CN109161580A - Her2基因荧光原位杂交探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HER2基因荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。本发明的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法以及采用该制备方法制备得到的HER2基因荧光原位杂交探针,专门针对基因组非重复区设计,可以降低非特异反应,减少背景干扰;构建的探针是单链DNA,较之传统的BAC或PCR产物等双链探针,可以减少探针与自身的配对,增加杂交效率;并且构建的单链DNA探针片段小,可以更加快速的与靶向序列结合,减少杂交时间。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域,尤其是涉及一种HER2基因荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。
背景技术
荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是根据已知种群特异的DNA序列,以利用荧光标记的DNA片段作为探针,与细胞基因组中DNA分子杂交,检测该特异DNA的存在与丰度。FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核。
目前商业化的HER2等基因FISH检测主要使用BAC(Bacterial ArtificialChromosome)或者PCR产物作为探针经过荧光分子标记后进行杂交检测。然而,BAC和PCR产物探针存在一些非特异序列,探针特异性不高,信号背景偏高。现有探针片段普遍偏大,一般长度在200-500nt之间,缺乏有效方法进行小片段化,杂交效率偏低,杂交时间长。而且现在探针在标记荧光的时候是随机参入荧光,因此每个探针荧光数目不确定,造成每个批次差异比较大。
发明内容
基于此,有必要提供一种特异性高、杂交效率高且荧光标记强度高的HER2基因荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。
一种HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法,包括如下步骤:
构建探针文库:选择包含HER2基因的人类基因组17号染色体上非重复的目标基因区域,每隔1-10bp构建一个与目标基因区域完全互补的长度为35nt-200nt的单链片段作为候选探针,通过BLAST比对,获得非特异杂交的Tm值,去除非特异Tm值对于45℃的候选探针,并选择非重叠的候选探针,在筛选得到的候选探针的两端分别加上扩增引物片段,得到目的探针文库;
扩增所述目的探针文库;
对扩增产物进行体外转录,制备与所述目的探针文库对应的文库RNA;
对所述文库RNA进行反转录,制备单链DNA探针;
对制备的单链DNA探针进行荧光标记,即得。
在其中一个实施例中,所述候选探针的长度为40-50nt。
在其中一个实施例中,所述扩增引物片段的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
在其中一个实施例中,所述构建探针文库是使用芯片合成技术在基因芯片上合成所述目的探针文库。
在其中一个实施例中,使用乳液PCR扩增的方法扩增所述目的探针文库。
在其中一个实施例中,在乳液PCR扩增时,将配制的PCR反应体系分成多份,并分别在热循环仪上进行PCR反应,反应结束后合并部分或全部PCR产物进行后续处理。
在其中一个实施例中,在对所述文库RNA进行反转录,制备单链DNA探针时,包括向反应体系中加入氨基dNTP进行探针标记的步骤,得到的单链DNA探针标记有氨基。
在其中一个实施例中,在对制备的单链DNA探针进行荧光标记时,是使用荧光染料标记的N-羟基琥珀酰亚胺酯与氨基标记的单链DNA探针反应对所述单链DNA探针进行荧光标记。
一种HER2基因荧光原位杂交探针,采用上述任一实施例所述的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法制备得到。
一种HER2基因荧光原位杂交检测芯片或检测试剂盒,含有上述HER2基因荧光原位杂交探针。
上述HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法以及采用该制备方法制备得到的HER2基因荧光原位杂交探针,专门针对基因组非重复区设计,可以降低非特异反应,减少背景干扰;构建的探针是单链DNA,较之传统的BAC或PCR产物等双链探针,可以减少探针与自身的配对,增加杂交效率;并且构建的单链DNA探针片段小,可以更加快速的与靶向序列结合,减少杂交时间。
并且本发明创造性的提出通过使用乳液PCR进行单次扩增,扩增产物转录构建文库RNA,再由文库RNA反转录构建得到单链DNA探针,较之传统的直接由探针文库进行PCR扩增得到双链DNA探针,可以充分利用转录和反转录得到线性的单链DNA,在探针文库扩增过程中,不会存在非特异性的扩增,降低偏向性扩增,可以提高探针的均一性,进而有利于提高后续原位杂交的准确性。
