領域にハイブリダイズさせ、試料をすすいで非結合二本鎖プローブを除去し、ハイブリダイズされたプローブの存在を検出する。次いで、各アッセイにおいて連続的にブロッキングＤＮＡを増加させることによりブロックされるバックグラウンドの量を観察する。バックグラウンドの特定のパーセントのブロッキングを得るブロッキングＤＮＡの量は、非特異的結合の特定のパーセント（例えば５０％）以下を遮断するのに十分なブロッキングＤＮＡの量に相当する。例えば、バックグラウンドの５０％を遮断することを得るブロッキングＤＮＡの量は、非特異的結合の５０％以下を遮断するのに十分なブロッキングＤＮＡの量に相当する。
いくつかの実施態様では、前記ブロッキングＤＮＡの量は、約１ｐｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、前記ブロッキングＤＮＡの量は、約１ｐｇ／ｍｌから０．５ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、前記ブロッキングＤＮＡの量は、約１ｐｇ／ｍｌから０．２５ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、前記ブロッキングＤＮＡの量は、約１ｐｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌである。
いくつかの例示的な実施態様では、細胞あたり二の明視野発色性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションシグナルを得るための方法は、単一の染色体のコントロール領域に特異的なコントロールプローブ（これはブロッキングＤＮＡの非存在下で明らかに非特異的に結合しないように選択されている）と複数の細胞を含有する組織試料を接触させること、該コントロールプローブを前記染色体のコントロール領域にハイブリダイズさせること、試料をすすいで非結合プローブを除去すること、及び細胞あたり二の明視野発色性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションシグナルを生成するために、ハイブリダイズされたプローブの存在を発色試薬を介して検出することを含みうる。選択されたプローブがブロッキングＤＮＡの非存在下で明らかに非特異的に結合しないことを決定するために、前記のアッセイ（アッセイ１）と併せて、比較アッセイ（アッセイ２）を実施することができ、アッセイ１とアッセイ２の両方で同じ選択されたプローブが使用される。アッセイ１はブロッキングＤＮＡなしで、アッセイ２はブロッキングＤＮＡを用いる。次いで、この二つのアッセイのそれぞれのデータが比較される。二つのそれぞれのアッセイのデータが同じか又は実質的に同じである場合、選択されたプローブは、ブロッキングＤＮＡの非存在下で、明らかに非特異的に結合しない。
いくつかの例では、ハイブリダイゼーション溶液は、負に帯電したプローブＤＮＡに非特異的に結合することができる高い正味正電荷を有する非ＤＮＡ物質（例えば反応容器又はスライド）に対するプローブの非特異的結合を減少させるために、異なる生物からのキャリアＤＮＡ（ゲノム標的核酸がヒトゲノム標的核酸である場合、例えばサケ精子ＤＮＡ又はニシン精子ＤＮＡ）を含有してもよい。
本発明の方法は、シグナルを検出することを含むことができ、ここで、組織試料の核の５０％超が前記染色体の計数可能なシグナルを有し、計数可能なシグナルは一般に、（例えば上記のように）円形である。いくつかの実施態様では、バックグランドシグナルは、組織試料の細胞の＞７０％において観察されない。いくつかの実施態様では、バックグランドシグナルは、組織試料の細胞の＞８０％において観察されない。いくつかの実施態様では、バックグランドシグナルは、組織試料の細胞の＞９０％において観察されない。いくつかの実施態様では、バックグランドシグナルは存在するが、核の＞５０％において計数可能なシグナルの識別を可能にするほど十分弱い。
いくつかの実施態様では、核の６０％超が計数可能な染色体シグナルを有する。いくつかの実施態様では、核の７０％超が計数可能な染色体シグナルを有する。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の６０％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の７５％以上である。いくつかの実施態様では、内半径は、外半径の９０％以上である。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、中期又は間期の染色体調製物（例えばスライドにマウントされた細胞又は組織試料）の文脈で、標的核酸（例えばゲノム標的核酸）を含む試料を、標的核酸に対して特異的であるか又は特異的にハイブリダイズ可能な標識されたプローブ（例えば本明細書に開示のプローブの一又は複数）と接触させることを伴う。スライドは、例えば均一なハイブリダイゼーションを妨害しうるパラフィン又は他の物質を除去するために、前処理されてもよい。二本鎖核酸を変性させるために、染色体試料及びプローブは両方とも、例えば加熱により処理される。プローブ（適切なハイブリダイゼーション緩衝液中で調製されたもの）及び試料は、ハイブリダイゼーションが起こるのを可能にするような条件下でかつ十分な時間（典型的には、平衡に到達するまで）混合される。染色体調製物は過剰のプローブを除去するために洗浄され、標的の特異的標識の検出が標準的な技術を用いて実施される。
例えば、ビオチン化プローブは、蛍光標識アビジン又はアビジン−アルカリホスファターゼを用いて検出されうる。蛍光色素検出については、蛍光色素を直接的に検出することができ、又は試料を、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合アビジンと共にインキュベートすることができる。必要であれば、ＦＩＴＣシグナルの増幅を、ビオチン結合ヤギ抗アビジン抗体とのインキュベーション、洗浄、及びＦＩＴＣ結合アビジンとの第二のインキュベーションにより行うことができる。酵素活性による検出のために、試料を、例えばストレプトアビジンとインキュベートし、洗浄し、ビオチン結合アルカリホスファターゼとインキュベートし、再度洗浄し、（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）緩衝液中で）プレ平衡化することができる。酵素反応は、例えば ＮＢＴ／ＢＣＩＰ含有ＡＰ緩衝液中で実施し、２Ｘ ＳＳＣ中でのインキュベーションにより停止することができる。Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法の一般的な説明については、例えば、米国特許第４８８８２７８号（その開示はその全内容が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨのための多くの手順が当技術分野で知られている。例えば、ＦＩＳＨを実施するための手順が米国特許第５４４７８４１号；第５４７２８４２号；及び第５４２７９３２号に記載されており、ＣＩＳＨが米国特許第６９４２９７０号に記載されており、また追加の検出方法が米国特許第６２８０９２９号で提供され、これらの開示はその全内容が参照により本明細書に援用される。
感度、解像度又は他の所望の特性を改善するために、多くの試薬及び検出スキームがＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨ法と組み合わせて使用されうる。上述のように、ＦＩＳＨを実施する場合、フルオロフォア（蛍光染料及び量子ドットを含む）で標識されたプローブを、直接的に光学的に検出することができる。あるいは、プローブは、例えばハプテンのような非蛍光性分子（例えば、次の非限定的例：ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ、及び種々のオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオウレア、ロテノン、
クマリン、クマリン系化合物、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン系化合物、及びそれらの組み合わせ）、リガンド又は他の間接的に検出可能な部分で標識されうる。このような非蛍光性分子（及びそれらが結合する標的核酸配列）で標識されたプローブは、次いで試料（例えばプローブが結合する細胞又は組織試料）を、選択したハプテン又はリガンドに特異的な抗体（又は受容体若しくは他の特異的な結合パートナー）などの標識された検出試薬と接触させることにより検出されうる。検出試薬は、フルオロフォア（例えば量子ドット）又は他の間接的に検出可能な部分で標識することができ、又は一若しくは複数の追加の特異的結合剤（例えば二次抗体又は特異的抗体）と接触させて、その結果としてフルオロフォアで標識することができる。場合によって、検出可能な標識は、抗体、受容体（又は他の特異的結合剤）に直接的に付着している。
あるいは、検出可能な標識は、ヒドラジドチオールリンカー、ポリエチレングリコールリンカーなどのリンカーを介して、又は同等の反応性を有するその他の任意のフレキシブルな付着部分を介して接合剤に付着する。例えば、抗体、受容体（又は他の抗リガンド）、アビジン等の特異的な結合剤は、ヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーなどのヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーを介して、フルオロフォア（又は他の標識）で共有結合的に修飾されうる。ヘテロ二官能性リンカーは、例えばカルボニル反応性基、アミン反応性基、チオール反応性基、及び光反応性基から選択される二の異なる反応性基を結合し、これらのうちの第一のものは標識に付着し、第二のものは特異的な結合剤に付着する。
他の例では、プローブ又は特異的結合剤（例えば一次抗体などの抗体、受容体又は他の結合剤など）は、蛍光発生組成物又は発色性組成物を検出可能な蛍光シグナル、着色シグナル又は（例えばＳＩＳＨで検出可能な金属粒子の沈着などのような）他の検出可能なシグナルに変換することが可能な酵素で標識されている。上記のように、酵素は、リンカーを介して関連するプローブ又は検出試薬に直接的又は間接的に付着しうる。適切な試薬（例えば結合試薬）及び化学物質（例えばリンカー及び連結化学物質）の例は米国特許出願公開第２００６／０２４６５２４号、第２００６／０２４６５２３号、及び第２００７／０１１７１５３号に記載されており、これらの開示はその全内容が参照により本明細書に援用される。
