NO303943B1 - RNA-virus fra cDNA fra et vaksinestamme 3 poliovirus, rekombinant DNA-molekyl, vert og fremgangsmÕte for fremstilling av et terapeutisk aktivt levedyktig RNA-virus - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører sant RNA-virus cDNA avledet fra et vaksinestamme 3 pollovlrus, rekombinant DNA-molekyl, vert transformert med et rekombinant DNA-molekyl og fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt levedyktig RNA-virus.

I denne søknaden er forskjellige referanser blitt referert til innenfor parenteser eller med arabiske tall i parenteser. Fullstendige bibliografiske siteringer for disse publika-sjonene som blir referert til ved arabiske tall kan finnes i slutten av beskrivelsen. Beskrivelsene av disse publika-sjonene er i sin helhet inkorporert heri som referanse og de beskriver teknikkens stand som foreliggende oppfinnelse vedrører.

Humane enteroviruser som hører til familien Picornaviridae er kjennetegnet ved et enkelt-trådet positivt RNA-genom. Medlemmer fra denne virale familien inkluderer pollovlrus, echoviruser, coxackiviruser og rhinoviruser. Blant disse virusene er pollovlrus blitt mest studert.

Poliovirus er kjent for å være det midlet som forårsaker poliomyelitt, en paralytisk sykdom innen sentralnerve-systemet. Dette viruset er kjent for å eksistere i tre stabile serotyper, 1, 2 og 3. I over 25 år er denne sykdom blitt kontrollert ved anvendelse av både Sabin oral levende-attenuert vaksine og Salk inaktivert virusvaksine. Sabin-vaksinen består av attenuert virus fra hver serotype, og ingen av disse har evnen til å forårsake sykdom. Stammene anvendt for å produsere vaksinen ble dannet ved en kombinasjon av omfattende in vivo- og in vitro-passering av hver av de tre villtype-stammene gjennom apevev. Ved oral administrering replikerte det levende viruset innbefattet i Sabin-vaksinen i tarmen og indusert dermed både systemisk og lokal immunitet. Den drepte virus (Salk)-vaksinen, som blir administrert intramuskulært, er begrenset til å indusere systemisk immunitet.

Til tross for at Sabin-vaksinen er betraktet å være en trygg og effektiv beskyttelse overfor poliomyelitt, har et lite antall mottagere utviklet vaksine-assosiert sykdom.

I et forsøk på å forstå det molekylære grunnlaget for attenuering og reversjon, ble nukleotidsekvensene til cDNA som tilsvarer hver av de tre attenuerte stammene og deres villtype-forløpere sammenlignet [A. Nomoto et al., "Complete Nucleotide Sequence of the Attenuated Sabin 1 Strain Genome", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79, s. 5793-97 (1982); G. Stanway et al. , "Nucleic Acid Sequence of the Region of the Genome Encoding Capsid Protein VP1 of Neurovirulent and Attenuated Type 3 Polioviruses", Eur. J. Biochem. , 135, s. 529-33

(1983); G. Stanway et al., "Comparison of the Complete Nucleotide Sequences of the Genomes of the Neurovirulent Pollovlrus P3/Leon/37 and its Attenuated Sabin Vaccine Derivative P3/Leon 12ab", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79, s. 1539-43 (1984); og H. Toyoda et al., "Complete Nucleotide Sequences of All Three Pollovlrus Serotype Genomes", J. Mol. Biol., 174, s. 561-585 (1984)]. De observerte forskjellene i nukleotidsekvens mellom hver villtype-forløper og dennes resulterende attenuerte stamme ble deretter ytterligere analysert for å bestemme deres forhold til attenuerings-fenomenet.

I serotype 3 var den attenuerte stammen f.eks. forskjellig i forhold til villtype-stammen med bare 10 punktmutasjoner [G. Stanway et al., (1984), supra]. Fra disse forskjellene var bare forandringene i nukleotidposisjonene 472 og 2034 antatt å være sterkt knyttet til attenuering [D.M.A. Evans et al., "Increased Neurovirulence Associated With A Single Nucleotide Change In A Noncoding Region of the Sabin Type 3 Pollovlrus Genome", Nature, 314, s. 548-50 (1985); G.D. Westrop et al., "Genetic Basis of Attenuation of the Sabin Type 3 Oral Pollovlrus Vaccine", J. Virol., 63, s. 1338-44 (1989)].

Før identifikasjonen av nukleotidene som er koblet til attenuering, ble det demonstrert at cDNA syntetisert fra et viral RNA-templat ("RNA-virus cDNA") kunne bli anvendt for å produsere levedyktige pollovlrus etter transfeksjon av pattedyrceller [V.R. Rancaniello et al., "Cloned Pollovlrus Complementary DNA Is Infectious In Mammalian Cells", Science, 214, s. 916-19 (1981)]. Slike observasjoner skapte muligheten av å produsere forbedrede poliovaksiner via genetiske omkonstrueringsteknikker. Dette kunne bli oppnådd ved å endre cDNA rundt de viktige nukleotidene for å minimalisere reversjon til villtype-nukleotidet, mens strukturell og funksjonell integritet til virus ble opprettholdt.

Til tross for oppdagelsen om at RNA-virus cDNA kan bli anvendt for å produsere levedyktige virus, har det aldri blitt demonstrert at disse cDNA er nøyaktige kopier av viralt RNA til stede i villtype eller vaksinevirus. Anvendelse av cDNA-sekvenser for å bestemme hvilke nukleotider er koblet til attenuering, kan ha forårsaket at en eller flere kritiske seter er blitt oversett. Dette skyldes at prosessen anvendt for å produsere cDNA, dvs. revers transkripsjon, er kjent for å danne feil [I.M. Verma, "Reverse Transeriptase", In The Enzymes, bind 14, P.D. Boyer, utg., Academic Press, New York, s. 87-104 (1981)].

Det eksisterer derfor et behov for produksjon av RNA-virus cDNA som er komplementære med vaksinevirus RNA. Anvendelse av unøyaktige RNA-virus cDNA kan resultere i redusert attenuering dersom disse cDNA blir anvendt for å produsere vaksiner, såsom poliovaksiner.

Genomet til poliovirus er et enkelt-trådet RNA-molekyl av pluss-tråd som er omtrent 7500 nukleotider i lengde. Feilen som ofte er assosiert med replikasjon av enkelt-trådet RNA, som for poliovirus, er spesielt høy sammenlignet med den til dobbelt-trådet DNA (3). På grunn av denne iboende egenskapen, må hver preparering av poliovirus inkludert det opprinnelige Sabin (SO )-stammene bli betraktet som genotypisk heterogene.

Dyrkningsbetingelser (dvs. temperatur, cellesubstrat) samt homogenitet til input-viruset influerer sannsynligvis på hvilken genotype som det er mest av i løpet av ampiifikasjon av en poliovirusprøve. Det er derfor ikke overraskende at autoriteter som regulerer fremstilling av OPV (dvs. FDA og WHO) dikterer strenge regler vedrørende produksjon av fremstilling av avkom samt passasjenivået av avkom representert i vaksine (22, 26). Disse reglene ble satt under virkning som et forsøk på å minimalisere seleksjon og amplifikasjon av mindre attenuerte variantstammer.

Det er blitt dokumentert at den attenuert fenotypen av Sabin 3-stammen er mindre genetisk stabil enn type 1- og 2-vaksinestammer (4, 7, 11). I den senere tiden er det fremkommet et nytt fremstillingsavkom (RSO) avledet fra det opprinnelige Sabin 3-viruset ved selektering av en plakk produsert i Vervet apenyrecellemonolag fra ekstrahert infektiøs RNA (19). Isolatet ble valgt basert på øket stabilitet av følsomheten ved dyrkning ved 40,3°C (rct-markør) i løpet av seriepassering samt øket attenuering i aper. Følsomheten for vekst ved temperaturer over 37°C (rct-markør) blir enda anvendt som en in vitro-biologisk test for å analysere kvaliteten til vaksinestammer (13).

En rapport av Kohara et al. (9) foreslår at en infektiøs cDNA-klon kan bli anvendt for å konservere konstantheten og kvaliteten til Sabin 1-slekt. Det er sannsynlig at en lignende tilnærmelse også kan være fordelaktig for attenuert type 3-stamme. Inntil nylig inneholdt litteraturen to cDNA-sekvenser for Sabin 3 som var forskjellige ved nukleotidposisjonene (17, 21). Divergensen mellom disse sekvensene kan være forårsaket av det faktum at passasjederivater og klonale isolater av Sabin 3 istedenfor virkelige vaksinevirus ble anvendt for å danne cDNA-kloner.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en vaksine nyttig for immunisering av et individ, f.eks. et menneske, overfor infektiøs poliovirus, hvori vaksinen omfatter en effektiv mengde av en RNA-virus, produsert ved transformasjon av en egnet vertscelle med en rekombinant nukleinsyresekvens som koder for viruset; og isolering av viruset produsert på denne måten, som er effektiv for å immunisere individet.

Et individ såsom et menneske kan immuniseres overfor infektiøs poliovirus, ved administrering til individet en egnet dose av vaksinen beskrevet ovenfor.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 angir en kromatografisk profil av første-tråd cDNA

syntetisert fra poliovirus stamme 3 RNA fra en Sepharose CL-4B-kolonne.

Figur 2 viser cDNA-kloner som kunne bli kartlagt til

P3/Sabin-genomet.

Figur 3 angir strategien for sammenstilling av delvis cDNA

til et enkelt, full-lengde P3/Sabin cDNA ifølge oppf innelsen.

Figur 4 (panelene A og B), og

figur 5 viser sammen strategien for mutagenisering av PS/Sabin cDNA og konstruering av et sant, full-lengde PS/Sabin cDNA ifølge oppfinnelsen.

Figur 4, panel C, angir følgende. Sekvensen til pLED3 angitt i figur 6, A-K ble avledet fra fullstendig analyse av pVR318 som deretter ble endret i posisjon 2493 ved utveksling av et SacI/HindIII-fragment fra samme subklon (pLL3-271) anvendt for å konstruere pVR318. Bekreftende sekvensering av hele cDNA-sekvensen i plasmid pLED3 viste en ytterligere "A" (adenosin) i en region hvor en kjøring av seks A normalt finnes i det virale genomet (posisjon 4133-4138). Det feilaktige "A" ble også funnet å subklon pLL3-271. pLL3-271 og pBr318 ble manipulert for å danne pLED3.2 som inneholder det riktige antallet A i dette setet.

For å rekonstruere pLED3 med riktig antall A, ble SacI/- HindIII-fragmentet fra pLL3-271 anvendt ovenfor klonet inn i bakteriofag M13 for oligonukleotid-rettet delesjonsmutage-nese. Et oligonukleotid som dekker nukleotidene 4121-4150 ble syntetisert for denne hensikten. Oligonukleotidet har sekvensen: 5'-CGCCTCAGTAAATTTTTTCAACCAACTATC-3 ' .