此外,通过采用反转录掺入氨基-dNTP,然后偶联荧光染料,可以增加每个探针标记的荧光数目,进而有利于增加荧光原位杂交时荧光强度,提高检测结果的准确性和可靠性。
附图说明
图1为乳液PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳的检测结果;
图2为Nanodrop检测体外转录获得的RNA的结果;
图3为Nanodrop检测探针浓度的结果;
图4为对正常细胞的荧光原位杂交的镜检结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
一实施方式的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法,包括如下步骤:
步骤一:构建探针文库:选择包含HER2基因的人类基因组17号染色体上非重复的目标基因区域,每隔1-10bp构建一个与目标基因区域完全互补的长度为35nt-200nt的单链片段作为候选探针,通过BLAST比对,获得非特异杂交的Tm值,去除非特异Tm值对于45℃的候选探针,并选择非重叠的候选探针,在筛选得到的候选探针的两端分别加上扩增引物片段,得到目的探针文库。
本实施方式的目标基因区域为基因组的非重复区,通过对非重复区设计候选探针,可以降低非特异性反应,减少背景干扰。
针对不同的目标基因区域,间隔预设长度构建候选探针,如可以间隔1-10bp的长度来构建候选探针,可以避免探针之间相互干扰,有利于提高检测结果的准确性。
优选的,候选探针的长度优选在35-100nt之间,进一步优选在45nt左右,如在40-50nt之间。本实施方式构建的单链DNA探针片段小,可以更加快速的与靶向序列结合,减少杂交时间。
扩增引物片段可以是各种通用的扩增引物,如在一个具体的实施例中,扩增引物片段的序列如SEQ ID NO.1(5’-GGAGGCCGGAGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’)和SEQID NO.2(5’-CGTGGTCGCGTCTCA-3’)所示。
本实施方式所构建探针文库是使用芯片合成技术在基因芯片上合成目的探针文库。
步骤二:扩增所述目的探针文库。
具体的,本实施方式是使用乳液PCR扩增的方法扩增所述目的探针文库。并且在乳液PCR扩增时,将配制的PCR反应体系分成多份,并分别在热循环仪上进行PCR反应,反应结束后合并部分或全部PCR产物进行后续处理。PCR反应可以进行但不限于25-35个循环,可根据具体的探针的长度等情况而定。
步骤三:对扩增产物进行体外转录,制备与所述目的探针文库对应的文库RNA。
步骤四:对所述文库RNA进行反转录,制备单链DNA探针。
在本实施方式中,在对所述文库RNA进行反转录,制备单链DNA探针时,包括向反应体系中加入氨基(Amino)dNTP进行探针标记的步骤,得到的单链DNA探针标记有氨基。在一个具体的实施例中,是使用氨基dUTP(Amino-dUTP)进行探针标记,在其他实施例中,不限于使用氨基dUTP进行标记,也可以使用氨基dATP、氨基dCTP等进行标记。
通过使用乳液PCR进行单次扩增,扩增产物转录构建文库RNA,再由文库RNA反转录构建得到单链DNA探针,较之传统的直接由探针文库进行PCR扩增得到双链DNA探针,可以充分利用转录和反转录得到线性的单链DNA,在探针文库扩增过程中,不会存在非特异性的扩增,降低偏向性扩增,可以提高探针的均一性,进而有利于提高后续原位杂交的准确性。
步骤五:对制备的单链DNA探针进行荧光标记,即得。
对应的,在对制备的单链DNA探针进行荧光标记时,是使用荧光染料标记的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS ester)与氨基标记的单链DNA探针反应对所述单链DNA探针进行荧光标记。荧光染料可以是但不限于绿色荧光染料Alexa Fluor 488。
通过采用反转录掺入氨基-dNTP,然后偶联荧光染料,可以增加每个探针标记的荧光数目,进而有利于增加荧光原位杂交时荧光强度,提高检测结果的准确性和可靠性。
此外,本实施方式还提供了一种HER2基因荧光原位杂交探针,其采用上述任一实施例所述的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法制备得到,并进一步提供了一种HER2基因荧光原位杂交检测芯片或检测试剂盒,其含有上述HER2基因荧光原位杂交探针。
上述HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法以及采用该制备方法制备得到的HER2基因荧光原位杂交探针是单链DNA,较之传统的BAC或PCR产物等双链探针,可以减少探针与自身的配对,增加杂交效率;并且构建的单链DNA探针片段小,可以更加快速的与靶向序列结合,减少杂交时间。