さらなる例において、プローブの感度を上げるために、例えばシグナル増幅法が利用される。例えば、チラミドシグナル増幅を利用してもよい（開示の全内容が参照により本明細書に援用される米国特許第５１９６３０６号参照）。この方法の一つの変形例において、ビオチン化核酸プローブは、標的に結合することにより標的の存在を検出する。次に、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートが加えられる。ストレプトアビジンは、ビオチンに結合する。ビオチン化チラミドの基質（チラミンは４−（２−アミノエチル）フェノールである）が使用され、それはペルオキシダーゼ酵素と相互作用する際、恐らくフリーラジカルになる。フェノール系ラジカルは、次いで周囲の物質と素早く反応し、それゆえ近傍にビオチンを沈着させるか又は固定する。このプロセスはさらなる基質（ビオチン化チラミド）を与え、さらに局在化されたビオチンを増大させることにより繰り返される。最後に、「増幅された」ビオチン沈着物が、蛍光分子に付着したストレプトアビジンで検出される。あるいは、増幅されたビオチン沈着物は、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体で検出することができ、次いで３，３’−ジアミノベンジジンが供給され、褐色の色が生成される。蛍光分子に付着したチラミドは、酵素の基質としても働くことが判明しており、ゆえに工程を除外することによってこの方法は簡略化される。さらに別の増幅法が米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７９号に記載されており、その開示の全内容は参照により本明細書に援用される。
他の例において、シグナル増幅法は、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅を利用する。いくつかの例において、標的特異的オリゴヌクレオチド（標識増量剤（ｌａｂｅｌ ｅｘｔｅｎｄｅｒ）及び捕捉増量剤（ｃａｐｔｕｒｅ ｅｘｔｅｎｄｅｒ）が高ストリンジェンシーで標的核酸にハイブリダイズされる。捕捉増量剤は、標的にハイブリダイズしてプローブを捕捉するように設計されており、プローブがマイクロウェルプレートに付着する。標識増量剤は、標的の連続した領域にハイブリダイズし、前置増幅器オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための配列を提供するように設計されている。次いで、シグナル増幅が標識増量剤にハイブリダイズする前置増幅器プローブから始まる。前置増幅器は、二の隣接する標識増量剤にハイブリダイズする場合にのみ、安定なハイブリッドを形成する。前置増幅器の他の領域は、分岐構造を作成する多数のｂＤＮＡ増幅分子にハイブリダイズするように設計されている。最後に、ｂＤＮＡ増幅配列に相補的なアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションによってｂＤＮＡ分子に結合する。ｂＤＮＡシグナルは、ＡＰ反応の化学発光生成物である（例えば、開示の全内容が参照により本明細書に援用される、Tsongalis、Microbiol. Inf. Dis.、126:448-453、2006；米国特許第７０３３７５８号を参照のこと）。
さらなる例において、シグナル増幅法は、重合抗体を利用する。いくつかの例において、標識プローブは、標識に対する一次抗体（例えば抗ＤＩＧ又は抗ＤＮＰ抗体）を用いることにより検出される。一次抗体は、重合二次抗体（例えば重合ＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体又はＡＰ−コンジュゲート二次抗体）によって検出される。ＡＰ又はＨＲＰの酵素反応は、可視化することができる強力なシグナルの形成をもたらす。
標識プローブに特異的な結合剤の対を適切に選択することによってマルチプレックス検出スキームを作成し、（例えば単一の細胞若しくは組織試料又は二以上の細胞若しくは組織試料での）単一のアッセイにおいて複数の標的核酸（例えばゲノム標的核酸）の検出を容易にすることができることが当業者によって理解されるだろう。例えば、第一標的核酸に対応する第一のプローブをビオチンなどの第一のハプテンで標識化することができ、一方、第二の標的核酸に対応する第二のプローブをＤＮＰなどの第二のハプテンで標識化することができる。試料をプローブに曝露した後、試料を第一の特異的な結合剤（この場合、第一のフルオロフォア（例えば５８５ｎｍで発光する第一のスペクトル的にはっきりした量子ドット）で標識化されたアビジン）と第二の特異的な結合剤（この場合、第二のフルオロフォア（例えば７０５ｎｍで発光する第二のスペクトル的にはっきりした量子ドット）で標識化された抗ＤＮＰ抗体又は抗体断片）とを接触させることによって、結合されたプローブを検出することができる。追加のプローブ／結合剤の対も、他のスペクトル的にはっきりしたフルオロフォアを使用してマルチプレックス検出スキームに加えることができる。直接的及び間接的な数多くの変形例（一つの工程、二つの工程又はそれ以上）を想定することができ、そのすべてが、本開示のプローブ及びアッセイの文脈において適切である。
例えばＣＩＳＨ法及びＳＩＳＨ法に利用されるような特定の検出方法に関するさらなる詳細は、Dako Corporation(Santa Barbara, CA)刊、Bourne, The Handbook of Immunoperoxidase Staining Methodsに見出される。
ＩＳＨ試験においてしばしば遭遇する困難は、組織が典型的に保存される方法に起因しうる。何十年もの間、診断病理学研究室の主力は、切片化され、ガラススライドにマウントされた、組織のホルマリン固定、パラフィン包埋ブロックであった。このような防腐剤中での固定は、アミノ酸及び核酸双方の巨大分子の架橋を生じさせる。これらの架橋成分は、標的核酸へのプローブの接近を許容して、抗体が対応する抗原を認識できるようにするためには除去されなければならない。抗原及び／又は核酸の「アンマスキング」は、典型的には複数の前処理、タンパク質消化、及び洗浄工程を使用して手作業で達成される。染色の前に、パラフィンが抗体又はプローブ結合を妨害しないように、パラフィンの完全な除去が必要とされる。脱パラフィンは、パラフィン系溶剤（例えばキシレン、キシレン代替品又はトルエン）である複数（例えば二又は三）の逐次の透徹試薬の使用によって達成されうる。
いくつかの実施態様では、準備は細胞コンディショニング工程を含む。細胞コンディショニングは、出典明示によりその主題事項が援用される米国特許第６８５５５５２号のTowne, et al. 「Automated immunohistochemical and in situ hybridization assay formulations」で詳細に論じられている例示的な細胞コンディショニング工程では、細胞コンディショニング試薬が適用され、試料が適切な時間の間、適切な温度で接触させられて、抗原標的及び／又は核酸標的が検出のために十分に発現されるようになる。本開示の一態様は、自動機器が、ユーザーの入力に応じて細胞コンディショニングの継続時間及び／又は温度を自動的に調整することができることである。細胞コンディショニングは、プロテアーゼ試薬を適用することをさらに含みうる。例示的には、プロテアーゼ処理は、生体試料にプロテアーゼ溶液を接触させる工程を伴いうる。プロテアーゼ処理は、細胞コンディショニングと同様に、標的抗原及び／又は標的核酸の発現を増加させることが意図されている。
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの核酸標的（ＩＳＨ）用の細胞コンディショニング試薬が使用されうる。接触は、約２から約９０分間、約９５℃の温度でなされうる。考えられる試薬の部分的なリストが、Analytical Morphology, Gu編., Eaton Publishing Co. (1997）の１〜４０頁にある。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び／又はエチレングリコールがコンディショニング溶液に含まれていてもよい。さらに、金属イオン又は他の物質をこれらの試薬に添加して、細胞コンディショニングの効果を高めてもよい。例示的な細胞コンディショニング溶液は、アリゾナ州ツーソンのヴェンタナメディカルシステムズ社から入手できる（Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＣＣ１） カタログ＃：９５０−１２４；Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ２（ＣＣ２） カタログ＃：９５０−１２３；ＳＳＣ （１０Ｘ） カタログ＃：９５０−１１０；ＵＬＴＲＡ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＵＬＴＲＡ ＣＣ１） カタログ＃：９５０−２２４；ＵＬＴＲＡ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＵＬＴＲＡ ＣＣ２） カタログ＃：９５０−２２３、Ｐｒｏｔｅａｓｅ １ カタログ＃：７６０−２０１８；Ｐｒｏｔｅａｓｅ ２ カタログ＃：７６０−２０１９；Ｐｒｏｔｅａｓｅ ３ カタログ＃：７６０−２０２０）。いくつかの実施態様では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション結合試薬の適用は、細胞コンディショニング試薬の適用後で発色試薬の適用前に発生する。
例示的な実施態様では、該方法はすすぎ試薬を適用することを含む。本明細書に記載の様々な工程の合間に、また本明細書に記載のシステムの一部として、すすぎ工程が先の工程からの未反応残留試薬を除去するために加えられうる。すすぎ工程は、混合を伴って又は混合を伴わないで予め決められた温度で予め決められた時間、試料上にすすぎ試薬を維持することを含むインキュベーションをさらに含みうる。このすすぎ工程に適した条件は、様々な工程間で異なっていてもよい。例示的なすすぎ試薬は、アリゾナ州ツーソンのヴェンタナメディカルシステムズ社から入手可能である（Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ （１０ｘ） カタログ＃：９５０−３００；Ｓｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ Ｗａｓｈ（１０ｘ） カタログ＃：８６０−０１５）。
アリゾナ州ツーソンのヴェンタナメディカルシステムズ社から入手可能である例示的な自動システムは、ＳＹＭＰＨＯＮＹ（登録商標）Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ＃：９００−ＳＹＭ３、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｌｉｄｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃：Ｎ７５０−ＢＭＫＸＴ−ＦＳ、Ｎ７５０−ＢＭＫＵ−ＦＳ、ＶＥＮＴＡＮＡ、及びＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ自動化スライド染色装置を含む。これらのシステムは、放射状に配置されたスライドを支持する回転カルーセルを含むマイクロプロセッサ制御システムを用いている。ステッパモータがカルーセルを回転させ、スライド上方に位置する一連の試薬ディスペンサーのうちの一つの下に各スライドを配置する。スライド及び試薬ディスペンサー上のバーコードは、コンピュータの適切なプログラミングによって、様々な組織試料のそれぞれについて異なる試薬処理を行うことができるように、ディスペンサーとスライドのコンピュータ制御された位置決めを可能にする。
本発明は、一本鎖オリゴヌクレオチドベースのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７二重ＩＳＨアッセイを説明するが、当業者であれば他の目的の遺伝子／セントロメアの組み合わせに本明細書に開示の発見を適用することができるであろう。