Mutagenesen ble utført ved anvendelse av et "T7-GEN In Vitro Mutagenesis Kit" (United States Biochemical, Cleveland, Ohio) og ved å følge fremstillerens anbefalinger. Det mutageniserte innskuddet ble betegnet CB2 og ble demonstrert å ha seks A i posisjonene 4133-4138 samt C i 2493 ved sekvensanalyse. Den riktige full-lengde-konstruksjonen ble dannet ved ligering av SacI/Hindlll-fragmentet til CB2 til SAcI/Hindlll delvis spaltningsfragmentet til pVR318 som var blitt anvendt i den opprinnelige pLED3-konstruksjonen. Produktet fra denne ligeringen ble betegnet pLED3.2. Hele cDNA-sekvensen til pLED3.2 er blitt verifisert å matche sekvensen rapportert i figur 6, A-K. Figur 6, panelene A til og med K, angir nukleotidsekvensen til en sann type 3 pol iovirusvaksinestamme cDNA ifølge oppfinnelsen. Figur 7, panel A, viser strukturen til plasmidet som inneholder full-lengde LED3 cDNA og T7 RNA-polymerasepromoter. Det store skraverte området representerer poliovirus cDNA. Det lille åpne området indikerer T7-promoteren (pT7) og startsetet for in vitro positive polaritetstranskriptene til cDNA. Plasmidet ble spaltet med Pvul (seter vist) før "run-off"-transkripter blir syntetisert. Panel B viser RNA transkribert fra cDNA-kloner ved renset T7-RNA-polymerase. Deler av transkripsjonsreaksjonsblandingen ble analysert ved elektroforese i en 0, 6% agarosegel som beskrevet i Materialer og Metoder, eksempel 13. Kolonnene 1-3 representerer 0,75 jjg, 0,50 jjg og 0,25 pg 7,5 kb ssRNA-markør. Hindi II-spaltet fag-X-DNA er vist i kolonne 4. Kolonnene 5 og 6 demonstrerer transkripsjonsreaksjoner inneholdende Pvul-spaltet pLED3- og pVR318-templater. RNA ekstrahert fra pelleterte viruser er vist i kolonne 7. Figur 8 viser SDS-polyakrylamidgelelektroforese av LED3 og VR318 cDNA-avledede viruser. En [<35>S]metionin-merket prøve ble preparert og applisert i hver kolonne og oppløst ved elektroforese som beskrevet nedenfor. Gelen ble tørket og proteinbåndene visualisert ved autoradiografi. LED3-virus i kolonne "A"; VR318-virus i kolonnene "B". Posisjonene til de forfarvede molekylvektsmarkørene (kilodalton) er indikert til venstre. Posisjonene til virale kapsidproteiner er identifisert til høyre. Figur 9, angir plassfenotypen til Leon (vill-type), VR318- og LED3-viruser på Vero-celler. Etter inkubasjon ved 33,5°C i 3 dager under 1,0$ næringsagar, ble cellene farvet med nøytralrød for å visualisere plakkene. Figur 10 angir kinetikken til virusvekst ved 33,5°C. Vero-cellemonolagene ble infisert ved en MOI på 4, og det ekstracellulære mediet ble høstet ved de angitte tidene etter Infeksjon. Plakkanalysene ble anvendt for å bestemme titeret til infektiøse partikler pr. ml som beskrevet i Materialer og Metoder, eksempel 13.

Figur 11 angir termisk stabilitet til LED3- og VR318-virus ved forskjellige temperaturer. Virusprøver inneholdende omtrent IO<7>»<3>pfu/ml ble inkubert ved 22°C (sirkel), 37"C (kvadrat) og 42" C (trekant). Prøvene ble periodevis fjernet og titeret til infektiøs virus ble bestemt ved plakkanalyser. Åpne markører, LED3; fylte markører VR318.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig sant RNA-virus cDNA avledet fra et vaksinestamme 3-poliovirus, kjennetegnet ved at nevnte cDNA har U i posisjon 2493 og velges fra gruppen bestående av:

(a) pLED3.2; som angitt i figur 7a og

(b) cDNA som ved ekspresjon koder for polypeptidene som

blir kodet ved ekspresjon av pLED3.2.

Det er videre beskrevet et rekombinant DNA molekyl kjennetegnet ved at det omfatter et RNA-virus cDNA ifølge krav 1, som er operabelt bundet til en promoter, som eventuelt er T7-promoteren, istand til å dirigere ekspresjon av nevnte RNA virus cDNA.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også vert transformert med et rekombinant DNA-molekyl som angitt ovenfor kjennetegnet ved at nevnte vert velges fra gruppen bestående av bakterier, gjær, sopp, insektsceller og dyreceller.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt levedyktig RNA-virus, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn:

(a) anvendelse av ln vitro-transkripsjonsmidler for å fremstille RNA fra et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av ovennevnte krav; (b) isolering av RNA; (c) transf ekter ing av en vert med nevnte isolerte RNA, hvori nevnte vert er en dyrecelle; (d) dyrking av nevnte vert ifølge krav 3 under betingelser som muliggjør produksjon av levedyktige RNA-virus; og (e) høsting av nevnte levedyktige RNA-virus fra nevnte

vertscellekultur.

Sant RNA-virus cDNA kan fremstilles omfattende følgende trinn: (a) isolering av genomisk RNA fra en RNA-kildevirus; (b) anvendelse av RNA-sekvenseringsmidler for å bestemme nukleotidsekvensen til en del av isolert genomisk RNA; (c) anvendelse av cDNA-syntesemidler for å produsere et

dobbelt-trådet cDNA fra isolert genomisk RNA;

(d) anvendelse av DNA-sekvenseringsmidler for å bestemme nukleotidsekvensen til en del av cDNA, hvori den delen av cDNA tilsvarer den delen av RNA sekvensert

i trinn (b);

(e) sammenligning av sekvensert cDNA med sekvensert RNA

for å bestemme gjeldende forskjeller i nukleotidsekvens; og

(f) endring av gjeldende forskjeller i cDNA for å danne

et sant RNA-virus cDNA.

Et sant RNA-virus cDNA eller et RNA-virus cDNA kan f.eks. bli produsert som er avledet fra et vaksinestamme 3 poliovirus, idet cDNA blir valgt fra det som er innbefattet i et nytt plasmid betegnet pLED3.2 eller pLED3, eller cDNA som ved ekspresjon koder for polypeptldene kodet for ved ekspresjon av pLED3.2 eller pLED3, og rekombinant DNA-molekyl produsert derved.

Det rekombinante DNA-molekylet kan være operabelt bundet til en promoter av RNA-transkripsjon. Egnede promotere omfatter, men er ikke begrenset til T7-promoteren.

En vert transformert med et rekombinant DNA-molekyl beskrevet ovenfor er også tilveiebragt Ifølge denne oppfinnelsen, hvori verten blir valgt fra gruppen bestående av bakterier, såsom E. coli, gjær og andre sopp, insektsceller og dyreceller. Egnede dyreceller omfatter, men er ikke begrenset til Vero-celler, HeLa-celler, COS-celler, CV-l-celler og primære apenyreceller.

Videre tilveiebragt ved denne oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av et levedyktig RNA-virus omfattende trinnene: (a) dyrking av en vert beskrevet ovenfor under betingelser som muliggjør produksjon av levedyktige

RNA-virus; og

(b) høsting av levedyktige RNA-virus fra vertscellekulturen.

RNA-virus kan være en vaksinestamme 3 poliovirus og den rekombinante nukleinsyresekvensen er en rekombinant infektiøs full-lengde nukleinsyresekvens som koder for viruset; dyrking av vertscellen under betingelser som muliggjør produksjon av virus og isolering av viruset produsert på denne måten.

Det er mulig å øke attenueringen av et stamme 3 poliovirus kodet for av et RNA-virus cDNA, hvori cDNA omfatter nukleotidsekvens ATT i posisjonene 2492 til 2492, idet fremgangsmåten omfatter trinnene mutagenisering av cDNA ved nukleotid 2493 for å forandre T til C. Videre kan det omfatte trinnet som omfatter mutagenisering av cDNA ved nukleotid 2494 for å forandre T til et nukleotid valgt fra gruppen bestående av A, C og G.

En vaksine nyttig for immunisering av et individ, f.eks. et menneske, overfor infektiøs poliovirus, kan fremstilles hvori vaksinen omfatter en effektiv mengde av et RNA, produsert ved transformering av en egnet vertscelle med en rekombinant nukleinsyresekvens som koder for viruset; dyrking av vertscellen under betingelser som muliggjør for produksjon av virus; og isolering av viruset produsert på denne måten, effektivt for å immunisere individet, og en egnet bærer. RNA-viruset kan være en vaksinestamme 3 polyvirus og den rekombinante nukleinsyresekvensen er en rekombinant infektiøs full-lengde nukleinsyresekvens som koder for vaksinestamme 3 poliovirus.

Den rekombinante nukleinsyresekvensen som koder for RNA-virus kan være en DNA-sekvens, eller en RNA-sekvens eller i den foretrukne utførelsesformen ifølge oppfinnelsen, er den rekombinante nukleinsyresekvensen er en cDNA-sekvens. Egnede cDNA er plasmider betegnet pLED3.2 eller pLED3, der hver inneholder en promoter-bundet cDNA-nukleinsyresekvens som koder for vaksinestamme 3 poliovirus. Plasmid pLED3 ble deponert til American Type Culture Collection (ATCC), beliggende ved 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, under forutsetningene til Budapest Treaty av "the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure". Plasmidet pLED3 ble betegnet med aksesjonsnr. 40789. Plasmid pLED3.2 ble også deponert til ATCC under forutsetningene til Budapest-avtalen og fikk tildelt et aksesjonsnummer.

Egnede vertsceller omfatter, men er ikke begrenset til bakterier, såsom E. Coli, gjær og andre sopp, insektsceller og dyreceller.

Egnede dyreceller omfatter, men er ikke begrenset til Vero-celler, HeLa-celler, COS-celler, CV-l-celler og primære apenyreceller.

Egnet bærer kan være et fysiologisk balansert kulturmedium, såsom saltvann inneholdende stabiliserende midler, f.eks., dekstrose og laktose, eller andre ikke-toksiske forbindelser. Disse vaksinene kan også bli formulert med en egnet adjuvant såsom alum. For fremgangsmåter for vaksinepreparering, se J.I. Duffy, Vaccine Preparation Techniques, Noyes Data Corporation (1980), og G.W. Warr, "Preparation of Antigens and Principles of Immunization", i J.J. Marchalonis og G.w. war, utg. , Antibody As A Tool - The Applications of Immuno-chemlstry, s. 21-58, John wiley & Sons (1982).

