CN102243238B - 病原体的核酸金标快速检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明“病原体核酸金标快速检测方法及试剂盒”，属于医学生物技术领域，结合了胶体金标记技术和核酸PCR检测技术的优点，除PCR仪之外不依赖任何仪器，对传染病爆发流行时的大规模筛查以及血液制品的筛查具有重要的意义，特别检测HBV病毒早期感染，筛查献血源中的潜在HBV携带者，保障血液制品的安全性；实现早期、特异、灵敏、经济的检出病原体的目的。

Description

病原体的核酸金标快速检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及医学生物技术，特别是涉及病原体的核酸金标快速检测方法。

背景技术

免疫胶体金技术(Immunogold labelling techique)是上世纪80年代继荧光素、放射性同位素和酶三大标记技术后发展起来的固相标记免疫测定技术。该技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，形成肉眼可见的红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新型层析材料基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，近年来发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。该技术主要是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在硝酸纤维膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂并相互反应，再移动至固定抗原或抗体区域时，待测物-金标试剂复合物与之发生特异性结合而被截留，胶体金标记复合物聚集在检测带上，可通过目测得到直观的显色结果。而游离的标记物则越过检测带，从而达到与检测物自动分离的目的。胶体金颗粒本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标致癌性底物显色及终止显色的步骤，对人体无毒害；金标记物比酶标记物更稳定，试验结果可以长期保存而不腿色。免疫胶体金层析技术作为诊断试剂广泛应用到临床后，由于它的快速简便、准确，具有高度特异性和高敏感性，结果直观可靠，而且试剂和样品用量极少，无需仪器设备，简化了烦琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差，是一种目前发展最快的复合型免疫层析技术。免疫胶体金层析技术现已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一，特别适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量、时间紧的检测和大面积普查等。该法被认为是微生物和传染病及寄生虫病诊断技术标准化最有前途的新技术之一，并且可以进一步研发定量或半定量检测试纸条以及通用检测试纸条，因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。

近十年以来，以核酸检测为基础的分子诊断技术在感染性疾病的诊断、病原微生物的鉴定和分型、耐药基因的分析、抗病毒疗效的监测以及提高血液制品的安全性都起到越来越重要的作用。相对传统的病原微生物培养和显微技术等形态学鉴定方法，核酸检测方法对用传统的技术和方法很难鉴定的感染因子及根据表型分类困难的菌株更显示出其明显的优越性。核酸检测具有直接、快速、灵敏和特异性好的特点，对疾病的早期诊断起着重要的作用，有利于患者获得及时有效的治疗。目前以核酸检测为基础的分析主要包括3个基本的步骤：核酸的抽提、用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)或逆转录-PCR(reversetranscription PC，RT-PCR)及其他的基因扩增技术扩增目的基因以及基因扩增产物的检测。

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是最常见也是对人们生命健康威胁最大的传染性疾病。目前全世界约有3.5亿人感染HBV，占全部人口的6％。HBV主要通过体液传播，其中输血传播也是感染HBV的重要途径。虽然几乎所有的献血源都要经过HBV的筛查，但是由于目前我国对HBV的筛查仍然是以检测病原体抗原为主的免疫检测，对于处于“窗口期”(“窗口期”是病毒感染后到机体产生特异性抗体的这段时间，由于体内不管是病毒含量还是抗原的滴度都非常低，检测非常困难，往往漏检)的病人，隐匿感染的慢性携带者，血清中抗原或抗体滴度低于目前检测水平以及感染变异毒株患者，目前的检测方法却可能造成漏检，存在很大的生物安全隐患。以HBV核酸检测为基础的实时荧光定量PCR可以灵敏特异的检测患者体内低拷贝的HBV，但是需要昂贵的荧光定量PCR仪和经过专业训练的检验师对检测结果进行分析，不利于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查。

