CN108291210A - 生产和纯化含核酸组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于生产和纯化含核酸的组合物的改进方法，如非天然存在的病毒，例如可以用作溶瘤剂的重组脊髓灰质炎病毒。一些所描述的改进方法涉及生产病毒DNA模板的改进方法。还描述了用于含核酸的组合物的层析纯化的改进方法，其中使用含核酸的组合物的一种或多种核酸序列的快速检测方法定量层析级分中的核酸，如通过实时RT‑qPCR检测。另外，描述了用于生产和纯化溶瘤性脊髓灰质炎病毒如PVS‑RIPO的改进方法。还提供了使用这些方法生成的组合物。

Description

生产和纯化含核酸组合物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年6月10日提交的美国临时申请No.62/173,777的优先权，其通过引用并入本申请。
领域
本申请公开了用于制造含核酸组合物的方法，所述组合物包括可用作抗癌剂或疫苗的基于病毒的高纯度核酸组合物，例如基于重组RNA的病毒(例如重组脊髓灰质炎病毒)。本申请还提供了使用这种方法产生的组合物。
背景
基于核酸的生物药物可用于防护或治疗各种疾病和病症。例如，基于DNA的疫苗可以用作用于治疗或预防感染性疾病的保护性或治疗性疫苗，重组逆转录病毒载体可以用于基因治疗，并且可以产生选择性地破坏肿瘤细胞的溶瘤病毒。已经鉴定了几种类型的病毒作为潜在的溶瘤剂，例如腺病毒，牛痘病毒和单纯疱疹病毒。
导致人类脊髓灰质炎的脊髓灰质炎病毒是小核糖核酸病毒(Picornaviridae)家族的小RNA病毒。修饰的减毒形式的脊髓灰质炎病毒可能用作载体，将核酸序列递送至人脑，因为脊髓灰质炎病毒可能通过穿过血脑屏障并结合CD155受体而感染中枢神经系统，如Gromeier等(Virology 2000 273(2)：248-57)所讨论的。修饰的减毒形式的脊髓灰质炎病毒的一种潜在应用是用于生产治疗脑恶性肿瘤如神经胶质瘤和成神经管细胞瘤的治疗性溶瘤组合物。
在基于核酸的生物药物领域，临床应用和临床产品如溶瘤病毒的制造需要大量高度纯化的核酸材料。因此，需要一种降低复杂程度并减少成本的有效生产和纯化工艺，从而产生足量的高纯度核酸物质。
概要
本申请公开了用于生产纯化的活病毒(例如重组脊髓灰质炎病毒)的方法或方法，其分别或组合地使用(i)产生病毒模板质粒的改进方法和(ii)纯化活病毒的改进方法，包括在柱色谱分离期间或之后的快速检测步骤。产生病毒模板质粒(例如包括用于RNA病毒的DNA模板的质粒)的改进方法解决了宿主(如细菌)细胞中质粒的遗传不稳定性问题，该质粒含病毒基因(如重组脊髓灰质炎病毒)，且该质粒通常在该宿主中繁殖。例如，当这种模板的遗传不稳定性问题存在时，该方法可用于在细菌细胞中产生病毒DNA模板。本申请所示的提高产物产率和/或纯度并降低纯化时间的病毒纯化改进方法，通常适用于纯化任何含有核酸分子的组合物，如基于病毒的组合物，可用于纯化活的天然或重组病毒，例如临床应用所需的那些病毒。
在一个实施例中，生产病毒模板质粒的改进方法是产生含有病毒模板序列(例如RNA病毒的相应DNA序列，如重组脊髓灰质炎病毒)的质粒DNA(例如，细菌质粒)的方法，其中可以被称为“病毒模板质粒”，或者更具体地称为“重组脊髓灰质炎病毒质粒DNA模板”。“改进的方法包括用病毒模板质粒(例如减毒重组脊髓灰质炎病毒质粒DNA)转化宿主细胞(例如细菌宿主细胞)，在固体培养基上生长转化细胞，并选择含有正确质粒序列(例如重组脊髓灰质炎病毒质粒DNA序列)的克隆。在液体培养物中繁殖含有正确质粒序列(例如，非空质粒，未重组的)的宿主细胞，从繁殖的宿主细胞中提取病毒模板质粒(例如重组脊髓灰质炎病毒质粒DNA)。进行细胞繁殖和提取步骤而不冷冻在繁殖步骤中产生的物质，这降低了质粒遗传的不稳定性和病毒模板序列中所导致的错误风险。在一些实施例中，将提取的病毒模板质粒线性化并在体外转录以产生感染性的裸病毒RNA，其随后用于感染哺乳动物细胞。受感染的哺乳动物细胞可以在多步骤过程中在培养物中扩增(可以称为“扩张”)并且生长，以产生活病毒，随后进行纯化(例如使用所公开的改进方法)。
用于产生含质粒的分离的质粒DNA组合物的方法，所述质粒包含了一个或多个病毒模板序列，所述方法可以包括，例如通过转化将包含一个或多个病毒模板序列的质粒DNA引入到一个或多个宿主细胞(例如细菌细胞)中，从而产生用分离的质粒DNA转化的一个或多个细胞。在一些实施例中，引入宿主细胞的质粒DNA来自原种(例如来自细胞库)。在其他实施例中，将导入宿主细胞中的质粒DNA纯化或分离。例如在选择条件下，转化的细胞在固相培养物上生长，由此产生一个或多个克隆(例如细菌克隆)。测试一个或多个克隆中是否存在来自一个或多个病毒模板序列的一个或多个核酸序列(例如，以确保质粒中存在所需的病毒序列)。，包含了一个或多个病毒模板序列，对检测到有一种或多种核酸序列存在的一个克隆(或多个克隆)的宿主细胞液体培养物进行增殖。从转化细胞中提取或去除含有源自增殖转化细胞的一个或多个病毒模板序列的质粒DNA，由此产生分离的质粒DNA组合物。在这样的方法中，转化细胞在繁殖步骤和提取步骤之间不暴露于冷冻条件(例如-20℃或低于-20℃的温度)。
本公开内容还提供了用于纯化含核酸组合物，例如活病毒，例如活重组脊髓灰质炎病毒的改进方法。这种方法可用于获得纯化的含核酸分子的组合物，如病毒。这种改进的方法可以全部或部分地应用于各种含核酸组合物的生产和纯化，包括但不限于生产和纯化基于减毒和灭活病毒的核酸组合物和质粒DNA纯化。方法包括两个柱层析分离步骤(尺寸分离后进行阴离子交换)和通过快速检测过程如定量聚合酶链式反应(qPCR)在柱层析级分中检测靶核酸(例如活的重组脊髓灰质炎病毒)。快速检测色谱级分中靶核酸的特定序列增强了整体纯化的一致性和稳健性，并减少了所用色谱步骤的数量，从而降低了其复杂性和成本。快速检测还降低总体纯化时间，并且提高靶核酸(例如活重组脊髓灰质炎病毒)的产量和/或纯度。因此，示例性的纯化方法是快速、有效的，并且出乎意料地提高了靶核酸分子(例如活重组脊髓灰质炎病毒)的产量和/或纯度。
在具体实施例中，提供了产生病毒宿主细胞的方法，所述宿主细胞感染有非天然存在的基于RNA的病毒(例如，非天然存在的脊髓灰质炎病毒)。这样的方法可以包括将含有非天然存在的基于RNA的病毒的模板序列的质粒DNA(例如，细菌质粒)引入一个或多个宿主细胞(例如细菌细胞)中，由此产生用质粒DNA转化的宿主细胞。在一些实施例中，引入宿主细胞的质粒DNA来自原种(例如来自细胞库)。在其它实施例中，将导入宿主细胞中的分离的质粒DNA纯化或分离。例如在选择性条件下，转化的细胞在固相培养物中生长，从而产生一个或多个克隆(例如细菌克隆)。检测一个或多个克隆中是否存在来自非天然存在的基于RNA的病毒的一个或多个核酸序列(例如，以确保质粒中存在所需的病毒序列)。例如在发酵条件下繁殖含有一个克隆(或多个克隆)的宿主细胞液体培养物，所述克隆中检测到来自非天然存在的基于RNA的病毒的一种或多种核酸序列。从转化的细胞中提取质粒DNA，所述质粒DNA包含来自繁殖转化细胞的非天然存在的基于RNA病毒的模板序列。非天然存在的基于RNA的病毒的裸RNA可选地通过模板序列的体外翻译产生。将得到的非天然存在的基于RNA的病毒的裸RNA导入到病毒宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，从而生成被非天然存在的基于RNA的病毒感染的病毒宿主细胞。这些方法不包括于繁殖和提取步骤之间将转化细胞暴露于冷冻条件(例如，-20℃或低于-20℃的温度)。
生产纯化的核酸组合物如含病毒的组合物的方法可以包括，在色谱柱(如尺寸分离柱)上分离含有核酸组合物的溶液，然后检测从色谱柱洗脱的一个或多个级分的核酸中存在的至少一种核酸序列(例如使用qPCR)，然后汇集一个或多个级分，所述级分中检测到以高于阈值量存在的至少一个核酸序列。
在一个实施方式中，提供了通过在一轮或多轮细胞培养物中培养感染脊髓灰质炎病毒的哺乳动物宿主细胞、从而纯化非天然存在的脊髓灰质炎活病毒的方法，以产生含有脊髓灰质炎病毒的液体细胞培养基；将液体细胞培养基与哺乳动物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞碎片或两者进行分离，从而产生含有脊髓灰质炎病毒的上清液；在色谱柱上分离含有脊髓灰质炎病毒的上清液；通过检测在脊髓灰质炎病毒中发现的核酸序列，检测存在于从色谱柱洗脱的一个或多个级分中的脊髓灰质炎病毒；并将其中检测到高于阈值量的核酸序列的那些级分进行汇集。
在另一个实施方式中，提供获得纯化的非天然存在的基于RNA的活病毒的方法，通过提供含有非天然存在的基于RNA的病毒的模板序列的细菌质粒原液分离的质粒DNA；将原液分离的质粒DNA导入一个或多个细菌细胞，从而产生用原液分离的质粒DNA转化的细菌细胞；培养用原液分离的质粒DNA转化的一种或多种细菌细胞的固相培养物，从而产生一个或多个细菌克隆；在至少一个细菌克隆中检测来自基于RNA的病毒模板序列的一个或多个核酸序列的存在；从其中检测到存在一种或多种核酸序列的细菌克隆中繁殖细菌细胞的培养物，其中细菌细胞在繁殖步骤和提取步骤之间不冷冻；从繁殖的细菌细胞中提取含有基于RNA的病毒模板序列的质粒DNA；通过模板序列的体外翻译产生基于RNA的病毒的裸RNA；并将基于RNA病毒的裸RNA导入病毒宿主细胞中，从而生成感染基于RNA病毒的病毒宿主细胞；在一轮或多轮细胞培养物中培养用基于RNA的病毒感染的病毒宿主细胞，以产生含有基于RNA的病毒的液体细胞培养基；从哺乳动物宿主细胞中分离液体细胞培养基、哺乳动物宿主细胞的碎片或两者，从而产生含有基于RNA的病毒的上清液；在色谱柱(例如尺寸分离柱)上分离含有非天然存在的基于RNA的活病毒上清液；通过检测在基于RNA的病毒中发现的一种或多种核酸序列(例如使用qPCR)，检测存在于从色谱柱洗脱的一个或多个级分中的基于RNA的活病毒；并将其中以高于阈值量存在的核酸序列的那些级分进行汇集。所述方法可以进一步包括将汇集的级分用于阴离子交换色谱柱，和浓缩阳性流通洗脱液。
在一个实施例中，用于获得包含非天然存在活脊髓灰质炎病毒组合物的纯化方法包括在尺寸分离色谱柱上分离含有非天然存在活脊髓灰质炎病毒的水性流体，通过定量聚合酶链式反应(qPCR)检测在非天然存在活脊髓灰质炎病毒中发现的一个或多个核酸序列，从所述尺寸分离柱中收集和汇集洗脱液的至少一个阳性级分，其包含在非天然存在活脊髓灰质炎病毒中发现的一个或多个核酸序列，并在阴离子交换色谱柱上分离汇集的阳性级分。将非天然存在活脊髓灰质炎病毒收集在来自阴离子交换色谱柱的洗脱液的至少一个阳性级分中。在一些实施例中，该纯化方法在阴离子交换色谱分离步骤之后不包含任何进一步的色谱分离步骤。因此，在一些实施例中，所述方法仅具有两个色谱分离步骤。纯化方法可以进一步包括通过透析浓缩流通洗脱液中洗脱的非天然存在活脊髓灰质炎病毒。在一些实施例中，纯化过程可以在少于8小时的时间内进行，例如4-8小时。在一些实施方式中，纯化方法的产率为≥50％，如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少83％、如50-60％、50-80％、60-80％、70-85％或50-85％。来自阴离子交换色谱柱的洗脱液的至少一个阳性级分的非天然存在活脊髓灰质炎病毒的产量可以≥50％。
含有活病毒(例如非天然存在活脊髓灰质炎病毒)的水性液体可以是液体细胞培养基，其通过包括对在一轮或多轮细胞培养中被病毒感染的病毒宿主细胞进行培养的方法获得。液体细胞培养基可以通过培养后将病毒宿主细胞、病毒宿主细胞的碎片或两者与液体细胞培养基分离来获得。细胞培养基可以通过将液体细胞培养基与能够在溶液中消化游离核酸但不包封病毒核酸的核酸酶一起孵育来获得。病毒感染的病毒宿主细胞可以通过包括以下步骤的方法获得：提供包含病毒模板序列的细菌质粒的原液分离质粒DNA；将原液分离的质粒DNA导入一个或多个细菌细胞，由此产生用原液分离的质粒DNA转化的一种或多种细菌细胞；培养一种或多种经转化细菌细胞的固相培养物，由此产生一种或多种细菌克隆；在一个或多个细菌克隆中的至少一个中检测来自病毒模板序列的一个或多个核酸序列的存在；繁殖来自至少一种细菌克隆的细菌细胞培养物，所述克隆中检测到一种或多种核酸序列的存在；从繁殖的细菌细胞中提取包含病毒模板序列的质粒DNA，其中在繁殖和提取步骤之间不冷冻细菌细胞；通过模板序列的体外翻译产生病毒(例如，非天然存在的脊髓灰质炎病毒的)的裸RNA；将病毒的裸RNA导入病毒宿主细胞，从而产生病毒感染的病毒宿主细胞。细菌质粒可以是具有大肠杆菌(E.coli)复制起点的质粒，并且其中一种或多种细菌细胞是大肠杆菌细胞。病毒宿主细胞可以是哺乳动物宿主细胞，如非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。
使用所公开的方法纯化的病毒可以是RNA病毒或DNA病毒，例如单链DNA病毒。在一个实施例中，病毒是天然或非天然存在的脊髓灰质炎病毒，例如萨宾(Sabin)病毒或溶瘤脊髓灰质炎病毒，例如PVS-RIPO。
本申请还提供了包含使用所公开方法产生的纯化病毒(或其他分析物)的组合物和试剂盒。
从参照附图进行的以下详细描述中，本申请的前述内容和其他目的和特征将变得更加显著。
附图说明
图1A显示了基于pUC19的大肠杆菌质粒载体构建体的电泳分离(溴化乙锭染色琼脂糖凝胶)结果的数字图像，其分离自模板质粒DNA转化的大肠杆菌的液体培养物，该培养物生长于冷冻大肠杆菌原液，用于重组溶瘤性脊髓灰质炎病毒PVS-RIPO。该示意图说明了从培养物中分离的正确和不正确的载体序列(1-在PVS-RIPO序列中具有转座子插入的载体；2-正确的载体序列((“PVSRIPO_kan”)；3-没有病毒模板序列的pUC19二聚体；4-没有病毒模板序列的“空”pUC19载体)。
图1B是显示图1A凝胶的扩展形式的数字图像，是与PVS-RIPO登录库中正确载体序列对照批号L0305006(左侧泳道2-4)相比，包含整合的转座子IS10R的PVS-RIPO质粒生产批号L0311005(右侧泳道6-8)的琼脂糖凝胶分析。注意由于相对泳道3(对照)的泳道7(测试)中的转座子整合引起的中心带尺寸的变化，也注意与泳道4相比泳道8中线性化质粒的分子量的增加。泳道1、5和9是1Kb加DNA分子量标记(英杰公司，Invitrogen Inc)，其中上部标记带大小约为12Kbp。泳道2和泳道6是未切割的超螺旋和开放环状PVS-RIPO形式，泳道3和7是Mun I切割质粒，泳道4和8是Sal I切割线性化质粒。
图2显示了用于生产病毒模板质粒(例如用于PVS-RIPO)的所公开的改进方法(左)和先前使用的方法(右)之间的示意性比较。
图3显示了用于生产PVS-RIPO的模板质粒DNA的改进方法的示意图。
图4是显示通过公开的改进方法生产的PVS-RIPO的模板质粒DNA的两个批号(批号1和批号2)的琼脂电泳分离的数字图像。参考是来自ACB批号L0305006的质粒DNA。两个测试样品是两个单独烧瓶装的PVSRIPO，开发批号L0401014，其不显示质粒不稳定性。
图5是对来自宿主细胞培养基的病毒(例如PVS-RIPO)的改进纯化过程示意图，所述宿主细胞培养基含有该病毒。
图6显示了来自Vero细胞培养基的PVS-RIPO病毒的改进纯化方法中所用的尺寸分离色谱。该图说明了通过测量254nm处的吸光度(顶线)和通过RT-qPCR检测PVS-RIPO序列(底线)，在琼脂糖凝胶6FF色谱级分中连续光学检测核酸的比较。表格显示了色谱级分中检测到的PVS-RIPO的量。
图7是提供PVSRIPO最终分装产品批号L0904010的生产概况流程图。
图8是PVSRIPO(PVSRIPO-kan/pUC19)质粒DNA的图谱。
图9是显示PVSRIPO质粒DNA批号L0401014生产的工艺流程图。
图10是大肠杆菌DH5α主细胞库批号L0301014的分析证书。
图11是大肠杆菌DH5α工作细胞库批号L0303011的分析证书。
图12是PVSRIPO质粒DNA批号L0401014的分析证书。
图13是显示PVSRIPO初始病毒种子批号L0402026(P0)制造概要的流程图。
图14是Vero MCB批号2003-0049的分析证书。
图15是Vero工作细胞库分析证书，批号217002-2。
图16是PVSRIPO主病毒种子批号L0403006(P1)的病毒制造工艺流程图。
图17是PVSRIPO主病毒种子批号L0403006的分析证书。
图18A-18B是细胞扩增批号L0903010，感染细胞裂解物批号L0904008和PVSRIPO净化无菌批量批号L0904009(P2)的纯化工艺流程图。
图19是PVSRIPO收获池批号L0904008的分析证书。
图20是PVSRIPO净化无菌批量批号L0904009的分析证书。
图21是PVSRIPO最终分装产品批号L0904010的分析证书。
图22是PVSRIPO毒理学批号L0603006的分析证书。
图23是PVSRIPO制造的批次记录。
图24是显示最终分装产品批号L1402001的生产过程概要流程图。
图25A-25B是显示细胞扩增批号L1310003，感染细胞裂解物批号L1311003和PVSRIPO纯化的无菌批量批号L1405001的纯化工艺流程。
图26是PVSRIPO收获池批号L1311003的分析证书。
图27是PVSRIPO净化无菌散装批号L1405001的分析证书。
图28是PVSRIPO最终分装产品批号L1402001的分析证书。
序列表
使用37C.F.R.1.822中定义的氨基酸的三字母代码和核苷酸碱基的标准字母缩写显示氨基酸和核酸序列。各核酸序列只显示一条链，但通过参考所显示的链，互补链被理解为包括在内。2016年6月10日生成并递交的序列表(3.08kb)作为参考并入文本。
SEQ ID NOS：1-13是用于实时RT-PCR测定的核酸引物和探针序列。
具体实施方式
除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学常用术语的定义可见于：Benjamin Lewin，基因七(Genes VII)，牛津大学出版社出版，1999；Kendrew等人(编)，分子生物学百科全书(The Encyclopedia of Molecular Biology)，布莱克威尔科学公司(Blackwell Science Ltd.)出版，1994；以及Robert A.Meyers(编辑)，分子生物学和生物技术：综合案头参考(Molecular Biology and Biotechnology:a ComprehensiveDesk Reference)，VCH出版公司出版，1995；和其他类似的参考文献。
如本申请所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个”和“该”是指单数以及复数形式。如本申请所使用的，术语“包含”意思是“包括”。因此，“包含核酸分子”是指“包括核酸分子”而不排除其他元素。应进一步理解的是，除非另有说明，给出的核酸的任何和所有碱基大小都是近似的，并且是为了描述的目的而提供。虽然可以使用与本申请描述的那些类似或等同的许多方法和材料，但是特别合适的方法和材料如下所述。如有冲突，以本说明书，包括对术语的解释为准。另外，这些材料，方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。包括专利申请和专利在内的所有参考文献以及与列出的登录号(截至2016年6月10日)相关的序列通过引用并入本申请。
为了便于审阅本公开的各种实施方式，提供对特定术语的以下解释：
佐剂：当与免疫原性剂(例如使用所公开的方法纯化的病毒)组合使用时，增加或以其它方式改变或修饰所得免疫应答的化合物、组合物或物质。在一些实施例中，佐剂增加免疫原性试剂在对象中诱导的抗体滴度。在另一个实施例中，如果抗原剂是多价抗原剂，则佐剂会改变对象中诱导的抗体特异性结合的特定表位序列。
示例性的佐剂包括但不限于弗氏不完全佐剂(Freund's Incomplete Adjuvant，IFA)、弗氏完全佐剂、B30-MDP、LA-15-PH、油佐剂(montanide)、皂苷、铝盐如氢氧化铝(Amphogel，惠氏实验室(Wyeth Laboratories)，麦迪逊(Madison)，新泽西(NJ))、明矾、脂质、匙孔血蓝蛋白、血蓝蛋白、MF59微乳、分枝杆菌抗原、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、聚阴离子、两亲物质、ISCOM(免疫刺激复合物，如欧洲专利EP 109942公开的那些)、植物油、卡波姆(Carbopol)、氧化铝、油乳(例如Bayol F或Marcol 52)、大肠杆菌热不稳定毒素(LT)、霍乱毒素(CT)及其组合。
在一个实施例中，佐剂包括刺激免疫激活的DNA基序，例如T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞和天然杀伤细胞的先天性免疫应答或适应性免疫应答。刺激免疫激活的DNA基序的具体非限制性实施例包括CG寡聚脱氧核苷酸(如美国专利号6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116、6,339,068、6,406,705和6,429,199所描述)以及IL-2或其他免疫调节剂。
给药：通过任何有效的途径向对象提供或给予试剂，如使用所公开的方法纯化的病毒。示例性的给药途径包括但不限于注射(例如皮下、肌内、真皮内、腹膜内、瘤内和静脉内)、口服、经皮、鼻内和吸入途径。
减毒病原体：能够产生疾病的能力降低或减弱，而类似天然病原体还具有能够刺激免疫应答能力的病原体。在另一个实施例中，通过在某些生长条件下选择无毒变体来减弱病原体(例如参见Sabin和Boulger.J.Biol.Stand.1：115-8；1973；Sutter等人，2003.脊髓灰质炎病毒疫苗–活(Polivirus vaccine--live)，第651-705页。在S.A.Plotkin和W.A.Orenstein(编辑)，疫苗(Vaccines)，第四版。W.B.桑德斯公司，费城)。典型的减毒病原体是萨宾脊髓灰质炎病毒。
接触：直接物理接触方式放置，包括固体或液体形式。接触可以体外或离体发生，例如，通过向样品(例如含有表达病毒模板质粒的细菌细胞样品)中加入试剂，或者在体内发生，通过给予对象(例如给予使用所公开的方法纯化的病毒)。
有效量：足以实现有益的或期望的结果(例如保护性免疫应答，例如抗癌应答)的药剂(例如使用所公开的方法纯化的病毒)的量。
治疗有效量可根据以下一项或多项而变化：正在治疗的对象和疾病状况，对象的体重和年龄，疾病状况的严重程度，施用方式等，其可由本领域普通技术人员容易确定。有益的治疗效果可以包括通过诊断确定；改善疾病、症状、障碍或病理状况；减少或预防疾病、症状、障碍或病症的发作；并且通常消解疾病、症状、病症或病理状态。在一个实施方式中，(例如使用所公开的方法纯化的病毒的)“有效量”是足以降低肿瘤(例如成胶质细胞瘤)的体积/大小、肿瘤重量、转移瘤数目，减少转移瘤的体积/大小、转移瘤的重量或其组合，例如减少至少10％、至少20％、至少25％、至少50％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％(与未施用治疗剂相比)。在一个实施方式中，(例如使用所公开的方法纯化的病毒的)“有效量”是足以增加体内免疫应答的量，例如对免疫原特异性抗体的产生增加至少10％、至少20％、至少25％、至少50％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少600％(与未施用治疗剂相比)。
宿主细胞：可以在其中繁殖载体并表达其核酸的细胞。细胞可以是原核或真核的。该术语还包括目标宿主细胞的任何后代。因此，宿主细胞可以是转基因的，因为它们包括已被引入细胞的核酸分子，如病毒模板质粒核酸分子。在一个实施例中，宿主细胞是病毒(如PVS-RIPO)增殖的细胞(如哺乳动物细胞)。病毒在宿主细胞中的增殖可以用于生产病毒材料(例如，用于生产PVS-RIPO的Vero细胞)，或者在一些情况下用于蛋白质表达。例如，重组杆状病毒可用于昆虫细胞中的重组蛋白表达(“杆状病毒表达系统”)。当病毒宿主细胞是生物体的一部分时，病毒增殖可以在体内或体外发生，例如在细胞培养中。
免疫应答：免疫系统细胞如B细胞，T细胞，巨噬细胞，单核细胞或多形核细胞对免疫原性试剂(如使用所公开的方法纯化的病毒)的反应。免疫应答可以包括涉及宿主防御应答的任何身体细胞，例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天性免疫应答或炎症。
应答可以对特定抗原是特异性的(“抗原特异性应答”)。在一个特定的例子中，免疫应答是T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。在另一个实施例中，应答是B细胞应答，并且导致产生针对免疫原性试剂的特异性抗体。
在一些实施例中，这样的免疫应答为对象提供免疫原性试剂或免疫原性试剂来源的保护。例如，应答可以保护诸如人类或兽医主体的对象免于病原体的感染，或者干扰病原体感染的进展。免疫应答可以是主动的并涉及对对象免疫系统的刺激，或者是由被动获得的免疫力产生的应答。
增加或减少：与对照值(例如代表无治疗剂的值)相比在数量上分别具有统计学显著的正或负变化。增加是正变化，例如与对照值相比增加至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。减少是负变化，例如与对照值相比减少至少20％、至少25％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或至少100％。在一些示例中，减小量小于100％，例如减少不超过90％，不超过95％或不超过99％。
分离的：“分离的”生物组分(如使用所公开的方法纯化的病毒)已经与含有该组分的细胞或培养基中的其它生物组分如其他核酸分子和蛋白质(例如宿主细胞染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)基本分离、从其分离产生或从其纯化。在一些实施例中，使用所公开的方法纯化的分离的病毒，或使用所公开的方法扩增的病毒模板质粒至少50％纯，例如至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.9999％或至少100％纯，例如通过残余宿主细胞(HC)DNA测量的。在一些实施例中，使用所公开的方法纯化的分离的病毒或使用所公开的方法扩增的病毒模板质粒在通过残余HC蛋白质(HCP)测量时具有较低的纯度，如至少3％纯，至少4％纯或至少5％纯(例如3-4％纯)，例如当需要总PFU增加时。即使在～3％的蛋白质纯度下，HCP的水平在治疗产品的可接受范围内。在一些实施例中，使用所公开的方法纯化的分离的病毒或使用所公开的方法扩增的病毒模板质粒当通过残余HCP测量时为至少50％纯，例如至少75％、至少80％、至少90％％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.9999％纯。
药学上可接受的载体：用于本发明的药学上可接受的载体是常规的。雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，E.W.Martin，麦克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州，第15版(1975)描述了适用于药物递送使用所公开的方法纯化的病毒的组合物和制剂。
通常，载体的性质取决于所采用的特定给药模式。例如，胃肠外制剂通常包含可注射流体，其包括药学上和生理上可接受的流体，例如水，生理盐水，平衡盐溶液，葡萄糖水溶液，甘油等作为媒介物。除生物学中性载体外，待施用的药物组合物可以包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨糖醇酐单月桂酸酯。
脊髓灰质炎病毒(PV)：小儿麻痹症(脊髓灰质炎)病原体小核糖核酸病毒科的肠道病毒。脊髓灰质炎病毒有三种血清型。示例性的脊髓灰质炎序列提供于Toyoda等，J.Mol.Biol.174：561-85，1984。
脊髓灰质炎病毒的非天然形式包括重组溶瘤性脊髓灰质炎病毒PVS-RIPO和减毒萨宾口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)，并且可以使用所公开的方法产生。PVS-RIPO是一种重组的非致病性减毒活溶瘤病毒，含有口服脊髓灰质炎病毒萨宾1型，其中内部核糖体进入位点(IRES)被来自人类鼻病毒2型(HRV2)的IRES取代，具有潜在的抗肿瘤活性(参见例如Brown等，肿瘤“Cancer”120：3277-86，2014和Goetz等，细胞因子生长因子综述“Cytokine GrowthFactor Rev.”2010 21(2-3)：197-20)。OPV包括57个核苷酸替换，其区分减毒Sabin 1毒株和其毒性亲本(马奥尼(Mahoney)血清型)，两个核苷酸替换减弱了萨宾2毒株，并且在减毒萨宾3毒株中有10个替换。
所有三种萨宾疫苗常见的主要减毒因子是位于病毒内部核糖体进入位点(IRES)的突变，其改变了茎环结构，并降低了脊髓灰质炎病毒在宿主细胞内翻译其RNA模板的能力。示例萨宾序列提供于基因库登录号E01572.1、E01571.1和E01570.1，以及Nomoto等人，Proc Natl Acad Sci U SA.79(19)：5793-5797，1982。
PV的另一种形式是由Jonas Salk博士开发的化学灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)。这基于三个毒株马奥尼(1型脊髓灰质炎病毒)，MEF-1(2型脊髓灰质炎病毒)和Saukett(3型脊髓灰质炎病毒)。这些PV毒株可以使用所公开的方法产生。
纯化的：术语纯化的不要求绝对纯度；相反，它只是一个相对的术语。因此，例如，使用所公开的方法产生的纯化病毒制剂是其中病毒比病毒在宿主细胞或宿主细胞提取物中更富集的制剂。在一个实施例中，纯化制剂使得纯化的病毒占制剂总核酸含量的至少50％。在其它实施例中，在与其它制剂成分如药物载体，赋形剂，缓冲剂，吸收增强剂，稳定剂，防腐剂，助剂或其它联合成分混合之前，病毒被纯化到如下程度：在纯化的制剂中存在至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的所有大分子物质。在一些实施例中，纯化的制剂基本上是均匀的，其中其它大分子物质不能通过常规技术检测到。这种纯化的制剂可以包括与活性剂共价结合的材料，例如与活性剂混合或偶联的材料，其可以是期望产生活性剂的修饰衍生物或类似物或产生组合的治疗制剂或偶联物。