以下通过一具体实施例对本发明的HER2基因荧光原位杂交探针及其构建方法作进一步详细的说明,可理解,本发明的HER2基因荧光原位杂交探针及其构建方法不限于下述具体的实施例。
1.设计与合成寡核苷酸探针文库
设计寡核苷酸探针文库:选择包含HER2基因的人类基因组17号染色体chr17:37758215-37988632的约230kb区域,该区域为HER2基因在癌细胞中重复的区域。每隔3bp设计一个与目标区域完全互补的长度45nt左右的候选探针。通过BLAST比对,获得非特异杂交的Tm值。通过打分去除非特异Tm值大于45℃的探针。选择非重叠的候选探针,共获得1630个合格探针序列,其在基因组上的位置如下表所示:
使用芯片合成探针文库,通过引物扩增获得。
引物序列如下:
Primer 1 | 5-’GGAGGCCGGAGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’ |
Primer 2 | 5-’CGTGGTCGCGTCTCA-3’ |
2.乳液PCR扩增探针文库
使用Micellulia DNA Emulsion&Purification试剂盒(EURX公司)进行乳液PCR扩增探针文库。
具体步骤如下:
1)建立乳液:
乳液成分1 | 220μl |
乳液成分2 | 20μl |
乳液成分3 | 60μl |
总体积 | 300μl |
震荡混匀,置于冰上待用。
2)在冰上建立PCR反应:
3)进行乳液反应:混合50μl水相和300μl油水混合物,充分混匀,分装到7个0.2mlPCR管中。在热循环仪上依据如下条件进行PCR反应。
4)纯化PCR产物:合并各PCR管中的乳液PCR产物,加入1ml丁醇,混匀。再加入400μlOrange-DX,混匀。离心两分钟。除去上层有机相,水相过柱子结合。经过洗液洗涤三次后,使用100μl洗提液洗提。使用Nanodrop定量PCR产物。
5)结果验证
如图1所示,PCR产物在2%凝胶上检测,可以在100bp处有特异性条带,说明乳液PCR扩增成功。
3.体外转录产生文库RNA
a)建立以下体外转录反应体系(MEGAscriptTMT7 Transcription Kit,ThermoFisher Scientific公司),进行体外转录产生RNA:
在PCR仪上37℃反应4小时。
b)使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒纯化RNA。
共获得42μg RNA用于下一步反应。
c)结果验证
取1μl RNA 10倍稀释,使用Nanodrop检测转录体外转录获得RNA,结果如图2所示。
4.使用SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis System(ThermoFisherScientific公司)进行反转录产生单链DNA探针。
a)在冰上准备以下反应:
混匀,置于PCR仪上进行65℃变性5分钟,迅速放置冰上。
b)准备以下反应混合液:
成分 | 体积(μl) |
10×RT buffer | 10 |
25mM MgCl<sub>2</sub> | 20 |
0.1M DTT | 10 |
SUPERaseOUT | 5 |
SuperScript III RT | 2.5 |
50℃反应2小时,补加入2.5μl SuperScript III RT,继续反应2小时。加入11μlExonuclease I buffer和2μl Exonuclease I,混悬5秒,离心5秒。37℃消化15分钟。加入12μl 0.5M EDTA,混匀。85℃5分钟灭活反转录酶。反应置于冰上。
c)消化RNA:加入4μl 5U/μl的RNaseH和4μl 10mg/ml的RNaseA,按照以下程序进行反应:
温度 | 时间 |
37℃ | 120min |
70℃ | 20min |
50℃ | 60min |
95℃ | 5min |
缓慢降低到50℃ | 0.1℃/sec |
50℃ | 60min |
4℃ | 保温 |
d)使用Zymo Quick-RNA Miniprep试剂盒纯化反应。
使用Nanodrop检测单链寡核苷酸探针,一次反应可以获得20μg。
5.探针标记荧光
a)50μl纯化后单链DNA加入5μl 3M NaAc,混匀,加入130μl 100%乙醇,混匀,置于-20℃过夜。
b)乙醇沉淀:4℃离心30min,去除上清,使用70%乙醇洗涤一次。
c)探针荧光偶联反应:干燥沉淀DNA,溶解在5μl水中。
试剂 | 用量 |
氨基标记的单链DNA(约20μg) | 5μl |
0.2M NaCO<sub>3</sub> | 3μl |
Alexa Fluor 488NHS ester | 2μl |
室温避光反应2小时。
d)加入40μl纯水,使用Zymo Quick-RNA Miniprep试剂盒纯化反应。
e)使用Nanodrop检测探针浓度和荧光,结果见图3。获得探针浓度为170ng/μl,AlexaFluor488为57.4pmol/μl。平均每个探针标记5-6个荧光。分装备用。
6.荧光原位杂交
