CN112795649A - 一种用于检测her2基因扩增水平的探针组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域,具体涉及一种用于检测HER2基因扩增水平的探针组及其应用,该探针组由说明书表1所示的核苷酸序列制备得到。在HER2基因的非重复区域,采用多种不同长度的寡核苷酸文库,在使用尽可能少的探针的基础上,增加探针分辨率;其在制备的过程中还采用PCR掺入法,保证产物中含有更多的荧光基团,采用上述探针组用于检测HER2基因的扩增水平,在30分钟内即可完成石蜡组织样本的FISH杂交,敏感性高,特异性强且杂交背景干净、信噪比低。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体涉及一种用于检测HER2基因扩增水平的探针组及其应用。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)通路是影响肿瘤的重要通路,EGFR属于酪氨酸激酶受体家族,主要在上皮组织细胞表面,包括HER1、HER2、HER3和HER4等成员。其中HER2是原癌基因HER2/neu编码的一种分子量为185kD跨膜糖蛋白p185,HER2基因扩增与增加细胞分化、局部及远处转移、迁移、减少细胞凋亡、加快血管发生、肿瘤侵袭、局部及远处转移密切相关。基础研究表明HER2的过量表达可促进肿瘤细胞的转移,一方面通过调节上皮细胞钙黏蛋白等黏附因子的表达来促进迁移,另一方面可启动多种转移机制来加快肿瘤细胞的转移。研究表明,大约25%~30%的浸润性乳腺癌有HER2基因扩增或蛋白过表达,但是具体的表达对比情况还不明确,因此,准确地检测HER2状态不仅能为乳腺癌患者的愈后提供依据,而且是有效治疗乳腺癌的前提。
荧光原位杂交(FISH)探针指被荧光标记的已知序列的单链核酸,能与待测样本中互补的单链核酸特异性结合,荧光显微镜能检测到杂交荧光的位置,从而定位特定基因在染色体上的位置。荧光原位杂交技术作为一种可视化特定DNA序列的分子细胞遗传学技术,目前广泛被应用于染色体畸变的检测中。
现有的荧光原位杂交技术其存在的最大弊端就是检测时间长、探针数量多,成本较高且检测时间往往都在12小时以上,患者在进行检测时当天很难拿到检测结果,检测结果过慢往往也是导致医患关系紧张的一个重要因素。因此,如何缩短荧光原位杂交技术的检测时间并保证其准确度是该领域一直在研究的一个重要方向。
发明内容
基于此,本发明的目的在于提供一种新的用于检测HER2基因扩增水平的探针组,该探针组由说明书表1所示的核苷酸序列制备得到。
作为本发明的一种实施方式,该探针组采用上述核苷酸序列,并在所述核苷酸序列的两端添加标签序列得到特征性引物,对所述特征性引物其进行PCR扩增得到。
作为本发明的另一种实施方式,PCR扩增体系中含有Alexa fluor555-dUTP标记的dUTP。
作为本发明的另一种实施方式,5’端标签序列为:TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ IDNO:1);3’端标签序列为:CCGCTGAGCAATAACTAGCA(SEQ ID NO:2)。
作为本发明的另一种实施方式,PCR扩增产物标记有荧光材料。
本发明还提供一种上述用于检测HER2基因扩增水平的探针组的制备方法,包括以下步骤:
S1,以HER2基因的序列为依据,在不含重复序列的区域分别设计含45个碱基/60个碱基/80个碱基的核苷酸序列,设定探针Tm值为50℃,GC含量范围为40-60%,舍弃包含AAAA/TTTT/CCCC/GGGG的序列后,得到1702条候选核苷酸序列探针,再经过全基因组(hg38)BLAST比对分析后,最终得到共计1245个核苷酸探针序列,具体参见说明书中表1所示;
S2,分别在每条核苷酸序列的5’加上20bp的标签序列、3’端加上20bp的标签序列,得到一系列带有标签序列的特征性引物,其中5’端标签序列为:TAATACGACTCACTATAGGG;3’端标签序列为:CCGCTGAGCAATAACTAGCA;