RNA-vlrus kan også bli desikert, f.eks., ved frysetørking for lagring eller for påfølgende formulering til flytende vaksiner.

Ved immunisering av et individ såsom et menneske overfor infektiøs poliovirus, kan fremgangsmåten omfatte administrering til individet en egnet dose av vaksinen. Egnede fremgangsmåter for administrering av vaksiner er velkjent for fagfolk innenfor dette området. Slike fremgangsmåter kan f.eks. omfatte, men er ikke begrenset til, intramuskulær, intravenøs, subkutan, intratrakeal eller intranasal administrering.

I tillegg er den effektive immuniseringsmengden en mengde som er nødvendig for å vekke produksjon av antistoffer i individet for derved å utøve beskyttelse individet overfor infektiøs poliovirus eller poliomyelitt.

Referanser til spesifikke nukleotider i cDNA-molekyler er overfor nukleotider til stede på den kodende tråden til cDNA, dvs. tråden som har en sekvens som er ekvivalent med posisjonen RNA-tråden til et RNA-virus. Referanser til spesifikke nukleotidposisjonstall i stamme 3 poliovirus tilsvarer nukleotidnummereringssystemet til G. Stanway et al., "Comparison of the Complete Nucleotide Sequences of the Genomes of the Neurovirulent Poliovirus P3/Leon/37 and its Attenuated Sabin Vaccine Derivative P3/Leon 12alb", Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 81, s. 1539-43 (1984). Følgende standardforkortelser blir anvendt i beskrivelsen og i kravene for å angi spesifikke nukleotider:

C - cytosin A - adenosin

T - thymidin G - guanosin

U - uracil

Betegnelsen "viruskilde" refererer til RNA-virus fra det fra RNA er isolert og anvendt som et templat for cDNA-produksjon. Betegnelsen "øket attenuering" blir anvendt for å indikere en lavere reversjonsrate til neurovirulent fenotype enn de fra konvensjonelle vaksinevirusstammer.

Betegnelsen "sant RNA-virus cDNA", som anvendt heri, refererer til et cDNA som leder produksjonen av et levedyktig RNA-virus som er fenotypisk lik viruskilden. Foreliggende oppfinnelse omfatter derfor cDNA-molekyler som i kraft av degenereringen av den genetiske koden, er kjennetegnet ved den nukleotidsekvens som er forskjellig fra den til virus RNA-kilden, men som koder for polypeptider som har samme aminosyresekvenser, som de som blir kodet av virus RNA-kilden. Oppfinnelsen omfatter også cDNA som koder for aminosyresekvenser som er forskjellige fra de fra virus-polypeptider anvendt som kilde, men som ikke produserer fenotypiske forandringer. Nedenfor blir disse endrede, men fenotypisk ekvivalente aminosyresekvensene betegnet "ekvivalente aminosyresekvenser". Foreliggende oppfinnelse omfatter cDNA-molekyler kjennetegnet ved forandringer i ikke-kodende regioner som ikke endrer fenotypen til RNA-viruset produsert derifra når sammenlignet med viruskilden. Forskjeller mellom nukleotidsekvensen til et RNA-virus cDNA og viruskilde RNA som resulterer 1 fenotypiske forskjeller i viruset produsert derifra blir nedenfor referert til som "substantive forskjeller".

I en utførelsesform ifølge denne oppfinnelsen er RNA-viruset til sant RNA-virus og i en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er RNA-viruset et "fenotypisk ekvivalent" virus. I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen er RNA-kildeviruset et Picornavirus, f.eks. et vaksinestamme 3 poliovirus.

Fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen kan også bli anvendt for å produsere et RNA-virus cDNA ved å endre nukleotidene i forskjellige regioner av poliovirusgenomet, f.eks., for å korrigere mutasjoner introdusert i regionen kodende for aminoterminusen til VP1 av typen 1 Mahoney-poliovirus [K. Kirkegaard, "Mutations in VP1 of Poliovirus Specifically Affect Both Encapsulation and Release of Viral RNA", J. Virology, 64, s. 195-206 (1990)].

Et rekombinant DNA-molekyl kan omfatte et RNA-virus cDNA som beskrevet ovenfor, og kan omfatte, men er ikke begrenset til rekombinant DNA-molekyl hvori RNA-virus cDNA er operabelt bundet til en promoter av RNA-transkripsjon såsom T7-promoteren.

En vert transformert med et rekombinant DNA-molekyl beskrevet ovenfor er også tilveiebragt, hvori verten velges fra gruppen bestående av bakterier, gjær og andre sopp, insektsceller og dyreceller. I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er verten en dyrecelle og velges fra gruppen bestående av Vero-celler, HeLa-celler, COS-celler, CV-l-celler og primære apenyreceller. I en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er verten E. coil.

Et levedyktig RNA-virus kan fremstilles ved trinnene: dyrking av en vert beskrevet ovenfor under betingelser som muliggjør produksjon av levedyktig RNA-virus og høsting av levedyktige RNA-virus fra vertscellekulturen. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et levedyktig RNA-virus som omfatter av anvendelse av in vitro-transkripsjonsmidler for å produsere RNA fra et rekombinant DNA-molekyl beskrevet ovenfor, isolering av RNA, transf ekter ing av en vert med isolert RNA, hvori verten er en dyrecelle, dyrking av verten under betingelser som muliggjør produksjon av levedyktig RNA-virus og høsting av levedyktig RNA-virus fra vertscellekulturen. I den foretrukne ut-førelsesf ormen ifølge oppfinnelsen er RNA-viruset en vaksinestamme 3 poliovirus og verten er en primær apenyre-celle.

Bestemmelse av fenotypiske forskjeller kan bli utført ved flere metoder som er velkjente innenfor dette området. Et sant RNA-virus cDNA av et attenuert stamme 3 poliovirus koder for et virus som samme grad av attenuering som viruskilden. Flere godt karakteriserte markører kan bli anvendt for å bestemme fenotypiske forandringer i en poliovirusstamme. Disse er "d"-markører, som regulerer evnen som viruset har til å vokse under sure betingelser [M. Vogt et al., "Mutant of Poliomyelitis Viruses with Reduced Efficiency of Plating in Acid Medium and Reduced Neuropathogenicity", Virology, 4, s. 141-44 (1957)]; og "rct4g"-markøren, som regulerer evnen som viruset har til å vokse ved forhøyede temperaturer [A. Lwoff, "Factors Influencing the Evolution of Viral Diseases at the Cellular Level and in the Organism", Bact. Rev., 23, s. 109-24 (1959)].

Den mest foretrukne fremgangsmåten for å bestemme fenotypiske forandringer mellom et attenuert stamme 3 kildepoliovirus og viruset produsert fra dets sanne RNA-virus cDNA er en sammenligning av neurovirulens. Flere protokoller for vurdering av neurovirulens er kjent innenfor fagområdet [Code of Federal Regulations, Title 21, kap. 1, s. 91-93 (1. april 1987-utgave)].

Produksjon av et sant RNA- virus cDNA

Ifølge en utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å fremstille sant RNA-virus cDNA. Produksjonen av et sant RNA-virus cDNA ifølge denne oppfinnelsen kan anvende en hvilken som helst RNA-viruskilde, positivt enkelt-trådet, negativt enkelt-trådet eller dobbelt-trådet. Viruskilden er fortrinnsvis et positivt enkelt-trådet virus. Viruset er et humant enterovirus hørende til familien Picornaviridae og dette er mest foretrukket. Mest foretrukket er et attenuert type 3 vaksinestammepoliovirus (også referert heri som "P3/Sabin").

A. Proliferasjon og isolering av virus

Det opprinnelige trinnet ved produksjon av sant RNA-virus cDNA involverer proliferasjon og rensing av viruskilden og isolering av RNA derifra. Teknikker for proliferering og isolering av virus er velkjente innenfor dette fagområdet [R.J. Kuchler, "Biochemical Methods in Cell Culture and Virology", Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., Stroudsburg, PA

(1977)]. Det er å bemerke at fremgangsmåten for viral vekst, inkludert valg av vertscelle, seleksjon av vekstmedium og betingelser for vekst, vil være forskjellig avhengig av den bestemte viruskilden. I en foretrukket utførelsesform blir attenuert stamme 3 poliovirus proliferert i primære apenyreceller ifølge kjente fremgangsmåter [A. Sabin et al., "Studies On Variants Of Poliomyelitis Virus", J. Exp. Med., 99, s. 551-76 (1954)]. Følgende prosedyrer kan anvendes for en hvilken som helst poliovirusstamme. Anvendelse av en annen RNA-viruskilde i disse prosedyrene kan kreve visse virus-spesifikke modifikasjoner som er kjent for fagfolk innenfor dette området.

Viral proliferasjon av RNA-virus blir latt forløpe til et punkt hvor en tilstrekkelig mengde virus kan bli høstet for isolering av RNA. Kulturmediet inneholdende viruskilden blir deretter samlet og cellulært debris blir fjernet, fortrinnsvis ved sentrifugering ved en hastighet som ikke vil pelletere viruset. Dette er vanligvis omtrent ved 2500 rpm i omtrent 20 minutter. Supernatanten kan deretter bli ytterligere renset ved ultrafiltrering ved anvendelse av et filter som har en porestørrelse som er større enn de virale partiklene. Et filter med omtrent 0,22 jjm kan fortrinnsvis bli anvendt.

Etter filtrering blir de virale partiklene samlet ved polyetylenglykol-presipitering, etterfulgt av sentrifugering eller, fortrinnsvis, ved sentrifugering ved høy hastighet ved omtrent 70 000 rpm. De virale partiklene blir deretter resuspendert i et lite buffervolum, fortrinnsvis TNE (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4). En ikke-ionisk detergent kan eventuelt bli tilsatt til den virale partikkél-suspens]onen for å oppløse eventuelle kontaminanter. Til tross for at høy-hastighet-viral-pelleten er tilstrekkelig ren for å bli anvendt som en kilde for viralt RNA, den kan virale suspensjonen eventuelt bli ytterligere renset ved sukrose-tetthetsgradientsentrifugering.

Dersom tetthetsgradientsentrifugering blir anvendt, blir fraksjoner samlet opp fra gradienten og analysert for tilstedeværelse av viruskilde. En hvilken som helst konven-sjonell analyse som detekterer virus-spesifikke kilde-proteiner kan bli anvendt. Slike analyser omfatter, f.eks., Western-blott, ELISA, radioimmunoanalyse, eller polyakrylamid-gelelektroforese og sammenligning med en virusstandard-kilde. Den sistnevnte teknikken er mest foretrukket på grunn av at den er den mest økonomiske.

