TW202328456A - 染色體著絲粒探針 - Google Patents

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趙榮淞
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大陸商廣州康立明生物科技股份有限公司
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Abstract

本發明屬於分子生物學領域，具體涉及一種人染色體著絲粒探針及其應用。本發明的探針模板序列或探針序列長度僅為40-90nt，具有單一染色體的特異性，雜交時間短，信號強度高；同時本發明的探針是寡核苷酸探針，較常規探針短，適用於體外直接合成，製備成本較低。

Description

染色體著絲粒探針
本發明屬於分子生物學領域，具體涉及一種人染色體著絲粒探針。
染色體異常與許多疾病的發生有密切聯繫。在許多情況下，染色體拷貝數也是一些疾病染色體異常與許多疾病的發生有密切聯繫。在許多情況下，染色體拷貝數也是一些疾病非手術治療患者的良好預後指標。非手術治療患者的良好預後指標。
如17號染色體多體是乳腺癌常見的遺傳畸變，是增加HER2拷貝數的另一種機制。螢光原位雜交法（FISH）是檢測HER2基因狀態的金標準，通過分析HER2基因與17號染色體著絲粒（CEP17）的信號數及HER2/CEP17比值來進行結果判讀。研究證實，明顯的“多倍體”（CEP17增加）通常與局灶性中心點增加有關，而不是真正的多倍體，當HER2基因與CEP17共擴增時，確定HER2狀態也可能是複雜的，因此準確判斷17號染色體的拷貝數非常關鍵。HER2狀態的準確評估，對臨床指導單克隆抗體靶向用藥，如Herceptin®（赫賽汀，曲妥珠單抗），從而降低復發和死亡風險至關重要。另外，HER2/CEP17比值＞2也是胃癌HER2基因擴增的標誌，對患者預後和治療的具有重要臨床價值。染色體拷貝數不穩定（CIN）是一種對細胞生物學產生多重效應的基因組不穩定性，是細胞群體遺傳異質性的來源。CIN導致染色體拷貝數的細胞間變異，螢光原位雜交（FISH）可以檢測和定量。極端CIN-17在四分之一以上的胃食管腺癌中被檢出，是非手術治療患者良好的預後指標。
已經公開了確定8p21-22基因座的丟失、8號染色體的增加和c-myc拷貝數相對於著絲粒拷貝數的額外增加是一種預測前列腺癌的方法（美國專利號6,613,510）。
有報導表明，12號染色體三體和不典型的形態學及免疫表型特徵之間有明顯的相關性，還與淋巴細胞增殖活性高、分期級別高及預後有關係。12號染色體三體是慢性淋巴細胞白血病中常見的染色體異常現象，12號染色體三體的慢性淋巴細胞白血病具有臨床及生物學上的特殊性，如早期出現淋巴結及器官的浸潤，並可轉化為幼稚淋巴細胞白血病或其它侵襲性淋巴瘤（Richter’s綜合症），研究認為存在12號染色體三體的患者預後普遍較差。
X染色體是人類的性染色體，X性染色體的數目異常會使人產生性染色體病，性染色體病會使人性腺發育不全或兩性畸形。如Klinefelter綜合症、多X綜合症、Turner綜合症等等。
螢光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。目前這項技術已經廣泛應用於動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領域。FISH的基本原理是用已知的標記核酸為探針，按照鹼基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由於DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而探針可以直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統的放射性標記原位雜交相比，螢光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點，因此在分子細胞遺傳學領域受到普遍關注。
雜交所用的探針大致可以分類三類：1）染色體特異重複序列探針，例如α衛星、衛星III類的探針，其雜交靶位常大於1Mb，不含散在重複序列，與靶位結合緊密，雜交信號強，易於檢測；2）全染色體或染色體區域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針，由一個或幾個克隆序列組成。
傳統的染色體著絲粒探針一般是標記包含重複序列的α衛星DNA，通常為幾百個鹼基，由於序列特異性較低，實際雜交中容易出現非特異性信號，背景高，導致雜交效果較差，嚴重的甚至影響判讀。近年來，隨著合成生物學的發展，寡核苷酸探針已經廣泛用於螢光原位雜交，其一般採用數量較多的幾十個鹼基大小的非重複序列來標記特定位點。但染色體著絲粒含大量重複序列，不適用於製備去重複序列的較短的寡核苷酸探針。
一方面，本發明提供了一種用於螢光原位雜交檢測人染色體著絲粒的探針，所述探針序列長度為40-90nt，所述探針序列對應於目標染色體著絲粒區域的拷貝數≥200。
在一些實施方案中，所述探針經FISH驗證未出現非特異性信號。
在一些實施方案中，所述目標染色體的靶區域為目標染色體的序列區域或目標染色體的著絲粒區域。
在一些實施方案中，所述探針序列對應於非靶區域的匹配數≤10；在一些實施方案中，所述的非靶區域的匹配數是BLAT中的查詢匹配數；在一些實施方案中，所述探針的靶區域匹配分值≥10000；在一些實施方案中，所述的探針為檢測染色體著絲粒拷貝數的探針；在一些實施方案中，所述的探針為DNA探針和/或RNA探針；在一些實施方案中，所述探針序列對應於目標染色體著絲粒區域的拷貝數為200-6000；優選為200-5000。
一方面，本發明提供了一種染色體著絲粒探針組，包括一條或多條所述的染色體著絲粒探針，各條探針間TM值差異≤10℃，各條探針序列長度相差≤10nt；在一些實施方案中，所述的探針為DNA探針和/或RNA探針。
一方面，本發明提供了一種用於檢測17號染色體著絲粒的探針，包含如SEQ ID NO：16所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt。
如本文所用，DNA探針的序列“對應的RNA序列”，是指與DNA序列相同，而將脫氧核糖核苷酸替換成相應的核糖核苷酸而得到的RNA序列；在鹼基層面上，A、G、C保持與DNA一致，在RNA序列中，鹼基T替換成U。包含本發明序列表所示的DNA序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列的探針，均在本發明的保護範圍中。
在一些實施方案中，所述探針的序列如SEQ ID NO：1-23任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
一方面，本發明提供了一種人7號染色體著絲粒探針，包含如SEQ ID NO：24-29任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt；在一些實施方案中，所述探針的序列如SEQ ID NO：24-29任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
一方面，本發明提供了一種人10號染色體著絲粒探針，包含如SEQ ID NO：30-40任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt；在一些實施方案中，所述探針的序列如SEQ ID NO：30-40任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
一方面，本發明提供了一種人18號染色體著絲粒探針，包含如SEQ ID NO：41-46任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt；在一些實施方案中，所述探針的序列如SEQ ID NO：41-46任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
一方面，本發明提供了一種人X染色體著絲粒探針，包含如SEQ ID NO：47-59任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt；在一些實施方案中，所述探針的序列如SEQ ID NO：47-59任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
一方面，本發明提供了一種人6號染色體著絲粒探針，包含如SEQ ID NO：60-64任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt；在一些實施方案中，所述探針的序列如SEQ ID NO：60-64任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
一方面，本發明提供了一種人8號染色體著絲粒探針，包含如SEQ ID NO：65-74任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt；在一些實施方案中，所述探針的序列如SEQ ID NO：65-74任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
一方面，本發明提供了一種人11號染色體著絲粒探針，包含如SEQ ID NO：75-78任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt；在一些實施方案中，所述探針的序列如SEQ ID NO：75-78任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
一方面，本發明提供了一種人12號染色體著絲粒探針，包含如SEQ ID NO：79-85任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt；在一些實施方案中，所述探針的序列如SEQ ID NO：79-85任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
一方面，本發明提供了一種人16號染色體著絲粒探針，包含如SEQ ID NO：86-87任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt；在一些實施方案中，所述探針的序列如SEQ ID NO：86-87任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
在一些實施方案中，所述探針的長度為45-85 nt；在一些實施方案中，所述探針的長度為45-80nt；在一些實施方案中，所述探針的長度為45-75 nt；在一些實施方案中，所述探針的長度為48-55 nt；優選地，所述探針的長度為50-55 nt。
一方面，本發明提供了一種篩選檢測人染色體著絲粒探針模板序列或探針序列的方法，包括以下步驟：
S1.獲取多條初始備選序列組成初始序列庫：
從目標染色體的α衛星序列中，獲取多條長度為40-90nt的序列片段，成為初始備選序列庫；
S2.獲取中期備選序列：
對步驟S1獲得的多條初始備選序列在人類基因組資料庫中進行查詢比對；在對某條初始備選序列進行查詢比對時，以該初始備選序列為查詢基準序列，獲得該查詢基準序列在人類基因組資料庫中的匹配對象，確定匹配對象分佈在靶區域的匹配數A及分佈在非靶區域的匹配數B，當B和A的相對量小於等於預設比例時，其對應的初始備選序列被確定為中期備選序列；
S3.獲取一條或多條探針模板序列或探針序列：對中期備選序列進行參數篩選，所述參數符合預設條件的，其對應的中期備選序列被確定為探針模板序列或探針序列。