使用荧光标记的HER2探针进行荧光原位杂交检测HER2基因。具体步骤如下:1)将细胞或组织固定在玻片上,进行预处理;2)将含有探针的杂交液加入玻片,进行变性和杂交;3)进行充分洗涤,除去背景;4)进行复染并封片,镜检。
以上方案的步骤1)对待检样品玻片预处理根据情况有一定的差异,这里使用细胞样品为例进行,具体如下:细胞经过3:1的甲醇/冰醋酸固定30分钟或者-20℃过夜,离心去上清;使用固定液重悬细胞已获得合适细胞密度;取一滴细胞悬液滴于玻片,气干;在65℃老化玻片2分钟;用2×SSC于室温洗2min,依次放入70%,90%,100%的酒精中脱水各2min,室温晾干玻片;将玻片放入水浴加热至37℃的胃蛋白酶溶液(0.25%)中处理5min,立即取出玻片,在室温条件下,依次将玻片放入2×SSC、70%、90%、100酒精中各处理2分钟,气干玻片。
步骤2)具体如下:滴加12μl含探针的杂交液到玻片上,盖玻片封片;在67℃变性8分钟,注意避光;在42℃杂交2小时。
步骤3)具体如下:除去盖玻片。避光置于37℃预热洗涤缓冲液(2×SSC,0.1%NP40)洗涤15分钟;避光置于常温2×SSC洗涤15分钟;重复常温洗涤一次;在0.2×SSC中快速洗涤一次;空气干燥。
步骤4)具体如下:滴加15μl含DAPI复染液,加盖玻片,使用指甲油封片。镜检。
对正常细胞的镜检结果可见95%以上的细胞有两个清晰的杂交信号,见图4。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州简册生物技术有限公司
<120> HER2基因荧光原位杂交探针及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaggccgga gaattgtaat acgactcact atagggaga 39
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtggtcgcg tctca 15
Claims (10)
1.一种HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
构建探针文库:选择包含HER2基因的人类基因组17号染色体上非重复的目标基因区域,每隔1-10bp构建一个与目标基因区域完全互补的长度为35nt-200nt的单链片段作为候选探针,通过BLAST比对,获得非特异杂交的Tm值,去除非特异Tm值对于45℃的候选探针,并选择非重叠的候选探针,在筛选得到的候选探针的两端分别加上扩增引物片段,得到目的探针文库;
扩增所述目的探针文库;
对扩增产物进行体外转录,制备与所述目的探针文库对应的文库RNA;
对所述文库RNA进行反转录,制备单链DNA探针;
对制备的单链DNA探针进行荧光标记,即得。
2.如权利要求1所述的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法,其特征在于,所述候选探针的长度为40-50nt。
3.如权利要求1所述的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法,其特征在于,所述扩增引物片段的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法,其特征在于,所述构建探针文库是使用芯片合成技术在基因芯片上合成所述目的探针文库。
5.如权利要求1~4中任一项所述的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法,其特征在于,使用乳液PCR扩增的方法扩增所述目的探针文库。
6.如权利要求5所述的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法,其特征在于,在乳液PCR扩增时,将配制的PCR反应体系分成多份,并分别在热循环仪上进行PCR反应,反应结束后合并部分或全部PCR产物进行后续处理。
7.如权利要求1~4中任一项所述的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法,其特征在于,在对所述文库RNA进行反转录,制备单链DNA探针时,包括向反应体系中加入氨基dNTP进行探针标记的步骤,得到的单链DNA探针标记有氨基。
8.如权利要求7所述的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法,其特征在于,在对制备的单链DNA探针进行荧光标记时,是使用荧光染料标记的N-羟基琥珀酰亚胺酯与氨基标记的单链DNA探针反应对所述单链DNA探针进行荧光标记。
9.一种HER2基因荧光原位杂交探针,其特征在于,采用如权利要求1~8中任一项所述的HER2基因荧光原位杂交探针的制备方法制备得到。
10.一种HER2基因荧光原位杂交检测芯片或检测试剂盒,其特征在于,含有如权利要求9所述的HER2基因荧光原位杂交探针。
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