CN111635936A

CN111635936A - 检测人染色体数目的探针组合物、试剂盒和应用

Info

Publication number: CN111635936A
Application number: CN202010600228.XA
Authority: CN
Inventors: 祝丹平; 魏亮; 肖书圣; 解亚平
Original assignee: Wuhan Youzhiyou Medical Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Youzhiyou Medical Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2020-09-08

Abstract

本发明公开了一种检测人染色体数目的探针组合物、试剂盒和应用，涉及分子生物学技术领域。本发明公开的探针组合物靶向人8号染色体着丝粒的第一探针组合和靶向人17号染色体着丝粒的第二探针组合。该探针组合物可以检测人8和17号染色体数目，该探针组合物易于进入细胞与靶区域杂交，杂交信号强度高，信噪比低，且特异性强。

Description

检测人染色体数目的探针组合物、试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种检测人染色体数目的探针组合物、试剂盒和应用。

背景技术

8号染色体跨越超过1.46亿个DNA构建块(碱基对)，占细胞总DNA的4.5％至5％。识别每条染色体上的基因是遗传研究的一个活跃领域。由于研究人员使用不同的方法来预测每条染色体上的基因数量，因此估计的基因数量会有所不同。8号染色体含有约700个基因，这些基因所编码的蛋白，在体内发挥着各种不同的作用。8号染色体异常引起的相关疾病包括8p11骨髓增生综合征，心结合因子急性髓性白血病以及8号染色体重组综合征，另外8号染色体拷贝数异常在一切乳腺癌亚型中是经常发生的，随着临床分期的进展，8号染色体拷贝数异常的频率增加。而且，8号染色体的拷贝异常与淋巴结转移，晚期胃癌，胰腺癌和肺癌的发生具有相关性。

现在，人17号染色体着丝粒探针主要作为HER-2/TOP2A等探针的内标探针在乳腺癌、胃癌临床方面的起到很重要的作用。人类第17号染色体由大约8100万个碱基对构成，含有1500多个基因，有许多与疾病相关的基因，如乳腺癌基因、神经纤维瘤基因、遗传性神经紊乱基因等。乳腺癌临床检测中，HER2基因扩增检测可指导用药以及预后判断，荧光原位杂交中常用HER2探针与人17号染色体着丝粒探针荧光数的比值来判断待检组织HER2基因扩增状态。

目前常用的人8/17号染色体着丝粒探针一般采用已提供序列的特异性重复单元序列标记，但实际杂交效果较差，存在特异性较低，杂信号多，杂交背景差等缺点，这不利于临床的正确诊断及治疗。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供检测人染色体数目的探针组合物、试剂盒和应用。本发明提供的探针组合物可以检测人8和17号染色体数目，该探针组合物易于进入细胞与靶区域杂交，杂交信号强度高，信噪比低，且特异性强。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供一种检测人染色体数目的探针组合物，所述探针组合物选自如下探针组合中的至少一种：

靶向人8号染色体着丝粒的第一探针组合，其包括：SEQ ID NO.2、5、6、7、10和11所示的探针或其互补的探针；

靶向人17号染色体着丝粒的第二探针组合，其包括：SEQ ID NO.16、19、20、21、26和27所示的探针或其互补的探针。

本发明的探针组合物根据人8号染色体着丝粒和人17号染色体着丝粒区域的高度特异性序列设计，探针组合物中的各探针长度短，控制在10-20bp范围内，短片段的探针易于进入细胞，提高杂交成功率；同时为了避免单条的短片段探针可能出现荧光信号弱的问题，增加每个探针组合中的探针数量，多个探针以组合形成与着丝粒靶区域杂交，有助于提高信号强度；且每个探针的序列都是经过发明人的精心设计，确保其特异性强，避免探针与其他非靶区域杂交；采用本发明的探针组合物检测人8号染色体和人17号染色体数目具有杂交信号强度高、特异性强、灵敏度高以及信噪比低等特点。