在一些實施方案中，所述步驟S1，是從目標染色體的α衛星序列中，通過1~10nt/位移的方式進行截取，獲得至少一條長度為40-90nt的序列片段；優選通過1~5nt/位移的方式進行截取；更優選通過1nt/位移的方式進行截取。
在一些實施方案中，設定序列片段長度為45-85 nt；在一些實施方案中，設定序列片段長度為45-80nt；在一些實施方案中，設定序列片段長度為45-75 nt；在一些實施方案中，設定序列片段長度為48-55 nt；在一些實施方案中，設定序列片段長度為50-55 nt。
在一些實施方案中，對於所獲取的序列片段完全相同的，只保留一條。
在一些實施方案中，所述步驟S2中，匹配對象的匹配條件是：與查詢基準序列的一致性I或相似性S大於等於預設的一致性閾值It或相似性閾值St。
在一些實施方案中，所述步驟S2中的所述一致性或相似性的預設的一致性閾值It或相似性閾值St的選取範圍為70%~95%。
在一些實施方案中，當以BLAT為工具查詢匹配對象時，所述的一致性的閾值It為70%；並且在一些實施方案中，SCORE≥20。
在一些實施方案中，步驟S2所述靶區域為目標染色體的序列區域。
在一些實施方案中，所述靶區域為目標染色體的著絲粒區域；在一些實施方案中，所述非靶區域為除了所述靶區域外的其他區域；在一些實施方案中，所述非靶區域包括非目標染色體的序列區域；在一些實施方案中，所述非靶區域還包括目標染色體的非著絲粒序列區域。
在一些實施方案中，所述B和A的相對量的預設比例為7:8；優選3:4；更優選5:8；還更優選1:2。
在一些實施方案中，所述匹配數A、B滿足A≥16且B≤14；在一些實施方案中，A≥16且B≤12；在一些實施方案中，A≥16且B≤10；在一些實施方案中，A≥16且B≤8；在一些實施方案中，A≥16且B≤6；在一些實施方案中，A≥16且B≤4。
作為一種優選的實施方式，可以使用Blat工具進行B和A的相對量的獲取。此時的運算效率更高。
在一些實施方案中，以BLAT工具進行查詢時，所述匹配數為匹配結果數matches。
在一些實施方案中，所述的步驟S3中，所述參數選自中期備選序列在靶區域的拷貝數；當所述拷貝數大於等於預設拷貝數的，其對應的中期備選序列被確定為探針模板序列或探針序列；
在一些實施方案中，所述的預設拷貝數為200~4000；優選為200~1000；在一些實施方案中，所述步驟S3中的參數篩選，還包括以下參數中的一種或多種：TM值、靶區域的匹配分值、序列長度、非靶匹配數；在一些實施方案中，在對中期備選序列進行參數篩選前，還包括將多條中期備選序列進行聚類分析的步驟。
在後續的FISH實驗驗證中，發明人發現，參數選取拷貝數200或以上，是較為優選作為優先考慮的因素。同一區域的常規的螢光信號分子在達到200或以上，在常規螢光顯微鏡下FISH信號能更好地顯現。
在一些實施方案中，所述步驟S3的步驟包括：
對中期備選序列進行聚類分析，將序列間有連續20個或以上鹼基相同的中期備選序列歸為一組；獲取各條中期備選序列的參數，所述參數為靶區域的拷貝數；將獲取的各條中期備選序列的參數進行分析，按照靶區域的拷貝數高的原則從聚類分析得到的每組中期備選序列中選出各1條序列；並且，所述的從每組中期備選序列中所選出的各1條序列，符合靶區域的拷貝數≥200的條件。
在一些實施方案中，所述參數還包括以下的一種或多種：TM值、靶區域的匹配分值、序列長度、非靶匹配數；當在每組中期備選序列中作選取時，以如下原則作選取：TM值越高，和/或靶區域的匹配分值越高，和/或非靶匹配數越小，則優先選取。
在一些實施方案中，所述靶區域的匹配分值≥10000；在一些實施方案中，當聚類得到的組超過一組時，不同組選出的各條序列間TM值差異≤10℃，不同組選出的各條序列長度相差≤10nt；在一些實施方案中，當以BLAST工具獲取匹配分值時，所述匹配分值為Total Score值。
一方面，本發明提供了一種驗證/確定所述的方法所獲得的探針模板序列或探針序列的方法，將所述的方法所獲得的探針模板序列或探針序列進行驗證。
在一些實施方案中，所述的驗證方法為FISH。
在一些實施方案中，在驗證前對所述探針模板序列或探針序列進行螢光標記；在一些實施方案中，在探針序列的5’端、3’端或中間的任意鹼基標記1個或多個螢光基團；在一些實施方案中，所述螢光基團選自Alexa Fluor，德克薩斯紅（TexasRed），香豆素，螢光素(FITC)，四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC），羧基四甲基羅丹明（TAMRA），Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy 7，PlatinumBright，Pacific Green，Oregon Green，Pacific Blue，Pacific Orange，6-羧基螢光素（6-FAM），2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基螢光素（JOE），四氯-6-羧基螢光素（TET），六氯-6-甲基螢光素（HEX），羧基-X-羅丹明（ROX）和ATTO系列螢光基團中的至少一種。
一方面，本發明提供了一種設計探針的方法，包括以下步驟：
1）如所述的方法獲得一條或多條探針模板序列或探針序列；
2）如所述的方法驗證步驟1）獲得的一條或多條探針模板序列或探針序列或它們的互補序列。
一方面，本發明提供了一種合成探針的方法，包括以下步驟：
1）如所述的方法獲得一條或多條探針模板序列或探針序列；
2）如所述的方法驗證步驟1）獲得的一條或多條探針模板序列或探針序列；
3）根據步驟2）獲得的驗證後的一條或多條探針模板序列或探針序列或它們的互補序列，進行合成。
一方面，本發明提供了一種篩選人染色體著絲粒探針模板序列或探針序列的方法，包括以下步驟：
向序列比對服務器發送多條序列查詢請求，各所述序列查詢請求分別攜帶有一條初始備選序列，所述初始備選序列為從目標染色體的α衛星序列中獲取的長度為40-90nt的序列片段；
獲取所述序列比對服務器返回的各所述初始備選序列對應的各匹配對象；
獲取各所述匹配對象的第一匹配數和第二匹配數，所述第一匹配數為對應的匹配對象分佈在靶區域的匹配數，所述第二匹配數為對應的匹配對象分佈在非靶區域的匹配數；
當任意一所述匹配對象的所述第二匹配數和所述第一匹配數的相對量小於預設比例時，將所述任意一所述匹配對象對應的初始備選序列被確定為中期備選序列；
對各所述中期備選序列進行參數篩選，將參數符合預設條件的中期備選序列確定為探針模板序列或探針序列。
一方面，本發明提供了一種篩選人染色體著絲粒探針模板序列或探針序列的裝置，所述裝置包括：
請求發送模組，用於向序列比對服務器發送多條序列查詢請求，各所述序列查詢請求分別攜帶有一條初始備選序列，所述初始備選序列為從目標染色體的α衛星序列中獲取的長度為40-90nt的序列片段；
對象獲取模組，用於獲取所述序列比對服務器返回的各所述初始備選序列對應的各匹配對象；
匹配數獲取模組，用於獲取各所述匹配對象的第一匹配數和第二匹配數，所述第一匹配數為對應的匹配對象在靶區域的匹配數，所述第二匹配數為對應的匹配對象在非靶區域的匹配數；
序列篩選模組，用於當任意一所述匹配對象的所述第二匹配數和所述第一匹配數的相對量小於預設比例時，將所述任意一所述匹配對象對應的初始備選序列被確定為中期備選序列；
探針獲取模組，用於對各所述中期備選序列進行參數篩選，將參數符合預設條件的中期備選序列確定為探針模板序列或探針序列。
一方面，本發明提供了一種由如所述的方法獲得的探針。
一方面，本發明提供了一種染色體著絲粒探針，所述探針的長度為40-90nt，所述探針的序列對應於目標染色體靶區域的拷貝數≥200；在一些實施方案中，所述探針的序列對應於目標染色體著絲粒靶區域的拷貝數≥200；在一些實施方案中，所述探針的靶區域匹配分值≥10000。
一方面，本發明提供了一種染色體著絲粒探針組，包括一條或多條所述的染色體著絲粒探針，各條探針間TM值差異≤10℃，各條探針序列長度相差≤10nt。
在一些實施方案中，所述目標染色體選自1-22號，X，和Y染色體中的一條或多條；在一些實施方案中，所述目標染色體選自6、7、8、10、11、12、16、17、18、X染色體中的一條或多條。
在一些實施方案中，本發明提供了所述的探針或所述的方法篩選的序列在檢測染色體拷貝數異常疾病中的應用；在一些實施方案中，所述疾病包括21三體綜合症、13三體綜合症、18三體綜合症、Klinefelter綜合症、Turner綜合症、骨髓增生異常綜合症、慢性淋巴細胞白血病、急性髓系白血病、獲得性囊性腎病、腎乳頭狀癌、髓母細胞瘤中的至少一種。
在一些實施方案中，本發明提供了一種受試者疾病的檢測方法，包括：進行該受試者的檢測樣品的染色體拷貝數檢測，該樣品的染色體拷貝數檢測是以所述的探針或所述的方法所獲得的探針模板序列或探針序列進行檢測；以及根據該染色體拷貝數檢測所得的該受試者的該樣品的染色體拷貝數，與正常對照樣品的染色體拷貝數偏離，可選地相比的偏高或偏低，指示該受試者患有或有風險患有該疾病。
在一些實施方案中，本發明提供了所述的方法篩選的序列，作為對照探針，可以與疾病基因的特異（LSI）FISH探針一同使用。包括CEP17/HER2基因檢測探針可特異檢測位於17號染色體的HER2基因的異常擴增，CEP7/c-MET基因檢測探針可特異檢測位於7號染色體的c-MET基因的異常擴增，CEP7/EGFR基因檢測探針可特異檢測位於7號染色體的EGFR基因的異常擴增，CEP17/P53可特異檢測位於17號染色體的P53基因的缺失或擴增。
在一些實施方案中，本發明提供了所述的方法篩選的序列在CRISPR/TALEN基因組編輯實驗中鑒定目的染色體的拷貝數中的應用。
“染色體”：是真核細胞在有絲分裂或減數分裂時DNA存在的特定形式，由染色質絲螺旋纏繞，逐漸縮短變粗形成。
“著絲粒”：是指中期染色體的兩條姐妹染色單體的連接處，位於染色體的主縊痕處，著絲粒將兩條染色單體分為短臂(p)和長臂(q)，由高度重複的異染色質組成，其主要成分為DNA和蛋白質。
“α衛星序列”：是一種包括人在內的靈長類每條染色體著絲粒區的串聯重複序列，並存在著等級結構，其最小重複單位是171bp，它既有染色體特異性，又具有染色體間的同源性。不同染色體著絲粒的α衛星DNA序列存在差別，構成了一個家族。
“螢光探針”：即核酸探針，是一段帶有螢光標記，且順序已知的，與目的序列互補的核酸序列(DNA或RNA)，通過分子雜交與目的基因結合，產生雜交信號，能從基因組中把目的序列顯示出來。根據雜交原理，作為探針的核酸序列至少必須具備以下兩個條件：①應是單鏈，若為雙鏈，必須先行變性處理。②應帶有容易被檢測的螢光標記。
“螢光原位雜交”：Fluorescence in situ hybridization，簡稱FISH，是將直接或間接標記的核酸探針與待測樣本中的核酸序列按照鹼基互補配對的原則進行雜交，經洗滌後直接在螢光顯微鏡下觀察，對特定基因或核酸序列進行定位、定性、或定量的技術。
“TM值”：melting temperature，是指吸光值增加到最大值的一半時的溫度，是一段序列的解鏈溫度或熔點。
“一致性（identity）”是具體比對序列的簡單一致程度，不考慮比對序列的起源和功能。
“相似度（similarity）”：比較的序列間含相同或相似鹼基的數量及比例；是比對序列功能或特點的趨同程度，不考慮序列的具體起源。
在一些情況下，“相似度”的程度可以由“一致性”進行體現和判斷。
在一些實施方案中，本發明涉及的術語包括以下定義：
“初始備選序列”：從目標染色體的α衛星序列中，通過1~10nt/位移的方式按特定序列長度進行截取的去除完全相同的序列。
“查詢基準序列”：在進行基因組序列相似性比較分析時，輸入的原始序列。
“匹配對象”：查詢基準序列通過基因組序列相似性比較分析（例如BLAT）得到的與基準序列相似度高的匹配對象；
“中期備選序列”：對初始備選序列進一步篩選得到的滿足非靶匹配數低於一定值或比例的序列。