B. Isolering og sekvensering av viralt RNA

Når viruset er renset som beskrevet ovenfor, kan viralt RNA deretter bli isolert. Dette blir oppnådd ved først å dissosiere virale kapsidproteiner ved behandling med detergent, fortrinnsvis natriumdodecylsulfat ("SDS") ved en sluttkonsentrasjon på 0,5$. De dissosierte proteiner blir deretter ekstrahert ved behandling av prøven med organiske oppløsningsmidler. Ekstraksjonen "blir fortrinnsvis oppnådd med en fenol:kloroform:isoamylalkohol-blanding. RNA til stede i den vandige kan deretter bli isolert ved en hvilken som helst metode som er velkjent innenfor fagområdet [T. Maniatis, "The Molecular Guide To Cloning", Cold Spring Harbor Press (1983)]. Viralt RNA blir fortrinnsvis presipitert med 0,5 volumer 7,5 M ammoniumacetat og 2,5 volumer etanol ved -20°C. Kvantitering og integriteten til viralt RNA kan bli bestemt ved agarose-gelelektroforese. Det er å bemerke som kjent innenfor molekylær biologi at det må utøves forsiktighet ved preparering og håndtering av RNA-prøvene på grunn av tilstedeværelse av RNaser. Fremgangsmåter for inaktivering av RNaser som kan være til stede i reagensene og i beholderne anvendt ved RNA-preparering er velkjente [T. Maniatis, supra].

Når virus RNA-kilden er blitt isolert, blir den utsatt for dideoksynukleotidsekvensering [F. Sanger et al., "DNA Sequencing With Chain-Terminating Inhibitors", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74: 5463-67 (1977)] ved anvendelse av modifikasjoner for RNA [D.C. Deborde et al., "Resolution Of A Common RNA Sequencing Ambiguity By Terminal Deoxynucleotidyl Transferase", Anal. Biochem., 157, s. 275-82 (1986)]. Ifølge en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir hele RNA-genomet til viruset sekvensert og sammenlignet med et cDNA-sekvensen ved fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor. I denne utførelsesformen av oppfinnelsen er viruskilden fortrinnsvis et attenuert type 3 vaksinestammepoliovirus.

C. Syntese og screening av et RNA- virus cDNA bibliotek

Etter RNA-sekvensering blir virus RNA-kilden anvendt som et templat for syntese av et full-lengde, dobbelt-trådet cDNA. En hvilken som helst velkjent fremgangsmåte eller kommersielt tilgjengelig cDNA-syntesekit blir anvendt for å syntetisere cDNA. cDNA blir fortrinnsvis syntetisert ved fremgangsmåten til V.R. Racaniello et al., "Molecular Cloning Of Poliovirus cDNA And Determination Of The Complete Nucleotide Sequence Of

The Viral Genome", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, s. 4887-91

(1981). For å lette deteksjonen kan de første cDNA-trådene eventuelt bli radioaktivt merket ved anvendelse av et radioaktivt nukleotid i løpet av cDNA-syntesen. Når syntetisert blir enkelt-trådet cDNA fortrinnsvis størrelsesseparert enten ved agarose-gelelektroforese eller, fortrinnsvis, ved gelkromatografi. Større cDNA blir isolert og anvendt som templater for syntese av den andre tråden. Dobbelt-trådet cDNA blir deretter størrelsesseparert som beskrevet ovenfor og de største molekylene blir anvendt for dannelsen av et virus cDNA kilde bibliotek. cDNA blir deretter påsatt hale enten ved oligo dG/dC-metoden eller ved tilsetning av restriksjonsenzymlinkere, og klonet inn i en hensiktsmessig vektor. Valg av vektor vil være basert på teknikken som vil bli anvendt for å screene biblioteket. For eksempel krever anvendelse av en immunoscreeningsteknikk at cDNA blir skutt inn i en ekspresjonsvektor, såsom X-gtll (ATCC aksesjonsnr. 37194). Dersom en hybridiseringsscreeningsmetode blir anvendt, er vektorer såsom bakterielle plasmider mest hensiktsmessig. cDNA blir fortrinnsvis påført hale ved oligo dG/dC-metoden og klonet inn i Pstl-setet til pBR322.

Når ENA-virus cDNA biblioteket blir dannet, blir det screenet for en full-lengde cDNA-klon. Dette kan oppnås ved velkjente screeningsmetoder, såsom antistoffscreening eller hybridisering til en merket probe. Biblioteket blir fortrinnsvis screenet ved kolonihybridisering ved anvendelse av virus-spesifikke cDNA-prober [M. Grunstein et al., "Colony Hybridization; A Method for the Isolation of Cloned DNAs That Contain A Specific Gene", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, s. 3961-65 (1975)], basert på kjente nukleotidsekvenser eller aminosyresekvenser til viruset. Når en klon inneholdende et RNA-virus cDNA først er blitt identifisert og isolert, kan det bli fjernet fra vektoren og analysert for å bestemme om den representerer et full-lengde ENA-virus cDNA. I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir dC-hale-påført cDNA fjernet fra et Pstl-kutt, dG-hale-påført vektor ved spaltning med Pstl. Delvis cDNA kan bli anvendt for å på ny probe biblioteket og å lokalisere lengere eller full-lengde cDNA. Dersom det ikke kan bli detektert full-lengde cDNA, kan flere overlappende delvis cDNA som representerer hele kildevirusgenomet blir ligert sammen ved felles restriksjonsseter for å produsere et full-lengde cDNA [V.R. Racaniello et al., "Cloned Poliovirus cDNA Is Infections In Mammalian Cells", Science, 214, s. 916-69 (1981)]. En hvilken som helst del av det virale genomet som ikke er representert ved et Isolert cDNA kan bli syntetisert ved anvendelse av standard oligonukleotidsyntetiserende teknikker og deretter bli ligert inn i en riktig posisjon for å danne et full-lengde cDNA.

D. Sekvensering og endring av cDNA for å tilsvare virus RNA-kilden

Deler av full-lengde cDNA som tilsvarer den sekvenserte delen av kildevirus RNA blir deretter sekvensert ved standard DNA-sekvenseringsmetoder. De sekvenserte regionene til viralt RNA og RNA-virus cDNA ble deretter sammenlignet. Teoretisk skal cDNA korrespondere nøyaktig med RNA som virket som dets templat. Det er derimot kjent at revers transkriptase kan danne feil ved transkribering av cDNA fra RNA [I.M. Verma, "Reverse Transcriptase", i The Enzymes, bind 14, P-D. Boyer, utg. , Academic Press, New York, s. 87-104 (1981)]. Ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det derfor nødvendig å endre nukleotidsekvensen til cDNA slik at den tilsvarer sekvensert RNA.

Foreliggende oppfinnelse betrakter endring av cDNA-sekvensen ved de setene som er ansvarlig for fenotypiske forandringer. Deler av cDNA som koder for polypeptider som har ekvivalente aminosyresekvenser som de som blir kodet fra viruskilde RNA trenger ikke å bli endret. En hvilken som helst cDNA-nukleotidmutasjon som potensielt kan påvirke virusproduk-sjonen eller viral polypeptidsyntese bør bli endret for å tilsvare virus-RNA-kilden.

Fremgangsmåter for endring av nukleotidsekvensen til et cDNA-molekyl er kjent innenfor området og omfatter sete-rettet mutagenese [CA. Hutchinson, III et al., "Mutagenesis At A Specific Position In A DNA Sequence", J. Bio. Chem., 253, s. 6551-60 (1978); A. Razin et al., "Efflcient Correction Of A Mutation By Use Of A Chemically Synthesized DNA", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75, s. 4268 (1978)]. Alternativt kan en delvis cDNA-klon inneholdende den ønskede sekvensen bli isolert fra cDNA-biblioteket og dets DNA eller en del derav, substituert i full-lengde klonen for sekvenser som skal bli endret. Når cDNA-sekvensen er blitt endret, blir den anvendt i andre utførelsesformer ifølge denne oppfinnelsen.

Ifølge en annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse kan sant RNA-virus cDNA bli skutt inn i en hensiktsmessig vektor og anvendt for å transformere en hensiktsmessig vert. Valg av vektor vil avhenge av anvendelsen av cDNA. Valg av vert vil likeledes avhenge av både vektoren som blir valgt og målet for transformasjonen.

Hvis det f.eks. er ønskelig å bare lagre cDNA og danne en ubegrenset mengde derav, vil cDNA bli skutt inn i en vektor som kan transformere en encellet organisme, såsom en bakterie, gjær eller annen sopp, en dyrecelle eller en insektscelle. cDNA blir skutt inn i Pstl-setet til pBR322 og verten som skal bil transformert er E. coil.

Sant RNA cDNA kan bli operabelt bundet til en promoter for transkripsjon. Som anvendt heri betyr betegnelsen "operabelt bundet" posisjonert på en slik måte at promoteren vil stenge transkripsjonen av RNA til sant virus cDNA. Eksempler på slike promotere er SP6, T4 og T7. Den mest foretrukne promoteren er T7-promoteren [J.J. Dunn et al., "Complete Nucleotide Sequence of Bacteriophage T7 DNA og the Locations of T7 Genetic Elements", J. Mol. Biol., 166, s. 477-535

(1983)]. Vektorene som inneholder både en promoter og et kloningssete hvori et innskutt stykke av DNA er operabelt bundet til den promoteren er velkjent innenfor området. Disse vektorene har fortrinnsvis evne til å transkribere RNA in vitro. Eksempler på slike vektorer er pGEM-seriene [Promega Biotec, Madison, WI] .

Ifølge en ytterligere utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for fremstilling av levedyktige positivt trådede RNA-virus. Dette kan bli oppnådd ved transfektering av en hensiktsmessig vert med et sant RNA-virus cDNA. En hvilken som helst standardmetode for transfektering av dyreceller med DNA kan bli anvendt [F.M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates & Wiley Intersciences (1987)]. Verten blir deretter dyrket under betingelser som fører til produksjon av RNA-virus. Slike betingelser er velkjent Innenfor fagområdet og vil variere avhengig av viruset som blir produsert. Valg av vertscelle bør være en som er kompatibel med viruset, fortrinnsvis primate celler i kultur. I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen, hvori sant RNA-virus cDNA koder for et attenuert stamme 3 poliovirus, velges verten fra gruppen bestående av Vero-celler, HeLa-celler, COS-celler, CV-l-celler, humane diploide cellelinjer, såsom WI-38 og MRC5 og primære apenyreceller. De mest foretrukne vertene er apenyreceller. Når cellene har produsert et ønsket nivå av virus, blir virusene høstet fra cellekulturen ifølge standardprotokoller.

Ifølge en alternativ utførelsesform kan viralt RNA, som blir produsert ved in vitro-transkripsjon av et sant RNA-virus cDNA ifølge oppfinnelsen bli anvendt i fremgangsmåter for fremstilling av levedyktige RNA-virus. In vitro-transkribert RNA ble isolert ved standardmetoder og anvendt for å transfektere en hensiktsmessig vert. Anvendelse av RNA for å transfektere celler er velkjent innenfor fagområdet [S. van der Werf et al., "Synthesis of Infectious Poliovirus RNA by Purified T7 RNA Polymerase", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, s. 2330-34 (1986)]. Når cellene er transfektert, blir de dyrket og virus høstet ifølge standardprotokoller.