本发明的探针组合物可以仅包括第一探针组合或第二探针组合，也可以是包括第一探针组合和第二探针组合，当其包括第一探针组合或第二探针组合是可以仅针对人8号染色体或17号染色体数目检测；当其包括第一探针组合和第二探针组合，两个探针组合可以同时在同一体系中与各自的靶区域杂交，相互间不产生影响，同时对人8号染色体或17号染色体数目检测，在提高检测效率的同时，确保杂交特异性。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述第一探针组合中的各探针标记有相同的第一荧光染料。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述第一荧光染料选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3和CY5中的一种。

第一荧光染料包括但不限于FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3和CY5，在其他的实施例中，本领域技术人员可以根据需要合理选择，只要能够使得第一探针组合与靶区域的杂交位置以荧光形式被观察即可。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述第二探针组合中的各探针标记有相同的第二荧光染料。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述第二荧光染料选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3和CY5中的一种。

第二荧光染料包括但不限于FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3和CY5，在其他的实施例中，本领域技术人员可以根据需要合理选择，只要能够使得第二探针组合与靶区域的杂交位置以荧光形式被观察即可。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述探针组合物包括第一探针组合和第二探针组合时，所述第二荧光染料与所述第一荧光染料不同。

为了便于区分两个探针组合的杂交位置以及便于区分二者所结合的染色体类型，需要控制第二荧光染料与第一荧光染料不同，通过不同荧光染料所发射的不同颜色的荧光，可以实现对两个探针组合的杂交位置的有效区分，实现同时检测人8号染色体或17号染色体数目的效果。

本发明的探针组合物通过化学合成的方式得到，也可以通过PCR扩增的方式得到，无论以何种方法制备的探针，其只要是上述探针序列或者于上述探针序列具有高达95％、96％、97％、98％或99％的同一性，其均是属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供一种检测人染色体数目的试剂盒，所述试剂盒包括如上任一项所述的探针组合物。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括杂交缓冲液，所述杂交缓冲液含有：去离子甲酰胺、葡聚糖、SSC和Tris-HCl。

其中，去离子甲酰胺有利于降低双链DNA的融解温度，硫酸葡聚糖，有效提高探针浓度，SSC缓冲液的盐离子中和RNA/DNA主链上的负电荷，使其呈电中性，这样可以使探针和靶序列的结合比较容易进行。该杂交缓冲液可以提高杂交效果，缩短杂交时间。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述杂交缓冲液中，去离子甲酰胺的浓度为40-50％，优选为45％(体积百分比)。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述杂交缓冲液中，葡聚糖的浓度为8％-12％，优选为10％(质量体积百分比)。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述杂交缓冲液中，SSC的浓度为0.1-0.3mol/L，优选为0.2M。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述杂交缓冲液中，Tris-HCl的浓度为45-55mM，优选为50mM。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述杂交缓冲液含有鲑精DNA，优选地，所述鲑精DNA的浓度为8-12ng/μL，优选为10ng/μL。

鲑精DNA用于封闭非特异性位置。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述探针组合物存在于所述杂交缓冲液中。

当然，在其他的实施例中，所述探针组合物也可以独立地存在于试剂盒中，而非与所述杂交缓冲液混合，这是本领域技术人员根据需要可以选择的，无论以何种方式存在，其均是属于本发明的保护范围。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述探针组合物中的各探针在所述杂交缓冲液中的浓度为8-12ng/μL，优选为20ng/μL。