“靶匹配數”：查詢基準序列在進行基因組序列相似性比較分析（例如BLAT）中目標染色體著絲粒序列區域的匹配對象數（在BLAT中為匹配結果數matches或hits）。
“非靶匹配數”：查詢基準序列在進行基因組序列相似性比較分析（例如BLAT）中非目標染色體的序列區域和/或目標染色體的非著絲粒序列區域的匹配對象數（在BLAT中為匹配結果數matches或hits）。
“拷貝數”：即重複次數，指序列在基因組中的重複次數，對應為查詢基準序列在靶區域的匹配數；在一些實施例中，具體是指序列在BLAST工具查詢得到的在靶區域的Number of Matches參數值。 “匹配分值”：當用BLAST進行查詢時，是該備選序列在BLAST工具查詢得到的在靶區域的Total Score值。 “序列長度”：是指該備選序列的鹼基數。
“聚類分析”：即多序列比對，通過多個類似長度的生物序列的比對，分析不同的序列間的相似程度或一致性；常用軟件有Clustal Omega、EMBOSS Cons、Kalign、MAFFT、MUSCLE、MView、T-Coffee、WebPRANK等。
“中期FISH”：是在秋水仙鹼處理後，染色體停滯在細胞分裂中期的細胞上進行的螢光原位雜交。
“間期FISH”：是在處於細胞分裂間期的細胞上進行的螢光原位雜交。鏡下觀察，對特定基因或核酸序列進行定位、定性、或定量的技術。
α-衛星DNA（alpha satellite DNA）是唯一一個存在於所有人類染色體著絲粒區域的著絲粒DNA（centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的單體為單位組成的高度串聯重複片段，重複數百次至數千次，跨越長達100kb的著絲粒DNA區域，其中大部分序列高度保守，但是在每條染色體上，其保守序列仍具有一定的差異性（Willard HF，Chromosome-specific organization of human alpha satellite DNA.Am J Hum Genet.1985，37（3）：524-532）。
“染色體計數探針（CEP）”或“著絲粒探針”是使得細胞中特定染色體的數目被計數的任何探針。染色體計數探針通常識別並結合特定染色體的著絲粒附近（稱為“著絲粒周圍”）或著絲粒處的區域，通常是重複DNA序列（例如，α衛星DNA）。染色體的著絲粒通常被認為代表該染色體，因為著絲粒是細胞分裂過程中可靠分離（faithful segregation）所需的。可以通過比較對應于特定基因座的信號數（拷貝數）與對應於著絲粒的信號數，而將特定染色體區域的缺失或擴增，與其通常存在於其內的整個染色體（異倍體）的丟失或增加相區別。一種用於進行這種比較的方法是將代表基因座的信號數除以代表著絲粒的信號數。小於一的比率表明該基因座的相對丟失或缺失，而大於一的比率表明該基因座的相對增加或擴增。類似地，比較可以在相同染色體上的兩個不同基因座、例如染色體的兩個不同臂上進行，以表明染色體內的不平衡增加或丟失。代替染色體的著絲粒探針，本領域技術人員將認識到染色體臂探針可以替代地用於接近于全染色體缺失或增加。然而，此類探針在計數染色體時是不準確的，因為對於此類探針的信號損失並不總是表明整個染色體的丟失。
如本文所使用的術語“和/或”是指並且涵蓋一個或多個相關聯的所列項目的任何和所有可能的組合。當在兩個或多個項目的清單中使用時，術語“和/或”表示所列出的項目中的任何一個可以單獨使用，或者可以使用兩個或多個所列出的項目的任何組合。例如，如果組合物，組合，構造等被描述為包括（或包含）組分A，B，C和/或D，則該組合物可以單獨包含A；單獨包含B；單獨包含C；單獨包含D；包含A和B的組合；包含A和C的組合；包含A和D的組合；包含B和C的組合；包含B和D的組合；包含C和D的組合；包含A，B和C的組合；包含A，B和D組合；包含A，C和D的組合；包含B，C和D組合；或A，B，C和D組合使用。
以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案，具體實施例不代表對本發明保護範圍的限制。其他人根據本發明理念所做出的一些非本質的修改和調整仍屬於本發明的保護範圍。
如本文所用，術語“包括”、“具有”、“含有”和“包含”以及其它類似形式及其語法等效物旨在在含義上等效並且是開放式的，因為這些詞語中的任一個之後的一個或多個項並不意味著是這一個或多個項的詳盡列表，或者意味著僅限於所列出的一個或多個項。例如，“包括”組分A、B、和C的物可以由組分A、B、和C組成（即，僅含有組分A、B、和C），或者可以不僅含有組分A、B和C，而且可以包括一種或多種其它組分。因此，意圖並理解的是，“包括”及其類似形式及其語法等同形式包含“基本上由……組成”或“由……組成”的實施例的公開。
在提供值的範圍的情況下，應理解，除非上下文另外明確規定，否則在所述範圍的上限與下限之間的到下限的單位的十分之一的每一中間值和在所述範圍中的任何其它陳述的或中間值包含在本發明內，但受所述範圍中的任何特定排除的限制。在所述範圍包含一個或兩個限值的情況下，排除那些所包含的限值中的任一個或兩個的範圍也包含在本發明中。
本文提及的“約”值或參數包含（和描述）涉及該值或參數本身的變化。例如，提及“約X”的描述包含“X”的描述。
如本文所用，包含在所附權利要求中，單數形式“一”、“或”、和“所述”包含複數指代物，除非上下文另外清楚地指明。
術語“第一”、“第二”、“第三”僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性。
實施例 1  17 號染色體著絲粒探針的設計
1）將人類基因組17號染色體所有α衛星序列，逐個鹼基位移（1nt/位移）分割成50或51nt長度的序列，完全相同序列只保留一個，組成初始備選序列庫。
2）運用UCSC網站的BLAT工具對這些序列進行批量查詢，得到符合“SCORE≥20且IDENTITY≥70%”條件的匹配對象，進一步篩選這些匹配對象在17號染色體著絲粒區域（靶區域）的匹配對象數（靶匹配數）≥16且非靶匹配數≤12（非靶區域為非17號染色體著絲粒區域之外的其它區域）的初始備選序列，作為17號染色體中期備選序列庫；
3）對17號染色體中期備選序列庫進行綜合參數篩選：首先獲取中期備選序列參數資訊，得到包括TM值、拷貝數、序列長度、匹配分值、非靶匹配數等參數，選擇拷貝數大於等於200的序列，再對所有中期備選序列進行聚類分析，按照“序列間有連續20個或以上鹼基相同”的條件歸為一組；按照拷貝數越高，非靶匹配數越小，TM值越高，匹配分值越高的排序從每組序列中選擇一條序列；得到多條相對獨特的待驗證的序列組合，其綜合參數如表1，序列如表2所示。
表 1  17 號染色體待驗證序列的綜合參數
序列編號 長度/nt 拷貝數 非靶匹配數 靶匹配數 匹配分值 TM值/℃
Chr17-01 51 1301 1 18 117208 66.20
Chr17-02 51 830 11 16 78243 68.50
Chr17-03 50 1179 2 17 104253 67.90
Chr17-04 50 333 6 18 29473 68.30
Chr17-05 50 215 2 16 19905 68.30
Chr17-06 50 1316 6 16 114910 69.60
Chr17-07 50 1461 2 18 127628 69.40
Chr17-08 50 1208 5 18 105626 68.00
Chr17-09 50 1646 7 17 125907 69.00
Chr17-10 50 1034 0 18 87195 66.60
表 2  17 號染色體待驗證序列
序列編號 序列名稱 序列（5' → 3'）
SEQ ID NO: 1 Chr17-01 TTCATAGAGTAGTTCTGAAACATGCTTTTCGTAGTGTCTACAAGTGGACAT
SEQ ID NO: 2 Chr17-02 ACAGAAGCATTCACAGAAAACTCTTGGTGACGACTGAGTTTAACTCACAGA
SEQ ID NO:3 Chr17-03 GTTTGCATTCAAATCCCCGAGTTGAACTTTCCTTTCAAAGTTCACGTTTG
SEQ ID NO:4 Chr17-04 AGTTGAAGGTTCCTTTTCAAAGAGCAGTTTCCAATCACTCTTTGTGTGGA
SEQ ID NO:5 Chr17-05 AAACTGCAAGGGGATAATTGCACTCTTTGAGGAGTACCGTAGTAAAGGAA
SEQ ID NO:6 Chr17-06 GCTGAGCATTCCTTGCGATGTAGCAGTTTAGAAACACACTTTCTGCAGAA
SEQ ID NO:7 Chr17-07 CGTTGGAAACGGGATAACTGCACCTAACTAAACGGAAGCATTCTCACAAA
SEQ ID NO:8 Chr17-08 GTGGTGGAAAACGAATTATGGTCACATAAAAACTGGAGAGAGCCTTCTCA
SEQ ID NO:9 Chr17-09 GGATAAACCGCACAGAACTAAACAGAAGAATTCTCAGAGCCCTCTTCGTG
SEQ ID NO:10 Chr17-10 TCATTGCACTTCTTTGAGGCCTACCGTAGTAAAGGAGATAACTTCCTATA
實施例 2 用於 FISH 驗證探針特異性的細胞玻片樣本製備
以MDA-MB-231細胞玻片樣本的製備為例，本發明涉及其它細胞系的細胞滴片的製備方法與之基本一致。
1）當培養的MDA-MB-231細胞貼壁生長面積達80%～90%時，若是製備中期細胞玻片，則往T75培養瓶中分別加入50µL 10mg/mL秋水醯胺（Thermofisher，貨號: 15212012）溶液，輕輕混勻，37℃繼續培養2～4小時；若是製備間期細胞玻片則直接開始下一步；
2）棄去上清，分別加入5mL 1xPBS潤洗瓶底，吸去PBS，加入2mL 0.25%Trypsin-EDTA溶液（Thermofisher，貨號: 25200056），37℃孵育3～5min直至貼壁細胞脫落，加入5mL含10%FBS的RPMI-1640培養基（Thermofisher，貨號: 61870036），吹洗瓶底，將細胞懸液分別轉移到一個15mL離心管中，1000rpm離心4min，棄去上清，得到細胞沉澱；
3）往收穫的細胞沉澱中，加入8ml 37℃預熱的0.075M KCl低滲液，充分混勻，在37℃水浴箱中孵育15分鐘；
4）加入2ml新鮮的固定液（甲醇:冰乙酸=3:1）充分混勻，以1800rpm，離心5min；
5）棄上清，加入8～10ml固定液重懸細胞，1800rpm，離心5min，重複固定2次；
6）棄去上清液，加入適量的固定液重懸細胞，將細胞懸液均勻的滴落在乾淨的載玻片上，放入60℃烤箱中烘烤1小時；
7）將玻片浸入2xSSC中，洗滌2次各3min，再依次用70%、85%、100%乙醇各洗滌2min，風乾玻片，-20℃保存或進行下一步雜交實驗。
實施例 3  17 號染色體待驗證序列的探針特異性驗證
1）將實施例1中的所有待驗證的序列分別進行寡核苷酸合成並在5’端和3’端修飾標記Alexa Fluor 488螢光基團（綠色）或Texas Red螢光基團（紅色）得到螢光探針，將每條探針稀釋到2μM濃度，與雜交緩衝液（10%甲醯胺、20%硫酸葡聚糖、0.3M氯化鈉、0.03M檸檬酸鈉）以1:9比例混合用於FISH；
2）對實施例1所獲得的探針分別進行FISH性能驗證，取實施例2中的細胞玻片樣本，遵照常規方法優化探針濃度、雜交緩衝液組分、雜交溫度、洗滌溫度和雜交時間等實驗條件，分析每條候選探針雜交結果，篩選在85℃變性5min，42℃雜交1h條件下特異性較好且信號強度較高的探針；結果如表3，其代表性結果如圖2所示，結果可見在所有待驗證探針中，有6條探針特異性較好，2條探針特異性一般，2條探針特異性較差。對於出現理論上序列特異性很高，但實際驗證後的探針特異性較差的情況，可能由於染色體著絲粒區域序列的複雜性，已知人類基因組的著絲粒區域序列並不完善。