いくつかの実施態様では、本開示のシステム（例えばプローブ）は、生物学的試料（例えば組織試料）中の標的核酸（例えばＨＥＲ２）のコピー数を決定する方法において使用することができる。遺伝子又は染色体領域のコピー数を決定する方法は、当業者によく知られている。いくつかの例では、該方法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば蛍光、発色性又は銀ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）、比較ゲノムハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応（例えばリアルタイム定量的ＰＣＲ）を含む。いくつかの例では、遺伝子のコピ−数を決定する方法は、一又は複数の個々の細胞中の標的核酸に対するＩＳＨシグナルの数（蛍光、着色又は銀スポット）をカウントすることを含む。該方法はまた、該細胞中の参照（例えば染色体特異的プローブ）に対するＩＳＨシグナルの数（蛍光、着色又は銀スポット）をカウントすることも含む。特定の例では、遺伝子（又は染色体）のコピ−数は、スライドをスコアリングする人（自動化法の場合にはコンピュータ−）により見積もられる。いくつかの例では、対照と比較して増加したコピー数（例えば対照試料又は参照値と比較して約１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍又はそれ以上）は、標的核酸コピー数の増加を示す。
いくつかの例では、該方法は、異常でないことがわかっている染色体遺伝子座、例えばセントロメアなどの参照細胞又は核当たりのコピー数をカウントすることを含む。いくつかの例では、該参照は目的の遺伝子と同じ染色体上にある。目的の特定のヒト遺伝子のために使用されうる例示的な参照染色体を表２に示す。特定の例では、参照遺伝子座は、セントロメア特異的プローブを用いることにより検出される。そのようなプローブは当該技術分野で知られており、例えばＶｙｓｉｓ ＣＥＰプローブ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｄｅｓ Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）及びＳＰＯＴＬＩＧＨＴセントロメアプローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のように、市販されている。いくつかの例では、約２を上回る（例えば２、３、４、５、１０、２０又はそれ以上）参照コピー数に対する標的核酸コピー数の比率は、標的核酸コピー数の増加を示す。
Figure 0006982392
Ｆ．スコアリングの方法
本発明はまた、標的領域の遺伝子コピ−数のスコアリング方法及び場合によっては標的領域の遺伝子コピ−数をコントロール領域の該コピー数と比較する方法を特徴とする。本明細書に記載の方法と共に使用することができる追加のスコアリングの方法については、ＩＳＨスコアリングに関する開示のために参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１２／０１４１４７２号が参照される。
いくつかの例では、増加した遺伝子コピ−数は、約２コピー以上の（例えば２、３、４、５、１０又は２０コピー）、試料中の核あたりの遺伝子コピー数（例えば核当たりの平均遺伝子コピ−数）を含む。他の例では、増加した遺伝子コピ−数は、約２以上の、試料中の遺伝子コピ−数のそれに対応する染色体コピー数に対する比率（例えば２、３、４、５、１０又は２０以上の比率）を含む。さらなる例では、増加した遺伝子コピ−数は、対照と比較した遺伝子コピー数の増加（例えば約１．５倍、約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍、約２０倍又はそれ以上の増加）を含む。したがって、いくつかの例では、該方法は、対象の試料中の遺伝子コピ−数を対照又は参照値又は適切な正常組織中の遺伝子コピ−数の予測値の範囲と比較することを含む。
また、本明細書で開示されるのは、対象由来の試料中の遺伝子コピ−数のスコアリング法（例えば計数すること）であって、ここで試料はＩＳＨ（例えばＦＩＳＨ、ＳＩＳＨ、ＣＩＳＨ又はこれらの二若しくはそれ以上の組み合わせ）により目的の遺伝子が染色され、遺伝子の個々のコピーは試料中の細胞において区別可能である。特定の例において、試料は、腫瘍試料のような、対象由来の生体試料（例えば腫瘍生検）である。ＩＳＨにより遺伝子コピ−数を決定する方法は、当該技術分野でよく知られている。
いくつかの実施態様では、該方法は、核あたりの遺伝子のシグナル数の最大数（例えば試料中の最も強いシグナル）を有する試料中の個々の細胞を同定すること、同定された細胞中の遺伝子のシグナル数をカウントすること、及び細胞あたりのシグナルの平均数を決定し、それにより試料中の遺伝子コピ−数をスコアリングすることを含む。さらなる実施態様において、該方法は、参照（例えばセントロメアＤＮＡのような、異常でないことが分かっている染色体遺伝子座）へのシグナル数をカウントすること、及び細胞あたりの参照へのシグナル数に対する遺伝子へのシグナル数の平均比率を決定することをさらに含む。
本スコアリング方法は、試料中の細胞の目的の遺伝子のシグナル数が最も多い（例えば細胞あたりのスポットが最大数又は最も明るい染色強度）試料（例えば組織切片又は腫瘍コア）中の個々の細胞を同定することを含みうる。したがって、本開示の方法は、試料中の細胞のランダム抽出における遺伝子コピ−数を決定することではない。むしろ、該方法は、試料中の遺伝子コピー数の最大数を有する細胞における遺伝子コピー数を明確にカウントすることを含む。いくつかの例では、遺伝子のシグナル数の最大数を有する個々の細胞を同定することは、弱拡大顕微鏡下（例えば約２０＞＜倍率）でＩＳＨにより遺伝子を染色された試料を調べることを含む。最強シグナル（例えば強拡大下での最高の増幅シグナル）を有する細胞は、視覚又は自動撮像システムによってカウントのために同定される。試料が組織切片である場合などのいくつかの例において、試料は、腫瘍細胞が集中し、遺伝子増幅を有する領域を同定するために（例えば視覚的走査で）調べられる。次いで、選択した領域で最大の増幅度を有する細胞における遺伝子コピ−数をカウントする。試料が腫瘍コア（腫瘍マイクロアレイなど）であるような他の例において、試料の大半は弱拡大顕微鏡下の視野で目視でき、最強シグナル（例えば強拡大下での最高の増幅シグナル）を有する個々の細胞（腫瘍細胞など）がカウントのために別々に同定される。特定の例では、遺伝子コピー数のカウントのために選択される細胞は、互いに隣接せず又は接触していない細胞など、非連続細胞であってもよい。他の例では、遺伝子コピー数のカウントのために選ばれる細胞のうちの少なくともいくつかは、互いに隣接又は接触している細胞など、連続的細胞であってもよい。
本開示の方法は、同定された細胞中の遺伝子に対するＩＳＨシグナルの数（蛍光、着色又は銀スポット等）をカウントすることを含む。本方法はまた、同定された細胞中の参照（例えば染色体特異的プローブ）に対するＩＳＨシグナルの数（蛍光、着色又は銀スポット）をカウントすることも含む。いくつかの例では、細胞あたりのスポット数は同定された細胞において区別可能であり、スポットの数がカウント（又は計数）され、記録される。他の例において、一又は複数の同定された細胞は、カウント（又は計数）できない核の中の複数の重なったシグナルの存在であるクラスターを含みうる。特定の例では、遺伝子（又は染色体）のコピ−数は、スライドをスコアリングする人（自動化法の場合にはコンピュータ−）により見積もられる。例えば、病理学の当業者は、試料中の遺伝子コピー数の計数経験に基づいて、クラスターが特定の数の遺伝子コピー（例えば１０、２０又はそれ以上のコピー）を含有することを見積もることができる。他の例では、クラスターの存在は、クラスターに存在するコピー数を見積もることなしに、一つのクラスターとして記録されうる。
カウントのために同定された細胞数は、遺伝子コピー数の変化（例えば増加又は減少）の検出を行うのに十分な細胞数である。いくつかの例では、カウントのために同定された細胞数は、少なくとも約２０、例えば少なくとも２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、５００、１０００細胞又はそれ以上である。特定の例では、約５０細胞がカウントされる。他の例では、目的の遺伝子の３以上のコピー（例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又はそれ以上）を含有する、試料中のすべての細胞又は顕微鏡視野内のすべての細胞、又は複数の顕微鏡視野（少なくとも２つの顕微鏡の視野、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つの顕微鏡視野等）内のすべての細胞がカウントされる。
方法は、本明細書に開示の方法に従ってＩＳＨが実施された試料を得ることを特徴としうる。最多のコピー数を有する腫瘍核の領域が同定され、計数可能な染色体／標的のシグナルが５０〜１００の腫瘍核及び、５０の隣接する間葉核又は５０の隣接する正常上皮核のいずれかにカウントされる。
次のようなスコアリング基準であってもよい：染色なし又は＜１ドット／１０細胞はスコア０；１〜３ドット／細胞はスコア１；４〜９ドット／細胞、ドットなし又はごく少数のドットのクラスターはスコア２；１０〜１５ドット／細胞かつ＜１０％のドットがクラスターに存在はスコア３；及び＞１５ドット／細胞かつ＞１０％のドットがクラスターに存在はスコア４としてスコア化される。
いくつかの実施態様では、核あたりの標的シグナル（例えばＨＥＲ２）の平均数が計算される。いくつかの実施態様では、核あたりの染色体（例えばＣＨＲ１７）コピーの平均数が計算される。いくつかの実施態様では、標的シグナル対染色体シグナル比率が計算される。
本開示は、以下の非限定的な実施例によりさらに説明される。
実施例１
Ａ．標本
乳房組織試料は、一本鎖オリゴヌクレオチドＨＥＲ２並びに／又はＣＨＲ１７単一及び二重ＩＳＨアッセイを開発し、最適化するために利用された。試料は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）にて維持されていた組織標本アーカイブから入手した。これらの試料は、デアイデンティファイされていて患者情報からのリンクがなく、ゆえに患者のインフォームドコンセントが必要ない（６）、余剰臨床標本であった。ホルマリン固定、パラフィン包埋された乳房組織の組織コアを含有するパラフィン切片（４μｍ）をＳＵＰＥＲＦＲＯＳＴ Ｐｌｕｓガラススライド上に配した。
Ｂ．プローブ
ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ試薬は、ジゴキシゲニン標識（ＤＩＧ）Ｃｈｒ１７プローブと４ｍｇ／ｍｌヒトブロッキングＤＮＡが入ったホルムアミドベースの緩衝液と、１２μｇ／ｍｌのジニトロフェニル（ＤＮＰ）標識ＨＥＲ２プローブとのカクテルを含有するプローブディスペンサーを含む。