目前没有一种既具备荧光定量PCR的特异性、灵敏性又具备胶体金标记检测的便捷性的病原体快速检测方法及试剂盒。

发明内容

本发明提供一种病原体的核酸金标快速检测方法，结合胶体金标记技术和核酸PCR检测技术的优点，除PCR仪之外不依赖任何仪器，对传染病爆发流行时的大规模筛查以及血液制品的筛查具有重要的意义，特别检测HBV病毒早期感染，筛查献血源中的潜在HBV携带者，保障血液制品的安全性；早期、特异、灵敏、经济的检出病原体也是今后传染病病原体筛查的发展方向。

病原体的核酸金标快速检测方法，包括如下步骤：

(1)采用对病原体DNA特异的引物扩增待测患者的血液DNA；

(2)在上步扩增产物中加入两条对所述引物扩增的DNA片段特异的探针，退火杂交，两条探针各标记有一种半抗原；

(3)制备检测试纸，试纸一端至另一端依次包括样品吸收垫、胶体金垫、检测区；所述胶体金结合垫上固定有抗一种半抗原且与胶体金偶联的单克隆抗体；所述检测区设置有检测线，检测线上固定有抗另一种半抗原的单克隆抗体；

(4)在检测试纸的样品吸收区加步骤(2)所得的杂交液。

所述一条探针标记的半抗原为生物素，另一条探针标记的半抗原为地高辛；所述胶体金垫区固定胶体金标记且抗地高辛的单克隆抗体，所述检测带上固定有抗生物素的单克隆抗体。

所述病原体为乙型肝炎病毒，所述探针对乙型肝炎病毒基因具有特异性，且能够同时识别A～H 8种基因型的乙型肝炎病毒的S区基因序列。

所述引物为两对巢式引物，具有如下序列：

Outer Primer1：5-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3，

Outer Primer2：5-CGAACCACTGAACAAATGGC-3：

Inner Primer1：5-AGRTRGGAGYGGGAGCATTCGG-3，

Inner Primer2：5-GGCACTAGTAAARTGAGCCA-3(R为A和G；Y为C和T)；

所述探针具有如下序列：

Probe1：5-TCCTCCRAYTTGTCCTGGNTAT-3，

Probe2：5-TCTCHTGGCTCARTTTACTAG-3(R为A和G；Y为C和T；H为A，T，G和C)。

所述检测试纸采用高蛋白亲和性的高分子纤维素膜作为固相载体。

所述检测区还设置有质控线，所述质控线上固定有羊抗鼠单克隆抗体。

一种检测病原体的胶体金标检测试剂盒，包括胶体金标试纸条，胶体金垫区固定有胶体金标记的且抗一种半抗原的单克隆抗体，检测区固定有抗另一种半抗原的单克隆抗体。

所述试剂盒还包括盛装着对待测病原体基因特异的特异性引物的引物管和盛有探针的探针管，所述探针特异性识别所述特异性引物扩增的序列，所述探针为两条，一条探针标记有与胶体金垫区的单克隆抗体特异性结合的半抗原，另一条探针标记有与检测区固定的单克隆抗体特异性结合的半抗原。