另一方面，本发明提供如上任一项所述的探针组合物在制备染色体数目异常相关疾病或基因数目异常相关疾病的辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供的探针组合物有效地检测人8号染色体和17号染色体的数目，具有特异性强，灵敏度高，信噪比低的特点，基于此，本发明提供的探针组合物可以用于染色体数目异常相关疾病或基因数目异常相关疾病的辅助诊断，为此类疾病的诊断提供一种更加可靠的探针。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述染色体数目异常相关疾病是指人8号染色体数目异常所致的疾病；所述基因数目异常相关疾病是指人17号染色体上基因数目异常所致的疾病。例如乳腺癌患者中17号染色体异常表达情况较为普遍，且位于其上的HER2、TOP2A等基因，及Ki67、ER、病理分型等临床指标与乳腺癌密切相关。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述人8号染色体数目异常所致的疾病选自骨髓增生异常综合症和癌症。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述癌症选自晚期胃癌、胰腺癌和肺癌。例如，胰腺癌患者中8号染色体存在不同比例的扩增和缺失现象，其上的c-myc基因的表达与胰腺导管癌早期发生相关。另外，8号和17号染色体异倍体及TP53、TOP2A蛋白的表达对胃腺癌辅助诊断也具有一定意义。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述人17号染色体上基因数目异常是指乳腺癌基因、神经纤维瘤基因或遗传性神经紊乱基因数目异常。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实验例1中的荧光原位杂交实验结果。

图2为对比例1中的荧光原位杂交实验结果，图中：A：某公司的8号染色体着丝粒探针荧光原位杂交实验结果，B：某公司17号染色体着丝粒探针荧光原位杂交实验结果，C：实施例4试剂盒荧光原位杂交实验结果；1、2、3代表选取的不同视野。

图3为对比例2中的单独使用表1中探针的荧光原位杂交实验结果。

图4为对比例2中的单独使用表2中探针的荧光原位杂交实验结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的检测人染色体数目的探针组合物，其能够针对人8号染色体数目检测，其包括第一探针组合；其中，第一探针组合包括如下表1中所示的探针，各探针标记有FAM基团；

表1靶向人8号染色体着丝点区域的探针

探针名称	探针序列(5’-3’)	SEQ ID NO.
			CHR8-2	ccagatactacaaatagagtgctgc	2
CHR8-5	atgcttctgtcttgttttcattgga	5
			CHR8-6	tgcgaatgcttctgtctagtttttg	6
CHR8-7	tgcgaatgcttctgtctagtttttg	7
			CHR8-10	aagcattctcagaaacagcgt	10
CHR8-12	gtcacagagttgaacattccc	12

实施例2

本实施例提供的检测人染色体数目的探针组合物，其能够针对人17号染色体数目检测，其包括第二探针组合；其中，第二探针组合包括如下表2中所示的探针，各探针标记有HEX基团；

表2靶向17号染色体着丝点区域的探针

实施例3

本实施例提供的检测人染色体数目的探针组合物，其能够同时检测人8号和人17号染色体数目检测，其包括第一探针组合和第二探针组合；其中，第一探针组合包括的探针见表1，第二探针组合包括的探针见表2。

实施例4

本实施例提供一种检测人染色体数目的试剂盒，该试剂盒包括实施例3的探针组合物以及杂交缓冲液，探针组合物存在与杂交缓冲液中；按10人份计，该试剂盒包括100μL杂交缓冲液，其中，含有的各组分浓度见表3。

表3

成分	10人份	终浓度
			实施例3的探针组合	10μL	20ng/μL(各探针)
去离子甲酰胺	45μL	45％
			50％葡聚糖	20μL	10％
20×SSC	10μL	2×SSC(0.2M)
			Tris-HCl(pH8.0～8.8)	5μL	50mM
鲑精DNA	1μL	10ng/μL
			水	9μL	-

实验例1

对实施例4的试剂盒进行细胞荧光原位杂交实验

1正常人外周淋巴细胞滴片的制备

材料：人外周血淋巴细胞培养基、秋水仙碱、低渗液(0.4％KCl)、固定液(甲醇:乙酸＝3:1，体积比)。

细胞培养及同步化：取0.4mL肝素抗凝全血于人外周血淋巴细胞培养基中，混匀后于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养72h，并于终止前4h，向培养基中加入秋水仙素至终浓度(0.1μg/mL)继续培养4h。