一本鎖オリゴヌクレオチドＨＥＲ２プローブ（ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ）は、特異的にＨＥＲ２遺伝子領域を標的とする、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）標識、無反復ゲノムプローブである。ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅと同様に、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブは、ＨＥＲ２標的領域を包含する、ヒト１７番染色体のヒトゲノムＤＮＡの＞３２７，０００のヌクレオチド（ｎｔ）（３５，０２７，９７９〜３５，３５５，５１６）にまたがる（ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｍａｙ ２００４（ＮＣＢＩ３５／ｈｇ１７）Ａｓｓｅｍｂｌｙ）。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチド配列は、ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅにおける配列から設計された。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドの各々は、８０−ｍｅｒの長さで設計された。それゆえ、非標的結合のためのストリンジェンシーレベルは、上記オリゴヌクレオチドプローブの設計基準に応じて上げられた。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの特異性は、ＩＳＨアッセイ試験条件下で中期スプレッドについて実験的に検証された。
ＨＥＲ２標的領域周辺のＨＥＲ２に特異的な核酸配列を同定するために、バイオインフォマティクス検索を使用した。選択されたゲノム標的核酸配列は、連続した非重複８０ｎｔセグメントに分けられる。１１９６の〜８０ｍｅｒオリゴヌクレオチドが合成され、各々が一つの脱塩基性ホスホラミダイト上に２０ｎｔ分の間隔を空けて５のＤＮＰハプテンを有する。このようなオリゴヌクレオチドの代表的な構造を図１（Ａ）〜（Ｂ）に示す。図１（Ａ）の太字部分（配列番号１でもある）を図１（Ｂ）においてより詳細に示す。該オリゴヌクレオチドをアフィニティー精製し、質量分析及びゲル電気泳動により解析した。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブは、ヒトブロッキングＤＮＡなしでホルムアミドベースの緩衝液へまとめられた。最初のスクリーニング工程では、オリゴヌクレオチドの数、ＤＮＰハプテンの数及び間隔が、ＨＥＲ２遺伝子の感度及び特異性のために、ヒトブロッキングＤＮＡなしでホルムアミドベースの緩衝液中で機能的に試験された。
二本鎖ＨＥＲ２プローブ（ＨＥＲ２ ｄｓプローブ）は、ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅにおいて、同じＨＥＲ２ ＤＮＡテンプレートを用いてＤＮＰ標識された。ＨＥＲ２ ｄｓプローブは、ホルムアミドベースの緩衝液中に４ｍｇ／ｍｌのヒトブロッキングＤＮＡを用いて製剤化された。ＨＥＲ２ ｄｓプローブは、単一のＩＳＨアッセイでのみ使用された。
上記の市販品のＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡは、ＤＩＧ標識Ｃｈｒ１７プローブとＤＮＰ標識ＨＥＲ２とのカクテルを０．７５ｕｇ／ｍｌ含有するディスペンサーを含む。
一本鎖オリゴヌクレオチドＣｈｒ１７プローブ（Ｃｈｒ１７オリゴヌクレオチドプローブ）は、５８ｂｐから８７ｂｐの長さの１４のオリゴヌクレオチドからなるプールで作られた。各オリゴヌクレオチドは、その５’末端に配列 ＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴを有する非結合テール上の二のＤＩＧハプテン分子で標識された（図２（Ａ）〜（Ｃ）参照。図２（Ａ）は、５’テールを含む例示的なＣｈｒ１７プローブ配列（配列番号２）を示し、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）の太字のアミノＣ６＋Ｄｉｇ領域のさらに詳しい構造を示し、及び図２（Ｂ）は、太字のＡｍ〜Ｕｎｉ＋Ｄｉｇ領域のより詳しい構造を示す）。このようなオリゴヌクレオチドは、ＰＡＧＥ精製され、質量分析で解析された。Ｃｈｒ１７オリゴヌクレオチドプローブは、ヒトブロッキングＤＮＡなしでホルムアミドベースの緩衝液中で製剤化された。最初のスクリーニング工程では、総計２８のオリゴヌクレオチドの、１７番染色体セントロメアに対する特異性が試験された。これらは、ＤＩＳＨアッセイと同様にテスト用プールとして、この最初のスクリーニングのためにヒトブロッキングＤＮＡなしで、ホルムアミドベースの緩衝液中で個別に製剤化された。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ（１５μｇ／ｍｌ）及びＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドプローブ（０．５μｇ／ｍｌ）が、ヒトブロッキングＤＮＡなしで、ホルムアミドベースの緩衝液中で製剤化された。例示的実施態様では、Ｃｈｒ １７プローブは、表３に挙げた配列のうちの一又は複数を含む。
Figure 0006982392
Ｃ．間期スライドの自動明視野ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＵＬＴＲＡ自動スライド処理システム（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ，Ａｒｉｚｏｎａ）が、一本鎖オリゴヌクレオチドＨＥＲ２の発見及び性能評価、並びに／又はＨＥＲ２とＣＨＲ１７ ＤＮＡ標的のためのＣＨＲ１７単一及び二重ＩＳＨアッセイのために用いられた。ＦＤＡ認可のＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ａｓｓａｙプロトコールを組織染色のために用いた。短いハイブリダイゼーション時間（すなわち１６分、３２分、及び１時間）のために修正が行われた。特定の試験シナリオでは、一本鎖オリゴヌクレオチドＨＥＲ２及び／又はＣｈｒ１７プローブを過剰標識ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２／Ｃｈｒ１７プローブディスペンサーにおいて用いた。ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ａｓｓａｙ試薬は、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）標識ＨＥＲ２及びジゴキシゲニン標識（ＤＩＧ）Ｃｈｒ１７プローブカクテル、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ ＳＩＳＨ及びｕｌｔｒａＶｉｅｗ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｒｅｄ ＩＳＨ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を含む。スライドは６９℃で脱パラフィン化され、これにｐＨ６のクエン酸緩衝液との８２℃でのインキュベーション、次にＩＳＨ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ３による２０分間の消化が続いた。プローブ（単数又は複数）は、最初に８０℃で８分間変性され、次いで設定時間（６時間がＦＤＡ認可プロトコールのデフォルド）の間４４℃でハイブリダイズされ、これにｐＨ６．０のクエン酸緩衝液を用いた７２℃での３回のストリンジェンシー洗浄が続いた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ＤＮＰ抗体リンカーの適用後に、その標的へのＤＮＰ結合ＨＥＲ２プローブの特異的ハイブリダイゼーションが銀クロモゲンの不溶性沈殿物によって可視化された。アルカリホスファターゼ標識マウス抗ジゴキシゲニン抗体リンカーの適用後、ジゴキシゲニン結合Ｃｈｒ１７プローブの可視化が、アルカリホスファターゼ系Ｆａｓｔ Ｒｅｄ発色系の水溶性沈殿物によって検出された。組織の全体的な形態を可視化するために、スライドをヘマトキシリンで４分間対比染色し、次にブルーイング試薬で４分間ポスト対比染色した。
Ｄ．自動明視野染色体中期スプレッドＩＳＨ染色：
中期染色体（ＣＧＨ Ｍｅｔａｐｈａｓｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｌｉｄｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を、２００ｍＪのエネルギーレベルでＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｏｄｅｌ ＃ Ｃ００５１８）にＵＶ架橋した。次いで、それらのスライドを室温で５秒間、１％トリプシン（Ｓｉｇｍａ カタログ＃Ｔ１４２６）を用いて処理した。次いで、ベーキング、脱パラフィン、細胞コンディショニング、及び対比染色の工程を抜かす以外は上記と同じ条件下で、該スライドをＩＳＨ染色のために処理した。染色が該機器で完了した後、スライドを、Ｇｕｒｒ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃１０５８２−０１３）で希釈した４％Ｇｉｅｍｓａ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃１００９２−０３）を用いて室温で５分間染色し、その染色を通常の光学顕微鏡で可視化した。
Ｅ．解析スライドのスコアリング基準：
ＨＥＲ２／Ｃｈｒ１７ ＤＩＳＨ染色スライドの読影経験がある委員会認定病理医（Ｐ．Ｂ．）が該スライドを評価し、スコア化した。各スライドは、シグナル強度及びバックグラウンドについてスコア化された。解析スライドのスコアリング基準（表１）は、「許容可能」又は「許容不可能」な染色を記載している。「許容可能」又は「許容不可能」の基準は、シグナルのＨＥＲ２又はＣｈｒ１７対が一のスライド上の２０個の細胞中で計数可能か否かの可能性に対応している。このスコアリング基準は、アッセイ最適化のためにストリンジェント分析ツール（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｏｏｌ）として開発され、用いられた。
Ｆ．ＨＥＲ２及びＣｈｒ１７のシグナル計数
適切な標的領域が同定されると、読影者は２０の代表的な核に存在するＨＥＲ２及びＣｈｒ１７コピー数のスコアを記録した。得られるＨＥＲ２／Ｃｈｒ１７比率が１．８〜２．２の範囲内にある場合、読影者はさらに２０の核をスコア化することが推奨され、得られる比率は、合計４０の核から計算される。ＨＥＲ２遺伝子の状態は、非増幅（ＨＥＲ２／Ｃｈｒ１７＜２．０）又は増幅（ＨＥＲ２／Ｃｈｒ１７＞２．０）と報告されている。Interpretation Guide Ventana INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Assayが参照されるが、これは該アッセイに関連する開示のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
Ｇ．ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ性能評価：