所述半抗原指生物素或地高辛。

所述病原体指乙型肝炎病毒，所述引物为两对巢式引物，具有如下序列：

Outer Primer1：5-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3，

Outer Primer2：5-CGAACCACTGAACAAATGGC-3；

Inner Primer1：5-AGRTRGGAGYGGGAGCATTCGG-3，

Inner Primer2：5-GGCACTAGTAAARTGAGCCA-3(R为A和G；Y为C和T)；

所述探针具有如下序列：

Probe1：5-TCCTCCRAYTTGTCCTGGNTAT-3，

Probe2：5-TCTCHTGGCTCARTTTACTAG-3(R为A和G；Y为C和T；H为A，T，G和C)。

本发明“病原体的核酸金标快速检测方法”，是先对待测对象的血液或细胞的DNA进行特异性PCR扩增，所用的特异性引物是对目标病原体DNA特异的引物；接着采用对特异性引物扩增出来的核苷酸序列特异性识别且为半抗原所标记的一对寡核苷酸探针与PCR扩展产物杂交，其中一条作为捕获探针，另一条作为检测探针，两条探针标记的半抗原不相同；然后在检测试纸上检测杂交液中是否有待检病原体的核苷酸序列，所用的检测试纸为胶体金标试纸，其特点在于，胶体金垫上固定的与胶体金偶联的抗体是抗一条探针上的半抗原的单克隆抗体，检测带上固定的抗体为抗另一条探针上的半抗原的单克隆抗体。检测时，先通过PCR扩增，将待检物DNA信号扩大，然后加入半抗原标记的探针，使之与扩增片段退火杂交，然后杂交液加在检测试纸样品区后，在检测试纸的载体材料如硝酸纤维膜的毛细作用下，杂交液向胶体金垫区移动，杂交液中与探针杂交的扩展产物被胶体金标记的单克隆抗体捕获形成PCR产物一半抗原标记的探针-胶体金标记抗体复合物，复合物继续在毛细作用下向检测区移动，复合物上的另一条探针所带的半抗原与检测带上的单克隆抗体特异抗体结合，使胶体金标记的复合物在检测带聚集显色形成肉眼可见的阳性检测带；而那些非特异性扩增产物或游离的探针等核苷酸片段，将在毛细作用下继续向前移动从而与阳性扩增条带分离开。本检测方法结合了PCR方法的灵敏性，但不需要凝胶电泳、荧光染色或紫外灯观察检测结果等步骤和设备，而是结合酶联免疫原理，在检测试纸上直接观察检测结果，有以下几点优点：(1)特异性强：设计的探针高度保守，检测试纸以抗探针上标记的半抗原的高特异性单克隆抗体制备，交叉反应很低。2)敏感性高：血清样本首先经过PCR的扩增，将样本中少量的病原体核酸数量级放大，抗生物素抗体和抗地高辛抗体又分别与探针上的标记物生物素和地高辛结合，级联放大检测的信号使得其检测灵敏度进一步提高，检测灵敏度可达10IU/ml的病毒载量，克服了经典的酶免疫反应快速检测试纸条灵敏度较差的缺点。(3)操作简便：病原体的核酸检测除了常规的PCR仪外不需要其他辅助设备。PCR后，加入杂交探针退火杂交，直接将试条插入待检样本中，然后取出平放即可。(4)检测结果形象、准确、快速：包括PCR在内整个检测过程在3h内完成，肉眼直接判定检测结果。两条棕红色条带为阳性，一条棕红色条带为阴性。

本发明中，用于标记寡核苷酸探针的半抗原优选生物素和地高辛。用化学法对合成的寡核苷酸探针进行标记，标记好的寡核苷酸探针需要用反相高压液相色谱法纯化，分光光度仪测定其浓度，质谱分析，毛细管电泳和反相阴离子高压液相色谱法测定其纯度以及结构修饰情况，以获得高纯度、高特异性、高灵敏度的标记探针。生物素和地高辛标记的探针稳定，不易失活，交叉反应少。以生物素标记的探针作为捕获探针，另一条探针用地高辛标记作为检测探针，抗地高辛的特异性单克隆抗体用胶体金标记，固定在胶体金垫上；抗生物素的抗体固定在检测带上。

本发明的一个重要的贡献在于提供了乙型肝炎病毒(HBV)的核酸金标快速检测方法，其特点在于提供了两对HBV特异性引物及与对引物扩增的序列特异性识别的一对半抗原标记的探针，HBV序列特异性探针的设计是从HBV A-H 8种基因型的基因序列中通过同源比对，选取HBV基因序列S区的高度保守区序列，并符合探针的一般要求，长度20-25个核苷酸，GC含量50-60％，杂交温度68-72℃，避免多个重复碱基出现，尤其要避免4个以上的G。并将设计的探针在NCBI中进行同源比对，保证其高度的特异性，可以用于检测乙肝病毒。由于本检测方法的敏感性与荧光定量PCR相同但不需要昂贵的荧光定量PCR仪和经过专业训练的检验师对检测结果进行分析，特别适合于处于“窗口期”的病人、隐匿感染的慢性携带者、血清中抗原或抗体滴度低于目前检测水平以及感染变异毒株患者。

本发明采用的检测试纸可通过现有的金标试纸制备方法制作，试纸上固定的单克隆抗体的制备也为常规方法制备。本发明优选使用高分子纤维膜作为固相载体，该膜具有很强的蛋白吸附功能。

根据本发明的检测病原体方法的原理，还提供一种检测病原体的胶体金检测试剂盒，其中主要包括检测胶体金标检测试纸条，试纸条的胶体金垫区固定有胶体金标记的且抗一种半抗原的单克隆抗体，检测区固定有抗另一种半抗原的单克隆抗体。半抗原可以是生物素、地高辛，或本领域常用的其它能标记在核苷酸链上的可作为半抗原的物质。检测时结合标记有地高辛及生物素的探针一起使用。

为了进一步方便检测，本发明优选提供一种既包括上述检测试纸条的试剂盒，还在试剂盒中增加了对病原体特异的引物的试剂管，及探针试剂盒管，探针标记着试纸条上的单克隆抗体特异性识别的半抗原。

本发明采用的检测试纸的膜反应体系由以下部分组成，其层结构示意图见图2：

检测垫8：高蛋白亲和性的高分子硝酸纤维素膜，经预处理后制备为反应膜用来作为系统反应的载体和显示反应结果。

样品吸收垫6(M2a、M2b、M3)：分别选用有较强吸水能力的无纺布和玻璃纤维，经特殊处理后，为反应系统提供适合的反应条件，并帮助吸取样本。

胶体金垫7：吸附力较强的高分子纤维素膜，作为胶体金标记抗体的固相载体。

吸水垫5：吸收检测后的样本。

塑料基板：作为反应体系的支撑物。

不同规格的双面和单面胶带：用于固定各反应膜和吸水材料于M6上。

透明保护胶带：固定和保护样本垫和胶体金垫

彩色标志胶带：作为该检测试条的特征标识。

将检测垫8分为质控区和检测区。在质控区包被羊抗鼠IgG形成质控对照线9，在检测区包被抗生物素的特异性单抗形成反应检测线10(T)。

本发明的预期反应状况及结果

·阴性(-)：出现一条紫红色条带。位于质控区(C)内。如样本中不含HBV的核酸扩增产物，胶体金抗体在层析过程中不会与固定在膜上检测带内的抗体反应，因而测试区内(T)不会出现一条紫红色检测带。无论HBV的核酸是否存在样品中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够样品液，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。阴性结果表明：待检样品中不含HBV的核酸。

·阳性(+)：质控区(C)出现一条紫红色条带，在测试区(T)内同时出现紫红色条带。如果待检样品中存在HBV核酸的扩增产物，PCR产物-半抗原标记的探针-胶体金标记抗体反应复合物中标记探针的生物素与检测带上抗生物素的特异性抗体结合，因此在测试区内(T)出现紫红色检测带。阳性结果表明：待检样品中存在HBV核酸的扩增产物。

·无效：质控区(C)未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。

附图说明

图1本发明核酸金标快速检测方法的原理示意图

图2膜反应体系层膜层结构示意图

其中1-生物素标记的捕获探针、2-待测病原体的特异性序列，3-地高辛标记的检测探针，4-胶体金标记的抗地高辛单克隆抗体；5-吸水垫，6-样品吸收垫，7-胶体金结合垫，8-检测垫，9-质控线，10-检测线

具体实施方式：

实施例1.引物、探针的设计

步骤1.HBV核酸扩增引物的设计

根据HBVA-H 8种基因型共818条基因序列的同源比对，并分析其型间和型内保守性和特异性，选取基因序列相对保守的S区作为PCR扩增区域，设计两对PCR引物，其序列如下：

Outer Primer1：5-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3

Outer Primer2：5-CGAACCACTGAACAAATGGC-3

Inner Primer1：5-AGRTRGGAGYGGGAGCATTCGG-3

Inner Primer2：5-GGCACTAGTAAARTGAGCCA-3(R为A或G；Y为C或T).

通过套式PCR的方法对样本进行PCR扩增，保证了PCR扩增的灵敏性和特异性。步骤2.HBV寡核苷酸探针的设计和标记

根据HBV A-H 8种基因型基因序列的同源比对，选取步骤1设计的套式PCR内巢扩增的序列来设计寡核苷酸探针，探针序列要求高度保守又能覆盖8种不同的基因型，长度为20～25个核苷酸，GC含量在40-60％之间，杂交温度在68-72℃之间，避免单个碱基连续重复出现，尤其要避免4个以上的G，这样设计的探针具有高度的特异性，避免非特异杂交。

本发明设计的探针序列如下：

Probe1：5-TCCTCCRAYTTGTCCTGGNTAT-3

Probe2：5-TCTCHTGGCTCARTTTACTAG-3(R为A或G；Y为C或T；H为A、T、G或C)。

上述一对探针分别用化学方法对其进行生物素和地高辛标记。标记后的探针用反相高压液相色谱法纯化，分光光度仪测定其浓度，质谱分析、毛细管电泳和反相阴离子高压液相色谱法测定其纯度以及结构修饰情况，以获得高纯度、高特异性、高灵敏度的标记探针。

实施例2.制备检测试纸

步骤1抗半抗原生物素和地高辛的特异性单克隆抗体的制备

1)动物的免疫和血清抗体效价的测定

用与多聚赖氨酸偶联的生物素和地高辛作为抗原，分别免疫8-12周龄的纯系BALB/C雌鼠，免疫结束后3天眼眶取血，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清抗体效价确定免疫效果。在融合前3天进行一次加强免疫。

2)无菌条件下取出有效免疫小鼠的脾脏，制备脾细胞悬液并计数。用存活率不低于95％生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0，计数。在聚乙二醇的促融作用下，促进脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0的融合。融合的细胞在HAT培养系统中选择培养，只有融合的杂交瘤细胞得以繁殖生长。融合后3-5天镜检各培养孔克隆状况，记录克隆数。待克隆长至孔底面积的1/3-1/2，用ELISA检测培养上清中是否含有所需的特异抗体存在，确定杂交瘤细胞的阳性情况。

3)阳性杂交瘤细胞的扩大培养及克隆化筛选

将阳性孔细胞吹打脱落，由96孔板转至24孔板，进而扩大至6孔板，再至培养瓶，扩大到一定程度后，冻存保种。采用有限稀释法进行克隆化培养。

4)单克隆抗体腹水的制备

BALB/C小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml。1周后，将抗生物素和地高辛的单抗杂交瘤细胞注射于以上预先处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞1～3×10⁶。10天后收获腹水，以上过程皆在无菌条件下完成。

5)抗生物素和抗地高辛单克隆抗体的纯化

a.以DEAE离子交换层析及Sephacryl S 300分子筛对单抗进行纯化；SDS-PAGE垂直电

泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；

b.纯化过程：取小鼠单抗腹水→3000rpm离心15分钟→上清液加50％硫酸铵沉淀，过夜→3000rpm离心20分钟→沉淀溶于0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)→S300凝胶柱→DEAE Blue层析柱→0～800mM NaCl梯度洗脱→超滤离心，浓缩单抗；

c.单抗纯度测定：常规SDS-PAGE电泳，上述方法所纯化的单抗的纯度皆在95％以上；

d.蛋白浓度测定：紫外分光光度计测定280nm处的O.D.值，按以下公式计算蛋白含量：OD₂₈₀/1.4＝mg/ml(纯化单抗)。将单抗浓度调节为约1mg/ml；

e.单抗活性测定：牛血清白蛋白(BSA)-生物素及BSA-地高辛分别包被ELISA板(1μg/孔)，用间接ELISA法测定各单抗效价(大于1∶5000)。

步骤2羊抗鼠抗体高效价免疫抗血清的制备和纯化

1)纯化好的抗生物素单克隆抗体+完全佐剂→免疫山羊→加强免疫二次，每次间隔一月→第二次加强后10天左右取血→离心取血清→硫酸铵沉淀→DEAE离子交换层析纯化；

2)效价测定：ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于1∶256；

3)蛋白浓度测定：紫外分光法测定OD₂₈₀，计算蛋白浓度。

步骤3.胶体金及金标抗体制备

1)胶体金的制备：以柠檬酸盐还原法制备40～60nm的胶体金。将0.01％氯金酸(HAuCl₄)加热至沸加入一定量的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，继续加热煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由兰→紫→红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期保存，可加入0.02％NaN₃。

2)将胶体金液500ml用0.1M NaOH调pH8.4，磁力搅拌下缓慢加入抗地高辛的单抗2ml，搅拌20分钟。5500rpm离心30Min，除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体金标记抗体沉淀，沉淀溶于10ml保存液中，用0.45μm微孔滤膜过滤。取样进行检定，其余置4℃保存。

步骤4.检测垫8的制备

1)将抗生物素的单抗及纯化的羊抗鼠IgG以0.1M磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约0.2-2mg/ml。

2)硝酸纤维素膜大小：10cm×27cm，每张膜可喷长25cm的检测及控制带各4条；

3)将以上两种溶液分别加入Biodot XYZ3000喷涂机的二个喷头储存瓶中；

4)设置喷速为2μl/cm，NC膜的移行速度为50mm/s。以抗生物素的单抗(2mg/ml)在检测垫8上包被反应检测线10；以1.0mg/ml羊抗鼠IgG包被反应质控线9，质控线与检测线的距离为4-4.5mm；

5)完成包被后，置37℃干燥箱24小时，用BB封闭液封闭处理半小时，用WB洗液抽洗一次；

6)37℃干燥箱干燥备用；

7)切制备好的硝酸纤维素膜：1.8cm×27cm/条，放入铝薄袋中密封干燥保存。置室温保存备用。

步骤5.膜反应体系M2a、M2b及M3的制备

将无纺布(M2)和玻璃纤维(M3)浸泡于M溶液(溶液配方为0.5％BSA，0.01％tween-20，0.01M PH7.0PBS，0.2‰NaN_3，)中，浸透后，取出晾干，装入塑料袋中，室温保存。

1)M2a制备：将制好的无纺布切27cmx1.2cm/条；

2)M2b制备：将制好的无纺布切27cmx1.8cm/条；

3)M3制备：将制好的玻璃纤维切27cmx1.2cm/条。

步骤6胶体金垫7的制备

1)取胶体金-单抗复合物4，加入稀释液，混匀配成工作浓度；

2)将胶体金-单抗复合物4的溶液加入喷涂机Biodot的Airjet喷头储存瓶中；

3)设定压力为15PSI，玻璃纤维膜的移动速度为50mm/s；

4)喷制规格为0.5-1.5cm×25cm/条，每条喷2遍；

于37℃烘干12小时，放入铝薄袋中，加入干燥剂，热合封口，室温保存。步骤7反应体组装(示意图如图2)

1)在塑料基板上贴双面胶带二条；

2)在双面胶中间贴检测垫8(18mm)，离塑料基板上缘约22mm；

3)在双面胶上贴吸水垫5(22mm)，与塑料基板上缘对齐并与检测垫8上缘交1mm；

4)在双面胶上贴步骤5中制备的M2a(12mm)，与检测垫8下缘相接；

5)在M2a上贴胶体金垫7(10mm)，压住检测垫下缘约0.5mm；

6)在双面胶上贴步骤5中制备的M3(12mm)，上缘压住胶体金垫的2/3；

7)在双面胶M7上贴步骤5中制备的M2b(18mm)，上缘压住胶体金垫约2/3，下缘与双面胶的下缘对齐；M2b与M3重叠部分构成样品吸收垫6

8)在胶体金垫7和双面胶上贴透明保护胶带，上缘完全压住胶体金垫，并压住检测垫8约1.5mm；

9)在吸水垫5上贴彩色标记胶带，与检测垫上缘交1mm，另一端翻过塑料基板上缘，贴于塑料基板的被面；

将组装成型的检测试纸用全自动切条机切成3.5mm规格。

实施例4乙型肝炎病毒检测

1)检测样本处理及准备

20份经荧光定量PCR及乙肝五项检测证实含有不同乙型肝炎病毒载量的阳性血清和10份阴性对照血清为待测标本验证本发明的检查方法及设计引物和探针的特异性，每份分别取200μl，用高纯度的病毒核酸抽提试剂盒(High Pure viral nucleic acid kit，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)提取病毒核酸，提取的病毒核酸溶解在50μl无核酸的双蒸水中，-80℃保存，备用。