Det er mulig å screene for varianter av en stamme 3 poliovirus. Ved hjelp av RNA-sekvensering ble det oppdaget at tilstedeværelse av en C ved nukleotidposisjon 2493 til dette viruset er koblet til den attenuerte stamme 3 genotypen. Tidligere analyser av denne stammen innså ikke viktigheten av denne posisjonen i attenueringen på grunn av kombinasjon av to faktorer: sekvensene til vill-type og attenuert stamme 3 poliovirus ble sammenlignet på cDNA-nivået, istedenfor genomisk RNA-nivå; og noen av disse cDNA ble dannet fra plakkisolater av de opprinnelige virale prøvene [Stanway et al., "Comparison of the Complete Nucleotide Sequences of the Genomes of the Neurovirulent Poliovirus P3/Leon/37 and its Attenuated Sabin Vaccine Derivative P3/Leon 12alb", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, s. 1539-43 (1984 ); H. Toyoda et al., "Complete Nucleotide Sequences of All Three Poliovirus Serotype Genomes", J. Mol. Biol., 174, s. 561-85 (1984)]. Som et resultat av enten feil i reverstranskripsjon eller mutasjoner resulterende fra passering av virus, inneholdt cDNA som tidligere var blitt produsert en T i posisjon 2493. RNA av type 3 vaks Ines tammen til poliovirus ble derfor feilaktig antatt å inneholde U i denne posisjonen, som er det samme nukleotidet som er til stede i villtype-stammen [Stanway et al., supra; H. Toyoda et al., supra]. Posisjon 2493 var aldri påtenkt å bidra med attenuering av poliovirusstamme 3 genomet.

Fremgangsmåten for varianter av et stamme 3 poliovirus omfatter trinnene av å sekvensere RNA til virus og å bestemme nukleotidet i posisjon 2493. Delen av RNA som skal bli sekvensert består fortrinnsvis av omtrent 100-200 nukleotider som flankerer nukleotid 2493. Denne fremgangsmåten kan bli anvendt i løpet av amplifikasjonen av viruskilden (f.eks. ved vaksineproduksjon) for å forsikre opprettholdelse av C i posisjon 2493 i det virale genomet.

Det er mulig å øke attenueringen av et stamme 3 poliovirus produsert fra et sant RNA-virus cDNA, hvori cDNA omfatter sekvensen ATT i posisjonene 2492-2494. Fremgangsmåten omfatter mutagenisering av nukleotidet i posisjon 1493 fra en T til en C og deretter anvendelse av det mutageniserte cDNA for å produsere levedyktig virus. Tilstedeværelse av en C istedenfor av en U i posisjon 2493 i stamme 4 poliovirus RNA bør ventes å endre den sjette aminosyren til viralt kapsidprotein, VP1, fra isoleucin til treonin, basert på den genetiske koden. Kondonet som koder for denne aminosyren dekker nukleotidene 2492-2494, derfor kan fremgangsmåten for å øke attenueringen av stamme 3 poliovirus også omfatte mutagenisering av nukleotid 2494 fra en T til enten A, C eller G.

For at oppfinnelsen beskrevet heri skal bli lettere å forstå, angis følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Rensing av et stamme 3 pollovlrus

Alt glassutstyr anvendt i fremgangsmåtene beskrevet nedenfor blir enten steriliserte eller behandlet med dietylpyro-karbonat (DEP) for å ødelegge RNaser. Alle reagenser blir laget med vann som er blitt behandlet med DEP før bruk.

Primære apenyreceller blir infisert med et attenuert stamme 3 poliovirus, isolert ved plakkrensing fra "Orimune"-vaksinen (Lederle Laboratories, Pearl River, NY), ved en lav infek-sjonsmultiplisitet ("MOI"). De infiserte kulturene blir opprettholdt ved 34<0>C i modifisert Earle's lakteal opp-holdelsesmediet, pH 7,3, helt til cellemonolaget blir ødelagt (+4 cytopatisk effekt ("CPE")). Kulturmediet (120 ml) blir samlet opp og sentrifugert ved 2500 rpm i 20 minutter for å fjerne eventuelt cellulært debris. Supernatanten blir deretter filtrert gjennom et 0,22 jjM Millex GV-diskf ilter. Filtratet blir deretter plassert i hurtigforseglede sentri- fugerør for høy hastighet og sentrifugert i en 70,1 Til-rotor ved 70 000 rpm i en time ved 4°C.

Viruspelleten blir resuspendert i 4 ml RNase-fritt TNE (10 mM tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) og suspensjonen overført til et 15 ml polypropylenrør. Det virale kapsidet blir deretter dissosiert ved tilsetning av RNasefritt SDS til en sluttkonsentrasjon på 0,5$.

EKSEMPEL 2

Isolering og sekvensering av viralt RNA

Viralt RNA ble deretter isolert ved ekstrahering av oppløst kapsid som fremstilt i eksempel 1, med et likt volum fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1). Det vandige laget ble fjernet og reekstrahert med samme organiske oppløsning. Et halv volum 7,5 M ammoniumacetat og 1,5 volumer 100$ etanol blir tilsatt til det vandige ekstraktet og RNA blir presipitert ved -20° C i minst 30 minutter. RNA ble deretter pelletert ved sentrifugering ved 12 000 rpm i 30 minutter. RNA-pelleten ble vasket to ganger med is-kald 70$ etanol, tørket under vakuum og resuspendert i 20 jjM vann. Integriteten og konsentrasjonen til RNA blir vurdert ved anvendelse av agarosegelelektroforese.

Viralt RNA blir deretter sekvensert essensielt ved fremgangsmåten til DeBorde [D.C. Deborde et al., Anal. Biochem., 157, s. 275-82 (1986)], og beskrivelsen derav inkorporert heri som referanse. De spesifikke detaljene til sekvenseringen er beskrevet nedenfor.

Omtrent 500 mg renset viralt RNA blir oppvarmet denaturet ved 100°C i 3 minutter i 200 mM Tris-HCl, pH 8,3, 200 mM KC1 , 20 mM MgCl2»10 mM DTT og deretter hurtig avkjølt ved ned-senkning i et isbad. Primer, dATP og enzymer blir deretter blandet i med RNA, som beskrevet av DeBorde et al. 2VS jjI primer-RNA-blandlng blir deretter kombinert med et likt volum av forskjellige reaksjonsblandinger, i separate rør, for å tilveiebringe følgende komponentkonsentrasjoner: Rør A: 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1, 5 mM MgCl, 10 mM DTT, 100 pM hver av dCTP, dGTP og dTTP, 5 pCi [<33>S]-dATP, 1,25 pM ddATP, 100 ng RNA, 15 ng primer og 2,8 enheter reverstranskriptase;

Rør C: samme som rør A, med unntagelse av 20 mM dCTP, 2,5 mM ddCTP og ikke noe ddATP;

Rør G: samme som rør A, med unntagelse av 20 pM dGTP, 3,0 pM ddGTP og ikke noe ddATP;

Rør T: samme som rør A, med unntagelse av 20 pM dTTP, 7,5 pM ddTTP og ikke noe ddATP;

Rør N: samme som rør A, med unntagelse av ikke noe ddATP.

Hvert rør blir inkubert ved 42° C i 20 minutter. Etter denne inkubasjonen blir en 1 pl av chase-oppløsning (1 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP og 2 enheter terminal deoksy-nukleotidyltransferase) tilsatt til hvert rør og rørene blir inkubert i ytterligere 30 minutter ved 37°C. Reaksjonene blir stoppet ved frysing ved — 20° C. Før elektroforese blir 5 pl formamidfarveblanding tilsatt til hvert rør. Prøvene blir deretter oppvarmet til 100° c i 3 minutter og 5 pl av hver prøve blir applisert pr. gelkolonne.

Sekvenseringsgelene (35 cm x 13 cm x 0,1 mm) består av 6$ polyakrylamid (38:2; arylamid:bis-arylamid) inneholdende 7 M urea i TBE (89 mM tris, 89 mM borsyre, 2 mM EDTA).

Når hele sekvensen av attenuert stamme 3 poliovirus RNA-genom er sammenlignet med publisert P3/Sabin cDNA-sekvensen [Stanway et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, s. 1539-43

(1984)], blir to nukleotidforskjeller observert, og en av disse forårsaker en aminosyreforandring. Disse er vist i følgende tabell:

Forskjellen observert i posisjon 2493 er viktig av flere grunner. For det første koder den for en signifikant aminosyreforandring i viralt kapsidprotein VP1. På grunn av at vill-type stamme 3 poliovirus har en U i denne posisjonen (T i cDNA), vil antatt tilstedeværelse av en T ved 2493 i attenuert stamme 3 poliovirus cDNA ha ødelagt en signifikant forskjell mellom vill-type og attenuerte genomer.

EKSEMPEL 3

Syntese av et full- lengde poliovirus cDNA

Viralt RNA oppnådd i tidligere eksempel blir anvendt som et templat for syntese av et dobbelt-trådet cDNA ved anvendelse av fremgangsmåten til V.R. Racaniello et al., "Molecular Cloning Of Poliovirus cDNA And Determination Of The Complete Nucleotide Sequence Of The Viral Genome", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, s. 4887-91 (1981). 2,5 pg viralt RNA blir anvendt for å produsere cDNA første tråden i en 100 pl reaksjon inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 10 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,5 mM hver av dATP, dTTP, dGTP og dCTP, 0,4 mM DTE, 30 pg/ml oligo dT (12-18 nukleotider i lengde) 4 mM natrium-pyrofosfat, 10 pCi/pl [a-<32>P]-dATP, 1 enhet/pl RNasin og 2 enheter/pl revers transkriptase [Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN]. Reaksjonen blir inkubert ved 42°C i 60 minutter. Reaksjonen blir stoppet ved tilsetning av EDTA til en sluttkonsentrasjon på 50 pM. Oppløsningen blir deretter fenolekstrahert og det vandige laget applisert på en

5 x 0,7 cm Sepharose CL-4B-kolonne. Kolonnen blir utviklet med 0,3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA. Profilen oppnådd på denne måten er angitt i figur 1. Fraksjonene 5-13 blir slått sammen fra kolonnen og 20 pg glykogen blir tilsatt. cDNA blir deretter presipitert ved —20°C ved tilsetning av 2,5 volum etanol, pelletert ved sentrifugering og resuspendert i 25 pl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA (TE) for anvendelse ved syntese av den andre tråden.