ＨＥＲ２のオリゴヌクレオチドプローブは、速くハイブリダイズする。ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ（ＦＤＡ認可のプロトコール、６時間ハイブリダイゼーション）による弱いＨＥＲ２シグナルを有する乳房の症例が選択された。複製スライドを、短いハイブリダイゼーション時間（１６、３２、及び６０分）でＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ及びＨＥＲ２ ｄｓプローブ（各６．０μｇ／ｍｌ）で染色した。１６分間のハイブリダイゼーションの場合、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの染色は、ＨＥＲ２シグナル強度１．０＆１．５（図３（Ａ）及び（Ｃ））を示し、一方、ＨＥＲ２ ｄｓプローブの染色強度は０．５＆０．５（図３（Ｂ）及び（Ｄ））である。３２分間のハイブリダイゼーションの場合、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの染色は、ＨＥＲ２シグナル強度１．５＆１．５を示し、一方、ＨＥＲ２ ｄｓプローブの染色強度は１．０＆１．５（図３（Ａ））である。６０分間のハイブリダイゼーションの場合、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの染色は、ＨＥＲ２シグナル強度２．０＆２．０を示し、一方、ＨＥＲ２ ｄｓプローブの染色強度は２．０＆１．５（図３（Ａ））である。
１６分間のハイブリダイゼーションの場合、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの染色は、ＨＥＲ２シグナル範囲４０％＆３０％（図３（Ｂ）及び（Ｃ））を示し、一方、ＨＥＲ２ ｄｓプローブ染色のシグナル範囲は５％＆２０％（図３（Ｂ）及び（Ｄ））である。３２分間のハイブリダイゼーションの場合、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの染色は、ＨＥＲ２シグナル範囲５０％＆５０％を示し、一方、ＨＥＲ２ ｄｓプローブ染色のシグナル範囲は３０％＆２５％（図３（Ｂ））である。６０分間のハイブリダイゼーションの場合、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの染色は、ＨＥＲ２シグナル範囲５５％＆６０％を示し、一方、ＨＥＲ２ ｄｓプローブ染色のシグナル範囲は５０％＆５０％（図３（Ｂ））である。
ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブは、試験したすべてのハイブリダイゼーション時点でバックグラウンドシグナルを示さなかった。一方、ＨＥＲ２ ｄｓプローブの染色は、弱いバックグラウンドを有する（３２分時点で０．７５及び０．２５、６０分時点で０．２５及び０）。
２時間のハイブリダイゼーションの場合、ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅの染色は、ＨＥＲ２シグナル強度２＆２．５及びシグナル範囲６０％＆６５％を示す。６時間のハイブリダイゼーションの場合、ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅの染色は、ＨＥＲ２シグナル強度２＆２．５及びシグナル範囲６５％＆６５％を示す。これらのスライドでバックグラウンドは観察されなかった。
上記のデータは、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドがＨＥＲ２ ｄｓプローブよりも速くハイブリダイズすることを示唆している。より強いシグナル強度及びより良好なシグナル範囲が、ハイブリダイゼーション処理の早い時点で実証された。
ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの染色は、ＨＥＲ２ ｄｓプローブと比較した場合、同じ濃度（３、６、９、及び１２μｇ／ｍｌ）、ハイブリダイゼーション時間（１＆２時間）、ストリンジェンシー洗浄の温度（６８、７０、及び７２℃）で好ましい染色を示した。６μｇ／ｍｌのＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブは、１２μｇ／ｍｌのＨＥＲ２ ｄｓプローブと同等か又はそれより良好な染色を得ることができた。
ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの染色（１２．０μｇ／ｍｌ）は均一サイズを有する規則的な形状のシグナルを生成し（図４（Ａ））、一方、ＨＥＲ２ ｄｓプローブの染色（１２．０μｇ／ｍｌ）は異なるサイズの不規則なシグナル形状を有する（図４（Ｂ））。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ は最小のバックグラウンドシグナルを生成し（図４（Ａ））、一方、ＨＥＲ２ ｄｓプローブの染色はいくらか核の粉塵の（ｎｕｃｌｅａｒ ｄｕｓｔｉｎｇ）バックグラウンド（図４（Ｂ））を有する。通常の濃度範囲で使用した場合、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの染色が最小のバックグラウンドシグナルを示したことから、本出願人らは、非常に高い濃度（２４μｇ／ｍｌ）でそれに挑んだ。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ染色は核の境界を取り囲む茶色がかったバックグラウンドを示したものの、このバックグラウンドパターンはシグナル計数の邪魔にならない。２４μｇ／ｍｌでのＨＥＲ２ ｄｓプローブ染色は、非特異的バックグラウンドシグナルから微弱な特異的シグナルを混同させうる核の粉塵を示した。
１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ染色は、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅの性能レベルに達するのに十分なほど堅牢である。具体的には、１０９の乳房組織がＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの性能評価のために選択された。これらの試料は、最初にＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅで染色され（ＦＤＡ認可のプロトコール、６時間ハイブリダイゼーション）、十分な又は「ボーダーライン」の染色強度（許容範囲としては２がカットオフ、１．５がボーダーライン）が実証された。このプレスクリーニングは、解析前の条件に起因する低品質の組織を排除する助けとなった。７９の組織（７２．５％）がＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅにより合格したと考えられた。表４参照。
Figure 0006982392
１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ（１２μｇ／ｍｌ）染色は、９４（８６．２％）の組織を合格させた。一方、１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２ ｄｓプローブは、３２（２９．３％）の組織を合格させた（表４）。データは、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ染色が６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅの性能レベルに達するのに十分なほど堅牢であることを示唆している。ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅによる強度≧２を有する７９の組織（図５（Ａ））のうち、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブが類似の性能（７７が合格）を得た。ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅによる強度１．５を有する３０の組織（図５（Ｂ））のうち、１７の組織の染色が強度２に向上した（したがって合格した）。
Ｈ．１７番染色体オリゴヌクレオチドプローブ性能評価：
１７番染色体特異的オリゴヌクレオチドの選択
２８の１７番染色体オリゴヌクレオチド（１．０μｇ／ｍｌ）の各々を、ストリンジェンシー洗浄の温度７０℃及び／又は７２℃で、２の乳房組織上で染色した。余分な交差反応シグナルのため、１４のオリゴヌクレオチド、すなわちＭ４．５（２．０＆２．５）、Ｍ６．１（０＆０．２５）、Ｍ６．２（０．５＆２．５）、Ｍ７．２（１．０＆１．５）、Ｍ８．１（２．０＆２．０）、Ｍ１０．１（１．５＆２）、Ｍ１０．２（２＆２．５）、Ｍ１１．１（０＆２）、Ｍ１４．１（０．７５＆１．０）、Ｍ１４．２（１．５＆１．５）、Ｍ１５．１（０＆０．２５）、及びＭ１５．２（２．０＆２．０）を除外した（図６（Ｂ））。図６（Ｄ）は、Ｍ１１．２染色スライドの一例であり、十分な強度を有する１〜２の特異的なｃｈｒ１７シグナルが各細胞内に存在する。図６（Ｃ）は、Ｍ７．２染色スライドの一例を示し、余分なかすかな交差反応シグナルが、強いｃｈｒ１７特異的シグナルの他に細胞内に存在していた。極めて弱いシグナルのために、２のオリゴヌクレオチド、すなわちＭ１．２（０．２５＆０．２５）及びＭ２．２（０＆０．２５）を除外した（図６（Ａ））。合計１４のオリゴヌクレオチド（Ｍ１．１、Ｍ２．１、Ｍ２．２、Ｍ３．１、Ｍ５．１、Ｍ５．２、Ｍ８．２、Ｍ９．１、Ｍ９．２、Ｍ１１．２、Ｍ１２．１、Ｍ１３．１、Ｍ１６．１、及びＭ１６．２）が、本明細書にリスト化されているＣｈｒ１７オリゴヌクレオチドプローブのプールに入れるために選択された。
１５の乳房組織が、Ｃｈｒ１７オリゴヌクレオチドプローブ性能評価のために選択された。これより先に１７番染色体染色を、ＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ（ＦＤＡ認可のプロトコール、６時間ハイブリダイゼーション）で実施した。これらの試料における１７番染色体シグナル（各々重複スライド）は、強い強度から弱い強度までの範囲（０−３スケール）にある。１時間ハイブリダイゼーションのＣｈｒ１７オリゴヌクレオチドプローブ（０．５μｇ／ｍｌ）染色は、Ｃｈｒ１７ ＰＭＡプローブと同等の染色強度（２．６０±０．６１ ｖｓ ２．５４±０．８４、ｐ＞０．０５、図７（Ａ））、染色範囲（７０．５０±１４．４６ ｖｓ ６６．９３±２４．６１、ｐ＞０．０５、図５Ｂ）、及びバックグラウンド（０．０４±０．１６ ｖｓ ０．０２±０．０７、ｐ＞０．０５、図７（Ｃ））を有する。すべての非許容ｃｈｒ１７染色は不十分なｃｈｒ１７ シグナル強度に起因しており、そのうち２つはＣｈｒ１７ オリゴヌクレオチドプローブにより、５つはＣｈｒ１７ ＰＭＡプローブにより不合格となった（図７（Ｄ））。データは、１時間ハイブリダイゼーションのＣｈｒ１７オリゴヌクレオチドプローブ染色が６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅの性能レベルに達するのに十分なほど堅牢であることを示唆している。
ＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨアッセイの解析的特徴付け