2)套式PCR(tested PCR)扩增HBV的S区片段。

10μl     DNA模板

5μl      10×buffer

0.4μl    10mM dNTP

10pmol    引物

1U        Taq酶

ddH₂O     补足50μl

反应体系  50μl

PCR循环条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸60sec；外巢引物扩增20个循环，内巢引物扩增35个循环。

3)在扩增产物中加入20pmol探针，100℃加热5min，冷却至室温成为待检的样品液。

4)检测及结果

检测：将检测试纸的样品端垂直向下，插入准备好的样品液中，(样品端浸没入样品液的深度约为0.5cm)，吸水材料使待检样品缓慢上移，膜反应体系被启动。

无论HBV的核酸扩增产物是否存在于血清样品中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够的样品液，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。

结果判定：

1)如样本中不含HBV的核酸扩增产物，游离的胶体金标记抗体在层析过程中不会被固定在检测带的单抗特异性捕捉而聚集，因而测试区内(T)不会出现一条紫红色检测带，显示阴性(-)结果，即仅在质控区(C)内出现一条紫红色条带。阴性结果表明：待检样品中不含HBV的核酸扩增产物。

2)如果待检样品中含有HBV的核酸扩增产物，胶体金标记的抗地高辛抗体可以与杂交后核酸扩增产物上探针标记物地高辛结合，反应复合物可因“灯芯引流现象”作快速定向泳动，另一条探针上的标记物生物素与固相膜上抗生物素的单克隆抗体特异结合，形成特异的金标记复合物红色沉积线。在测试区内(T)将出现另一紫红色检测带，显示阳性(+)结果，即在质控区(C)和检测区内各出现一条紫红色条带。阳性结果表明：待检血清样本中含有HBV的核酸。注意：测试区(T)内的紫红色条带可显现出颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，都应判定为阳性结果。

3)如质控区(C)未出现紫红色条带，则检测结果无效，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。

经实验数据证明，20份阳性血清的检测结果为两条检测带，10份阴性对照血清只在质控区出现一条带。说明本发明检测方法的可行性，及设计的乙肝病毒特异性引物和探针具有针对乙肝病毒核酸的特异性。

本发明检测方法的优点在于：

1)特异性强：设计的HBV探针高度保守并覆盖A-H 8种基因型，检测试条以高特异性抗生物素和抗地高辛的单克隆抗体制备，交叉反应很低。

2)敏感性高：血清样本首先经过PCR扩增，将血清样本中少量的HBV核酸数量级放大，抗生物素抗体和抗地高辛抗体又分别与探针上的标记物生物素和地高辛结合，级联放大检测的信号使得其检测灵敏度进一步提高，检测灵敏度可达10IU/ml的病毒载量。

3)操作简便：HBV的核酸检测除了常规的PCR仪外不需要其他辅助设备。PCR后，加入杂交的探针退火，直接将试条插入待检样本中，然后取出平放即可。

4)检测结果形象、准确、快速：包括PCR在内整个检测过程在3h内完成，肉眼直接判定检测结果。两条棕红色条带为阳性，一条棕红色条带为阴性。

SEQUENCE LISTING

<110>蓝十字生物药业(北京)有限公司

<120>病原体的核酸金标快速检测方法及试剂盒

<130>P10147/LSZ

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒特异性引物Outer Primer1

<400>1

tcaccatatt cttgggaaca aga                      23

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒特异性引物Outer Primer2

<400>2

cgaaccactg aacaaatggc                          20

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒特异性引物inner primer 1

<220>

<221>variation

<222>(10)..(10)