S3,合成S2中的特征性引物并设计其扩增引物;
S4,采用含有扩增引物、Alexa fluor555-dUTP标记的dUTP的反应体系扩增特征性引物,将荧光材料标记掺入PCR产物中并纯化PCR产物即得。
其中,PCR扩增时所用的引物为:Primer-F:TAATACGACTCACTATAGG,Primer-R:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG
本发明还提供了一种用于检测HER2基因扩增水平的试剂盒,其特征在于,含有上述所述的探针组。
本发明在HER2基因的非重复区域,采用多种不同长度的寡核苷酸文库,在使用尽可能少的探针的基础上,增加了探针分辨率,其在制备的过程中还采用PCR掺入法,保证产物中含有更多的荧光基团。采用上述探针组用于检测HER2基因的扩增水平,成本较低且在30分钟内即可完成石蜡组织样本的FISH杂交,敏感性高,特异性强且杂交背景干净、信噪比低。
附图说明
图1为实施例2中正常人外周淋巴细胞滴片荧光原位杂交后得到的荧光显微镜下的照片;
图2为实施例4中乳腺癌石蜡组织切片荧光原位杂交后得到的荧光显微镜下的照片;
图3为对比例1中乳腺癌石蜡组织切片荧光原位杂交后得到的荧光显微镜下的照片,其中A1和A2为本申请中探针组的检测结果,A3和A4为市面上某公司的探针组的检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种用于检测HER2基因扩增水平的探针组的制备方法,具体包括以下步骤:
S1,以HER2基因的序列为依据,在不含重复序列的区域分别设计含45个碱基/60个碱基/80个碱基的核苷酸序列,设定探针Tm值为50℃,GC含量范围为40~60%,舍弃包含AAAA/TTTT/CCCC/GGGG的序列后,得到1702条候选探针,再经过全基因(hg38)BLAST比对分析后,最终得到共计1245个核苷酸序列,具体如下表1所示;
S2,分别在每条核苷酸序列的5’端加上20bp的标签序列、3’端加上20bp的标签序列,得到一系列带有标签序列的特征性引物,其中5’端标签序列为:TAATACGACTCACTATAGGG,3’端标签序列为:CCGCTGAGCAATAACTAGCA;
S3,采用高通量芯片合成技术,按照半导体芯片制备步骤S2中的特征性引物并设计该特征性引物的扩增引物;
S4,以洗脱后的特征性引物为模板,加入用lexa fluor555-dUTP标记的dUTP进行PCR扩增,将荧光标记材料掺入PCR产物中,得到荧光标记的PCR产物;PCR扩增时的引物为:Primer-F:TAATACGACTCACTATAGG,Primer-R:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG;
PCR扩增体系为:10x buffer 5uL、F+Rprimer(10uM)2uL、洗脱后特征性引物1uL、10mM dATP 1uL、10mM dCTP 1uL、10mM dGTP 1uL、10mM dTTP 0.75uL、1mMAlexa fluor555-dUTP 2.5uL、Taq DNApolymerase 0.5uL、ddH2035.25 uL;
PCR反应程序为94℃5min、55℃5min;72℃2min、94℃1min、55℃1min,30个循环;72℃5min、4℃保温。
S4,对步骤S3扩增后的PCR产物进行纯化,得到荧光原位杂交探针组。
表1 1245个探针的序列信息
将上述制备得到的探针组按照下表2的组分混合制备得到杂交缓冲液,并进一步制备成试剂盒。
表2 10人份的杂交缓冲液的制备
实施例2正常人外周淋巴细胞滴片实验
材料:人外周血淋巴细胞培养基、秋水仙碱、低渗液(0.4%KCl)、固定液(甲醇:乙酸=3:1,体积比)。