重组：重组核酸分子是具有非天然存在的序列或具有通过将两个分开的序列片段人工组合成的序列的核酸分子。这种人工组合可以使用常规方法完成，例如通过化学合成或通过人工操作分离核酸片段，例如通过基因工程技术，如Sambrook等人(编辑)，分子可控：实验手册“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第2版，1-3卷，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989。术语重组包括仅通过添加，取代或缺失部分核酸分子而改变的核酸分子。类似地，重组蛋白质是由重组核酸分子编码的蛋白质。重组病毒包括其基因已被构建和/或置于非天然环境中的基因，例如用于表达，例如使用重组工程技术。
对象：脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于鼠类，猿猴，人类，农场动物，运动动物和宠物。在一个实施方式中，对象是非人哺乳动物对象，如猴或其他非人灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、猪、山羊、绵羊、狗、猫、马或牛。在一些实施例中，对象患有可使用所公开的方法产生的脊髓灰质炎病毒治疗的肿瘤，例如成胶质细胞瘤。在一些例子中，对象是实验室动物/生物体，如小鼠，兔子或大鼠。
转化或转染：病毒或载体在将核酸转移到宿主细胞中时“转化”或“转导”宿主细胞。当DNA被细胞稳定复制时，通过将核酸掺入到细胞基因组中，或通过游离型复制，通过核酸转导到细胞中细胞被“转化”或“转染”。
许多转染方法是本领域技术人员已知的，例如：化学方法(例如磷酸钙转染)，物理方法(例如电穿孔，显微注射，粒子轰击)，融合(例如脂质体)，受体介导的胞吞作用(例如DNA-蛋白质复合物，病毒包膜/衣壳-DNA复合物)和通过病毒如重组病毒的生物感染(Wolff，JA编，基因治疗“Gene Therapeutics”，Birkhauser，波士顿，美国1994)。在被逆转录病毒感染的情况下，感染的逆转录病毒颗粒被靶细胞吸收，导致逆转录病毒RNA基因组的逆转录，并将所得前病毒整合到细胞DNA中。
转基因：由载体提供的外源基因。在一个实施例中，转基因包括病毒模板序列，例如RNA病毒的病毒DNA模板序列，例如脊髓灰质炎(天然脊髓灰质炎病毒或非天然存在的脊髓灰质炎病毒)。
治疗的，治疗和治疗：减轻或改善损伤、病理或病症的任何成功或成功标志，包括任何客观或主观的参数，如消除、缓解、减轻症状或使病况对患者更可耐受，表现为退化或衰退速度减慢，使退化的最终点弱化，改善对象的身体或精神状况，或延长生存期。治疗可以通过客观或主观的参数来评估，包括体格检查、血液和其他临床检查的结果等。在一些实施例中，用所公开的方法治疗导致肿瘤(例如，脑肿瘤)的数量、体积和/或重量和/或转移瘤的减少。
在足以……的情况下：用于描述能够进行所需活动的任何环境的短语。在一个实施例中，期望的活动是通过病毒模板质粒转化宿主细胞，或这种转化的宿主细胞的生长。在一个实施例中，所需活动是例如使用qPCR检测靶病毒核酸分子。在一个实施例中，期望的活动是体内治疗肿瘤和/或刺激免疫应答，例如采用使用所公开的方法纯化的病毒。
疫苗：可以施用于动物或人以赋予针对疾病或其他病理状况的免疫力，例如主动免疫力的免疫原性组合物。疫苗可以预防性或治疗性使用。因此，可以使用疫苗来降低感染的可能性或降低疾病或病症症状的严重程度或限制疾病或病症的进展。在一个实施例中，疫苗包括使用所公开的方法纯化的一种或多种病毒(例如，天然脊髓灰质炎病毒或非天然存在的脊髓灰质炎病毒)。
载体：一种核酸分子，引入到宿主细胞中，由此产生转化的宿主细胞。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含一种或多种治疗性基因或选择标记基因以及本领域已知的其它遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此使得细胞表达除细胞天然核酸分子或蛋白以外的核酸分子或蛋白。载体任选地包括有助于实现核酸进入细胞的材料，例如病毒颗粒、脂质体、蛋白质涂层等。在一个实施例中，载体是质粒，如细菌质粒。
含核酸分子的组合物
本公开提供了用于生产和纯化含有核酸分子的组合物的改进工艺或方法，并且在此被称为用于生产、分离、纯化或获得包含核酸分子的组合物、制剂、材料等的方法或工艺。一些实施例提供了用于产生天然或重组病毒的核酸DNA模板(例如病毒的质粒DNA模板)的改进方法。其它实施例提供了通常用于纯化含核酸分子的组合物的改进方法，并且提供了用于获得纯化的含核酸分子的组合物的改进方法。术语“含有核酸分子的组合物”及相关术语包括各种含有聚合物核苷酸的组合物和分子。包含核酸分子的组合物的实施例是含有DNA、RNA、DNA/RNA双链体、病毒、质粒、载体和核蛋白的组合物。含有核酸分子的组合物可含有天然存在的核酸或非天然存在的核酸，其也称为修饰的(通过遗传修饰或其他方法，如选择或化学修饰)、人工的、人造的、合成的、基因修饰的、基因工程改造的、工程化的、重组的、重组生产的或其他相关的术语。包含核酸分子的组合物包括但不限于基于病毒的核酸组合物、重组病毒、基于重组RNA的病毒(例如重组脊髓灰质炎病毒)、减毒病毒、含有病毒序列的质粒和病毒DNA模板。
本公开提供了用于生产和纯化病毒的改进方法，所述病毒包括天然和非天然存在的病毒。非天然存在的病毒在不同程度上可能与天然存在的病毒不同。非天然存在的病毒可以来源于通过人工产生(“工程改造”)(如重组技术)的天然存在的病毒，在这种情况下，非天然存在的病毒可以被称为“重组”。“非天然存在的病毒的一个例子是通过基因操作或其他过程(如选择或化学修饰)来修饰以降低或破坏其致病性的病原性病毒。该过程或者分别由此产生的修饰的病毒可以被称为“减毒”，“减毒的”或者其它相关的术语。
非天然存在的病毒包括但不限于病毒载体、溶瘤病毒和用作疫苗的减毒或重组病毒。溶瘤病毒是用于选择性感染和/或破坏癌细胞的病毒。病毒载体是用于在体内或体外(在细胞培养中)将遗传物质递送到细胞中用于各种应用的病毒。例如，病毒载体可用于基因修饰、基因治疗、用于蛋白质表达或用作病毒疫苗。病毒疫苗用于将遗传物质递送到细胞或生物体中，目的是引发保护性或治疗性免疫应答。例如，减毒活病毒可以用作疫苗来触发针对相同病毒(例如脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、麻疹病毒等)的天然存在病原性变体的免疫应答。术语溶瘤病毒、病毒载体和病毒疫苗有时在含义上是重叠的，但是所有这些可以人为地构建，例如通过使用重组工程技术对天然存在的病毒进行遗传修饰。溶瘤病毒可以基于但不限于肠道病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、水泡性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡病毒或牛痘病毒。病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体，如慢病毒载体和基于莫洛尼鼠白血病病毒的载体，腺病毒载体和基于腺伴随病毒的载体。病毒疫苗包括但不限于流感疫苗、麻疹疫苗株、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、水痘(水痘)疫苗、天花疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、HIV和HTLV疫苗、出血热疫苗或任何活的、减毒或灭活的病毒疫苗。
在一个实施例中，通过所公开的方法生产和/或纯化的非天然存在的病毒是重组脊髓灰质炎病毒，例如由PVS-RIPO为例的溶瘤减毒重组脊髓灰质炎病毒。PVS-RIPO是通过交换脊髓灰质炎病毒的同源内部核糖体进入位点(IRES)与人类鼻病毒2型(HRV 2)的对应物而产生的萨宾I型脊髓灰质炎病毒的减毒形式，从而产生在正常神经元细胞内不复制的脊髓灰质炎病毒株，但表现出对脑肿瘤细胞的溶瘤活性。在肿瘤内施用重组溶瘤性脊髓灰质炎病毒PVS-RIPO后，脊髓灰质炎病毒被选择性吸收并在表达CD155(脊髓灰质炎病毒受体，PVR或NECL5)的肿瘤细胞中复制，最终导致肿瘤细胞裂解。CD155是癌胚细胞粘附分子和肿瘤抗原，在某些癌症(如多形性成胶质细胞瘤(GMB))中异位表达。由于该重组病毒中所含有的异源HRV2 IRES，PVS-RIPO仅在易感的非神经元细胞(例如GBM)中增殖。PVS-RIPO及其性质和应用在例如Goetz等人，细胞因子生长因子综述“Cytokine Growth Factor Rev.”2010 21(2-3)：197-20，Yang等，病毒学方法杂志“J.Virol.Methods.”2009 155(1):44-54，Cello等，J.Med.Virol.2008 80(2):352-9和Dobrikova等，分子治疗“Molecular Therapy”2008 16(11)：1865-1872中有所描述。
在一个实施例中，通过所公开的方法生产和/或纯化的非天然存在的病毒是减毒的萨宾脊髓灰质炎病毒(例如具有适当突变的1型、2型和/或3型脊髓灰质炎病毒)。在一个实施例中，通过所公开的方法生产和/或纯化的病毒是用于灭活的脊髓灰质炎疫苗(例如1型、2型和/或3型脊髓灰质炎病毒)的病毒，其可以化学灭活(例如用福尔马林)，然后使用所公开的方法进行生产。
改进的病毒纯化方法和现有方法的比较
用于生产和纯化活PVS-RIPO的现有方法，例如，在Ouellette等人，生物工艺“BioProcessing”J.2005 4(2)：31-38(“Ouelette等人”)中描述。Ouelette等人描述的方法涉及从用PVS-RIPO质粒原种转化的细菌细胞制备PVS-RIPO质粒DNA，随后通过限制性内切核酸酶线性化质粒DNA，使用T7RNA聚合酶体外合成病毒RNA，以及将病毒RNA电穿孔到Vero细胞中产生病毒种子原种，其用于在Vero细胞培养物中产生PVS-RIPO病毒。在Ouellette等人描述的纯化方法中，从Vero细胞培养物上清液中分离出PVS-RIPO病毒，用酶处理PVS-RIPO病毒并进行一系列四个柱层析分离步骤。第一步是使用琼脂糖凝胶4FF(Sepharose 4FF)的尺寸排阻层析，监测柱洗脱液在280nm处的UV吸光度和电导率。第二步是使用超级Q 650M(Super Q 650M)树脂的阴离子交换柱色谱法，其未结合病毒(即，病毒在流出物中收集)。第三步是使用病毒结合CDM树脂的阴离子交换柱层析。第二步和第三步串联进行，通过SDS-PAGE从CDM柱洗脱出的级分中检测是否存在PVS-RIPO，并基于检测是否有PVS-RIPO的存在来选择并收集，用于下一步骤。第四步是使用交联葡聚糖G-25(SephadexG-25)树脂的尺寸排阻色谱法，其中按照前一步骤测试、选择并收集级分。第四步包含在了额外的PVS-RIPO纯化中，并用于除去从CDM柱洗脱PVS-RIPO的高盐缓冲液，因为脊髓灰质炎病毒在长时间暴露于高盐时会丧失传染性。
本申请提供了一种改进的病毒纯化方法。可以使用这些方法生产和纯化的示例性病毒包括但不限于DNA病毒(例如，单链DNA病毒，如以下家族之一的那些：指环病毒科(Anelloviridae)、虹彩病毒科(Bacillariodnaviridae)、二分DNA病毒科(Bidnaviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、双生病毒科(Geminiviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、矮化病毒科(Nanoviridae)、细小DNA病毒科,(Parvoviridae)和螺旋病毒科(Spiraviridae)；RNA病毒(例如小RNA病毒(Picrornavirus)，如口蹄疫病毒(Aphthovirus)(例如口蹄疫病毒和牛鼻炎病毒)、Aquamavirus、禽肝病毒(Avihepatovirus)、心病毒(Cardiovirus)、Cosavirus、Dicipivirus、肠病毒(Enterovirus)(例如，肠道病毒A-J或鼻病毒A-C中的任一种)、马鼻病毒(Erbovirus)、肝病毒(Hepatovirus)(例如甲型肝炎)，峭病毒(Kobuvirus)，Megrivirus，副肠孤病毒(Parechovirus)(例如，人副肠孤病毒或永安河病毒(Ljungan virus))，Piscevirus、Salivirus、萨佩罗病毒(Sapelovirus)、塞内加病毒(Senecavirus)、捷申病毒(Teschovirus)或震颤病毒(Tremovirus)、杆状病毒(Rhabdovirus)(如狂犬病)、副粘病毒(Paramyxovirus)(如麻疹病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒)、黄病毒(Flavivirus)(如登革病毒、塞卡病毒、西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒和日本脑炎病毒)和丝状科病毒(Filoviridae)(如埃博拉病毒))或逆转录酶病毒如HIV或HTLV。在一个实施例中，使用这些方法生产和纯化的病毒是IV组或VI组病毒，例如丙型肝炎，戊型肝炎，鼻病毒或HIV。
在一个例子中，使用这些方法生产和纯化的病毒是天然存在的脊髓灰质炎病毒或非天然存在的脊髓灰质炎病毒(例如由PVS-RIPO为例的溶瘤减毒重组脊髓灰质炎病毒)。在一个实施例中，使用这些方法生产和纯化的病毒是脊髓灰质炎病毒或疫苗，如萨宾脊髓灰质炎病毒或天然沙克(Salk)病毒(其可在纯化后化学灭活)。
所公开的方法包括第一层析分离步骤，其在尺寸分离色谱柱上分离含有病毒(例如，活病毒，例如非天然存在的活脊髓灰质炎病毒)的水性流体，通过定量聚合酶链式反应(qPCR)检测在一个或多个级分病毒(例如，活病毒，例如非天然存在活脊髓灰质炎病毒)里发现的一个或多个核酸序列，所述级分从尺寸分离色谱柱洗脱，将其中检测到一个或多个核酸序列的一个或多个级分的这些级分进行汇集，从而产生汇集的级分。本申请讨论了可以使用的qPCR和其他快速检测方法，并且包括本领域已知的方法。
所公开的方法包括第二阴离子交换层析分离步骤。第二色谱分离步骤进一步纯化来自第一色谱步骤的阳性汇集级分。因此，可以将在第一层析步骤之后获得的汇集级分上样到阴离子交换色谱柱上。在阴离子交换色谱柱中使用的树脂不与病毒显著结合，意味着从阴离子交换色谱柱上将病毒(例如，活病毒，例如非天然存在的活脊髓灰质炎病毒)洗脱到流通洗脱液中，而污染物与树脂结合。与病毒结合树脂相比，在该步骤中使用病毒非结合树脂和流通洗脱，避免病毒暴露于从病毒结合树脂中洗脱病毒所需的高盐洗脱缓冲液。暴露于高盐缓冲液可导致病毒失活，同时避免暴露于高盐缓冲液可提高活病毒的产量。在一个实施例中，所公开的改进的纯化方法在阴离子交换色谱分离步骤之后不包含任何另外的色谱分离步骤。因此，在具体实施例中，改进的纯化方法仅包含(例如由其组成)两个色谱分离步骤(尺寸分离和在流通中洗脱的病毒的离子交换)。在一些实施例中，改进的纯化方法不包括利用病毒结合CDM树脂的步骤。在第二层析分离步骤之后，改进的纯化方法可以进一步包括浓缩步骤，例如通过透析。这导致流通洗脱液中病毒(例如活的病毒，如非天然存在的活脊髓灰质炎病毒)的洗脱。
在本申请所述的改进的纯化方法中，应用于尺寸分离柱的含有病毒(例如活的病毒，如非天然存在的活脊髓灰质炎病毒)的水性流体可以是液体细胞培养基，通过在一轮或多轮细胞培养培养病毒(例如，非天然存在的脊髓灰质炎病毒)感染的病毒宿主细胞获得。用待纯化病毒感染的病毒宿主细胞可通过本申请所述的方法获得。在培养被病毒感染的病毒宿主细胞之后并且在第一层析分离步骤之前，可以将含有感染了病毒的病毒宿主细胞的细胞培养基与病毒宿主细胞、病毒宿主细胞的碎片或两者分开，例如通过离心或过滤。液体细胞培养基也可以用能够在溶液中消化游离核酸但不包封病毒核酸的核酸酶，例如酶处理。可以使用其他核酸酶，例如一种或多种DNA酶，一种或多种RNA酶，或者DNA酶和RNA酶的混合物。核酸酶的处理去除了或基本上减少了游离核酸，以提高安全性、降低收获粘度，并提高纯化过程中使用的病毒检测方法(本申请讨论的检测方法)的信噪比。
与用于大规模制备纯化病毒(例如非天然存在的脊髓灰质炎病毒)的先前描述的纯化方法(如Ouelette等人所述的方法)相比，本申请描述的改进的纯化方法在涉及的步骤和产生的病毒中具有许多差异。例如本申请描述的改进的纯化方法提供了以下一种或多种(优点)：病毒产量的提高、从运行到运行的高重复性、运行时间的减少(即，改进的方法比先前已知的更快)，以及选择产品收率和纯度之间的理想折衷(即更大的工艺灵活性)。改进方法的运行时间缩短至少部分归因于改进方法包含较少纯化步骤的事实。工艺步骤数量的减少也会导致材料成本的降低，并减少病毒降解的机会。由于第一层析步骤之后收集的柱级分的大小可以通过对病毒产物的存在进行快速和特异性级分测试(例如通过qPCR)精确调整，通过改变级分大小和在第一层析步骤之后选择哪些级分汇集用于随后的纯化，可以调整改进的方法以产生更纯的病毒产物，产生具有产量较高但纯度较低的病毒产物，或可容易地选择所需的产量和纯度的组合。
生产病毒的新方法和老方法之间的一个区别在于步骤的数量，即步骤数量减少，包括层析分离步骤数量的减少。仅用于说明目的，表1示出了改进的纯化方法的示例性实施方式和Ouelette等人所述的方法的并列比较。表1中从上到下依次列出了这些方法的处理步骤。Ouelette等人包含四个色谱纯化步骤。相比之下，表1中所示的改进的纯化方法仅使用两个色谱分离步骤，即初始尺寸分离层析步骤，然后在病毒非结合树脂上进行离子交换层析作为最后的层析步骤。这些步骤之后可能是浓缩步骤。与Ouelette等人相比，改进的纯化方法不包括阴离子交换CDM树脂层析步骤(“CDM捕获”)，也不包括交联葡聚糖G25树脂上的尺寸分离层析。由于病毒不再与用于洗脱CDM树脂柱的高盐缓冲液接触，除去了CDM捕获的步骤导致改进的纯化方法中活病毒的产量有所提高。不使用CDM树脂柱也可以消除Ouelette等人方法中使用的最终尺寸分离步骤，因为需要这个最终尺寸分离步骤来去除先前的CDM捕获步骤产生的高盐缓冲液。反过来，省略CDM捕获和最终尺寸分离色谱步骤减少了对从这些柱洗脱的组分进行检测的需要，并基于检测到的病毒的存在选择和汇集组分。
因此，本申请描述的改进的纯化方法减少了步骤的数量(例如，色谱分离步骤的数量减少了两倍)，这使得该方法更为精简且复杂度降低。步骤数量的减少还只是执行该方法所需的时间减少。例如，在一些实施方式中，改进的纯化方法可以在8小时或更短，或少于8小时(例如4至8小时，4至6小时，6至8小时或7至8小时)内进行。
表1改进的纯化方法与Ouelette等人描述方法的比较
另外，所公开的方法不同于Thomassen等人的方法(Plos One，8：83374,2013)。例如，尽管Thomassen等人使用两个层析步骤，他们没有纳入在线实时(PAT)分析步骤，以确定在尺寸排阻层析期间病毒的确切位置(例如实时RT-PCR)。相反，他们认为色谱柱上的吸光度值仅仅是由于基于事后SDS-PAGE结果的病毒衣壳蛋白。然而，发明人已经发现这不一定是这种情况(例如参见图6)，并且包含如实时RT-qPCR的方法以在汇集之前鉴定含有最多病毒的级分。另外，Thomassen等人不从病毒质粒模板开始。相反，他们从病毒原种开始。这些差异所造成的结果是，所产生的病毒不像使用所公开的方法获得的那样纯。
改进的纯化过程的复杂性降低使其适合于大规模生产，例如用于临床使用的PVS-RIPO的生成。术语“大规模生产方法”可以指由该方法(方法产量)产生的活病毒产品的总量。对于活病毒产品，如PVS-RIPO，方法产量通常以斑块形成单位(PFU)或组织培养感染剂量(TCID50)单位表示。相反，灭活的病毒材料产生的产量可以用质量和/或拷贝数表示。
此外，改进的纯化方法减少了导致活病毒产量易变和产量降低的两个色谱分离步骤。意想不到的是，通过减少这两个色谱分离步骤，改进的纯化方法仍然获得纯度与Ouelette等人描述方法获得的纯度相当的纯化的非天然存在的脊髓灰质炎病毒产物。据发现，传统的色谱监测技术，例如监测254或280nm处的UV吸光度(例如用于检测核酸分子)，使得在尺寸分离色谱之后需要使用额外的色谱分离步骤，接着从第二个阴离子交换柱流通洗脱病毒。在之前描述的纯化过程中，通过监测254或280nm处的UV吸光度而选择的病毒阳性尺寸分离柱层析级分，导致对含有高含量污染DNA、非病毒RNA和蛋白质级分的收集，这是因为所需要的病毒对洗脱液总吸光度的贡献相对较小。因此，在现有方法中，大量收集的物质与所需的病毒核酸分子(例如脊髓灰质炎病毒的病毒RNA)无关。此外，使用现有方法，回收的病毒产量(例如在PFU中)是高度可变的并且是不可预测的(例如可能只有几个％回收，或高达约50％的回收)。该问题通过所公开的方法来解决，所述方法通过快速且特异的检测程序(例如实时qPCR)检测在第一层析步骤(尺寸分离)中洗脱的级分中的病毒核酸。在此解决方案之前，层析柱级分中的病毒产物的存在不是特异性确定的，并且在汇集级分之后必须完成电泳、病毒空斑测定和其他特定测定以验证特定纯化步骤后获得的产物中病毒的存在。例如，Ouelette等人的方法(如表1所示)包括两个SDS-PAGE检测步骤来检测病毒产物。Ouelette等人使用的这些测试增加了方法的持续时间并转换了有限值的信息，因为测试级分的大小(体积)相对于柱大小相对较大。相反，在本申请所述的方法中使用快速且特异的检测方法来测试层析级分(例如qPCR，例如实时RT-qPCR)，使得对在第一层析步骤之后收集的较小体积级分进行快速测试并可选择含有高拷贝数病毒的级分。使用快速和病毒特异性检测技术，如实时qPCR，可以快速确定和定量哪些尺寸分离柱级分中含有最高滴度病毒，并选择这些级分用于汇集和随后应用于病毒非结合离子交换柱。在第一个层析步骤后得到的改进的纯化使得活病毒产量的提高，且复杂性和成本有所降低。
与先前已知的方法(如Ouellette等人描述的方法)比较，改进的纯化病毒(例如非天然存在的脊髓灰质炎活病毒，例如PVS-RIPO示例的溶瘤减毒重组脊髓灰质炎病毒)的生产方法出乎意料地实现了活感染病毒产率的提高。纯化收率(也称为工艺收率)的计算：为纯化病毒所得的总斑块形成单位(pfu)与宿主细胞培养物(例如，哺乳动物细胞(例如Vero细胞)中的病毒，其被用作待纯化的病毒的来源)中所收获的那些病毒的比值，其中纯化病毒获自最后一个工艺步骤。或者，纯化产量基于拷贝数(通过qPCR)或TCID50。例如，对于PVS-RIPO，使用所公开的方法获得的纯化收率一直≥50％，例如理论最大值的50％-60％。理论最大值是保留在最终纯化的“大批”药物中的收获物中pfu效价的100％(即，总pfu基础上没有丧失感染性)。因此，改进的方法出乎意料地导致了大约≥50％的感染性活病毒的纯化收率，例如至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、或至少85％的纯化产率，例如50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％或85％的纯化产率，例如50％-60％、50％-80％、50％-83％、50％-85％、60％-83％、60-85％、70-83％或70-85％的纯化产率。相反，Ouellette等人描述的方法获得感染性活病毒的总产率仅为29％。当试图将该工艺扩大到更大体量时，低于20-30％的产量通常会被认为是不经济的且存在困难。对于如单纯疱疹病毒(HSV)，腺病毒(例如血清型5)和麻疹病毒等病毒，使用其它已知的病毒层析纯化方法提供的产量通常小于50％，通常可小于20％。也可以通过比较每个可比较量的输入材料产生的产品总量来比较不同的纯化过程的产率。例如，本申请所述的改进方法使用与Ouelette等人相同或相当量的输入材料。(例如以约-1E13PFU开始)可确切地获得5×1012pfu范围内的产率。相反，Ouelette等人描述的过程仅产生1×109至5×1010pfu量级的收率(例如，以大于>3E10至大于1.5E12PFU开始)，具有低再现性。因此，与之前已知的方法产生的最高500亿pfu的高产量相比，本申请描述的改进的方法可以确切地产生5万亿pfu的活病毒产物。
不管所需的纯度如何，改进的纯化方法所达到的收率均不能用前述方法如Ouelette等人所描述的方法来实现，因为洗脱柱级分中病毒的“位置”和数量直到方法完成之后才知道。Ouelette等人采用了耗时的检测方法，即SDS-PAGE，在最后两个层析步骤(病毒结合离子交换和尺寸分离层析)期间洗脱的级分中检测病毒。发现Ouelette等人描述的方法中第三和第四层析步骤的组合以及缓慢的检测导致了活体感染病毒的产量下降。层析步骤(特别是需要用高盐缓冲液洗脱的病毒结合离子交换层析)和由SDS-PAGE检测程序引起的延迟可引起病毒失活(丧失感染性)。在改进的纯化方法中，使用快速且特异的方法检测第一层析步骤期间洗脱级分中的病毒，可以减少后续潜在灭活纯化步骤，并缩短总纯化时间，从而使感染性非天然存在的活脊髓灰质炎病毒(例如由PVS-RIPO示例的溶瘤减毒重组脊髓灰质炎病毒)的产率出乎意料地得以提高。由于出乎意料地提高了纯化产率，与本文描述的那些相比，本申请提供的生产方法可以在10个10级“细胞工厂”的生产规模上产生大约3×1012个组织培养感染剂量(TCID)50的PVS-RIPO。由于如此高的产量，改进的纯化过程可以适应或并入大规模生产过程产生非天然存在的活脊髓灰质炎病毒，例如由PVS-RIPO示例的溶瘤减毒重组脊髓灰质炎病毒。
尽管在一些实施例中观察到，使用改进的纯化方法获得的最终产物的整体纯度降低(例如通过检测残余的宿主细胞蛋白质(HCP)和Benzonase酶测量)，与先前描述的方法相比，所产生的病毒(例如非天然存在的活脊髓灰质炎病毒)纯度的最终程度对于大规模临床制造是可接受的。本申请显示，与先前方法相比，产量增加了5-10倍，而经残余HCP和Benzonase酶测定的总体纯度伴随降低仍然在临床制造可接受的限度内。在一些实施例中，最终产品中Benzonase酶的量小于50ng/mL(例如小于20ng/mL、小于10ng/mL、小于5ng/mL或小于1ng/mL)，最终产品中HCP的量小于10mg/mL(如小于5mg/mL、小于2mg/mL、小于1mg/mL或小于0.5mg/mL)，或其组合。基于本申请的教导，本领域技术人员将理解，通过改变在第一层析步骤之后用于选择级分的参数，可以实现病毒产物的纯度提高。
产生病毒模板质粒
本公开提供了用于产生含有病毒模板序列的质粒DNA的改进方法。图2提供了新旧方法之间的比较，图3提供了新方法的细节。产生病毒DNA模板质粒的改进方法确保了用于产生病毒序列的病毒DNA模板含有正确的病毒模板序列。所公开的方法包括以下更详细描述的一个或多个以下步骤：将病毒模板质粒导入到一个或多个宿主细胞(例如细菌细胞)(例如转化)中；培养用病毒模板质粒转化的一种或多种宿主细胞的固体培养基；检测在固体培养基培养物上生长的一个或多个克隆中一种或多种病毒序列的存在；繁殖在其中检测到存在有一种或多种病毒模板序列的一个或多个克隆的细胞(例如通过在液体培养物中发酵)，并从繁殖的宿主细胞中提取病毒质粒。在一些实施例中，宿主细胞(例如细菌细胞)或源自宿主细胞(例如细菌细胞)的材料的冷冻(例如，暴露于或在-20℃或-80℃或以下的温度孵育)故意不在繁殖和提取步骤之间进行。繁殖时间也可能受到限制。在一些实施例中，所公开的质粒制备方法不包括将转化的宿主细胞暴露于甘油或通常添加至储存介质中的其它试剂(例如DMSO)。因此，在一些实施例中，所公开的质粒制备方法不包括将转化的宿主细胞在含有甘油或通常添加至储存介质中的其它试剂(例如DMSO)的培养基中孵育，并且转化的宿主细胞不经冷冻。
图2提供比较旧和新公开的方法的概述。在两种方法中，将含有病毒序列和选择标记(例如卡那霉素抗性)的病毒模板质粒转导到宿主细胞(例如大肠杆菌)中。转化的细胞在含有选择化合物如卡那霉素的合适生长培养基的存在下生长从而可以对转化体进行选择。在新方法中，这种增长发生在固体培养基上，而在现有方法中，这种增长发生在液体培养基中。固体培养物上的生长能够对具有经鉴定的无缺陷质粒的所需个体转化克隆(PAT对照)进行选择。新方法中的PAT(过程分析技术)控制步骤允许在制造过程中进行实时监控和基于数据进行决策。例如，PAT可以包括质粒的快速电泳分析，以确保在发酵之前通过克隆选择以及在发酵之后进行“批量样品”分析而具有完整正确尺寸。相反，旧方法在液体培养基中生长转化的细胞，导致缺陷型质粒和无缺陷型质粒的繁殖。在现有方法中，转化后，在液体培养物生长和通过选择标记(例如抗生素抗性)进行克隆选择，处理细胞至高滴度，然后进行细胞建库。在这个阶段，将转化的细胞置于储存介质(通常含有甘油)中以产生冷冻细胞库用于随后的制造。非GMP库通常被认为是登记细胞库(ACB)，其一部分被用于通过液体培养基发酵产生第一GMP主细胞库(MCB)。细胞库可以无限存储，如图2中的≠符号所示。一部分MCB批号通常用于通过产品发酵过程中使用的液体培养基发酵产生工作细胞库(WCB)。在新的方法中，在固体培养基上生长并用正确的质粒选择验证的克隆后，将转化的细胞在优化的条件下在液体生长培养基中重新扩增以制备质粒(发酵)。在现有方法中，在优化的条件下将库存的细胞(未验证其质粒)在液态生长培养基中扩增以制备质粒(发酵)。随后，在两种方法中，将液体培养物沉淀并破碎细胞以释放质粒DNA(质粒纯化)。随后的层析，过滤，洗涤，缓冲液交换和浓缩步骤可用于产生具有宿主细胞染色体DNA、内毒素(LPS)和/或宿主细胞蛋白残留浓度较低的纯化的质粒DNA。
改进的方法解决了在宿主(例如细菌)细胞中繁殖的病毒模板质粒的遗传不稳定性问题。使用先前的纯化方法，当PVS-RIPO质粒在大肠杆菌培养物中繁殖时，PVS-RIPO模板序列是不稳定的并且易于发生细菌转座子插入事件。例如，存在于大多数革兰氏阴性细菌中的细菌转座子TN10/ISR10可以迅速将其自身插入到病毒模板序列中，导致有缺陷的病毒模板。PVS-RIPO质粒产物在细菌培养物中繁殖，并作为冷冻转化的大肠杆菌原种(例如Ouelette等人使用的病毒质粒原种，其在质粒纯化前发酵-参见Ouelette等人，第32页，第1栏)通常含有大量的杂质，包括空pUC19载体、二聚pUC19载体或大肠杆菌转座子DNA插入(图1中示意性说明)。
产生含有病毒模板序列的质粒DNA的现有方法还包括将病毒模板质粒引入一个或多个宿主(例如细菌)细胞中，但随后使这些细胞在液体培养基中生长，然后“建库”或冷冻(参见图2)。另外，没有进行验证过程来确认质粒保持完整。典型的质粒产物在发酵之前经历多达三次或更多次细胞库发酵和冷冻过程以用于制造目的。已经确定，获得的含有病毒模板的质粒DNA库包含大量降解的质粒(例如，由于非所需的转座子事件而不包括正确的病毒模板序列)，因此不是最佳的。从这些库的起始材料中获得全长克隆是很困难的。在一些实施例中，当使用先前的纯化方法时，质粒群体的至少70％(例如至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或甚至有时100％)不包括正确病毒模板序列。已经显示，避免使用建库步骤(例如，不存在冻结步骤)的新方法引起了质粒群体的降解减少，这可能是由于较少的转座子插入事件。例如，使用所公开的产生病毒模板质粒的方法，可以产生含有病毒模板序列的质粒DNA群体，具有至少50％的克隆遗传上的“稳定”(例如至少60％、至少65％、至少70％或至少75％)，如琼脂糖凝胶电泳(AGE)和含有正确病毒模板序列的质粒群(或小于50％的质粒群含有不正确病毒模板序列(如小于40％、小于45％、小于30％或小于25％))的RE图谱所示。
本文描述的改进过程通过一个或多个以下特征来解决与现有方法相关的问题。在一些实施例中，改进的方法提供初始病毒模板质粒原种(例如PVS-RIPO病毒DNA模板质粒)作为含有分离的病毒模板质粒原种(例如PVS-RIPO质粒DNA)的组合物，而不是使用转化的宿主细胞(例如大肠杆菌)，并使用分离的病毒模板质粒原种(例如PVS-RIPO质粒DNA)进行宿主细胞(例如大肠杆菌)的新转化。在一些实施例中，改进的方法包括测试转化的细胞是否存在正确的质粒序列(例如，使用琼脂糖凝胶电泳和RE图谱)。在本申请所述的示例性方法中，在细菌细胞的固体培养基生长的克隆上进行测试，但是可以使用任何适当的技术来测试转化的细菌细胞是否存在正确的病毒模板序列，并选择其中存在这种序列的细胞用于进一步繁殖。通过包括检测或选择步骤，其例证是从来自最初的质粒原种转化的细胞生长的细菌克隆中检测一种或多种病毒模板序列，改进的方法确保含有正确或基本上正确的病毒模板质粒序列的细菌细胞被选择用于进一步繁殖。在一些实施例中，改进的方法不包括在繁殖和分离步骤期间或步骤之间冷冻转化的宿主细胞，这也降低了存在于细菌细胞中的病毒模板序列的遗传不稳定性的风险。有意地限制的繁殖时间也可以用于改进的方法中，以降低扩增含有缺陷型病毒模板序列的质粒克隆的风险。
图3中提供了所公开的方法的概述100。含有病毒模板序列的质粒DNA110,120，也可称为质粒病毒DNA模板、病毒DNA模板质粒、病毒模板质粒、质粒、病毒DNA模板和其它相关术语，是含有指定(意味着互补或一致)病毒DNA或RNA序列的一种或多种病毒DNA模板序列。病毒模板质粒可以以纯化的质粒原种(如来自质粒库(110)的质粒)或其它形式获得。在一个实施例中，质粒以分离形式(120)提供，意指不包含在细菌细胞中。病毒DNA或RNA序列可以包含天然病毒序列、工程化或修饰的病毒序列，或非病毒序列，例如编码待表达于宿主细胞的非病毒蛋白质的序列。在将病毒DNA模板序列引入宿主细胞后，病毒DNA模板用于在体内或体外合成病毒序列(例如，RNA聚合酶可用于从病毒DNA模板序列体外合成病毒RNA序列)。
任何病毒模板质粒都可以用所公开的方法纯化。在一些实施例中，病毒模板质粒包括RNA病毒，如脊髓灰质炎病毒的DNA模板(例如PVS-RIPO、灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)、减毒脊髓灰质炎病毒(即萨宾疫苗)的模板)。在一个实施例中，病毒模板质粒包括用于正链RNA病毒的DNA模板，例如小核糖核酸病毒(例如口疮病毒科[例如口蹄疫病毒(FMDV)]，甲型肝炎或脊髓灰质炎)；心病毒；肠病毒(例如柯萨奇病毒，埃可病毒，肠道病毒和脊髓灰质炎病毒)；鼻病毒(鼻病毒，如鼻病毒A，B或C)；披膜病毒(Togavirus)(例如风疹；甲病毒(如西方马脑炎病毒，东方马脑炎病毒和委内瑞拉马脑炎病毒))；黄病毒(例如登革热病毒，寨卡病毒，西尼罗病毒，丙型肝炎病毒和日本脑炎病毒)；和冠状病毒(例如，SARS冠状病毒，如厄巴尼株)。在一个实施例中，病毒模板质粒包括用于负链RNA病毒的DNA模板，例如正粘病毒(如流感，如流感A或B)，弹状病毒(如狂犬病)，丝状病毒科(如埃博拉病毒)和副粘病毒(如麻疹病毒，呼吸道合胞病毒和副流感病毒)。在一些实施例中，病毒模板质粒包括DNA病毒序列，例如来自疱疹病毒(例如水痘-带状疱疹病毒，例如奥卡毒株；巨细胞病毒；和单纯疱疹病毒(HSV)类型1和2)，腺病毒(如1型，14型，5型，40型或41型腺病毒)，痘病毒(如痘苗病毒)，乙型肝炎病毒和细小病毒(如细小病毒B19)。在一些实施例中，病毒模板质粒包括用于逆转录病毒的DNA或RNA模板，例如1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)，例如C亚型，HIV-2；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；猫白血病病毒(FeLV)；猿免疫缺陷病毒(SIV)；和禽肉瘤病毒。
如图3所示，将病毒模板质粒引入(例如转化)到一个或多个宿主细胞130。可以使用的示例性宿主细胞包括但不限于：细菌，古生菌，植物，真菌，酵母和昆虫细胞，例如乳杆菌属(Lactobacillus)，乳球菌属(Lactococcus)，芽孢杆菌(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌subtilis)，埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠杆菌，例如DH5α，K12或大肠杆菌的K12衍生菌株)，梭菌(Clostridium)，酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)(如酿酒酵母S.cerevisiae或巴斯德毕赤酵母P.pastoris)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，SF9细胞，C129细胞，293细胞，脉孢菌细胞和哺乳动物细胞。将病毒模板质粒引入宿主细胞可以通过任何合适的方法完成。示例性的转化方法包括但不限于：电穿孔或将宿主细胞暴露于二价阳离子如Ca 2+，然后进行热休克。
转化130后，转化的宿主细胞在选择标记(例如抗生素)存在下在固体培养基(例如琼脂平板)上生长。用病毒模板质粒转化的一个或多个细胞的固体培养基培养物的生长可以通过任何合适的方法完成。例如，可以将转化的细胞划线或稀释铺板到固体培养基如琼脂基细菌生长培养基上。选择单个克隆，并分别在液体培养基140(例如50mL培养基)中培养。可以使用在液体或固体培养基中使用合适的选择标记来选择转化的细胞。例如，可以通过使用含有抗生素的生长培养基(例如但不限于含有卡那霉素的培养基用于KanR选择质粒转化体(或其它，如含有用于质粒转化体的AmpR选择的氨苄青霉素的培养基)来完成病毒质粒DNA中所含的赋予抗生素抗性的基因的选择。可以使用的其它抗生素抗性标记物包括潮霉素、氯霉素和嘌呤霉素。另外，可以使用其他选择方法，如β-半乳糖苷酶α互补(使用大肠杆菌lacZAM15作为宿主)并用X-gal铺板。
在使转化的宿主细胞得以生长之后(例如在选择条件下)，确定哪些细菌克隆含有正确的病毒模板序列，150。可以通过一种或多种合适的检测方法检测在固体培养基培养物上生长的一个或多个细菌克隆中一种或多种病毒模板序列的存在。例如，可以进行聚合酶变化反应(PCR)、DNA测序、限制性分析、凝胶电泳、印迹或其他方法中的一个或多个。在一个实施例中，使用限制性(内切酶)作图琼脂糖凝胶电泳，最终接着进行完整的质粒测序。对一个或多个病毒模板序列是否存在进行检测以验证所测试的一个或多个克隆的细胞含有正确或基本上正确的病毒模板DNA序列，并且不含有大量的杂质，如不含病毒模板序列的“空”质粒载体、质粒二聚体等，或病毒DNA序列变异或错误，如缺失，插入或取代。
可以通过任何合适的方法实现一个或多个克隆转化细胞的繁殖，并从繁殖的细胞中提取病毒质粒，所述克隆中检测到一种或多种病毒模板质粒序列的存在。例如，如步骤160所示，可以使用其中检测到一种或多种病毒模板质粒细胞存在的克隆来接种转化细胞的液体培养物，然后将其生长(“发酵”)至适当的程度。然后可以纯化含有该质粒的细胞，例如通过沉淀、过滤或其他合适的分离方法从生长培养基中分离出来。病毒DNA模板质粒可以通过合适的技术170从细胞中提取(例如纯化或分离)。可以分析180所得的分离的病毒DNA模板质粒的数量和质粒的质量(例如，为了确定质粒是否包含正确的序列)。例如，步骤180可以包括测定所得样品的DNA浓度，大肠杆菌LAL(内毒素)浓度，所得样品中的质粒DNA纯度或其组合。这样的方法可以包括限制性内切酶消化分析和/或测序分析。在纯化、透析和无菌过滤之后，可以将得到的质粒包装，190，例如1mL在2-3mL玻璃瓶中。在一些情况下，所公开的方法有意在繁殖和提取步骤之间(例如，步骤130-170)不包括任何冷冻步骤或时段。对于质粒起始培养物，繁殖时间可以有意限制在大约14小时，主发酵时间约为20小时。
在改进方法的具体实施例中，使用热休克将PVS-RIPO病毒DNA模板质粒(使用两个不同的批号)转化大肠杆菌细胞。转化的细胞在固体培养基上生长。筛选所得大肠杆菌细胞的克隆以使用AGE(scDNA和RE作图分析)鉴定含有正确PVS-RIPO质粒的克隆。额外的筛选可以通过质粒DNA测序进行。选择含有正确PVS-RIPO质粒的大肠杆菌细胞用于进一步繁殖，在含有50μg/mL卡那霉素的含LB-大豆蛋白的液体大肠杆菌细胞培养基中繁殖，并从繁殖的大肠杆菌细胞中分离PVS-RIPO质粒(将细胞糊离心并使用裂解/纯化，使用 EndoFreeGigaPrep试剂盒)，不对细菌进行冷冻。繁殖限于通过OD 600nm下预测定的细胞密度，在起始种子培养和主发酵之间使用凝胶基检测，对起始和主发酵均采用平行培养，并对质粒进行即时处理(即，没有冷冻细胞浆)。图4说明了相对于图1A和1B，通过改进的质粒生产方法获得的PVS-RIPO质粒纯度有所提高。使用所公开的方法，实现回收具有高超螺旋(sc)DNA百分比(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％、例如70-95％、75-85％或80-90％)的完整全长质粒。另外，使用AGE和AGE/RE作图分析发现，没有完全或部分的质粒丢失、质粒插入丢失、重组或转座子整合的迹象。
还提供了使用所公开的方法产生的病毒模板质粒DNA。例如，使用所公开的方法产生的含有病毒模板质粒DNA的组合物可以包括缓冲液，例如10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0。在一些实施例中，所得的病毒模板质粒DNA包括质粒，其中至少50％含有合适的病毒DNA模板质粒(例如至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，例如50-75％，50-85％或50-60％的克隆含有所需大小的单一质粒构建体，限制性图谱模式遵循所公开的方法，例如对于PVSRIPOpDNA)。与使用其它纯化方法时观察到的事件相比，在一些例子中，使用所公开的方法产生的含有病毒模板质粒DNA的组合物包含的质粒转座子插入事件较少，质粒二聚体化较少，较少没有病毒模板序列的空质粒较少或其组合。因此，在一些实施例中，使用所公开的方法产生的含有病毒模板质粒DNA的组合物包含小于约50％的具有转座子插入事件的质粒(如小于45％，小于40％，小于30％，小于20％，小于10％，小于5％或小于1％，例如10-50％，20-40％或1-20％)，小于约25％的二聚化质粒(如小于20％％，小于15％，小于10％或小于5％，如1-25％，或10-20％)，小于约25％的空质粒没有病毒模板序列(如小于20％，小于15％，小于10％或小于5％，例如1-25％，或10-20％)或其组合。
使用所公开的方法产生的病毒模板质粒DNA可以进一步处理，例如线性化，从而产生病毒DNA模板，并导入宿主细胞。例如，对于基于RNA的病毒，可以使用体外转录从病毒DNA模板产生病毒RNA序列，并用于转染病毒宿主细胞。来自转染的宿主细胞的澄清的病毒可被收集并被称为“主病毒库”(MVB)。MVB包含病毒而不是宿主细胞。由于其寿命短，感染的细胞通常不会被收集到细胞库中。MVB含有包含澄清病毒的转染后细胞裂解物。然后以合适的方式(如在体外细胞培养中)生长感染的病毒宿主细胞。感染细胞的生长可以包括在培养物中对感染的哺乳动物细胞的一轮或多轮扩增(增殖)，意指在培养物中培养细胞，然后使用生长的细胞“接种”(启动)另外的细胞培养物，尽管这可能是不可能的，因为细胞病变效应的速度及感染后的细胞死亡。
在改进方法的一个实施例中，在Vero细胞中产生了主病毒种子(MVS)，所述Vero细胞由IVT产生的病毒RNA转化而来；使用MVS感染的扩展Vero细胞产生MVB病毒，随后澄清但不纯化；生产批号使用感染病毒的Vero细胞形成MVB批号；在所有情况下，Vero扩增发生在转染(病毒RNA至MVS)或感染(MVB)和生产之前。但是，对于生成小型MVS/MVB库而不是大规模生产大量病毒，所需的细胞扩增通常较少。因此，使用如上所述产生的PVS-RIPO质粒DNA，并将得到的裸露病毒RNA序列用于转染Vero哺乳动物细胞。在RNA转染或病毒感染之前，将Vero培养物扩增到所需的细胞数。对于PVS-RIPO和其他病毒，感染后细胞不会扩增。在感染的Vero细胞中发生病毒复制和扩增以产生收获批号的PVS-RIPO。
用色谱级分中核酸序列的快速检测方法的纯化工艺
本申请提供用于获得纯化或分离的含有核酸分子的组合物的改进过程或方法。改进的纯化方法包括色谱分离含有所需核酸分子(如病毒)的样品。本申请显示通过使用快速检测方法(如定量聚合酶链式反应(qPCR))检测在洗脱的色谱柱级分中被纯化的包含所需核酸分子的组合物(例如“分析物”)，并且基于检测结果选择级分(例如，选择和组合含有所需核酸分子的级分)，与通过传统色谱监测技术(例如监测色谱柱洗脱液吸光度和电导率)进行样品检测的方法相比，实现了改进的纯化。尽管用本申请所述改进的纯化方法获得的感染性活病毒的产量有所增加，但该方法不限于纯化活病毒。例如，所公开的方法可用于纯化其他分析物，例如灭活病毒(例如疫苗中使用的病毒)和纯化的病毒核酸。
改进的纯化过程可引起以下一种或多种结果：分析物的产率更高，分析物纯度的增加和纯化时间的降低(参见表2)。纯化时间的降低使得纯化效率提高，在某些情况下提高了纯化分析物的质量。例如，使用改进的纯化方法在4-8小时内实现了PVS-RIPO的纯化(与使用Ouelette等人的方法至少2天或至少3天相比)，这使得纯化的PVS-RIPO感染性(效价)提高。换句话说，更短的纯化时间导致活的感染性病毒的产量和稳定性提高。通过改进的纯化过程获得的分析物参数，如产量和纯度或纯化时间等，可以通过调整纯化参数来控制。例如，可以调整(增加或减少)通过快速检测方法检测分析物是否存在的收集和/或测试的的色谱级分的数目，增加色谱柱分辨率，添加额外的纯化和/或检测步骤或选择不同类型的快速检测方法。在一个实施例中，可以通过测试大量层析级分并汇集更多的含分析物的级分用于进一步的制备步骤来提高分析物的总收率。在另一个实施例中，分析物的纯度可以通过收集较小的级分并汇集具有最高分析物含量的少量级分用于进一步的制备步骤来改善。
表2所公开方法提高的产出
*来自最后一个步骤后获得的纯化病毒的总噬菌斑形成单位(pfu)与从宿主细胞培养物收获的那些病毒(例如，哺乳动物细胞如Vero细胞中的病毒，其用作待纯化病毒的来源)的比率
图5提供了改进方法的概述，200。将先前用病毒模板质粒感染并在培养物中生长的宿主细胞(如感染脊髓灰质炎病毒(如PVS-RIPO)的Vero细胞)经病毒裂解。将所得上清液与核酸酶一起温育210。核酸酶可以消化溶液中的游离RNA和DNA，但保留封装病毒的核酸(即包含在完整的病毒颗粒中)完整性。因此，核酸酶在能够消化(且因此降低和或去除)宿主细胞DNA(例如，gDNA，mtDNA)和RNA(例如，tRNA，rRNA)、其他潜在污染DNA/RNA(如内源性/外源性病毒)(如果存在的话)以及未封装的游离病毒RNA的条件下采用包含所需病毒的上清液孵育。在一个实施例中，核酸酶以50单位/毫升(或更少)的浓度存在，例如在2-8℃下16-24小时。在一些实施例中，核酸酶在较高温度(例如25-37℃)下使用较短时间，但可发生病毒衣壳降解。在一个实施例中，核酸酶是核酸内切酶，例如酶。在一个实施例中，核酸酶是一种或多种DNA酶，一种或多种RNA酶，或一种或多种DNA酶与一种或多种RNA酶的组合。
然后将核酸酶消化的上清液进行尺寸分离(或凝胶过滤)色谱，220。例如，可将核酸酶消化的上清液施加到尺寸分离柱，例如包含琼脂糖基树脂(例如琼脂糖凝胶)的柱。在一个实施例中，尺寸分离柱是具有高流速的琼脂糖6快流(FF)树脂。在一些实施例中，使用6FF而不是4FF柱可以提高病毒的纯度和/或提高纯化的速度。使用qPCR(例如实时RT-qPCR)分析从柱收集的一个或多个级分的靶核酸分子的存在(例如，通过检测靶病毒的靶序列)，230。在一些实施例中，还监测洗脱液的其他参数，例如吸光度(例如，在280nm，215nm或254nm的一个或多个波长处)和/或电导率。然后将鉴定出的含有靶核酸分子(例如病毒)的级分汇集或合并240。在一个实施例中，阳性级分是具有＞107拷贝/毫升的阳性级分(其中拷贝指病毒RNA或cDNA基因组拷贝)。
汇集的级分进行阴离子交换色谱，250。例如，汇集的级分可以应用于Super Q650M含树脂柱。在一些实施例中，监测来自阴离子交换的洗脱液参数，例如吸光度(例如，在280nm，215nm或254nm的一个或多个波长处)和/或电导率。在一些实施例中，例如使用PCR(例如实时RT-PCR)监测来自阴离子交换的洗脱液中病毒的存在。例如，含有至少5×10 9个拷贝/毫升的级分可以得以保留和汇集，尽管这可以扩大到含有至少2×109个拷贝/毫升的级分以提高产率，以纯度为代价(例如，如果相比更高纯度更需产量)。
从阴离子交换柱收集的含有靶核酸分子的所得流通物峰可以使用透析浓缩，260。可以对所得的渗透物和/或冲洗物进行收集、汇集、无菌过滤或其组合。如果需要，可以进一步分析所得渗透物和/或冲洗物，例如测定pH，BCA(蛋白质含量)，Vero HCP含量，HC DNA含量，LAL，进行噬菌斑(PFU)测试或其组合。在一些实施例中，将额外的材料加入到所得纯化的核酸分子制备物中，例如佐剂，人血清白蛋白(HSA)，糖(甘露醇，蔗糖等)，表面活性剂(例如吐温/聚山梨酸酯)等等中的一种或多种。
色谱
所公开的用于获得含有核酸分子如纯化病毒的组合物的方法包括通过液相柱色谱法分离含有所需核酸分子的样品、收集从柱色谱法洗脱的级分、使用快速检测方法(如实时RT-qPCR)来检测核酸混合物中一个或多个级分中的靶核酸序列，以及选择一个或多个级分，该级分中靶核酸分子的测定基于所述靶核酸序列浓度的预定阈值(“截断值”)(如阈值>109拷贝/毫升(即如实时RT-qPCR确定的病毒基因组的拷贝))靶核酸。柱层析包括能够分离含有核酸分子样品的组分的所有方法，并涉及填充有固定相(色谱介质)和流动相(液体洗脱液)的柱，其中样品是可溶的。将样品施加到柱上，然后施加洗脱液。选择固定相和流动相使得样品的各种组分以不同的方式穿过固定相。适用于分离含核酸样品的示例性液相色谱法是已知的，并且例如由McLaughlin，TrAC Trends in Analytical Chemistry 5(8)：215-219(1986)或McGrath等，J Virol.25(3):923-927(1978)所描述。例如，可以根据介质的类型和/或所涉及的分离过程对液相色谱法进行分类。一些例子是尺寸排阻(凝胶过滤)色谱层析，离子交换色谱层析，疏水性色谱层析和亲和色谱层析。可以与所公开的方法一起使用的一些合适层析介质例子是Q-琼脂糖FF，SP-琼脂糖，Superdex-75，Capto-Q，Source-Q，DEAE-Sephacel，Zenix-C，Source-S，苯基/丁基/辛基-Capto等。
典型地将来自柱子的洗脱液收集在一系列级分(预定体积的样品)中。可采用各种检测方法对级分进行检测以确定一种或多种样品组分的存在或不存在，这些样品组分可以被称为分析物。也可以继续监测洗出液，从而连续检测柱洗脱液，然后收集级分。示例性的检测方法是在适合于检测核酸和/或蛋白质波长的吸光度检测或者用于检测电解质(例如盐)的电导率监测。可以使用一种或多种合适的分析技术(如酶活性测试，电泳，印迹等)分析级分是否存在生物分子。在分离含核酸样品期间通常采用的检测技术缺乏特异性。例如，可以采用测量合适波长(例如RNA为254nm)的吸光度检测，但是它不允许检测特定的核酸序列(例如病毒靶序列)，并且所得到的样品因此可以含有不需要的污染物，例如宿主细胞RNA。然而，更具体的检测方法可能是耗时的，这可能导致在获得检测结果的同时样品遭到非期望降解。
在所公开的改进纯化方法中，不管用于分离含有核酸分子的样品(如病毒核酸)的层析介质的类型如何，所述方法包括使用快速检测方法检测或测定一个或多个级分中靶核酸分子，该方法可以特异性地检测含核酸分子分析物中的一个或多个序列。这种方法的一个例子是实时RT-qPCR检测。其它检测技术，如吸光度和电导率监测，可以与快速检测结合使用。例如，当使用实时RT-qPCR进行快速检测时，可以基于吸光度和电导率监测的结果来选择用于实时RT-qPCR检测的级分。然而，选择一个或多个存在靶核酸分子的级分是基于样品中靶核酸序列的实时RT-qPCR检测。基于存在于样品中的靶核酸序列的预定阈值(“截止值”)来选择级分。即，选择含有靶核酸序列浓度等于或高于阈值的级分。然后可以组合多个级分。所得组合物含有比最初施加到色谱柱上的样品更高浓度的靶核酸分子。它也可以含有除所需核酸以外的较低浓度的样品组分。
所公开的纯化方法说明性地用于从Vero细胞获得PVS-RIPO的纯化方法中。PVS-RIPO生产过程涉及从主病毒库获得的由1代(P1)PVS-RIPO感染的Vero细胞的多个十级细胞工厂。收获物(细胞培养基上清液)用酶处理，并通过两个柱层析步骤，Sepharose 6FF尺寸分离层析和Super-Q 650M阴离子交换层析纯化。对于PVS-RIPO来说，两个色谱步骤都是“流通的”，这意味着它不与柱介质结合，因此在流通洗脱液中被洗脱。在第一层析步骤中，使用Sepharose 6FF柱分离细胞培养基中的较低分子量的污染物并作为缓冲液交换步骤。除了使用连续吸光度监测(260nm/280nm处的UV吸收)鉴定主要病毒峰之外，跨峰收集级分并使用实时RT-qPCR进一步分析。色谱图通常包含两个确定的紫外吸收峰。在之前的PVS-RIPO纯化过程中，如Ouelette等人描述的(使用Sepharose 4FF，而不是6FF)，汇集级分的决定基于吸收监测，导致在此阶段的纯化收率约为80％。相比之下，在此步骤中RT-qPCR检测产生了约100％的产率。令人惊讶的是，通过实时RT-qPCR进行级分分析表明，主要的PVS-RIPO病毒峰大致位于小的初始UV吸收峰附近，而较大的后续吸收峰仅包含微量的PVS-RIPO。在某些情况下，A254“小初始峰”和RT-qPCR结果并不完全重叠，表明最初的A254nm峰不一定是由病毒RNA单独引起的。因此，RT qPCR检测在确定要收集的合适级分(使用>107个拷贝/毫升的阈值)用于进一步处理时便呈出乎意料的关键。PVS-RIPO浓度出乎意料地提高，以及Sepharose 6FF层析后获得的污染物减少不需要Ouelette等人描述的CMD阴离子交换和Sephadex G-25层析步骤。汇集所选级分并在第二SuperQ 650M色谱步骤中进一步纯化。SuperQ 650M柱用于从非结合病毒中去除宿主细胞蛋白质污染物。纯化后，将PVS-RIPO组合物浓缩，过滤并装瓶。
通过所公开的方法获得的感染性活PVS-RIPO的平均产量可重现为≥50％，例如在50％-80％的范围内。与Ouelette等人描述的四个色谱步骤相比，纯化过程的时间、成本和复杂性显著降低，因为它仅使用两个柱色谱步骤。这种改进的生产和纯化过程可用于重组脊髓灰质炎病毒或其它病毒的临床生产，从而产生以下一种或多种(效果)：最终纯化产物产量、感染性和纯度的提高，。例如，所公开的方法可以用于临床制造其他重组病毒，例如由不稳定的质粒载体产生的那些。在含有完整天然RNA病毒序列(特别是来自ssRNA病毒的那些)的大肠杆菌中增殖的任何质粒本质上都是不稳定的。例子包括但不限于HIV，人类T细胞噬淋巴细胞病毒(HTLV)，狂犬病，丙型肝炎，麻疹，埃博拉病毒和其他出血性病毒。
检测色谱级分中的靶标
用于检测色谱级分中的分析物的各种快速检测方法可用于改进的纯化过程。检测方法可以允许检测含核酸分析物中的核酸序列(如DNA，cDNA或RNA序列)。示例性的检测方法包括核酸测序、核酸扩增(例如PCR)以及使用标记的序列特异性核酸探针的直接检测。在一个例子中，标签是荧光或酶/比色的。因此，在一些实施例中，检测方法包括快速直接测序(例如来自依诺米那“Illumina”或基于纳米孔的方法)、连接酶链式反应(LCR)，BIAcore(表面等离子体共振)和使用与病毒序列结合的探针的Octet(干涉法)。在一些实施方式中，使用定量PCR(qPCR)。定量PCR通常指的是能够对在PCR反应开始时使用的靶核酸序列的量进行定量的方法。
定量PCR技术使用各种方法进行定量。定量PCR方法的一个例子是RT-qPCR(逆转录定量PCR)。这里，术语“定量PCR”涵盖所有能够对初始存在的靶核酸序列进行定量的基于PCR的技术。术语“实时PCR”表示允许在整个PCR反应期间或实时检测PCR产物的定量PCR技术的子集。实时PCR的原理一般在Held等，Genome Research 6：986-994(1996)中有描述。通常，实时PCR在每个扩增循环测量信号。常规的实时PCR技术依赖于在每个增殖循环完成时发出信号的荧光团。这种荧光团的例子是荧光染料，其在结合双链DNA后以特定的波长发射荧光(例如SYBR绿)。由于PCR产物的积累，每个扩增循环期间双链DNA有所增加，并由此导致荧光强度的增加。用于实时PCR的荧光团的另一个例子是序列特异性荧光报告探针。这种探针的例子是探针和FRET探针。探针包含荧光团和荧光淬灭剂，其可以降低荧光团发出的荧光。在PCR的延伸阶段，探针被DNA聚合酶的核酸外切酶活性切割，释放荧光团。荧光团释放导致荧光信号增加，其与PCR产物的量成比例。FRET探针使用荧光共振能量转移(FRET)。设计两种标记的序列特异性探针以在PCR退火阶段结合PCR产物，其导致能量从供体荧光团向受体荧光团转移。这导致退火阶段的荧光有所增加，这与PCR产物的量成正比。序列特异性报道探针的使用使得靶序列的检测具有高特异性，并且即使在非特异性DNA扩增存在的情况下也能进行定量。荧光探针也可用于多重分析-用于在相同反应中检测几种基因-基于具有不同颜色标记的特异性探针。例如，多重测定可以使用在同一PCR反应混合物中用多种荧光团(包括但不限于以下：FAM，JA270，CY5.5和HEX)标记的几种序列特异性探针。
使用纯化的病毒
用所公开的方法纯化的病毒可临床使用，例如作为疫苗，例如在癌症免疫治疗中或提供保护性免疫应答。
在一个实施例中，纯化的脊髓灰质炎病毒如PVS-RIPO用于治疗癌症患者，例如成胶质细胞瘤。例如，对象可以直接肿瘤给药(每次)约1x 108TCID50。至少两周后，对象可以进行活检以确认癌症的诊断/复发。一旦诊断被确认，对象可以将导管置于PVS-RIPO(5×107TCID50)的对流增强递送。放置导管后，用6.5小时以上向对象注入PVS-RIPO。输液完成后，可以取出导管。可以执行MRI来监测治疗。
在一个实施例中，使用纯化的脊髓灰质炎病毒，例如减毒的萨宾脊髓灰质炎病毒来接种对象以防脊髓灰质炎。例如，纯化的减毒萨宾脊髓灰质炎病毒可以单剂量口服(通常是两滴，其中含有1,000,000感染单位的萨宾1(对PV1有效)，100,000感染单位的萨宾2毒株和60万感染单位的萨宾3)。这种疫苗也可能含有少量抗生素(如新霉素和链霉素)，但不含防腐剂。
在一个实施例中，使用纯化的脊髓灰质炎病毒(例如灭活的脊髓灰质炎病毒)来接种对象以防止脊髓灰质炎。例如，纯化的OPV可以通过以单剂量注射(例如，与白喉、破伤风和无细胞百日咳疫苗一起)进行给药。
实施例1
细胞培养中PVS-RIPO的生产
细胞培养
将两个Vero工作细胞库细胞(批号217002-2)的小瓶解冻。将每个小瓶中的内容物加入到9mL加温的含10％胎牛血清(FBS，Hyclone)的完全培养基(Dulbecco ModifiedEagle Medium，DMEM，Invitrogen)中。进行细胞计数，将细胞在4℃下以1000rpm离心10分钟。将所有细胞重新悬浮并置于一个75cm2烧瓶中。将瓶盖拧松并放入培养箱中。这是第142代(解冻后第1代)。在两次再供给后再一周，将细胞胰蛋白酶化并重新分散在一个新的以20,000/平方厘米接种的75cm2烧瓶中(第143代)。此时细胞的存活率为92％。
将75cm2的细胞烧瓶放大至两个225平方厘米烧瓶，以33,280个细胞/平方厘米(第144代)接种。此时细胞为94％存活。三天后，细胞100％存活。将两个225cm2烧瓶汇集在一起。在汇集之前和之后获得的几个样品的最终细胞密度为213,000至234,000个细胞/平方厘米，样品中的细胞存活率为86％至96％。
从两个225cm2细胞烧瓶所获得的培养物中接种三个225cm2烧瓶(第145代)以扩大至10层细胞培养室，其也可以被描述为“细胞工厂”( Inc.，康宁，纽约)。首先，将来自三个225cm2的细胞扩增到六个225cm2的烧瓶中。将这六个细胞烧瓶(第147代)胰蛋白酶化并收集在一起。从中以39,000个细胞/平方厘米(均为第148代)接种一个五层腔室，一个单层腔室和五个225cm2烧瓶。
使用五层腔室(148代)以42,000个细胞/平方厘米接种一个十层和四个单层腔室。该十层腔室用于其中一种感染。从接种一个十层腔室到感染的时间是90个小时。对四个单层腔室的一个腔室中的细胞进行计数，以确定需要多少病毒来感染该十层腔室。此时的细胞计数为332,932个细胞/平方厘米，细胞为96％存活。另一个单层腔室被用作对照。
由最初的225cm2烧瓶制成的单层(第148代)被用于制造一个五层(第149代)。然后使用该五层腔室以42,000个细胞/平方厘米接种两个十层腔室(第150代)。从接种两个十层腔室到感染的时间为94小时。这两个十层腔室用于其他两种感染。
感染
将一个MVB批次用于感染生产细胞。生产一个PVS-RIPO批次和一个MVB批次的过程总结如下：使用来自世界卫生组织的种子Vero细胞产生一个Vero MCB批次。该Vero细胞通过胰蛋白酶化收集。离心后，将细胞以约1x 107个细胞/mL的浓度重悬浮于90％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亚砜(DMSO)的冷冻保护剂(cyoprotectant)溶液中。一个Vero WCB批次通过Vero MCB批次的扩增按如下所生产：一瓶Vero MCB批次被用于启动一个Vero WCB。在DMEM中传四代后，将含L-谷氨酰胺和含有FBS的Hepes的高浓度葡萄糖，WCB以1mL/瓶的体积和4.7x 106个细胞/mL的浓度装入小瓶中。将装有Vero Master WCB批次的小瓶置于汽相液氮中。使用PVS-RIPO质粒DNA批次通过体外转录来产生PVS-RIPO RNA批次。通过Sal I消化将四十(40)μg的PVS-RIPO质粒DNA批次线性化。用苯酚和氯仿提取线性化的DNA，在≤-70℃下进行乙醇沉淀过夜。将DNA重新悬浮于40uL不含DNase/RNase的蒸馏水中。消化/纯化之前和消化/纯化之后的质粒DNA样品通过琼脂糖凝胶电泳分析以确定产物大小和回收率。
使用二十(20)μg线性化的DNA作为模板，在两个相同的反应中合成PVS-RIPO RNA。每个反应使用10μg线性化的DNA进行。为了建立反应，将10μg线性化质粒DNA加入到体外转录反应混合物(RiboMAX大规模RNA生产系统，Promega)中至终体积为100μl。转录反应在37℃下孵育2.5-3小时。当反应完成时，将反应试管置于≤-70℃下储存。来自合格的工作细胞库(WCB)的Vero细胞用于电穿孔步骤。将一个Vero细胞WCB批次的两个小瓶在含有L-谷氨酰胺、不含酚红、富含10％FBS的DMEM中进行扩增，并在37℃和5％CO2下孵化三代。
通过加入胰蛋白酶-EDTA(0.05％胰蛋白酶，0.5mM EDTA)将Vero细胞胰蛋白酶化，并在37℃和5％CO2下孵化4-6分钟。收集胰蛋白酶化的细胞并在约4℃和1000RPM下离心10分钟。将收集的细胞悬浮于100±2mL PBS(不含钙和镁)中。细胞悬液样品被用于确定细胞计数。在1000RPM和4℃的设定下离心10分钟收集剩余细胞。除去澄清的PBS，并将细胞沉淀重新悬浮于新鲜的PBS中，直至最终计算的细胞密度为1.25x 107个细胞/mL。将大约55μg的PVS-RIPO RNA和9mL扩增的Vero细胞合并，并以0.8mL等分转移到比色杯中。使用Bio-RadGene Pulser II电穿孔单元对比色杯的内容物进行0.5千伏和0.25微法的两次电击。在室温下孵化15至20分钟后，将比色杯内容物转移至含有DMEM/F12培养基(英杰公司)的T75烧瓶中。将T75瓶在33℃和5％CO2下孵化。在孵化的第三天观察到完全的细胞病变效应。
收集烧瓶中的内容物并通过离心进行澄清以产生初始病毒种子(IVS)批次。Vero细胞扩增如下：将Vero细胞接种到两个含有DMEM、含L-谷氨酰胺、不含酚红(DMEM，英杰公司)和含10％FBS(Hyclone)的T25烧瓶中，并在37℃和5％CO2下，在二氧化碳培养箱中孵化。将细胞传代三次后，将Vero细胞进一步扩增至50个T162烧瓶。在第三次传代的第三天，在显微镜下检查50个T162烧瓶内容物以确定细胞状态。选择43个纯的培养物并且至少95％融合的烧瓶。检查所选择的T162烧瓶中的一个烧瓶中的细胞以确定细胞数目和活力，并将另一个烧瓶作为细胞质量对照烧瓶进行孵化。在用DMEM：营养混合物F12 1：1的不含酚红的混合物(DMEM/F-12，Invitrogen)接种后，将剩余的41个烧瓶中的一个作为阴性对照。将PVS-RIPO电穿孔后的种子批次从储存中移出，在室温下解冻并使用DMEM/F-12培养基稀释。用PVS-RIPO电穿孔后种子批次以0.5的感染复数(MOI)感染40个T162烧瓶(含有扩增的Vero细胞)。加入新鲜的DMEM/F-12细胞培养基后，接种的烧瓶在33℃和5％CO2下孵化。在培养过程中监测病毒感染的培养瓶和对照培养瓶的属性，如可见污染、细胞状况和融汇百分数。
在感染后70小时，终止培养，检查烧瓶的属性，如可见污染、细胞状况和融汇百分数，然后收集。将烧瓶的内容物转移到离心瓶中，并在4℃和2500RPM下离心33分钟以清除细胞碎片。将含有PVS-RIPO病毒的上清液合并到850cm2的滚瓶中。将合并的上清液分别转移到以20mL和80mL等分的2个30mL和24个125mL PETG瓶中。另外，用1mL等分填充12个2mL冷冻管。将剩余的上清液(总共3.8mL)转移至3个2mL冷冻管中，总共15个标记为PVS-RIPO主病毒种子批次的2mL冷冻管。将11个2mL冷冻管，23个125mL PETG瓶和2个30mL PETG瓶在≤-70℃下冷冻，随后转移至≤-70℃受控存储器。将4个2mL冷冻管进行分析/生物药物质量控制，用于滴度(通过pfu和TCID50)、病毒颗粒和DNA序列释放测试。释放测试的其余部分是在适当的情况下进行，并开发了PVS-RIPO材料处理程序。
先前部分中制备的具有细胞培养物的3个十层腔室用Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(DPBS，英杰公司)洗涤，然后在DMEM/F-12(英杰公司)中用0.1的感染复数(MOI)感染。将P1主病毒库(批号#L0403006)的一个80mL等分解冻，并使用21mL等分在33℃下、5％CO2培养箱中感染每个十层细胞腔室72小时。使用显微镜在视觉上确认100％细胞病变效应(CPE)后，在感染后70小时收集10层细胞工厂。将收集的物质在4℃下以3,800rpm离心20分钟。纯化前立即处理上清液(批号L1308002B，参见表3)或在-70℃下储存至多九天(批号#L1308002C和L1308002D，参见表3)。
实施例2
PVS-RIPO的纯化
根据图5中所示的示意图方案纯化来自3个十层腔室中每一个腔室的收集物，即核酸酶处理，再进行凝胶过滤层析后进行qPCR分析，然后进行阴离子交换层析，然后通过渗滤进行浓缩。对三次生产运行中的每一次进行纯化方案的重复。
核酸酶处理
酶(西格马-奥德里奇，圣路易斯，密苏里州(Sigma-Aldrich，SaintLouis，MO))是消化溶液中的游离RNA和DNA的一种内切核酸酶。完全包封的病毒核酸(即包含在完整的病毒颗粒中)不受影响。需要酶来减少和/或去除1)宿主细胞DNA(gDNA，mtDNA)和RNA(tRNA，rRNA)；2)其它潜在的污染性DNA/RNA(如内源性/外源性病毒)，如果存在的话；和3)未封装的游离病毒RNA。为了安全起见，需要去除游离核酸，降低收获粘度，并且提高下游病毒检测方法如A254nm和RT-qPCR的信噪比。酶的性能取决于其所含的缓冲溶液。
将100mM氯化镁(MgCl2)加入到三种澄清收集物中的每一种中，以在添加酶之前获得1mM MgCl2的最终浓度。酶的添加基于收集量来实现每次收集中最终的酶浓度为50μg/ml。然后将每个收集瓶在2-8℃孵化16-24小时。
凝胶过滤层析
向10cm(内径(i.d.))BPG柱(GE医疗-生命科学，匹兹堡，宾夕法尼亚(GEHealthcare-Biosciences，Pittsburgh，PA))中装入3140mL琼脂糖6Fast Flow(FF)树脂(GE医疗-生命科学)至40cm床高。使用之前，填充柱用0.5N NaOH消毒，并在环境温度下放置26-28小时。用水冲洗柱子，柱子被保存在0.05M NaOH中直到纯化过程。在纯化之前，用5M NaCl冲洗柱子，并在纯化过程开始之前使其置于5M NaCl溶液中24小时。然后向柱中加入两倍柱体积的4.7mM Na2HPO4，1M NaCl pH7.5，并用三倍柱体积的4.7mM Na2HPO4、42mM NaCl pH7.5来平衡，流速为50mL/min。
对于三种纯化中的每一种，将经酶处理的收集物以30厘米/小时的单柱注射，25％柱体积施用。使用4.7mM Na2HPO4，42mM NaCl，pH 7.5的缓冲液洗脱柱子。使用三个波长(280/215/254nm)连续监测洗脱液的吸光度，并且还连续测定电导率。以体积150-200mL收集每个琼脂糖6FF色谱柱步骤的洗脱部分。通过实时RT-qPCR(参见实施例3)分析来自全部三次运行的选定部分，并基于来自实时RT-qPCR分析的PVS-RIPO拷贝数(>1x107个拷贝/mL)进行汇集。然后在第二个色谱步骤中将汇集的物质纯化。
阴离子交换色谱
2.6cm(i.d.)XK柱用53mL Super Q650M树脂(东曹生命科学，泰森德洛，比利时，(Tosoh Bioscience，Tessenderlo，Belgium))填充至最终床高为10cm。填充柱用0.5N NaOH消毒，并在环境温度下放置1小时。将填充的柱子用水冲洗以除去NaOH，然后用5M NaCl冲洗柱，并使其在5M NaCl溶液中放置24小时。
然后向柱中加入4.7mM Na2HPO4，1M NaCl，pH 7.5，并以10mM/min的流速，用4.7mMNa2HPO4，42mM NaCl，pH 7.5进行平衡。对于三种纯化物中的每一种，将琼脂糖6FF合并的部分用于单次柱注射。使用4.7mM Na2HPO4，42mM NaCl，pH 7.5缓冲液洗脱柱子。使用三个波长(280/215/254nm)连续监测洗脱液的吸光度，并连续监测电导率。所收集的主峰为流通物的峰；污染物被附着于柱上。收集主峰后，使用4.7mM Na2HPO4，1M NaCl pH 7.5将柱子条带化，并将条带峰收集在次级容器中，并且一次通过SDS-PAGE分析。
浓缩/渗滤
将在Super Q 650M柱后收集的流通物高峰浓缩至约50mL，并用500mL的50mMNa2HPO4，150mM NaCl，pH 7.4渗滤。在每个浓缩步骤中，切向流过滤(TFF)过滤器用2×25mL的50mM Na2HPO4，150mM NaCl，pH 7.4冲洗。收集渗透物，并且一次通过SDS-PAGE分析。将冲洗液和浓缩纯化的PVS-RIPO合并在一起，并将20％人血清白蛋白(HSA)(BaxterPharmaceuticals，迪尔菲尔德，IL)加入到纯化的PVS-RIPO中，得到50mM Na2HPO4，150mMNaCl，pH7.4，0.2％HSA的最终制剂。
汇集和装瓶
最终配制的三批PVS-RIPO合并在一起，使用0.2μm 20过滤器进行无菌过滤。然后将无菌过滤材料以0.5mL体积分配到3mL玻璃小瓶中。小瓶储存在-70℃。
实施例3
分析纯化的PVS-RIPO
在噬菌斑测定(NIH，国家癌症研究所－弗雷德里克(Frederick)，生物制药开发计划(BDP)标准操作程序(SOP)22163脊髓灰质炎病毒的噬菌斑检测)中测试来自凝胶过滤和层析步骤中所选择的级分。在汇集之前，在最终大块材料上，在三次纯化操作的每一次的最后进行TCID50(使用Hep-2C细胞对脊髓灰质炎病毒的BDP SOP 22165TCID50测定)。通过实时qPCR(检测和定量核酸的BDP SOP 22195定量PCR(qPCR)方法)测定来自琼脂糖6快速流动色谱的级分以监测PVS-RIPO。
使用一种靶向PVS-RIPO中HRV-2IRES区域的基于的RT-qPCR(应用生物系统公司-Applied 福斯特市，加州(Foster City，CA))扩增子来测试琼脂糖6FF级分的总PVS-RIPO病毒RNA。在实时RT-qPCR扩增之前，使用(瓦伦西亚-Valencia，CAQ)病毒RNA微量制备试剂盒来提取级分样品。使用ABI Primer Express软件(应用生物系统公司)设计引物和双荧光染料标记探针。71-bp的HRV-2IRES(PVS1)扩增子由正向引物：5’-(AAC CCA ATG TGT ATC TAG TCG TAA TGA)(SEQ ID NO：1)；反向引物：5’-(TGAAAC ACG GAC ACC CAA AG)(SEQ ID NO：2)；和探针：5’-[6FAM]-(CAATTG CGG GATGGG ACC AAC T)-[TAMRA](SEQ ID NO：3)组成。用无核酸酶水(NFW)将引物和探针分别稀释至10和5pmol/μl。该反应由25μl含有ROX染料的1－步RT-PCR 2X Master Mix，1μlRNase抑制剂，1μl NFW，1μl正向引物，1μl反向引物，1μl 探针和20μL样品为50μl最终反应体积。(具有ROX染料的1－步RT-PCR 2X Master Mix购自应用生物系统公司)。将反应混合物加载到96孔板中，用光学膜覆盖，并用ABI型号7900HT 96孔序列检测系统(应用生物系统公司)使用5步qPCR步骤(2:00分钟，50.0℃；60.0℃下45分钟(RT步骤)；5:00分钟，95.0℃；45分钟；20秒45次循环，94.0℃；1:00分钟，62.0℃)扩增。用于定量的扩增子cDNA标准曲线由PVS-RIPO质粒DNA制备，并按每个反应1ng至1fg，10倍连续稀释成NFW。在每个测定中使用PCR抑制，提取液，缓冲液/NTC，和逆转录对照。
来自三次纯化操作中每一次的纯化产品均表现出一致的结果。表3显示了纯化收率。总的PVS-RIPO收率达到或超过60％。检测到的恢复可变性可能部分归因于斑块测定的变化。因此，该过程的关键阶段已通过终点稀释测定来分析样品。通过该测定，最终配制的纯化块体的结果分别为5.83x 1011，3.77x 1011，和2.98x 1011TCID50。这些结果显示出三次纯化中恒定的产量和浓度。
三次纯化操作中琼脂糖6FF柱和Super Q 650M柱的层析图的比较显示了在凝胶过滤和阴离子交换层析步骤中纯化的一致性。琼脂糖6FF色谱图包含两个明确的峰。通过实时RT-qPCR的级分分析表明PVS-RIPO主峰位于小的初始峰值内，如图6所示。紧随其后的大峰似乎是残留的盐。当在254nm波长处具体监测时，光学监测的色谱图和实时RT-qPCR结果的比较性叠加表明，一些含有PVS-RIPO的级分不出现在光学检测峰内。因此实时RT-qPCR结果对于确定哪些级分含有PVS-RIPO(使用>107拷贝/mL的截断值)并且应该汇集哪些用于进一步处理是关键的。SuperQ 650M色谱图显示了一个大的流通物峰。在SuperQ 650M纯化步骤中，在流通的过程中有一些外来的污染物。紧随主峰收集之后，当柱子用4.7M Na2HPO4，1MNaCl pH 7.5缓冲液分离时出现大峰。为了确认PVS-RIPO材料在整个过程中不丢失，对从该峰收集的样品以及来自浓缩步骤的渗透物样品进行SDS-PAGE分析。两种测定表明在任一样品中均不存在PVS-RIPO。
在最后的浓缩/渗滤过程中，病毒的外观由半透明变为乳白色，因为它变得更浓。所有三个最终的浓缩样品显示出相同的外观。当它们汇集在一起并进行过滤时，外观从乳白色变为透明/半透明产品。过滤前TCID50 1.4X of 1012和过滤后2.4X 1012表明过滤过程没有产物的损失。在分装至小瓶前PVS-RIPO产品的最终浓度确定为6.09X 109TCID 50/mL。
表3.纯化结果的总结。
实施例4
疫苗组合物的纯化
临床用单纯性疱疹病毒(HSV-1)的纯化利用了酶进行处理，然后通过Q-Sepharose XL和Sepharose 4FF色谱层析。由于HSV衣壳的大小，不使用无菌过滤。这些问题与PVS-RIPO相同，因为病毒级分对宿主细胞DNA/RNA或蛋白质的位置通过A280或A260测量并不立即显而易见。因此，可使用如本文所述的qPCR来帮助鉴定含有HSV-1的级分。作为实时RT-qPCR的替代，表面纤溶酶共振(BIAcore)或表面干涉测量(Octet)方法可用于定量BIAcore芯片或Octet传感器上的HSV-1衣壳表位(结合)密度。从而唯一确定柱中级分中病毒位置和数量。
实施例5
非致病性溶瘤脊髓灰质炎病毒嵌合体(PVSRIPO)最终分装产品批号L0904010的化学、制造和对照信息
这个例子描述了生产用于胶质母细胞瘤治疗的PVS-RIPO批号L0904010的方法。摘要在图7中提供。简言之，纯化的PVS-RIPO质粒DNA批号L0401014经转录产生PVS-RIPO RNA。然后将PVS-RIPO RNA电穿孔成合格的Vero细胞并扩增以产生初始病毒种子批号L0402026(P0)。初始病毒种子批号L0402026在合格的Vero细胞中扩增以产生主病毒种子批号L0403006(P1)。扩增并纯化主病毒种子批号L0403006以产生纯化的过滤容量批次L0904009(P2)。填充纯化的过滤容量批次L0904009以生产FVP批次L0904010。将所得浓缩的纯化病毒配制在含有0.9％氯化钠、pH7.4±0.2％人血清白蛋白的50mM磷酸钠中，并进行无菌过滤。
对PVSRIPO-kan/pUC19质粒DNA序列(批号L0401014)进行全长测序。批号L0401014在现行优良制造规范(CGMPs)下生产和纯化，并进一步用于生产主病毒种子批次L0403006，随后用于生产PVS-RIPO纯化的无菌原料批次L0904009和最终的瓶装产品批次L0904010。该序列被发现与PVS-RIPO质粒参考序列批号L0305007是100％同源的。对质粒DNA进行的BLAST搜索表明不存在致癌、毒素或意外的病毒序列。
还使用来自主病毒种子批次L0403006、纯化的无菌原料批次L0904009和最终的瓶装产品批次L0904010的材料进行PVS-RIPO基因组序列测序，并证实与PVS-RIPO参考序列批次L0401014具有100％的同源性。
材料
用于制造PVSRIPO的动物来源的原料包括胎牛血清(FBS)、人血清白蛋白和胰蛋白酶-EDTA。原材料制造商提供的文件表明：
(1)酶的制备是通过在发酵生长培养基中使用来自牛奶的酪蛋白酸进行微生物发酵来重组生产的。自1990年以来，牛奶来源于在本地繁殖的动物中没有疯牛病记录的的国家，并被认为适合人类食用。
(2)FBS由经美国农业部检测的位于美国的屠宰场所采集的胎牛血制成，并对牛病毒检测呈阴性。
(3)HSA来自百特医疗保健公司(Baxter Healthcare Corporation)，这是一家获得美国FDA许可的制造和生产销售用于人类的血浆衍生物的工厂。依据适用的美国FDA规定，仅从美国捐赠者采集血浆。
(4)胰蛋白酶为猪源并来源于美国/加拿大。原料胰蛋白酶经测试发现猪细小病毒阴性，并在配制前照射。
遗传结构
a.PVSRIPO质粒
将重组PVSRIPO DNA(7.7kb)克隆到修饰的pUC19载体(携带卡那霉素抗性基因而非氨苄青霉素抗性基因)中，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中以扩增质粒DNA。
PVSRIPO-kan/pUC19质粒图谱如图8中所示。
b.PVS-RIPO病毒基因组
PVS-RIPO病毒基因组由5'非翻译区(5'-NTR)，PVS-RIPO开放阅读框(ORF)和3'非翻译区(3'-NTR)组成。5'-NTR含有人类鼻病毒2型内部核糖体进入位点(HRV-IRES)。PVS-RIPO开放阅读框编码单个蛋白质，蛋白水解加工成病毒结构蛋白(P1)和非结构蛋白(P2和P3)。P1，P2和P3将被进一步处理。除了HRV-IRES区域之外，PVS-RIPO基因组与减毒的脊髓灰质炎病毒I型萨宾株相同。PVS-RIPO基因型为5'-三叶草[PV1(M)；登录号NC_002058；nt 1-109]-限制性内切酶EcoRI-IRES的裂解位点[HRV2；登录号XO2316；nt 105-610]-开放阅读框[PV1(S)；登录号V01150；nt 743-7369；nt 748(t至a)]-3'UTR[PV1(S)；nt 7370-7441]-聚(A)。
PVSRIPO质粒DNA的生产
批号L0401014PVSRIPO质粒DNA生产方法如图9所述。
a.宿主细胞系统的描述和测试
宿主细胞系统，大肠杆菌DH5α从英杰公司获得，随后在BDP中进行修饰和扩增以生产大肠杆菌DH5α主细胞库(MCB)批次L0301014，随后生产大肠杆菌DH5α工作细胞库(WCB)批号L0303011。
通过在三个500mL烧瓶中扩增一个小瓶(大约1mL)的英杰公司大肠杆菌DH5α批号1159251来生产大肠杆菌DH5αMCB批号L0301014，每个烧瓶含有150mL无菌制备的培养基(氯化钠10g/mL，大豆胨10μg/mL，酵母提取物5g/mL)。冷冻的小瓶在37±1℃的培养箱中解冻5分钟。将接种的培养基在37±1℃和150±10rpm下孵化约18小时。将甘油溶液与烧瓶1的内容物(OD600＝4.31)混合至最终甘油浓度为20％。细胞悬浮液以1.0±0.2mL/小瓶装瓶，得到144个装满的小瓶。使用控制速率冷冻将填充的小瓶冷冻至≤-70℃，并放入≤-70℃的受控存储器中。大肠杆菌DH5αMCB批号L0301014的规格和释放测试结果在图10的分析证书中提供。
通过在3个125mL第一阶段种子烧瓶(接种体积约400μL)(每个烧瓶含有40mL无菌制备的培养基(氯化钠10g/mL，大豆胨10g/mL，酵母提取物5g/mL，和七水合硫酸镁5g/mL))、然后是2个两升的第二阶段种子烧瓶(接种体积约4mL)(每个烧瓶含有390mL相同的无菌制备的培养基)中扩增两个小瓶(两个小瓶中的总数大约＝2mL)的大肠杆菌DH5αMCB批号L0301014来生产大肠杆菌DH5αWCB批次L0303011。将冷冻的小瓶在37±1℃的培养箱中解冻5分钟。接种的培养物在37±1℃和235rpm的设定速度下孵化。将第一阶段种子烧瓶孵化过夜(约16小时)至OD 600＝2.5，并将第二阶段种子烧瓶孵化约2.6小时至OD 600＝0.361。将第二阶段种子烧瓶1的内容物在以下设定下离心分离7分钟：1600×g和4℃。将细胞沉淀物重新悬浮于100mM氯化钙/15％v/v甘油溶液中，并在以下设定下离心5分钟：1100×g和4℃。将得到的细胞沉淀物重新悬浮于100mM氯化钙/15％v/v甘油溶液(最终甘油浓度为15％)中并以0.15mL/小瓶的体积装瓶，得到95个装满的小瓶。将装满的小瓶在干冰/乙醇浴中冷冻并置于≤-70℃的受控存储器中。大肠杆菌DH5αWCB批号L0303011的规格和释放测试结果在图11的分析证书中提供。
b.纯化原始PVS-RIPO质粒DNA以生产纯化的PVS-RIPO质粒DNA批号L021217
原始PVS-RIPO质粒DNA由杜克大学医学院提供。该材料用于产生另外的纯化质粒DNA。将10微升(μL)原始PVS-RIPO质粒DNA转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(英杰公司目录号18263-012)中。通过琼脂糖凝胶电泳和限制性内切酶消化来分析应用Plasmid Mini和Maxi试剂盒(Qiagen目录号分别为27104和12165)所得的十八个转化体中提取的质粒DNA和从杜克大学医学院获得的原始PVS-RIPO质粒DNA。分析结果表明，从2.5kb到10.3kb观察到多个条带。选择10个转化体进行进一步研究。基于限制性酶消化分析，对来自被鉴定为S-1的转化体中一个的DNA进行测序，发现具有经由BLASTn确定为细菌微型转座子IS10R的1.3千碱基对(Kb)的插入。其他菌落以空载体(约2.5kb)、二聚体载体(约5.0kb)或PVSRIPO质粒DNA(约10kb)出现。
琼脂糖凝胶电泳用于对从杜克大学医学院获得的原始PVS-RIPO质粒DNA的条带模式进一步分析。从凝胶上切下8个条带，然后用MiniElute凝胶提取试剂盒(凯杰公司目录号27104)纯化，并保存于-20℃。将来自八个条带中的每一条纯化的DNA转化到DH5α感受态细胞中，并将选择的转化体在补充有50μg/mL卡那霉素的液体Soy-LB培养基中于37℃过夜生长。使用QIAprep Spin Mini试剂盒(凯杰公司目录号27106)纯化的DNA通过琼脂糖凝胶电泳和限制酶消化进行分析。鉴定出#6-3(来自条带#6转化)和#5-3(来自条带#5转化)的两个克隆似乎具有正确的质粒大小并被选择用于进一步的研究。
将两个克隆#6-3和#5-3分别在含有50μg/mL卡那霉素的Soy-LB培养基中在37℃和120转/分钟(RPM)下进行扩增，收集细胞。使用QIAfilter质粒Mega试剂盒(凯杰目录号12281)进行DNA纯化。限制性消化分析表明来自两个克隆中的每一个的纯化质粒DNA具有正确的限制性模式，并且不存在1.3kb的插入片段。从克隆#6-3扩增的批次被分配为批号L021217，并且对纯化的批次L021217DNA进行测序。所得序列被发现与预期的正确序列100％同源。批号L021217在≤-70℃下以1mL等分试样冷冻。
c.纯化的PVS-RIPO质粒DNA登录库批号L0305007的生产和检测
纯化的PVS-RIPO质粒DNA批号L0305007登录库由纯化的PVS-RIPO质粒DNA批号L021217来生产。将2个纯化质粒DNA批号L0212017和6个DH5α感受态工作细胞库批号L030301的小瓶从≤-70℃的受控存储器中取出，并在冷包(0至-20℃)上解冻。将六个解冻的DH5α感受态工作细胞库Lot L0303011小瓶的内容物合并，并将100μL等分到三个冷却管中的每一个中。将纯化的DNA批次L021017在不含内毒素的10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0中稀释5倍。将一微升稀释的DNA批号L021217加入到两个冷冻管中，并将第三个冷冻管用作阴性对照。将三个试管密封并在冷却包装上孵化约30分钟。然后通过将这三个管置于40±2℃的水浴中大约42秒来热激这三个管。将试管在冷却包上冷却约4分钟。在生物安全柜(BSC)中工作时，将大约900μL的Soytone-LB培养基(参见表4的Soy-LB培养基配方)加入到三个试管中的每一个中，并将管在37℃和120RPM下孵化大约一个小时。将来自含有质粒制备溶液的两个试管中每一个试管的等分试样(100,200和400μL)均匀分布在Soytone-LB+50μg/mL卡那霉素琼脂平板上(参见表5的Soy-LB琼脂平板配方)，共有六个平板。将阴性对照管(200μL)的内容物均匀分布在Soytone-LB+50μg/mL卡那霉素琼脂平板上。将七个平板在37℃孵化过夜。
表4：Soy-LB培养基配方
表5：Soy-LB琼脂平板配方
成份 制造商和产品目录号 每升数量
大豆胨 Difco SE50MAF 10.0g
氯化钠 J.T.Baker 3629-07 10.0g
酵母抽提物 Difco 0127-08 5.0g
琼脂 Difco 214530 15.0g
使用各自含有加入了50μg/mL卡那霉素的无菌50±1mL蛋白胨LB培养基的250mL摇瓶来制备六种起始培养物。检测接种的蛋白胨-LB+50μg/mL卡那霉素琼脂平板的菌落生长，并用单一菌落接种六种发酵剂培养物的每一种。将接种的烧瓶在37℃和120RPM的设定下孵化过夜。
从每个起始培养物瓶中取出1毫升样品，通过琼脂糖凝胶电泳进行DNA分析，培养物瓶储存在2-8℃。选择一个烧瓶向四个2L培养物烧瓶(含有补充50μg/mL卡那霉素的600mL大豆胨-LB培养基)中每一个提供约3mL(0.5％)接种物。将接种的烧瓶在37℃和120RPM的设定下孵化过夜。
通过在4℃，6000×g的设定下离心约15分钟收获培养物。弃去上清液，收集总计16.1克细胞体。将细胞体分成四个小批，并使用Qiagen EndoFree Plasmid Giga试剂盒(凯杰目录号12391)纯化。纯化后，将四个小批中的每一个都储存在2-8℃。合并四个小批量，并使用无内毒素的10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0将其稀释至终浓度为0.5±0.2mg/mL。将纯化的PVS-RIPO质粒DNA以1.0±0.1mL的等分试样填充到2mL冷冻管中，标记为PVS-RIPO质粒DNA批号L0305007，并且储存在≤-70℃下用于进一步的生产用途。表6中提供了PVS-RIPO质粒DNA批号L0305007的测试总结。
表6：PVS-RIPO质粒DNA批号L0305007测试总结
d.发酵和DNA纯化以生产纯化的PVSRIPO质粒DNA批号L0401014
使用纯化的PVS-RIPO质粒DNA批号L0305007和GMPDH5α感受态工作细胞批号L0303011进行DNA转化以生产纯化的PVSRIPO质粒DNA批号L0401014。将感受态细胞(DH5α感受态工作细胞批号L0303011)解冻，温和混合，并以100μL等分试样转移到冷冻聚丙烯微量离心管(在湿冰上)。
纯化的DNA批号L0305007在不含内毒素的10mM Tris-HCl，pH8.0,1mM EDTA中稀释10倍。将1微升稀释的DNA加入含有感受态细胞等分试样的微量离心管中。将微量离心管的内容物温和混合。将感受态细胞/纯化的DNA悬浮液在冰上孵育30±1分钟，然后在设定为40±2℃的水浴中进行45±2秒的热激步骤。将感受态细胞/纯化的DNA悬浮液置于湿冰上2分钟。将室温的Soy-LB培养基(0.9mL)加入每个微量离心管中。表4中描述了Soy-LB培养基配方。将悬浮液在速度设置为120RPM下37℃±1℃摇动61分钟，并且在100μL，200μL和400μL等分试样中扩散至用50μg/mL卡那霉素制备的选择性琼脂平板(Soy-LB琼脂平板)上。表5中描述了选择性琼脂培养基。将平板在37±1℃孵化20小时58分钟，第二天检查菌落的生长。
使用含有50μg/mL卡那霉素的50mL Soy-LB培养基在250mL带挡板的烧瓶中制备十二(12)个起始培养物。用来自选择性琼脂平板的新鲜单菌落接种12个起始培养物中的每一个。将12个起始培养物生长22小时至吸光度600nm(OD600)大于或等于1的光密度。在37±1℃的摇床/培养箱中以120RPM的速度进行孵化。第二天，通过Mun I限制性消化分析12个发酵剂培养物中的每一个，发现条带在所预测大小的10％以内(检测报告QC-020628)。使用起始培养物之一，将3mL(0.5％)接种物接种到四个含有600mL富含50μg/mL卡那霉素的Soy-LB培养基的2升摇瓶的每一个中。接种的2升摇瓶在摇床/培养箱中生长18.5小时。在37±1℃下以120RPM的速度进行孵化。通过限制性消化测试培养物，发现与对照和预期模式一致。4℃、6,000×g离心15分钟收获培养物。收集细胞，分成四小批，并使用Qiagen EndoFreePlasmid Giga试剂盒(凯杰公司目录号12391)纯化。四小批中的每一个都通过限制性消化进行测试，发现与对照和预期模式一致。合并四个小批，并使用无内毒素10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0将其稀释至0.3±0.2mg/mL的终浓度。将纯化的PVSRIPO质粒DNA以1.0±0.1mL等分试样填充到2mL冷冻管中，标记为PVSRIPO质粒DNA批号L0401014，并且储存在≤-70℃用于进一步制造用途。
分析证明书(图12)中显示了检验PVSRIPO质粒DNA批号L0401014的检测、方法、描述和结果。
生产PVSRIPO初始病毒种子批号L0402026(P0)
在BDP病毒生产设备中进行的生产PVSRIPO初始病毒种子批号L0402026(P0)的制造过程总结在图13中并所述如下。
a.宿主细胞系统的描述和测试
使用Vero细胞(世界卫生组织[WHO]种子，第134代，1987年10月)生产Vero MCB批号2003-0049。Vero细胞通过胰蛋白酶化收获。离心后，将Vero细胞以约1×107个细胞/mL的浓度重悬浮于90％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亚砜(DMSO)的冷冻保护剂溶液中。VeroMCB批号2003-0049的释放测试、方法、描述和结果的总结包括在图14所示的分析证书中。
Vero WCB批号217002-2是由Vero MCB批号2003-0049扩大生产的。一瓶Vero MCB批号2003-0049被用于启动一个Vero WCB。在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、含有含FBS的Hepes高葡萄糖w/L-谷氨酰胺中传4代后，WCB以1mL/瓶的体积和4.7×106个细胞/mL的浓度装瓶。将标记为Vero Master WCB批号217002-2的小瓶置于汽相液氮中。Vero WCB批号217002-2的释放测试、方法、描述和结果的总结包括在图15中。释放测试之一是致瘤性测试，其在Vero工作细胞库批号217002-2上使用已传代四次的细胞进行。测试结果表明VeroWCB在这些条件下是非致瘤性的。Vero WCB批号217002-2在整个PVSRIPO病毒生产中都有使用。从WCB的起始代为第142代。
b.体外转录(L0402001)合成PVS-RIPO RNA
使用PVS-RIPO质粒DNA批号L0401014通过体外转录生产PVS-RIPO RNA批号L0402001。通过Sal I消化将四十(40)μg的PVS-RIPO质粒DNA批号L0401014线性化。用苯酚和氯仿提取线性化DNA，在≤-70℃进行乙醇沉淀过夜。将DNA重悬于40μL不含DNase/RNase的蒸馏水中。通过琼脂糖凝胶电泳分析消化/纯化之前和消化/纯化之后的质粒DNA样品，以确定产物大小和回收率。
使用二十(20)μg线性化的DNA作为模板在两个相同的反应中合成PVSRIPO RNA。每个反应使用10μg线性化的DNA来进行。为建立反应，将10μg线性化质粒DNA加入到体外转录反应混合物(RiboMAX大规模RNA生产系统，普洛麦格-Promega，目录号P1300)中至终体积100μL。转录反应在37±1℃孵化2.5-3小时。当反应完成时，将反应管放置在≤-70℃下储存。
为了检查产物大小并从反应估计RNA的收率，使用不含DNase/RNase的蒸馏水和RNA样品缓冲液将反应混合物稀释1至10或1至20。然后将稀释的反应混合物连同RNA梯度标准物(RNA Ladder 0.24-9.5kb，英杰公司，目录号15620-016)一起加载到RNA变性琼脂糖凝胶[Reliant Gels，1X MOPS缓冲液中1.25％SeaKem Gold，Lonza(以前称为Cambrex)目录号54948)上。发现观察到的RNA体外转录产物在琼脂糖凝胶上具有预期的大小。反应混合物中的RNA的预估浓度为6.6mg/mL。
c.电穿孔生产PVSRIPO初始病毒种子(批号L0402026)
来自合格的工作细胞库(WCB)批号217002-2的Vero细胞用于电穿孔步骤。VeroWCB在BDP建立，并在此处进行描述。将2瓶Vero细胞WCB批次L217002-2在含有富含10％胎牛血清并不含酚红的L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM)中进行扩增，并在37℃和5％CO2的设定下孵化传三代。通过加入胰蛋白酶-EDTA(0.05％胰蛋白酶，0.53mMEDTA)将Vero细胞胰蛋白酶化，并在37℃和5％CO2的设定下孵育4-6分钟。收集胰蛋白酶化的细胞并在约4℃和1000RPM下离心10分钟。将收集的细胞悬浮于100±2mL PBS(不含钙和镁)中。使用细胞悬液的样品来确定细胞计数。通过在1000RPM和4℃的设定下离心10分钟收集剩余的细胞。除去澄清的PBS并将细胞沉淀物重新悬浮于新鲜的PBS中，直至最终计算的细胞密度为1.25×107个细胞/mL。
将大约55μg的PVS-RIPO RNA(体外转录批号L0402001)和9±0.2mL扩增的Vero细胞合并并转移至0.8±0.01mL等分试样的比色杯中。使用Bio-Rad Gene Pulser II电穿孔单元对比色杯的内容物进行0.5千伏(kv)和0.25微法(μF)的两次电击。在室温下孵化15至20分钟后，将比色杯内容物转移至具有DMEM/F12培养基(英杰公司，目录号21041-025)的T75烧瓶中。将T75瓶在33℃和5％CO2的设定下孵育。重复相同的过程以生产总共20个用PVS-RIPO RNA转染的Vero细胞的T75烧瓶。另外的两个对照烧瓶仅包含电穿孔后的Vero细胞并且Vero细胞不经受电穿孔。在培养期间监测培养瓶内容物的细胞病变效应(CPE)。在含有用PVS-RIPO RNA转染的Vero细胞的所有烧瓶中，在孵化的第三天观察到完全的CPE。
在生物安全柜内进行操作，收集烧瓶内容物，然后通过离心澄清以产生初始病毒种子批号L0402026(P0)。在2500RPM的离心条件下离心32分钟后，收集含有PVS-RIPO病毒的上清液。然后将上清液合并并转移到60mL等分试样中的6个125mL聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETG)瓶中，并以1mL等分试样转移到4个2mL冷冻管中。将样品提交至过程分析(也称为生物制药质量控制)以进行过程中的测试。六个瓶子被标记为PVS-RIPO电穿孔后的种子批号L0402026，并被转移到≤-70℃储存。
PVSRIPO主病毒种子批号L0403006(P1)的生产和检测
PVSRIPO主病毒种子批号L0403006(P1)的制造过程总结在图16中。
a.Vero细胞的扩增
将两小瓶Vero细胞(WCB批号217002-2)接种到包含含有10％FBS(Hyclone目录号SH30070)的不含酚红的L-谷氨酰胺的DMEM(DMEM，英杰公司目录号21063)的两个25cm2(T25)烧瓶中。并置于37℃和5％CO2的CO 2培养箱中孵化。将细胞传代三次后，将Vero细胞进一步扩大至50个162cm2(T162)烧瓶。在第三代孵化的第三天，在显微镜下检查50个T162烧瓶的内容物以确定细胞的状态。选择四十三(43)个纯培养物，至少95％融合的培养瓶。检查一个所选定的T162烧瓶中的细胞以确定细胞数量和存活力，另一个选定的烧瓶作为“细胞质量对照”烧瓶孵化。在使用不含酚红的DMEM：营养混合物F12，1：1混合物(DMEM/F12，英杰公司目录号21041)接种后，在其余的41个选择的T162烧瓶中，将一个烧瓶维持为阴性对照。
b.PVS-RIPO主病毒种子(L0403006)感染与收获
PVS-RIPO电穿孔后种子批号L0402026在≤-70℃的储存下取出并在室温下解冻。使用DMEM/F12培养基稀释PVS-RIPO电穿孔后种子批号L0402026，并用PVS-RIPO电穿孔后种子批号L0402026以0.5的感染复数(MOI)感染40个T162烧瓶(含有扩增的Vero细胞)。在加入新鲜的DMEM/F12细胞培养基后，接种的烧瓶在33℃和5％CO2下孵化。
在孵化过程中监测病毒感染的烧瓶和对照烧瓶的属性，如可见污染、细胞状况和融汇百分数。在感染后70小时，终止培养，检查烧瓶的属性，如可见污染，细胞状况和融汇百分数，然后转移到生物安全柜(BSC)中收获。将烧瓶的内容物转移到离心瓶中，并在4℃和2500RPM的设定下离心33分钟以清除细胞碎片。将含有PVS-RIPO病毒的上清液汇集到850cm2的滚瓶中。将汇集的上清液分别转移到以20±1mL和80±5mL等分试样的2个30mL和24个125mL PETG瓶中。另外，以1±0.2mL等分试样填充12个2mL冷冻管。将剩余的上清液(总共3.8mL)转移到3个2mL冷冻管中，总共15个2mL冷冻管。将PETG瓶和小瓶分别标记为PVSRIPO主病毒种子批号L0403006。将11个2mL冷冻管，23个125mL PETG瓶和2个30mL PETG瓶在≤-70℃下冷冻，随后转移至≤-70℃受控存储器。将4个2mL冷冻管进行过程分析(PA)/生物药品质量控制(BQC)以用于滴度(通过pfu和TCID50)、病毒颗粒和DNA序列释放测试。其余的释放测试是按照适当的分析方法进行的，并开发了PVSRIPO材料处理程序。将剩余的125mL PETG瓶(20±1mL填充)在≤-70℃下冷冻。
模拟感染瓶中的上清液(阴性对照)也被收集并装瓶。制备2个30mL的PETG瓶，每个具有20±1mL的过程控制材料，并制备4个2mL的冷冻管，每个具有1±0.2mL的过程控制材料，并且标记为“PVSRIPO过程控制”。将两个30mL PETG瓶转移至PA/BQC进行测试。将4个2mL冷冻管冷冻至≤-70℃，并放置在≤-70℃的受控存储器中。
PVSRIPO主病毒种子批号L0403006的释放测试总结在图17的分析证书中。
c.体外外来病毒检测
在PVS-RIPO主病毒种子批号L0403006上进行体外外来病毒测试。通过观察用于致细胞病变效应(CPE)、血细胞吸附(HAD)和血细胞凝集(HA)的三种类型的指示细胞系，进行该测定以评估测试物品是否存在外来的病毒污染物。用于检测外来介质的细胞是Vero，MRC-5和A549。所有这些都容易受到PVS-RIPO的感染，从而导致CPE。因此必须中和测试样品中的PVS-RIPO以进行测试。我们在测定中包括干扰对照，并使用腺病毒5、副流感3和疱疹病毒。将病毒稀释至10pfu和100pfu，并进行与PVS-RIPO相同的中和程序。包括模拟中和对照。在与模拟中和对照相同的时间段和浓度下检测所有病毒。在检测这些其他模型病毒时似乎没有可由抗体或中和过程本身检测到的效果。
为了进行测试，使用的三种指示细胞培养物是：正常的男性人胚胎细胞培养物MRC-5；Vero，一种非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾系；和A549，一种成年男性人肺癌。用已被脊髓灰质炎病毒I型抗血清中和的测试样品接种这些指示细胞培养物，并且每周至少检查三次于至少28天。[在接种前使用以下程序进行中和过程：将测试品在2-8℃下以1400rpm离心10分钟，然后与等体积(3.0mL)的1:2.5稀释的从FDA获得的I型脊髓灰质炎病毒抗血清(Evgenia Dragunsky/CBER)混合，并在36±2℃孵化1小时。然后给每个细胞系加0.2毫升/孔的该溶液，并在36±2℃孵化1小时，然后除去接种物，用2.0mL的合适培养基洗涤细胞。然后移除该洗涤溶液并用2.0mL新鲜培养基代替，并将细胞返回到36±2℃培养箱中。
检查培养物是否由于存在病毒试剂而导致形态变化的发展。在孵化期结束时，使用鸡、豚鼠和人类红细胞来测试培养物的血细胞凝集和血细胞吸附。在测定中使用副流感3作为阳性对照。用于干扰控制的病毒是从FDA获得的用I型脊髓灰质炎病毒抗血清中和的腺病毒5、疱疹病毒和副流感3。使用含有10％FBS的DMEM作为Vero和MRC-5细胞的阴性对照，使用含10％FBS的F-12K作为A549细胞的阴性对照。
d.体内外来病毒测试(AVA)
根据批准的程序，在豚鼠(改良的欧洲变体)、成年小鼠，乳鼠和含胚鸡蛋中评估了PVS-RIPO主病毒种子批号L0403006的体外外来病毒。该测定的目的是评估测试样品中病毒的存在，该病毒可能存在于细胞系但在细胞培养系统中不引起任何可辨别的作用。为了完成MVS批号L0403006的体内AVA测试，将测试样品中和，以避免由于测定中使用的PVS-RIPO测试样品的高浓度而导致的在测试动物中潜在的非特异性毒性。由于PVS-RIPO病毒载量引起的非特异性毒性可能干扰对存在于样品中其它外来试剂的检测。为确定抗体是否可以对其它外来试剂的检测产生影响，如上所述，在体外测定中用抗体建立干扰对照。
豚鼠容易感染多种病毒，包括副粘病毒(仙台)和呼肠孤病毒。使用肌内和腹膜内途径将试验品接种到豚鼠，并保持测试至少28天。试验样品在37℃的水浴中解冻，然后与中和抗体等量混合。将测试物品/中和抗体混合物保持在37℃水浴中1小时，每20分钟温和混合。五只成年豚鼠接种所制备的测试物品，0.2mL肌内注射，5.0mL腹腔注射。另外五只成年豚鼠接种Eagles Minimal Essential Medium作为阴性对照，0.2mL肌内注射，5.0μg腹腔注射。28天每天观察每只动物的发病率或死亡率。
成年小鼠对许多病毒制剂敏感，包括柯萨奇病毒和黄病毒组成员(圣路易斯脑炎病毒和日本脑炎病毒)。新生乳鼠容易感染各种各样的病毒，包括囊膜病毒，布尼亚病毒，黄病毒，小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒组A和B，艾柯病毒)和疱疹病毒。通过尿囊和卵黄囊接种含胚鸡蛋。通过尿囊途径的接种有利于正粘病毒(流感病毒)和副粘病毒(副流感，腮腺炎和麻疹)在尿囊的内胚层细胞中的复制。通过卵黄囊接种有利于疱疹病毒、立克次氏体、支原体和细菌的繁殖。因为存在于原始接种物中的任何病毒剂将在新的测试系统中被扩增，将来自接种的乳鼠和接种的含胚鸡蛋的子代接种材料接种到新的测试系统中用于增加该测定的灵敏度。
含胚鸡蛋
测试物和中和抗体使用37±2℃水浴解冻。将测试物和中和抗体以1:1的比例混合并孵化60分钟。在接种之前，将用于阴性对照的Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM)和测试物-抗体稀释物通过0.45微米醋酸纤维素低蛋白结合过滤器过滤。
六(6)个鸡蛋/接种途径作为递送对照。每个工作日进行对光检查以检查其存活率，并在孵化期结束后进行冷藏。冷藏后未收集或检查这些鸡蛋。
尿囊测试：将十二个鸡蛋(10天龄)的尿囊腔接种0.5mL所制备的测试物。将蛋在37-38℃孵化3天。每个工作日将胚胎进行对光检查以检查其存活率。在孵化期结束前死亡的胚胎被冷冻，并且在孵化期结束时检查所有的胚胎。收集第1代(P1)尿囊液，汇集并在-60℃或低于-60℃储存，直到测定血凝活性(HA)或直到子代接种进入第二组的10个蛋(11天龄)。在接种到第二组鸡蛋之前，通过低速离心使该子代接种材料澄清，并通过0.45微米的乙酸纤维素低蛋白结合过滤器过滤。第二组蛋在与第一组相同的条件下孵化。然后收集第2代(P2)尿囊液，合并，在-60℃或低于-60℃储存，直到测定HA，在此之后检查胚胎。为了建立阴性对照，对另外两组含胚鸡蛋使用0.45微米过滤的EMEM作为初始接种物并行运行该步骤。
卵黄囊试验：将12只含胚鸡蛋(6天龄)的卵黄囊用0.5mL所制备的测试物接种。将卵在37-38℃孵化9天。每个工作日将胚胎进行对光检查以检查存活率。在孵化期结束前死亡的胚胎被冷冻，并且在孵化期结束时检查所有的胚胎。收获P1蛋黄囊，洗涤并合并。制备10％的卵黄囊悬浮液，并在-60℃或低于-60℃储存，直到子代接种进入第二组的十二(12)个蛋(6天龄)。在接种到第二组鸡蛋之前，通过低速离心澄清子代接种材料，并通过0.45微米醋酸纤维素低蛋白质结合过滤器过滤。第二组蛋在与第一组相同的条件下孵化，然后检查胚胎。为了建立阴性对照，对另外两组含胚鸡蛋使用0.45微米过滤的EMEM作为初始接种物并行运行该步骤。
通过将P1和P2混合的尿囊液、相应的P1和P2阴性对照、作为阳性对照的库存流感病毒A型进行连续两倍稀释，在微量滴定板中进行血细胞凝集测定。EMEM作为测定阴性对照。将清洗的鸡、豚鼠和人类O型红细胞作为0.5％悬浮液分别加入。在2-8℃和37±2℃孵化1-2小时后，观察重复平板的HA活性。
如果至少80％接种的胚胎在测试期间存活(不包括由于创伤或细菌污染而死亡的胚胎)且外观正常，则测试物被认为不含可检测的外来病毒污染物；并且从接种的胚胎收集的尿囊液不产生血细胞凝集。
成年和哺乳的小鼠
冷冻的测试物在设定为37℃的水浴中解冻，然后与中和抗体等量混合。将测试物/中和抗体混合物保持在设定为37℃的水浴中1小时，每15分钟轻轻混合。用制备的测试物接种二十(20)只成年小鼠，并用对照物(EMEM)接种五(5)只成年小鼠。每只测试或对照小鼠用合适的物质进行0.03mL脑内注射和0.5mL腹膜内注射。每天观察动物的临床感染提示症状。接种后第21天，将小鼠处死。
用制备的测试物接种20只新生乳鼠，并用对照品接种20只新生乳鼠。每只小鼠用合适的物质进行0.01mL脑内和0.1mL腹膜内注射。每天观察动物的异常临床体征。在接种后第14天，将小鼠处死，收集组织，匀化并汇集在试验组或对照组内。用EMEM将组织匀浆并低速离心。通过低蛋白质结合的0.45微米醋酸纤维素过滤器过滤组织匀浆，并装入供注射的适当尺寸的注射器中。20只新生乳鼠接种试验小鼠组织上清液，20只小鼠注射对照小鼠组织上清液(0.01mL大脑内和0.1mL腹膜内注射)。在注射组织匀浆后的第14天，将小鼠处死。
如果至少80％的哺乳小鼠和至少80％的成年小鼠在测试期间存活，且没有与污染物外来传染性试剂相一致的不良临床观察结果，则认为测试物不含可检测的外来病毒污染物。
PVSRIPO纯化的无菌批量批号L0904009(P2)的生产
生产PVS-RIPO纯化的无菌批量批号L0904009(P2)的制造过程如图18A-18B所示。使用Vero工作细胞库(WCB)批号217002-2和MVS批号L0403006作为起始材料来制造PVS-RIPO纯化的无菌批量批号L0904009。对三个小瓶的Vero WCB批号217002-2进行扩增，在十个6360平方厘米的细胞工厂中生产细胞扩增批号L0903010。使用PVSRIPO MVS批号L0403006感染细胞扩增批号L0903010，并将收获物质(收获汇集批号L0904008)用于生产PVSRIPO纯化批量批号L0903007，随后生产PVSRIPO纯化的无菌批量批号L0904009。
a.Vero细胞的启动和扩增
来自细胞扩增批号L0903010的Vero细胞用于生产细胞收获批号L0904008。在整个扩增期间，Vero细胞在补充有L-谷氨酰胺和10％经照射的胎牛血清(FBS)的DMEM中生长，并在37℃和5％CO2的设定下孵化。将三个小瓶的Vero工作细胞库(WCB)批号217002-2在37±2℃的水浴中解冻，并用于以约50,864个细胞/平方厘米的密度接种一个T-162cm2烧瓶(冷冻后的第1代)。使用如上所述的生长培养基和条件将细胞从T-162cm2烧瓶扩大至6360cm2细胞工厂，636cm2细胞工厂和T-150cm2烧瓶，冷冻后总共传代5次(参见图18A-18B)。
b.Vero细胞的感染
为了产生感染的细胞裂解物批号L0904008，使用含有95-100％融合且没有可见的污染迹象的健康细胞Vero细胞批号L0903010(10个6360cm2细胞工厂，3个636cm2细胞工厂和5个T-150cm2烧瓶)。将四个瓶子的PVS-RIPO主病毒种子(MVS)批号L0403006(带80mL MVS等分试样的125mL PETG瓶)从≤-70℃受控储存器中取出，在33-38℃水浴中解冻，用于以0.1pfu/细胞的感染复数(MOI)的感染过程。通过向制备的感染培养基(不含Hepes和酚红的L-谷氨酰胺的DMEM/F12)中加入265mL解冻的MVS批号L0403006来制备总体积约8升的配制的感染培养基。
通过用约750mL洗涤培养基(含有L-谷氨酰胺(不含Hepes和酚红)的DMEM/F12)洗涤，然后用约750mL制备的配制感染培养基进行填充来制备10个6360cm2细胞工厂用于感染。还制备了阳性和阴性对照。感染的细胞工厂和对照在33℃、5％CO2浓度和80％湿度的设定下孵化。在感染后70小时，在9个细胞工厂中注意到100％细胞病变效应(CPE)，在一个细胞工厂中注意到80％CPE，并且在每个对照瓶中注意到所预期的结果。
c.经感染细胞的裂解液的收获和澄清
从每个细胞工厂收获PVS-RIPO病毒感染的细胞悬浮液批号L0904008并汇集到无菌培养基袋中。对感染的细胞悬液取样，用于对PVSRIPO收获汇集批号L0904008进行释放测试。总结PVSRIPO收获汇集批号L0904008的释放测试的测试、规格方法和结果的分析证书包括在图19中。
将感染的细胞悬浮液以约750mL等分试样转移至1L聚碳酸酯离心瓶中。将感染的细胞悬浮液在4℃和3800×g的设定下离心约20分钟。将来自每个离心瓶的澄清的上清液合并到无菌的10升培养基袋中，并在室温下转移至纯化组。
d.对最终收获物进行核酸酶处理
为了降低在PVS-RIPO纯化批量批号L0903007的生产期间宿主基因组DNA水平，将澄清的PVSRIPO批号L0904008收获物与酶一起孵育。在加入酶之前，将氯化镁混合加入到澄清的PVSRIPO批号L0904008收获物中至终浓度1mM。在混合下加入酶至终浓度为50单位/mL。将袋子在2-8℃孵化16小时。将酶处理的裂解物从2-8℃取出并取样。使用噬菌斑测定分析样品以确定病毒滴定量。
e.琼脂糖6快速流动柱层析
琼脂糖6FF层析柱步骤在PVS-RIPO纯化批量批号L0903007的生产期间提供缓冲液交换和并将有低分子量宿主细胞污染物来源的病毒库进行部分纯化。用琼脂糖6快速流动(FF)树脂(GE医疗-生物科技，皮斯-卡塔韦，新泽西(Piscataway，NJ))填充的层析柱用于将病毒缓冲交换成低电导率磷酸盐缓冲液，以备进一步纯化。在加载酶处理的裂解物之前，将琼脂糖6FF柱用5M NaCl冲洗，加入4.7mM NaPO4，1M NaCl，pH 7.5，并用4.7mMNaPO4，42mM NaCl，pH 7.5平衡。将Benzonase处理的裂解物加载到2009年5月19日以两次相同灌注的琼脂糖6FF柱上。用4.7mM NaPO4，42mM NaCl，pH 7.5洗脱产物，并将来自两次注射的PVS-RIPO主峰级分收集到相同的接收袋中。使用噬菌斑测定分析收集的洗脱物样品以确定病毒滴定量。PVS-RIPO主峰储存在2-8℃。
f.Q650M流通层析柱
在琼脂糖6FF步骤后，将批号L0903007洗脱液用于Q650M流通层析柱以从非结合病毒中去除剩余的宿主细胞蛋白质污染物。用Super Q 650M树脂填充层析柱，并用5M NaCl冲洗，然后用4.7mM NaPO4，1M NaCl，pH 7.5冲洗，并用4.7mM NaPO4，42mM NaCl，pH 7.5平衡。该柱装载有PVS-RIPO琼脂糖6FF主峰，收集含有病毒产物的流通液。洗脱过程中使用的缓冲液是4.7mM NaPO4，42mM NaCl，pH 7.5。使用5M NaCl调节所收集的Q650M主峰的NaCl浓度至150mM NaCl。Q650M主峰材料取样，然后在2-8℃储存。使用噬菌斑测定分析样品以确定病毒滴定量。
g.通过切向流过滤来浓缩和渗滤
将Q650M主峰批号L0903007材料从2-8℃的储存中移出并使用超滤中空纤维膜(GE医疗UFP-50-C-4MA)进行浓缩。然后将浓缩的病毒材料对配制缓冲液(50mM NaPO4，150mMNaCl，pH 7.4)渗滤。通过噬菌斑测定分析渗滤的PVS-RIPO溶液样品以确定病毒滴定量。将HSA(25％)加入到渗滤的PVS-RIPO批号L0903007中，使终浓度为0.2％。对配制的PVS-RIPO样品进行噬菌斑测定和微生物含量分析。
h.PVS-RIPO的批量分装、取样和储存
将配制好的PVS-RIPO纯化批量批号L0903007转移到100级生物安全柜中，并以约30mL/个的体积分配到9个125mL PETG瓶中。将9瓶PVS-RIPO纯化批量批号L0903007标记，在乙醇/干冰浴中冷冻，并储存在≤-70℃以备进一步生产使用。将PVS-RIPO纯化批量批号L0903007转移到≤-70℃的受控存储器中。
i.纯化的无菌批量批号L0904009(P2)
将9瓶PVS-RIPO净化批量批号L0903007从≤-70℃受控储存器中取出，并转移到≤-70℃的冷冻箱中。将9瓶PVS-RIPO纯化批量批号L0903007在24-31℃的水浴中解冻；产品温度为11-17℃)。总解冻时间是43分钟。将9个容器的内容物合并到1L PETG瓶中，得到总的终体积271.09mL。将合并的PVS-RIPO纯化批量批号L0903007经已通过使用前测试且已用稀释剂(含0.9％NaCl的50mM NaPO4，pH 7.4+0.2％HSA)预先润湿的0.2微米无菌Millipak 20(Millipore)过滤器泵送。在产物过滤后，使用相同的稀释剂冲洗过滤器，得到总量为283.24mL的过滤产物。过滤器通过了过滤后的完整性测试。收集样品(25.5毫升)，并进行过程分析/生物制药质量控制进行纯化无菌批量批号L0904009的释放测试，得总的终体积为257.74毫升。纯化的无菌批量批号L0904009然后进行填充步骤。PVSRIPO收获汇集批号L0904008的释放测试、方法、描述和结果在图19中提供。
PVSRIPO收获汇集批号L0904008的测试方法描述
a.病毒滴度(TCID50分析)
通过TCID50在Hep-2C指示细胞上进行该测定，以确定PVS-RIPO收获汇集批号L0904008，纯化的无菌批量批号L0904009和最终分装产品批号L0904010中的PVS-RIPO病毒滴度。将100微升(100μL)稀释培养基(具有4mM L-谷氨酰胺和1％FBS的RPMI-1640)加入到独立的96孔板的每个孔中(为每个参照标准、阳性对照和测试样品提供独立的板)。使用稀释培养基(具有4mM L-谷氨酰胺和1％FBS的RPMI-1640)制备了FDA脊髓灰质炎病毒1型参照标准(1：10000)、萨宾原始1型阳性对照脊髓灰质炎病毒(1：1000000)和测试样品(1：1000000)的初始稀释液。将各最终稀释液的100μL等分试样加入到相应96孔板的第一栏中八个孔的每一个中。使用校准的多通道移液器制备1:2连续稀释液，方法如下：在每个96孔板上从第1栏的每个孔中移除100μL，转移到第2栏的邻近孔中，彻底混合并重复该系列的下一栏。对于FDA参考标准，稀释在第11栏处终止，第12栏用作阴性对照孔(仅含有稀释介质)。弃去来自11栏的过量100μL。对于阳性对照和测试品，稀释方案在第二个96孔板继续，终止于第23栏，第24栏用作阴性对照孔。然后将生长培养基(具有4mM L-谷氨酰胺和10％FBS的RPMI-1640)(0.1mL，1x105个细胞/mL)中的10,000个Hep-2C细胞加入到每个96孔板的每个孔中，并在36±1℃下在潮湿的5％CO2培养箱中孵化10天。在第1,3,7和10天检查板的细胞病变效应(CPE)。完成测定后，将每个样品显示CPE的孔的数目输入由FDA提供的计算程序模板的适当区域。该程序根据FDA脊髓灰质炎病毒1型参考标准的应答计算每个样品的TCID50/mL。
b.扩展的生物负载
生物负载是对含水样品中存在的存活需氧微生物数量的估计。PVS-RIPO收获汇集批号L0904008的生物负载测试使用Milliflex-Sensor II系统进行，该系统是用于检测和计数微生物的快速和高通量过滤装置。
用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)将重复的测试样品(2.5mL)稀释至50mL，并直接加入到分开的Milliflex过滤漏斗的顶部。通过过滤100mL的PBS来制备阴性对照。对每个过滤装置抽真空以将测试样品或对照物吸到过滤膜中。除去漏斗，将滤膜用于合适类型的琼脂以促进所存在的任何微生物的生长。将来自重复测试样品的一个滤膜用于胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)(用于帮助细菌生长)，并将另一个滤膜用于沙氏葡萄糖琼脂(SDA)(用于帮助酵母和霉菌的生长)。作为释放测试原材料的一部分，TSA和SDA介质都经过生长促进测试。TSA样品在30-35℃孵化120小时，SDA样品在20-25℃在倒置位置孵化120小时。在孵化期后，检查琼脂平板的生长情况并计数菌落数(如果观察到的话)并报告为菌落形成单位/mL。
c.用NIH/3T3细胞检测支原体(PTC)
使用间接和直接步骤在收获汇集批号L0904008上进行支原体的检测。
间接检测方法通过在NIH/3T3细胞(瑞士小鼠胚胎细胞系)上培养支原体，然后使用DNA结合荧光染料染色，使支原体特别是不可培养的支原体可视化。在测定中使用阴性和阳性对照。阳性对照包括强的细胞吸附(M.hyorhinis)和弱的细胞吸附(M.orale)支原体种类。基于观察到的染色图案,用DNA结合荧光染料染色培养基能够检测到支原体。在阴性培养物中只观察到细胞核荧光，而在阳性培养物中观察到核和外核荧光。
直接培养是一种灵敏而特异的检测支原体的方法。使用的琼脂和肉汤培养基提供营养物以及可培养支原体生长所需的碳和能量。在直接测定中使用阳性和阴性对照。阳性对照包括发酵性支原体(肺炎支原体)和非发酵性支原体(M.orrale)。该程序基于FDA生物制品评估和研究中心(Center for Biologics Evaluation and Research)推荐的附件#2中的1993年“用于生产生物制品的细胞系的特征要点(Points to Consider in theCharacterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals)”中所述的方案。
d.由鲎变形细胞溶解物(LAL)产生的内毒素
使用动力学显色试验来确定PVSRIPO收获汇集批号L0904008、纯化的无菌批量批号L0904009和PVSRIPO最终分装产品批号L0904010的内毒素(LAL)含量。该测试基于鲎变形细胞溶解物(一种鲎变形细胞(Limulus polyphemus amoebocytes)衍生物)的反应性，以确定测试物中的内毒素。该程序设计为符合1987年12月颁布的FDA关于验证鲎试验法(LAL)作为人和动物肠胃外药物、生物制品和医疗装置的终产品内毒素测试生效指南中所述的建议。
热原是产生发热的物质，最常来源于革兰氏阴性细菌的细胞壁。来自细菌细胞壁的热原被称为细菌内毒素，并且易于通过动力学显色LAL测试系统检测。动力学显色LAL法提供了可检测的内毒素水平的直接定量，并且特别适用于检测低水平的内毒素。根据制造商的说明书来准备试剂和标准。
通过将25μL的测试样品移入Endosafe-许可的PTS内毒素盒中的四个样品贮器中的每一个来进行测试。PTS在两个通道抽取测试样品，并在其中与LAL试剂混合，在另外两个通道中测试样品并与LAL试剂和阳性产品控制(PPC)混合。孵化样品，然后与显色底物混合。混合后，测量孔的光密度，并对照内部存档的批次特异性标准曲线进行分析。PTS同时进行重复测试，并根据USP指南对结果进行平均。如果两个重复样品之间的变异系数(CV)<25％且两个PPC重复之间的CV<25％，则该测定是有效的。如果PPC回收率是50-200％，结果是有效的。该测定的检测限度为0.005EU/mL。
e.rct40病毒稳定性
该测定通过Vero指示细胞上的噬斑形成，用于确定在36℃和40℃下，收获汇集批号L0904008、最终装瓶产品批号L0904010中的PVSRIPO以及的对照的滴度。比较病毒在36℃和40℃下的log10滴度，如果36℃和40℃之间的对数降至少为5，则确定样品对于40℃时的生长敏感，并且被认为已通过测试。样品在33℃时的滴度也被确定，以便能与先前确定33℃时样品的滴度进行比较。阳性对照包括RCT 40+对照：脊髓灰质炎病毒1Sabin克隆S33批号L0406008和RCT 40-对照：脊髓灰质炎病毒1Sabin克隆S71批号L0406004。阴性对照是含有10％FBS的DMEM。
使Vero细胞铺板并使其生长直至达到80％至100％的融合度。去除生长培养基，给予Vero细胞0.2mL的测试或对照样品。然后将一式两份的培养皿在33℃，36℃和40℃孵化约1小时。除去接种物，用琼脂糖/2×Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)覆盖细胞片。使琼脂糖固化，并将两份的培养皿在33℃，36℃和40℃孵化直至阳性对照(2天)中斑块完全形成。然后用含有中性红的琼脂糖/2×EMEM在黑暗中覆盖培养皿，当细胞片被中性红染色时对噬菌斑进行计数。确定平均斑块值。滴度(pfu/mL)使用公式计算：平均空斑值×稀释倍数/接种量。
f.体内的外来试剂
PVS-RIPO收获汇集批号L0904008在成年小鼠、哺乳小鼠和含胚鸡蛋中评估体内外来病毒。该测试的目的是评估测试样品病毒的存在，该病毒可能存在于细胞系、但在细胞培养系统中不引起任何可辨别的作用。在PVS-RIPO收获汇集批号L0904008的体内AVA测试之前，在QC-040664下进行R&D研发以评估用于完成该测试的方法。这些研究表明，当以2x108pfu/mL的浓度用PVS-RIPO病毒裂解物制剂给药时，乳鼠中未观察到副作用。因此，体内AVA测试在PVS-RIPO收获汇集批号L0904008上进行，不包括中和抗体处理。在含胚鸡蛋中不经稀释(2.14×109TCID 50/mL)地测试材料。然后将材料稀释至2×108pfu/mL，并在成年和乳鼠中测试。
成年小鼠对许多病毒制剂敏感，包括柯萨奇病毒和黄病毒组成员(圣路易斯脑炎病毒和日本脑炎病毒)。乳鼠容易感染各种各样的病毒，包括囊膜病毒，布尼亚病毒，黄病毒，小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒组A和B，艾柯病毒)和疱疹病毒。通过尿囊和卵黄囊接种胚胎鸡蛋。通过尿囊途径的接种有利于正粘病毒(流感病毒)和副粘病毒(副流感，腮腺炎和麻疹)在尿囊的内胚层细胞中的复制。通过卵黄囊接种有利于疱疹病毒，立克次氏体，支原体和细菌的繁殖。因为通过该连续传代将扩大存在于原始接种物中的任何病毒试剂，将来自接种的乳鼠和接种的含胚鸡蛋的材料子代接种到新的测试系统中以增加该测定的灵敏度。
含胚鸡蛋
六(6)个含胚鸡蛋/接种途径作为递送对照。将这些每个工作日进行对光检查以检查其存活率，并在孵化期结束后冷藏。冷藏后未收集或检查这些鸡蛋。
尿囊测试：将十二个鸡蛋(10天龄)的尿囊腔接种0.5mL所制备的测试物。将蛋在37-38℃孵化3天。每个工作日将胚胎进行对光检查以检查其存活率。在孵化期结束前死亡的胚胎被冷冻，并且在孵化期结束时检查所有的胚胎。收集第1代(P1)尿囊液，汇集并在-60℃或低于-60℃储存，直到测定血凝活性(HA)或直到子代接种进入第二组的12个蛋(10天龄)。在接种到第二组鸡蛋之前，通过低速离心使该子代接种材料澄清，并通过0.45微米的乙酸纤维素低蛋白结合过滤器过滤。第二组蛋在与第一组相同的条件下孵化。然后收集第2代(P2)尿囊液，合并，在-60℃或低于-60℃储存，直到测定HA，在此之后检查胚胎。为了建立阴性对照，对另外两组含胚鸡蛋使用0.45微米过滤的EMEM作为初始接种物并行运行该步骤。通过将P1和P2混合的尿囊液、相应的P1和P2阴性对照、作为阳性对照的库存流感病毒A型进行连续两倍稀释，在微量滴定板中进行血细胞凝集测定。EMEM作为测定阴性对照。将清洗的鸡、豚鼠和人类O型红细胞作为0.5％悬浮液分别加入。在2-8℃和37±2℃孵化1-2小时后，观察重复平板的HA活性。
卵黄囊试验：将十二(12)只含胚鸡蛋(6天龄)的卵黄囊用0.5mL经0.45微米的滤测试物接种。将鸡蛋在37-38℃孵化9天。每个工作日将胚胎进行对光检查以检查其存活率。在孵化期结束前死亡的胚胎被冷冻，并且在孵化期结束时检查所有的胚胎。收获P1蛋黄囊，洗涤并合并。制备10％的卵黄囊悬浮液，并在-60℃或低于-60℃储存，直到子代接种进入第二组的十二(12)个蛋(6天龄)。在接种到第二组卵中之前，通过低速离心澄清子代接种材料，并通过0.45微米醋酸纤维素低蛋白质结合过滤器过滤。第二组蛋在与第一组相同的条件下孵化，然后检查胚胎。为了建立阴性对照，对另外两组胚胎卵使用0.45微米过滤的EMEM作为初始接种物并行运行该步骤。
如果至少80％接种的胚胎在测试期间存活(不包括由于创伤或细菌污染而死亡的胚胎)且外观正常，则测试物被认为不含可检测的外来病毒污染物；并且从接种的胚胎收集的尿囊液不产生血细胞凝集。
成年和哺乳的小鼠
用制备的测试物接种二十(20)只成年小鼠，并用对照物品接种五(5)只成年小鼠。每天观察动物的临床感染提示症状。接种后第21天，将小鼠处死。用制备的测试物接种20只新生乳鼠，并用对照品接种20只新生乳鼠。每天观察动物的异常临床体征。接种后第14天，处死小鼠，收集组织，液化并汇集在试验组或对照组内。用EMEM将组织匀浆并低速离心。用试验小鼠组织上清液接种20只新生乳鼠，20只小鼠注射对照小鼠组织上清液。首先将组织上清液通过0.45-μm过滤器过滤并装入适当尺寸的注射器中以供注射。注射后第14天，处死小鼠。如果至少80％的哺乳小鼠和至少80％的成年小鼠在测试期间存活，且没有与传染性试剂的存在相一致的不良临床观察结果，则认为测试物不含可检测的外来病毒污染物。
PVSRIPO纯化的无菌批量批号L0904009的释放测试、方法、描述和结果在图20的分析证书中提供。
PVSRIPO纯化的无菌批量批号L0904009的测试方法描述
a.全基因组测序
根据批准的程序对PVS-RIPO纯化的无菌批量批号L0904009和最终分装产品批号L0904010进行全面的4X序列分析。从测试物中分离病毒RNA，并在约1200bp的片段中反转录并扩增基因组。使用寡核苷酸获得扩增子的DNA序列分析。引物设计为相距约250个碱基，具有约50％的GC含量，长度在18-24bp之间，并且定位为使得扩增的病毒cDNA的两条链都用来自每条链的两个读段进行测序。
使用BigDye v1.1测序试剂盒进行测试物和pGEM3Z对照质粒的荧光染料终止子DNA循环测序。对于测试样品：将2.0μL的5x大染料测序缓冲液与2μL的2μM引物、20ng纯化的PCR产物和ddH 2O结合至终体积为10μL。对于用作反应和仪器对照的pGEM3Z对照反应：用20ng(约3.2pmol)M13F-20引物(5'GTAAAACGACGGCCAGT-3'，SEQ ID NO：4)对200ng pGEM3Z进行测序。用每个测序装置进行对照反应并在ABI3130xl上分析。使用PTC-225Peltier热循环仪进行循环测序反应。在分析之前，使用Centriflex凝胶过滤柱，从未掺入的染料终止剂、盐和低分子量化合物中纯化序列反应。从测序计算机收集序列数据，并使用Sequencher软件版本4.7(GeneCodes，Ann Arbor，MI)修整数据并将其对齐成连续的一系列片段(称为“重叠群”)。将对齐的DNA序列与参考序列进行比较，如果有的话，确定测试样品和参考序列之间的碱基错配或多态性。
使用从过程分析/生物制药质量控制测试报告QC037657(毒理学异种研究病毒批号022208，由M.Gromeier，杜克大学，达勒姆，北卡罗来纳(Duke University，Durham，NC)提供的样品)获得的参考序列分析DNA序列。当与来自QC020658的PVSRIPO质粒参照序列(GMP质粒批号L0401014)中包含的克隆病毒质粒序列比较，以及与来自主病毒种子(MVS)序列的病毒cDNA序列批号L0403006，QC022271比较时，发现PVSRIPO纯化的无菌批量批号L0904009和最终装瓶产品批号L0904010的序列在全部7303个碱基位置是100％同源的。
b.宿主细胞DNA(Vero)
使用靶向Cercopithecus aethiops(Vero)特异性nectin-1α基因内基因复制的基于的定量聚合酶链式反应(qPCR)(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)扩增子，单拷贝基因(GenBank登录号AF308635)测试PVSRIPO纯化的无菌批量批号L0904009的Vero基因组DNA负载。试验的检测限度为每毫升1ng Vero基因组DNA。使用Vero细胞基因组DNA(gDNA)作为阳性对照(100ng-1pg)，使用5ng测试物的Vero gDNA作为PCR抑制对照，所期望的阴性对照结果为与无核酸酶的水的非测试对照反应，并且提取对照是磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液/PBS缓冲液，其含有相当于100pgVero的gDNA/次反应。
实时qPCR是一种灵敏的定量扩增方法，可用于基因表达分析、基因分型、病原体检测/定量、突变筛选和精确的DNA检测，包括样品中低拷贝残留DNA或RNA的定量。使用Applied Biosystems 7900HT 96孔仪器在扩增过程中连续检测PCR扩增产物的积累，从而允许在PCR的指数阶段进行准确的靶定量。使用96孔板块可以比384孔板块获得更大的反应体积，从而提高了对残留DNA和污染物DNA研究的测定灵敏度。
qPCR化学使用双重标记的荧光寡核苷酸探针。用于检测人基因组DNA的探针由用具有发射最大值的两种可区分荧光染料标记的寡核苷酸末端组成。探针5'末端用报告染料6-羧基荧光素(6-FAM)标记，3'探针末端用淬灭染料羧甲基罗丹明(TAMRA)标记。寡核苷酸探针与非洲绿猴(Vero)nectin-1α基因PCR扩增子内的内部靶序列同源，并对Vero和CV-1细胞具有高度特异性。Vero对人类gDNA的高排斥率是通过利用人类gDNA中不存在的非洲绿猴特有的九碱基序列重复元件作为探针靶点的一部分来实现的。探针猝灭染料在完整和游离溶液中通过荧光共振能量转移(FRET)减少荧光报告发射。在 PCR反应的延伸阶段期间，探针被Taq DNA聚合酶的5'核酸酶活性切割，从探针释放报告染料并增加了报告基因的发射。
ABI Prism 7900HT使用双轴扫描头将来自氩离子(488nm)激光的激发光分配到所有96个孔中。电荷耦合器件(CCD)成像器测量每个孔的荧光光谱和强度，以在PCR扩增期间产生实时光谱数据。ABI序列检测软件(SDS)对报告基因、猝灭剂和归一化(ROX)染料的荧光强度解卷积，并计算放大过程中增加的归一化报告基因发射强度。
每次PCR反应中初始靶标的精确定量发生在试剂耗尽或反应的副产物抑制之前的扩增指数(log2)阶段期间。然而，由于反应的信噪比和一般背景荧光的信噪比，最准确的数据通常是在对数阶段后期产生的。将归一化的报告荧光与时间作图，以PCR循环数表示。目标拷贝数或质量值是通过在背景之上分配荧光阈值和确定每个样品的扩增曲线达到阈值(定义为阈值循环或Ct)的循环点而产生的。每个反应的阈值循环值用于定量与已知标准物的量相比较的每个测试物反应中最初包含的靶点量。
使用靶向非洲绿猴(VERO)特异性Nectin-1α基因基因内部复制的基于的qPCR扩增子，单拷贝基因(GenBank登录号AF308635)来测试PVS-RIPO纯化的无菌批量批号L0904009的VERO基因组DNA载量。使用ABI Primer Express软件(版本2.0.0)设计引物和双荧光染料标记的探针。111-bp扩增子由正向引物组成：5'-(CCT CTG CCC AGCGTGAAG；SEQ ID NO：5)；反向引物：5'-(CAC AGA CAC GCC CAT GGA T SEQ ID NO：6)；和探针：5'-[6FAM]-(CAC CCA AGC CAC CAA TGG CTC CAA)-[TAMRA]SEQ ID NO：7。用无核酸酶水(NFW)分别将引物和探针稀释至10和5pmol/μL。反应混合物由含UNG和ROX染料，2μLNFW，1μL正向引物，1μL反向引物，1μ 探针和20μL样品(50μL终反应体积)的25μ PCR 2X Master Mix组成。将反应混合物装载到96孔板中，用光学膜覆盖，并使用2步qPCR谱(2:00分钟，50.0℃；10:00分钟；95.0℃；40个0:15分钟循环，95.0℃；1:00分钟，60.0℃)使用ABI型号7900HT 96孔序列检测系统进行扩增。由纯化的DNA(ATCC，部件#1587D)制备的VERO基因组DNA标准曲线从100ng至1pg以10倍连续稀释到NFW中。很少观察到10和1pg/rxn标准的阳性反应，相当于大约2.6和0.26个基因拷贝/rxn。全部测试样品DNA用缓冲液AL 1：2灭活，并在qPCR反应之前使用Qiagen DNA mini-prep方法提取。通过将5ng基因组DNA加入到提取的测试物样品中来监测由样品组合物引起的潜在的PCR抑制。通过使用PBS缓冲液空白和每个qPCR反应添加相当于100μgVERO gDNA的PBS缓冲液样品来监测提取效率。取缓冲液(NFW无模板)对照样品用于测试。定期包括污染(哨兵)控制。使用ABI7900HT软件通过将样品阈值循环值与人类DNA标准曲线方程进行比较来计算测试样品中的初始基因组DNA污染水平。使用以下公式将初始DNA水平转化为pg DNA/mL：样品稀释因子(2)*[(平均测试样品质量(pg)-平均无模板质量(pg))÷(平均提取前加样回收效率(如果提取对照具有≥10％的回收率，则设定为100％))]÷[(样品体积，每反应μL(20μL))*1000μL/mL]。
在纯化之前，PVSRIPO病毒收获汇集物由酶处理。核酸酶处理通常产生≤12个核苷酸的平均寡核苷酸片段，消化后片段群体遵循卡方分布。用于该测定的C.aethiops(Vero和CV-1细胞系)nectin-1qPCR扩增子是111bp。该测定所产生的结果代表了基于完整单倍体C.ethiops基因组DNA(约3.88pg/单倍体拷贝)质量的对于残留宿主细胞DNA浓度的最差情况估计。
c.残留的酶
由于核酸内切酶用于生产PVSRIPO经纯化无菌批量批号L0904009的纯化过程，因此使用批准的程序检查测试样品以确定核酸内切酶的残留水平。使用Merck 核酸内切酶ELISA试剂盒II测定残余核酸内切酶的浓度。通过将标准品、样品和对照添加到微量滴定带来开始测定，所述微量滴定带预先用亲和纯化的多克隆捕获抗体包被。将孔在室温下孵化2小时，然后洗涤。将针对内切核酸酶的二级辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗体加入到每个孔中，并将平板在室温下孵化1小时。这导致形成下列三明治复合物：固相抗体-内切核酸酶-HRP，缀合抗体。洗涤孔并抽吸除去未结合的反应物。通过向每个孔添加3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，一种HRP底物，以检测残余的将这些孔经15分钟的孵化期染色。使用校准的Spectra MAX 340读板仪定量所得到的与分析物的量相关的颜色强度。通过比较样品的信号和同时测定的Benzonase核酸内切酶标准品来实现准确的测量。阳性对照是核酸内切酶标准品，范围从0.25到10ng/mL。测定稀释液用作阴性对照。测定的检测限度为0.25ng/mL。
d.经BCA的总蛋白
由核酸干扰和/或低蛋白质浓度，溶液中总蛋白质不能被直接定量测定，对其的检测可通过使用双金鸡宁酸(BCA)反应和在562nm的比色定量实现。当Cu+2在高pH条件下由于蛋白质的存在而被还原成Cu+1，并且两个BCA螯合一个铜的Cu+1离子时，形成水溶性的蓝紫色反应产物。BCA Cu+1螯合物显示λmax为562nm，吸光度与蛋白质浓度的三个对数(<0.5μg/mL至>500μg/mL)紧密相关，尽管特定的反应条件和仪器常常限制有效线性范围到仅两个对数。已知在Cu 2+存在下与BCA反应的蛋白质溶液的吸光度取决于溶液中聚集蛋白质结构、肽键的总数以及溶液中半胱氨酸/胱氨酸、色氨酸和酪氨酸残基的相对比例。
使用BCA测定法分析测试样品PVS-RIPO纯化批量批号L0903007在20mM Tris，42mMNaCl的缓冲溶液中的总蛋白质。测试样品不含有其浓度会干扰BCA测定的缓冲液组分，并且在将HSA加入到PVS-RIPO纯化批量批号L0903007中之前采集。BCA工作试剂和BSA储备溶液和标准曲线在分析前立即由Pierce BCA蛋白质分析试剂盒产生。样品-BSA刺激反应的产生证实了样品缓冲液没有干扰，所述样品-BSA刺激反应产生如下：将含有500μL的BSA(50μL/mL)和400μL的缓冲液稀释剂的100μL测试样品加入到1mL BCA工作试剂中，成为25μg/mL有效刺激浓度。将100μL测试样品一式两份加入到900μL缓冲液稀释剂和1mLBCA工作试剂中。加入BCA工作试剂后，将样品和对照在室温下孵化2小时，然后测量562nm处吸光度。使用缓冲液稀释剂-BCA工作试剂样品将分光光度计设定为零(空白)。每个反应重复测量一次，在进一步分析之前平均BSA标准品。产生BSA标准曲线(0μg/mL至100μg/mL)的线性回归拟合，结果为R2＝0.989，没有发现标准曲线上的点有异常值，并且结果是有效的。与平均值相比，重复测试样本没有表现出过多的变化。对照25μg/mL BSA加标样品显示回收率为114.61％(总共28.65μg/mL)，表明样品组合物不干扰测定。当计算PVS-RIPO纯化批量批号L0903007测试样品总平均值时，使用BSA标准曲线方程计算为-0.0197AU562等于比检测水平(<1μg/mL)低蛋白质浓度，BSA标准曲线方程X＝(((YA)/B)*10)，其中“X”是蛋白质浓度，“Y”是吸光度值，“A”和“B”是曲线参数，10是指每个反应使用100μL样品。方法的定量限为5μg/mL，因此BCA测定结果为<5μg/mL蛋白质。
e.差异杀伤
确定U87-MG人成胶质细胞瘤和HEK 293人胚胎肾细胞上的PVS-RIPO纯化无菌批量批号L0904009的差异杀伤活性。使用(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-咔唑-9-基)内盐(MTS)和电子偶联剂吩嗪乙硫酸盐(PES)并用Promega AQueous One Solution细胞增殖测试进行测定。
为进行测试，将U87-MG细胞在补充有10％胎牛血清和1％非必需氨基酸溶液的L-谷氨酰胺的DMEM中培养。将HEK 293细胞在补充有10％FBS的L-谷氨酰胺的DMEM中培养。将细胞以4×104个细胞/孔(4x 105个细胞/mL，0.1mL/孔)铺板于96孔板中。将测试物稀释至2×107PFU/mL的初始估计滴度，然后连续4倍稀释。将稀释的病毒样品(100μL/孔)转移至含有细胞的平板中。测试物最终病毒滴度(MOI)范围为约50至0.0002PFU/细胞(基于TCID50计算的MOI)。将平板在37℃，5％CO2和80％湿度的环境中孵化48小时。在48小时的孵化期后，加入 AQueous One Solution(20μL/孔)，并在37℃，5％CO2和80％湿度的环境中再孵化4小时。将SDS(25μL/孔的10％溶液)加入到孔中。5分钟内在平板读数器(Molecular Devices)的490nm吸光度处读取平板。从测试样品孔读数中减去仅含细胞生长培养基孔中的背景读数(无细胞)。使用非线性4-参数曲线拟合(来自Molecular Devices的SoftMax Pro)分析数据。测定中使用的对照包括PVSRIPO毒理学批号L0603006(阳性对照)和细胞生长培养基(阴性对照)。
f.灭菌(直接接种)
通过直接接种方法进行PVSRIPO纯化无菌批量批号L0904009和最终装瓶产品批号L0904010无菌测试。
g.抑菌/抑真菌(灭菌后)
根据21CFR 610.12使用美国药典(USP)浸入法对PVSRIPO纯化无菌批量批号L0904009无菌后测试进行抑菌/抑真菌(B&F)测试。进行B&F测试以确保测试物中固有的任何抑菌和/或抑真菌活性不会对无菌测试方法的可靠性有不利影响。
PVS-RIPO纯化无菌批量批号L0904009的稳定性
为生产PVS-RIPO最终分装产品批号L0904010，PVS-RIPO纯化无菌批量批号L0904009在分装前没有进行储存。因此PVSRIPO纯化无菌批量批号L0904009没有进行稳定性测试，因为它是在同一天最后一次过滤时分装的。
最终分装产品
使用0.2μmPVDF膜过滤器无菌过滤在0.9％氯化钠、pH 7.4+0.2％HSA的50mM磷酸钠中配制的PVSRIPO纯化无菌批量批号L0904009，以生产最终分装产物。根据“美国联邦法规”21CFR 210,211和600中的，以及关于制造和测试I/II期研究产品的FDA/ICH指南中所描述的现行的良好生产规范(CGMP)进行最终瓶装产物的制造、测试和维护。
填充PVSRIPO纯化无菌批量批号L0904009以生产最终分装产品批号L0904010。填充操作按照批准的程序在生物安全柜(BSC)中进行。使用2mL-13mm I型硼硅酸盐玻璃小瓶(Wheaton目录号223683，批号1438174)。每个小瓶的目标分配体积为0.57mL(0.564-0.576mL)。进行过程中的重量检查。
在填充442个小瓶之后，插入B2Flurotec Westar RS塞子(West Pharma目录号1970-0002，批号J8281)，并进行卷曲操作。在卷曲操作期间目视检查卷曲的完整性，并且没有小瓶被遗漏。在完成填充、加塞和压接操作之后，检查未标记的小瓶(442)。
PVS-RIPO最终分装产品批号L0904010的释放测试，方法和规格在下图21的分析证书中所提供。用于测试PVS-RIPO最终分装产品批号L0904010[除病毒滴度(TCID50测定)，通过LAL获得内毒素，通过rct40获得病毒稳定性，完整基因组序列和灭菌(直接接种)]的方法描述如下。关于PVS-RIPO收获汇集批号L0904008的病毒滴度(TCID50测定)，描述了LAL的内毒素和rct40的病毒稳定性的方法，并且可以在本文中找到。描述了针对PVS-RIPO纯化无菌批量批号L0904009的完整基因组序列和灭菌方法(直接接种)，并且可以在本文中找到。
a.外观
目视检查PVS-RIPO最终分装产品批号L0904010的样品。检查产品的容器完整性、溶液的清晰度和容器标签的准确性。检查容器是否有裂纹或变质，并确保顶部安全封闭。通过目视检查来评价溶液的澄清度，以确定液体制剂中的可溶性产物是否没有任何颗粒物质、不透明物并确定容器中流体的色调，或容器中任何流体的浑浊度或浊度。检查容器标签以确认冷冻管贴有适当的标签并且确保标签被贴好。
b.RT-qPCR(HRV-2IRES和Polio多聚蛋白)
使用PVSRIPO中靶向HRV-2IRES(PVS-1)和脊髓灰质多聚蛋白(PO1)的基于的RT-qPCR扩增子来对重组脊髓灰质炎病毒PVSRIPO最终分装产品批号L0904010的PVSRIPO HRV-2IRES(PVS-1)和脊髓灰质多聚蛋白(PO1)RNA载量进行测试。实时定量PCR(qPCR)是一种灵敏的定量扩增方法，可用于基因表达分析、基因分型、病原体检测/定量、突变筛选和精确的DNA检测，包括样品中低拷贝残留DNA或RNA的定量。过程分析/生物制药质量控制实验室使用应用生物系统7900HT 96孔仪器在扩增过程中连续检测PCR扩增产物的积累，从而在PCR的指数阶段进行准确的靶标定量。使用96孔的反应体积比384反应体积更大，从而提高了残留DNA和污染物DNA研究的测定灵敏度。
qPCR化学利用具有每个扩增子的双重标记的荧光寡核苷酸探针。用于检测人基因组DNA的探针由用两种荧光染料标记的寡核苷酸末端组成，该荧光染料具有可区分的发射最大值。探针5'末端用报告染料6-羧基荧光素(6-FAM)标记，3'探针末端用淬灭染料羧甲基罗丹明(TAMRA)标记。寡核苷酸探针与PVSRIPO HRV-2衍生的IRES和Polio Polyprotein RT-PCR扩增子内的内部靶序列同源，并且当一起使用时对PVSRIPO具有特异性。由于PVSRIPO是单链RNA病毒，在qPCR扩增之前，使用扩增引物将样品逆转录成cDNA，作为热循环方案的一部分。在完整且在游离溶液中，探针猝灭染料通过荧光共振能量转移(FRET)减少荧光报告发射。在 PCR反应的延伸阶段期间，探针被TaqDNA聚合酶的5'核酸酶活性切割，从探针释放报告染料并允许报告基因发射的增加。
ABI Prism 7900HT使用双轴扫描头将来自氩离子(488nm)激光的激发光分配到所有96个孔中。CCD成像仪测量每个孔的荧光光谱和强度以在PCR扩增期间产生实时光谱数据。ABI序列检测软件(SDS)对报告基因、猝灭剂和归一化(ROX)染料的荧光强度解卷积，并计算放大过程中增加的归一化报告基因发射强度。
每个PCR反应中初始靶标的精确定量发生在试剂耗尽或反应副产物抑制之前的扩增指数(log2)阶段。然而，由于反应的信噪比和一般背景荧光的信噪比，最准确的数据通常是在对数阶段后期产生的。将归一化的报告荧光与时间作图，以PCR循环数表示。目标拷贝数或质量值是通过在背景之上分配荧光阈值并确定每个样品的扩增曲线达到阈值(定义为阈值循环或Ct)的循环点而产生的。每个反应的阈值循环值用于定量与已知标准物的量相比较的每个测试物反应中最初包含的靶标的量。
为了在BDP上进行测定，使用ABI Primer Express软件(版本2.0.0)设计引物和双荧光染料标记的探针。71-bp HRV-2IRES(PVS-1)扩增子由正向引物：5'-(AAC CCAATG TGT ATC TAG TCG TAA TGA，SEQ ID NO：1)；反向引物：5'-(TGA AAC ACG GAC ACC CAAAG SEQ ID NO：2)；和探针：5'-[6FAM]-(CAA TTG CGG GAT GGG ACC AAC T SEQID NO：3)-[TAMRA]组成。PO1的70-bp扩增子由正向引物：5'-(TTG GTG GGA ACG GTT CAC ASEQ ID NO：8)；反向引物：5'-(TCA CCT TGA CTC TGA GTG AAG TAT GA SEQ ID NO：9)；和探针：5'-[6FAM]-(TTG CAG CGG CCC TGA AGC G SEQ ID NO：10)-[TAMRA]组成。用无核酸酶水(NFW)将引物和探针分别稀释至10和5pmol/μL。反应混合物由25μL具有ROX染料的1步RT PCR 2X Master Mix，1μL RNA酶抑制剂，1μL NFW，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL 探针和20μL测试样品(50μL最终反应体积)组成。将反应混合物装载到96孔板中，用光学膜覆盖，并用ABI型号7900HT 96-孔序列检测系统扩增，使用3步qPCR谱(2:00分钟，50.0℃；30分钟，48.0(RT步骤)；10:00分钟，95.0℃；40个循环：0:15分钟，95.0℃；1:00分钟，60.0℃)。从PVSRIPO质粒DNA制备扩增子cDNA标准曲线，并将其从1ng至10fg连续稀释10倍至NFW中。在RT-qPCR反应之前，全部测试样品RNA用缓冲液AVL 1：4失活并采用Qiagen病毒RNA微量制备方法提取。通过将500pg PVSRIPO质粒DNA加入到提取的测试样品中来监测由于样品组成造成的潜在的PCR抑制。对该测试做缓冲液(NFW无模板)阴性对照样品。使用PVSRIPO质粒DNA批号L0305006作为阳性对照。两种PVSRIPO扩增子都在同一个96孔板上运行以消除批间变异。使用ABI 7900HT软件通过比较样品阈值循环值与质粒DNA标准曲线方程来计算测试样品中的初始PVSRIPORNA浓度。使用如下公式将初始RNA水平转化为pgRNA/mL：样品稀释因子(2)*[(平均测试样品质量(pg)-平均无模板质量(pg))÷(平均提取前加样回收效率(设为100％))]÷[(样品体积，每反应μL(20μL))*1000μL/ml]。
c.pH值
在PVSRIPO最终分装产品批号L0904010上进行pH测试。使用对氢离子活性敏感的指示电极、玻璃电极和合适的参考电极，从适当标准化的电位滴定仪(pH计)获得pH值，所述电位滴定仪能够重现pH值到0.02pH单位。该仪器能够检测电极对两端的电位，并能够通过温度和/或斜率控制来控制pH读数中每单位变化的毫伏数变化。测量在25±2℃进行。为了进行测试，使用两组两种标准化缓冲液(pH4.0和7.0，pH7.0和10.0)将pH计标准化。然后在测定试样pH值之前冲洗探针并吸干。该方法是有效的，因为两个标准化的斜率值在92.0％-102.0％的范围内。阳性对照为pH 4.0标准，pH 7.0标准，pH 10.0标准。
d.电子显微镜(EM)下的病毒颗粒
该测试被设计为通过负染色电子显微镜定量测试样品(PVSRIPO最终装瓶产品批号L0904010)中的病毒颗粒/mL的数量。对10个格栅空间进行照相，计数每个部分中病毒颗粒的数量并用于计算病毒颗粒/mL。通过用等体积的固定剂(2X PBS中8％甲醛)稀释并固定测试样品。将测试样品(0.5μL)置于Formvar-处理的/碳涂覆的网格上并使其风干。然后用5μL双蒸水(DDH20)洗涤样品以从样品中洗涤盐/磷酸盐缓冲液。然后将1％磷钨酸(PTA，pH7.0)水溶液(0.5μL)加入格栅中并使其风干。用电子显微镜检查格栅。拍摄十个格栅空间，并通过下式计算确定病毒颗粒的数量：
#病毒颗粒(vp)＝(平均#vp)×(格栅面积/照片面积)×(1mL/加入的病毒量，以μL计)
e.每个感染单元的病毒颗粒比例
通过将病毒颗粒浓度1.01×10 11vp/mL(QC-042172)除以病毒滴度3.98x109TCID50/mL(QC-042165)，计算PVS-RIPO最终分装产品批号L0904010的每感染单位的病毒颗粒比例(vp/IU)。
f.稳定性测试
1.PVSRIPO最终分装产品批号L0904010
PVSRIPO最终分装产品批号L0904010的稳定性测试正根据SP-137号方案进行，为期四年。指定的用于稳定性测试的样品瓶储存在≤-70℃的受控存储器中。稳定性测试的最终瓶装PVS-RIPO产品的特性包括视觉外观、效价(TCID50的病毒滴度)和安全性(内毒素/LAL，pH和生物负载)。在0,6,12,24,36和48个月的稳定时间点测试外观和TCID50的病毒滴度。在0,12,24,36和48个月的稳定时间点进行安全性(内毒素/LAL，pH和生物负载)测试。表8中包括了通过PVSRIPO最终分装产品批号L0904010的6个月稳定时间点所收集的稳定性数据总结。结果表明，PVSRIPO最终分装产品毒理学批号L0904010在≤-70℃下稳定6个月。
表8：PVSRIPO最终生物产品批号L0904010稳定性结果
2.PVSRIPO最终分装产品毒理学批号L0603006
之前的试验批次(PVS-RIPO毒理学批号L0603006)已经生产。PVS-RIPO毒理学批号L0603006用于食蟹猴的PVS-RIPO的测距调查研究。PVS-RIPO毒理学批号L0603006采用与临床批号L0904010相同的工艺制造，仅在与工艺规模有关的问题上有所不同。PVS-RIPO毒理学批号L0603006的分析证书包括在图22中。
储存在≤-70℃的PVS-RIPO最终分装产品批号L0603006的稳定性测试进行了48个月。通过电子显微镜检查(因为该方法不被认为是指示稳定性)来修改方案以除去病毒颗粒，去除测定病毒颗粒与感染单位的比例(Ratio VP/IU)，并且增加年度生物负载测试。表9中包括了通过PVSRIPO最终分装产品毒理学批号L0603006的48个月稳定时间点所收集的完整稳定性数据总结。结果表明，PVSRIPO最终分装产品毒理学批号L0603006在≤-70℃下稳定48个月。
生成小瓶标签，并将一个标签贴在每个小瓶上。这个过程产生了435个标记的填充小瓶。将标记的小瓶装箱并放入≤-70℃的储存。样品(52个标记的小瓶)被指定用于BQC释放测试。其余的383个标记的小瓶被指定为产品。将383个产品瓶转移到≤-70℃的受控存储器中。
将一个袋子标签插入每个383迷你袋中。将36个迷你袋(每个包含插入的袋子标签)放入每个贴有标签的包装盒中。将贴有标签的包装盒放入生物安全柜(BSC)中，放入盛有干冰的托盘中，使其冷却并在整个包装操作过程中保持在干冰上。在≤-70℃下，从受控存储器中取出总共383个标有PVSRIPO最终分装产品批号L0904010的小瓶，并将其置于相同的BSC干冰中。其中包括349个产品瓶，3个保留物和用于稳定性测试的31个产品瓶。将每个PVS-RIPO最终分装产品批号L0904010小瓶放入单独的迷你袋中(每个包含所插入的袋子标签)。
将每盒包装好的小瓶和吸收材料一起放入生物危害包中，并放回至≤-70℃储存。共有383瓶在≤-70℃下进行控制储存。
实施例6
PVSRIPO最终分装产品批号L1402001的化学，制造和控制修正
图23提供了由申请人生产的PVSRIPO最终分装产品批号的历史。使用与实施例5中所述相同的步骤来制造PVSRIPO最终分装产品批号L1402001，并进行以下改变。在琼脂糖6FF色谱步骤中使用实时RT-qPCR测试来确定含高滴度(≥1x107拷贝/mL)PVSRIPO病毒RNA的级分。这导致选择的级分略有不同，从而导致该批次的残留蛋白和游离病毒RNA更高。这也使得总感染的(TCID50IU)病毒产量增加了大约6倍。在收获汇集测试中增加了两次额外的支原体检测。一种检测是使用Vero细胞对病毒产物的支原体检测，另一个检测是使用Touch-down(TD)-PCR检测支原体。所有的支原体检测都是对最初使用Vero细胞而不是NIH/3T3细胞的收获汇集进行的。随后使用难以被PVSRIPO感染的NIH/3T3细胞进行测定。冷冻样品储存后还进行了触减PCR测试以验证不存在支原体DNA。在脊髓灰质炎病毒IRES的最终分装产品释放测试中又增加了额外的RT-qPCR测试，以确保不存在野生型病毒。对纯化无菌批量和最终分装产品释放测试的基因组测序方法使用Illumina新一代测序(NGS)方法。
图24提供了制造过程的概述。PVSRIPO最终分装产品批号L1402001由与先前PVSRIPO最终分装临床批号L0904010所用的相同主病毒种子批号L0403006和Vero工作细胞库批号217002-2制成。按照与之前临床批号相同的步骤(参见实施例5)，将Vero细胞扩增并在十层细胞工厂中用主病毒种子感染。通过离心收集病毒并汇集。用酶处理收获汇集以降低宿主基因组DNA的水平，并使用两个柱层析步骤(琼脂糖6FF层析和Q650M流通层析)纯化。然后使用超滤中空纤维膜浓缩物质，并对制剂缓冲液(50mM NaPO4，150mMNaCl，pH 7.4)进行渗滤。这种材料在≤-70℃冷冻大约三个月。解冻后，将物质合并，0.2微米无菌过滤，并装入2mL玻璃瓶中。简要的制造过程概述总结如下。
PVSRIPO最终分装产品是配制为含有0.2％HSA(HSA)的50mM磷酸钠、0.9％氯化钠pH7.4缓冲液的无色液体。PVSRIPO最终分装产品以每瓶0.5mL体积和4.48×109TCID 50/mL(2.2×109TCID 50/瓶)的浓度填充。产品在≤-70℃下储存。
生产材料
用于制造PVSRIPO最终分装产品批号L1402001的生产材料/试剂与实施例5中描述的相同。该酶是植物来源的并且通过发酵生产。酪蛋白酸水解物用于发酵培养基。用于生产酪蛋白酸水解产物的牛奶来自澳大利亚和新西兰的健康动物，其收集条件与人类食用牛奶相同。酪蛋白酸水解物不用牛奶之外的其他反刍动物材料制备。FBS是从经美国农业部检查的美国屠宰场采集的胎牛血制成的，对所检测的牛病毒呈阴性。HSA从Octapharma购买。HSA按照GMP规定生产，符合美国和欧洲药典的生产和产品检测标准。所有的捐赠血浆都经单独测试，对HBsAg，HIV-1/HIV-2Ab和HCV Ab没有反应。通过聚合酶链式反应方法(PCR)检测每个血浆池，并发现对HBsAg，HIV-1/HIV-2Ab和HCV-RNA阴性。胰蛋白酶来自加拿大动物收集的猪胰腺。动物在兽医的监督下进行宰前和宰后检查，显然没有传染性和传染性疾病。照射原料胰蛋白酶。供应商使用牛乳糖作为稀释剂来达到1：250的强度。这种乳糖来源于美国健康奶牛的适合人类食用的牛奶。对用于这种生产的原料胰蛋白酶进行了检测，发现对猪细小病毒、支原体和PCV 1和2阴性。
生产概要
生产PVSRIPO纯化无菌批量批号L1405001(P2)的制造过程如图25A-25B所示。PVSRIPO纯化的无菌批量批号L1311004是在BDP中使用工作细胞库(WCB)批号217002-2和MVS批号L0403006作为起始材料来制造的。两瓶Vero WCB批号217002-2在10个6360cm2的细胞工厂中进行扩增以生产细胞扩增批号L1310003。使用PVSRIPO MVS批号L0403006感染细胞扩增批号L1310003，并将收获物质(收获汇集批号L1311003)用于生产PVSRIPO纯化的无菌批量批号L1405001。
a.Vero细胞的启动和扩增
来自细胞扩增批号L1310003的Vero细胞用于生产细胞收获批号L1311003。在ATRF建筑A，GMP病毒生产车间的BDP进行细胞扩增活动。在整个扩增过程中，Vero细胞在补充有L-谷氨酰胺和不含酚红的HEPES的DMEM中生长。加入胎牛血清(HyClone目录号SH30070.03IR)，浓度为10％。细胞在整个细胞扩增过程中在37℃和5％CO2的设下进行孵化。
将两瓶Vero工作细胞库(WCB)批号217002-2在恒定搅拌下在37±2℃的水浴中解冻。将来自每个小瓶的细胞和9mL完全温热的培养基加入到15mL离心管中。混合后，取样进行计数并测定活力(79％和84％)。然后将细胞在4℃以1000rpm离心10分钟。离心后，弃去上清液，将细胞沉淀重新悬浮于含总体积为30mL DMEM培养基(如上所述)的75cm2烧瓶中。使用如上所述的生长培养基和条件，将细胞从75cm2培养瓶扩大至6360cm2细胞工厂，自冷冻后总共8次传代。
对从初始解冻的10代外的EOP细胞进行另外的致瘤性测试，以模拟生产所需的另外的放大传代。还增加了猪圆环病毒测试。此外，还加入了野生型脊髓灰质炎病毒IRES的检测。
b.Vero细胞的感染
在确认每个容器含有95-100％融合的健康细胞并且没有可见的污染迹象以产生感染的细胞裂解物之后使用Vero细胞批号L1310003(10个6360cm2细胞工厂，3个636cm2细胞工厂)。四瓶PVSRIPO主病毒种子(MVS)批号L0403006(125mL PETG瓶，80mL MVS等分试样)从≤-70℃受控储存中取出，在33-38℃的水浴中解冻，并用于以0.1pfu/细胞感染复数(MOI)的感染过程。通过将226mL的解冻的MVS批号L0403006添加至制备的感染培养基(含有非Hepes和酚红的L-谷氨酰胺的DMEM/F12)中来制备配制的感染培养基，总体积约8升。
通过用约750mL洗涤培养基(含有非Hepes和酚红的L-谷氨酰胺的DMEM/F12)洗涤，然后用约750mL制备的配制感染培养基进行灌注来制备10个6360cm2细胞工厂用于感染。还制备了阳性和阴性对照。感染的细胞工厂和对照在33℃、5％CO2浓度和80％湿度下孵化。在感染后70小时，在所有十个细胞工厂中都注意到了95-100％细胞病变效应(CPE)，并且在每个对照瓶中都注意到了预期的结果。
c.感染细胞裂解液的收获和澄清
从每个细胞工厂收获PVSRIPO病毒感染的细胞悬液批号L1311003，并将其汇集于无菌培养基袋中。取样感染的细胞悬液进行PVSRIPO收获汇集批号L1311003的释放测试。对PVSRIPO收获汇集批号L1311003释放测试的测试、规格、方法和结果总结的分析证明包括在图26中。
将感染的细胞悬浮液以约750mL等分试样转移至1L聚碳酸酯离心瓶中。将感染的细胞悬浮液在4℃和3800×g的设定下离心约20分钟。将来自每个离心瓶的澄清上清液合并在10L袋中，并分配到10×1L无菌PETG瓶中，冷冻，并转移到MMIC，在≤-70℃储存。
d.最终收获的处理
为了降低PVS-RIPO纯化批量批号L1311004生产过程中宿主基因组DNA的水平，澄清的PVS-RIPO批号L1311003收获物在≤-70℃下储存约3个月后，在室温下解冻21小时。将解冻的PVS-RIPO合并成两个10升袋并轻轻混合。将来自每个单独袋子的3毫升样品合并到一个15mL锥形管中。从每个袋中取出样品用于以下测试：TEM，Vero gDNAqPCR，噬菌斑测定，HCP，SDS-PAGE和全基因组测序。
在加入Benzonase酶之前，将100mM MgCl2混合加入到澄清PVSRIPO批号L1311003收获物的每个袋子(两袋)中至1mM MgCl2终浓度。将酶混合加入到每个袋中，至终浓度为50单位/mL。将袋子在2-8℃孵化18-21小时。经处理的裂解物从2-8℃中取出并取样。通过SDS-PAGE，全基因组测序，HCP，TEM，Vero gDNA qPCR，噬菌斑测定和TCID50分析样品。
e.琼脂糖6快速流动层析柱
琼脂糖6FF层析柱步骤在PVSRIPO纯化批量批号L1311004的生产期间提供缓冲液交换并将有低分子量宿主细胞污染物来源的病毒库进行部分纯化。用琼脂糖6快速流动(FF)树脂(GE医疗-生物科技，皮斯-卡塔韦，新泽西)填充的层析柱用于将病毒缓冲交换成低电导率磷酸盐缓冲液，以备进一步纯化。在加载酶处理的裂解物之前，将琼脂糖6FF柱用5M NaCl冲洗，加入4.7mM NaPO4，1M NaCl，pH 7.5，并用4.7mM NaPO4，42mM NaCl，pH 7.5平衡。
将处理的裂解物以两次相同的灌注加载到琼脂糖6FF柱上。用4.7mMNaPO4，42mM NaCl，pH 7.5洗脱产物，并将来自每次注射的PVS-RIPO主峰级分收集在几个2LPETG瓶中。通过实时逆转录qPCR(RT-qPCR)分析来自两次色谱运行的单个级分的样品。PVS-RIPO主峰级分在2-8℃下储存8-17小时。将基于实时RT-qPCR结果和来自琼脂糖6FF运行的UV吸光度的选定级分汇集到20L无菌袋中。对汇集的色谱分析样品进行如下分析：噬菌斑测定，RT-qPCR，SDS-PAGE，HCP，TEM和Vero gDNA qPCR。
f.Q650M流通层析柱
在琼脂糖6FF步骤后，将批号L1311004洗脱液用于Q650M流通层析柱以从非结合病毒中去除剩余的宿主细胞蛋白质污染物。用Super Q 650M树脂填充层析柱，并用5M NaCl冲洗，然后用4.7mM NaPO4，1M NaCl，pH 7.5冲洗，并用4.7mM NaPO4，42mM NaCl，pH 7.5平衡。
该柱装载有PVS-RIPO琼脂糖6FF主峰，收集含有病毒产物的流通液。洗脱过程中使用的缓冲液是4.7mM NaPO4，42mM NaCl，pH 7.5。使用5M NaCl调节所收集的Q650M主峰的NaCl浓度至150mM NaCl。Q650M主峰材料取样，然后在2-8℃储存约16小时。对样品进行以下分析：用于确定病毒滴度的噬菌斑测定，TCID50，SDS-PAGE，HCP，TEM和Vero gDNA qPCR。
g.通过切向流过滤来浓缩和渗滤
将Q650M主峰批号Lot L1311004材料从2-8℃的储存中移出并使用超滤中空纤维膜(GE医疗UFP-50-C-4MA)进行浓缩。然后将浓缩的病毒材料对配制缓冲液(50mM NaPO4，150mM NaCl，pH 7.4)渗滤。对渗滤的PVS-RIPO溶液样品进行分析：用于噬菌斑测定以确定病毒滴度、TCID50、SDS-PAGE、HCP、TEM和Vero gDNA qPCR。将HSA(25％)加入到渗滤的PVS-RIPO批号L1311004中，使终浓度为0.2％。对配制的PVS-RIPO样品进行分析：扩展生物负载，噬菌斑测定，TCID50，SDS-PAGE，HCP，TEM和Vero gDNA qPCR。
h.PVS-RIPO的批量分装，取样和储存
将配制好的PVS-RIPO纯化批量批号Lot L1311004转移到100级生物安全柜中，并以各自约3×250mL和1×167mL的体积分配到四个500mL PETG瓶中。将4瓶PVS-RIPO纯化批量批号Lot L1311004标记，在乙醇/干冰浴中冷冻，并储存在≤-70℃以备进一步生产使用。将PVS-RIPO纯化批量批号Lot L1311004转移到≤-70℃的受控存储器中。
i.纯化的无菌批量批号L1405001(P2)
将3×250mL和1×167mL瓶的PVS-RIPO纯化批量批号L1311004从MMIC中的≤-70℃受控储存器中取出，并转移到≤-70℃下。随后，将4瓶PVSRIPO纯化批量批号L1311004在21-25℃的水浴中解冻。产品温度为20℃。总解冻时间是195分钟。将4个容器的内容物合并到2LPETG瓶中，得到总的终体积934.3mL。将纯化的PVS-RIPO的2.5mL样品分配到0.5mL等分试样中，储存在≤-70℃下。将122mL在50mM NaPO4，150mM NaCl，pH7.4中的新鲜制备的0.2％HSA加入合并的PVS-RIPO纯化的批量批号L1405001中。在含0.2％HSA的50mM NaPO4，150mMNaCl，pH 7.4中的PVS-RIPO纯化的批量批号L1405001通过0.2微米无菌Millipak 20(Millipore)过滤器泵送，该过滤器已通过使用前的完整性测试并且已用稀释剂(50mMNaPO4，150mM NaCl，pH 7.4+0.2％HSA)预湿。在过滤产物后，使用相同的稀释剂冲洗过滤器，得到总量为1054mL的最终过滤产物。过滤器通过了过滤后的完整性测试。使用无菌移液管，取出27mL纯化的无菌批量批号L1405001，并将其分配到无菌样品容器中。将样品进行纯化无菌批量批号L1405001释放测试，得总的终体积约为1027mL。纯化的无菌批量批号L1405001然后进行填充步骤。
分装生产PVSRIPO最终分装产品批号L1402001
灌装PVSRIPO纯化的无菌批量批号L1405001以生产最终分装产品批号L1402001。手动灌装操作按照批准的程序在生物安全柜(BSC)中进行。使用两毫升13mm USP/EP I型硼硅酸盐玻璃瓶(West Pharmaceutical，目录号6800314，批号6102124826)。每个小瓶的目标分配体积为0.55mL(0.545至0.556mL)。进行工程中的重量检查。
在填充1792个小瓶之后，插入B2Flurotec Westar RS塞子(WestPharmaceutical，目录号1970-0002，批号D3161200)，并进行卷曲操作。在卷曲操作期间目视检查卷曲的完整性，丢弃五个小瓶。在完成填充、加塞和压接操作之后，检查未标记的小瓶。在检查期间，弃去21个未贴标签的小瓶，留下总共有1766瓶。
进行标记操作以继续该过程，取出用于测试和留存的54个小瓶后，产生可用的1712个带标记的填充小瓶。将所有的小瓶放入带标签的储存盒中，在≤-70℃下储存。随后取出另外两个小瓶用于测试，留下1710个小瓶。
包装PVSRIPO。将带有病毒浓度的附加标签插入塑料迷你袋中。将36个迷你袋(每个包含插入的袋子标签)放入每个贴有标签的包装盒中。将贴有标签的包装盒放入装有干冰的托盘上的BSC中，使其冷却并在整个包装操作过程中保持在干冰上。在≤-70℃下，共有1710个PVSRIPO最终分装产品批号L1402001标签的瓶子从受控制存储器中取出，并在干冰上在相同BSC中装入迷你袋(每袋一个瓶)。在装入迷你袋子的过程中，所有小瓶和盒子都放在干冰上。将36个包装的小瓶中的每一个放入标记的盒子中。将盒子放入≤-70℃的受控存储器中。
可接受的限度和分析方法
PVSRIPO收获汇集、纯化的无菌批量和最终分装产品的测试和规格与实施例5中描述的相同，但以下变化例外。收获汇集测试中增加了两个额外的支原体测试。一个是对使用Vero细胞对病毒产物支原体检测的测试，另一个测试是使用Touch-down(TD)-PCR检测支原体。对收获汇集的支原体检测最初使用Vero细胞而非NIH/3T3细胞。随后使用难以被PVSRIPO感染的NIH/3T3细胞进行测定。冷冻样品储存后还进行了触减PCR测试以验证不存在支原体DNA。在脊髓灰质炎病毒IRES的最终分装产品释放测试中又增加了额外的RT-qPCR测试，以确保不存在野生型病毒野生型或疫苗株脊髓灰质炎病毒。纯化无菌批量和最终分装产品释放测试的基因组测序方法改为更先进的Illumina新一代测序(NGS)方法。
PVSRIPO收获汇集批号L1311003、纯化的无菌批量批号L1405001和最终分装产品批号L1402001的释放测试、方法、描述和结果可在图27-28中的分析证书中找到。
分析方法的变化和测试描述
如实施例5中所述进行PVSRIPO收获汇集物、纯化无菌批量和最终分装产品的测试，除了对收获汇集样品进行一些额外的支原体测试。下面介绍这些方法以及其他支原体检测和新一代测序方法。
a.使用Vero细胞用于病毒产品的支原体测试
使用间接和直接方法在收获汇集批号L1311003上进行支原体检测。意外地是，Vero细胞的这个测试只在该收获汇集批号上进行，先前的测试已使用对脊髓灰质炎难以感染的NIH/3T3细胞(也对NIH/3T3细胞进行了测试)。由于与NIH/3T3细胞一起使用的收获汇集样品相对于Vero细胞测试，额外冷冻保存了一段时间，因此还进行了触减PCR(TD-PCR)测试以验证在收获汇集中不存在支原体DNA。
间接检测方法能够通过接种到Vero细胞上然后使用DNA结合荧光染料染色来显现支原体，特别是不可培养的支原体。在测试中使用了阴性和阳性对照。阳性对照包括强的细胞吸附(M.hyorhinis)和弱的细胞吸附(M.orale)支原体种类。基于观察到的染色图案,用DNA结合荧光染料染色培养基能够检测到支原体。在阴性培养物中只观察到细胞核荧光，而在阳性培养物中观察到核和外核荧光。
直接培养是一种灵敏而特异的检测支原体的方法。使用的琼脂和肉汤培养基提供营养物以及可培养支原体生长所需的碳和能量。在直接测定中使用阳性和阴性对照。阳性对照包括发酵性支原体(肺炎支原体)和非发酵性支原体(M.orrale)。
对于间接检测方法，收获汇集样品在37±2℃解冻，使用无菌磷酸盐缓冲液制备1:5和1:10稀释液。将未稀释的测试样品和每种稀释物接种到含有Vero细胞的两个盖玻片(每个样品/稀释物)的每一个上。盖玻片在36±1℃和5-10％CO2下孵育1-2小时。然后将2mL含有8％胎牛血清的EMEM加入到每个盖玻片中。盖玻片在36±1℃和5-10％CO2下孵育。孵育3天后，固定盖玻片，染色(Hoechst染色)，然后用落射荧光显微镜读取。
将两毫升未稀释的测试物分别接种到两个SP-4琼脂平板上，并将10毫升接种到含有50毫升SP-4肉汤的75cm2的烧瓶中。将平板在36±1℃下厌氧孵育至少14天。将烧瓶在36±1℃下厌氧孵化，并在第3天，第7天和第14天分别在两个SP-4琼脂平板(0.2mL/平板)上传代培养。将这些平板在36±1℃下厌氧孵育至少14天。14天每个工作日观察培养瓶颜色或浊度的改变。一般而言，支原体的生长导致发酵液变得浑浊。孵化14天后(第0天)观察琼脂平板。孵化14天后观察SP-4肉汤培养的平板(第3天，第7天和第14天)。支原体菌落长入琼脂中，使菌落中心显得不透明，周边表面生长呈半透明状。在光学显微镜下可以容易地观察到这些菌落。
b.经TD-PCR的支原体
在收获汇集批号L1311003上使用触减聚合酶链式反应(TD-PCR)测试进行支原体检测。如果PTC支原体Vero和NIH-3T3细胞测试性能之间的样品保持时间(≤-70℃下)可能导致保留的收获汇集样品中任何潜在的活的支原体丢失，则进行该测试。基于PCR的支原体测试将不会受到收获汇集保留物的冻融和超低温储存的影响。
PCR是一种对细胞、血清或组织样品中支原体DNA的检测非常敏感的工具。无论其传染性如何，PCR扩增了支原体DNA。通过用一组引物定义支原体序列选定保守区域的边界，有可能在几个小时内将靶序列扩增大于一千万倍。所扩增靶DNA的存在通过乙锭染色的凝胶电泳证实。该测试可用于检测少至1cfu的支原体DNA。触减PCR是一种改进的循环方法，使用退火梯度大大提高特异性和灵敏度。
通过裂解细胞或上清液并纯化获得测试样品DNA。将得到的DNA再悬浮于一定体积的无核酸酶的水中以产生0.1μg/μl的DNA。为了PCR扩增，制备含有合适引物，dNTP，缓冲液，水，MgCl2和Taq DNA聚合酶的试剂的主要混合物，并将其加入到测试的每个反应中。用8-甲氧基补骨脂素处理反应并暴露于U/V光以减少假启动事件的发生。将六个等份的测试物分配到PCR反应管中。处理三个等分试样，没有额外的对照DNA加标。其余三个等分试样加入1,10和100cfu的支原体DNA。处理四个等份试剂对照；一个反应含有除样品外的所有反应混合物的组分。其他反应管中加入1、10和100cfu的支原体DNA。使用一等份纯化的人类细胞H9DNA作为阴性对照。将三等份H9DNA加入1、10和100cfu的支原体DNA。TD-PCR扩增后，通过凝胶电泳分离扩增子并通过UV光检查。
c.病毒滴度(TCID50)
使用Hep-2C指示细胞进行TCID50病毒滴度以确定PVSRIPO收获汇集物、纯化的无菌批量和最终分装产品中的PVSRIPO病毒滴度。将100微升(100μL)稀释培养基(含4mM L-谷氨酰胺和1％FBS的RPMI1640)加入到独立96孔板的每个孔中(为每个参比标准、阳性对照和测试样品提供独立的板)。使用稀释培养基(含4mM的L-谷氨酰胺和1％FBS的RPMI1640)制备FDA脊髓灰质炎病毒1型参照标准-FDA批号TA4(1：10,000)、Sabin原始1型阳性对照脊髓灰质炎病毒(1：1,000,000)和测试样品(1：1,000,000)的初始稀释液。将各最终稀释液的100μL等分试样分别加入到相应96孔板的第一栏中的八个孔中。使用校准的多道移液器，通过在每个96孔板上从第1栏的每个孔中移除100μL，转移到第2栏中的邻近孔中，彻底混合并重复该系列的下一个栏的过程来制备系列1:2稀释液。对于FDA参考标准，稀释在第11栏处终止，第12栏用作阴性对照孔(仅含有稀释介质)。丢弃来自第11栏的过量的100μL。对于阳性对照和测试物，稀释方案在第二个96孔板继续，终止于第23栏，第24栏用作阴性对照孔。然后将生长培养基(具有4mM L-谷氨酰胺和10％FBS的RPMI-1640)(0.1mL，1x105个细胞/mL)中的10,000个Hep-2C细胞分别加入到每个96孔板的孔中，并在36±1℃下在潮湿的5％CO2培养箱中孵化10天。在第1,3,7和10天检查板的细胞病变效应(CPE)。完成测定后，将每个样品显示CPE的孔的数目输入由FDA提供的计算程序模板的适当区域。该程序根据FDA脊髓灰质炎病毒1型参考标准的应答计算每个样品的TCID50/mL。其他充分表征的PVSRIPO和Sabin-strain标准可用作阳性对照病毒，取决于FDA参考标准的可用性。
d.经rct40的病毒稳定性
该测试通过33℃，36℃和40℃下Vero指示细胞上噬菌斑的形成来确定PVSRIPO收获汇集物、最终分装产物和对照的病毒滴度。该测试是应用与温度相关的生长特性变化作为潜在遗传变化的指示来对病毒稳定性的间接测量。该测试是基于2002年第904号的世界卫生组织技术报告系列。其指出，与相同病毒类型的适当rct/40-和rct/40+的脊髓灰质炎病毒株相比，过滤的批量病毒悬浮液应在36℃和40℃的温度下进行再生性能测试。孵育温度应控制在+0.1℃以内。如果批量悬浮液的滴度和36℃适宜的参考标准比在40℃测定的至少高5.0个数量级(log)，则该过滤的批量将通过测试。所有参考物质的滴度应在预期值内。
比较病毒在36℃和40℃下的log10滴度，如果36℃和40℃之间的对数降低至少为5，则确定样品对于40℃是生长敏感的，并且被认为已通过测试。样品在33℃时的滴度也被确定，以便能与先前确定33℃时样品的滴度进行比较。阳性对照包括RCT 40+对照：脊髓灰质炎病毒1Sabin克隆S33批号L0406008和RCT 40-对照：脊髓灰质炎病毒1Sabin克隆S71批号L0406004。阴性对照是含有10％FBS的DMEM。
将Vero细胞铺板并使其生长直至80％至100％的融合度。去除生长培养基，Vero细胞用0.2mL测试或对照样品给药。然后将一式两份的培养皿在33℃、36℃和40℃孵育约1小时。除去接种物，并用1.5％琼脂糖/2×EMEM/20％FBS覆盖细胞片。使琼脂糖固化，并将两份的培养皿在33℃、36℃和40℃孵化直至阳性对照(2天)中斑块完全形成。然后用含有中性红的琼脂糖/2×EMEM在黑暗中覆盖培养皿，当细胞片被中性红染色时对噬菌斑进行计数。确定平均斑块值。滴度(pfu/mL)使用公式计算：平均空斑值×稀释倍数/接种量。
e.完整的基因组序列
对PVSRIPO纯化无菌批量和最终分装产品批次进行全面深度的序列分析。
1.RNA提取和逆转录
使用来自凯杰-Qiagen(日耳曼镇，马里兰州(Germantown，MD))的QIAamp病毒RNA微型试剂盒作为标准Qiagen方案的修改版本从测试样品中分离基因组RNA。简言之，将560μl不含载体RNA的Buffer AVL加入到140μl样品中。将样品涡流并在室温(23℃±2℃)下孵化10分钟。向样品中加入560微升100％乙醇，涡流混合，然后将一半样品(约630μl)加入到QIAamp Mini柱中，并以6000xg离心1分钟。将剩余的样品加入柱中并重复离心。然后用两种缓冲液洗柱。用40μl洗脱缓冲液洗脱两次，总的终体积约80μl。使用NanoDrop 8000分光光度计以光学计量法测定总RNA。然后使用来自生命技术(卡尔斯巴德，加利福尼亚州-LifeTechnologies，Carlsbad，CA)的ThermoScriptTM RT-PCR系统将RNA制成cDNA。简言之，将9μlRNA，1μl寡核苷酸(dT)20引物和dNTP在65℃孵化5分钟。孵化后，向样品中加入cDNA合成缓冲液，DTT，RNase Out和ThermoScript RT，将样品在50℃孵化45分钟，然后在85℃孵化5分钟以终止反应。将RNase H加入到样品中，并在37℃孵化20分钟。使用NanoDrop 8000分光光度计以光学计量法测量cDNA。然后使用来自新英格兰生物实验室的NEBNext第二链合成试剂盒并使用5μlcDNA产物进行第二链反应。将cDNA与第二链合成缓冲液以及第二链合成酶混合，并在16℃下孵化2.5小时。使用来自Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒对产物纯化，并在30μl无核酸酶水(NFW)中洗脱。使用NanoDrop 8000分光光度计以光学计量法测量ds-cDNA，并储存于-20±4℃用于短期储存。
2.文库制备
使用制备的dscDNA制备文库，用于在Illumina HiSeq 2500上测序。由每个原始样品制备一个文库。使用来自Illumina(圣地亚哥，加州)的Nextera XT文库制备试剂盒制备文库。基于先前对范围研究的努力，使用1μg至1ng的ds-cDNA输入量，dscDNA的起始总输入量为1ng。按照Illumina Nextera XT文库制备方案制备文库。简言之，使用Nextera标记化学物质，将每个样品酶促片段化并用接头序列同时进行标记(连接)。该过程将输入DNA片段化，并将接头序列添加到片段的末端以用于下游处理。然后中和连接酶，并进行简短的12个循环扩增以在5'和3'端添加条形码到每个样品上。每个文库都被分配了不同的条形码，以在分析过程中识别和描绘不同的样品。使用双轮Ampure XP珠洗涤清洁PCR反应物，然后在TE缓冲液中洗脱。然后使用高灵敏度DNA芯片在Agilent生物分析仪上分析每个文库以评估文库的质量和数量。将样品文库保存在-20±4℃作为短期保存。
3.Illumina cDNA测序和分析