表 3  17 號染色體待驗證序列的 FISH 探針特異性驗證
序號 序列編號 序列名稱 螢光標記 樣本/細胞系 特異性主要信號模式 特異性評價等級
1 SEQ ID NO: 1 Chr17-01 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 3G +++++
2 SEQ ID NO: 2 Chr17-02 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 3G +++++
3 SEQ ID NO:3 Chr17-03 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 3G +++++
4 SEQ ID NO:4 Chr17-04 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 3G +
5 SEQ ID NO:5 Chr17-05 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 3G +++++
6 SEQ ID NO:6 Chr17-06 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 3G +++++
7 SEQ ID NO:7 Chr17-07 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 3G +
8 SEQ ID NO:8 Chr17-08 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 3G +++
9 SEQ ID NO:9 Chr17-09 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 3G +++++
10 SEQ ID NO:10 Chr17-10 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 3G +++
注：“AF488”表示Alexa Fluor 488螢光基團；“TRed”表示Texas Red螢光基團；“3G”表示該細胞目標染色體著絲粒探針的主要FISH信號模式，單一細胞核中有3個綠色信號；特異性評價等級劃分：“+++++”表示高倍鏡下幾乎所有細胞均無肉眼可見非特異性信號，“+++”表示高倍鏡下可能部分細胞有微弱的非特異性信號，並且當進行常規優化雜交條件去除（如提高雜交溫度或提高雜交後洗滌溫度和增加洗滌時間等）；“+”表示目標染色體出現信號的同時，高倍鏡下還可見很明顯的非特異性信號。
從步驟2）中探針驗證結果可見單條探針信號較弱，為了增強螢光信號強度，一方面可以將多條經驗證的特異性較好探針混合使用，一方面可以在合成時增加單條探針的螢光標記數量。本發明對同其中5條特異性較好的序列（Chr17-01、Chr17-02、Chr17-03、Chr17-05、Chr17-06）的及其互補序列（Chr17-01v、Chr17-02v、Chr17-03v、Chr17-05v、Chr17-06v）分別進行人工合成並在5’端、3’端及中間修飾6～7個Alexa Fluor 488螢光基團，如表4所示；
表 4  17 號染色體特異性探針的增強螢光標記
序列編號 探針編號 探針序列（下劃線表示被 Alexa Fluor 488 螢光基團修飾的鹼基）
SEQ ID NO:1 Chr17-01-7G 5`Alexa Fluor 488 -TTCATAGAG TAGTTC TGAAACATGC TTTTCGTAGTG TCTACAAG TGGACAT - 3`Alexa Fluor 488
SEQ ID NO:11 Chr17-01v-6G 5`Alexa Fluor 488 -ATGTCCACT TGTAGACAC TACGAAAAGCA TGTTTCAGAAC TACTCTATGAA - 3`Alexa Fluor 488
SEQ ID NO:2 Chr17-02-7G 5`Alexa Fluor 488 -ACAGAAGCA TTCACAGAAAAC TCTTGG TGACGAC TGAGTTTAAC TCACAGA - 3`Alexa Fluor 488
SEQ ID NO:12 Chr17-02v-6G 5`Alexa Fluor 488 -TCTGTGAGTTAAAC TCAGTCG TCACCAAGAGTTTTC TGTGAA TGCTTCTGT - 3`Alexa Fluor 488
SEQ ID NO:3 Chr17-03-6G 5`Alexa Fluor 488 -GTTTGCA TTCAAA TCCCCGAGTTGAAC TTTCCTTTCAAAG TTCACGTTTG - 3`Alexa Fluor 488
SEQ ID NO:13 Chr17-03v-6G 5`Alexa Fluor 488 -CAAACG TGAACTT TGAAAGGAAAGTTCAAC TCGGGGA TTTGAATGCAAAC - 3`Alexa Fluor 488
SEQ ID NO:5 Chr17-05-6G 5`Alexa Fluor 488 -AAACTGCAAGGGGA TAATTGCACTC TTTGAGGAG TACCGTAG TAAAGGAA - 3`Alexa Fluor 488
SEQ ID NO:14 Chr17-05v-6G 5`Alexa Fluor 488 -TTCCTTTAC TACGGTACTCC TCAAAGAG TGCAATTA TCCCCTTGCAGTTT - 3`Alexa Fluor 488
SEQ ID NO:6 Chr17-06-6G 5`Alexa Fluor 488 -GCTGAGCA TTCCTTGCGA TGTAGCAG TTTAGAAACACAC TTTCTGCAGAA - 3`Alexa Fluor 488
SEQ ID NO:15 Chr17-16v-6G 5`Alexa Fluor 488 -TTCTGCAGAAAG TGTGTTTC TAAACTGC TACATCGCAAGGAA TGCTCAGC - 3`Alexa Fluor 488
4）將合成的10條新的探針分別用TE緩衝液溶解稀釋至100μM濃度的儲存液，再各取1μL混合後加190μL滅菌純化水稀釋至每條探針0.5μM的工作液，再將此工作液與雜交緩衝液（包含10%甲醯胺，20%硫酸葡聚糖，0.3M氯化鈉，0.03M檸檬酸鈉）按1:9的比例混合後，得到新的人17號染色體著絲粒探針（CEP17），-20℃避光保存。
5）將實施列2製備細胞玻片樣本從冰箱取出，晾乾，同時將人17號染色體著絲粒探針（CEP17）從-20℃冰箱取出室溫，輕輕混勻；
6）取製備的細胞玻片加入10μL 人17號染色體著絲粒探針，加上合適大小的蓋玻片蓋住檢測區域，用封片膠封閉蓋玻片四周，防止探針溢出。封片過程若出氣泡則將其輕輕擠出，以防影響雜交；
7）放入原位雜交儀（雅培S-500）中85℃變性5min，42℃雜交1小時；
8）雜交結束後用鑷子小心的揭開封片膠，移去蓋玻片，將玻片依次浸沒在室溫的2xSSC中洗滌3min，50℃預熱的雜交後洗滌緩衝液（0.4×SSC/0.1%NP-40）中洗滌5min，37℃預熱的滅菌純化水中洗滌2min，暗室直立風乾；
9）在探針目標區域加入10μL的DAPI複染液，蓋上蓋玻片，靜置20min；
10）螢光顯微鏡（Nikon Eclipse Ci-L）下觀察和分析結果：分析了4個不同組織來源的細胞系（HEK293、SV-HUC-1、MCF-7、A549）樣本，無論間期和中期細胞均獲得明亮清晰的特異性信號，且背景較低，無非特異性信號雜點；其中圖3為HEK293細胞中期FISH結果代表性圖像，可見a、b、c、d對應的17號染色體上均有特異性信號，無非特異性信號；圖4為4個細胞系間期FISH結果代表性圖像，可見信號清晰，背景較低。圖5為40倍物鏡下MCF-7細胞間期FISH照片，各細胞可見清晰信號，說明本發明的CEP17信號強度高。同時，組合後的增強探針CEP17與原來的（Chr17-01、Chr17-02、Chr17-03、Chr17-05、Chr17-06）任一單個探針相比，信號強度明顯提高，其特異性保持不變（如圖6所示，Chr17-03與CEP17的FISH信號對比結果），也從側面反映了各個單一探針本身的特異性較好，保證了混合探針仍然具有較低的背景和較強的特異信號。
實施例 4  17 號染色體著絲粒探針與商業探針性能比對驗證
為了充分驗證本發明的17號染色體探針性能，與A公司和B 公司的17號染色體探針採用同批次的MDA-MB-231細胞樣本進行測試，後兩者按照其說明書方案進行探針雜交和洗滌。代表性圖像如圖7所示，可見A公司的探針背景較高，微弱可見非特異性信號，B公司的相對較好，但信號強度較弱，本發明的探針較前兩者具有信號強度高，背景較低的優勢；而且如果加入新的特異性探針，可以進一步增加螢光強度。
實施例 5  17 號染色體著絲粒探針在石蠟組織樣本中驗證
為了驗證本發明的CEP17探針在石蠟組織樣本中的適應性，選取了3例非小細胞肺癌患者組織切片樣本進行驗證，按常規方法進行預處理，包括二甲苯脫蠟，硫氰酸鈉高溫水浴，胃蛋白酶消化等步驟，探針雜交與雜交後洗滌方案參照實施案例3所述，在3例組織切片中均可見清晰的特異性信號，圖8為代表性圖像，說明本發明的的探針可應用於石蠟組織樣本。
實施例 6 不同長度 17 號染色體著絲粒探針的獲取及驗證
為了驗證本發明探針在不同長度的適用性，將人類基因組17號染色體所有α衛星序列，逐個鹼基位移分割成不同長度（45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或80nt）的序列，完全相同序列只保留一個。其它步驟與實施例1相同。
得到不同長度的候選 序列庫，選取了一組序列相似度最高的不同長度的序列（皆包含核心序列SEQ ID NO:16：AGCATTCACAGAAAACTCTTGGTGACGACTGAGTTTAACTCACAG），如表5所示。針對表2中的每一條序列製備5’和3’端標記的螢光探針，在MDA-MB-231間期細胞中各自進行FISH性能驗證，結果如圖9所示，結果可見，所驗證的這組不同長度的探針，特異性均較好，無明顯非特異性信號，說明本發明的染色體著絲粒高特異性序列獲取方法能夠也適用於其它45～80nt長度的染色體著絲粒特異性探針獲取。從結果也可以看到，在相同雜交條件下，長探針（例如：75nt）比短探針（例如：45nt）信號強度較高，原因可能是雜交過程中長探針與靶區域結合更穩定，且能耐受更劇烈的洗滌條件。
然而，如表6所示，目標探針序列越長，按照本發明方法篩選得到的候選序列越少，意味著可用探針越少；相對而言，短的探針得到的候選序列越多，實際使用過程中可選擇特異性探針數量更多，可以通過多條探針組合獲得更好的信號強度。
表 5 不同長度的探針序列
序列編號 探針編號 序列（5' → 3'） 長度
SEQ ID NO:16 Chr17-2-45 AGCATTCACAGAAAACTCTTGGTGACGACTGAGTTTAACTCACAG 45nt
SEQ ID NO:17 Chr17-2-50 ACAGAAGCATTCACAGAAAACTCTTGGTGACGACTGAGTTTAACTCACAG 50nt
SEQ ID NO:18 Chr17-2-55 TAAAACAGATAGCATTCACAGAAAACTCTTGGTGACGACTGAGTTTAACTCACAG 55nt
SEQ ID NO:19 Chr17-2-60 AGAACTAAAACAGATAGCATTCACAGAAAACTCTTGGTGACGACTGAGTTTAACTCACAG 60nt
SEQ ID NO:20 Chr17-2-65 CGCACAGAACTAAAACAGATAGCATTCACAGAAAACTCTTGGTGACGACTGAGTTTAACTCACAG 65nt
SEQ ID NO:21 Chr17-2-70 TAACCCGCACAGAACTAAAACAGATAGCATTCACAGAAAACTCTTGGTGACGACTGAGTTTAACTCACAG 70nt
SEQ ID NO:22 Chr17-2-75 CGGGATAACCCGCACAGAACTAAAACAGATAGCATTCACAGAAAACTCTTGGTGACGACTGAGTTTAACTCACAG 75nt
SEQ ID NO:23 Chr17-2-80 GGAAACGGGATAACCCGCACAGAACTAAAACAGATAGCATTCACAGAAAACTCTTGGTGACGACTGAGTTTAACTCACAG 80nt
表 6  17 號染色體按不同序列長度可篩選到的中期備選序列資訊
篩選序列長度（nt） 候選序列總數 TM值範圍（℃） 平均TM值（℃） 靶區域 平均拷貝數
45 2831 59.0-72.5 66.51 1121
50 1227 64.6-72.3 68.03 941
55 759 65.7-72.6 68.77 901
60 411 67.1-72.5 70.20 1377
65 221 68.4-73.5 70.75 965
70 163 68.6-73.6 71.22 984
75 74 69.9-73.6 71.99 952
80 18 70.4-73.0 72.17 906
實施例 7 用本發明的設計方法在 7 號、 10 號、 18 號、 X 染色體中驗證
7.1  7 號、 10 號、 18 號、 X 染色體著絲粒探針探針的序列獲取
為了驗證本發明的探針設計方法在其它染色體中的適用性，發明人先後對7號、10號染色體、18號染色體、X染色體按照實施例1中17號染色體著絲粒探針的設計方法先後進行了序列查找、篩選和分析，分別得到了這4條染色體對應的著絲粒探針待驗證序列組，如下表7-表8。
表 7 7 號、 10 號、 18 號、 X 染色體的待驗證序列的綜合參數
序列編號 長度 拷貝數 非靶匹配數 靶匹配數 匹配分值 TM值/℃
Chr7-01 50 1882 2 18 174558 68.70
Chr7-02 50 2476 1 16 216424 66.80
Chr7-03 50 2422 3 16 185828 68.00
Chr7-04 50 2463 2 16 215888 68.10
Chr7-05 50 2454 10 20 214238 65.00
Chr7-06 50 2210 0 21 193364 66.70
Chr10-01 50 1264 6 16 100803 63.70
Chr10-02 50 1052 3 16 90560 64.00
Chr10-03 50 840 2 16 75782 67.10
Chr10-04 50 725 3 17 63782 66.70
Chr10-05 50 704 3 16 65341 68.50
Chr10-06 50 904 4 16 78650 70.00
Chr10-07 50 854 5 18 76656 65.70
Chr10-08 50 760 3 17 68666 67.40
Chr10-09 50 504 6 16 44553 70.00
Chr10-10 50 505 3 16 44047 71.10
Chr10-11 50 494 5 16 42926 68.30
Chr18-01 50 1757 2 17 137801 68.00
Chr18-02 50 4561 2 17 418900 70.50
Chr18-03 50 4229 1 25 368148 68.50
Chr18-04 50 2122 4 16 168819 69.80
Chr18-05 50 1805 3 18 149987 70.90
Chr18-06 50 2088 2 18 182185 70.50
ChrX-01 50 1732 2 39 155395 67.50
ChrX-02 50 1785 0 39 156166 70.10
ChrX-03 50 1726 1 42 151520 70.60
ChrX-04 50 1795 0 42 166226 69.00
ChrX-05 50 1850 2 41 170540 67.40
ChrX-06 50 1809 0 44 165065 67.80
ChrX-07 50 1797 2 42 157162 64.30
ChrX-08 50 1782 2 42 155629 66.80
ChrX-09 50 1780 2 43 155005 67.00
ChrX-10 50 1754 0 44 154523 66.90
ChrX-11 50 1751 2 42 157457 69.50
ChrX-12 50 1652 0 42 146718 66.00
ChrX-13 50 1649 1 43 144234 68.00
表 8 7 號、 10 號、 18 號、 X 染色體的待驗證序列
序列編號 序列名稱 序列（5' → 3'）
SEQ ID NO:24 Chr7-01 TTCGTTGCAAACGGGGTTTCTTCCTTTCATGCTAGACTAAGAAGAGTTCT
SEQ ID NO:25 Chr7-02 AGTGGAGATTTCTAGCCATTTGATGCCAACAGTACAAAGGGAAATATCTT
SEQ ID NO:26 Chr7-03 TTTTCTGAGAGCAGCTTAGAAACACTCTGCTTGTTATGTCTGCAAGTTGA
SEQ ID NO:27 Chr7-04 GAAACACTCTTTTTGCGGAAGTTGCAAGTGGAGATTTCTAGCCATTTGAT
SEQ ID NO:28 Chr7-05 CCATTTGATGCCAACAGTAGAAAGGGAAATATCTCAAATAAAAACCAGAC
SEQ ID NO:29 Chr7-06 ACGGGATTTCTTCATTGAATGCTAGACGGAAGGATTCTCAGTAAATTCTT
SEQ ID NO:30 Chr10-01 TGCAATTGGAGATTTTAAGAGATTTGAGGCTAATCTTTGAAATGGAAATATC
SEQ ID NO:31 Chr10-02 ACATCTTCGTATTAAAAGTACACAGAGTCATTCGTAGAAACTAGTTTGTG
SEQ ID NO:32 Chr10-03 GAATTTGCTAGTGCAGATTTCAAACGCTTCGAAGACAGTGATAGAAAAGG
SEQ ID NO:33 Chr10-04 GTTTGGAAATACACTCTTTGTAAGTCTGCAGCTGGATAATTGTCCCTCTA
SEQ ID NO:34 Chr10-05 GGAGATTTCAAGCGAATTCACGCCAATCTTAGACATGGAAACATCTTCGT
SEQ ID NO:35 Chr10-06 ACACTCTGTTTTTGGAATTTGCAAGTGCAGATTACAAGCGCTTCTAGGCC
SEQ ID NO:36 Chr10-07 TGGAAACATCTTCGTATTAAAAGTACACAGAGTCATTCGCAGAAACTAGT
SEQ ID NO:37 Chr10-08 TTCTTTAATCGAGCAGTTTGGAAATACACTCTTTGTAAGTCTGCAGCTGG
SEQ ID NO:38 Chr10-09 TTTGTAAGTCTGCAGGTGGATAATTGTCCCTCTATGAGCCCTTCGTTGGA
SEQ ID NO:39 Chr10-10 TAAAGCCTGCAAGTGCTTTTTTGGACTTCATTGAGGCCTCGTTGGAAACG
SEQ ID NO:40 Chr10-11 AAAGACTCTGTCTGTAAGTCTGCAAGTGATTAGTTAGACCCCTTTGAGGC
SEQ ID NO:41 Chr18-01 TTTTCTGGAATCTGCTAGACGATATTTGCCTAGCCTTGAGGATTTCGTTG
SEQ ID NO:42 Chr18-02 TTGGAAGCGGGAATTCATACAAATTGCAGACTGCAGCGTTCTGAGAAACA
SEQ ID NO:43 Chr18-03 TGTACTCAACTAAGAGAATTGAACCACCGTTTTGAAGGCGCAGTTTTGAA
SEQ ID NO:44 Chr18-04 TTTGGAGCACTATCAGGCCCATGTTGGAAAGGGAAATATCTTCCCGTAAC
SEQ ID NO:45 Chr18-05 GCAGTCCTGAAACACCCCTTTGGTAGTATCTGGAACTGGACTTTTGGAGC
SEQ ID NO:46 Chr18-06 TGGCTATTTGGCTAGCTTTGGGGATTTCGCTGGAAGCGGGAATACATATA
SEQ ID NO:47 ChrX-01 GAGATGAACCTGCCTTTGAGAGTTCAGGTTCGAAACACTCTTTCTGTATA
SEQ ID NO:48 ChrX-02 TGTTTCGAACCTGAACTCTCAAAGGCAGGTTCATCTCTGCGAGTTCAATG
SEQ ID NO:49 ChrX-03 TCCACTTGCACATTGTAGAAAAAGTGTGTCGAAGCTGCGCTATCAAAGGG
SEQ ID NO:50 ChrX-04 AAAGAATGTTCTGAGTTTGCTTCCGTTCAGTTATGGGAAGTTGATCCCGT
SEQ ID NO:51 ChrX-05 CAATGCTTCTCTCTCGTCTTTCTGTGAAGATAAAGGAAAAGGCTTTCAGG
SEQ ID NO:52 ChrX-06 TTGAACTTTCCCTTTGATAGCGCAGCTTTGACACACTTTTTCTACAATGT
SEQ ID NO:53 ChrX-07 GAAGATTTCTTTCGAAACGGGAATATTTCCACAGAAAAACTAAACTGAAG
SEQ ID NO:54 ChrX-08 TTTGATAGTTGAGGTTTGCAACACCCTTGTAGTAGAATCTGCAAGTGTAT
SEQ ID NO:55 ChrX-09 CATTCTCAGAATATTCTTTGTGATGATGGAGTTTCACTCACAGAGCGGAA
SEQ ID NO:56 ChrX-10 GGAAACGGGAATAATTTCCCATAACTAAACACAAACACGCTGAGAAAGTT
SEQ ID NO:57 ChrX-11 TTTGACACACTTTTTCTACAATGTGCAAGTGGCTATTTAGCGGGCTTGGA
SEQ ID NO:58 ChrX-12 GAATGCTTCCGTTTGCCTTTTATATGAAGTTCCTTCCTATACTACCGTAG
SEQ ID NO:59 ChrX-13 TGTGAGGATGGCATTCAACACATGGAGTTGAACAATCCTATTGATAGAGC
7.2  7 號、 10 號、 18 號、 X 染色體待驗證序列的探針特異性驗證
將表8的各染色體待驗證序列參考實施例3中的方法在MCF7或MDA-MB-231細胞玻片樣本中進行了探針特異性驗證，具體驗證步驟同17號染色體。驗證結果如表9及圖10-圖15所示，本發明的方法在7號、10號、18號、X染色體均獲得了較好或一般的特異性寡核苷酸探針，說明本發明的染色體著絲粒高特異性探針的製備方法不僅僅適用17號染色體高特異性寡核苷酸的探針獲得，也能拓展到其它染色體特異性寡核苷酸探針的獲取。
表 9  7 號、 10 號、 18 號、 X 染色體待驗證序列的 FISH 探針特異性驗證
序號 編號 螢光標記 樣本/細胞系 特異性信號主要模式 特異性評價等級
1 Chr7-01 5`AF488，3`AF488 MCF7 2G +++++
2 Chr7-02 5`AF488，3`AF488 MCF7 2G +++++
3 Chr7-03 5`AF488，3`AF488 MCF7 2G +++
4 Chr7-04 5`TRed，3`TRed MCF7 2R +
5 Chr7-05 5`TRed，3`TRed MCF7 2R +++++
6 Chr7-06 5`TRed，3`TRed MCF7 2R +
7 Chr10-01 5`AF488，3`AF488 MCF7 2R +
8 Chr10-02 5`AF488，3`AF488 MCF7 2R +
9 Chr10-03 5`AF488，3`AF488 MCF7 2R +++
10 Chr10-04 5`AF488，3`AF488 MCF7 2G +
11 Chr10-05 5`AF488，3`AF488 MCF7 2G +++++
12 Chr10-06 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +
13 Chr10-07 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +++++
14 Chr10-08 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +++++
15 Chr10-09 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +
16 Chr10-10 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +
17 Chr10-11 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +++++
18 Chr18-01 5`AF488，3`AF488 MCF7 2G +++
19 Chr18-02 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +++++
20 Chr18-03 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +
21 Chr18-04 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +++++
22 Chr18-05 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +++++
23 Chr18-06 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +
24 ChrX-01 5`AF488，3`AF488 MCF7 2G +
25 ChrX-02 5`AF488，3`AF488 MCF7 2G +
26 ChrX-03 5`AF488，3`AF488 MCF7 2G +
27 ChrX-04 5`AF488，3`AF488 MCF7 2G +++
28 ChrX-05 5`AF488，3`AF488 MCF7 2G +++++
29 ChrX-06 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +++++
30 ChrX-07 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +++++
31 ChrX-08 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +++++
32 ChrX-09 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +
33 ChrX-10 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +++++
34 ChrX-11 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +++++
35 ChrX-12 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +++
36 ChrX-13 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +++
注：“AF488”表示Alexa Fluor 488螢光基團；“TRed”表示Texas Red螢光基團；“2G”表示該細胞目標染色體著絲粒探針的主要FISH信號模式，單一細胞核中有2個綠色信號；“2R”表示該細胞目標染色體著絲粒探針的主要FISH信號模式，單一細胞核中有2個紅色信號；“3R”表示該細胞目標染色體著絲粒探針的主要FISH信號模式，單一細胞核中有3個紅色信號；特異性評價等級劃分：“+++++”表示高倍鏡下幾乎所有細胞均無肉眼可見非特異性信號，“+++”表示高倍鏡下可能部分細胞有微弱的非特異性信號，並且當進行常規優化雜交條件去除（如提高雜交溫度或提高雜交後洗滌溫度和增加洗滌時間等）；“+”表示目標染色體出現信號的同時，高倍鏡下還可見很明顯的非特異性信號。
實施例 8 用本發明的設計方法在 6 號、 8 號、 11 號、 12 號、 16 號染色體中驗證
8.1  6 號、 8 號、 11 號、 12 號、 16 號染色體著絲粒探針探針的序列獲取
發明人進一步對6號、8號、11號、12號、16號染色體按照實施例1中17號染色體著絲粒探針的設計方法先後進行了序列查找、篩選和分析，分別得到了這5條染色體對應的著絲粒探針待驗證序列組，如下表10-表11。
表 10 6 號、 8 號、 11 號、 12 號、 16 號染色體的待驗證序列的綜合參數
序號 序列編號 長度/nt 拷貝數 非靶匹配數 靶匹配數 匹配分值 TM值/℃
1 Chr6-01 50 818 0 17 73796 70.80
2 Chr6-02 50 413 7 16 38224 68.00
3 Chr6-03 50 407 2 16 35720 69.00
4 Chr6-04 50 400 10 16 33191 68.30
5 Chr6-05 50 254 1 17 22222 64.90
6 Chr8-01 50 1163 3 16 101986 71.70
7 Chr8-02 50 829 0 16 76456 66.40
8 Chr8-03 50 793 1 16 69521 68.00
9 Chr8-04 50 715 1 16 62098 69.70
10 Chr8-05 50 699 2 16 64726 69.00
11 Chr8-06 50 1307 1 18 113118 64.90
12 Chr8-07 50 848 2 16 77815 68.40
13 Chr8-08 50 838 0 17 74758 69.00
14 Chr8-09 50 814 3 16 70784 65.30
15 Chr8-10 50 524 1 16 45643 66.00
16 Chr11-01 50 889 3 26 77587 68.10
17 Chr11-02 50 3669 4 22 334726 65.80
18 Chr11-03 50 1471 5 16 127388 67.00
19 Chr11-04 50 1984 2 17 163303 68.40
20 Chr12-01 50 1420 10 25 123789 67.80
21 Chr12-02 50 1666 6 32 144830 68.10
22 Chr12-03 50 1516 6 34 132091 67.70
23 Chr12-04 50 1420 7 21 123443 65.40
24 Chr12-05 50 1555 1 26 142581 65.30
25 Chr12-06 50 1399 1 20 120216 64.80
26 Chr12-07 50 2950 2 32 235520 67.70
27 Chr16-01 50 1068 1 18 98792 69.40
28 Chr16-02 50 1097 2 22 91291 63.30
表 11 6 號、 8 號、 11 號、 12 號、 16 號染色體的待驗證序列
序號 序列編號 序列名稱 序列（5' → 3'）
1 SEQ ID NO:60 Chr6-01 TGTGTGATGGCTGCATTCCACACACACGGTGGAACATTTCTCTTGATAGA
2 SEQ ID NO:61 Chr6-02 AGAGCAGTTTGAAACGCTGTGGTTGTAGTATTTCCAAGCGGATATTAGAG
3 SEQ ID NO:62 Chr6-03 TTCCAAGGGGATATTTATAGCGCATTGAGCCTACGGCAGAAAAAGAAACA
4 SEQ ID NO:63 Chr6-04 TTGATAGAGCGTTTCTGAAACACCCTTCTTGTAGTAGCTGCAAGTGGATA
5 SEQ ID NO:64 Chr6-05 CTTCATGTTACTCTAGACAGAGAATTCTCAAACACTGCTATGTGATGTTT
6 SEQ ID NO:65 Chr8-01 GTTTGAAACCCCCTTTTTATAGTGTCTGGAAGCGGGCATTTGGAGCGCTT
7 SEQ ID NO:66 Chr8-02 AACGGGATGCAATATAAAACGTACACAGCAGCATACTCAGAAAATACTTT
8 SEQ ID NO:67 Chr8-03 CATTCTCAGAACCTTGATTGTGATGTGTGTTCTCCACTAACAGGGTTGAA
9 SEQ ID NO:68 Chr8-04 TTGTGATGTGTGCATCAACTGTCAGAATTGAACCTTGGTTTGGACAGAGC
10 SEQ ID NO:69 Chr8-05 GAAACAATCTTCTCGTACTATCTGGCAGTGGACATTTTGAGCTCCTTGGG
11 SEQ ID NO:70 Chr8-06 GGAAATATCTTCCCATGAATGCGAGATAGAAGTATCTCAGAAACATGTTT
12 SEQ ID NO:71 Chr8-07 AAACGGACTTGAACCTTTCGTTTCATGCAGTACTTCTGGAACACTCTTTT
13 SEQ ID NO:72 Chr8-08 ACAGAATTGAACATCCCCTCACATAGAGCAGTTGTGCAGCACTCTATTTG
14 SEQ ID NO:73 Chr8-09 CATACTCAGAAAATACTTTGCCATATTTCCATTCAAGTCACAGACTGGAA
15 SEQ ID NO:74 Chr8-10 AGCGCTTCAGGCCTATGCTTAAAATAGGAAATATCTACCTACAGAAACTA
16 SEQ ID NO:75 Chr11-01 GAACTTTCCTCTTGACCGAGCAGCTCTGAAACCCTCTTATTCTAGAATCT
17 SEQ ID NO:76 Chr11-02 ATCTAAAAACCAAACGGAAGCATTCACAGACAATTCTTAGTGATCATTGG
18 SEQ ID NO:77 Chr11-03 CTTTGTGAAGTTTGTGTTCCACTTCAGGAATTGAACTTTCCTCTTGACAG
19 SEQ ID NO:78 Chr11-04 GTGATCATTGGATTGAACTAACAGAGCTGAACTTCCTTTAGATGGCGCAG
20 SEQ ID NO:79 Chr12-01 TTCCTTTAGAAGAGCAGATGTTAAACACCCTTTTGTGGAATTTGCAGCTG
21 SEQ ID NO:80 Chr12-02 AACCTTTCTTTGATGGAGGAGTTTGGAGACACTGTCTTTGTAAAGTCTGC
22 SEQ ID NO:81 Chr12-03 TCTTTGTGTTGCCTCTATTCAACTCACAAAGGTGAACTGTCCTTTAGACA
23 SEQ ID NO:82 Chr12-04 ATAATGTTTGATAGGAGAAGTCTCAGTAACTTCTTTGGGCTGTGTGTATT
24 SEQ ID NO:83 Chr12-05 GTTGAATAGAGGCAACACAAAGAACTTACTCAGTATTCTTCTTTCTAGCG
25 SEQ ID NO:84 Chr12-06 ATTTCTTCATAGAACGCTGGAAAGAAGAATACTGAGTAAGTTCTTTGTGT
26 SEQ ID NO:85 Chr12-07 TATTTGTGCAGTTTCCAGTTGGAGATTTCAATCGCTTTGAGACCAAATGT
27 SEQ ID NO:86 Chr16-01 CAAGACAAACTCGTTCCCAGACACTGCGTAGTGATGTGTGTGTTTAACTC
28 SEQ ID NO:87 Chr16-02 CAAAAGCAGAAAAGGAAATATTTTCCTATAAAACCTCGACAGAATCTTTC
8.2  6 號、 8 號、 11 號、 12 號、 16 號染色體待驗證序列的探針特異性驗證
將表11的各染色體待驗證序列參考實施例3中的方法在MCF7或MDA-MB-231細胞玻片樣本中進行了探針特異性驗證，具體驗證步驟同17號染色體。驗證結果如表12及圖16-圖21所示，本發明的方法在6號、8號、11號、12號、16號染色體均獲得了較好或一般的特異性寡核苷酸探針，說明本發明的染色體著絲粒高特異性探針的製備方法也能拓展到其它染色體特異性寡核苷酸探針的獲取。
表 12  6 號、 8 號、 11 號、 12 號、 16 號號染色體待驗證序列的 FISH 探針特異性驗證
序號 序列編號 螢光標記 樣本/細胞系 特異性信號主要模式 特異性評價等級
1 Chr6-01 5`TRed，3`TRed NCI-H1993 2R +++++
2 Chr6-02 5`TRed，3`TRed NCI-H1993 2R +++++
3 Chr6-03 5`TRed，3`TRed NCI-H1993 2R +++++
4 Chr6-04 5`TRed，3`TRed NCI-H1993 2R +++++
5 Chr6-05 5`TRed，3`TRed NCI-H1993 2R +++++
6 Chr8-01 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +
7 Chr8-02 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +
8 Chr8-03 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +
9 Chr8-04 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +++++
10 Chr8-05 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +++
11 Chr8-06 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +++
12 Chr8-07 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +++++
13 Chr8-08 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +++++
14 Chr8-09 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +++++
15 Chr8-10 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +++++
16 Chr11-01 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 3G +++
17 Chr11-02 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +++++
18 Chr11-03 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +++++
19 Chr11-04 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 3R +++++
20 Chr12-01 5`AF488，3`AF488 MDA-MB-231 2G +
21 Chr12-02 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +
22 Chr12-03 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +++
23 Chr12-04 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +
24 Chr12-05 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +++++
25 Chr12-06 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +++++
26 Chr12-07 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +++++
27 Chr16-01 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +++++
28 Chr16-02 5`TRed，3`TRed MDA-MB-231 2R +++
注：“AF488”表示Alexa Fluor 488螢光基團；“TRed”表示Texas Red螢光基團；“3G”表示該細胞目標染色體著絲粒探針的主要FISH信號模式，單一細胞核中有3個綠色信號；“2G”表示該細胞目標染色體著絲粒探針的主要FISH信號模式，單一細胞核中有2個綠色信號；“2R”表示該細胞目標染色體著絲粒探針的主要FISH信號模式，單一細胞核中有2個紅色信號；“3R”表示該細胞目標染色體著絲粒探針的主要FISH信號模式，單一細胞核中有3個紅色信號；特異性評價等級劃分：“+++++”表示高倍鏡下幾乎所有細胞均無肉眼可見非特異性信號，“+++”表示高倍鏡下可能部分細胞有微弱的非特異性信號，並且當進行常規優化雜交條件去除（如提高雜交溫度或提高雜交後洗滌溫度和增加洗滌時間等）；“+”表示目標染色體出現信號的同時，高倍鏡下還可見很明顯的非特異性信號。
以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對發明專利範圍的限制。對於所屬領域的具有通常知識者來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動仍處於本發明創造的保護範圍之內。
無。
圖1為中期備選序列庫的綜合參數篩選流程圖； 圖2為實施例3中17號染色體待驗證序列的探針特異性驗證結果； 圖3為實施例3中CEP17探針檢測HEK293細胞中期FISH結果代表性圖像（a、b、c、d代表特異性的CEP17信號點）； 圖4為實施例3中CEP17探針檢測HEK293、SV-HUC-1、MCF-7、A549四種不同細胞的細胞間期FISH結果代表性圖像； 圖5為實施例3中40倍物鏡下MCF-7細胞間期FISH圖； 圖6為實施例3中單探針Chr17-03與CEP17的FISH信號對比結果； 圖7為實施例4中本發明的CEP17探針與商業探針的FISH結果對比圖； 圖8為實施例5中CEP17探針在組織切片樣本中驗證FISH圖； 圖9為實施例6中不同長度的CEP17探針在MDA-MB-231細胞的驗證FISH圖（圖中的每一幅小圖表示只驗證具有相關長度的1條探針的結果）； 圖10-15為實施例7中7號染色體待驗證序列的探針特異性驗證結果； 圖11-12為實施例7中10號染色體待驗證序列的探針特異性驗證結果； 圖13為實施例7中18號染色體待驗證序列的探針特異性驗證結果； 圖14-15為實施例7中X染色體待驗證序列的探針特異性驗證結果； 圖16為實施例8中6號染色體待驗證序列的探針特異性驗證結果； 圖17-18為實施例8中8號染色體待驗證序列的探針特異性驗證結果； 圖19為實施例8中11號染色體待驗證序列的探針特異性驗證結果； 圖20為實施例8中12號染色體待驗證序列的探針特異性驗證結果； 圖21為實施例8中16號染色體待驗證序列的探針特異性驗證結果。
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Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (32)

  1. 一種用於螢光原位雜交檢測人染色體著絲粒的探針，其特徵在於，所述探針序列長度為40-90nt，所述探針序列對應於目標染色體著絲粒區域的拷貝數≥200。
  2. 如請求項1所述的探針，其中，所述探針經FISH驗證未出現非特異性信號。
  3. 如請求項1所述的探針，其中，所述目標染色體的靶區域為目標染色體的序列區域或目標染色體的著絲粒區域。
  4. 如請求項1所述的探針，其中，所述探針序列對應於非靶區域的匹配數≤10；優選地，所述的非靶區域的匹配數是BLAT中的查詢匹配數； 優選地，所述探針的靶區域匹配分值≥10000； 優選地，所述的探針為檢測染色體著絲粒拷貝數的探針； 優選地，所述的探針為DNA探針和/或RNA探針； 優選地，所述探針序列對應於目標染色體著絲粒區域的拷貝數為200-6000；優選為200-5000。
  5. 一種人染色體著絲粒探針組，其特徵在於，包括一條或多條如請求項1所述的染色體著絲粒探針，各條探針間TM值差異≤10℃，各條探針序列長度相差≤10nt； 優選地，所述的探針為DNA探針和/或RNA探針。
  6. 一種用於檢測人17號染色體著絲粒的探針，其特徵在於，包含如SEQ ID NO：16所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt。
  7. 如請求項6所述的探針，其中，所述探針的序列如SEQ ID NO：1-23任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
  8. 一種人7號染色體著絲粒探針，其特徵在於，包含如SEQ ID NO：24-29任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt； 優選地，所述探針的序列如SEQ ID NO：24-29任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
  9. 一種人10號染色體著絲粒探針，其特徵在於，包含如SEQ ID NO：30-40任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt； 優選地，所述探針的序列如SEQ ID NO：30-40任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
  10. 一種人18號染色體著絲粒探針，其特徵在於，包含如SEQ ID NO：41-46任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt； 優選地，所述探針的序列如SEQ ID NO：41-46任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
  11. 一種人X染色體著絲粒探針，其特徵在於，包含如SEQ ID NO：47-59任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt； 優選地，所述探針的序列如SEQ ID NO：47-59任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
  12. 一種人6號染色體著絲粒探針，其特徵在於，包含如SEQ ID NO：60-64任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt； 優選地，所述探針的序列如SEQ ID NO：60-64任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
  13. 一種人8號染色體著絲粒探針，其特徵在於，包含如SEQ ID NO：65-74任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt； 優選地，所述探針的序列如SEQ ID NO：65-74任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
  14. 一種人11號染色體著絲粒探針，其特徵在於，包含如SEQ ID NO：75-78任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt； 優選地，所述探針的序列如SEQ ID NO：75-78任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
  15. 一種人12號染色體著絲粒探針，其特徵在於，包含如SEQ ID NO：79-85任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt； 優選地，所述探針的序列如SEQ ID NO：79-85任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
  16. 一種人16號染色體著絲粒探針，其特徵在於，包含如SEQ ID NO：86-87任一所示的序列、其互補序列和/或它們對應的RNA序列，長度為40-90nt； 優選地，所述探針的序列如SEQ ID NO：86-87任意一條和/或它們對應的RNA序列所示。
  17. 如請求項1-16任一所述的探針，其中，所述探針的長度為45-85 nt； 優選地，所述探針的長度為45-80nt； 優選地，所述探針的長度為45-75 nt； 優選地，所述探針的長度為48-55 nt； 優選地，所述探針的長度為50-55 nt。
  18. 一種篩選檢測人染色體著絲粒的探針模板序列或探針序列的方法，其特徵在於，包括以下步驟： S1.獲取多條初始備選序列組成初始序列庫： 從目標染色體的α衛星序列中，獲取多條長度為40-90nt的序列片段，成為初始備選序列庫； S2.獲取中期備選序列： 對步驟S1獲得的多條初始備選序列在人類基因組資料庫中進行查詢比對；在對某條初始備選序列進行查詢比對時，以該初始備選序列為查詢基準序列，獲得該查詢基準序列在人類基因組資料庫中的匹配對象，確定匹配對象分佈在靶區域的匹配數A及分佈在非靶區域的匹配數B，當B和A的相對量小於等於預設比例時，其對應的初始備選序列被確定為中期備選序列； S3.獲取一條或多條探針模板序列或探針序列：對中期備選序列進行參數篩選，所述參數符合預設條件的，其對應的中期備選序列被確定為探針模板序列或探針序列。
  19. 如請求項18所述的方法，其中，所述步驟S1，是從目標染色體的α衛星序列中，通過1~10nt/位移的方式進行截取，獲得一條以上長度為40-90nt的序列片段；優選通過1~5nt/位移的方式進行截取；更優選通過1nt/位移的方式進行截取； 優選地，設定序列片段長度為45-85 nt； 優選地，設定序列片段長度為45-80nt； 優選地，設定序列片段長度為45-75 nt； 優選地，設定序列片段長度為48-55 nt； 優選地，設定序列片段長度為50-55 nt； 優選地，對於所獲取的序列片段完全相同的，只保留一條。
  20. 如請求項18所述的方法，其中，所述步驟S2中，匹配對象的匹配條件是：與查詢基準序列的一致性I或相似性S大於等於預設的一致性閾值It或相似性閾值St； 優選地，所述步驟S2中的所述一致性或相似性的預設的一致性閾值It或相似性閾值St的選取範圍為70%~95%； 優選地，當以BLAT為工具查詢匹配對象時，所述的一致性IDENTITY的閾值It為70%；並且優選的，SCORE≥20。
  21. 如請求項18所述的方法，其中，所述步驟S2中，所述靶區域為目標染色體的序列區域； 優選地，所述靶區域為目標染色體的著絲粒區域； 優選地，所述非靶區域為除了所述靶區域外的其他區域； 優選地，所述非靶區域包括非目標染色體的序列區域； 優選地，所述非靶區域還包括目標染色體的非著絲粒序列區域； 優選地，所述B和A的相對量的預設比例為7:8；優選3:4；更優選5:8；還更優選1:2。
  22. 如請求項18所述的方法，其中，所述的步驟S3中，所述參數選自中期備選序列在靶區域的拷貝數；當所述拷貝數大於等於預設拷貝數的，其對應的中期備選序列被確定為探針模板序列或探針序列； 優選地，所述的預設拷貝數為200~4000；優選為200~1000； 優選地，所述步驟S3中的參數篩選，還包括以下參數中的一種或多種：TM值、靶區域的匹配分值、序列長度、非靶匹配數； 優選地，在對中期備選序列進行參數篩選前，還包括將多條中期備選序列進行聚類分析的步驟。
  23. 如請求項18所述的方法，其中，所述步驟S3的步驟包括： 對中期備選序列進行聚類分析，將序列間有連續20個或以上鹼基相同的中期備選序列歸為一組； 獲取各條中期備選序列的參數，所述參數為靶區域的拷貝數； 將獲取的各條中期備選序列的參數進行分析，按照靶區域的拷貝數高的原則從聚類分析得到的每組中期備選序列中選出各1條序列；並且，所述的從每組中期備選序列中所選出的各1條序列，符合靶區域的拷貝數≥200的條件。
  24. 如請求項18所述的方法，其中，所述參數還包括以下的一種或多種：TM值、靶區域的匹配分值、序列長度、非靶匹配數；當在每組中期備選序列中作選取時，以如下原則作選取：TM值越高，和/或靶區域的匹配分值越高，和/或非靶匹配數越小，則優先選取； 優選地，所述靶區域的匹配分值≥10000； 優選地，當聚類得到的組超過一組時，不同組選出的各條序列間TM值差異≤10℃，不同組選出的各條序列長度相差≤10nt； 優選的，當以BLAST工具獲取匹配分值時，所述匹配分值為Total Score值。
  25. 一種驗證/確定如請求項18-24任一所述的方法所獲得的探針模板序列或探針序列的方法，其中，將如請求項18-24任一所述的方法所獲得的探針模板序列或探針序列進行驗證； 優選驗證方法為FISH。
  26. 如請求項25所述的方法，其中，在驗證前對所述探針模板序列或探針序列進行螢光標記； 優選地，在探針序列的5’端、3’端或中間的任意鹼基標記1個或多個螢光基團； 優選地，所述螢光基團選自Alexa Fluor，德克薩斯紅（TexasRed），香豆素，螢光素(FITC)，四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC），羧基四甲基羅丹明（TAMRA），Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy 7，PlatinumBright，Pacific Green，Oregon Green，Pacific Blue，Pacific Orange，6-羧基螢光素（6-FAM），2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基螢光素（JOE），四氯-6-羧基螢光素（TET），六氯-6-甲基螢光素（HEX），羧基-X-羅丹明（ROX）和ATTO系列螢光基團中的至少一種。
  27. 一種設計探針的方法，其特徵在於，包括以下步驟： 1）如請求項18-24任一所述的方法獲得一條或多條探針模板序列或探針序列； 2）如請求項25或26所述的方法驗證步驟1）獲得的一條或多條探針模板序列或探針序列或它們的互補序列。
  28. 一種合成探針的方法，其特徵在於，包括以下步驟： 1）如請求項18-24任一所述的方法獲得一條或多條探針模板序列或探針序列； 2）如請求項25或26所述的方法驗證步驟1）獲得的一條或多條探針模板序列或探針序列； 3）根據步驟2）獲得的驗證後的一條或多條探針模板序列或探針序列或它們的互補序列，進行合成。
  29. 一種篩選人染色體著絲粒探針模板序列或探針序列的方法，其特徵在於，包括以下步驟： 向序列比對服務器發送多條序列查詢請求，各所述序列查詢請求分別攜帶有一條初始備選序列，所述初始備選序列為從目標染色體的α衛星序列中獲取的長度為40-90nt的序列片段； 獲取所述序列比對服務器返回的各所述初始備選序列對應的各匹配對象； 獲取各所述匹配對象的第一匹配數和第二匹配數，所述第一匹配數為對應的匹配對象分佈在靶區域的匹配數，所述第二匹配數為對應的匹配對象分佈在非靶區域的匹配數； 當任意一所述匹配對象的所述第二匹配數和所述第一匹配數的相對量小於預設比例時，將所述任意一所述匹配對象對應的初始備選序列被確定為中期備選序列； 對各所述中期備選序列進行參數篩選，將參數符合預設條件的中期備選序列確定為探針模板序列或探針序列。
  30. 一種篩選人染色體著絲粒探針模板序列或探針序列的裝置，其特徵在於，所述裝置包括： 請求發送模組，用於向序列比對服務器發送多條序列查詢請求，各所述序列查詢請求分別攜帶有一條初始備選序列，所述初始備選序列為從目標染色體的α衛星序列中獲取的長度為40-90nt的序列片段； 對象獲取模組，用於獲取所述序列比對服務器返回的各所述初始備選序列對應的各匹配對象； 匹配數獲取模組，用於獲取各所述匹配對象的第一匹配數和第二匹配數，所述第一匹配數為對應的匹配對象在靶區域的匹配數，所述第二匹配數為對應的匹配對象在非靶區域的匹配數； 序列篩選模組，用於當任意一所述匹配對象的所述第二匹配數和所述第一匹配數的相對量小於預設比例時，將所述任意一所述匹配對象對應的初始備選序列被確定為中期備選序列； 探針獲取模組，用於對各所述中期備選序列進行參數篩選，將參數符合預設條件的中期備選序列確定為探針模板序列或探針序列。
  31. 如請求項1-16所述的探針或請求項18-24任一所述的方法所獲得的探針模板序列或探針序列在檢測染色體拷貝數異常疾病中的應用； 優選地，所述疾病包括21三體綜合症、13三體綜合症、18三體綜合症、Klinefelter綜合症、Turner綜合症、骨髓增生異常綜合症、慢性淋巴細胞白血病、急性髓系白血病、獲得性囊性腎病、腎乳頭狀癌、髓母細胞瘤中的至少一種。
  32. 一種受試者疾病的檢測方法，包括： 進行該受試者的檢測樣品的染色體拷貝數檢測，該樣品的染色體拷貝數檢測是以請求項1-16所述的探針或請求項18-24任一所述的方法所獲得的探針模板序列或探針序列進行檢測；以及 根據該染色體拷貝數檢測所得的該受試者的該樣品的染色體拷貝數，與正常對照樣品的染色體拷貝數偏離，可選地相比的偏高或偏低，指示該受試者患有或有風險患有該疾病； 優選地，所述疾病包括21三體綜合症、13三體綜合症、18三體綜合症、Klinefelter綜合症、Turner綜合症、骨髓增生異常綜合症、慢性淋巴細胞白血病、急性髓系白血病、獲得性囊性腎病、腎乳頭狀癌、髓母細胞瘤中的至少一種。
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