Syntese av den andre tråden blir utført i en 100 pl reaksjon inneholdende enkelt-trådet cDNA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 7 mM MgCl2, 0,1 M KC1, 50 pg/ml bovinserumalbumin (BSA), 0,1 mM av hver av dNTP, 150 pM e-NAD, 5 pg/ml E. coil DNA-ligase, 250 enheter/ml E- coli DNA-polymerase I og 90 enheter/ml RNase H. Blandingen blir inkubert ved 15°C i 60 minutter etterfulgt av 90 minutter ved romtemperatur. cDNA blir deretter fenolekstrahert og kromatografert over Sepharose CL-4B som beskrevet ovenfor. Void-volumfraksjonene blir slått sammen, presipitert med etanol og resuspendert i 25 pl TE, som tidligere beskrevet.

Det resulterende dobbelt-trådede cDNA blir påført hale med deoksycytidin (dC) i en 100 pl reaksjon inneholdende 140 mM K-kakodylat, pH 7,2, 30 mM Tris-HCl, 1 mM CoCl2, 1 mm DTT, 50 pg/ml BSA, 150 pM dCTP og 800 enheter/ml terminal deoksy-nukleotidyltransferase. Reaksjonen blir inkubert ved 37°C i 60 minutter og oppløsningen blir deretter fenolekstrahert. Det vandige laget blir fjernet, eter ekstrahert og hale-påført cDNA blir presipitert derifra med etanol inneholdende 20 pg glykogen. Den resulterende pelleten blir suspendert i 50 pl 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA (NTE).

EKSEMPEL 4

Produksjon av et poliovirus cDNA- bibllotek

Økende mengder (1, 2, 5, 10 pl) dC-hale-påført, dobbelt-trådet cDNA, produsert som i eksempel 3, blir sammensmeltet til 10 ng Pstl-spaltet, dG-hale-påført pUC9 (Pharmacia, Piscataway, NJ) i NTE ved oppvarming av blandingen til 68°C i et vannbad i 5 minutter, avkjøling av blandingen i et 42 " C vannbad og deretter sakte økning av temperaturen til romtemperatur over natt ved å skru av vannbadet. Dette muliggjør for optimal hybridisering mellom dC-halene på cDNA og dG-halene på pUC9. De sammensmeltede blandingene ble deretter anvendt for å transformere E. coli DH5a-cellene (Bethesda Research Labs, Galthersburg, MD) ved anvendelse av standardprosedyrer. Ampicillin-resistente kolonier blir selektert for screening.

EKSEMPEL 5

Isolering av polioviruskloner

Bakterielle kolonier blir plukket inn 1 oppdelte plater og screenet ved kolonihybridisering, ved anvendelse av linearisert plasmid pOLIO (Sabin) som en probe [J.W. Almond et al., "Attenuation and Reversion to Neurovirulence of the Sabin Poliovirus Type-3 Vaccine", In Vaccines, 85, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, s. 271-77 (1985)]. Plasmid pOLIO (Sabin) er et plasmid inneholdende et full-lengde cDNA avledet fra P3/Leon 12a^b [G. Stanway et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, s. 1539-43 (1984 )]. Av 600 kolonier screenet ved hybridisering gir 140 positive hybridiseringssignaler. Små kulturer (5 ml; LB-medium + ampicillin) av hver av disse positive klonene blir preparert og plasmid-DNA blir isolert ved den hurtige kokemetoden [T. Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Isolerte plasmider blir spaltet med Pstl, som antas å spalte ut det klonede innskuddet. De 140 klonene som er analysert på denne måten inneholder de fleste enten små innskudd (<1 kb) eller så frigjøres ikke innskuddene ved spaltning med Pstl. Det har heller ikke vært mulig å identifisere og kartlegge tre cDNA-kloner til P3/Sabin-genomet (pLL3-51, 69 og 82; se figur 2). 800 kolonier blir screenet ved kolonihybridisering ved anvendelse av et EcoRI-fragment fra pOLIO(Sabin) cDNA, som inneholder de ytterste 5'-747 nukleotidene, som en probe. Av de 33 koloniene som hybridiserer til proben representerer fem av cDNA-nukleotidene 85-779 fra P2/Sabin. Opphavet til disse cDNA-klonene er ikke kjent.

Ytterligere cDNA blir deretter koblet til pUC9 og transformert inn i DH5a-celler. 800 kolonier blir screenet ved kolonihybridisering ved anvendelse av. full-lengde pOLIO (Sabin) cDNA som en probe. 29 positive kloner blir analysert ved restriksjonsenzymspaltning. Åtte av de positive klonene som inneholder cDNA-innskuddene blir utsatt for nukleotidsekvensering fra en hvilken som helst ende av det innskutte DNA. Fem av disse klonene (pLL3-239, 251, 253, 254 og 255 ) inneholder et cDNA som kan bli kartlagt til 3'-enden av P3/Sabin-genomet (figur 2).

Som det fremgår av figur 2 (åpne linjer) representerer de 8 isolerte og analyserte cDNA-klonene nukleotidene 3630 til og med 3'-enden av P3/Sabin viralt RNA-genom.

For å oppnå ytterligere 5'-cDNA-kloner blir et oligonukleotid som er komplementært med et område av baser fra nukleotid 4317-4334 (se svart skravering i figur 2, pLL3-253) syntetisert. Dette oligonukleotidet blir anvendt for å prime cDNA-syntesen på P3/Sabin-viralt RNA isolert ifølge eksempel 2 ved anvendelse cDNA-syntesemetodene beskrevet i eksempel 3. De resulterende cDNA blir dC-hale-påført og klonet inn i PStl-kuttet, dG-hale-påført pUC9. De resulterende plasmidene blir deretter dannet for å transformere DH5a-cellene. Transformantene blir screenet ved hybridisering til pOLIO (Sabin 3). 11 positive cDNA-kloner blir isolert, analysert ved restriksjonsenzymspaltning og sekvensert (figur 2, svarte bokser). De 11 klonene tilsvarer nukleotidene 6 til og med 4329 av P3/Sabin-viralt RNA.

Til tross for at cDNA-kloner som representerer alle unntatt de første fem nukleotidene av P3/Sabin-genomet er identifiserte, har forsøk på å ligere sammen flere av 5'-cDNA til et enkelt cDNA vist seg å være vanskelig på grunn av mangelen på hensiktsmessige restriksjonsseter. En endelig runde med cDNA-kloning blir derfor gjennomført i et forsøk på å oppnå en enkelt cDNA som representerer omtrent nukleotidene 1 til og med 1900.

Et oligonukleotid som er komplementært med basene 1904-1922 blir syntetisert og anvendt for å prime cDNA-syntesen på P3/Sabin RNA. cDNA blir deretter dC-hale-påført, skutt inn i dG-hale-påført, Pstl-kuttet pUC9 og det resulterende plasmidet blir anvendt for å transformere DH5a-celler.. Transformantene blir på ny screenet med pOLIO (Sabin 3). En av de resulterende cDNA-klonene blir identifisert å inneholde nukleotidene 9-1900 av viralt RNA (figur 2, pLL3-307). Dette fullfører cDNA-kloningen av P3/Sabin-genomet.

EKSEMPEL 6

Konstruksjon av et full- lengde poliovirus cDNA

Strategien for oppstilling av P3/Sabin cDNA til et enkelt full-lengde cDNA er angitt i figur 3. For det første blir klonene pLL3-253 og pLL3-271 oppstilt i en enkelt klon ved anvendelse av et felles Hindlll-sete ved nukleotid 4241. Den resulterende cDNA-klonen, som representerer nukleotidene 1500 til og med 3'-poly(A) av genomet, blir betegnet pLL3-I.

Deretter blir de første fem nukleotidene av det P3/Sabin virale genomet, som mangler fra cDNA pLL3-277 syntetisert. Dette blir oppnådd ved syntetisering av to komplementære oligonukleotider ved anvendelse av en automatisert oligonukleotid syntesemaskin og deretter sammensmeltning av oligonukleotidene til hverandre. Det resulterende dobbelt- trådede oligomikleotidet omfatter fra 5' til 3', et Pstl-sete, nukleotidene 1 til og med 34 P3/Sabin cDNA og en Bgel klebrig ende, blir deretter anvendt for å erstatte det 5'-ytterste Pstl/Bgll-fragmentet til pLL3-277. Dette resulterer i en cDNA-klon som representerer nukleotidene 1-1085. Denne klon blir betegnet pLL3-II.

Det endelige trinnet er deretter ligering av de tre Sacl-fragmentene som representerer nukleotidene 1-747, 747-1895 og 1895 til og med 3'-enden, for å danne et full-lengde P3/Sabin cDNA (betegnet pLL3-FL). Denne konstruksjonen blir utført i flere separate trinn ved anvendelse av hensiktsmessig cDNA-innskudd fra pLL3-II, pLL3-307 og pLL3-I.

EKSEMPEL 7

Sekvensanalyse av P3/ Sabln cDNA

Sekvensanalyse av P3/Sabin cDNA anvendt for å konstruere full-lengde cDNA blir utført ved anvendelse av tre metoder. Den første omfatter cDNA som blir subklonet inn i M13-vektorer. Et sett av delesjoner av subklonen cDNA ved anvendelse av eksonuklease II og mungbønne-nuklease [E. Ozkaynak et al., "A Unidirectional Deletion Technique for the Generation of Clones for Sequencing, Biotechniques, 5, s. 770-73 (1987)], blir deretter isolert og deres nukleotidsekvenser bestemt.

I den andre metoden blir cDNA isolert og spaltet med Rsal. De resulterende fragmentene blir deretter "skutt" inn i M13 for sekvensanalyse. Den siste tilnærmelsen anvender cDNA-fragmenter som blir isolert fra kloner og subklonet inn i M13 for sekvensanalyse.

Ved nukleotidsekvensering av hele P3/Sabln cDNA-klonen, blir tre forskjeller funnet når cDNA-sekvensen blir sammenlignet med RNA-sekvensen. Disse forskjellene er oppsummert i følgende tabell:

Nukleotidfeilen i posisjon 198 i cDNA er beliggende i det 5'-ntranslaterte området av genomet. Funksjonen av den region forblir ukjent. Tilstedeværelse av en T, ikke en C, i cDNA i posisjon 4466 vil danne en forandring i residuet 118 til 2C-proteiner fra histidin til tyrosin. Til tross for at funksjonen av 2C-proteinet forblir udefinert, ser den antatte aminosyreforandringen ut til å være signifikant. Nukleotid-forandringen i posisjon 6334 er i polymerasegenet, men er stille med hensyn på aminosyreforandring.

For å oppnå en full-lengde cDNA-klon som tilsvarer nøyaktig poliovirus RNA-sekvensen, blir protokollen angitt i figur 4, panelene A og B fulgt. P3/Sabin cDNA-innskuddet pLL3-II blir subklonet inn i Pstl-setet til bakteriofag M13 for oligonukleotid-rettet mutagenese av nukleotid 198 fra G til A som beskrevet nedenfor. Et oligonukleotid som dekker nukleotidene 190-206 og som inneholder en A i posisjon 198 blir syntetisert for denne hensikten. Oligonukleotidet har sekvensen:

3'-GGCGTATCTGACAAGGG-5 *.