染色体中期スプレッド上のＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨの解析的な特異性を試験した。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ（黒いシグナル）及びＣＨＲ１７ オリゴヌクレオチドプローブ（赤いシグナル）を同じ染色体に局在化させた。ＨＥＲ２プローブ又はＣＨＲ１７プローブの他の染色体へのクロスハイブリダイゼーションもまったく観察されなかった（図８）。
必要最小数のＨＥＲ２オリゴヌクレオチドで機能試験を実施した。総数（１１９６）の４８、７２、及び１００％のＨＥＲ２オリゴヌクレオチドが、５の乳房症例からの３０のスライド上で機能上の試験をされた。ＨＥＲ２染色についてすべてのスライドが（基準強度≧２で）合格した。１１９６のＨＥＲ２オリゴヌクレオチドのうちの４８％がＨＥＲ２強度２．００±０を有し、７２％がＨＥＲ２強度２．４５±０．１６を有し、１００％がＨＥＲ２強度２．７５±０．３５を有した。１００％（１１９６のオリゴヌクレオチド）が、４８％及び７２％のものと比べて最も堅牢なＨＥＲ２染色を有した（ｐ＜０．０５）。１１９６のＨＥＲ２オリゴヌクレオチドのうちの４８％がＨＥＲ２範囲６９．００±４．６０を有し、７２％がＨＥＲ２範囲７３．５０±２．４２を有し、１００％がＨＥＲ２範囲７７．５０±５．８９を有した。１００％（１１９６のオリゴヌクレオチド）が、４８％のものよりも有意に広いＨＥＲ２染色範囲を有した（ｐ＜０．０５）（図９）。
フルセット（１１９６）Ｈｅｒ２オリゴヌクレオチドの経時変化（１、２、及び６時間）の機能試験を実施した。４の乳房症例からの１６のスライドで、フルセット（１１９６）Ｈｅｒ２ オリゴヌクレオチドの１、２、及び６時間ハイブリダイゼーションについて試験した。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２オリゴヌクレオチド染色は、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅと同等の染色性能を得た。本出願人らは、長いハイブリダイゼーション時間（例えば２及び６時間）と改善された染色強度との間に一貫した関連性を見出すことはなかった（図１０）。
個々の乳房組織での１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨの同等性研究が、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅと比べた染色妥当性を比較するために実施された。８９の乳房組織がＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ性能評価のために選択された。上と同様に、これらの試料は、十分な又は「ボーダーライン」の染色強度、すなわち６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅにより染色した少なくとも一のスライド上で、ＨＥＲ２シグナル強度が≧１．５、ＣＨＲ１７シグナル強度が≧１．５を示した。このプレスクリーニングは、解析前の条件に起因する低品質の組織を排除する助けとなった。１２８のスライド（１２８／１４６、８５．５％）が１時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ ＰｒｏｂｅによるＨＥＲ２染色で「合格」とみなされた。一方、１５６のスライド（１５６／１７４、８７．６７％）が１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨによるＨＥＲ２染色で「合格」とみなされた（ｐ＝０．５７８）。１０３のスライド（１０３／１４９、６９．１３％）が６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ ＰｒｏｂｅによるＣＨＲ１７染色で合格とみなされた。一方、１２９のスライド（１２９／１７５、７３．７１％）が１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨによるＣＨＲ１７染色で合格とみなされた（ｐ＝０．３６３）。ＨＥＲ２及びＣＨＲ１７染色に関して、この二のアッセイ間で有意な差異は見られなかった。重度のスペックリング又はスライド乾燥アーチファクトは１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨでは見つからなかったものの、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅで染色した６のスライドは、重度のスペックリングバックグラウンド（ｓｐｅｃｋｌｉｎｇ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）のために評価で不合格となり、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅにより染色した５のスライドも、スライド乾燥で不合格だった（１１／１７５、６．３％）。表５参照。
Figure 0006982392
図１１（Ａ）は、症例＃７０９の染色の一例である。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＩＳＨ染色は、ＨＥＲ２強度２．５、範囲７０％、バックグラウンド０；Ｃｈｒ１強度２．５、範囲７０％、及びバックグラウンド０を有した。一方、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ染色は、ＨＥＲ２強度１、範囲４０％、バックグラウンド０；Ｃｈｒ１７強度１、範囲３５％、バックグラウンド０を有した。丸で囲んだ間質領域では、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅに染色がなかった。ゆえにＨＥＲ２とＣＨＲ１７の染色強度は１に割り当てられた。データは、１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色性能が６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅのそれと同等であることを示唆している。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色は、染色の不合格発生率（すなわち重度のスペックリング及びスライド乾燥）が６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅによるそれよりも低い。
１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色と６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ染色間のＨＥＲ２遺伝子状態の一致
１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ及び６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ ＰｒｏｂｅによるＨＥＲ２とＣＨＲ１７双方について強度≧２の対のスライドを有する６３の症例が、シグナル計数のために選択された。５０の症例が、１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色及び６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ染色の双方によるＨＥＲ２の増幅はないと診断された。１２の症例が、１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色及び６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ染色の双方によりＨＥＲ２が増幅されていると診断された。一つの症例（ＩＬＳ３２５５４）は、１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色（ＨＥＲ２／Ｃｈｒ１７比率：２．０８）によりＨＥＲ２が増幅されていると診断された一方で、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ染色では非増幅である（ＨＥＲ２／Ｃｈｒ１７比：１．９２）。陽性一致率（ＰＰＡ）は１００％（９５％スコアＣＩ：７７．１−１００％）で、陰性一致率（ＰＮＡ）は９８．０４％（９５％スコアＣＩ：９２．７−９８．０％）である。対のスライドの（ＨＥＲ２及びＣＨＲ１７の）非クラスター化シグナルカウントの変動係数の割合（ＣＶ％）は、５．６６±４．８４（＜２０％が許容可能）である。表６参照。
Figure 0006982392
図１１（Ｂ）は、症例＃７３１の染色の例である。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色は、ＨＥＲ２強度３、範囲８０％、バックグラウンド０；Ｃｈｒ１７強度２．５、範囲７５％、バックグラウンド０；ＨＥＲ２カウント４６、Ｃｈｒ１７カウント３４、比率１．３５を有した。一方、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ染色は、ＨＥＲ２強度３、範囲８０％、バックグラウンド０．５；ＣＨＲ１７強度３、範囲８０％、バックグラウンド０を有した。双方の染色がＨＥＲ２とＣＨＲ１７の同じようなシグナルカウントを生成したため、同じようなＨＥＲ２／ＣＨＲ１７比率である。銀の粉塵のバックグラウンドが、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ染色で観察された。データは、１時間ハイブリダイゼーション のＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色及び６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂ染色がＨＥＲ２遺伝子状態．の診断について高い一致を有することを示唆している。
