JPH05503634A - ｃＤＮＡからＲＮＡウイルスを産生する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｃＤＮＡからＲＮＡウィルスを産生ずる方法発明の背景 本明細書の全体にわたって、多様な参考文献が括弧内に、あるいは括弧内のアラ ビア数字で引用されている。アラビア数字で引用された参考文献の完全な文献目 録は、請求の範囲の直前の、明細書の最後に示しである。これらの文献全体の開 示はここに参考として本明細書に含め、本発明が含む技術の記述をより完全に説 明するものである。

ピコルナウィルス科に属するヒトエントロウィルスは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲ ノムを特徴とする。このウィルス科のメンバーとしては、ポリオウィルス、エコ ーウィルス、コクサラキーウィルス、およびライノウィルスが含まれる。これら のウイ゛ルスのなかで、ポリオウィルスが最も詳細に研究されている。

ポリオウィルスは、中枢神経系の麻痺性疾叡であるポリオ（を軸性小児麻痺）を 引き起こすウィルスであることが知られている。このウィルスは３つの安定な血 清型−１，２，および３が存在することが知られている。２５年以上、この疾患 はサビン（Ｓａｂｉｎ）経口弱毒性生ワクチンおよびソーク（Ｓａｌ、ｋ）不活 化ウィルスワクチンの使用によって抑えられてきた。サビンワクチンは各血清型 の弱毒性ウィルスから成り、そのいずれも疾患を引き起こすことはできない。ワ クチンを作成するのに用いた株は、サル組織で３種の各野生型株をｉｎ　ｖｉｖ ｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏでの広範な継代によって作られた。経口投与では、サ ビンワクチンに含まれる生きたウィルスが腸で増殖し、それによって全身性およ び局部免疫を誘導する。不活化されたウィルス（ソーク）ワクチンは、筋肉内に 投与されるものであり、全身性免疫を誘導する。

サビンワクチンは安全でポリオに対する効果的な予防法であると考えられている が、少数の受容者はワクチンに関連した疾患にかかった。

弱毒化と復帰の分子的基礎を理解する努力を行う過程において、３種の弱毒性株 およびその野生型祖先に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較が行われた （Ａ。

ノモト他、“弱毒性サビン１株ゲノムの完全なヌクレオチド配列”、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　じＳＡ、７９、ｐｐ、　５７９３−９７ （１９ｇ２）：Ｇスタンウェイ（Ｓｔａｎｗａｙ）他、“神経劇毒性および弱毒 性３型ポリオウイルスの外殻タンパク質ｖＰ１をコードするゲノム領域の核酸配 列”、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、１３５．ｌ）ｐ、５２９−３３（１９ ８３）：Ｇ、スタンウェイ他、“神経劇毒性ポリオウィルスＰ３／レオン／３７ およびその弱毒性サビンワクチン誘導株Ｐ３／レオン／１２ａｂのゲノムの完全 なヌクレオチド配列の比較”、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ、７９、ｐｐ、　１５３９−４３（１９８４）　；およびＨトヨダ他、 “ポリオウィルスの３種すべての血清型のゲノムの完全なヌクレオチド配列”、 Ｊ、　１ｌｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　１７４　ｐｐ、　５６１−５１１１５（１ ９８４））。それぞれの野生型祖先とそれから得られた弱毒性株のヌクレオチド 配列で見いだされた相違点がさらに解析され、弱毒化という現象との関連が決定 された。

たとえば血清型３では、弱毒性株は野生型株と、１０個の点変異のみが異なって いた（Ｇスタンウェイ他、（１９８４）、前出）。これらの相違点の中で、ヌク レオチド４７２位と２０３４位における変異のみか弱毒化に強く関与していると 考えられている（Ｄ、　Ｍ、　Ａ。

エバンス（ｌｖａｎｓ）他、“サビン３型ポリオウィルスゲノムの非コード領域 における単一のヌクレオチド変異と関連している神経劇毒性の増加”、５ａｔｕ ｒｅ、　３１４．　ｐｐ、　５４ｇ−５０（１９８５）　；Ｇ、　Ｄ、ウニスト ロツブ（Ｗｅｓｔｒｏｐ）他、“セビン３型経ロポリオウィルスワクチンの弱毒 性の遺伝学的基礎″、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　、　６３．　ｐｐ、　１３３８−４ ４（１９８９））。

弱毒化にリンクしているヌクレオチドの同定に先立ち、ウィルスＲＮＡ鋳型から 合成されたｃＤＮＡ（“ＲＮ＾ウィルスｃＤＮＡ”　）を哺乳類細胞にトランス フェクションしたのちに生育可能なポリオウィルスを産生ずるのに使用できるこ とが示された（Ｖ、　Ｒ。

ラカニエロ（Ｒａｃａｎｊｅｌｌｏ）他、“クローニングされたポリオウィルス 相補ＤＮＡは哺乳類細胞に感染性を持ツー、５ｃｉｅｎｃｅ、　２１４．　ｐｐ 、　９１６−１９（１９８１））。このような観察により、遺伝子工学技術によ って改良したポリオワクチンを産生ずる可能性が生じた。これは、ウィルスの構 造的および機能的な統合性を維持しながら、野生型ヌクレオチドへの復帰を最小 にするように、重要なヌクレオチドの周辺のｃＤＮＡを変異させることによって 達成された。

ＲＮ＾ウィルスｃＤＮＡを生育可能なウィルスの産生に使用できるという発見に もがかわらず、これらのｃＤＮＡが野生型あるいはワクチンウィルスに存在する ウィルス性ＲＮ＾の正確なニビーであることは証明されていなかった。さらに、 どのヌクレオチドか弱毒化に寄与しているかを決定するためにｃＤＮ＾配列を使 用したことにより、１力所以上の重要な部位を見落とすことになった可能性もあ る。これは、ｃＤＮＡを作成するために用いられた過程、すなわち逆転写が誤り を生じやすいためである（Ｉ。

組パーマ（Ｖｅｒｍａ）、”逆転写酵素’、Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　Ｖｏｌ 、　１４．　Ｐ、　Ｄ、ボイヤ（Ｂａｙｅｒ）！ＩＪＩ、アカデミツク・プレス 、ニュー・ヨーク、ｐｐ、　８７−１０４（１９８１））。

したがって、ワクチンウィルスＲＮＡに完全に相補的なＲＮ＾ウィルスｃＤＮＡ 産生の必要性がまだ残されている。さらに、これらのｃＤＮＡが最終的にポリオ ワクチンなどのワクチンを産生ずるために使用されると、不正確なＲＮＡウィル スｃＤＮ＾の使用により弱毒性が低下する可能性もある。

ポリオウィルスのゲノムは、約７５００ヌクレオチドの一本鎖ブラス鎖ＲＮＡ分 子である。ポリオウィルスに関して、一本ＱＲＮ＾の複製に関連した読み誤りの 頻度は、二本鎖ＤＮＡと比較した場合、顕著に高い（３）。この遺伝的性質によ り、オリジナルのサビン（ＳＯ）株を含むすべてのポリオウィルスの調製物は遺 伝型に関して均質ではないと考えなければならない。

培養条件（すなわち、１度、細胞基質）、および加えたウィルスの均質性が、ポ リオウィルス試料の増幅の際にどの遺伝子型が優勢になるかに影響するようであ る。

したがって、ｏｐｖの生産を規制する機関（すなわちＦＤ＾およびＶ！１１０） がシードの生産法およびワクチン中で典型的なシードの継代レベルに関して厳し いガイドラインを課しているのも驚くべきことではない（２２，２６）。これら の規制は、弱毒性が低い変異株の選択および増幅を最小にするための努力の一環 として実行された。

サビン３型株の弱毒性表現型は、１型および２型ワクチン株よりも遺伝学的に不 安定であることはよ（報告されている（４．７．１１）。過去には、新しく製造 したシード（Ｒ２Ｏ）は、抽出された感染性ＲＮ＾によってオナガザル腎臓細胞 単層に生じたプラークを選択することにより、オリジナルのセビつ３型ウィルス を得た（１９）。単離したウィルスは、連続継代において４０，３℃での増殖に 対する感受性の安定性が増していること（ｒａｔマーカー）と、サルでの弱毒性 が増していることを指標に選択した。３７℃以上の温度での増殖感受性（ｒｃｔ マーカー）は、ワクチン株の貫を分析するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏ生物学的試験 として現在も用いられる（１３）。

コハラ他の報告（９）は、感染性ｃＤＮ＾クローンをサビン１型ンードの均一性 と質を保持するために使用し得ることを提案している。同様な手法を弱毒性３型 株にも適用することも可能だと考えられる。最近まで、文献にはヌクレオチドの α１が異なる２種類のサビン３型株ｃＤＮ＾が報告されていた（１７．２１）。

これらの配列の相違は、ＣＤＮ＾クローンを作成するために実際のワクチンウィ ルスではなく、サビン３型の継代誘導物およびクローン性単離物を用いた二とに よると考えられる。

発明の概略 本発明は、ヒトなどの対象を免疫するのに有用なワクチンも与えるものであり、 ここでワクチンは、ウィルスをコードする組み換え核酸配列で適当な宿主細胞を 形質転換することによって産生される、効果的な量のＲＮＡウィルスを含む、ま た、対象を免疫するのに効果的な、このように産生されたウィルスを単離するこ とを提供する。

本発明により、感染性ポリオウィルスに対して、ヒトなどの対象を免疫する方法 もさらに含み、ここにおいて該方法は上記の適当量のワクチンを対象に投与する ことを含む。

図面の簡単な説明 第１図はセファロースＣＬ−４Ｂカラムを通した、ポリオウィルス３型株から合 成したｃＤＮＡ東−鎖のクロマトグラフィーのプロフィールを示している。

ＷＣ２図はＰ３／サビンゲノムにマツプされたｃＤＮＡクローンを示す。

東３図は部分的ｃＤＮＡから本発明による一本鎖全長Ｐ３／サビンｃＤＮＡを合 成するためのストラテジーを示している。

箪４図（パネルＡおよびＢ）、および第５図はともに、Ｐ３／サビンｃＤＮＡを ミュータジェナイズするストラテジーおよび、本発明の真の全長Ｐ３／サビンｃ ＤＮ＾を構築するためのストラテジーを示している。

第４図、パネルＣは以下のものを示している。第６図に示されたｐＬＥＤ３の配 列、Ａ−には、ｐＶｉ！３１８の完全な解析により演縫されたものであり、ｐＶ Ｒ３１ｇの構築に用いられた同じサブクローン（ｐＬＬ−２７１）由来の５ａｃ Ｉ／ＢｉｎｄｌＩＩ断片を交換することによって２４９３位を変換した。しかし 、ｃＤＮＡ全長の配列の確認のためにプラスミドｐＬＥＤ３の塩基配列決定を行 ったところ、ウィルスゲノムで通ｆ６個のＡが連続している部分（４１３３−４ １３８位）に、さらに−Ａ′（アデノンン）が挿入されていることが明らかにな った。誤った“八゛はサブクローンｐＬＬ３−２７１１：も見いだされた。ｐＬ Ｌ３−２７１およびｐＢｒ３１８から、この部位に正しい数の＾を含むｐＬＥＤ ３．２を作成した。

正しい数の＾を持つｐＬＥＤ３を再構築するために、上で用いたｐＬＬ−２７１ 由来の５ａｃｒ／ＥｌｉｎｄＩＩＩ断片をバクテリオファージＭ１３にクローニ ングし、オリゴヌクレオチドによる欠失ミュータジェネンスを行った。この目的 のために、ヌクレオチド４１２１−４１５０の範囲のオリゴヌクレオチドを合成 した。オリゴヌクレオチドの配列は次のものであル：　５’−ＣＧＣＣＴＣＡＧ ＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＡＣＣＡＡＣＴＡＴＣ−３’。

ミュータジェネシスはゴ７−ＧＥＮ　ｉｎ　Ｖ１ｉｒＯミュータジエネンスキッ ト”（ユナイテッド・ステー７・バイオケミカル社、クリーブランド、オハイオ 州）を用いて行い、製造元の指示に従ワた。ミュータジエネシスを行ったインサ ートをＣＢ２と呼び、塩基配列決定により、４１３３−４１３８位に６個のＡを 、２４９３位にＣを持つことが示された。ＣＢ２の５ａｃＩ／ＢｉｎｄＩ１１断 片を、もとのｐＬＥＤ３の構築に使用したｐｖＲ３１ｇの５ａｃｌ／ＨｉｎｄＩ ｒＩ部分消化断片に連結することにより、正しい全長構造を作成した。この連結 産物をｐＬＥＤ３．２と呼ぶ。ｐＬＥＤ３．２の完全なｃＤＮ＾塩基配列は、第 ６図の＾−にの配列と一致することが確認された。

第６図、パネルＡからＫは、本発明の真の３型ポリオウィルスワクチン株ｃＤＮ ＾のヌクレオチド配列を示している。

第７図、パネルＡは、全長ＬＥＤ　ｃＤＮＡおよびＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプ ロモーターを含むプラスミドの構造を示している。大きな陰のついた部分はポリ オウィルスｃＤＮＡを示す。小さな白抜き部分はＴ７プロモーター（ｐＴ７）お よびｃＤＮＡのｔｎ　ｖｉｔｒｏでポジティブな極性の転写産物の開始部位を示 す。プラスミドは、ラン−オフ転写産物を合成する前に、ＰｖｕＩで切断する（ 切断部位を示す）。パネルＢは精製した丁７ＲＮ＾ポリメラーゼによってｃＤＮ Ａクローンから転写されたＲＮＡを示す。転写反応液の一部は、材料と方法、実 施例１３で述べるように、０．６％アガロースゲルでの電気泳動によって解析し た。レーン１から３は、７．５ｋｂ　５ｓＲＮＡで、それぞれ０．７５５ｇ、０ ．５ｈｇ、０．２５＋Ｉｇである。ＢｉｎｄＩｌｌで消化したλファージＩＩＮ ＾をレーン４に示す。レーン５および６は、それぞれＰｖｕＩで消化したｐＬＥ Ｄ３およびｐＶＲ３１８の鋳型を含む転写反応を示す。ペレットとなったウィル ス粒子から抽出したＲＮＡをレーン７に示す。

箆８図はＬＥＤ３およびｖＲ３１８ｃＤＮＡ由来ウィルスのＳＯＳポリアクリル アミドゲル電気泳動を示す。Ｃ３５Ｓ］メチオニン標識した試料を調製して各レ ーンにのせ、後で述べるように電気泳動で分離した。ゲルを乾燥させ、オートラ ジオグラフィーによってタンパク質のバンドを視覚化した。ＬＥＤ３ウィルスを レーン“＾”に、ｖＲ３１８ウィルスをレーン丁に示す。染色済分子量マーカー （キロダルトン）の位置を左側に示しである。ウィルス外殻タンパク質を右側に 示している◇第９図はＶｅｒｏ細胞でのレオン（野生型）、ｖＲ３１ｇ、および ＬＥＤ３ウィルスのプラーク表現型を示している。１鴎栄養寒天で３３５℃で３ 日インキュベートした後、細胞をニュートラルレッドで染色し、プラークを視覚 化した。

第１０図は、３３５℃におけるウィルス増殖の動力学を示している。ＶｅｒＯ細 胞の単層を１ｌＯＩ　４で感染させ、感染後の図示した時間に細胞外培地を回収 した。材料と方法、実施例１３で述べるように、プラークアッセイによって１ｍ ｌあたりの感染性粒子の力価を決定した。

０−０．　ＬＥＤ３　；　△−−−−”△、ＶＲ３１８゜第１１図は多様な温度 でのＬＥＤ３およびＶＲ３１ｇウィルスの温度安定性を示している。

約１０７３ｐｆｕ／ｍｌを含むウィルス試料を２２℃（丸）、３７℃（四角）、 および４２℃（三角）でインキュベートした。試料を定期的に取り、感染性ウィ ルスの力価をプラークアッセイによって決定した。白抜きのマーク、ＬＥＤ３； 黒のマークＪＲ３１８゜発明の詳細な説明 本発明は真のＲＮ＾ウィルスｃＤＮＡを産生ずるための方法を与えるものであり 、（ａ）ＲＮＡウィルスからゲノムＲＮ＾を単離すること：（ｂ）ＲＮ＾シーク エンλ法により、単離したゲノムＲＮＡの一部のヌクレオチド配列を決定するこ と＋（ｃ）ｃＤＮＡ合成法により、単離したゲノムＲＮ＾から二本鎖ｃＤＮ＾を 作成すること：（ｄ）ＤＮＡンークエンス法によってｃＤＮＡの一部のヌクレオ チド配列を決定することであって、ここでｃＤＮＡの一部は過程（ｂ）において 配列決定したＲＮＡ部分に対応する；（ｅ）配列決定したｃＤＮＡを配列決定し たＲＮＡと比較して、ヌクレオチド配列の実際の相違点を決定すること；および （ｆ）ｃＤＮＡにおける実際の相違を修正して、真のＲＮ＾ウィルスｃＤＮ＾を 作成すること、の過程を含む。

本発明はまた、ＲＮ＾ウィルスｃＤＮ＾を産生ずる方法も与えるものであり、ａ ）ＲＮＡウィルスからゲノムＲＮ＾を単離すること、ｂ）ＲＮＡシークエンス法 により、単離したゲノムＲＮＡの一部のヌクレオチド配列を決定すること＋ｃ） ｃＤＮＤＮＡ法により、単離したゲノムＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを作成するこ と；ｄ）ＤＮＡシークエンス法によってｃＤＮＡの一部のヌクレオチド配列を決 定することであって、ここでｃＤＮＡの一部は過程ｂ）において配列決定したＲ ＮＡ部分に対応する；ｅ）配列決定したｃＤＮＡを配列決定したＲＮＡを比較し て、ヌクレオチド配列の実際の相違点を決定すること、およびｃＤＮＡにおける 実際の相違を修正してＪＮＡウィルスｃＤＮ＾を作成すること、の過程を含む。

本発明はまた、上述の方法で、ＲＮＡウィルスが３型ポリオウィルスワクチン株 などのピコルナウィルスである方法も与えるものである。

本発明の態様の一つでは、過程（ｂ）で塩基配列決定されるＲＮＡ部分はワクチ ン株３型ポリオウィルスのヌクレオチド２４９３位を含む。本態様のさらなる局 面において、該ＲＮ＾は約１００から２００ヌクレオチドからなる。あるいは、 単離したウィルスＲＮＡ全長のヌクレオチド配列を過程（ｂ）で決定する。

本発明はさらに、上述の方法で産生された真のＲＮ＾ウィルスｃＤＮ＾またはＲ Ｎ＾ウィルスｃＤＮ＾を与えるものである。例えば、真のＲＮＡウィルスｃＤＮ ＾またはＲＮＡウィルスはワクチン株３型ポリオウィルス、ｐＬＥＤ３．２また はｐＬＥＤ３と呼ばれる新しいプラスミドに含まれるものから選択されるｃＤＮ Ａ、あるいはｐＬＥＤ３．２またはｐＬＥＤ３から発現されるようにコードされ ているポリペプチドの発現をコードしているｃＤＮＡ、およびこれらから作成さ れた組み換えＤＮＡ分子に由来するものである。

組み換えＤＮＡ分子はＲＮＡ転写用プロモーターに、機能するように連結するこ とができる。適当なプロモーターであり、制限を与えるものではないものとして は、Ｔ７プロモーターがある。

上述の組み換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主も本発明で与えられるものであり 、ここで宿主は大腸菌などの細菌、酵母およびその他の菌類、昆虫細胞、および 動物細胞からなる群から選択される。適当であるが、制限を加えるものではない 動物細胞としては、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯ５細胞、ＣＶ−１細胞、 および−次サル腎臓細胞がある。