S1,细胞培养及同步化:取0.4mL肝素抗凝全血(来自医院)于人外周血淋巴细胞培养基中,混匀后于37℃、5%CO2恒温培养箱内培养72h,并于终止前4h,向培养基中加入秋水仙素至终浓度(0.1μg/mL)继续培养4h;
S2,收集和固定:收集培养基,500g离心5min后,弃上清,再加入0.4%KCl低渗液孵育30min,然后用甲醇-冰醋酸混合液固定细胞,室温静置10min,500g离心沉淀细胞,重复细胞固定步骤一遍,弃上清液后,根据细胞数量加入适当固定液;
S3,制片:吸取7-10μL细胞悬液,自70-80cm高处滴在一张干燥清洁的载玻片上,吹干后,56℃烤片2h;
S4,变性杂交:取10μL实施例1中制得的杂交缓冲液以及商品化的CEP17探针(武汉友芝友医疗科技有限公司)滴加到处理好的样本的玻片杂交区域,立即加盖盖玻片,用橡皮胶封边,避免盖玻片与玻片之间产生气泡。杂交仪上95℃共变性2min,42℃杂交30min;
S5,杂交后洗涤:用镊子小心撕去盖玻片周围封片胶,避免粘掉或者移动盖玻片;将载玻片放入稀释后的洗涤液1(含0.6M氯化钠和50mM Tris-Hcl)中浸泡1min,待盖玻片自然脱落,再将载玻片放入洗涤液2(含0.6M氯化钠、50mM Tris-HCl和0.3%NP-40)于52℃中浸泡5min,最后将载玻片放入37℃预热的去离子水中浸泡10s,暗处自然干燥载玻片;
S6,DAPI复染:向切片正中心滴加细胞核染色液(荧光原位杂交样品处理试剂盒细胞核染色液,购自Thermo Fisher Scientific),盖玻片封片,置于荧光显微镜下,先在低倍物镜(10×)下确认细胞区域;转到40×物镜下,找到一个细胞分布均匀的位置,再在高倍物镜(100×)下观察细胞核的FISH结果。
实验结果:结果如图1所示,中期细胞中HER2基因探针信号清晰可见,有两个明亮的红色信号(见图1中a和b),两个明亮的绿色信号(见图1中c和d)其中绿色荧光信号为17号染色体着丝粒探针,证明HER2基因荧光信号定位于17号染色体上,且在染色体其它位置都未见荧光信号,特异性强。
实施例3
参考与实施例2的方法检测含有50个中期淋巴细胞的载玻片,结果如下表3所示,可以看出,HER2基因探针的FISH信号点都在99个,敏感性达到99%。
表3探针的敏感性检测结果
探针类型 | 中期淋巴细胞(个) | FISH信号点(个) | 敏感性 |
HER2基因探针 | 50 | 99 | 99% |
实施例4乳腺癌石蜡组织切片实验
S1,乳腺癌石蜡组织切片前处理:
S2,烤片:将组织切片置于烤片机上65℃烤片1-2小时;
S3,将组织切片放入二甲苯中室温脱蜡10分钟,重复一次,然后放入100%无水乙醇中室温10分钟,去除残留二甲苯;取出玻片,将其放入100%、90%、70%梯度乙醇中各2分钟,随即浸入去离子水中3分钟,取出切片后用无绒纸巾沿组织周围吸去多余水分;再将其放入通透剂中90℃煮片20分钟;取出玻片,再将玻片放入去离子水中室温洗涤5分钟;再将玻片放入37℃预热的蛋白酶K工作液中,消化20-30分钟;取出玻片将其放入2×SSC中室温洗涤5分钟;取出玻片后,再放入另一缸2×SSC中室温洗涤5分钟;再将玻片依次放入70%,90%,100%梯度乙醇室温脱水各3分钟;取出玻片,室温晾干。
S4,变性杂交:取10μL实施例1制得的杂交缓冲液滴加到处理好的样本的玻片杂交区域,立即加盖盖玻片,用橡皮胶封边,避免盖玻片与玻片之间产生气泡;杂交仪上95℃共变性2min,42℃杂交30min。
S5,杂交后洗涤:用镊子小心撕去盖玻片周围封片胶,避免粘掉或者移动盖玻片;将载玻片放入稀释后的洗涤液1(含0.6M氯化钠和50mM Tris-Hcl)中浸泡1min,待盖玻片自然脱落,再将载玻片放入洗涤液2(含0.6M氯化钠、50mM Tris-Hcl和0.3%NP-40)于52℃中浸泡5min,最后将载玻片放入37℃预热的去离子水中浸泡10s,暗处自然干燥载玻片。