收集和固定：收集培养基，500g离心5min后，弃上清，再加入0.4％KCl低渗液孵育30min，然后用甲醇-冰醋酸混合液固定细胞，室温静置10min，500g离心沉淀细胞，重复细胞固定步骤一遍，弃上清液后，根据细胞数量加入适当固定液。

制片：吸取7-10μL细胞悬液，自70-80cm高处滴在一张干燥清洁的载玻片上，吹干后，56℃烤片2h，-20℃保存备用。

2细胞荧光原位杂交实验

细胞样本前处理：首先在上述步骤制得的载玻片上滴加150μL固定液室温固定5min。完成后PBS漂洗3次，每次3min。再滴加150μL穿孔剂室温放置3min。完成后PBS漂洗3次，3min。再将切片依次置于75％，85％，100％的乙醇溶液各2min，再将切片置于阴暗通风处晾干。

变性杂交：取10μL实施例5制得的杂交缓冲液滴加到处理好的样本的玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边，避免盖玻片与玻片之间产生气泡。杂交仪上95℃共变性2min，42℃杂交20min。

杂交后洗涤：用镊子小心撕去盖玻片周围封片胶，避免粘掉或者移动盖玻片；将载玻片放入稀释后的洗涤液1(含0.6M氯化钠和50mM Tris-HCl)中浸泡1min，待盖玻片自然脱落，再将载玻片放入洗涤液2(含0.6M氯化钠、50mM Tris-HCl和0.3％NP-40)于52℃中浸泡5min，最后将载玻片放入37℃预热的去离子水中浸泡10s，暗处自然干燥载玻片。

DAPI复染：向切片正中心滴加细胞核染色液(荧光原位杂交样品处理试剂盒细胞核染色液)，盖玻片封片，置于荧光显微镜下，先在低倍物镜(10×)下确认细胞区域；转到40×物镜下，找到一个细胞分布均匀的位置，再在高倍物镜(100×)下观察细胞核的FISH结果。

实验结果：结果如图1所示，中期细胞中8号染色体着丝粒区域清晰可见，有两个明亮的红色信号(见图1中a和b)，说明8号染色体数目为2个；17号染色体着丝粒区域清晰可见，有两个明亮的绿色信号(见图1中e和f)，说明17号染色体数目为2个，敏感性高，且在染色体其它位置都未见荧光信号，特异性强；间期细胞中8号染色体着丝粒区域清晰可见有两个明亮的红色信号(图1中c和d)；17号染色体着丝粒区域清晰可见(图1中g和h)，有两个明亮的绿色信号，敏感性高，且在染色体其它位置都未见荧光信号，说明本发明的探针的特异性强，信噪比低。

实验例2

参考与实验例1的方法检测含有50个中期淋巴细胞的载玻片，结果如下表4所示，可以看出，8号染色体着丝粒探针的FISH信号点都在99个，敏感性达到99％，17号染色体着丝粒探针的FISH信号点都在98个，敏感性达到98％，说明两种探针都具有较高的敏感性。

表4探针的敏感性检测结果

探针类型	中期淋巴细胞(个)	FISH信号点(个)	敏感性
				8号染色体着丝粒探针	50	99	99％
17号染色体着丝粒探针	50	98	98％

对比例1

使用实施例4的试剂盒与市面上某公司的8号染色体着丝粒探针和17号染色体着丝粒探针进行荧光原位杂交(FISH)对比实验，实验方法同实验例1。

实验结果如图2所示，在同样20min的杂交时间内，实施例4的试剂盒与同类产品对比，实施例4的试剂盒信号点强度更亮，杂交背景更干净，信噪比更低。

对比例2

参照实施例4的杂交缓冲液配制方法，将上表1和表2中的探针配置仅含一条探针的杂交缓冲液，并用该杂交缓冲，参考实验例1的方法进行检测，实验样本为临床血液；另外设置不同的对照探针，见表5：