６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅによってプレスクリーニングしなかった組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）のコホートに対する、この二のアッセイの堅牢性の評価が完了した。解析前の条件及び組織品質についての情報なしに、このような組織に対するアッセイの堅牢性の評価のために１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ及び６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ ＰｒｏｂｅでＴＭＡスライドにおける９５の乳房組織コアを染色した。アーカイブされたＴＭＡ組織が一般的にＩＳＨアッセイでは扱いにくい標本と見なされていることから、本試験は、そのアッセイ堅牢性を評価するために設計された。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨは、７３のコア（７６．８％）をＨＥＲ２強度２以上に染色し、一方、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅは、５７のコア（６０．０％）をＨＥＲ２強度２以上に染色した。ＨＥＲ２強度に関するこの二のアッセイ間の差異は、９０％ＣＩで有意性あり（ｐ＝０．０１１）にほぼ達する。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨは、５３のコア（５５．８％）をＣＨＲ１７強度２以上に染色し、一方、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅは、３５のコア（３６．８０％）をＣＨＲ１７強度２以上に染色した。ＣＨＲ１７強度に関するこの二のアッセイ間の差異は、９０％ＣＩで有意性あり（ｐ＝０．０１２）にほぼ達する。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色スライドはＨＥＲ２強度１．８９±０．７６を有し、一方、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ染色スライドはＨＥＲ２強度１．５８±０．７６を有した（ｐ＝０．００５）。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色スライドはＣＨＲ１７強度１．４９±０．８３を有し、一方、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ染色スライドはＣＨＲ１７強度１．０４±０．８７を有した（ｐ＝０．０００）。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨのバックグラウンド（０．１１±０．１８）と６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅのバックグラウンド（０．０４±０．１１）の双方とも許容可能なレベル（＜２）からかなり低い。表７参照。
Figure 0006982392
データは、１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨが６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅよりも、扱いにくい組織でより堅牢な染色を有することを示唆している。
乳房組織での試験に加えて、１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨの実現可能性は、肺（一本鎖プローブを示す図１２（Ａ）及び二本鎖プローブを示す１２（Ｂ））及び胃組織（一本鎖プローブを示す図１３（Ａ）及び二本鎖プローブを示す図１３（Ｂ））でも実証された。本出願人らはさらに、１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨを１０の肺組織及び１０の胃組織の重複スライドで試験した。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨは、ＨＥＲ２では６５％、ＣＨＲ１７では５０％の合格を有し（基準強度≧２に基づく）、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ ＰｒｏｂｅによるＨＥＲ２で５５％の合格、ＣＨＲ１７で５０％の合格（ＨＥＲ２でｐ＝０．５１６、ＣＨＲ１７でｐ＝１．０００）と類似している。図１２（Ａ）〜（Ｂ）は、症例＃Ｆ１０１４１１Ａ１の染色の一例である。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色は、ＨＥＲ２強度３、範囲８０％、バックグラウンド０；Ｃｈｒ１７強度３．０、範囲８０％、バックグラウンド０を有した。一方、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ染色は、ＨＥＲ２強度３、範囲８０％、バックグラウンド０．５；ＣＨＲ１７強度３、範囲８０％、バックグラウンド０を有した。いくらかの銀の粉塵のバックグラウンドが、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅにより染色された組織で観察された。
本出願人らは、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅにより十分に染色された１０の胃組織の症例を選択した。各症例の重複スライドを１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨで染色した。ＨＥＲ２／ＣＨＲ１７Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨにより染色された１８のスライドが合格した（基準強度≧２に基づく）。２の症例については、重複スライドの一方が１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨによる不十分な染色を有した。図１３（Ａ）〜（Ｂ）は、症例＃Ｉ−５１８９−Ｃ８ａの染色の一例である。１時間ハイブリダイゼーションのＨＥＲ２／ＣＨＲ１７ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ ＤＩＳＨ染色は、ＨＥＲ２強度３、範囲８０％、バックグラウンド０；Ｃｈｒ１７強度３．０、範囲８０％、バックグラウンド０を有した。一方、６時間ハイブリダイゼーションのＩＮＦＯＲＭ ＨＥＲ２ ＤＵＡＬ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ染色は、ＨＥＲ２強度２．５、範囲７０％、バックグラウンド０．５；ＣＨＲ１７強度２．５、範囲７５％、バックグラウンド０を有した。
実施例２
実施例２は、ｐ１７Ｈ８プラスミドと４２ｍｅｒのＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドプローブを比較する（また、４２ｍｅｒのＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドプローブのＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブとの両立性を決定する）。
ｐ１７Ｈ８プラスミド（ＰＭＡ）：ｐ１７Ｈ８プラスミドプローブは、この全配列を含有する。１６６ｂｐ配列の反復が１６ある。このプローブは、他の染色体へのクロスハイブリダイゼーションからの弱いシグナルを生じさせるため、ヒト胎盤ＤＮＡを必要する。
ＣＨＲ１７（４２ｍｅｒ）オリゴ：４２ｍｅｒのＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドプローブ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｐ／Ｎ：９０６８２、１０７６０、９５２２１）は、ＣＨＲ１７に対して良好な特異性を有し、ヒト胎盤ＤＮＡを必要としない。ただし、最適なハイブリダイゼーション条件は、ＨＥＲ２プローブ２（ＩＮＦＯＲＭ ＰＣＲ産物から作られるＦＤＡ認可の製品）と異なる。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブとのその両立性が、ここで評価される。
定型アッセイ条件：ＳｔｄＣＣ２、Ｐ３ ２０分、変性 ８分、銀及び赤色検出 ８分、Ｈ＆Ｅ ８分
試験条件：
（１）Ｃｈｒ１７オリゴヌクレオチド（４２ｍｅｒ）濃度：０．３５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、及び３．０μｇ／ｍｌ
（２）ハイブリダイゼーション温度：４２℃、４４℃、及び４６℃
（３）ハイブリダイゼーション時間：１時間、２時間、及び６時間
（４）ストリンジェンシー洗浄温度：５４℃、５９℃、及び６５℃
（５）ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミド濃度：２２．８％及び３３．２％
結果：図１４（Ａ）は、４２ｍｅｒのＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドプローブのかすかな染色を示す（条件は次の通り：Ｃｈｒ１７オリゴヌクレオチド（４２ｍｅｒ）０．７５μｇ／ｍｌ、４６℃、及び６時間Ｈｙｂ（ハイブリダイゼーション）、５９℃ストリンジェンシー洗浄、ホルムアミド濃度：３３．２％）。図１４（Ｂ）は、Ｃｈｒ１７（４２ｍｅｒ）染色が３３．２％ホルムアミドでＰＭＡよりも薄いことを示す。濃度及びハイブリダイゼーション時間を増やしても、シグナルは増加しなかった。（条件には５９℃ストリンジェンシー洗浄、３３．２％ホルムアミドが含まれる）。図１４（Ｃ）は、２２．８％ホルムアミドがより良好なＣＨＲ１７シグナルを生じさせたが、それでもＰＭＡより弱かったことを示す。濃度及びハイブリダイゼーション時間を増やしても、シグナル強度は増加しなかった。５９°Ｃのストリンジェンシー洗浄ではバックブラウンドは観察されなかった。しかし、２２．８％ホルムアミドはＨＥＲ２ Ｏｌｉｇｏｎμｃｌｅｏｔｉｄｅ ＩＳＨに最適ではない（両立しない）。図１４（Ｄ）は、ＣＨＲ１７オリゴヌクレオチド（４２ｍｅｒ）に対するストリンジェンシー洗浄温度がＨＥＲ２オリゴヌクレオチド（６８〜７２°Ｃ）とは一致しないこと；６５°Ｃのストリンジェンシー温度がＣＨＲ１７シグナルを削減させたことを示す。
要約すると、４２ｍｅｒ ＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドプローブは特異的なシグナルを生成し、０．７５及び１．５μｇ／ｍｌで１時間が最も良好な染色をもたらす。しかし、この染色はＰＭＡ対照よりも薄い。濃度及びハイブリダイゼーション時間を増やしても、シグナル強度は改善しなかった。この４２ｍｅｒ ＣＨＲ１７オリゴヌクレオチドプローブ用のハイブリダイゼーションアッセイ条件は、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ用の条件と両立可能ではない：ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドに対するストリンジェンシー洗浄温度の最適範囲は６８〜７２℃であり；該温度が６５℃まで上昇すると、ＣＨＲ１７オリゴヌクレオチド（４２ｍｅｒ）の染色強度の低下が顕著になる。
本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体がすべての目的のために援用される。対立が生じた場合には、用語の説明を含む本明細書が支配する。次の他の特許はその全体が参照により本明細書に援用される：米国特許第７８０７３５６号；米国特許第８４４５２０６号。
多くの例示的な態様及び実施態様を上述してきたが、当業者は、その特定の変更、並べ替え、追加、及び部分的組合わせが本開示に存在していることを認識するであろう。したがって、以下の添付の特許請求の範囲及び今後導入される特許請求の範囲は、それらの真の精神及び範囲の内に入るすべての並べ替え、追加、及び部分的組合わせを含むと解釈されることが意図される。
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Claims (27)

  1. ヒト１７番染色体のコントロール領域のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのシステムであって、前記システムが：
    ヒト１７番染色体のアルファサテライトコントロール領域のＸ個の異なるモノマーに特異的な二以上の一本鎖コントロールプローブのセットを含み、ここで、Ｘ＝２〜１４であり、コントロールプローブは少なくとも一の第一の標識でそれぞれ標識されており、各コントロールプローブが：
    −配列番号３、４及び６から１６からなる群より選択される配列；又は