本発明によってさらに与えられるものは、生育可能なＲＮＡウィルスを産生ずる 方法であって、（ａ）生育可能なＲＮＡウィルスの産生の可能な条件下で、上述 の宿主を培養すること；（ｂ）生育可能なウィルスを宿主細胞培養液から回収す ること、の過程を含む。

本発明は生育可能なＲＮＡウィルスを産生ずる方法を与えるものであり、（ａ） ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写を用いて上述の組み換えＤＮＡ分子からＲＮＡを調製する こと、（ｂ）ＲＮＡを単離すること；（Ｃ）単離したＲＮＡで宿主をトランスフ ェクションすることであって、ここで宿主が動物細胞であること、（ｄ）生育可 能なＲＮＡウィルスの産生が可能な条件下で、宿主を培養すること；および（ｅ ）宿主細胞培養液から生育可能なｌ？Ｎ＾ウィルスを回収すること、の過程から なる。例えば、ワクチン株３型ポリオウィルスを用いることができ、宿主として は一部サル腎臓細胞を用いることができる。

本発明はさらに、生育可能なＲＮＡウィルスを産生ずる方法を与えるものであり 、（ａ）ＲＮ＾ウィルスｃＤＮ＾で宿主をトランスフェクションすることであっ て、ここでｃＤＮＡはプラスミドｐＬＥＤ３またはｐＬＥＤ３．２、あるいはｐ ＬＥＤ３またはｐＬＥＤ３．２によって発現されるポリペプチドの発現をコード するｃＤＮＡから選択されるものであり、ここで該宿主は動物細胞であ乞もの、 （ｂ）該宿主細胞培養液からの生育可能なＲＮＡウィルスの産生が可能な条件下 で、該宿主を培養すること、の過程を含む。

本発明はさらにＪＮ＾ウィルスを与えるものであり、該１１１Ｎ＾ウイルスはウ ィルスをコードする組み換え核酸配列で適当な宿主細胞を形質転換すること；ウ ィルス産生が可能な条件下で宿主細胞を培養すること：およびこのように産生さ れたウィルスを単離すること、によって産生される。

本発明の態様の一つでは、ＲＮＡウィルスはワクチン株３型ポリオウィルスであ り、組み換え核酸配列はワクチン株３型ポリオウィルスをコードする感染性の組 み換え全長核酸配列である。

３型ポリオウィルス株の変異株をスクリーニングする方法も与えられ、（ａ）ポ リオウィルスからゲノムＲＮ＾を単離すること＋（ｂ）ＲＮＡシークエンス法を 用いて２４９３位のヌクレオチドを決定すること、の過程を含む。

本発明はまたＪＮ＾ウィルスｃＤＮ＾にコードされる３型ポリオウィルス株の弱 毒性を増すための方法も与えるものであり、ここでｃＤＮＡは２４９２から２４ ９４位のヌクレオチド配列へゴを含み、該方法はヌクレオチド２４９３位のｃＤ ＮＡをミュータジエナイズしてＴからＣに置換する過程を含む。本発明の態様の 一つでは、該方法はさらに、ｃＤＮＡのヌクレオチド２４９４位のＴを＾、Ｃ１ およびＧからなる群から選択されるヌクレオチドに置換するミュータノエナイズ 過程を含む。

本発明−は、ヒトなどの対象を感染性ポリオウィルスに対して免疫するのに有用 なワクチンを与えるものであり、ここでワクチンは効果的な量のＲＮＡウィルス を含み、これは、ウィルスをコードする組み換え核酸配列で適当な宿主細胞を形 質転換すること、ウィルスの産生が可能な条件下で宿主細胞を培養すること、お よび適当な担体とともに対象を免疫するのに効果的である、このように産生され たウィルスを単離すること；によって産生される。ＲＮＡウィルスはワクチン株 ３型ポリオウィルスを用いることができ、組み換え核酸配列は、ワクチン株３型 ポリオウィルスをコードする、感染性組み換え全長核酸配列を用いることができ る。

ＲＮＡウィルスをコードする組み換え核酸配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列 であり、本発明の望ましい態様では組み換え核酸配列はｃＤＮ＾ＤＮＡある。適 当なｃＤＮＡはｐＬＥＤ３．２あるいはｐＬＥＤ３と呼ばれるプラスミドで、そ れぞれワクチン株３型ポリオウィルスをコードするｃＤＮ＾ＤＮＡ列に連結した プロモーターを含む。特許目的の微生物寄託の国際認識に関するブダペスト協定 に従い、プラスミドｐＬＥＤ３は１２３０１バー゛クローンドライブ、ロックビ ル、メリーランド州、２０８５２にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クション（＾ＴＣＣ）に寄託されている。プラスミドｐＬＥＤ３は受け入れ番号 ４０７８９号として登録されている。プラスミドｐＬＥＤ３．２もブダペスト協 定に従い＾ＴＣＣに寄託されている。

適当であるが制限するものではない宿主細胞としては、大腸菌などの細菌、酵母 およびその他の菌類、昆虫細胞、および動物細胞が含まれる。

適当であるが制限するものではない動物細胞としては、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ 細胞、ＣＯＳ細胞、ｃｖ−１細胞および一部サル腎臓細胞が含まれる。

適当な担体としては、例えばグルコース、ラクトース、その他の無毒物質などの 、安定剤を含む生理食塩水などの、生理学的にバランスのとれた培地を使用する ことができる。これらのワクチンは、硫酸アルミニウムなどの適当なアジュバン トと調合することもできる。ワクチン調製法に関しては、Ｊ１ダフィ−（Ｄｕｆ ｆｙ）、ワクチン調製法、ノイエス・データ・コーポレーション（１，９８０） 、およびＧ、Ｗワール（ｌａｒｒ）、“抗原の調製と免疫の原理”、Ｊ、Ｊ、マ ル力ロニス（ｌｌａｒｃｈａｌｏｎｉｓ）およびＧ、ｆワール編集、道具として の抗体−免疫化学の応用、ｐｐ、　２１−５８、ジョン・ウィリー＆サンズ（１ ９８２）参照。

１１Ｎ＾ウイルスは、例えば保存、あるいは液体ワクチンとする連続的な処方の ために、フリーズドライなどにより、乾燥させることもできる。

本発明によりさらに与えられることは、感染性ポリオウィルスに対して、ヒトな どの対象を免疫する方法であって、ここにおいて該方法は上述のワクチンの適量 を対象に投与することを含む。ワクチンを投与する適当な方法は、本分野の普通 の技術者にはよく知られている。しかしながら、例として、該方法は筋肉内、静 脈内、皮下、気管内、鼻内投与が含まれるが、これらに制限されるものではない 。

さらに、効果的な免疫量は、対象における抗体産生を引き起こすのに必要な量で あり、これにより感染性ポリオウィルスあるいはポリオに対して対象を保護でき るようにする。

本明細書の全体にわたって、ｃＤＮ＾ＤＮＡ分子的ヌクレオチドに関する情報は ｃＤＮＡのコード鎖、すなわちＲＮＡウィルスのＲＮＡ鎖と同等の配列を持つ鎖 に存在する。３型ポリオウイルス株における特異的なヌクレオチド番号に関する 常法は、Ｇ、スタンウェイ他、“神経劇毒性ポリオウィルスＰ３／レオン／３７ と弱毒性サビンワクチン由来株Ｐ３／レオン１２ａｌｂ”、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪＩ、ｐｐ、１５３９−４３　（１９８４ ）のヌクレオチド番号の付は方に従う。本明細書Ｊ二おいて以下の標準的な略号 を用いている。

Ｔ−チミジン　Ｇ−グアノシン ローウラシル “元のウィルス”という語はＪＮ＾を単離してｃＤＮＡ産生のための鋳型として 用いるＲＮＡウィルスを表す。“弱毒性を増すゝという語は、通常のワクチンウ ィルス株よりも、神経劇毒性となる復帰率がより低いことを示す意味で用いられ る。

“真のＲＮ＾ウィルスｃＤＮ＾”という語は、ここでは元のウィルスと同様の表 現型を示す生育可能なＲＮＡウィルスの産生を行うことのできるｃＤＮＡを意味 する。したがって、本発明は、遺伝コードの縮重性により、元のウィルスＲＮＡ とはヌクレオチド配列は異なるが、元のウィルスＲＮＡにコードされるのと同じ アミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を含む。本発明はさ らに、元のウィルスポリペプチドと異なるアミノ酸配列をフードするが、表現型 が変化しないようなｃＤＮＡも含む。以後、これらの変化しているが表現型は同 等なアミノ酸配列を“同等なアミノ酸配列°と呼ぶ。また、本発明は元のウィル スと比較した場合に、生じたＩ？ＮＡウィルスの表現型を変えない、非コード領 域での変化を特徴とするｃＤＮＤＮＡ分子む。産生されたウィルスにおける表現 型の相違を引き起こすＲＮＡウィルスｃＤＮ＾と元のウィルス１ｉＮＡとの相違 点を以後、“実質的な相違”と言う。

本発明は、（ａ）元のＲＮＡウィルスからゲノムＲＮＡを単離すること、（ｂ） ＲＮ八へ−クエンス法を用いて単離したゲノムＲＮ＾のヌクレオチド配列の一部 を決定すること、（Ｃ）ｃＤＮ＾ＤＮＡ行い、単離したゲノムＲＮＡから二本鎖 ｃＤＮ＾を作成すること、（ｄ）ＤＮＡシークエンス法により、ｃＤＮＡの一部 のヌクレオチド配列を決定することであって、ここでｃＤＮＡの一部は過程（ｂ ）で配列決定を行ったＲＮＡ部分に対応するもの、（ｅ）塩基配列決定を行った ｃＤＮＡを塩基配列決定を行ったＲＮＡと比較して、ヌクレオチド配列の実質的 な相違を決定すること、および、（ｆ）ｃＤＩＪＡにおける実質的な相違を改変 してＲＮ＾ウィルスｃＤＮ＾を作成すること、の過程からなるＲＮＡウィルスｃ ＤＮ＾を作成する方法を与える。本発明の態様の一つでは、Ｉ？ＮＡウィルスは 真のＲＮＡウィルスであり、別の態様ではＲＮＡウィルスは“表現型が同等の” ウィルスである。本発明の態様の一つでは、元のＲＮＡウィルスは、例えばワク チン株３型ポリオウィルスなどのピコルナウィルスである。

本発明はまた、過程（ｂ）で塩基配列決定を行うＲＮＡ部分がワクチン株３型ポ リオウィルスのヌクレオチド２４９３を含むか、望ましくはＲＮＡが約１００か ら２００ヌクレオチドからなるものである、上述の方法を与える。

本発明の別の態様では、単離されたウィルスＲＮ＾の全長のヌクレオチド配列を 過程（ｂ）で決定されるものである、上述の方法を与えるものである。

本発明の方法は、例えば、ｌ型マホニーポリオウィルスのｖＰｌのアミノ末端を コードする領域に導入された変異を正すために、ポリオウィルスゲノムの多様な 領域のヌクレオチドを変化させることにより、ＲＮＡウィルスｃＤＮ＾を産生ず るのに使用することもできる（Ｋカーヶガルド（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＞、“ポ リオウィルスのＶＰｌにおける変異は、粒子化とウィルスＲＮＡ放出の双方に影 響を与える”、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　６４．　ｐｐ、　１９５−２０６（ １９９０））。

本発明はさらに、上述の方法のいずれかにより産生されたＲＮ＾ウィルスｃＤＮ ＾を与えるものであり、これはワクチン株３型ポリオウィルス由来ＲＮ＾ウィル スｃＤＮＡＳｐＬＥＤ３またはｐＬＥＤ３．２からなる群から選択されたｃＤＮ Ａ、およびｐＬＥＤ３またはｐＬＥＤ３．２に発現されるポリペプチドの発現を コードするｃＤＮＡを含む可能性もあるがこれに制限されるものではない。

本発明はまた、上述のＲＮ＾ウィルスｃＤＮ＾からなる組み換えＤＮＡ分子を与 えるものであり、これはＴ７プロモーターなどのＲＮＡ転写プロモーターにＲＮ ＡウィルスｃＤＮ＾を機能するように連結した組み換えＤＮＡ分子を含むことも できるが、これに制限されるものではない。

上述の組み換えＤＮＡ分子で形質転換し宿主も与えられ、ここで宿主は、細菌、 酵母およびその他のｍａ、昆虫細胞、および動物細胞からなる群がら選択された ものである。本発明の望ましい態様では、宿主は動物細胞であり、Ｖｅｒｏ細胞 、ＩＩｅＬａ細胞、ｃｏｓ　’細胞、ＣＶ−１細胞、および−次サル腎臓細胞か らなる群から選択される。本発明の別の態様では、宿主は大腸菌である。

本発明はさらに、生育可能なＲＮＡウィルスの産生を可能にする条件下で上述の 宿主を培養すること、および宿主細胞培養液から生育可能なＲＮＡウィルスを回 収することからなる、生育可能なＲＮＡウィルスを産生ずる方法も与える。本発 明はまた、１ｎｖｔｔｒｏ転写によって上述の組み換えｔｌＮ＾分子からＲＮＡ を作成すること、ＲＮＡを単離すること、単離したＲＮＡで動物細胞である宿主 をトランスフェクトすること、生育可能なＲＮＡウィルスの産生を可能にするよ うな条件下で宿主を培養すること、および生育可能なＲＮＡウィルスを宿生細胞 培養液から回収すること、の過程からなる生育可能なＲＮＡウィルスを産生ずる 方法も与える。本発明の望ましい態様ではＪＮ＾ウィルスはワクチン株３型ポリ オウィルスであり、宿主は一部サル腎臓細胞である。

本発明は、３型ポリオウイルス株の変異体のスクリーニング法を与えるものであ り、ポリオウィルスからゲノムＲＮ＾を単離すること、およびＲＮＡシークエン ス法によって２４９３位のヌクレオチドを決定する過程を含む。

本発明はまたＪＮ＾ウィルスｃＤＮＡによってコードされる３型ポリオウイルス 株の弱毒性を増す方法も与えるものであり、ここにおいてｃＤＮＡは２４９２か ら２４９４位にＡＴＴというヌクレオチド配列を含み、該方法はヌクレオチド２ ４９３位のｃＤＮＡをミュータジェネシスによりＴからＣへ置換する過程を含む 。本方法はさらに、ヌクレオチド２４９４位をＴから、＾、Ｃ，Ｃからなる群か ら選択されたヌクレオチドに置換する過程を含む。

表現型の相違の決定は、本分野では既知の幾つかの方法によって行われる。弱毒 性３型ポリオウイルス株の真のＲＮＡウィルスｃＤＮＡは元のウィルスと同程度 の弱毒性を持つウィルスをコードしていることが望ましい。幾つかのよく解析さ れているマーカーを用いて、ポリオウィルス株の表現型の変化を決定することが 可能である。これらは酸性条件下のウィルス増殖能を制御する“ｄ”マーカーＣ Ｍ、フォークト（Ｖｏｇｔ）他、“酸性培地でのブレーティング効率が減少し、 神経毒性が減少しているポリオウィルス変異株”、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　４．　 ｐｐ、　１４１−５５（１９５７））　；および高温でのウィルス増殖能を制御 する“ｒｃｔａ。“マーカーである（Ａ、ルウオフ（Ｌｗｏｆｆ）、“生物中お よび細胞レベルでウィルス病の進化に影響をあたえる因子”、　Ｂａｃｔ、　Ｒ ｅｖ、　、　２３．　ｐ９．１０９−２４（１９５９））。

元の弱毒性株３型ポリオウィルスとその真のＲＮＡウィルスｃＤＮＡから産生き れたウィルスとの表現型の相違を決定するための最も望ましい方法は、神経毒性 の比較である。神経毒性を評価する幾つかの方法は本分野で既知である（連邦条 例規約、２１章１項、ｐｐ、　９ｌ−９３（１９８７年４月１日版））。

真のＲＮＡウィルスｃＤＮＡの産生 ある態様においては、本発明は真のＲＮＡウィルスｃＤＮＡの産生法に関するも のである。本発明による真のＲＮ＾ウィルスｃＤＮＡの産生には、プラス鎖一本 鎖、マイナス鎖一本鐘、あるいは二本鎖の、いかなるＲＮＡウィルスも使用可能 である。プラス鏑一本鎖ウイルスを元のウィルスとすることが望ましい。ウィル スがピコルナウィルス科に属するヒトエンチルウィルスであることがより望まし い。最も望ましいのは、弱毒性３型ワクチン株ポリオウィルス（“Ｐ３／サビン °とも呼ぶ）である。

＾、ウィルスの増殖と単離 真のＲＮ＾ウィルスｃＤＮＡ産生の最初の過程は、元のウィルスの増殖および精 製とそのＲＮＡの単離である。ウィルスの増殖および単離法は本分野でよく知ら れている（Ｒ。

Ｊ、クフラー（Ｋｕｃｈｌｅｒ）、“細胞培養とウィルス学における生化学的手 法”、ドーデン・ハッチンソン・アンド・ロス社、ストラスバーブ、Ｐ＾（１９ ７７））。宿主細胞の選択、培地の選択、および培養条件を含むウィルスの増殖 法はそれぞれの元のウィルスによつて真なることは理解されるであろう。望まし い態様では、既知の方法により、−次サル腎臓細胞を用いて弱毒性株３型ポリオ ウィルスを培養する（Ａ、サビン他、“ポリオウィルスの変異株の研究”、Ｊ、 　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、　９９．　ｐｌ）、　５５１−７６（１９５４））。

以下の方法はポリオウィルスのいかなる株にも適用可能である。しかしながら、 これらの方法で異なるＲＮＡウィルスを用いるためには、本分野の技術者には既 知の、ウィルス特異的な改変を行うことが必要である。

ＲＮＡウィルスの増殖はＪＮ＾単離のために十分量のウィルスが回収される時点 まで進行させることができる。元のウィルスを含む培地を集め、望ましくはウィ ルスをベレット状にしないような早さで遠心することにより細胞性残渣を除く。

これは典型的には約２５００ｒｐｍで２０分間である。上清を次に、ウィルス粒 子よりも大きなサイズの孔を持つフィルターを用いて限外濾過によってさらに精 製する。約０．２２μ麗のフィルターを用いることが望ましい。

濾過の後に、ウィルス粒子をポリエチレングリコール沈澱によって集め、その後 に遠心によって、より望ましくは約７０．０００ｒｐｍの高速遠心によって集め る。続いてウィルス粒子を少量の緩衝液、望ましくはＴＮＥ（１０ｍｌｉ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣｌ、　１１００ＩＩＩ　ＮａＣ１，ｌｄ　ＥＤＴ＾、　ｐ［１７，４ ）に呼局する。任意に非イオン性界面活性剤をウィルス粒子懸濁液に加え、混入 物を溶解することもできる。高速ウィルスベレットはウィルスＲＮ＾の材料とし て用いるのに十分精製されているが、任意にウィルス懸濁液を蔗糖密度勾配遠心 によってさらに精製してもよい。

密度勾配遠心を行う場合には、画分を勾配から集め、元のウィルスの存在を解析 する。元のウィルス特異的なタンパク質を検出する通常のアッセイを行うことが できる。このようなアッセイとしては、例えば、ウェスタンプロット、ＥＬＩＳ Ａ、ラジオイムノアッセイ、あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動および元 のウィルスを基準としての比較などが含まれる。最後の技術が最も経済的である ため、最も望ましい。

Ｂ、ウィルスＲＮＡの単離と塩基配列決定上述のようにウィルスを精製したら、 ウィルスＲＮＡを単離する。これは、まずウィルス外殻タンパク質を界面活性剤 処理、望ましくは最終濃度０５％のドデシル硫酸ナトリウム（“ＳＤＳ”）によ って分離する。分離したタンパク質を次に、有機溶媒で試料を処理することによ って抽出する。抽出は、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール混合液で 行うことが望ましい。水層に存在するＲＮＡを次に本分野で既知の方法によって 単離する（Ｔ、マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、“クローニングのための分 子的ガイド“、コールド・スプリング・ハーバ町ブレス（１９８３））。望まし くは、ウィルスＲＮ＾を０．５倍量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムと２．５倍量の エタノールで一２０℃で沈殿させる。ウィルスＲＮ＾の定量と純度は、アガロー スゲル電気泳動によって決定してよい。分子生物学分野でよく知られているよう に、Ｉ？Ｎアーゼが強力なため、ＲＮＡ試料の調製と扱いには十分な注意が必要 なことに注意すること。ＲＮＡ調製で用いる試薬中および容器に存在するＲＮア ーゼを不活化する方法はよく知られている（Ｔマニアナイス、上述）。

元のウィルスＲＮ＾を単離したら、ＲＮＡ用に改変した（Ｄ、　Ｃ，デボルデ（ Ｄｅｂｏｒｄｅ）他、“末端デオキシヌクレオチド転移酵素による、通常のＲＮ Ａシークエンス法における不明瞭さの解決法”、＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　、　１５７．　ｐｐ、　２７５−８２（１９８６））ジデオキシヌクレオチド 塩基配列決定法を行う（Ｆサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）他、“チェーンターミネー ション阻害剤を用いたＤＮＡンークエンス法”、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４：５４６３−６７（１９７７））。

本発明の望ましい態様では、ウィルスのＲＮＡゲノム全長をシーフェンス決定し 、後述する方法によってｃＤＮＡ配列と比較する。本発明のこの態様においては 、元のウィルスは弱毒性ワクチン株３型ポリオウィルスであることが最も望まし い。

Ｃ，ＲＮＡウィルスｃＤＮ＾ライブラリの合成とスクリーニングＲＮＡの塩基配 列決定に続いて、元のウィルスＲＮ＾を鋳型として用いて、全長の二本鎖ｃＤＮ Ａの合成を行う。既知の方法あるいは市販のｃＤＮ＾ＤＮＡットを用いてｃＤＮ Ａを合成する。望ましくは、ｖ、Ｒ，ラカニエロ（Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ）他、 “ポリオウィルスｃＤＮ＾の分子的クローニングと、ウィルスゲノムの完全なヌ クレオチド配列決定”Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ’　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 、７ｇ、ｐｐ、　４８８７−９１（１９８１）の方法によッｒｃＤＮＡを合成ス ル。検出ヲ簡単にするため、ｃＤＮＡの第一の鎖は任意に、ｃＤＮ＾ＤＮＡ際に 放射性ヌクレオチドを用いて放射性標識することも可能である。合成したら、一 本鎖ｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動あるいは、より望ましくはゲルクロマト グラフィーでサイズ分画することが望ましい。比較的長いｃＤＮＡを単離し、第 二の鎖の合成のための鋳型として用いる。二本鎖ｃＤＮＡを次に上述のようにサ イズ分画し、最も長い分子を元のウィルスｃＤＮＡライブラリの調製に用いる。

続いてオリゴｄＧ／ｄＣ法または制限酵素リンカ−の付加のいずれかによってｃ ＤＮＡにテイルを付け、適当なベクターにクローニングする。

ベクターは、ライブラリのスクリーニングに用いる技術に基づいて選択する。例 えば、免疫スクリーニングを行う場合には、λｇｔ１１．（ＡＴＣＣ受託番号３ ７１９４）などの発現ベクターにｃＤＮＡを挿入することが必要である。ハイブ リダイゼーションによるスクリーニング法を用いる場合には、細菌用プラスミド などのベクターが最も便利である。望ましくは、ｃＤＮＡはオリゴｄＧ／ｄＣ法 によってテーリングし、ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位にクローニングする。

ＲＮＡウィルスｃＤＮ＾ライブラリを調製したら、全長のｃＤＮ＾ＤＮＡンをス クリーニングする。これは、抗体スクリーニングまたは標識したプローブとのハ イブリダイゼーションなどの、既知のスクリーニング法によって行われる。より 望ましくは、ウィルスの既知のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を基にした 、ウィルス特異的なｃＤＮＤＮＡ−ブを用いてコロニーハイブリダイゼーシジン によってライブラリのスクリーニングを行う（Ｍグルンンユタイン（Ｇｒｕｎｓ ｔｅｉｎ）他、“コロニーハイブリダイゼーション特異的な遺伝子を含むクロー ニングされたＤＮＡの単離法”、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７２、ｐｐ、　３９６１−６５（１ ９７５））、ＲＮＡウィルスｃＤＮ＾を含むクローンが同定され単離されたら、 それをベクターから取り出して、全長のＲＮ＾ウィルスｃＤＮ＾であるかどうか を解析する。本発明の望ましい態様では、ｄＣテイルを付加したｃＤＮＡを、Ｐ ｓｔＩで消化することにより、ＰｓｔＩで切断してｄＧテイルを付加したベクタ ーから取り出す。部分的なｃＤＮＡはライブラリを再度スクリーニング、シ、よ り長い、あるいは全長のｃＤＮＡの同定に用いることができる。全長のｃＤＮＡ が検出されない場合には、元のウィルスゲル全体を含むような、複数の重なり合 う部分的ｃＤＮ＾を一般的な制限酵素部位で連結して全長のｃＤＮＡを作成する （ｖ、Ｒラカニエロ他、“クローニングしたポリオウィルスｃＤＮ＾は補乳類細 胞に感染性である“、５ｃｉｅｎｃｅ、　２１４．　ｐｐ、　９１６−１９（１ ９８１））。単離されたｃＤＮＡに含まれていないウィルスゲノム部分は、標準 的なオリゴヌクレオチド合成技術によって合成し、その適当な位置に連結して、 全長ｃＤＮ＾を作成する。

Ｄ、　ｃＤＮＡのシーフェンス決定と元のウィルスＲＮＡに対応するようにする ための変換つぎに、元のウィルスＩ？Ｎ＾のノーフェンス決定された部分に対応 する全長ｃＤＮＤＮＡを通常のＤＮＡンークエンス法によって塩基配列決定を行 う。ウィルスＲＮ＾およびＲＮ＾ウィルスｃＤＮ＾のシーフェンスされた領域を 比較する。理論的には、ｃＤＮＡはその鋳型として用いたＲＮＡと正確に対応し ているはずである。しかしながら、逆転写酵素は、ｃＤＮＡをＲＮＡから転写す るときに誤りを起こす可能性があることが知られている（ＬＭバーｖ（Ｖｅｒｍ ａ）、−逆転写酵素”、Ｔｈｅ　ＥｎｚｙｍｅｓＳＶｏｌ、　１４．　Ｐ、　Ｄ 、ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）編集、アカデミツクプレス、ニューヨーク、ｐｐ、　 ８７−１０４（１９８１））。したがって、本発明の方法によって、ｃＤＮＡの ヌクレオチド配列が、シーフェンスされたＲＮＡに対応するように修正すること が必要である。

本発明は、表現型の相違に寄与する部位におけるｃＤＮＡ配列を変えることを意 図する。したがって、元のウィルスＲＮＡにコードされているのと同一のアミノ 酸配列を持つポリペプチドをコードするｃＤＮＡ部分は変える必要はない。望ま しくは、ウィルス産生またはウィルスポリペプチド合成に影響を与える可能性の あるｃＤＮＡヌクレオチド変異は、元のウィルスＲＮＡに対応するように改変す るべきである。　′ｃＤＮ＾分子のヌクレオチド配列を改変する方法は、本分野 ではよく知られており、部位特異的ミュータジェネシスを含む（Ｃ，Ａ、ハッチ ンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）、ＩＩＩ他、“ＤＮＡ配列の特異的部位でのミ ュータジェネンス”　、Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｗ、　、　２５３．　ｐｐ、　 ６５５１−６０（１９７ｇ）；Ａ、ラジン（Ｒａｚｉｎ）他、“化学合成したＤ ＮＡの使用による、変異の効果的な修正”、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７５．１）、　４２６ｇ（１９７ｇ））。あるいは、望 みの配列を含む部分的ｃＤＮ＾ＤＮＡンをｃＤＮ＾ＤＮＡラリから単離し、その Ｄｌｌ＾、あるいはその一部を、全長クローンの中の改変させるべき配列と置換 する。ｃＤＮＡ配列を改変したら、本発明の他の態様に使用する。

本発明の別の態様では、真のＲＮ＾ウィルスｃＤＮＡを適当なベクターに挿入し 、適当な宿主を形質転換するのに使用する。ベクターの選択は、ｃＤＮＡの最終 的な使用法に依存する。同様に、宿主の選択も、選択されたベクターおよび形質 転換の最終的な目的の双方に依存する。

例えば、単にｃＤＮＡを保存し、それを産生して無制限に供給することを目的と するならば、細菌、酵母または他の菌類などの単細胞生物、動物細胞、あるいは 昆虫細胞に形質転換可能なベクターにｃＤＮＡを挿入する。本発明の態様のひと つでは、ｃＤＮＡをｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に挿入し、形質転換される宿主 を大腸菌にする。

本発明の別の態様では、真のＲＮ＾ウィルスＣＤＮ＾が機能するように転写ブロ モータ−に連結する。ここで用いる、“機能するように連結する”という語は、 プロモーターが真のウィルスｃＤＮＡからの転写を誘導するように位置付けるこ とを意味する。

このようなプロモーターの例としては、ＳＦ３．７４、Ｔ７がある。最も望まし いプロモーターはＴ７プロモーターである（Ｊ、　Ｊ、デュン（Ｄｕｎｎ）他、 ”バタテリオファージＴ７　ＤＮＡの完全ヌクレオチド配列とＴ７遺伝的要素の 位置”　、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　１６６、１）ｌ）、　４７７−５ ３５（１９８３））。プロモーターと、ＤＮＡ挿入断片をそのプロモーターが機 能するように連結するようなりローニング部位の双方を含むベクターは、本分野 でよく知られている。

望ましくは、このベクターはｉｎ　ｖｉｔｒｏでＲＮＡを転写できるものがよい 。このようなベクターの例としては、ｐＧＥＭシリーズ（プロメガ・バイオチク 社、マジソン、ＷＩ）。

さらなる態様では、本発明は生育可能なプラス鎖ＲＮ＾ウィルスを産生ずること に関するものである。これは、適当な宿主を真のＲＮ＾ウィルスｃＤＮ＾でトラ ンスフェクトすることによって行われる。動物細胞をＤＮＡでトランスフェクト する標準的な方法を用いる（Ｆ、　Ｍ、アウスベル（＾ｕｓｕｂｅｌ）他、“分 子生物学の現在の手法”、グリーン出版協会覆ワイリー・インターサイエンス社 （１９８７））。続いてＪＮＡウィルスの産生が可能な条件下で宿主を培養する 。このような条件は本分野ではよく知られており、産生ずるウィルスによって異 なる。同様に、宿主細胞はウィルスと適合性のものを選択するべきであり、培養 液中の霊長類細胞が望ましい。本発明の望ましい態様では、真のＲＮ＾ウィルス ｃＤＮ＾が弱毒性株３型ポリオウィルスをコードしており、宿主はＶｅｒＯ細抱 、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ−１細胞、ｌｌｌ−３８およびＭｌ？Ｃ５な どのヒト２倍体細胞系、および−次サル腎臓細胞からなる群から選択される。最 も望ましい宿主はサル腎臓縄胞である。細胞が望ましいレベルのウィルスを産生 したら、通常の方法により細胞培養液からウィルスを回収する。

本発明の別の嬰様では、本発明によって真のＲＮ＾ウィルスｃＤＮ八かへｉｎ　 ｖｉｔｒｏで転写されて産生されたウィルスＲＮＡを、生育可能なＲＮＡウィル スを産生ずる方法に用いる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏて転写されたＲＮＡを標準的な方 法で単離し、適当な宿主をトランスフェクトするのに用いる。ＲＮＡを細胞のト ランスフェクンヨンに使用する方法は、本分野ではよく知られている（Ｓヴアン デル・ワーフ他、“精ｔＲＴ７　ＲＮＡポリメラーゼによる感染性ポリオウィル スＲＮＡの合成”、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、 ８３、ｐｐ、　２３３０−３４（１９８６乃。細胞をトランスフェクトしたら、 それを培養して通常の方法によりウィルスを回収する。

他の態様では、本発明は、３型ポリオウイルス株の変異体のスクリーニング法に 関するものである。ＲＮＡンークエンス法により、このウィルスのヌクレオチド ２４９３位のＣの存在が弱毒性株３型の遺伝子型とリンクしていることが見いだ された。２つの因子の組み合わせにより、以前の解析ではこの部位が弱毒性に重 要であるという認識がなされなかった。野生型と弱毒性３型ポリオウイルス株の 配列をゲノムＲＮＡレベルではなく　、ｃＤＮＤＮＡルで比較したこと：および 、これらのｃｌ）Ｎ＾のいくつかは元のウィルス試料のプラーク単離物から調製 された（スタンウェイ（Ｓｔａｎｖａｙ）他、神経毒性ポリオウィルスＰ３／レ オン／３７およびその弱毒化サビンワクチン誘導体Ｐ３／レオン１２ａｌｂのゲ ノムの完全ヌクレオチド配列の比較”Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ。

ＵＳＡ、８Ｌｐｐ、　１５３９−４３（１９８４）；１１．　ｌ−ヨダ他、“３ 種すべての血清型ゲノムのポリオウィルスの完全ヌクレオチド配列“、Ｊ、　Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　１７４．　ｌｌｌ）、　５６１−８５（１９８４）） 。

逆転写酵素の誤り、あるいはウィルス継代Ｉこよる変異のいずれかの結果として 、以前に産生じたｃＤＮＡは２４９３位にＴを含んでいた。したがって、ポリオ ウィルスの３型ワクチン株のＲＮＡは、野生型株に存在するのと同じく、この位 置にＵを含むとあやまって信じられて来た（スタンウェイ他、上述二Ｈ，トヨダ 他、上述）。したがって、２４９３位はポリオウィルス３型株ゲノムの弱毒性に 寄与しているとは考えられていなかった。

したがって、本発明の３型ポリオウイルス株の変異体をスクリーニングする方法 は、ウィルスのＲＮＡのシーフェンス決定および２４９３位のヌクレオチドの決 定の過程を含む。最も望ましいのは、シーフェンス決定されるＲＮＡ部分がヌク レオチド２４９３の周辺の１．００−２００ヌクレオチドからなることである。

この方法は、元のウィルスの増幅中（例えば、ワクチン産生中）に、ウィルスゲ ノムの２４９３位のＣの維持の確認に用いられる。

本発明はまた、真のＲＮ＾ウィルスｃＤＮＡから産生される３型ポリオウイルス 株の弱毒性を増す方法に関する物であって、ここでｃＤＮＡは２４９２−２４９ ４位に配列へ宵を含む。

この方法は、２４９３位のヌクレオチドをＴからＣヘミュータノエナイズし、そ のミュータジエナイズしたｃＤＮＡを用いて生育可能なウィルスを産生ずること を含む。３型ポリオウイルス株の２４９３位がＵの代わりにＣが存在することに より、ウィルス外殻タンパク質、ＶＰｌの６番目のアミノ酸が、遺伝コードより 、イソロイノンからスレオニンに変化することが期待される。このアミノ酸をコ ードするコドンは、ヌクレオチド２４９２−２４９４である。したがって、本発 明により３型ポリオウイルス株の弱毒性を増す方法は、ヌクレオチド２４９４を Ｔから、Ａ、　Ｃ，Ｇのいずれかにミュータンエナイズすることを含む。

ここで述べる発明をより完全に理解するため、以下の実施例を示す。これらの実 施例の目的は例示することのみであり、本発明をいかなる形にも制限するもので はないことは、理解されるべきである。

実施例１３型ポリオウィルス株の精製 以下で述べる方法で用いるすべてのガラス製品は、滅菌するか、あるいはジエチ 　゛ルビ口カーボ不一ト（ＤＥＰ）で処理してＩ？Ｎアーゼを破壊した。すべて の試薬は使用前にＤＥＰ処理した水で作成した。

一部サル腎臓細胞を、“ＯＲＩＭＵＮＥ“ワクチン（レデルレ・ラボラトリーズ 、バールリバー、ＮＹ）からプラーク精製によって単離した弱毒性３型ポリオウ イルス株に、低感染多重度（”ＭＯＩ”）で感染させる。感染させた培養液を改 変したアーμ（Ｅａｒｌｅ）乳層維持培地、ｐＨ７，３内で、細胞単層が破壊さ れるまで３４℃に維持した（＋４細胞変性効果（“ＣＰＥ”）。培養液（１２０ ＋ａｌ）を集め、２５０Ｏｒｐｍで２０分間遠心し、細胞性残置を除く。上清を ０．２２ＡＭマイレクスＧ■ディスクフィルターで濾過する。濾過した液を次に 、クイックノール高速遠心チューブに移し、７０．　ＩＴｉローターで７０．０ ０Ｑｒｐｍで１時間、４℃で遠心する。

ウィルスベレットを４ｍＭのＲＮアーゼ−フリーＴＮＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩＳｌｏｏｍＭ　ＮａＣ１，１１ＩＩＭＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）に懸濁し、 １５ｍ１のポリプロピレンチューブに移す。ウィルス外殻を、最終濃度０５％の ＲＮアーゼ−フリーＳＤＳの添加により分離する。

実施例２ウイルスＲＮ＾の虫離とンークエンス決定続いて、実施例で調製した溶 解した外殻を、等量のフェノール・クロロホルム・インアミルアルコール（２５ ：２４：１）で抽出することにより、ウィルスＲＮ＾を単離する。水層を取り、 同じ有機溶媒で再抽出する。半分量の７．５１１酢酸アンモニウムと２．５倍量 の１００％エタノールを水層抽出液に加え、−２０℃で最低３０分分間−てＲＮ Ａを沈澱させる。つぎに、ＲＮＡを１２．０００ｒｐ閣で３０分間遠心すること によって、ベレットにする。ＲＮＡベレットを水冷７０％エタノールで２回洗浄 し、真空下で乾燥させ、２００Ｍの水に再懸濁する。ＲＮＡの純度および濃度は 、アガロースゲル電気泳動によって調べる。

つぎに、ウィルスＲＮ＾を実質的にデボルデ（ＤｅＢｏｒｄｅ）の方法（Ｄ、　 Ｃ，デボルデ他、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１５７．　ｐｐ、　２７ ５−８２（１９８６））によってシーフェンス決定を行い、この開示をここに参 考として含める。ンークエンスの詳細は以下に示す。

約５００ｍｇの精製ウィルスＲＮＡを、２００＋ａｌｌ　Ｔｒｉｓ−ロＣ１、Ｉ ）Ｂ８．３．２００ＱＩＭ　ＫＣＩ、２０ｍ１ｌ　ＭｇＣｌQ．１ ０ｍＭ　ＤＴＴ中で１００℃で３分間、熱変性させ、アイスバスに移すことによ って急冷する。

デポルデ他が述べているように、プライマー、ｄＡＴＰおよび酵素をＲＮＡに混 合する。２゜５μｍのプライマー−ＲＮＡ混合液を等量の多様な反応混合液と、 別々のチューブに混合し、以下の濃度となるようにした： チューブＡ：５０ｍ１ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ［１ｇ、　３．５０ｍＭ　ＫＣ Ｉ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ４．１ｈｉｌ　ＤＴＴ、各１０ｈＭ　рbＴＰ、ｄ ＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、５ｇＣ１［３５Ｓ］−ｄＡＴＰ、１．２５μＭ　ｄｄ ＡＴＰ、１１００ｎ　ＲＮＡ、１５ｎｇプライマー、および２．８ユニット逆転 写酵素： チューブＣ：２０！Ｍ　ｄＣＴＰ、２．５ｇＭ　ｄｄＣＴＰを含み、ｄｄＡＴＰ を含まない以外はチューブＡと同じ： チューブＧ：２０ｕｌｌ　ｄＧＴＰ、３．　ＣｈｒＭ　ｄｄＧＴＰを含み、ｄｄ ＡＴＰを含まない以外はチューブ＾と同じ： チューブＴ：２０ｘＭ　ｄＴＴＰ、７．５ｎＭ　ｄｄＴＴＰヲ含ミ、ｄｄＡＴＰ を含まない以外ハチューブ＾ト同じ。

チューブＮ：ｄｄＡＴＰを含まない以外はチューブ＾と同じ。

各チューブを４２℃で２０分間インキュベートする。このインキュベーション後 、１μｌのチェイス溶液（各ＩＩｏＩＩＩのｄＡＴＰ、　ｄｃＴＰ、　ｄＧＴＰ 、およびｄＴＴＰ、および２ユニツトのターミナルデオキシヌクレオチジルトラ ンスフェラーゼ）を各チューブに加え、チューブをさらに３７℃で３０分間イン キュベートする。反応は一２０℃で凍らせることによって停止する。電気泳動の 前に、５μｌのホルムアミド染色混合液を各チューブに加える。

試料を１００℃で３分間加熱し、各試料の５＋＋１をゲルのレーンに載せる。

シーフェンス用ゲル（３５ｃ＋＊Ｘ１３ｃｍｘＯ，１ｃ＋ａ）はＴＢＥ（ｌｌ１ ９ｍＭ　Ｔｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で７Ｉｌ尿素を含む ６％ポリアクリルアミド（３１１ｔ：２；アクリルアミド、ビスアクリルアミド ）である。

弱毒株３型ポリアクリルアミドＲＮ＾ゲノムの完全な配列を報告されているＰ３ ／サビンｃＤＮ＾配列（スタンウェイ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＩＩＳ＾、８Ｌｐｐ、　１５３９−４３（１９８４））と比較する と、２つのヌクレオチドの相違が見いだされ、その一つはアミノ酸の変化を引き 起こす。これらを以下の表に示す：２４９３　Ｔ　ＣＩｌｅからＴｈｒ （ＶＰＩ） ６０６１　ＣＵ（Ｔ）　サイレント ２４９３位に見られる相違は幾つかの理由から重要である。まず、これはウィル ス外殻タンパクＷｖ円中の顕著なアミノ酸変化をコードする。さらに、野生型３ 型ポリオウイルスはこの位置にＵをもち（ｃＤＮＡではＴ）、弱毒性株３型ポリ オウィルスｃＤＮ＾の２４９３位にあるといわれるＴは、野生型と弱毒性ゲノム の間の顕著な違いを隠して来た可能性がある。

実施例３全長ポリオウイルスｃＤＮＡの合成前の実施例で得られたウィルスＲＮ ＾を、ｌ’、　Ｒラカニエロ他、“ポリオウィルスｃＤＮ＾の分子クローニング とウィルスゲノムの完全ヌクレオチド配列の決定“、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７８、ｐｐ、　４８８７−９１（１９８１）の方 法により、二本鎖ｃＤＮ＾の合成のための鋳型として用いる。詳細には、２．５ ；＋ｇのウィルスＲＮＡを用いて、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＢＣＩ、ｐＨ８，３， １０ｍＭ　ｉ１ｇｃ１２．５０ｍ１ｌ　ＫＣＩ、各０．５ｍＭ　ｄＡＴＰ、　ｄ ＴＴＰ、　ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、０．４ｍl　ＤＴＥ、３０＋＋ ｇ７ｍｌオリゴｄＴ（１２−１８ヌクレオチド長）、４ＩＩ１Ｍビロリン酸ナト リウム、１０μＣ１／！Ｉ　Ｃσ−３２ｐコ−ｄＡＴＰ、　１ユニツト／μＩ　 ＲＮａｓｉｎ、および２ユニット／μｍ逆転写酵素（ベーリンカーマンハイム、 インディアナポリス、ＩＮ）を含む１００μｍ反応液中で第１のｃＤＮＡ鎖を合 成する。反応液を４２℃で６０分間インキュベートする。ＥＤＴＡを最終濃度５ ００Ｍで添加することにより、反応を停止させる。つぎに溶液をフェノール抽出 し、水層を５ＸＯ，７ｃｍのセフ　７０−スＣＬ−４Ｂカラムにかける。カラム は０．３Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍ１ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐｆ（８，０，１ｍ１ １　ＥＤＴＡで流す。このようにして得られたプロフィールを東１図に示す。

画分５−１３をカラムから集め、それに２０μｇのグリコーゲンに加える。続い て、２．５倍量のエタノールを加えることにより、ｃＤＮＡを一２０℃で沈殿さ せ、遠心によりベレットとし、２５ａｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｆｌｃｌ、ｐＨ ８，０，１１℃Ｍ　ＥＤＴＡ（ＴＥ）に懸濁し、第２の鎖の合成に使用する。

第２鎖の合成は、第１鎖ｃＤＮ＾、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ７，４， ７ｍＭ　ｍｇＣ１２，０，ｌｌｉ　ＫＣｌ、　５ｈｇ／ｍｌウン結成アルブミン （ＢＳ＾）、各０．１ｍＭ　ｄＮＴＰ、１５０ｇＭβ−ＮＡＤ、５ａｇ／＋１１ 大腸菌ＤＮＡリガーゼ、２５０ユニット／ｍｌ大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよ び９０ユニット／ｍｌ　ｉｌＮアーゼＨを含む１００μｍの反応液中で行う。混 合液を１５℃で９０分間インキユベートシ、その後室温で９０分間装（。つづい てｃＤＮＡをフェノール抽出し、上述のようにセファロースＣＬ−４Ｂでクロマ トグラフィーを行う。ヴオイド体積画分を保存し、エタノールで沈殿させ、上述 のように２５μｍのＴＨに再懸濁する。

１４０ｍｍ　Ｋ−カコジレート、ｐＥＩ７．２．３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＢＣＩ、 ｌｄ　ＣｏＣｌ２．１ｍＭ　ＤＴＴ、　５０μｇハ１１８３l、 １５０μＭ　ｄＣＴＰ、および８００ユニット／ｍｌターミナルデオキシヌクレ オチジルトランスフェラーゼを含む１００μｍの反応液中で、得られた二本鎖ｃ ＤＮ＾にデオキシチジン（ｄＣ）のテイルを付加する。反応液を３７℃で６０分 間インキュベートし、溶液をフェノール抽出する。水層を取り、エーテル抽出し て、テイルを付加したｃＤＮＡを２０μｇのグリコーゲンを含むエタノールで沈 殿させる。得られたペレットを、５０μｍのｌＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ ７，５，１，００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ＮＴＥ）で懸濁する。

実施例４ポリオウイルスｃＤＮ＾ライブラリの作成実施例３で作成したｄＣテイ ルを持つさまざまな量（１，２，５，１０μｍ）の二本鎖ｃＤＮ＾を１０℃ｇの ＰＳｔＩ消化、ｄＧテイル付きｐＵＣ９（ファルマシア、ビス力タウェイ、ＮＪ ）と混合し、ＮＴＥ中で水槽中で６８℃で５分間加熱し、４２℃の水槽で混合液 を冷却し、続いて水槽のスイッチを切って一晩かけて、室温までゆっくりと温度 を下げてアニーリングさせる。これにより、ｃＤＮＡ上のｄＣテイルとｐＵＣ９ 上のｄＧテイルとの間に最適なハイブリダイゼーションを行わせる。アニーリン グさせた混合液を用いて、通常の方法で大腸菌０口５α細胞（ベセスダ・リサー チ・ラブズ社、ガイタースバーグ、ＭＤ）を形質転換する。アンピンリン耐性の コロニーをスクリーニングのために選択する。

実施例５ポリオウイルスクローンの単離細菌のコロニーを網目をひいたプレート に移し、直鎖状にしたプラスミドｐＯＬＩ。

（サビン）をプローブとして、コロニーｌ＼イブリダイゼー／ヨンによってスク リーニングする（Ｊ、　ｆアマンド（Ａｌｍａｎｄ）他、“セビンポリオクイル ス３型株ワクチンの弱毒性および神経毒性への復帰“、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、　８ ５．コールドスプリングハーバ−・ラボラトリーズ、コールドスプリングハーバ ー、ＮＹ、ｐｐ、　２７１−７７（１９８５））。プラスミドｐＯＬＩＯ（サビ ン）は、Ｐ３／レオン１２ａｌｂ由来の全長ｃＤＮ＾を含むプラスミドである（ Ｇ、スタンウェイ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 、１１、ｐｐ、１５３９−４３（１９８４））。ハイブリダイゼーションによっ てスクリーニングした６００コロニーのうち、１４０がポンチイブなノ＼イブリ ダイゼーノヨンングナルを示した。これらのポジティブなりローンのそれぞれか ら少量の培養液（５ｍＭ：ＬＢ培地＋アンピ／リン）を調製し、迅速ボイリング 法によってプラスミドＤＮＡを調製する（Ｔマニアティス他、分子クローニング 研究室マニュアル、コールドスプリングハーバ−・ラボラトリ−（１９ｇ２）） 。単離したプラスミドをＰｓｔｌで切断し、これによりクローニングしたインサ ートが切り出されることが予測される。このように解析した１４０クローンのう ち、大多数は短い断片（ｌｋｂ以下）か、ＰｓｔＩ消化でインサートが切り出さ れなかった。しかしながら、我々は３つのｃＤＮ＾クローンを同定することがで き、Ｐ３／サビンゲノム上にマツプすることができた（ｐＬＬ３−５２．６９． ８２　；第２図参照）。５゛側の７４７ヌクレオチドを含む、ｐＯＬＩｏ（サビ ン）ｃＤＮＡのＥｃ。

１？Ｉ断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーションにより８０ ０コロニーのスクリーニングを行った。３３コロニーがプローブとハイブリダイ ズし、５つのｃＤＮＡがＰ２／サビンのヌクレオチド８５−７７９に対応してい た。これらのｃＤＮＡクローンの由来は不明である。

つづいて、さらにｃＤＮＡをｐＵｃ９にアニールさせ、ＤＨ５σ細胞に形質転換 する。全長ｐＯＬＩＯ（サビン）ｃＤＮＡをプローブとして用いたコロニーハイ ブリダイゼーションにより、８００個のコロニーをスクリーニングする。２９の ポジティブなコロニーを制限酵素切断によって解析する。ｃＤＮＡインサートを 含む８個のポジティブなりローンの、インサートＤＮＡのどちらかの末端からヌ クレオチド配列決定を行う。これらのうち５個（ｐＬＬ３−２３９．２５１．２ ５３．２５４．および２５５）は、Ｐ３／サビンゲノムの３′末端にマツプされ るｃＤＮＡを含んでいた（第２図）。

稟２ズに示したように（白抜きの棒）、８個の単離され、解析されたｃＤＮＡク ローンはＰ３／サビンウイルスＲＮＡゲノムのヌクレオチド３６３０から３゛末 端までに対応する。

さらに５’−ｃＤＮＡクローンを得るために、ヌクレオチド４３１７−４３３４ 由来の塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチド（第２図、ｐＬＬ３−２５３の黒 い陰の部分参照）を合成した。

このオリゴヌクレオチドを用いて、実施例３で述べたｃＤＮ人合成法により、実 施例２によって単離されたＰ３／サビンウイルスＲＮ＾からｃＤＮＡ合成を開始 させるのに使用した。

得られたｃＤＮＡにｄＣテイルを付け、ｄＧテイルを付けたｐＵＣ９にクローニ ングした。得られたプラスミドを用いてＤＨ５σ細胞を形質転換する。形質転換 体をｐＯＬＩｏ（サビン３）に対するハイブリダイゼーションでスクリーニング を行う。１１のポジティブなｃＤＮ＾クローンを単離し、制限酵素消化によって 解析し、塩基配列を決定した（第２図、黒い四角）。１１クローンはＰ３／サビ ンウイルスＲＮＡのヌクレオチド６から４３２９に対応する。

最初の５ヌクレオチドを除（すべてのＰ３／サビンゲノムに対応するｃＤＮ＾ク ローンが単離されたが、幾つかの５−ｃＤＮＡを一つのｃＤＮＡに連結する試み は、便利な制限酵素消化がないことから、困難であることがわかった。したがっ て、およそヌクレオチド１から１９００までに対応する単一のｃＤＮＡを得るた めに、最後にもう一度ｃＤＮ＾クローニングを行った。

ヌクレオチド１９０４−１９２２に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、Ｐ３ ／サビンＲＮＡのｃＤＮ＾合成のプライマーとして用いた。ｃＤＮＡにｄＣテイ ルを付け、Ｐｓｔｌで消化しｄＧテイルを付加したｐｌＪｃ９に挿入し、得られ たプラスミドを用いてＤＨ５ａ細胞を形質転換した。形質転換体を再度ｐＯＬＩ ｏ（サビン３）でスクリーニングした。えらえたｃＤＮ＾クローンのうち一つが ウィルスＲＮ＾のヌクレオチド９−１９００を含んでいることが示された（第２ 図、ｐＬＬ３−３０７）。これにより、Ｐ３／サビンゲノムのｃＤＮＡクローニ ングを完了しＰ３／サビンｃＤＮ＾を一つの全長ｃＤＮ＾にまとめるためのスト ラテジーを東３図に示す。

まず、クローンｐＬＬ３−２５３とｐＬＬ３−２７１を、ヌクレオチド４２４１ の一般的なＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて一つのクローンにまとめる。ゲノムのヌ クレオチド１５００から３′ポ１バＡ）までに対応する、得られたｃＤＮ＾クロ ーンをｐＬＬ−Ｉと呼ぶ。

つぎに、ｃＤＮＡ　ｐＬＬ３−２７７に欠けている、Ｐ３／サビンウイルスゲノ ムの最初の５ヌクレオチドを合成する。これは、自動オリゴヌクレオチド合成機 を用いて２つの相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、それを互いにアニールさ せることによって行う。得られた二本鎖オリゴヌクレオチドは５゛から３゛へ、 ＰｓｔＩ部位、Ｐ３／サビンｃＤＮＡのヌクレオチド１から３４、およびＢｇｅ ｌの粘着末端を含み、ｐＬＬ−２７７の５°側のＰｓｔＩ／ＢｇｌＩ断片を置換 するのに用いた。これにより、ヌクレオチド１−１０８５に対応するｃＤＮ＾Ｄ ＮＡンが得られた。このクローンをｐＬＬ３−ＩＩと呼ぶ。

最後の過程は、ヌクレオチド１−７４７．７４７−１８９５、および１８９５か ら３°末端に対応する３つの５ａｃＩ断片を連結して、全長のＰ３／サビンｃＤ ＮＡ（ｐＬＬ３−ＦＬと呼ぶ）を作成することである。この構築は、ｐＬＬ３− ＩＩ、ｐＬＬ３−３０７、およびｐＬＬ３−Ｉ由来の適当なｃＤＮＡインサート を用いて、幾つかの独立な過程により行う。

実施例７Ｐ３／サビンｃＤＮＡのシーフェンス解析全長のｃＤＮＡを構築するの に用いたＰ３／サビンｃＤＮＡのシーフェンス解析には、３つの手法を用いた。

最初の手法では、ｃＤＮＡを１１１３ベクターにサブクローニングする。エクソ ヌクレーゼＩＩＩとマングビーンヌクレアーゼを用いて、サブクローニングした ｃＤＮＡの重なり合った欠失を作成し、そのヌクレオチド配列を決定した（Ｅ、 オズケニャック（Ｏｚｋａｙｎａｋ）他、“塩基配列決定用のクローンを生成す るための一方向欠失法”、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　５．　ｐｐ、　７７ ０−７３（１９８７））。

第２の手法では、ｃＤＮＡを単離し、ＲｓａＩで消化する。得られた断片をシー フェンス解析用に、旧３に“ショットガン“クローニングする。最後の手法は、 クローンから単離し、シーフェンス用にＭ１３にサブクローニングしたｃＤＮＡ 断片を用いる。

Ｐ３／サビンｃＤＮ＾クローンの完全なヌクレオチド配列決定の際に、ｃＤＮＡ 配列をＲＮｋ配列と比較すると３つの相違点が見いだされる。これらの相違点を 以下の表に示す１９８６　＾　５゛非翻訳領域 ４４６６　Ｔ　ＣＨｉｓからＴｙｒ（２Ｃ）６３３４　７　Ｃサイレント ｃＤＮＡ中の１９８位のヌクレオチドの間違いは、ゲノムの５゛非翻訳領域に位 置する。

この領域の機能は未知である。４４６６位にＣではな（Ｔが存在することにより 、２Ｃタンパク質の残基１１８がヒスチジンからチロノンへ変化する。２Ｃタン パク質の機能はまだ定義されていないが、予測されるアミノ酸変化は顕著なもの である。ポリメラーゼ遺伝子中の６３３４位においてヌクレオチドが変化してい るが、アミノ酸変化という意味ではこれはサイレントである。

ポリオウィルスＲＮ＾配列に正確に対応した全長ｃＤＮＡクローンを得るために 、第４図パネル＾およびＢに示した方法を用いた。詳細には、Ｐ３／サビンｃＤ Ｎ＾インサートｐＬＬ３−丁１をバタテリオファーンＭ１３のＰｓｔＩ部位にサ ブクローニングし、以下に述べるようにヌクレオチド１９８をＧから＾に変える ためのオリゴヌクレオチドによるミュータジェネンスをおこなった。１９８位に 人を含むようなヌクレオチド１９０−２０６にわたるオリゴヌクレオチドをこの 目的のために合成する。オリゴヌクレオチドは、以下の配列をもツ：３’−ＧＧ ＣＧＴＡＴＣＴＧＡＣＡＡＧＧＧ−５’。

ミュータジエネシスはゴ７−ＧＥＮｉｎ　ｖｉｔｒ○ミュータンエネンスキット ”（ユナイテッド・ステーブ・バイオケミカル、クリーブランド、ＯＨ）を用い て行い、販売元の指示に従った。ミュータジエネノスしたインサートをｐＬＬ３ −ＩＩ（＾）と呼ぶ。ミュータジエネンスに続いて、ｐＬＬ３−ＩＩ（Ａ）のシ ーフェンスを決め、１９８位にＡが存在することを確認した。ｐＬＬ３−１１（ Ａ）をＰｓｔＩによってＭ１３から外し、続いてヌクレオチド７４７で切断する ５ａｃｒで消化した。ヌクレオチド１−７４７にわたる断片を用いて、ｐＬＬ３ −ＦＬの対応する断片を置換する。１９８位でヌクレオチドをミュータジェネン スした、得られた全長ｃＤＮＡをｐＬＬ３−ＦＬ（Ａ）と呼ぶ。

つぎに、ｐＬＬ３−ＦＬ（Ａ）をＰｓｔＩで消化し、ヌクレオチド１から２６０ ４にわたる断片を単離する。ｐＬＬ３−ＦＬ（Ａ）の単離したＰｓｔｒ断片の一 部一ヌクレオチド１から１９２２−を以下の二つのオリゴヌクレオチドをプライ マーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＦＩ）を行う： １）５°−ＣＴＧＣＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＡＡＡＡ ＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＧＴＴＧ−３’　、および２）５−ＧＡＡＴＣＡＴＧＧＴ ＧＴＣＴＡＴＣＴＣ−３’。

オリゴヌクレオチド１は５゛から３′の方向に、ＰｓｔＩ部位、Ｔ７プロモータ ー、およびＰ３／サビンｃＤＮ＾のプラス鎖のヌクレオチド１−２０に対応する 。オリゴヌクレオチド２はＰ３／サビンｃＤＮ＾のマイナス鎖のヌクレオチド１ ９０４−１９２２に対応する。ＰＣＢは、ペルキン−エルマー・ノータスのＧｅ ｎｅＡＭｐキットを用いて行う。

ＰＣＨによって作成された二本鎖ＤＮＡを、Ｐ３／’サビンｃＤＮ＾のヌクレオ チド７８４で切断する、ＥｃｏＲＩで切断する。得られたＴ７プロモーターとＰ ３／サビンｃＤＮ＾の５′末端に対応する、得られた０、　１１１ｋｂ断片を単 離し、５ｓｐＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＢＲ３２２にサブクローニングする。

得られたプラスミドをｐＶ＋！３０９と呼び、Ｔ７プロモーターとＰ３／サビン ｃＤＮ＾のヌクレオチド１−７８４を含むことを確認する。

つぎに、ｐＬＬ３−ＦＬを、ヌクレオチド７８４および２８６７で消化するＥｃ ｏＲＩで切断する。これらのヌクレオチドにわたる断片を単離し、ＥｃｏＲＩで 切断したＰＶＲ３０９に連結する。

得られたプラスミド、ｐＶＲ３１２はＰ３／サビンｃＤＮＡの最初の２８６７ヌ クレオチドを含むヌクレオチド４４６６と６３３４がウィルスＩ？Ｎ＾配列と対 応が付くように変化させるた　・め、上述のようにオリゴヌクレオチドによるミ ュータジエネンスを行う。インサート＋１ＬＬ３−２５３を１１３のＰｓｔ１部 位にサブクローニングする。オリゴヌクレオチド３’　−ＣＴＣＧＴｒＴＧＴＧ ＧＣＡＴＡＡＣ−５°を用いて、ヌクレオチド４４６６をＴからＣに変化させる 。オリゴヌクレオチド３’−ＣＣＣＡＴＧＧＧＧ＾丁闇＾ＣＣＧ−５′を、ヌク レオチド６３３４をＴからＣに変えるために用いる。ミュータジエネンスしたヌ クレオチドはヌクレオチドの配列決定によって確認する。得られた、修正された ｃＤＮＡ断片をｐＬＬ３−２５３（Ｃ）と呼ぶ。

つぎに、ｐＬＬ３−２５３（ｃ）とｐＬＬ３−２７１をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ で切断し、連結して長い断片を作ることにより、一つのクローンにまとめる。得 られたＤＮＡをｐＬＬ３−１（Ｃ）と呼び、Ｐ３／サビンのヌクレオチド１５０ ０から３′−ポリ（＾）末端までに対応する。ｐＬＬ３−Ｉ（Ｃ）の完全なｃＤ Ｎ＾ＤＮＡ−トをＰｓｔＩ部分消化によって単離する。ＰｓｔＩ部位がヌクレオ チド２６０４に存在するため、部分消化が必要となる。つぎに、ｐＬＬ３−Ｉ（ Ｃ）をＰＳｔＩ消化したｐｉｆ１３２２に連結する。インサートの一部をＳｍａ Ｉ／ＮｒｕＩ消化によってｐＢＲ３２２から除く。切断した断片は、ｃＤＮＡの ヌクレオチド２７６６から３′末端までと、ｐＢＲ３２２にまでわたっている。

ＳｍａＩ／ＮｒｕＩ断片をｐＶＲ３１２からも切り出す。このＤＮＡは、ｐＢＲ ３２２中のＮｒｕＩ部位からＴ７プロモーター、そしてＰ３／サビンｃＤＮ＾の ５°末端およびヌクレオチド２７６６のＳａ＋ａＩ部位までに対応する。これら の２つのＳａ＋ａＩ／ＮｒｕＩ断片を連結し、真のＰ３／サビンｃＤＮ＾を作成 する。得られたプラスミドをｐＶＲ３１８と呼ぶ。ｐＶＲ３１ｇ中に全長のイン サートが存在することは、制限酵素分析によって確認する。しかし、ｐｖＲ３１ ８の塩基配列決定により、２４９３位はＣではなくＴをもつことが示された。

ヌクレオチド２４９３をＣに置換するため、ｐＶＲ３１８のヌクレオチド１８９ ５から４２４１にわたる５ａｃＩ／ＥｉｎｄＩＩＩ制限断片を除去し、サブ制限 −ンｐＬＬ３−２７１由来の対応する断片に置換した。この過程を第５図に示す 。詳細には、ｐＬＬ３−２７１を５ａｃＩおよび［ｌ１ｎｄＩＩＩで消化し、ヌ クレオチド１８９５から４２４１にわたる２．３４６ｋｂ断片をアガロースゲル 電気泳動によって単離する。プラスミドｐｖｉｉ３ｉｓを５ａｃＩとｆｌｉｎｄ ＩＩＩで部分消化し、ヌクレオチド１８９５と４２４１の間の２．３４６ｋｂ断 片を除く。残りの１０．００７ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離 し、ｐＬＬ３−２７１由来の５ａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結する。得られ た連結産物ｐＬＥＤは、ワクチン株３型ポリオウィルスｃＤＮＡの全長に対応す る。ｐＬＥＤの配列を第６図、パネルＡ−Ｊに示す。

実施例８ポリオウイルスＰ３／サビンｃＤＮ＾を用いた細胞のトランスフェクシ ョン−次サル腎臓細胞を、バンクのバランス塩溶液、０．３５％重曹、および１ ０％０％ランを含むイーグルの基本培地（ＢＭＥ）で、２５Ｃ１！２のフラスコ ２本で、８０％の集密性まで培養する。培養液を３７℃に維持する。培地を除き 、細胞を、ＨＥＰＥＳｍ衝化生理食塩化生理食塩水中ルシウム沈澱として加えた ｐＬＥＤ３（実施例７で調製）でトランスフェクトする。室温で２０分後、細胞 をエーμの乳慶維持培地で覆い、３７℃で４時間インキュベートする。つぎに培 地を除き、細胞を新鮮な、暖かい培地で洗浄する。ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水 中１５％グリセロールを２ミリリットル加え、３７℃で３．５分間細胞をさらに インキュベートする。グリセロールを除き、細胞を再度新鮮な培地で洗浄する。

２本のうちの１本の培養液を、１％ノープル寒天（ディフコ社、デトロイトＪＩ ）を含む暖かい培地で覆い、他方は寒天を含まない培地で覆う。培養液を３４℃ で１−５日インキュベートする。００１％ニュートラルレッドで細胞を染めるこ とにより、プラークを視覚化する。液体培養の培地を用いて、Ｖｅｒｏ細胞上で のプラーク力価により、感染性ポリオウィルスのアッセイを行う。

実施例９Ｐ３／サビンｃＤＮ＾のｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反 応は、ファン・デル・ウエルフ他、Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ　＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ、８３、ｐｐ、　２３３０−３４（１９８６）の方法によって行う。

Ｔ７プロモーターーＰ３／サビン構造を含むｐＬＥＤを、ポリオウィルス配列の 外側にある適当な制限酵素で直鎖状にし、フェノール抽出とエタノール沈澱で精 製する。この鋳型ＤＮＡを、２０■［ノン酸ナトリウム、ｐ［Ｉ７７、　ｂ）Ｉ 　ＭｇＣｌ２．１０ｄ　ＤＴＴ、　ＩＩＩＭスペルミンンーＢＣＩ、５０ｍＭ　 ＮａＣ１および各１ｍＭ　ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ を含む混合液に加える。ＲＮＡ合成は１０−１５ユニツトの７７　ＲＮ＾ポリメ ラーゼ７μｇ１！鎖状鋳型を加えることによって開始し、３７℃で３０分反応さ せる。

ＲＮＡ合成後、ＤＮＡ鋳型をＤＮアーゼエで消化する。残ったＲＮＡをフェノー ル抽出および２．５Ｍ酢酸アンモニウムの存在下でのエタノール沈澱によって精 製する。精製したＲＮＡはＵＶ吸光度によって定量する。

実施例１０　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写したＰ３／サビンＲＮ＾による細胞のトラン スフエクノヨン実施例８で述べたように、準集密性単層の一部サル腎臓細胞を調 製する。実施例９で調製したＲＮＡで、Ａ、ハーク（ｖａｈｅｒｉ）他、“感染 性ポリオウィルスＲＮＡ：感度の高いアッセイ法”、ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　２７ ．　ｐｐ、　４３４−３６（１９６５）の方法により、細胞をトランスフェクト する。詳細には、細胞の単層を等張のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄 する。１５分後、ＰＢＳを吸引によって完全に除去する。単層をつぎに、ＰＢＳ 中にＲＮＡと５００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン（ングマ、セントルイ ス、ＮＯ＋５００．　ＯＯＯＭＷ）を含む感染液０．２５＋ａｌでコーティング する。感染させた単層を室温で静かに１５分置き、エージの乳層維持培地で一度 洗浄し、つぎに実施例８で述べたように、新鮮な培地または１％寒天を含む培地 のいずれかで覆う。３４℃で４−５日！いた後、プラーク形成（寒天含有培養液 中）、あるいは細胞変性効果によってウィルスを検出する。

実施例１１３型ポリオウイルスの弱毒性における、ヌクレオチド２４９３の効果 の評価ヌクレオチド２４９３にＣの代わりにＴを含むＪＶＲ３１８などの、弱毒 性３型ポリオウイルス株の誘導体が構築された。実施例８および１０のように、 ２４９３位にＴまたはＣを含むｃＤＮＡからウィルスを調製した。得られたウィ ルスを、通常の方法により、サルにおける神経毒性に関して検査を行った。

実施例１２３型ポリオウイルスの弱毒性の増強２４９３位にＴを含む３型ポリオ ウイルスｃＤＮＡに対して、部位特異的ミュータジェネノスを行い、ＴをＣ１， 、ｊｌ換した。例えば、ｐＬＥＤ３をＰｓｔｌで消化し、ポリオウィルスをコー ドする配列を除去する。ポリオウィルスｃＤＮ＾は単一の、内在性ＰｓｔＩ部位 をヌクレオチド２６０４位に持つ。したがって、ＰｓｔＩ消化により、５′の２ ．６ｋｂウィルスｃＤＮＡ断片と、３゛の４．８ｋｂウイルスｃＤＮＡ断片が得 られる２、　６ｋｂ断片を通常の方法により単離し、Ｍ１３ｍｐＨｌの単一のＰ ｓｔＩ部位にサブクローニングする。つぎにゴ７−ＧＥＮ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏミ ュータンエネンスキット”（ユナイテソド・ステー７・バイオケミカル、クリー ブランド、ＯＨ）を用いて販売元の指示に従い、部位特異的ミュータジエ不シス を行い、ヌクレオチド２４９３のＴをＣに変換する。ミュータジエネンスの後に 、２．６ｋｂのｃＤＮ＾ＤＮＡベクターから切りだし、ウィルスｃＤＮ＾の３′ 部分と再度連結して、完全なｃＤＮＡをｐＢＲ３２２にクローニングする。ミュ ータジェネンスしたｃＤＮＡと元のｃＤＮＡの双方を用いて、実施例８のように 生育可能なポリオウィルスを産生ずる。得られたウィルスに関して、通常の方法 により、弱毒性をアッセイした。ヌクレオチド２４９３にＣを含むｃＤＮＡによ って産生された、ミュータジェ不シスしたウィルスは、元のウィルスよりも弱毒 化されていることが期待される。

プラスミドｐＬＥＤａ中の完全ｃＤＮＡ配列の、確認のための配列決定から、ウ ィルスゲノムでは通常は６個のＡ（アデノシン）がつながっている部分（４１３ ３−４１，３８位）で、さらに余分なＡが見いだされた。以下の過程は、ｐＬＥ Ｄ３からｐＬＥＤ３．２を作成するための方法である。

誤ったｐＬＥＤ３配列の単離およびミュータジェネノス：精製したｐＬＥＤ３プ ラスミドＤＮＡから始めて、制限酵素５ａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩｌでＤＮＡを 完全に消化する。選択した方法（すなわち、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ）により、 ｃＤＮＡヌクレオチド１８９５−４２４１に対応する２３４６塩基対の５ａｃＩ ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を精製する。精製した制限酵素断片をバクテリオファージ Ｍ１３にサブクローニングし、オリゴヌクレオチドによる欠失ミュータジェネシ スを行えるようにする。この目的のために、ヌクレオチド４１２１−４１５０に わたるＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成する。このオリゴヌクレオｆ　）’（７ ）配列１ｔ：５°−ＣＧＣＣＴＣＡＧＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＡＣＣＡＡＣＴ ＡＴＣ−３′である。

ミュータジェネンスは、ゴ７−ＧＥＮ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏミュータジェネシスキ ット”（ユナイテッド・ステー７・バイオケミカル、クリーブランド、オハイオ ）を用いて販売元の指示にしたがって行う。ミュータジェ不ンスされたインサー トは、ンークエンス解析により、４１３３−４１３８に、７個ではなく６個のＡ が存在することを確認する。上述のように、改変した５ａｃＩ／ＨｉｎｄＩ工Ｉ 断片は、この制限断片を欠くプラスミドに連結するために、ゲルで精製して調製 する。

ｐＬＥＤ３プラスミドからｐＬＥＤ３．２の調製・精製したｐＬＥＤ３プラスミ ドＤＮＡから開始し、ＤＮＡを制限酵素５ａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩｌで部分的 に消化する。プラスミドから２３４６塩基対の上述のＳａｃ工／ＨｉｎｄｒＩＩ 断片を除いたものに対応する、１０．００７塩基対の５ａｃＩ／Ｈｉｎｄ工ＩＩ 断片を精製する。

ｐＬＥＤ３．　’）の構築： 精製したプラスミド本体と、ミュータンエネンスした２３４６塩基対断片を連結 する。形質転換可能な大腸菌ＤＨ５σ細胞を、連結産物で形質転換し、テトラサ イクリン耐性のコロニーを選択する。ｐＬＥＤ３．２の同定は、４１３３−４１ ３８の６個の＾の確認によって行う。

サルＩｆＶ試験で用いるＬＥＤ３およびＶＲ３１ｇウィルス。

ｐＬＥＤ３　（修正されていない）の全長のｃＤＮＡは、上述の余分なＡがあり 、ウィルスタンパク質２Ｃ，３Ａ、　３Ｂ、　３Ｃ１および３Ｄにフレームノッ トが生じたと予想されるにもかかわらず、感染可能であった。Ｔ７　ＲＮＡポリ メラーゼを用いたｐＬＥＤ３　ｃＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写によって、直接 ンークエンス法での解析により、誤りの７個のＡを含むＲＮＡが合成された。こ れらの転写産物をサル腎臓細胞にトランスフェクトするのに用いると、この部分 が正しい数の＾を持つウィルスに回復する。

ｐＬＥＤ３とｐｖＲ３ｉｇのなかのｃＤＮＡは、２４９３位および４１３０−４ １３６の＾の数に違いがあるにもかかわらず、これらのｃＤＮＡを用いて作成し たウィルスは、２４９３の変異のみが唯一の相違点であった。このｃＤＮ＾ＤＮ Ａウィルスは、２４９３変異の有意性を評価する研究に使用した（論文投稿中） 。

ポリメラーゼは、１種類のヌクレオチドが数回繰り返されている領域では複製に 問題が生じることが知られている。我々は、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼが、ｐＬ ＥＤ３から７個のＡを転写する際に、７個の＾ではなく６個の＾を含むＲＮＡを 、誤りによって作成する可能性があることを提案する。６個の＾を持つ転写産物 のみが細胞にトランスフェクトできるウィルスを産生ずることが可能である。こ の仮説的説明は、Ｔファージのポリメラーゼを研究する科学者にとっては非常に 有り得ることと考えられる。

本発明の過程で調製された組み替えＤＮＡは、特許目的のための微生物寄託の国 際認識に関するブダペスト条約に基づき、１２３０１バークローンドライブ、ロ ックビル、１１Ｄ　２０８５２のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨ ンに寄託されている試料によって例証される。この試料は１９９０年４月１７日 に寄託され、ワクチン株すビン３の完全性全長コピーとして同定され、ｐＬＥＤ ３と呼ばれる。この寄託は、ＡＴＣＣ受託番号４０７８９として登録されている 。

実施例　１３ Ｓａｂｉｎ３ワクチンウィルス（Ｌｅｄｅｒｌｅ−Ｐｒａｘｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌｓ、　ＮＹ）から、ウィルスＲＮＡを抽出した。逆転写酵素及び仕置（ １２）に記載されている方法を使用して、ウィルスＲＮ＾からｃＤＮＡライブラ リーを作製した。大腸菌株ＣＪ２３６中で増殖したＭ１３にサブクローンしたｃ ＤＮＡに、オリゴヌクレオチドを介して変異を導入し、ｃＤＮ＾ＤＮＡ個々の塩 基位置において変化させた（１６）。このような目的で、標的とするヌクレオチ ドが中央に位置するようにアンチセンスオリゴヌクレオチド（１７ｍａｒ）を合 成した。全長ｃＤＮＡクローンの構築には一般的な制限酵素切断部位（ＥｃｏＲ Ｉ、　ＨｉｎｄＩＩｌ、　５ａｃＬ　ＳｍａＩ）を利用した。全長ｃＤＮ＾（７ ，４５９ｂｐ）をベクターｐＢＲ３２２中に構築し、大腸。

菌株ＤＨ５α（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）を使用してそれらを選択及び増幅した。

１８Ｄ　：　Ｖｅｒｏ細胞は、０，１１％重炭酸塩（重曹？）及び１０％胎生牛 血清を加えたＥａｒｌｅの塩を含むＥａｇｌｅのＭＥＭ中で、単層で増殖させた 。アフリカミドリザル腎臓初代培養細胞（ＰＣＭＫ）は、０．０３５％重炭酸塩 （重曹？）及び１０％血清を含むＢａｎｋの塩を加えたＢＭＥ中で増殖開始させ た。もとの７０％量の、５％血清を含むＢＭＥ　（Ｅａｒｌｅの塩）をさらにそ の細胞に与えた。ポリオウィルスを感染させている間は、培養細胞は全て、Ｅａ ｒｌｅのラクトアルブミン加水分解物維持培地を改変した培地（ＬＭＭ；ｐＨ７ ，３４血清含まず）中で維持した。

ウィル７、　：　５ａｂｉｎ３’７クチンウイルス（Ｒ５Ｏ＋２：　Ｌｅｄｅｒ ｌｅ−Ｐｒａｘｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ。

Ｐｅａｒｌ　Ｒｉｖｅｒ、　ＮＹ）は、再びおこした（Ｒ３Ｏ＋１）製造ノード を一度ＰＣＭＫ細胞で継代して調製した。実験的な目的で、同じノードを使用し てＶｅｒｏ細胞中細胞−てＲ３Ｏ＋２ワクチンウィルスを生成した。７７２Ｎ＾ ポリメラーゼによるｐＬＥＤ３又はｐｖｏｉｇの転写産物をトランスフェクトし たＶｅｒｏ細胞から回収したｃＤＮ＾ＤＮＡウィルスを、ＬＥＤ３及びＶＲ３１ ８＋１と名付けた。これら”シード”ウィルスを感染の多重度（ＭＯＩ）０．１ ．３３、５：０．５℃でＶｅｒＯ細胞内で再度増幅し、ウィルスストックＬＥＤ ａ＋２及びＶｌ？３１８＋２を作成した。ＬＥＤ３＋２及びＶＲ３１８＋２ウィ ルスサンプルの調製に対して１よ、実際のワクチンの場合にできる限り近い条件 （継代レベルや培養条件を示す）で行われるように特に注意を払った。

ウィルス力価の検定、サンプル内の感染ウィルスの力価は、はとんどＨＥｌ）− ２細胞におけるミクロタイトレーノヨン法によって測定され、１ｍｌ当たりの培 養細胞感染量（ＴＣＩＤ）５０として表された（１）。感染力価が、Ｖｅｒｏ細 胞単層に対するプラーク数によって測定され、従って１ｍｌ当たりのプラーク形 成ユニｙ　ト（ｐｆｕ）として表された場合もあった。Ｌｉ３Ｎ内で１０倍ごと になるように調製したウィルス希釈液を用いて単層の集まり２５ｃｍ２に接種し 、２２℃でウィルス希釈液を吸収させた。細胞の上に、２％胎生牛血清を加えた （Ｒａｎｋの）ＭＥＩＩｌ、　０％特級寒天（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ）を−面にのせ、３３．５±０５℃で培養した。３日後、プラークが現れ 、ニュートラルレッド（０，０１１液）で細胞を染色してプラーク数を数えた。

与えられたサンプルの場合、上述した２つの方法で決定された絶対数の間にはい つも０．６１ｏｇの差があり、ＴＣＩＤ５０［の方が常に大きい。

塩基配列の決定・ＲＮＡ配列は、合成オリゴヌクレオチド及びジデオキシヌクレ オチド鎖終止法を用いて既述（２０）のとおりに決定した。クローン化したｃＤ Ｎ＾の配列決定は、シークエナーゼＤＮ＾シークエンジングキット（Ｕ、　Ｓ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用酵素ＰｖｕＩで完全に切断した後、フェノール 抽出及びエタノール沈澱を行うことによって調製した。モスら（１０５５ｅｔ　 ａｌ、　（１２））が示したように、鋳型ＤＮＡ１μｇを含む転写反応混合液を 調製した。精製７７　ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　３０ユニツ トを添加してＲＮＡ合成を開始し、反応液を３７℃で９０分間インキュベートし た。鋳型ＯＮ＾及び全長転写産物を、電気泳動後、エチジウムプロミドで染色し たアガロースゲル中において、それらに相当する大きさのバンドの強さを標準量 のものと比較することによって定量した。鋳型に対してはバクテリオファージλ ＤＮＡの９゜Ｏｋｂ　ＦＩｉｎｄＨＩ断片を、転写産物に対しては７．５ｋｂ一 本ＨＲＮＡマーカー（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）を標準として用いた。ゲルの写真のネガに対してデンシトメーターで 測定を行って、数字で表された値を得た。全長転写産物２５μｇを含む反応混合 液の一部を利用してＶｅｒｏ細胞単層（２５ｃｍ２）を、Ｖａｎ　ｄｅｒ　１ｅ ｒｆ　ｅｔ　ａｌ、　（２３）の記述に従った方法でトランスフェクトした。ｃ ＤＮ＾ＤＮＡィルスを、細胞単層が完全に破壊されたときに（＋４　ＣＰＥ）回 収した。

ウィルスの同位体標識とＰＡＧＥ：　Ｖｅｒｏ細胞（６，５ｘ１０６）をＭＯＩ 　１６ｐｆｕ／ｃｅｌｌでウィルスに感染させた。ウィルスを１時間吸収させた 後、細胞をＬＭＭで二回洗浄してから同じ培地で浸し、３３４５℃でインキュベ ートした。４時間牛後、培地をメチオニンを含まないＭＥＭ（Ｓｅｌｅｓｔ　Ａ ｍ１ｎｅ　Ｋｉｔ、　ＧｒＢＣＯ）に交換した。１時間後、細胞に［３５Ｓ］メ チオニン（比活性、＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；＾ｍｅｒｓｈａｍ）を終濃度６ ０μｃｉ／ｍｌになるように加えた新しい培地を補充してインキュベーションを 続けた。＋４　ＣＰＥ　（２４時間以内）のところで、ウィルスを含む培地を、 まず最初に低速遠心（２５０Ｏｒｐｍ、　２０分、４℃）にかけた後ミクロフィ ルトレーンヨン（０，２２μｍ　Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ；　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ） 　して透明にした。ベックマン７０．　ＩＴｉローターを使用して超遠心を行い （７０に、　１時間、４℃）、ウィルスを沈澱させた後、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩 衝液（１０）中に再懸濁し沸騰させた。試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電 気泳動し、オートラジオグラフィーをとってタンパクの様子を見た。

ウィルス熱安定性曲線：ウィルス（Ｌｉ３Ｎ中で約１０７．３ｐｆｕ／ｍｌ）を ３．ｈｌずつ数サンプル、室温（２２℃）、あるいは３７℃か４２℃の温浴中で インキュベートした。５日以上にわたって２４時間ごとに、各々のインキュベー ションの組からサンプルを一つ選び取って一２０℃に凍結した。サンプルが全て インキュベーションし終わったところで、それぞれのサンプルのウィルス力価を Ｖｅｒｏ細胞単層に対するプラーク数によって測定した。

ウィルス増殖曲線：　ＶｅｒＯ細胞単層（１０７細胞／２５ｃｍ２フラスコ）に ウィルスを４ｐｆｕ／ｃｅｌｌで感染させ、前述したように維持した。感染後示 しである時間後に培地を各培養液から採取し、７０℃に保存した。

神経毒性テスト：ウィルスサンプルのＭａｃｃａ　Ｍｕｌａｔｔｏサルにおける 神経毒性を、２種類の容認されている方法を用いてテストした。アメリカ合衆国 連邦条例規約（２２）の記載に従う方法では、最低１０７．６ＴＣＩＤ５０／ｒ ｓｌであるウィルスサンプル０．２１１１あるいはＱ、５１１１を、サルのを髄 （ＩＳ）あるいは大脳・小脳の各半球の視床部（ＩＴ）に、各テストごとにそれ ぞれ注射する。ｆｔ１Ｏテスト（２６）では、ウィルス（力価１０６．５−１０ ７．５　７（ＪＤ５（１／ｆｆ１ｌ）　０．２１１１１をサルの背骨の間に注射 することが必要である。注射後、試験動物を灰白髄炎の臨床的徴候の出方につい て１７−２１日間観察する。その後、動物を殺して脳及びを髄のポリオウィルス による傷害を組織学的に検査できるようにする。それぞれのサルから得た神経組 織を、観察した神経傷害の程度に応じて１（低い）から４（高い）までのスコア をつける方法を使用して評価する。平均傷害スコアは、グループ内のサルについ て記録されたスコアの平均値である。

統計的解析：平均傷害スコアの差を、平均値の範囲を算出する際に用いられる最 小に二乗決定法を伴う偏差解析法（ＡＮＯＶ＾）モデルによって解析した。視床 間に注射されたサルにおける反応頻度については、カイ二乗法を使用して、重要 度が分析された。

クリーニングし、５ａｂｉｎ　３ゲノムの５゛端６塩基以外の全ての部分に対応 する４個のｃＤＮ＾ＤＮＡ〉・を同定した。量も５′側を含むＣＤＮ＾ＤＮＡン を、５ａｂｉｎ３　ｃＤＮ＾の最初の６塩基をつけ足し、さらにそれがバクテリ オファージエフプロモーターの制御下に位置するように、ポリメラーゼ鎖反応を 利用して合成りＮＡオリゴヌクレ、ｔ−１−）’［５°−ＣＴＧＣＡＧＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＡＡＡＡＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＧＴＴＴＧ −３’　］を牛■■Zル ことによって改変した。プロモーターの方向によって、クローン化したｃＤＮ＾ の＋鎖ＲＮ人転写産物が合成されるようにしである。４個のｃＤＮＡクローンの 完全な塩基配列をＬＥＤ３　ＲＮＡの配列と比較したところ、４個の塩基の違い が認められた。この塩基の違いは、逆転写反応中に生じた誤りによるのか、ワク チンウィルスサンプルに含まれていた割合の低い塩基配列の多様性によるもので あるかはっきりしていない。しかしながら、全長の誤りの生じているｃＤＮ＾か ら生じたＴ７−由来転写産物でＩＩＩＩＰｉｌをトランスフェクトしてもウィル スもＣＰＥも生じなかったので、このｃＤＮ＾には感染性がなかった。オリゴヌ クレオチドを介した変異導入法（実施例１３、材料と方法参照）を１．９８（Ｇ からＡ）、４４６６（ＴからＣ）及び６３３４（ＴからＣ）という４箇所中３箇 所に施して塩基配列を正しく直した。最後の誤りである２４９３番目のＣがＵに 変化している箇所は、偶然にこの位置でＬｅｏｎ様塩基になっていたので、ｐＶ Ｒ３１８中の全長ｃＤＮＡではそのまま残しておいた。このクローンは塩基２４ ９３だけがＬＥＤ３　ＲＮＡ配列と異なっている。ｐＶｌ？３＋８と、２４９３ 番目にＣを持つワクチンｃＤＮ＾サブクローン間でｃＤＮ＾ＤＮＡ塩基１８９５ 番目の５ａｃＩから塩基４２４１番目のＨｉｎｄｌＩＩまで）を交換して最終的 に真正ＬＥＤ３　ｃＤＮ＾（ｐＬＥＤ３．２）を作製し終えた。

クローニングベクターｐＢＲ３２２中の全長ＬＥＤ３　ｃＤＮ＾ＤＮＡ、第７図 、パネルＡに図示しである。５ａｂｉｎ３　ｃＤＮ＾の３°末端とプラスミドｐ ＢＲ３２２の連結部にわたって塩基配列を解析したところ、２７個のＡからなる ｐｏｌｙ−Ａ部分があることが示された。ｃＤＮ＾をクローニングした際の操作 に由来する１５個のＣの連なりはｐｏｌｙ−Ａ部分のうしろに直接線いている。

ｐＬＥＤ３及びｐｖｏ１ｇ内のｃＤＮ＾の試験管内転写反応・プラスミドＤＮＡ をＰｖｕＩで切断して、１）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応の為に、完 全なポリオウィルスＲＮＡを含む線状ＤＮＡ鋳型を作製し、２）ｃＤＮ＾３′Ｄ ＮＡ続く外来ベクター配列の長さが最も短い鋳型をつくった。Ｐｖｕｒは、ｃＤ ＮＡ内に存在せず最もｃＤＮ＾の３′末端に近い（正確には１２６ｂｐ）制限酵 素部位に相当する。ｐＬＥＤ３及びｐｖＲ３ｔｇからは２つのＰＶｕＩ断片（４ ，４ｋｂと８゜Ｌｋ’）が生じるが、配列り解析によれば８゜ｌｋｂ断片しかＴ ７プロモーターを含まない（第７図、パネルＡ参照）。第７図のパネルＢは、Ｒ ＮＡがＰｖｕＩで切断されたｐＬＥＤ３及びｐＶＲ３１８からＴ７ＲＮＡポリメ ラーゼによって効率的に合成されていること、及びその大きさが８．１ｋｂ断片 から生じるランオフ（ｒｕｎｏｆｆ）　（８，１ｋｂの末端まで読み流してそれ 以上鋳型がないために転写が終止した）転写産物として予想されていたものと一 致することを示している。レーン５及びレーン６において、２つの上部のバンド （うすい）は、プラスミドＤＮＡをＰｖｕＩで切断して生じる８、　ｌｋｂと４ ．４ｋｂの断片に相当する。レーン４にはｄｓＤＮＡのサイズマーカー用にＥｉ ｎｄＩｒＩ／λＤＮ＾を流しである。転写産物（レーン５及び６において最も濃 いバンド）は、全長ＲＮＡ　（７５８５塩基）と一致する７、　５ｋｂ　５ｓＲ Ｎ＾マーカー（レーン１−３）ときっちり同じ位置に移動している。ウィルス粒 子ＲＮＡに比較して（レーン７）ポリオウィルスｃＤＮ＾の試験管内転写産物は わずかに速く移動するが、恐らく共有結合的に付着している■Ｐｇタンパク質が ないためであろう。鋳型１μｍを含む転写反応によって、２０−２５μｇの全長 転写産物が複写するように生成された。

ここで示されているように、５０μｍ反応混合液の１μｇ中にあるものに相当す るバンド（レーン５あるいは６）は、７．５ｋｂ　５ｓＲＮＡ５００ｎｇ　（レ ーン２）とほぼ同じ濃さである。これらの転写産物を直接塩基配列決定法によっ て解析したところ、ボリオウィルスの５゛端の最初の塩基のすぐ前に２つ余分な グアニンがあることがわかり、３゛末端のｐｏｌｙＡ、　ｐｏｌｙｃ部分のうし ろに１２６ｂｐの外来ｐＢＲ３２２配列が存在することが確認された。

ＶｅｒＯ細胞を前述のＲＮＡでトランスフェクトした場合、ポリオウィルスの感 染と同様の細胞変性効果が２４時間内に認められ、ウィルスを４８−７２時間の 間（＋４ＣＰＥ）に回収した。転写産物の比感染力は、１−２Ｘ１０２　ｐｆｕ ／μｇで、ワクチンＲＮ＾の約３％に当たることがわかった。シークエンンング を行って決定したところ、回収されたウィルスのＲＮＡは３°末端の外来ｐＢＲ ３２２配列が欠落している。さらに、これらのウィルスのゲノムは、４７２（Ｕ ）、２０３４（Ｕ）、及び６０６１（Ｕ）番目に弱毒化された塩基を持ッテイる ことが確かめられた（塩基２４９３１．かＬＥＤ３　（２４９３−Ｃ）とＶＲ３ １ｇ（２４９３−Ｕ）の違いはわかっていなかった。）。

塩基２４９３の変異は７円の移動度の変化に関連している　５ａｂｉｎ３ワクチ ンウイルスの共通ゲノム内の２４９３番目の４４墓におし・て測定された変異に より、ｖＰｌり２４）の工１ｅ−６のＴｈｒへの置換が予想される。このアミノ 酸の置換によってＶＰＩの生化学的性質が変化しているかどうかを調べるために 、このアミノ酸置換によって変化しているＬＥＤ３ノＶＰ１タンパク質と、ＬＥ Ｄ３及びＶＲ３１８ノＶＰ１タンハ’）賞ヲ比較シタ。ＬＥＤ３由来のＶＰＩは ６番目にスレオニンを持つが、ＶＲ３１１１はこの場所にイソロイシンを持って いる。これらのアミノ酸間の分子量の違いは最小であるのにもかかわらず、これ らのウィルス由来のｖＰ１タンパク質は、５Ｏ５−ＰＡＧＥによって区別するこ とが可能である（第８図）。Ｔｈｒの側鎖は水素結合の形成が可能である水酸基 を有しているのに対して、Ｉｌｅの側鎖は疎水性であるという事実によって、Ｖ ＰＩの移動度においてここで認められた違いが生じることを説明できる可能性が ある。結果として、１１、ｅ６を持つＶＲ３１８ウィルスのＶＰＩはＳＤＳをよ り結合し、従ってＬＥＤ３のＶＰＩよりも速く移動する可能性がある。これらの データは２４９３変異を少なくとも一つの生物物理学的変化に関連づけた。ＶＰ Ｉにおけるこの変化がウィルス粒子の３Ｄ構造に影響を与えるか否かは、検討中 である。

ＬＥＤ３及びＶＲ３１，８ウイルスの熱安定性、ポリオウィルスの三次元構造で は、ＶＰＩのＮ末端領域は、他のキャップシントタンバク質（６）の末端領域と 緊密に会合した状態で、天然のウィルス粒子の内側に埋まっている。２４９３変 異がウィルス粒子の安定性を変化させるか否かを検討しようという試みで、ＬＥ Ｄ３及びＶＲ３１ｇウィルスを、いくつかの温度において、熱による不活化に対 する感受性について比較した。第９図に図示しであるように、ウィルスサンプル は両方とも、室温（２２℃）で５日以上放置しても力価の減少は認められなかっ た。３７℃と４２℃では、ウィルスサンプルの力価は両方とも同様に減少した。

熱処理にもかかわらず、ＬＥＤ３とＹＩ＋３１８ウィルスの間のプラークの形態 における違いは、保たれていた（後述）。

表現型マーカーに対するｎ２４９３の影響　毒性のある株から弱毒化ワクチン株 を識別するために、プラークの大きさが小さいことを利用することがしばしばあ る（１３）。ＶｅｒＯ細胞単層上でｃＤＮ＾由来ウィルスサンプルを一回ブラー ク数によって力価測定を行った際に、ＶＲ３１ｇウィルスはＬＥＤ３ウィルスに 比べて明らかに大きいプラークを形成することがわかった。病原性患者Ｌｅｏｎ 株を含めて比較したところ、ＶＲ３１８のプラークは、中間の大きさであること が明らかになった（第１０図参照）。

これらのデータは、２４９３番目におけるＬＥＤ３ＣＣ）とｙ′１３Ｈ３（Ｕ） とｔ・う一つの塩基の違いがＬＥＤ　３に対するＶＲ３１８の示したプラークの 大きさの増加の原因となっていることを示唆している。

ＬＥＤ３及びＶＲ３１ｇウィルスの伝統的な熱感受性（ｒＣｔ／４０℃）及び” ｄ”マーカー表現型について検討した。このどちらのテストにおいてもこれらの ウィルスを互いに識別することはできなかったが、相方ともＬｅｏｎウィルスと 比較して弱毒化された表現型を示した（データは示さない）。

ＬＥＤ３及びＶＲ３１８の増殖曲線：　ＬＥＤ３及びＶ’Ｒ３１ｇの複製を比較 するため、これらのウィルスの増殖曲線の動きをＶｅｒｏ細胞内で、弱毒化され たポリオウィルスに対して許容的な条件下（すなわち、低温、高いｐＨ）で比較 した。第１１図は、ＬＥＤ３及びＶＲ３１８を感染させたＶｅｒＯ細胞からのウ ィルスの放出の変化には、著しい差異がないことを示している。感染後２４時間 後に得られた力価（１０８１）ｆｕ／＠ｌ）は、これらのウィルスが両方ともこ の条件下では極度に衰弱していないことを示している。感染後８時間から１２時 間に力価が倍加して増大する際に常に、わずかであるが差が認められ、このこと は、ＶＲ３１８がＬＥＤ３より速（複製する能力を持つ可能性を示唆している。

この時間の間に、ＶＲ３１８の力価は２００倍になるのに対し、ＬＥＤ３は３０ 倍にしかならない。どのように培養条件を変化させた場合に（例えば、低いｐＨ ）にＬＥＤ３とＶＲ３１８の増殖変化の間に認められた差が大きくなるのかとい うことを検討中である。

サルにおけるＬＥＤ３およびＶＲ３１８の神経毒性５ａｂｉｎ３およびＬｅｏｎ の全長ｃＤＮＡ由来の組み換えウィルスの構築、およびその神経毒性検定により 、ウェスドロップ（Ｗｅｓｔｒｏｐ）らは（２５）Ｓａｂｉｎ３の弱毒性の表現 型が４７２および２０３４番目のヌクレオチドにおける点突然変異と関連がある ことを示した。出願者による２４９３番目のヌクレオチドにおけるＳａｂ　ｉｎ ３特異的な点突然変異の同定により、この突然変異も弱毒化の決定基になりつる のかという疑問が生じた。

ｃＤＮＡ由来のウィルス、ＬＥＤ３およびＶＲ３１８を、ＷＨＯもしくは合衆国 ＣＦＨにおいてワクチンとして受諾される必要条件に含まれる操作によってサル を用いて神経毒性を検定した際に、適当な対照例と比較した（材料と方法、実施 例１３参照）。このような操作の差異には注入試料の量（体積、力価）と同様に 接種経路（視床内＋を髄内に対してを髄内のみ）が含まれる。表ＩＡにはＣＦＲ を髄内（ＩＳ）検定からの神経毒性のデータが示しである。ここでＬＥＤ３゜Ｖ Ｒ３１８は同時に検定されており、サルの腎臓の初代培養細胞（ＰＣＭＫ）で生 産された実際のワクチン（Ｒ８Ｏ＋２）の検定結果と比較されている。ＲＳＯ十 ２　（Ｖｅ　ｒｏ）ワクチンの検定から、記載のワクチンウィルスを生産するた めのＶｅｒ○細胞の使用は弱毒化に影響しないことが示された。Ｒ８Ｏ＋２　（ ＰＣＭＫ）、Ｒ８Ｏ＋２　（Ｖｅｒｏ）、ＬＥＤ３＋２　（Ｖｅｒｏ）によって 生み出される平均病変スコアはそれぞれ、０．　５２．　０．　３６．　０．　 ３４であった。このデータからＬＥＤ３が現行のワクチンウィルスと同様に神経 毒性がないことが示される。興味深いことに、ＶＲ３１８を受けたサルの平均病 変スコアは１．３１で、これは他のウィルスによるスコアに比べて有意に高い（ ｐ＜０．０１）。このデータにより、ＶＲ３１８が現在のＲ３Ｏ＋２ワクチンと 等価であること、２４９３番目のヌクレオチドにＵ　（ＶＲ３１８）ではなくＣ （ＬＥＤ３．Ｒ５Ｏ＋２）が存在すると弱毒化することが示される。

上記と同様にして、視床内経路でサルに注入した後のＬＥＤ３およびＶＲ３１８ の神経毒性を、現行のＲ５Ｏ＋２ワクチンの４つの完全検定から得たデータと比 較した（表ＩＢ）。脳組織はを髄に比べてポリオウィルス感染に対する感受性が 高くないので、この操作を用いての神経毒性は実質的に、病変スコアではなく病 変が目に見えて現れるか、それが何パーセントのサルに見られるかに基いている 。実際のＲ５Ｏ＋２ワクチンによって示されたように、一群のサルにおいて反応 性が低レベル（４，０％）であることが典型的であり且つ望ましい。ＬＥＤ３を 受けた１０匹のサルのうち、病変を示したものは見られなかった。しかし、ＶＲ ３１８では１０匹のうち２匹（２０％）の検定動物において病変が生じた。完全 なＩＴ検定には３０匹からなる一群のサルが必要とされるが、ＶＲ３１８群にお いてポジティブなサルの割合が増加したことは大変異常であり、現行のＲ３Ｏ＋ ２ワクチンと比べた場合ＬＥＤ３ウィルスは同等な、ＶＲ３１８は高い神経毒性 を持つことが予想されＶＲ３１８は不十分ではないかと考えられる。ＷＨＯの検 定操作を使って、ＬＥＤ３およびＶＲ３１８をウィルスＮＣＩと同時に評価した 。ＮＣＩは弱毒化したタイプ３のＷＨＯ検定対照と同等のものである。表２に挙 げるように、ＬＥＤ３およびＶＲ３１８に対する平均病変スコアはそれぞれ、０ 、　２１．　１．５１であった。３つの異なる方法によって確認したところ、Ｌ ＥＤ３がＶＲ３１８より弱毒化されているという事実は明白である。しかしなが ら、ＷＨＯ検定のデータ解釈は弱毒化された対照であるＮＣＩの挙動により何か 異なるものとなっている。この検定ではＮＣＩは１，０８の平均病変スコアを示 しており、これはＬＥＤ３とＶＲ３１８の計算値の間に落ちる。１．０８という 平均病変スコアはこの検定の対照としては高いものであるが、ＮＣＩ、ＬＥＤ３ ．ＶＲ３１８間での反応性の比較は、３者とも同時に検定していることから、正 しいものである。結果で得られたスコアの統計的比較は、この検定操作によって ＶＲ３１８を弱毒化した対照と区別することはできないことを指摘している。こ の予備データに基ずくと、１グループ当たり２４匹のサルを要す十分なＷＨＯ検 定に対してＶＲ３１８が不十分であるかを明確にすることはできない。一方、Ｌ ＥＤ３に関する病変スコアは、ＶＲ３１８およびＮＣＩ対照に比べて有意に低い ことが示された（ｐ＜０．０１）。

ＮＣＩ対照ウィルスが再誘導した５ａｂｉｎオリジナル（Ｒ２Ｏ）ではなく、Ｓ 　ａ　ｂ　ｌｒｒオリジナルのノードを用いて作製したワクチン材料を代表する ものであることは興味深い。ＳＯ＋２ワクチン（リーデル（Ｌｅｄｅｒｌｅ）： ＮＣ１に同じ）の２４９３番目のヌクレオチド配列の決定により、Ｃと変異体Ｕ が１・１で混ざっていることが明らかにされた。現行のＲ８Ｏ＋２ワクチンの同 様の評価（Ｌｅｄｅｒｌｅ）ではこの位置にはＣしか存在しない。このことはＲ ５Ｏシードが８０株の精製された誘導体である（２４）という事実を支持するも のである。ＲＮＡ配列決定によれば検定試料であるＬＥＤ３．ＶＲ３１８，ＮＣ Ｉは４７２番目ではヌクレオチド組成に違いがみられなかったので、ＷＨＯ操作 を使用してＬＥＤ３と比較した場合にＮＣＩに見られた上昇した神経毒性レベル は、ＮＣ１のウィルスプール内の２４９３−Ｕ変異体の部分集団によるものと思 われる。

ＶＰＩの６番目のアミノ酸をイソロイシンからスレオニンに変える、２４９３番 目のヌクレオチドにおける５ａｂｉｎ３特異的な新しい突然変異の同定（２４） は弱毒化の決定基であることがここで示された。５ａｂｉｎ３ポリオウイルスの 弱毒化は、以前に別件により４７２および２０３４番目のヌクレオチドにおける 点突然変異と関連づけられていた（２５）。２４９３番目の突然変異の寄与を評 価するため、完全に照合されたワクチンｃＤＮＡ　（ＬＥＤ３）を使ってウィル スを生産し誘導体であるＶＲ３１８と比較した。ＶＲ３１８はこの位置にＣでは な（Ｌｅｏｎ様のヌクレオチド（Ｕ）を持つ以外はＬＥＤ３と同じものである。

ＬＥＤ３において新たに発見された突然変異はサルにおける低下した神経毒性と 同様に小さなプラークを形成することと相関していた。

ここで提示されたデータは、弱毒化された５ａｂｉｎ３ワクチン株に関する生物 学的特性がＬＥＤａ内に保存されたことを表している。５ａｂｉｎ３ｃＤＮＡ由 来のシード株の利用に関しては多（の利益がある。オリジナルおよび再誘導した ５ａｂｉｎシード（それぞれＳ○、Ｒ８０）の両方の貯蔵量はそれらがウィルス プラークの分離体であるため制限がある。シードをクローン化され遺伝的に規定 されたｃＤＮＡの形で保存した場合、シード供給の制限は取り除かれ、さらにそ のようなノードは無限に保存することができる。シード供給の制限がないと、ワ クチンを生産するために用いられる感染の多重度（Ｍｏｌ）の柔軟性が増加する 。ウィークスーレビー（Ｗｅｅｋｓ−Ｌｅｖｙ）ら（２４）は受諾された市販の シードを使用して高いＭｏｌで生産されたウィルス試料が遺伝的な均一性がより 高いことを示した。ＲＮＡウィルスはその性質によりＤＮＡウィルスよりも高い 頻度で変異体を生じるので、クローン化され遺伝的に規定されたＤＮＡの形で確 立されたＲＮＡウィルスシードはかなり均一性の高いものとなる。この方法によ り、継代中に選択的に増幅されうる望ましくない変異体の量を最小限に抑えるこ とができ、これは遺伝的安定性の上昇へとつながる。５ａｂｉｎ３ワクチンに対 する他の市販のシードと比較した場合、ＬＥＤ３が遺伝的により安定であるか否 かを評価する継代研究は現在評価中である。

ヌクレオチド配列決定により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ継代の際に２４９３番目にＵを 持つＳａｂ　ｉｎ３変異体が、４７２番目にＣを持つ変異体よりも急速に蓄積す ることが示された（２４）。同じ研究において、異なる○Ｐｖの５ａｂｉｎ３組 成が２４９３番目のＣとＵの比率において非常に変化することが見いだされた。

ここで提示されたデータは、２４９３−Ｕ変異体の割合がどのようにしてワクチ ンロットの受容能に影響するかにつ（・では述べてｂ・なし・が、ＬＥＤ３　（ ２４９３−Ｃ＞とＶＲ３１８（２４９３−Ｕ）のウィルスを比較したデータは、 本結果が評価に使用した神経毒性検定法に依存することを示唆している。特に興 味深いのは、ＣＦＲの視床内構定法ではＬＥＤ３とＶＲ３１８を区別できること であった。

ＬＥＤ３またはＲ３Ｏ＋２ワクチンと比較して脳内でＶＲ３１８が異常に高い反 応性を示すことは、ウィルスが２４９３番目においてＵを持っている場合、ウィ ルスと脳組織の間の相互作用が高められていることを示唆している。ＷＨＯの検 定法では視床的経路の注入によるワクチンの評価は行っていないので、我々のデ ータは、この検定ではワクチンロット内の２４９３−Ｕ部分集団を検出できない 可能性があることを示唆している。

ポリメラーゼ連鎖反応を取り込んだ検出法が最近チュマコフ（Ｃｈｕｍａｋ。

Ｖ）ら（２）により使用され、総ウィルスの１．１７％以上を構成する４７２− Ｃ変異体を含むワクチンロフトがＷＨＯの神経毒性検定に不十分であることを決 定した。ＬＥＤ３およびＶＲ３１８の４７２番目における等優性の決定はウィル スＲＮＡ配列解析に基づくものであった。この方法を使用した場合、１０％の変 異体の部分集団が検出限界であることが決定された（２０）。より感度の高いＰ ＣＲ法であれば、ＬＥＤ３．ＶＲ３１８両方のウィルス調製品の４７２−Ｃ部分 集団を検出し得ると考えられる。しかしながらＬＥＤ３およびＶＲ３１８はクロ ーン化されたｃＤＮＡから等しい継代レベルを経ており、同一条件下で作製され たものなので、これらのウィルス試料が４７２−Ｃ変異体の比率において異なる というのはあまり考えられない。４７２−Ｃ変異体を検出するためのＰＣＲ法を 使用したＬＥＤ３とＶＲ３１８の評価では、これらの試料を区別することはでき ないことが示された。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ同様ｉｎ　ｖｉｖｏでも２４９３番目にＵをもつ５ａｂｉｎ３ 変異体の選択的優位性を支持するデータがいくつか出ている。ワクチン接種後５ 日目に回収した兄妹からの分離体ＫＷ４は、３ケ所において投与されたワクチン 株と異なる（４７２＝Ｃ，２４９３＝Ｕ、６０６１＝Ｕ／Ｃ）ことが示されてい る（２０）。ここで提示されたデータに基づくとその研究でＫＷ４について観察 された中間レベルの神経毒性は４７２同様２４９３番目における突然変異に帰属 することができる。Ｗｅ　ｅ　ｋ３　Ｌ　Ｃ”；　７ら（２４）は、弱毒化され た対照９゛　イルスＮＣＩをを髄内注入されたサルの神経組織（脳およびを髄） から回収された３つのウィルス分離体のうち２つが２４９３番目にＵをもつこと を見いだした。

分離体ＮＣｌ−６７９Ｂが４７２番目の弱毒化のＵを失わずに２４９３番目にＵ をもつことが、このウィルスが脳内で繁殖する機構に特異的に関係しているよう である。本データは、ＣＦＲの視床内法によって検定した際、ＬＥＤ３に比べて ＶＲ３１８の神経毒性が高いという観察と一致する。

２４９３番目のヌクレオチドにおけるＵからＣへの変化がＶＲ３１８と比べてＬ ＥＤ３を弱毒化する機構は不明である。この突然変異によりキャプシドタンパク 質■Ｐ１の６番目のアミノ酸が変更される。ポリオウィルスの３次元構造では、 ホーグル（Ｈｏｇｌｅ）ら（６）がｖＰｌのこの領域が天然のピリオンの内側に 埋まっていることを示している。最近では、フリックス（Ｆｒｉｃｋｓ）とホー グル（５）により、感受性細胞に付着する際にピリオンの形態が変化してキャプ シドタンパク質のＶＦ６が放出されＶＰＩのアミノ末端が外側に出ることが示さ れている。著者達はさらに、ＶＰｌのアミン末端の露出がリポソームへの付着に 必要であることを示しており、この現象が細胞への侵入の機構に何らかの役割を 果たしているという提案をだしている。こうした観察と一致して、キルケガール （Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ）（８）は、６番目の残基の両側にあるＶＰＩのアミノ 末端領域に異なる小さな欠失をもち、正常感染の際にキャプシドからウィルスＲ ＮＡを放出できなくなった２つのポリオウィルスの突然変異体について記載して いた。この欠失突然変異体は共に小プラークの表現型を示す。こうしたデータか ら、２４９３番目における５ａｂｉｎ３の突然変異はウィルスの脱外皮にも影響 していることが容易に推測される。

Ｓａｂ　ｉｎ３のＶＦ６　（２０３４）における突然変異に加え、弱毒化の決定 基が５ａｂｉｎｌのキャプシドタンパク質（１４）およびＳａｂ　ｉｎ２の近縁 であるタイプ２株（Ｐ２／７１２）（１６）にマツプされた。こうした他の突然 変異はキャプシドタンパク質ＶＰＩの中に見られるが、この研究で記載した構造 的な突然変異はＶＰＩのアミノ末端にマツプされた最初のものである。

本発明の多くの具象が上で記載されているが、基本的な構造を変更して、本発明 の過程、組み換えＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分へ形質転換した宿主に利用される他の 具象を供給し得るのはあきらかである。よって、本発明の範囲は前に実施例の方 法によって提示された特殊な具象によるのではなく、これから述べる請求の範囲 によって定義されるのが適当であろう。

ＣＥＲＮＶ検定操作を用いたＬＥＤ３及びＶＲ３１８株の神経毒性Ａ）を髄内１ 群　ウィルス　基質細胞　ヌクレオチド　サルの数　平均病変スコア４７２　２ ４９３番目 Ｉ　Ｒ５Ｐ＋２　ＰＣＭＫ　Ｕ　Ｃ２４０，５２２Ｒ３Ｏ＋２　ＶＥＲＯＵ　Ｃ １２０，３６３ＬＥＤ３＋２　ＶＥＲＯＵ　Ｃ１６０，３４４ＶＲ３１８＋２　 ＶＥＲＯＵ　Ｕ　１６　１．３１’ａｏ、２ｍｌのウィルス（力価≧７．６］ｏ ｇ　ＴＣＩＤ５ｏ／ｍｌ）をを髄内に投与 ｂ　ＡＮＯＶＡ検定により平均値検定により群４〉１．２．　３　（ｐ＜０．　 ０１）Ｂ）視床内。

群　ウィルス　基質細胞　ヌクレオチド　サルの数　ポジティブ（％）４７２　 ２４９３番目 ５　Ｒ５Ｏ’−，２ＰＣＭＫ　Ｕ　Ｃ１２０４６ＬＥＤ３＋２　ＶＥＲＯＵ　Ｃ １００７ＶＲ，３１８＋２　ＶＥＲＯＵ　Ｕ　１０　２０’ｃｏ、５ｍｌのウィ ルス（力価≧７．６］ｏｇ　ＴＣＩＤｓｏ／ｍｌ）を各大脳半球内の視床領域に 投与 ｄカイ二乗検定により７群〉５．６知＜Ｑ、０５）表２ ＷＨＯＮＶ検定操作を用いたＬＥＤ３およびＶＲ３１８株の神経毒性群　ウィル ス　基質細胞　ヌクレオチド　サルの数　平均病変スコア４７２　２４９３番目 Ｉ　ＬＥＤ３＋２　ＶＥＲＯＵ　Ｃ６０，２１′′２　ＮＣＩ’　ＶＥＲＯＵ　 Ｕ／Ｃ６１，０８３ＶＲ３１８＋２　ＶＥＲＯＵ　Ｕ　６　１．５１ａＱ、１ｍ ｌのウィルス（力価６５から７．５１ｏｇ　ＴＣＩＤｓｏ／ｍｌ）をを髄内に投 与 ｂ　ＡＮＯＶＡ検定により平均値検定により群２＜１．３ぐｐ＜０．１）ｃ　Ｎ Ｃ１（ＳＯ＋２）はＷＨＯＮＶ検定に使用される弱毒化されたタイプ３の対照で ある 参考文献 １、Ｐ　アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）、Ｊ、Ｃ，エンターライン（Ｅｎｔ ｅｒｌｉｎｅ）、Ｅ、Ｊ　ブー：／　（Ｂｏｏｎｅ）＆Ｍ、Ｊ、　クルツ（Ｋ　 Ｉ　ｕ　ｔ　ｃｈ）、１９８３．ＨＥｐ−２およびＶｅ　ｒｏ細胞培養における ポリオウィルスとポリオ抗体解析。Ｊ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄ、１１：９１−９ ７゜２、　Ｋ、、　Ｍ　チュマコフ（Ｃｈｕｍａｋｏｖ）、Ｌ、Ｂ、パワーズ（ Ｐｏｗｅｒｓ）、に、Ｅ　ヌーナン（Ｎｏｏｎａｎ）、Ｔ、Ｂ、ｏニソン（Ｒｏ ｎｉｓｏｎ）＆Ｌ　Ｓ、レーベンブック（Ｌｅｖｅｎｂｏｏｋ）、１９９１．改 変したヌクレオチド配列をもったウィルスの量と経口ポリオウィルスワクチンの 受容能に対するサルノ検定との間の相関関係。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ８８・１９９−２０３゜ ３６Ｅ、ドミンゴ（Ｄｏｍｉｎｇｏ）、１９８９．　ウィルス病の制御とＲＮＡ ウィルスの進化。Ｐｒｏｇ、Ｄｒｕｇ、Ｒｅｓ、３３：９３−１３３４、Ｇ、ダ ン（Ｄｕｎｎ）、Ｎ、Ｔ　ベツグ（Ｂｅｇｇ）、Ｎ、キャマック（Ｃａｍｍａｃ ｋ）＆Ｐ、Ｄ、フイナー（Ｍｉｎｏｒ）、１，９９０．２つのソースからの経口 生ポリオワクチンを用いた策１次ワクチン接種後の幼児によるウィルス発現と突 然変異。Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、３２：９２−９５５、Ｃ，Ｅ、７リンクス（ Ｆｒｉ　ｃｋｓ）＆Ｊ、Ｍ　ホーグル（Ｈｏｇｌｅ）１９９０　ポリオウィルス における細胞誘導性形態変化　ＶＰＩのアミノ末端の表面化はリポソーム結合に 関わっている。Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４：１９３４−１９４５゜ ６、Ｊ、　Ｍ、ホーグル（Ｈｏｇｌ　ｅ）、Ｍ　チャウ（Ｃｈｏｗ）＆Ｄ、Ｊ　 フィル７：／　（Ｆ　ｉ　１ｍａｎ）、１９８５．２．９Ａの分解能でのポリオ ウィルスの３次元構造。５ｃｉｅｎｃｅ　２２９＋１３５８−１３６５７、Ｏ， Ｍ、クー（Ｋｅｗ）、Ｂ、に、ノソティ　（Ｎｏ　ｔ　ｔ　ａｙ）、Ｍ、Ｈ，ハ ツチ（Ｈａｔｃｈ）、Ｊ、Ｈナカノ（Ｎａｋａｎｏ）＆Ｊ、Ｆ　オビジエスキ（ Ｏｂｉｊｅｓｋｉ）、１９８１．　ヒトの中で複製する際に経口ポリオワクチン に多様な変化が生じる。Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、５６：３３７−３４７゜８、 に、キに’ｒガール（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ）、１９９０　ポリオウィルスのＶ ＰＩでの突然変異はつ、イルスＲＮＡの包膜化と放出の両方に特異的に影響する 。

Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４・１９５−２０６９、　Ｍ、：＋ハラ（Ｋｏｈ　ａ　ｒ　 ａ）、Ａ、シップ（Ｓｈｉｎｏｂｕ）、Ｓ　クゲ（Ｋｕｇｅ）、Ｂ、Ｌ、セムラ ー（Ｓｅｍｌｅｒ）、Ｔ、コマツ（Ｋｏｍａｔｕ）。

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ハウブトマン（Ｈａｕｐｔｍａｎｎ）、Ｐ、ヒユーズ（Ｈｕｇｈｅｓ）、Ｌ、Ｄ 。

クラーク（Ｃ１ａｒｋｅ）、Ｒ，Ｃ，７ウントフオード（Ｍａｕｎｔｆｏｒｄ） 。

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ｓｉｕｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ａｇａ ｉｎｓｔ　Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、Ｗａｒｓａｗ、ｐｐ、３９Ｑ−３９７ ２０、Ｊ、　Ｍ、ターテム（Ｔａｔｅｍ）、Ｃウィークスーレビイ（Ｗｅｅｋｓ Ｌｅｖｙ）、Ｓ、Ｊ　メント（Ｍｅｎｔｏ）、Ｓ、Ｊ　ディミノエル（ＤｉＭｉ ｃｈｅｔｅ）、Ａ　ジョルノユ（Ｇｅｏｒｇｉｕ）、Ｗ、Ｆ、ウォーターフィー ルド（Ｗａｔｅｒｆ　１ｅｌｄ）、Ｂ　ンエイブ（Ｓｈｅ　ｉ　ｐ）、Ｃ，：ｌ スタラ。

ス（Ｃｏｓｔａｌａｓ）、Ｔ　ディビス（Ｄａｖ　ｉ　ｓ）　、　Ｍ、Ｂ　リッ チエイ（Ｒｉ　ｔｃｈｅｙ）＆Ｆ、Ｒ，カッ（Ｃａｎｏ）、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒ ｏｌ、（印刷中） ２１、Ｈトヨダ（Ｔｏｙｏｄａ）、Ｍ　コハラ（Ｋｏｈａｒａ）、Ｙ　カタオカ （Ｋａｔａｏｋａ）、Ｔ　スガヌ？　（Ｓｕｇａｎｕｍａ）、Ｔ、オマタ（○ｍ ａｔａ）、Ｎ　イムラ（Ｉｍｕｒａ）＆Ａ　ノモト（Ｎｏｍｏｔｏ）、１９８４ ゜３つのポリオウィルス全ての血清型のゲノムの完全なヌクレオチド配列　遺伝 的関係、遺伝子の機能、抗原決定基の推定。ＪｙＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、１７４：５ ６２２、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｃｏｄｅ　、ｏｆ　’Ｆｅｄｒａｌ　Ｒ ｅｇｕＩａｔｉｏｎｓ、１９９０．　ポリオウィルスワクチンの口内生存。Ｔｉ ｔｌｅ２１、Ｓｅａ、６３０．１０−１７゜ ２３．５　ファンデルヴエルフ（ｖａｎ　ｄｅｒ−Ｖｖ！、ｅｒｆ）、Ｊ　ブラ ッドリ（Ｂｒａｄｌｅｙ）、Ｅ　ウイマ−（Ｗｉｍｍｅ　ｒ）、Ｆ、Ｗ　ンユ’ ７デイエール（Ｓｔｕｄｉｅｒ）＆Ｊ、Ｊ　ダン（Ｄｕｎｎ）、１９８６．精製 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる伝染性ポリオウィルスＲＮＡの合成。Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：２３３０−２３３４゜２４　Ｃ，ウィーク スーレヴイ　（Ｗｅｅｋｓ−Ｌｅｖｙ）、Ｊ、Ｍ　ターテム（Ｔａｔｅｍ）、Ｓ 、Ｊ、ディミノエル（ＤｉＭｉｃｈｅ　ｌｅ）、Ｗ、ウォーターフィールド（Ｗ ａｔｅｒｆ　１ｅｌｄ）、Ａ、Ｆ　ジョルノｘ　（Ｇｅｏｒｇｉｕ）＆Ｓ。

Ｊ、メント（Ｍｅｎｔｏ）、投稿中。

２５、　Ｇ、　Ｄ、ウェスドロップ（Ｗｅｓ　ｔ　ｒａｐ）、に、Ａ　ウェアハ ム（Ｗａｒｅｈａｍ）、Ｄ、　Ｍ、Ａ、　工ヴアンス（Ｅｖａｎｓ）、Ｇ、ダン （Ｄｕｎｎ）、ＰＤ、マイナー（Ｍｉｎｏｒ）、Ｄ、１．７グラス（Ｍａｇｒａ ｔｈ）、Ｆ。

タフス（Ｔａｆｆｓ）、Ｓ、７−ズデン（Ｍａｒｓｄｅｎ）、Ｍ、Ａ、　スギナ −（Ｓｋｉｎｎｅｒ）、Ｇ、Ｃ，ノルド（Ｓｃｈ　ｉ　］　ｄ）　＆Ｊ、　Ｗ、 アーモンド（ＡＩｍｏｎｄ）、１９８９．５ａｂｉｎタイプ３経ロポリオウイル スワクチンの弱毒化の遺伝的基礎。Ｌ　Ｖｉｒｏｌ、６３：１３３８−１３４４ ２６　世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ） 。

１９９０、小児麻［（経口）ワクチンの必要性。Ｗ、　Ｈ，Ｏ，Ｔｅｃｈ、　Ｒ ｅｐＳｅｒ、８００：３０−３６ 浄書（内容に変更なし） 第１図 面分 浄書（内容に変更なし） 二＝コ　９８８年３月以前に分離とれたｃＤＮＡｓ浄書（内容に変更なし） 第３図 浄書（内πに変更なし）− 第４Ａ図 ｐＴ７　１　７８４ ＋　ｐＢＲ３２２を５５１）Ｔ　＆　ＥｃｏＲＩｌこより消化第４Ｂ図 上 Ｆｉｇｕｒｅ　６Ａ ＣＴにＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＣＣＧ ＧＡＣにＣＴＡＧＴｒＧＴＧＭＣＡＧＧＧＴＧＴＧ口ｇｕｒ・６Ｂ ＫＤＳＡＳＮＡＡＳＫＱＤＹ５ＱＤＰＳＩＣＦ口ｇｕｒ・６Ｃ Ｆｉｇｕｒｅ　６Ｄ 日ｇｕｒ・６ε Ｆｉｇｕｒｅ　６Ｆ Ｆｉｇｕｒｅ　６Ｇ ４７５０　＝、４７６０　４７７０　４７８０　４７９０　４８００＾ＧＧＣＡ ＴｒＣＴＧＴｒＣＡＣＡＴＣＣ入ＡＣＴＡＴＧＴ！ＴｒＡＧＣＣＴＣＣ入ＣＣＡ ＡＣＴＣＣＡＧＴＣＧＣＡＴＣＡＣＡＣＣＣＩＬＰＴＳＮＹＶＬＡＳＴＮＳＳＲ ＩＴＰＦｉｇｕｒｅ　６Ｈ ＶＭＧＥＹＳＲＤＧＫＬＮＭＡＭＡＴＥＴＣ工　ＱＬＭＤＫＳＳＲＶＲＹＳＶＤ ＱＩＴＴＭＧＰＬＱＹＫＤＬＫＫＤ　工　ＫＴＲＰＰＰＥＣＴ　工　ＬＱＡＶＴ ’ｌ’ＦＡＡＶＡＧＶ’ｌ／ＹＶＭＹＫＬＦＡＧＨＱＧＡＹＴＧＬＰＮＫＲＰＮ ＶＦｉｇｕｒｅ　６ｇ Ｆｉｇｕｒ・ジ Ｆｉｇｕｒｅ　６Ｋ Ｆｉｇｕｒｅ　７ａ ｐ５１１　Ｐｖｕ　１ Ｆｉｇｕｒｅ　７Ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　８ ６６゜２＞ ５Ｉ− ＝　−、、ＶＰＩ ３１、　−−一・ＶＦ６ −−　＠ＩＩＩ　−ｍ　’ｆＰ５ Ｆｉｇｕｒｅ　９ 浄書（内容に変更なし） 第１０図 感染後の時間／時間 浄書（内容に変更なし） 第１１図 培養期間（臼） 要約書 本発明は、ＲＮＡウィルスのｃＤＮＡ製造法、生存可能なＲＮＡウィルスの製造 法、およびこれらの方法により製造された生存可能なＲＮＡウィルスに関する。

新規ＲＮＡウィルスのｃＤＮＡ、そのｃＤｊ’ＪＡを含む組換えＤＮＡ分子、お よびこれらの組換えｃＤＮＡ分子により形質転換された宿主について記述してい る。

ストレイン３のポリオウィルスの変異体の新規スクリーニング法、および兄妹の ポリオウィルスの弱毒化法について記述している。本発明は、感染性ポリオウィ ルスに対する被検者を免疫するために有用なワクチンを提供するが、その際該ワ クチンは有効量のＲＮＡウィルスおよび適切なキャリアーを含む。被検者に適切 な量の上記ワクチンを投与することにより、感染性ポリオウィルスに対する被検 者を免疫する方法を記述している。

手続補正書（方式） 平成　５年　２月　５日りツ

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）ソースとなるＲＮＡウイルスからゲノムＲＮＡを分離し、（ｂ）ＲＮ Ａシークエンス注の使用により分離した該ゲノムＲＮＡの一部の塩基配列を決定 し、 （ｃ）ｃＤＮＡ合成法の使用により分離した該ゲノムＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡ を生産し、 （ｄ）ＤＮＡシークエンス法の使用により該ｃＤＮＡの一部の塩基配列を決定し （該ｃＤＮＡの該部分は過程（ｂ）でシークエンスした上記ＲＮＡの上記部分に 相当する）、 （ｅ）シークエンスした上記ｃＤＮＡをシークエンスした上記ＲＮＡと比較する ことにより塩基配列上の差異を決定し、（ｆ）上記ｃＤＮＡの上記差異を改変し ＲＮＡウイルスの正確なｃＤＮＡを生産する 過程からなるＲＮＡウイルスの正確なｃＤＮＡを生産するための方法。
2. ２．ソースとなる該ＲＮＡウイルスがピコルナウイルスである、請求の範囲第１ 項記載の方法。
3. ３．ソースとなる該ＲＮＡウイルスがワクチン株３のポリオウイルスである、請 求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．過程（ｂ）でシークエンスしたＲＮＡの上記部分がワクチン株３のポリオウ イルスのヌクレオチド２４９３からなる、請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．上記ＲＮＡが約１００から２００ヌクレオチドからなる、請求の範囲第４項 記載の方法。
6. ６．分離したウイルスＲＮＡの全体の塩基配列が過程（ｂ）で決定された、請求 の範囲第１項記載の方法。
7. ７．請求の範囲第１項記載の方法により生産された真のＲＮＡウイルスのｃＤＮ Ａ。
8. ８．ワクチン株３のポリオウイルス由来の真のＲＮＡウイルスｃＤＮＡであり、 該ｃＤＮＡは （ａ）ｐＬＥＤ３．２および （ｂ）ｐＬＥＤ３．２にコードされるポリペプチドをコードするｃＤＮＡからな るグループから選択される。
9. ９．（ａ）ソースとなるＲＮＡウイルスからゲノムＲＮＡを分離し、（ｂ）ＲＮ Ａシークエンス法の使用により分離した該ゲノムＲＮＡの一部の塩基配列を決定 し、 （ｃ）ｃＤＮＡ合成法の使用により分離した該ゲノムＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡ を生産し、 （ｄ）ＤＮＡシークエンス法の使用により該ｃＤＮＡの一部の塩基配列を決定し （該ｃＤＮＡの該部分は過程（ｂ）でシークエンスした上記ＲＮＡの上記部分に 相当する）、 （ｅ）シークエンスした該ｃＤＮＡをシークエンスした上記ＲＮＡと比較するこ とにより塩基配列上の差異を決定し、そして（ｆ）該ｃＤＮＡの該差異を改変し ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡを生産する過程からなるＲＮＡウイルスのｃＤＮＡを 生産するための方法。
10. １０．ソースとなる上記ＲＮＡウイルスがピコルナウイルスである、請求の範囲 第９項記載の方法。
11. １１．ソースとなる上記ＲＮＡウイルスがワクチン株３のポリオウイルスである 、請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．過程（ｂ）でシークエンスしたＲＮＡの上記部分がワクチン株３のポリオ ウイルスのヌクレオチド２４９３からなる、請求の範囲第９項記載の方法。
13. １３．上記ＲＮＡが約１００から２００ヌクレオチドからなる、請求の範囲第１ ２項記載の方法。
14. １４．分離したウイルスＲＮＡの全体の塩基配列が過程（ｂ）で決定されること を特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。
15. １５．請求の範囲第９項記載の方法により生産されたＲＮＡウイルスのｃＤＮＡ 。
16. １６．ワクチン株３のポリオウイルス由来のＲＮＡウイルスのｃＤＮＡであり、 該ｃＤＮＡは （ａ）ｐＬＥＤ３．２および （ｂ）ｐＬＥＤ３．２にコードされるポリペプチドをコードするｃＤＮＡからな るグループから選択される。
17. １７．請求の範囲第７、８、１５または１６項のいずれか１項に記載のＲＮＡウ イルスのｃＤＮＡからなる組み換えＤＮＡ分子。
18. １８．上記ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡを機能するようにＲＮＡ転写プロモーター につなげることを特徴とする、請求の範囲第１７項記載の組み換えＤＮＡ分子。
19. １９．上記プロモーターがＴ７プロモーターである、請求の範囲第１８項記載の 組み換えＤＮＡ分子。
20. ２０．宿主が細菌、酵母およびその他の菌類、昆虫細胞、動物細胞を含むグルー プから選択される、請求の範囲第１７または１８項記載の組み換えＤＮＡ分子で 形質転換された宿主。
21. ２１．宿主が、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ−１細胞、サル の腎臟の初代培養細胞を含むグループから選択される、請求の範囲第２０項記載 の宿主。
22. ２２．宿主が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求の範囲第２０項記載の宿主。
23. ２３．（ａ）成育可能なＲＮＡウイルスを生産しうる条件下で請求の範囲第２０ 項記載の宿主を培養し、 （ｂ）成育可能な該ＲＮＡウイルスを該宿主細胞の培養液から回収する過程から なる成育可能なＲＮＡウイルスを生産するための方法。
24. ２４．（ａ）請求の範囲第７、８、１５または１６項のいずれか１項に記載の組 み換えＤＮＡ分子から、ｉｎｖｉｔｒｏ転写法を使用してＲＮＡを生産し、（ｂ ）該ＲＮＡを分離し、 （ｃ）分離したＲＮＡを宿主（該宿主は動物細胞）にトランスフェクトし、（ｄ ）該宿主を成育可能なＲＮＡウイルスを生産しうる条件下で培養し、そして （ｅ）成育可能な該ＲＮＡウイルスを該宿主細胞の培養液から回収する過程から なる成育可能なＲＮＡウイルスを生産するための方法。
25. ２５．上記ＲＮＡウイルスがワクチン株３のポリオウイルスである、請求の範囲 第２３または２４項記載の方法。
26. ２６．宿主がサルの腎臟の初代培養細胞である、請求の範囲第２３または２４項 記載の方法。
27. ２７．（ａ）上記ポリオウイルスからゲノムＲＮＡを分離し、（ｂ）ＲＮＡシー クエンス法を使用して２４９３番目のヌクレオチドを決定する過程からなる、株 ３のポリオウイルスの変異体をスクリーニングする方法。
28. ２８．ｃＤＮＡが２４９２番目から２４９４番自においてＡＴＴのヌクレオチド 配列を含む、該ｃＤＮＡの２４９３番目のヌクレオチドをＴからＣに変える突然 変異導入の過程を含む該方法により、ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡによりコードさ れる株３のポリオウイルスの弱毒性を増加させるための方法。
29. ２９．上記ｃＤＮＡの２４９４番自のヌクレオチドをＴから、Ａ．Ｃ．Ｇからな るグループから選択されるヌクレオチドに変える突然変異導入の過程を更に含む 、請求の範囲第２８項記載の方法。
30. ３０．（ａ）請求の範囲第８または１６項記載のＲＮＡウイルスのｃＤＮＡを動 物細胞である宿主にトランスフェクトし、 （ｂ）成育可能なＲＮＡウイルスを生産しうる条件下で宿主を培養し、（ｃ）成 育可能な該ＲＮＡウイルスを該宿主細胞の培養液から回収する過程からなる成育 可能なＲＮＡウイルスを生産するための方法。
31. ３１．該ＲＮＡウイルスがワクチン株３のポリオウイルスである、請求の範囲第 ３０項記載の方法。
32. ３２．上記宿主がサルの腎臟の初代培養細胞である、請求の範囲第３０項記載の 方法。
33. ３３．（ａ）請求の範囲第２０項記載の宿主を成育可能なＲＮＡウイルスを生産 しうる条件下で培養し、 （ｂ）成育可能な該ＲＮＡウイルスを該宿主細胞の培養液から回収する過程によ って生産される成育可能なＲＮＡウイルス。
34. ３４．（ａ）請求の範囲第１７または１８項記載の組み換えＤＮＡ分子から、ｉ ｎｖｉｔｒｏ転写法を使用してＲＮＡを生産し、（ｂ）該ＲＮＡを分離し、 （ｃ）分離したＲＮＡを動物細胞である宿主にトランスフェクトし、（ｄ）該宿 主を成育可能なＲＮＡウイルスを生産しうる条件下で培養し、（ｅ）成育可能な 該ＲＮＡウイルスを該宿主細胞の培養液から回収する過程によって生産される成 育可能なＲＮＡウイルス。
35. ３５．上記ＲＮＡウイルスがワクチン株３のポリオウイルスである、請求の範囲 第３３または３４項記載のＲＮＡウイルス。
36. ３６．上記宿主がサルの腎臟の初代培養細胞である、請求の範囲第３３または３ ４項記載のＲＮＡウイルス。
37. ３７．（ａ）請求の範囲第８または１６項記載のＲＮＡウイルスの正確なｃＤＮ Ａを動物細胞である宿主にトランスフェクトし、（ｂ）該宿主を成育可能なＲＮ Ａウイルスを生産しうる条件下で培養し、（ｃ）成育可能な該ＲＮＡウイルスを 該宿主細胞の培養液から回収する過程によって生産される成育可能なＲＮＡウイ ルス。
38. ３８．上記ＲＮＡウイルスがワクチン株３のポリオウイルスである、請求の範囲 第３７項記載のＲＮＡウイルス。
39. ３９．上記宿主がサルの腎臓の初代培養細胞の場合の請求の範囲第３７項記載の ＲＮＡウイルス。
40. ４０．（ａ）ウイルスをコードする組み換え核酸配列で、適当な宿主細胞を形質 転換し、 （ｂ）ウイルスの生産が可能な条件で宿主細胞を培養し、（ｃ）生産されたウイ ルスを分離する ことにより生産された、被験体および適当な媒介体の免疫処理に有効である、有 効量のＲＮＡウイルスを含み、被験体を免疫処理するのに有用な、伝染性ポリオ ウイルスに対するワクチン。
41. ４１．被験体がヒトである場合の請求の範囲第４０項記載のワクチン。
42. ４２．請求の範囲第４１項記載のワクチンの適量を被験体に投与することからな る、伝染性ポリオウイルスに対する被験体の免疫処理法。
43. ４３．ワクチンを筋肉投与、静脈投与、皮下投与、気管内投与、または鼻腔内投 与により投与することを特徴とする、請求の範囲第４２項記載の、伝染性ポリオ ウイルスに対する被験体の免疫処理法。
44. ４４．被験体がヒトである、請求の範囲第４２項記載の方法。