S6,DAPI复染:向切片正中心滴加细胞核染色液(荧光原位杂交样品处理试剂盒细胞核染色液),盖玻片封片,置于荧光显微镜下,先在低倍物镜(10×)下确认细胞区域;转到40×物镜下,找到一个细胞分布均匀的位置,再在高倍物镜(100×)下观察细胞核的FISH结果。
实验结果:结果如图2所示,组织细胞中HER2基因探针信号明亮清晰可见,敏感性高。
对比例
使用实施例1的试剂盒与市面上K公司的HER2基因检测试剂盒对乳腺癌石蜡组织切片进行荧光原位杂交(FISH)对比实验,实验方法同实验例3。
实验结果如图3所示,在同样30min的杂交时间内,本申请中HER2基因探针产物(A1和A2)与同类产品(A3和A4)对比,信号点强度更亮,杂交背景更干净,信噪比更低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉友芝友医疗科技股份有限公司
<120> 一种用于检测HER2基因扩增水平的探针组及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 1
taatacgact cactataggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 2
ccgctgagca ataactagca 20
Claims (8)
1.一种用于检测HER2基因扩增水平的探针组,其特征在于,该探针组由说明书表1中所示的1245个核苷酸序列制备得到。
2.根据权利要求1所述的用于检测HER2基因扩增水平的探针组,其特征在于,该探针组采用权利要求1所述的核苷酸序列,并分别在所述核苷酸序列的两端添加标签序列得到特征性引物,对所述特征性引物其进行PCR扩增得到。
3.根据权利要求2所述的用于检测HER2基因扩增水平的探针组,其特征在于,PCR扩增体系中含有Alexa fluor555-dUTP标记的dUTP。
4.根据权利要求2或3所述的用于检测HER2基因扩增水平的探针组,其特征在于,5’端标签序列为:TAATACGACTCACTATAGGG;3’端标签序列为:CCGCTGAGCAATAACTAGCA。
5.根据权利要求4所述的用于检测HER2基因扩增水平的探针组,其特征在于,PCR扩增产物标记有荧光材料。
6.制备权利要求1-5任一项所述的用于检测HER2基因扩增水平的探针组的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,以HER2基因的序列为依据,在不含重复序列的区域分别设计含45个碱基/60个碱基/80个碱基的核苷酸序列,设定探针Tm值为50℃,GC含量范围为40-60%,舍弃包含AAAA/TTTT/CCCC/GGGG的序列后,共得到1702条候选探针序列,再经过全基因组hg38 BLAST比对分析后,最终得到1245个核苷酸探针序列,具体参见说明书中表1所示;
S2,分别在每条核苷酸探针序列的5’加上20bp的标签序列、3’端加上20bp的标签序列,得到一系列带有标签序列的特征性引物,其中5’端标签序列为:TAATACGACTCACTATAGGG;3’端标签序列为:CCGCTGAGCAATAACTAGCA;
S3,合成S2中的特征性引物并设计其扩增引物;
S4,采用含有扩增引物、Alexa fluor555-dUTP标记的dUTP的反应体系扩增特征性引物,将荧光材料标记掺入PCR产物中并纯化PCR产物即得。
7.根据权利要求6所述的用于检测HER2基因扩增水平的探针组的制备方法,其特征在于,PCR扩增时所用的引物为:Primer-F:TAATACGACTCACTATAGG,Primer-R:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG。
8.一种用于检测HER2基因扩增水平的试剂盒,其特征在于,含有权利要求1~5任一项所述的探针组。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |