CN105755135B - 一种人17号染色体着丝粒探针试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种人17号染色体着丝粒探针试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒包括荧光材料标记的CEP17着丝粒探针和杂交缓冲液，所述CEP17着丝粒探针的序列号如SEQ ID NO.1所示。本发明所述CEP17着丝粒探针的大小为156bp，较一般探针小，更容易进入细胞与靶区域杂交；细胞滴片原位杂交时，一般无前处理过程，细胞通透性不好，一般探针较难杂交，本发明所述CEP17着丝粒探针较一般探针小且大小均一，非常容易杂交，因此适用于细胞荧光原位杂交；本发明所述CEP17着丝粒探针序列具有高特异性，探针杂交检测结果判读的准确性高。

Description

一种人17号染色体着丝粒探针试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
人类第17号染色体由大约8100万个碱基对构成，含1500多个基因，有许多与疾病相关的基因，如乳腺癌基因、神经纤维瘤基因、遗传性神经紊乱基因等。乳腺癌临床检测中，HER2基因扩增检测可指导用药及预后判断，荧光原位杂交中常用HER2探针与人17号染色体着丝粒探针荧光数的比值来判断待检测组织HER2基因扩增状态。研究表明，13～46％的浸润乳腺癌患者癌细胞的17号染色体为非整倍体[Torrisir,Rotmens ZN,Bagnard IV,etal.HER2 status in early breast cancer:relevance of cell staining patterns,gene amplification andpolysomy17[J].Eur J Cancer,2007,43(16):2339-2344]。一方面，这种情况可能影响HER2基因状况的判断，另一方面，这种遗传学改变可能与乳腺癌的不良预后有关[May,Lespagnardl,Durbecqv,et al.Polysomy 17in HER2/neu statuselaboration in breast cancer:effect on daily practice[J].Clin Cancer Res,2005,11(12):4393-4399]。在膀胱癌的研究中，17号染色体数目异常可能与膀胱癌的复发相关[Watters A D,Ballantyne S A,Going J J,et al.Aneu-somy ofchromosomes7and17predicts the recurrence of transitional cell carcinoma ofthe urinary bladder[J].BJUInt,2000,85(1):42-47.]。因此，17号染色体计数对一些疾病的治疗及预后判断有重要意义。
目前常用的人17号染色体着丝粒探针的制备一般采用已提供序列的特异性重复单元序列标记，但实际杂交效果较差，存在特异性较低、杂信号多、杂交背景差等缺点，这不利于临床的正确诊断及治疗。因此研发一种特异性高的人17号染色体着丝粒探针非常必要。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒，包括：荧光材料标记的CEP17着丝粒探针和杂交缓冲液，所述CEP17着丝粒探针的序列号如SEQ ID NO.1所示。
上述方案中，所述荧光材料为异硫氰酸荧光素(FITC)。
上述方案中，所述杂交缓冲液为10％硫酸葡聚糖、0.01M的PBS缓冲液(PH＝7.4)与去离子甲酰胺按照体积比为1:6:3的比例混合的混合液。
上述方案中，所述荧光材料标记的标记效率为1％～5％。
上述高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备高特异性的人17号染色体着丝粒探针：
a.查找并筛选人17号染色体着丝粒的高特异性区域，人工合成该区域序列，获得pUc-CEP17质粒；
b.根据步骤a所得pUc-CEP17质粒的序列设计引物；
c.以步骤a所得pUc-CEP17质粒为模板，加入已用荧光材料标记的dUTP，利用步骤b设计的引物进行PCR扩增，得到荧光材料标记的PCR产物，所述PCR产物经纯化后即为CEP17着丝粒探针；
(2)将步骤(1)所得CEP17着丝粒探针用杂交缓冲液稀释至终浓度为2ng/μL，然后、分装、贴标签、组装后即得到高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒。
上述方案中，步骤(1)中所述高特异性区域的序列号如SEQ ID NO.1所示。
上述方案中，步骤(1)中所述引物为F：GGAATCTGCAAGTGGATATG；
R:CAGAACTACTCTATGAAAAGC。
上述方案中，步骤(1)中所述PCR扩增的反应体系为：5μL、10X buffer，2μL引物(F/R，浓度均为10μM)，1μL、1ng/μL pUc-CEP17质粒，1μL、10mM dATP，1μL、10mM dCTP，1μL、10mMdGTP，0.75μL、10mM dTTP，2.5μL、1mM Fluorescein-12-dUTP，0.5μL、Taq DNA polymerase，35.25μL去离子水。
上述方案中，步骤(1)中所述PCR扩增的程序为：94℃ 5min；55℃ 5min；72℃1min、94℃ 1min、55℃ 1min，30cycles；72℃ 5min，4℃保存。
上述高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒在制备用于检测人17号染色体着丝粒产品中的应用。
本发明的有益效果如下：(1)本发明所述试剂盒中，CEP17着丝粒探针的大小为156bp，较一般探针小，更容易进入细胞与靶区域杂交；(2)细胞滴片原位杂交时，一般无前处理过程，细胞通透性不好，一般探针较难杂交，本发明所述CEP17着丝粒探针较一般探针小，且大小均一，非常容易杂交，因此，本发明所述CEP17着丝粒探针试剂盒也适用于细胞荧光原位杂交；(3)本发明所述CEP17着丝粒探针序列是17号染色体着丝粒序列中的高特异性序列，提高了探针的特异性，进而增加了探针杂交检测结果判读的准确性。
附图说明
图1为PCR产物(CEP17着丝粒探针)电泳结果图，其中a为Mark，b为PCR产物。
图2为CEP17着丝粒探针与正常人外周血淋巴细胞荧光原位杂交实验结果。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1CEP17着丝粒探针的制备
高特异性的人17号染色体着丝粒探针(CEP17着丝粒探针)的制备：
(1)查找并筛选人17号染色体着丝粒的高特异性区域，并人工合成该区域序列，获得pUc-CEP17质粒；所述高特异性区域的序列号如SEQ ID NO.1所示。
(2)根据步骤(1)所得pUc-CEP17质粒的序列设计引物，经普通PCR扩增后测序验证，所述引物为“F：GGAATCTGCAAGTGGATATG；R:CAGAACTACTCTATGAAAAGC”；
(3)以步骤(1)所得pUc-CEP17质粒为模板，加入已用异硫氰酸荧光素标记的dUTP，利用步骤(2)设计的引物进行PCR扩增，将荧光材料标记掺入PCR产物中，得到荧光材料标记的PCR产物；
50μL PCR反应体系如下：
5μL 10X buffer
2μL引物(F/R，浓度均为10μM)
1μL 1ng/μL pUc-CEP17质粒
1μL 10mM dATP
1μL 10mM dCTP
1μL 10mM dGTP
0.75μL 10mM dTTP
2.5μL 1mM Fluorescein-12-dUTP
0.5μL Taq DNA polymerase
35.25μL去离子水
PCR程序如下：
94℃ 5min
55℃ 5min
72℃ 1min、94℃ 1min、55℃ 1min 30cycles
72℃ 5min
4℃ hold
PCR程序结束后，短暂离心，取5μL产物做电泳检测(1％的琼脂糖凝胶)电泳结果如图1所示(图中a为Marker，b为PCR产物条带)，在100～250bp间有单一明亮的条带。其余产物按照说明书用BioRad MicroP-30纯化柱进行纯化(避光操作)、分别测定浓度及在495nm处的吸光值并计算标记效率，要求标记效率在1～9/100碱基范围内，纯化后的PCR产物即为CEP17着丝粒探针，避光、-20℃储存。
实施例2试剂盒的组装
高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒的组装：
(1)杂交缓冲液的制备：将10％硫酸葡聚糖、0.01M的PBS缓冲液(PH＝7.4)与去离子甲酰胺按照1:6:3的体积比配制成杂交缓冲液；
(2)将CEP17着丝粒探针用杂交缓冲液稀释CEP17探针至终浓度为2ng/μL，具体稀释比例如下表：
表1稀释比例
(3)组装：将上述稀释后的CEP17着丝粒探针杂交缓冲液以每管100μL分装，贴标签，组装后的试剂盒如下表2：
表2试剂盒的组装
成分 规格 数量
杂交液(CEP17探针) 100μL/管 1管
说明书 — 1份
实施例3正常人外周血淋巴细胞滴片的制备
(1)试剂：秋水仙碱、培养基、低渗液、固定液(甲醇：乙酸＝3:1)。
(2)细胞培养及同步化：将肝素化的外周血用细胞培养液稀释十倍，培养箱培养67～72h，并于终止前4h，向外周血细胞培养液中加入秋水仙素至终浓度(0.1μg/ml)继续培养4h。
(3)收获细胞及固定：(a)离心，摇匀外周血培养液混匀血细胞，500g离心5min，弃去上清；(b)低渗，加入10ml低渗液，37℃水浴低渗20min；(c)预固定，在细胞悬液中逐滴加入0.5ml预冷固定液预固定细胞，轻轻吹打混匀后马上500g离心并去除上清；(d)向细胞悬液中缓慢加入10ml预冷固定液，室温静置10min，500g离心沉淀细胞；(e)重复步骤(d)一遍，弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液。
(4)制片：制片前吸除固定液上清，留少量液体及细胞沉淀，加入适量新鲜固定液重悬细胞；吸取7～10ul细胞悬液，自70～80cm高处滴在一张干燥清洁的载波片上，吹干。56℃烤片2h，室温下放置2天。-20℃保存备用。
实施例4CEP17探针细胞荧光原位杂交实验
使用实施例2组装的试剂盒、实施例3制备的正常人外周血淋巴细胞滴片，使CEP17着丝粒探针与正常人外周血淋巴细胞杂交：
(1)探针配置：用杂交缓冲液稀释CEP17着丝粒探针至终浓度2ng/μL，-20℃储存备用；
(2)变性杂交：取10μL已稀释好的探针滴加至玻片杂交区域，加盖玻片，用橡皮胶封边；杂交仪上83℃共变性5min，42℃杂交2～16h；
(3)杂交后洗涤：移去盖玻片，将玻片置于0.3％NP-40/0.4×SSC溶液(67℃，需提前30min预热)中，振荡1～3秒，漂洗2分钟；室温下将玻片置于0.1％NP-40/2×SSC洗涤液中，振荡1～3秒，漂洗30秒；室温下将玻片置于70％乙醇中，漂洗3分钟；
(4)DAPI复染剂复染：将已洗涤的玻片于室温、暗处自然风干，加10～20μLDAPI复染剂滴加至玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，暗处放置15～20min复染。
实验结果：荧光显微镜下，将玻片置于合适的滤片组观察并分析。结果如图2所示，结果显示：中期细胞中17号染色体着丝粒区域可见清晰、明亮的绿色信号，未见其他荧光信号(如图中a、b、c、d)；间期细胞中可见两个明亮的绿色信号(如图中e、f、g、h)，未见其他荧光信号。图2的结果说明了：本发明所述CEP17着丝粒探针试剂盒也适用于细胞荧光原位杂交；本发明所述CEP17着丝粒探针的特异性高，判读结果的准确性高。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒，其特征在于，包括：荧光材料标记的CEP17着丝粒探针和杂交缓冲液，所述CEP17着丝粒探针的序列号如SEQ ID NO.1所示；所述杂交缓冲液为10wt%硫酸葡聚糖、0.01M的PBS缓冲液和去离子甲酰胺按照体积比为1:6:3的比例混合的混合液。
2.根据权利要求1所述的高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒，其特征在于，所述荧光材料为异硫氰酸荧光素。
3.根据权利要求1所述的高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒，其特征在于，所述荧光材料标记的标记效率为1%~5%。
4.权利要求1~3任一所述高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备高特异性的人17号染色体着丝粒探针：
a．查找并筛选人17号染色体着丝粒的高特异性区域，人工合成该区域序列，获得pUc-CEP17质粒；
b．根据步骤a所得pUc-CEP17质粒的序列设计引物；
c．以步骤a所得pUc-CEP17质粒为模板，加入已用荧光材料标记的dUTP，利用步骤b设计的引物进行PCR扩增，得到荧光材料标记的PCR产物，所述PCR产物经纯化后即为CEP17着丝粒探针；
（2）将步骤（1）所得CEP17着丝粒探针用杂交缓冲液稀释至终浓度为2ng/µL，然后分装、贴标签、组装后即得到高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述引物为：
F：GGAATCTGCAAGTGGATATG；R：CAGAACTACTCTATGAAAAGC。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述PCR扩增的反应体系为：5 µL，10X buffer；2 µL，10 µM F/R引物；1 µL，1 ng/µL pUc-CEP17质粒；1 µL，10 mMdATP；1 µL，10 mM dCTP；1 µL，10 mM dGTP；0.75 µL，10 mM dTTP；2.5 µL，1 mMFluorescein-12-dUTP；0.5 µL，TaqDNA polymerase；35.25µL去离子水。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述PCR扩增的程序为：94℃ 5min；55℃ 5min；72℃ 1min，94℃ 1min，55℃ 1min，30cycles；72℃ 5min，4 ℃ 保存。
8.权利要求1~3任一所述高特异性的人17号染色体着丝粒探针试剂盒在制备用于检测人17号染色体着丝粒产品中的应用。
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