Mutagenese blir utført ved anvendelse av et "T7-GEN In Vitro Mutagenesis Kit" (United States Biochemical, Cleveland, OH) ved hjelp av fremstillerens anbefalinger. Det mutageniserte innskuddet blir betegnet pLL3-II(A). Etter mutagenese blir pLL3-II(A) sekvensert for å bekrefte tilstedeværelse av en A i posisjon 198. pLL3-II(A) blir deretter fjernet fra M13 med Pstl og deretter spaltet med SacI, som kutter ved nukleotid 747. Fragmentet som dekker nukleotidene 1-747 blir anvendt for å erstatte det tilsvarende fragmentet i pLL3-FL. Det resulterende full-lengde cDNA inneholdende det mutageniserte nukleotid i posisjon 198 blir referert til som pLL3-FL(A).

Deretter blir pLL3-FL(A) spaltet med Pstl og fragmentet som omfatter nukleotid 1 til 2604 blir isolert. En del av det isolerte Pstl-fragmentet av pLL3-FL(A), nukleotidene 1 til 1922, blir deretter utsatt for polymerasekjedereaksjon (PCR) for anvendelse av følgende to oligonukleotider som primere: 1) 5'-CTGCAGTAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCTCTGGGGTTG-3 *; og

2) 5*-GAATCATGGTGTCTATCTC-3'.

Oligonukleotid 1 representerer, i en 5<*->til-3'-retning, et Pstl-sete, T7-promoteren og nukleotidene 1-20 av den positive tråden til P3/Sabin cDNA. Oligonukleotid 2 representerer nukleotidene 1904-1922 av den negative tråden til P3/Sabin cDNA. PCR blir utført ved anvendelse av GeneAMp-kittet fra Perkin-Elmer Cetus.

Dobbelt-trådet DNA produsert ved PCR blir deretter spaltet med EcoRI, som spalter ved nukleotid 784 av P3/Sabin cDNA. Det resulterende 0,8 kb-fragmentet som representerer T7-promoteren og 5'-enden av P3/Sabin cDNA blir isolert og subklonet inn i SspI/EcoRI-spaltet pBR322. Det resulterende plasmidet, betegnet pVR309, blir bekreftet å inneholde T7-promoteren og nukleotidene 1-784 av P3/Sabin cDNA.

Deretter blir pLL3-FL spaltet med EcoRI, som spalter ved nukleotidene 784 og 2867. Fragmentet som dekker disse nukleotidene blir isolert og ligert til EcoRI-spaltet pVR309. Det resulterende plasmidet, pVR312, inneholder de første 2867 nukleotidene til P3/Sabin cDNA.

For å forandre nukleotidene ved 4466 og 6334 til å tilsvare den virale RNA-sekvensen, blir oligonukleotid-rettet mutagenese utført som beskrevet ovenfor. Innskuddet pLL3-253 blir subklonet inn i Pstl-setet til M13. Oligonukleotid 3'—CTCGTTTGTGGCATAAC-5' blir anvendt for å forandre nukleotid 4466 fra en T til en C. Oligonukleotid 3'—CCCATGGGGATGCACCG—5' blir anvendt for å forandret nukleotidet 6334 fra en T til en C. De mutageniserte nukleotidene blir bekreftet ved nukleotidsekvensering. Det resulterende korrekte cDNA-fragmentet blir betegnet pLL3-253(C).

Deretter blir pLL3-253(C) og pLL3-271 sammenstilt til en enkelt klon ved spaltning av hver Hindlll og deretter ligering av de resulterende store fragmentene. Det resulterende DNA, betegnet pLL3-I(C) representerer nukleotidene 1500 til og med 3-poly(A)-enden av P3/Sabin. Det fullstendige cDNA-innskuddet til pLL3-I(C) ble deretter isolert ved delvis Pstl-spaltning. En delvis spaltning er nødvendig på grunn av tilstedeværelse av et Pstl-sete ved nukleotid 2604. pLL3-I(C) blir deretter ligert til Pstl-spaltet pBR322. En del av det innskuddet blir deretter fjernet pBR322 ved en Smal/Nrul-spaltning. Det utspaltede stykket omfatter nukleotid 2766 til og med 3'-enden av cDNA og inn i pBR322. Et Smal/Nrul-fragment blir også spaltet fra pVR312. Dette DNA representerer sekvensene fra Nrul-setet i pBR322 til og med T7-promoteren og 5'-enden av P3/Sabin cDNA og opp til Smal-setet ved nukleotid 2766. Disse to Smal/NruI-fragmentene blir deretter ligert sammen for å danne et sant P3/Sabin cDNA. Det resulterende plasmidet blir betegnet pVR318. Tilstedeværelse av et full-lengde innskudd i pVR318 blir bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Ved sekvensering av pVR318 er det blitt bestemt at posisjon 2493 ble funnet å ha en T istedenfor en C.

For å omdanne nukleotid 2493 til en C blir et Sacl/Hindlll-restriksjonsfragment som dekker nukleotidene 1895 til og med 4241 fra pVR318 fjernet og erstattet med et tilsvarende fragment fra subklon pLL3-271. Denne fremgangsmåten er vist i figur 5. pLL3-271 blir spaltet med SacI og Hindlll og 2,346 kb-fragmentet som omfatter nukleotidene 1895 til og med 4241 blir isolert ved agarosegelelektroforese. Plasmid pVR318 blir delvis spaltet med SacI og Hindlll for å fjerne 2,346 kb-fragmentet mellom nukleotidene 1895 og 4241. Det gjenværende 10,007 kb-fragmentet blir isolert ved agarosegelelektroforese og deretter ligert til SacI/HindIII-fragmentet fra pLL3-271. Det resulterende ligeringsproduktet, pLED3, representerer en sann full-lengde type 3 poliovirusvaksinestamme cDNA. Sekvensen til pLED3 er angitt i figur 6, panelene A-J.

EKSEMPEL 8

Transfeksjon av celler med poliovirus P3/ Sabin cDNA

Primære apenyreceller blir dyrket til 80$ konfluens iduplikatet 25 cm<2>flasker i Eagle's basale medium (BME) inneholdende Hank's balanserte saltoppløsning, 0,35$ bikarbonat og 10$ kalveserum. Kulturene blir opprettholdt ved 37" C. Mediet blir deretter fjernet og cellene transfektert med pLED3 (fremstilt som i eksempel 7), tilsatt som et kalsiumfosfatpresipitat i HEPES-bufret saltvann. Etter 20 minutter ved romtemperatur blir cellene dekket med Earle's lakteal opprettholdelsesmedium og inkubert i 4 timer ved 37°C. Mediet blir deretter fjernet og cellene vasket en gang med friskt, varmt medium. 2 ml av 15% glycerol i HEPES-bufret saltvann blir deretter tilsatt til cellene og inkubasjonen blir fortsatt i 3,5 minutter ved 37°C. Glycerolet blir deretter fjernet og cellene vasket en gang på ny med friskt medium. En av duplikatkulturene blir deretter dekket med et varmt medium inneholdende 1% Noble-agar (Difco, Detroit, MI), mens den andre blir dekket med agarfritt medium. Kulturene blir inkubert ved 34°C I 1-5 dager. Plakk blir visualisert ved farving av cellene med 0,01$ nøytral rød. Medium fra den flytende kulturen blir analysert for infektiøse poliovirus ved plakktitrering på Vero-celler.

EKSEMPEL 9

In vitro- transkripsjon av P3/ Sabin cDNA

In vitro-transkripsjon blir utført ved fremgangsmåten til van der Werf et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, s. 2330-34

(1986). pLED3, inneholdende T7-promoter-P3/Sabin-konstruksjon, blir linearisert ved et hensiktsmessig restriksjonssete utenfor poliovlrussekvensene og renset ved fenolekstrahering og etanolpresipitering. Dette templat DNA blir deretter tilsatt til en blanding inneholdende 20 mM natriumfosfat, pH 7,7, 8 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM spermidin-HCl, 50 mM NaCl og 1 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dUTP. RNA-syntesen blir initiert ved tilsetning av 10-15 enheter T7 RNA polymerase/jjg linearisert templat og fortsatt 1 30 minutter ved 37°C.

Etter RNA-syntesen blir DNA-templatet spaltet bort med Dnase I. Gjenværende RNA blir renset ved fenolekstraksjon og etanolpresipitasjon i nærvær av 2,5 M ammoniumacetat. Renset RNA blir kvantifisert ved UV-spektrofotometri.

EKSEMPEL 10

Transfeksjon av celler med in vitro- transkribert P3/ Sabin RNA Semi-konfluente monolag av primære apenyreceller blir preparert som beskrevet i eksempel 8. Cellene blir transfektert med RNA preparert i eksempel 9 ved anvendelse av metoden til A. Vaheri et al., "Infectious Poliovirus RNA: A Sensitive Method of Assay", Virology, 27, s. 434-36 (1965). Cellemonolagene blir vasket med isotonisk fosfat-bufret saltvann (PBS). Etter 15 minutter blir PBS fullstendig fjernet ved utsuging. Monolaget blir deretter belagt med 0,25 ml inokulum inneholdende RNA og 5 00 pg/ml DEAE-dekstran (Sigma, St. Louis, MO; 500 000 MW) i PBS. De infiserte monolagene blir deretter holdt uforstyrret ved romtemperatur i 15 minutter, vasket en gang med Earl's lakteal oppholdelsesmedium og deretter belagt med enten friskt medium eller medium inneholdende 1% agar, som beskrevet 1 eksempel 8. Etter 4-5 dager ved 34°C blir virus detektert ved plakkdannelse (i kulturer inneholdende agar) eller ved cytopatisk virkning.

Virus blir deretter isolert og renset. Viralt RNA blir isolert ved teknikkene beskrevet ovenfor. Isolert RNA blir sekvensert og nukleotidet i posisjon 2493 blir bekreftet som cytosin, samme som den opprinnelige viruskilden.

EKSEMPEL 11

Vurdering av virkningen av nukleotid 2493 på attenueringen av et stamme 3 poliovirus

Et derivat av et attenuert stamme 3 poliovirus cDNA som inneholder en T istedenfor en C i nukleotid 2493 blir konstruert, såsom pVR318. Virus blir produsert fra cDNA med enten Tor C ved 2493 som i eksemplene 8 og 10. De resulterende virusene blir deretter testet for neurovirulens i aper ifølge standardprotokoller.