    −配列番号３、４及び６から１６の切断型からなる群より選択される配列であって、切断型が前記配列番号３、４及び６から１６の少なくとも４０の連続ｂｐであり、元の配列と同等のＩＳＨ法における染色性能を示すハイブリダイゼーション効率を有する配列；又は
    −配列番号３、４及び６から１６のうちの一つと少なくとも９０％の配列同一性又は少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列であって、元の配列と同等のＩＳＨ法における染色性能を示すハイブリダイゼーション効率を有する配列；又は
    −その相補体
    を含む、システム。
  2. 各コントロールプローブが：
    −配列番号３、４及び６から１６の切断型からなる群より選択される配列であって、切断型が前記配列番号３、４及び６から１６の少なくとも４０の連続ｂｐであり、元の配列と同等のＩＳＨ法における染色性能を示すハイブリダイゼーション効率を有する配列；又は
    −配列番号３、４及び６から１６のうちの一つと少なくとも９０％の配列同一性又は少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列であって、元の配列と同等のＩＳＨ法における染色性能を示すハイブリダイゼーション効率を有する配列；又は
    −その相補体
    を含む、請求項１に記載のシステム。
  3. コントロールプローブが５０〜１００のヌクレオチドをそれぞれ含む、請求項１又は２に記載のシステム。
  4. コントロールプローブがコントロール領域内で２〜１４の異なる部分を標的とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のシステム。
  5. コントロールプローブが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５の第一の標識でそれぞれ標識されている、請求項１から４のいずれか一項に記載のシステム。
  6. 少なくとも一の第一の標識がハプテンを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のシステム。
  7. ヒト１７番染色体の標的領域に特異的な標的プローブをさらに含み、該標的プローブが少なくとも一の第二の標識で標識されている、請求項１から６のいずれか一項に記載のシステム。
  8. 標的プローブが、ＨＥＲ２遺伝子座の近傍又は周囲の標的領域に特異的であるか又は、
    標的プローブが、ヒト１７番染色体のヌクレオチド３５，０２７，９７９と３５，３５５，５１６の間の領域に特異的である、請求項７に記載のシステム。
  9. ＩＳＨ染色機器をさらに含み、該機器がコントロールプローブを組織試料に接触させるように構成されている、請求項１から８のいずれか一項に記載のシステム。
  10. ヒト１７番染色体のコントロール領域のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、請求項１から８のいずれか一項に記載のシステム及び該システムを収容する容器を含む、キット。
  11. ヒト１７番染色体のコントロール領域のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのスライドであって、１７番染色体に対して発色性染色された複数の核を含み、請求項１から９のいずれか一項に記載のシステムを用いて作成される、スライド。
  12. 組織試料を請求項１から９のいずれか一項に記載のシステムと接触させることを含む、組織試料のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための方法。
  13. 二重明視野ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための方法であって：
    組織試料を、ヒト１７番染色体のアルファサテライトコントロール領域のＸ個の異なるモノマーに特異的な二以上の一本鎖コントロールプローブのセット（ここでＸ＝２〜１４であり、各コントロールプローブは少なくとも一の第一の標識で標識されており、各コントロールプローブが：
    −配列番号３、４及び６から１６からなる群より選択される配列；又は
    −配列番号３、４及び６から１６の切断型からなる群より選択される配列であって、切断型が前記配列番号３、４及び６から１６の少なくとも４０の連続ｂｐであり、元の配列と同等のＩＳＨ法における染色性能を示すハイブリダイゼーション効率を有する配列；又は
    −配列番号３、４及び６から１６のうちの一つと少なくとも９０％の配列同一性又は少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列であって、元の配列と同等のＩＳＨ法における染色性能を示すハイブリダイゼーション効率を有する配列；又は
    −その相補体
    を含む）と接触させること；
    組織試料を、ヒト１７番染色体のＨＥＲ２遺伝子座の近傍又は周囲の標的領域に特異的な一本鎖標的プローブであって、少なくとも一の第二の標識で標識されている標的プローブと接触させること；
    約３時間未満の時間条件下で該プローブをハイブリダイズさせること；
    該試料をすすいで非結合プローブを除去すること；及び
    該試料を染色してハイブリダイズされたプローブを検出すること
    を含む方法。
  14. 試料が、コントロールプローブを検出するための第一の発色性の色で染色され、かつヒト１７番染色体のＨＥＲ２遺伝子座の近傍又は周囲の標的領域に特異的な標的プローブを検出するための第二の異なる発色性の色で染色される、請求項１３に記載の方法。
  15. プローブが約２時間未満の時間条件下でハイブリダイズされ、場合によって、プローブが約１時間未満の時間条件下でハイブリダイズされる、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された組織試料である、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ＨＥＲ２遺伝子コピ−数について染色体をスコアリングする方法であって：
    請求項１３から１６のいずれか一項に記載のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを受けた組織試料を得ること（ここで、ヒト１７番染色体に特異的なコントロールプローブ及びＨＥＲ２に特異的な標的プローブが用いられる）；
    最も多いコピー数を有する腫瘍核の領域を同定すること；並びに
    少なくとも２０の核におけるＨＥＲ２シグナルの計数可能なシグナルをカウントすること；及び
    ＨＥＲ２シグナルの１７番染色体シグナルに対する比率（ＨＥＲ２／ＣＨＲ１７比率）を計算すること
    を含む方法。
  18. ＨＥＲ２／ＣＨＲ１７比率が１．８〜２．２の範囲内にある場合、次いで計数可能なシグナルが２０の追加の核においてカウントされ、ＨＥＲ２／ＣＨＲ１７比率が４０の総核から計算される、請求項１７に記載の方法。
  19. ２．０未満のＨＥＲ２／ＣＨＲ１７比率は非増幅とみなされ、２．０以上のＨＥＲ２／ＣＨＲ１７比率は増幅とみなされる、請求項１７に記載の方法。
  20. 核あたりのＨＥＲ２コピーの平均数を計算することをさらに含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 複数の一本鎖オリゴヌクレオチドコントロールプローブを含むプローブであって、各コントロールプローブが：
    −配列番号３、４及び６から１６からなる群より選択される配列；又は
    −配列番号３、４及び６から１６の切断型からなる群より選択される配列であって、切断型が前記配列番号３、４及び６から１６の少なくとも４０の連続ｂｐであり、元の配列と同等のＩＳＨ法における染色性能を示すハイブリダイゼーション効率を有する配列；又は
    −配列番号３、４及び６から１６のうちの一つと少なくとも９０％の配列同一性又は少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列であって、元の配列と同等のＩＳＨ法における染色性能を示すハイブリダイゼーション効率を有する配列
    を含むプローブ。
  22. 請求項１０に記載のキットを製造するための方法であって、パッケージで、請求項１から８のいずれか一項に記載される二以上の一本鎖コントロールプローブのセットを組み合わせることを含む、製造方法。
  23. 二重明視野ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのキットであって：
    ヒト１７番染色体のアルファサテライトコントロール領域のＸ個の異なるモノマーに特異的な二以上の一本鎖コントロールプローブのセット（ここでＸ＝２〜１４であり、各コントロールプローブは少なくとも一の第一の標識で標識されており、各コントロールプローブが：
    −配列番号３、４及び６から１６からなる群より選択される配列；又は
    −配列番号３、４及び６から１６の切断型からなる群より選択される配列であって、切断型が前記配列番号３、４及び６から１６の少なくとも４０の連続ｂｐであり、元の配列と同等のＩＳＨ法における染色性能を示すハイブリダイゼーション効率を有する配列；又は
    −配列番号３、４及び６から１６のうちの一つと少なくとも９０％の配列同一性又は少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列であって、元の配列と同等のＩＳＨ法における染色性能を示すハイブリダイゼーション効率を有する配列；又は
    −その相補体
    を含む）；及び
    ヒト１７番染色体のＨＥＲ２遺伝子座の近傍又は周囲の標的領域に特異的な一本鎖標的プローブであって、少なくとも一の第二の標識で標識されている標的プローブ
    を含む、キット。
  24. コントロールプローブが、試料に適用された場合、３時間以内のハイブリダイゼーションで≧２の染色強度及び核総数の≧５０％の染色範囲で、細胞あたり少なくとも二の計数可能なシグナルを得るように構成されている、請求項１から９のいずれか一項に記載のシステム、請求項１０又は２３に記載のキット、又は請求項１１に記載のスライド。
  25. コントロールプローブが、１７番染色体にハイブリダイズされた場合、計数可能なシグナルを得ることができ、各計数可能なシグナルは一般的に円形を有し、ここで円形は第一の領域内に収まる単純閉曲線により定義される形状であり、該第一の領域は内側の同心円の円上及び内側の同心円と外側の同心円との間の領域であり、該内側の同心円は内半径（Ｒｉｎ）を有し、該外側の同心円は外半径（Ｒｏｕｔ）を有し、ここでＲｉｎはＲｏｕｔの≧５０％であり、また単純閉曲線は半径Ｒｓｉｍｐｌｅを有し、ここでＲｉｎ≦Ｒｓｉｍｐｌｅ≦Ｒｏｕｔであり、かつ単純閉曲線はそれ自体と交差せず、開始点と同じ点で終わる曲線である、請求項１から９のいずれか一項に記載のシステム、請求項１０又は２３に記載のキット、又は請求項１１に記載のスライド。
  26. ＲｉｎがＲｏｕｔの≧９０％である、請求項２５に記載のシステム、キット、又はスライド。
  27. 外半径（Ｒｏｕｔ）が約０．２５から０．６７５μｍである、請求項２５に記載のシステム、キット、又はスライド。
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