<223>y is c ort

<400>3

agrtrggagy gggagcattc gg                       22

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒特异性引物inner primer 2

<220>

<221>variation

<222>(13)..(13)

<223>ris aorg

<400>4

ggcactagta aartgagcca                       20

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>探针

<220>

<221>variation

<222>(7)..(7)

<223>r is a or g

<220>

<221>variation

<222>(9)..(9)

<223>y is c or t

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>n is a，c，g，or t

<400>5

tcctccrayt tgtcctggnt at                    22

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>探针2

<220>

<221>variation

<222>(5)..(5)

<223>h is a，c，g，or t

<220>

<221>variation

<222>(13)..(13)

<223>r is a or g

<400>6

tctchtggct cartttacta g                      21

Claims (4)

1.病原体的核酸金标快速检测方法，包括如下步骤：

（1）采用对病原体DNA特异的引物扩增待测患者的血液DNA；

（2）在上步扩增产物中加入两条对所述引物扩增的DNA片段特异的探针，退火杂交得到杂交液，两条探针各标记有一种半抗原；

（3）制备检测试纸，试纸一端至另一端依次为样品吸收垫、胶体金垫、检测区；所述胶体金结合垫上固定有抗一种半抗原且与胶体金偶联的单克隆抗体；所述检测区设置有检测线，检测线上固定有抗另一种半抗原的单克隆抗体；

（4）在检测试纸的样品吸收区加步骤（2）所得的杂交液；所述一条探针标记的半抗原为生物素，另一条探针标记的半抗原为地高辛；所述胶体金垫区固定胶体金标记且抗地高辛的单克隆抗体，所述检测带上固定有抗生物素的单克隆抗体；所述病原体为乙型肝炎病毒，所述探针对乙型肝炎病毒具有特异性，且能够同时识别A～H8种基因型的乙型肝炎病毒基因序列；所述引物为两对巢式引物，具有如下序列：

Outer Primer1:5-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3，

Outer Primer2:5-CGAACCACTGAACAAATGGC-3；

Inner Primer1:5-AGRTRGGAGYGGGAGCATTCGG-3，

Inner Primer2:5-GGCACTAGTAAARTGAGCCA-3,其中R为A或G；Y为C或T；

所述探针具有如下序列：

Probe1:5-TCCTCCRAYTTGTCCTGGNTAT-3

Probe2:5-TCTCHTGGCTCARTTTACTAG-3，其中R为A或G；Y为C或T；H为A、T、G或C。

2.根据权利要求1所述的病原体核酸金标快速检测方法，所述检测试纸采用高蛋白亲和性的高分子纤维素膜作为固相载体。

3.根据权利要求2所述的病原体核酸金标快速检测试方法，所述检测区还设置有质控线，所述质控线上固定有羊抗鼠抗体。

4.一种病原体的胶体金标检测试剂盒，包括胶体金标试纸条，胶体金垫区固定有胶体金标记且抗一种半抗原的单克隆抗体，检测区固定有抗另一种半抗原的单克隆抗体；还包括盛装着对待测病原体基因特异性引物的引物管和盛有探针的探针管，所述探针特异性识别所述特异性引物扩增出的序列，所述探针为两条，一条探针标记有与胶体金垫区的单克隆抗体特异性结合的半抗原，另一条探针标记有与检测区固定的单克隆抗体特异性结合的半抗原，所述半抗原为生物素和地高辛；

所述病原体指乙型肝炎病毒，所述引物为两对巢式引物，具有如下序列：

Outer Primer1:5-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3，

Outer Primer2:5-CGAACCACTGAACAAATGGC-3；

Inner Primer1:5-AGRTRGGAGYGGGAGCATTCGG-3，

Inner Primer2:5-GGCACTAGTAAARTGAGCCA-3，其中R为A或G；Y为C或T；

所述探针具有如下序列：

Probe1:5-TCCTCCRAYTTGTCCTGGNTAT-3

Probe2:5-TCTCHTGGCTCARTTTACTAG-3，其中R为A或G；Y为C或T；H为A、T、G或C。

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