对于每个样品，在Illumina HiSeq 2500上运行一个快速流动细胞。对于每个流动细胞，将文库变性并稀释用于仪器上的群集。然后使用Illumina SBS测序技术和试剂对每个文库进行配对末端2x150bp测序。使用Illumina HiSeq软件对所得数据解复用，然后进行分析。使用单个样品运行每个流动细胞。针对所有测序的级分生成FastQ文件。使用Samtools和mpileup软件将输出文件从SAM转换为BAM格式和索引输出文件，以便在整合基因组浏览器中查看。Mpileup与一个标志一起使用来增加每个位置的深度，以便检查病毒的覆盖范围并寻找潜在的变化。由于Nextera XT文库制备需要12个循环的PCR预扩增，因此在给定位置建立调用病毒序列变体阈值为212＝4096或读数的0.1％，以较大者为准。根据以下标准定义变体：如果在给定碱基位置的测序深度等于或超过4,096,000，则潜在的变化被称为大于0.1％；如果深度小于4096000但大于4096，则取用超过4096或更高频率的变体；如果在给定碱基位置的覆盖深度小于4096个读数，如果它们大于1.0％，则取用潜在变体。在需要额外的测序工作(Illumina，Sanger或其他NGS方法)之前，每个碱基位置的最小读取覆盖率设定为4X(最低监管)。
使用Bowtie(简短阅读参考对准器)将每个样品的读数与PVSRIPO参考序列进行比对。计算每个样品的碱基总数、覆盖度和平均读取长度以及各样本参照比对的读数百分比的值，并与预先建立的用于测定有效性的说明书进行比较。通过取总序列碱基并除以PVSRIPO参考序列(7303个碱基对)的大小来得到预估的基因组覆盖度。制备每个样品与参考位置比较的覆盖范围图以及每个样品的样品读取长度图。与参考序列比较时，分析检查每个样品中的变体。由于已知脊髓灰质炎基因组(VPg结合和Stem a/b)的这个区域显示体内高序列变异性，因此在每个病毒批次的5'末端(碱基位置1-34)可以预见(并观察到)多态性水平的增高。通过NCBI BLASTn分析未比对的读取序列以确定其身份；可预期到，非对齐读取特别是来自未纯化的病毒样本的读取将来自Vero宿主细胞基因组或线粒体DNA序列，尽管也可以观察到罕见的人类DNA或其它实验室污染物DNA序列。
f.宿主细胞DNA
使用靶向非洲绿猴(Vero)特异性Nectin-1α基因基因内部复制的基于的定量聚合酶链式反应(qPCR)(应用生物系统公司，福斯特市，加州)扩增子，单拷贝基因(登录号AF308635)来测试PVS-RIPO纯化的无菌批量批号的VERO基因组DNA载量。测试的检测限度为每毫升<5ng Vero基因组DNA。使用Vero细胞基因组DNA(gDNA)作为阳性对照(100ng-10pg)，使用具有约2250拷贝的内部阳性对照(IPC)的一系列测试物作为PCR抑制对照。使用无核酸酶水(NFW)进行阴性非测试对照(NTC)，并且每个样品的核酸提取对照包含相当于每个反应约10,000个拷贝的IPC。IPC使用VIC标记的探针，允许在相同的PCR反应中对测试和IPC扩增子进行定量。来自Vero宿主细胞DNA方法的IPC结果也作为伴随进行的病毒定量RT-qPCR方法的提炼和抑制对照。
实时qPCR是一种灵敏的定量扩增方法，可用于基因表达分析、基因分型、病原体检测/定量、突变筛选和精确的DNA检测，包括样品中低拷贝残留DNA或RNA的定量。使用应用生物系统7900HT 96孔仪器在扩增过程中连续检测PCR扩增产物的积累，从而允许在PCR的指数阶段进行准确的靶定量。使用96孔板块可以比384孔板块获得更大的反应体积，从而提高了对残留DNA和污染物DNA研究的测试灵敏度。
qPCR化学使用双重标记的荧光寡核苷酸探针。用于检测人基因组DNA的探针由用具有发射最大值的可区分荧光染料标记的寡核苷酸末端组成。探针5'末端用报告染料6-FAM标记，3'探针末端用淬灭染料标记。内部阳性对照(IPC)扩增子使用具有非荧光淬灭剂的VIC标记的探针来避免来自目标扩增子的发射干扰。寡核苷酸探针与非洲绿猴(Vero)nectin-1α基因PCR扩增子内的靶序列同源，并对Vero细胞具有高度特异性。Vero对人类gDNA的高排斥率是通过利用人类gDNA中不存在的非洲绿猴特有的九碱基序列重复元件作为探针靶点的一部分来实现的。探针猝灭染料在完整和游离溶液中通过FRET减少荧光报告发射。在PCR反应的延伸阶段期间，探针被Taq DNA聚合酶的5'核酸酶活性切割，从探针释放报告染料并增加了报告基因的发射。
每次PCR反应中初始靶标的精确定量发生在试剂耗尽或反应的副产物抑制之前的扩增指数(log2)阶段期间。然而，由于反应的信噪比和一般背景荧光的信噪比，最准确的数据通常是在对数阶段后期产生的。将归一化的报告荧光与时间作图，以PCR循环数表示。目标拷贝数或质量值是通过在背景之上分配荧光阈值和确定每个样品的扩增曲线达到阈值(定义为阈值循环或Ct)的循环点而产生的。每个反应的阈值循环值用于定量与已知标准物的量相比较的每个测试物反应中最初包含的靶点量。
使用靶向非洲绿猴(VERO)特异性Nectin-1α基因基因内部复制的基于的qPCR(应用生物系统公司，福斯特市，加州)扩增子，单拷贝基因(GenBank登录号AF308635)来测试PVS-RIPO纯化的无菌批量批号的VERO基因组DNA载量。使用ABIPrimer Express软件(版本2.0.0)设计引物和双荧光染料标记的探针。111-bp扩增子由正向引物：5'-(CCT CTG CCC AGC GTG AAG，SEQ ID NO：5)；反向引物：5'-(CAC AGA CAC GCC CAT GGA T，SEQ ID NO：6)；和探针：5'-[6FAM]-(CAC CCA AGC CAC CAA TGG CTC CAA)-[猝灭剂]，SEQID NO：7组成。用无核酸酶水(NFW)分别将引物和探针稀释至10和5pmol/μL。反应混合物由含UNG和ROX染料的25μL PCR 2X Master Mix、1.5μL IPC扩增子引物/探针(或NFW)、0.5μL IPC DNA(或NFW)、1μL正向引物、1μL反向引物、1μL 探针和20μL样品(50μL最终反应体积)组成。将反应混合物装载到96孔板中，用光学膜覆盖，并使用2步qPCR谱(2:00分钟，50.0℃；10:00分钟；95.0℃；40个循环0:15分钟，95.0℃；1:00分钟，60.0℃)使用ABI型号7900HT 96孔序列检测系统进行扩增。由纯化的和光学定量的DNA提取物制成的Vero基因组DNA标准曲线从100ng至10pg以在NFW进行10倍系列稀释。很少观察到来自10pg/rxn标准的阳性应答，相当于大约2.6个基因拷贝/rxn。在qPCR反应之前，使用批准的Qiagen洗涤剂离心柱小型制备方法提取总测试样品DNA。通过将相当于约2250个拷贝的IPC靶标DNA加入到适当的被提取测试物样品(即，先前未掺入IPC以监测提取效率的样品)中来监测由于样品组合物引起的潜在PCR抑制。通过加入相当于10,000个拷贝的IPC DNA测试样品的使用来监测提取效率。使用NFW对阴性(NTC)对照样品进行测试。所有标准品、测试样品、IPC加入和对照PCR反应重复进行两次。为了报告样本结果，必须满足方法控制和系统适用性标准，包括：NTC Ct评分，标准曲线Ct评分和拟合(R2)以及IPC提取和尖峰干扰恢复。使用ABI软件通过将样品阈值循环值与Vero DNA标准曲线方程进行比较来计算测试样品中初始基因组DNA污染水平。
纯化前，PVS-RIPO病毒收获汇集物经酶处理。核酸酶处理通常产生≤12个核苷酸的平均寡核苷酸片段，消化后片段群体遵循卡方分布。用于该测试的非洲绿猴(Vero细胞系)nectin-1qPCR扩增子长度为111bp。因此，该测定产生的结果代表了基于完整单倍体非洲绿猴基因组DNA(约3.88pg/单倍体拷贝)质量对残留宿主细胞DNA浓度的最差情况估计。
对脊髓灰质炎病毒IRES的RT-qPCR
使用靶向天然脊髓灰质炎IRES序列、采用基于的逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)扩增子“POSA”来测试PVSRIPO最终分装产物批号的野生型脊髓灰质炎病毒1型和2型IRES序列的存在。PVSRIPO中的IRES区域来源于HRV-2，并与POSA扩增子引物和探针序列是异源的。测试的检测限度为每个PCR反应中每2.6×107个拷贝PVSRIPO的野生型脊髓灰质炎IRES<100个拷贝。在测试之前，通过使用在别处描述的靶向PVSRIPO中HRV-2IRES和多聚蛋白CDS区域的TaqMan扩增子“PVS1”和“PO1”来确定PVSRIPO测试物的拷贝数。在测试时，通过用加有Sabin 1型脊髓灰质炎病毒的样品来证实该方法的检测限(LOD)。使用提取的Polio Sabin1型病毒RNA产生标准曲线(每个反应100pg至1fg)，并且加有测试物PolioSabin1型RNA的100拷贝用作扩增子抑制对照和用作建立测试检测限度的手段。在qPCR反应之前，使用批准的Qiagen小量制备方法提取测试样品病毒RNA。所有标准品和测试样品反应均重复进行。阴性对照为无核酸酶水的非测试对照(NTC)反应。一般的PCR抑制和提取对照由异源内部阳性对照(IPC)DNA和相关的IPC特异性引物组成，在同时对残留Vero宿主细胞DNA进行TaqMan qPCR分析的过程中用样品提取物分析探针。
在扩增过程中使用应用生物系统7900HT 96孔仪器连续检测PCR扩增产物的积累，从而使得在PCR的指数阶段进行准确的靶定量。使用96孔板块比384孔板块有更大的反应体积，从而提高了对残留DNA和污染物RNA研究的测定灵敏度。 qPCR化学利用双重标记的荧光寡核苷酸探针。用于检测人基因组DNA的探针由用两种具有发射最大值的可区分荧光染料标记的寡核苷酸末端组成。探针5'末端用报告染料6-FAM标记，3'探针末端用非荧光淬灭染料标记。寡核苷酸探针与Polio1型和2型IRES区内的内部靶序列同源，并且不与PVSRIPO中HRV-2衍生的IRES交叉反应。通过利用不存在于HRV-2的高度异源性脊髓灰质炎IRES区域实现了HRV-2IRES对脊髓灰质炎IRES序列的高排斥比例。在完整和在游离溶液中，探针猝灭染料通过FRET减少荧光报告的发射。在 PCR反应的延伸阶段，探针被Taq DNA聚合酶的5'核酸酶活性切割，从探针释放报告染料并增加了报告基因的发射。每次PCR反应中初始靶标的精确定量发生在试剂耗尽或反应副产物抑制之前的扩增的指数(log2)阶段期间。但是，由于反应和一般背景荧光的信噪比，最准确的数据通常是在对数阶段后期产生的。将归一化的报告荧光与时间作图，以PCR循环数表示。目标拷贝数或质量值是通过在背景之上分配荧光阈值并确定每个样品扩增曲线达到阈值(定义为阈值循环或Ct)的循环点而产生的。每个反应的阈值循环值用于定量与已知标准物的量相比较的每个测试物反应中最初包含的靶标量。为了报告样本结果，必须满足方法控制和系统适用性标准，包括：NTC Ct评分，标准曲线Ct评分和拟合(R2)，以及野生型脊髓灰质炎RNA回收率。
使用靶向脊髓灰质炎IRES的、基于的RT-qPCR(应用生物系统公司，福斯特市，加州)扩增子对PVS-RIPO最终分装产物测试野生型(或疫苗株)Polio1型和2型IREScDNA序列。使用ABI Primer Express软件(版本2.0.0)设计引物和荧光染料标记的探针。109-bp扩增子由正向引物：5'-(TTG GCG GCC TAC CTA TGG，SEQ ID NO：11)；反向引物：5'-(TGG GAT TAG CCG CAT TCA，SEQ ID NO：12)；和探针：5'-[6FAM]-(AGC CTA TTGAGC TAC ATA AGA ATC CTC CGG C)-[猝灭剂]，SEQ ID NO：13组成。将引物和探针分别用无核酸酶水(NFW)稀释至10和5pmol/μL。反应混合物由25μL不含UNG的 RT-PCRUniversal Master Mix，1.5μL NFW，1μL正向引物，1μL反向引物，0.5μL 探针和20μL样品(含有约2.6×107拷贝PVSRIPO)组成为50μL终反应体积。将反应混合物装载到96孔板中，用光学膜覆盖，并使用ABI 7900HT型96孔序列检测系统扩增，使用4步qPCR谱(2:00分钟，50.0℃；45：00分钟，60.0℃；5:00分钟，95.0℃；45分钟，0:20分钟，94.0℃；1:00分钟，62.0℃)。将由纯化的病毒RNA(WHO标准，BDP Part#30374)制备的脊髓灰质炎Sabin1型菌株标准曲线从100pg至1fg(约2.43x107至约243拷贝/rxn)在NFW中进行10倍连续稀释。
用于HRV-2 IRES和脊髓灰质多聚蛋白的RT-qPCR
使用靶向PVSRIPO中HRV-2IRES(PVS-1)和脊髓灰质多聚蛋白(PO1)的、基于的RT-qPCR(应用生物系统公司，福斯特市，加州)扩增子测试PVS-RIPO最终分装产品以确定PVSRIPO HRV-2 IRES(PVS-1)和脊髓灰质多聚蛋白(PO1)RNA载量。
寡核苷酸探针与PVSRIPO HRV-2衍生的IRES和脊髓灰质多聚蛋白RT-PCR扩增子内的内部靶序列同源，并且当一起使用时对PVSRIPO具有特异性。由于PVSRIPO为单链RNA病毒，在qPCR扩增之前，使用扩增引物作为热循环方案的一部分将样品提取物逆转录为cDNA。在完整和在游离溶液中探针猝灭染料通过FRET减少荧光报告的发射。在PCR反应的延伸阶段期间，探针被Taq DNA聚合酶的5'核酸酶活性切割，从探针释放报告染料并增加了报告基因的发射。
ABI Prism 7900HT使用双轴扫描头将来自氩离子(488nm)激光的激发光分配到所有96个孔中。CCD成像仪测量每个孔的荧光光谱和强度以在PCR扩增期间产生实时光谱数据。ABI序列检测软件(SDS)对报告基因、猝灭剂和归一化(ROX)染料的荧光强度解卷积，并计算放大过程中增加的归一化报告基因发射强度。阴性对照具有无核酸酶水的无测试对照(NTC)反应，而通常的PCR抑制和提取对照由异源内部阳性对照(IPC)和与样品提取物一起使用并在Vero宿主细胞DNA扩增期间伴随进行的相关IPC扩增子组成。
每次PCR反应中初始靶标的精确定量发生在试剂耗尽或反应副产物抑制之前的扩增指数(log2)阶段期间。然而，由于反应和一般背景荧光的信噪比，最准确的数据通常是在对数阶段后期产生的。将归一化的报告荧光与时间作图，以PCR循环数表示。目标拷贝数或质量值是通过在背景之上分配荧光阈值并确定每个样品的扩增曲线达到阈值(定义为阈值循环或Ct)的循环点而产生的。每个反应的阈值循环值用于定量与已知标准物的量相比较的每个测试物反应中最初包含的靶标的量。
为了在BDP上进行测试，使用ABI Primer Express软件(版本2.0.0)设计引物和荧光染料标记的探针。71-bp的HRV-2IRES(PVS-1)扩增子由正向引物：5'-(AAC CCAATG TGT ATC TAG TCG TAA TGA，SEQ ID NO：1)；反向引物：5'-(TGA AAC ACG GAC ACC CAAAG，SEQ ID NO：2；和TaqMan探针：5'-[6FAM]-(CAA TTG CGG GAT GGG ACC AAC T)-[BHQ]，SEQ ID NO：3组成。PO1的70-bp扩增子由正向引物：5'-TTG GTG GGA ACG GTT CAC A，SEQID NO：8)；反向引物：5'-(TCA CCT TGA CTC TGA GTG AAG TAT GA，SEQ ID NO：9)；和探针：5'-[6FAM]-(TTG CAG CGG CCC TGA AGC G)-[BHQ]，SEQ ID NO：10组成。将引物和探针分别用无核酸酶的水(NFW)稀释至10和5pmol/μL。反应混合物由25μL含ROX染料的1步RT PCR 2X MasterMix，1μL RNase抑制剂，1μLNFW，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL探针和20μL测试样品(50μL最终反应体积)组成。将反应混合物装载到96孔板中，用光学膜覆盖，并用ABI型号7900HT 96-孔序列检测系统扩增，使用3步qPCR谱(2:00分钟，50.0℃；48.0℃下30分钟(RT步骤)；10:00分钟，95.0℃；40个0:15分钟循环，95.0℃；1:00分钟，60.0℃)。由PVS-RIPO质粒DNA制备扩增子cDNA标准曲线，并将其从100pg至1fg 10倍连续稀释至NFW中。将标准对照样品重复运行，同时使用各种PVS-RIPO测试样品提取物的3个系列log10稀释物(10至1000倍稀释物)来验证RT步骤的性能，并在1000倍样品稀释液中定量病毒靶标拷贝数。在RT-qPCR反应前，按照批准程序，使用Qiagen小量制备方法提取对照和样品病毒RNA。一般的PCR抑制和提取对照由异源内部阳性对照(IPC)DNA和对残留的Vero宿主细胞DNA同时进行TaqMan qPCR分析期间用样品提取物分析的相关IPC特异性引物和探针组成。对缓冲液(NFW，无模板)阴性对照样品进行测试。两个PVS-RIPO扩增子在相同96孔板上运行以消除批间变异。使用ABI 7900HT软件通过将样品阈值循环值与质粒DNA标准曲线方程进行比较来计算测试样品中PVS-RIPO RNA浓度。质量到病毒拷贝数的转换是基于约10.8ag/拷贝的PVSRIPO质粒(PCR标准)质量和约4.1ag/拷贝的PVSRIPO病毒基因组质量。
EM下的病毒颗粒
使用阴性透射电子显微镜(TEM)来定量测试样品(PVSRIPO最终分装产品)中病毒颗粒/mL的数量。对10个格栅空间进行照相，每个部分中病毒颗粒的数量被计数并用于计算病毒颗粒/mL。
通过用等体积的固定剂(2X PBS中8％甲醛)稀释并固定测试样品。将测试样品(0.5μL)置于制备好的EMS CF200-Cu涂覆的格栅上并使其风干。然后将样品用5μL双蒸水(DDH20)洗涤三次以从样品中洗涤盐/磷酸盐缓冲液。然后将0.5％醋酸双氧铀水溶液(5μL)加入格栅中并使其风干。格栅用电子显微镜检查。拍摄十个网格空间，并通过以下计算确定病毒颗粒的数量：
#病毒颗粒(vp)＝(平均#vp)×(格栅面积/照片面积)×(1mL/加入的病毒量，以μL计)
最终分装产品批号L1402001的稳定性测试
PVSRIPO最终分装产品批号L1402001(储存在≤-70℃)的稳定性测试包括外观、经TCID50的病毒滴度、内毒素、pH和生物负载。所有测试在12，24，36，48，60和72个月进行。病毒滴度在6个月时进行。生物负载不在零时间点执行，因为无菌已作为产品发布的一部分来执行。
表10中包括了可获得的稳定性结果。基于TCID50结果，PVSRIPO最终分装产品批号L1402001在≤-70℃下至少可稳定6个月。
表10：PVSRIPO最终分装产品批号L1402001的稳定性结果，储存温度≤-70℃
鉴于公开的原理可应用于许多可能的实施例中，应当认识到，所阐明的实施例仅是所公开的示例，而不应被视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由以下权利要求限定。我们因此声明在这些权利要求和精神范围内的所有发明属于我们的发明。
序列表
<110> 美国政府（由卫生和人类服务部的部长所代表）
T·L·布罗特
史迈尔·H·夏班
谢跃庆
J·S·朱
G·密特拉
<120> 生产和纯化含核酸组合物的方法
<130> 4239-96897-02
<150> US 62/173,777
<151> 2015-06-10
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸引物
<400> 1
aacccaatgt gtatctagtc gtaatga 27
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸引物
<400> 2
tgaaacacgg acacccaaag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸探针
<400> 3
caattgcggg atgggaccaa ct 22
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸引物
<400> 4
gtaaaacgac ggccagt 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸引物
<400> 5
cctctgccca gcgtgaag 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸引物
<400> 6
cacagacacg cccatggat 19
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸探针
<400> 7
cacccaagcc accaatggct ccaa 24
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸引物
<400> 8
ttggtgggaa cggttcaca 19
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸引物
<400> 9
tcaccttgac tctgagtgaa gtatga 26
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸探针
<400> 10
ttgcagcggc cctgaagcg 19
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸引物
<400> 11
ttggcggcct acctatgg 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸引物
<400> 12
tgggattagc cgcattca 18
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸探针
<400> 13
agcctattga gctacataag aatcctccgg c 31

Claims (25)

1.一种用于获得包含活病毒的组合物的纯化方法，包括：
在尺寸分离色谱柱上分离包含活病毒的水性流体，
通过定量聚合酶链式反应(qPCR)测定发现于活病毒内的一个或多个核酸序列，所述活病毒存在于来自所述尺寸分离柱的洗脱液中的至少一个级分；
收集来自所述尺寸分离柱洗脱液的至少一阳性级分，所述级分包含发现于活病毒中的一个或多个核酸序列；
汇集所述至少一阳性级分；
在阴离子交换色谱柱上分离所汇集的至少一阳性级分，和
收集流通洗脱液中包含活病毒的至少一阳性级分，所述流通洗脱液来自所述阴离子交换色谱柱。
2.一种用于获得包含活病毒的组合物的纯化方法，包括：
在Sepharose 6快流(FF)分离色谱柱上分离包含活病毒的水性流体，
收集来自所述Sepharose 6FF分离柱洗脱液的至少一阳性级分，所述级分包含发现于活病毒的一个或多个核酸序列；
汇集所述至少一阳性级分；
在Super Q 650M树脂阴离子交换色谱柱上分离所汇集的至少一阳性级分，和
收集来自所述Super Q 650M树脂阴离子交换色谱柱流通洗脱液的至少一阳性级分，所述级分包含活病毒。
3.一种用于获得包含活病毒的组合物的纯化方法，包括：
将包含活了病毒模板序列的质粒DNA导入一个或多个细菌细胞中，由此产生用所述质粒DNA转化的一个或多个细菌细胞；
培养一个或多个转化细菌细胞的固相培养物，由此产生一个或多个细菌克隆；
检测来自所述一个或多个细菌克隆中至少一个的病毒模板序列的一个或多个核酸序列的存在；
增殖来自其中检测到一个或多个核酸序列存在的至少一个细菌克隆的细菌细胞培养物；和
从增殖的细菌细胞提取包含了病毒模板序列的质粒DNA，其中在增殖和提取步骤之间不冷冻细菌细胞；
用质粒DNA感染哺乳动物宿主细胞；
用质粒DNA培养哺乳动物宿主细胞；
从包含活病毒的哺乳动物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞碎片或两者获得液体细胞培养物；
采用能在溶液中消化游离核酸而非包封病毒核酸的核酸酶培养源自哺乳动物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞碎片或两者的液体细胞培养物，从而产生包含活病毒的水性流体；
在尺寸分离色谱柱上分离包含活病毒的水性流体；
通过定量聚合酶链式反应(qPCR)测定发现于活病毒内的一个或多个核酸序列，所述活病毒存在于来自所述尺寸分离柱的洗脱液中的至少一个级分；收集来自所述尺寸分离柱洗脱液的至少一阳性级分，所述级分包含发现于活病毒中的一个或多个核酸序列；
汇集所述至少一阳性级分；
在阴离子交换色谱柱上分离所汇集的至少一阳性级分，和
收集流通洗脱液中包含活病毒的至少一阳性级分，所述流通洗脱液来自所述阴离子交换色谱柱。
4.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，在阴离子交换色谱分离步骤后，所述方法不包含任何其他色谱分离步骤。
5.如权利要求1-4任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述方法包含两个色谱分离步骤。
6.如权利要求1-5任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述方法还包括通过渗滤浓缩流通洗脱液中洗脱的活病毒。
7.如权利要求1-6任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法在少于8小时内进行。
8.如权利要求1-5任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法的纯化产率为至少50％，其中所述方法的活病毒产率为至少5×1011pfu，其中在流通洗脱液中洗脱的活病毒的感染性为至少为1×1012组织培养感染剂量(TCID)50，或其组合。
9.如权利要求1-2或4-8任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述包含活病毒的水性流体是通过包括在一轮或多轮细胞培养中培养感染病毒的宿主细胞的方法获得的液体细胞培养物。
10.如权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，所述液体细胞培养物通过在培养后还包含从宿主细胞、宿主细胞碎片或两者分离所述液体细胞培养物的方法获得。
11.如权利要求9或10所述的纯化方法，其特征在于，所述液体细胞培养物通过还包含采用能在溶液中消化游离核酸而非包封病毒核酸的核酸酶孵育液体细胞培养物的方法获得。
12.如权利要求9-11任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述活病毒通过包括以下步骤的方法获得：
将包含活病毒模板序列的质粒DNA导入一个或多个细菌细胞中，由此产生用所述质粒DNA转化的一个或多个细菌细胞；
培养一个或多个转化细菌细胞的固相培养物，由此产生一个或多个细菌克隆；
检测来自所述一个或多个细菌克隆中至少一个的病毒模板序列的一个或多个核酸序列的存在；
增殖源自其中检测到一个或多个核酸序列存在的至少一个细菌克隆的细菌细胞培养物；和
从增殖的细菌细胞提取包含了病毒模板序列的质粒DNA，其中在增殖和提取步骤之间不冷冻细菌细胞。
13.如权利要求9-11任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述感染病毒的宿主细胞通过包括以下步骤的方法获得：
将包含了活病毒模板序列的质粒DNA导入一个或多个细菌细胞中，由此产生用所述质粒DNA转化的一个或多个细菌细胞；
培养一个或多个转化细菌细胞的固相培养物，由此产生一个或多个细菌克隆；
检测来自所述一个或多个细菌克隆中至少一个的病毒模板序列的一个或多个核酸序列的存在；
增殖源自其中检测到一个或多个核酸序列存在的至少一个细菌克隆的细菌细胞培养物；
从增殖的细菌细胞提取包含了病毒模板序列的质粒DNA，其中在增殖和提取步骤之间不冷冻细菌细胞；
通过模板序列的体外翻译生成病毒的裸RNA；和
将病毒的裸RNA导入宿主细胞，从而产生病毒感染的宿主细胞。
14.如权利要求3、12或13所述的纯化方法，其特征在于，所述质粒是包含大肠杆菌复制起点的细菌质粒，并且其中所述一个或多个细菌细胞是大肠杆菌细胞。
15.如权利要求9-14任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
16.如权利要求3或13所述的纯化方法，其特征在于，所述哺乳动物宿主细胞是Vero细胞。
17.如权利要求1-16任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述病毒是RNA病毒或单链DNA病毒。
18.如权利要求17所述的纯化方法，其特征在于，所述RNA病毒是非天然存在的脊髓灰质炎活病毒。
19.如权利要求18所述的纯化方法，其特征在于，所述非天然存在的脊髓灰质炎活病毒是溶瘤脊髓灰质炎病毒或萨宾脊髓灰质炎病毒。
20.如权利要求18所述的纯化方法，其特征在于，所述非天然存在的脊髓灰质炎活病毒是PVS-RIPO。
21.一种产生包含病毒模板核酸分子的质粒的方法，包括：
将包含了病毒模板核酸分子的质粒DNA导入一个或多个宿主细胞中，由此产生用所述质粒DNA转化的一个或多个宿主细胞；
培养一个或多个转化细胞的固相培养物，由此产生一个或多个克隆；
检测来自所述一个或多个克隆中至少一个的病毒模板核酸分子的一个或多个核酸序列的存在；
增殖源自其中检测到来自病毒模板核酸分子的一个或多个核酸序列存在的至少一个克隆的细胞培养物；和
从增殖的细胞提取包含了病毒模板核酸分子的质粒DNA，其中在增殖和提取步骤之间不冷冻转化的细胞。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述病毒模板核酸分子编码PVS-RIPO、萨宾脊髓灰质炎病毒或天然脊髓灰质炎病毒。
23.一种组合物，使用权利要求1-22任一所述方法产生的组合物。
24.一种包含病毒模板质粒的组合物，其中所述组合物包含少于25％的具有转座子插入事件的质粒、少于25％的二聚化质粒、少于25％的无病毒模板序列的空质粒，或其组合。
25.一种试剂盒，包含权利要求23或24所述的组合物。
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