表5

结果见图3和图4。

图3显示了单独使用表1中的8号染色体探针的检测结果，可以看出，每条探针的FISH信号强度不一样，其中，探针CEP8-2/5/6/7/10/11在细胞内的杂交效果较好，信号强度好于对照探针。

图4显示了单独使用表2中的17号染色体探针的检测结果，可以看出，每条探针的FISH信号强度不一样，其中，探针CEP17-4/7/8/9/14/15在细胞内的杂交效果较好，信号强度好于对照探针。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉友芝友医疗科技股份有限公司

<120> 检测人染色体数目的探针组合物、试剂盒和应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctgctctat gaatcccaat gttcc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccagatacta caaatagagt gctgc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaagctagcc aaatatccac ctgca 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctttttcagc ataggcccca aggag 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgcttctgt cttgttttca ttgga 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgcgaatgct tctgtctagt ttttg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgcgaatgct tctgtctagt ttttg 25

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttcagaaagc gctccaaatg tccacttcca 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccataggcct gaaagcgctc caaatgtcca 30

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aagcattctc agaaacagcg t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaaacgggaa tatcttcaaa t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtcacagagt tgaacattcc c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgggatggag tagtttcgaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acataaaaac tatacagaag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttcctttgga tggagaaggt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aagccttctc agaaactact 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acatcttcaa ataaaatcta 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

catgcttttc gtagggtctg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

catcttcaaa taaaatctag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atctacaagt ggatattcgg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

actcacagag ttgaacactc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctcacagagt tgaacactcc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tcacagagtt gaacactcct 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atcttcaaat aaaatctaga 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tcttcaaata aaatctagac 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tttgaaacac actttctgta 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cgtagtgtct gcaagtggac 20

Claims

1.一种检测人染色体数目的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物选自如下探针组合中的至少一种：

2.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述第一探针组合中的各探针标记有相同的第一荧光染料；优选地，所述第一荧光染料选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3和CY5中的一种。

3.根据权利要求2所述的探针组合物，其特征在于，所述第二探针组合中的各探针标记有相同的第二荧光染料；优选地，所述第二荧光染料选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3和CY5中的一种；

优选地，当所述探针组合物包括第一探针组合和第二探针组合时，所述第二荧光染料与所述第一荧光染料不同。

4.一种检测人染色体数目的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的探针组合物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括杂交缓冲液，所述杂交缓冲液含有：去离子甲酰胺、葡聚糖、SSC和Tris-HCl；

优选地，所述杂交缓冲液中，去离子甲酰胺的浓度为40-50％；

优选地，所述杂交缓冲液中，葡聚糖的浓度为8％-12％；

优选地，所述杂交缓中，SSC的浓度为0.1-0.3M；

优选地，所述杂交缓冲液中，Tris-HCl的浓度为45-55mM；

优选地，所述杂交缓冲液含有鲑精DNA，优选地，所述鲑精DNA的浓度为8-12ng/μL。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针组合物存在于所述杂交缓冲液中；

优选地，所述探针组合物中的各探针在所述杂交缓冲液中的浓度为18-22ng/μL。

7.权利要求1-3任一项所述的探针组合物在制备染色体数目异常相关疾病或基因数目异常相关疾病的辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述染色体数目异常相关疾病是指人8号染色体数目异常所致的疾病；所述基因数目异常相关疾病是指人17号染色体上基因异常所致的疾病。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述人8号染色体数目异常所致的疾病选自骨髓增生异常综合症和癌症；

优选地，所述癌症选自晚期胃癌、胰腺癌和肺癌。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述人17号染色体上基因异常是指乳腺癌基因、神经纤维瘤基因或遗传性神经紊乱基因异常；

优选地，所述乳腺癌基因为HER2基因。