EKSEMPEL 12

Økning av attenueringen av et stamme 3 poliovirus

Et stamme 3 poliovirus cDNA som inneholder en T i posisjon 2493 blir utsatt for sete-rettet mutagenese for å omdanne et T til en C. For eksempel blir pLED3 spaltet med Pstl for å fjerne den kodende sekvensen til poliovirus. Poliovirus cDNA inneholder et enkelt, indre Pstl-sete ved nukleotid 2604. En Pstl-spaltning gir derfor et 5', 2,6 kilobase viralt cDNA-fragment og et 3', 4,8 kb viralt cDNA-f ragment. 2,6 kb-fragmentet blir isolert ved standardteknlkker og subklonet Inn i det unike Pstl-settet til vektor M13mpl8. Nukleotid 2493 blir deretter omdannet fra en T til en C ved sete-rettet mutagenese ved anvendelse av "T7-GEN In Vitro Mutagenesis Kit" (United States Biochemical, Cleveland, OH) og ifølge fremstillerens anbefalinger. Etter mutagenesen blir 2,6 kb-stykket av cDNA fjernet fra vektoren, religert til 3'-stykket av viralt cDNA og intakt cDNA blir klonet inn i pBR322. Både mutagenisert cDNA og det opprinnelige cDNA blir anvendt for å produsere levedyktig poliovirus som i eksempel 8. De resulterende virusene blir analysert for attenuering ifølge standardprotokoller. Mutagenisert virus produsert ved cDNA inneholdende en C ved nukleotid 2493 er ventet å være mer attenuert enn det opprinnelige viruset.

Bekreftende sekvensering av hele cDNA-sekvensen i plasmid pLED3 viste et ytterligere A (adenosin) i en region hvor seks A normalt blir funnet i det virale genomet (posisjonene 4133-4138). Følgende trinn beskriver en fremgangsmåte for å oppnå pLED3.2 fra pLED3:

Isolering og mutagenese av feilaktig pLED3- sekvens:

Med utgangspunkt i renset pLED3-plasmid DNA blir DNA spaltet fullstendig med restriksjonsenzymene SacI og Hindlll. Ved en valgt fremgangsmåte (dvs. gelelektroforese, HPLC) blir 2 346 basepar SacI/Hindlll-fragmentet som representerer cDNA-nukleotidene 1895-4241 renset.

Det rensede restriksjonsfragmentet blir subklonet Inn i bakteriofag M13 for å muliggjør oligo-rettet delesjonsmutage-nese. Et DNA oligonukleotid som dekker nukleotidene 4121-4150 blir syntetisert for dette. Sekvensen til denne oligomeren

er: 5'-CGC CTCAGTAAATTTTTTCAAC CAACTATC-3'.

Mutagenesen blir utført ved anvendelse av et "T7-GEN In Vitro Mutagenesis Kit" (United States Biochemical, Cleveland, Ohio) og ved å følge forhandlerens instruksjoner. Det mutageniserte innskuddet blir bekreftet å ha 6 Istedenfor 7 A i posisjonene 4133-4138 ved sekvensanalyse. Det endrede Sacl/Hindlll-fragmentet blir gelrenset som ovenfor ved preparering for ligering inn i plasmidlegemet som mangler dette restriksjons-f ragmentet.

Preparering av pLED3. 2 fra pLED3- plasmldet:

Utgående fra renset pLED3-plasmld DNA blir DNA delvis spaltet med restriksjonsenzymene SacI og Hindlll. 10 007 basepar

SacI/Hindlll-fragmentet tilsvarende plasmidet minus 2 346 basepar SacI/HindIII-fragmentet angitt ovenfor blir renset.

Konstruksjon av PLED3. 2:

Det rensede plasmidlegemet og mutagenisert 2 346 basepar-fragmentet blir ligert sammen. Kompetente E. coil DH5a-celler blir transformert med 1igeringsproduktene og tetracyklin-resistente kolonier blir selektert. Identiteten til pLED3.2 blir basert på bekreftelse på 6 A ved 4133-4138.

LED3- og VR318- vlruser anvendt i ape- NV- test:

Full-lengde cDNA i pLED3 (ukorrigert) var infektiøst til tross for at ytterligere A diskutert ovenfor tyder på et skift i leseramme for de virale proteinene 2C, 3A, 3B, 3C og 3D. In vitro-transkripsjon av pLED3 cDNA ved anvendelse av s7 RNA polymerase produserer RNA som har de feilaktige syv A som bestemt ved direkte sekvensanalyse. Når disse transkriptene ble anvendt for å transfektere apenyrecellene, ble virus isolert som har det riktige antall A ved disse setene.

Til tross for at cDNA i pLED3 og pVR318 har forskjellige nukleotidsammensetning ved 2493 og antall A mellom 4130-41346, var 2493-mutasjonen den eneste forskjellen som ble funnet for å skjelne virusene som ble dannet ved anvendelse av disse cDNA. Disse cDNA-avledede virusene ble anvendt for å utføre studiene for å vurdere betydningen av 2493-mutasjonen (beskrevet i manuskriptet som da revideres).

Polymeraser er kjent for å ha problemer med å kopiere fra regioner der et enkelt nukleotid blir gjentatt flere ganger. T7 RNA polymerasen kan ved feil ha dannet noen RNA som inneholder seks istedenfor syv A ved transkribering av de syv A fra pLED3. Bare de transkriptene med seks A kunne produsere virus ved transfeksjon av cellene. Denne foreslåtte for-klaringen virket meget sannsynlig for en vitenskapsmann som arbeider innen T-fag-polymerase.

Rekombinant DNA preparert ved fremgangsmåtene ifølge denne oppfinnelsen blir eksemplifisert ved hjelp av en prøve deponert til the American Type Culture Collection beliggende ved 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, under reglene innen Budapest-avtalen gjeldende The International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedures. Denne prøven ble deponert 17. april 1990, identifisert som et plasmid inneholdende infektiøs full-lengde kopi av vaksinestamme Sabin 3, og betegnet pLED3. Denne deponeringen ble tilegnet ATCC aksesjonsnr. 40789.

EKSEMPEL 13

Eksperimentelle metoder

Sabin 3- spesifikk mutasjon Innenfor den N- terminale regionen av VP2 er attenuering

Preparering av cDNA- kloner:

Viralt RNA ble ekstrahert fra Sabin 3 vaksinevirus (Lederle-Praxls Biologicals, NY) etter pelletering og SDS-nedbrytning som beskrevet ovenfor (20). Et cDNA-bibllotek ble dannet fra det virale RNA-templatet ved dannelse av reverstranskriptase og en prosedyre beskrevet andre steder (12). 01igonukleotId-rettet mutagenese ble utført på DNA subklonet 1 M13 dyrket i E. coli CJ236, for å forandre cDNA-sekvensen ved enkelte baseposisjoner (16). For dette ble antisens ollgonukleotidene (17-mer) syntetisert med målnukleotldet beliggende i midten av sekvensen. Felles restrlksjonsenzymspaltningsseter (EcoRI, Hindlll, SacI, Smal) ble anvendt for å konstruere full-lengde cDNA-kloner. Full-lengde cDNA (7 459 bp) ble konstruert i vektor pBR322, selektert og amplifisert ved anvendelse av E. coli DH5a (Bethesda Research Laboratories).

Celler:

Vero-celler ble propagert som monolag i Eagle's MEM med Earle's saltsupplementer med 0,11$ bikarbonat og 10$ føtalt bovinserum. Primære afrikanske grønne apenyreceller (PCMK) ble initiert i BME med Hank's salt inneholdende 0,035$ bikarbonat og 10$ serum. Ved 70$ konfluens ble cellene på ny matet med BME (Earle's salter) Inneholdende 5$ serum. I løpet av polloviruslnfeksjon ble alle kulturene opprettholdt i modifisert Earle's laktalbuminhydrolysat oppholdelsesmedium (LMM; pH 7,34 uten serum).

Viruser:

Sabin 3 vaksinevirus (RSO+2; Lederle-Praxis Biologicals, Pearl River, NY) ble preparert ved en enkel passasje av de nye oppnådde (RSO+1) fremstillingsavkommene i PCMK-celler. For eksperimentelle formål ble samme avkom anvendt for å produsere RS0+2-vaksinevirus i Vero-celler. Virus NC1 representerer vaksine (SO+2) produsert i PCMK-celler fra det opprinnelige (SO+1) fremstillingsavkom. cDNA-avledede viruser isolert fra Vero-celler transfektert med Tne7 RNA-poly-merasetranskripter av pLED3 eller pVR318 ble betegnet LED3+1 og VR318+1. Disse virusavkommer ble amplifisert en gang til i Vero-celler ved en multiplisitet ved infeksjon (MOI) ved 0,1 ved 33,5 + 0,5$ for å danne virusstokkene LED3+2 og VR318+2. Det ble spesielt påsett at preparering av LED3+2- og VR318+2-virusprøvene ble utført på en måte som er så lik som mulig den virkelige vaksinen (dvs. passasjenivå og dyrkningsbetingelser). De karakteriserende studiene ble utført ved anvendelse av disse endelige virusstammene.

Bestemmelse av virustiter:

Titere til infektiøse virus i prøver ble bestemt som oftest ved mikrotitrering på HEp-2-celler og uttrykt som vevskultur-infektiøs dose (TCID)50pr. ml (1). I noen tilfeller ble det infektiøse titeret målt ved plakktitrering på Vero-celle-monolag og derfor uttrykt som plakk-dannende enheter (pfu) pr. ml. Ti-ganger fortynninger i serie av virus preparert i LMM ble anvendt for å inokulere 25 cm<2>konfluente monolag og latt absorbere ved 22°C. Cellene ble belagt med 1,0$ Noble-agar (Difco Laboratories) i MEM (Hank's) pluss 2$ føtalt kalveserum og deretter inkubert ved 33,5 ± 0,5°C. Etter 3 dager ble plakkene visualisert og telt etter farving av cellene med nøytral rød (0,01$ oppløsning). For en gitt prøve er det rutinemessig en 0,6 logg forskjell i absolutt antall bestemt ved anvendelse av de to metodene beskrevet ovenfor og TCID5Q-verdien er alltid større.

Bestemmelse av nukleotidsekvens:

RNA-sekvensen ble bestemt ved anvendelse av syntetiske oligonukleotider og dideoksynukleotidkjedetermineringsmetoden som tidligere beskrevet (20). Sekvensering av klonede cDNA ble utført ved anvendelse av Sequenase DNA Sequencing Kit (U.S. Biochemical).

In vitro RNA- svntese og transfeksjon:

DNA-templater ble preparert ved spaltning av plasmid DNA fullstendig med Pvul-restriksjonsenzymet etterfulgt av ekstrahering med fenol og etanolpresipitering. Transkrip-sjonsreaksjonsblandingene inneholdende 1 pg DNA-templat ble preparert som beskrevet av Moss et al. (12). RNA-syntese ble initiert ved tilsetning av 30 enheter renset T7 RNA-polymerase (Pharmacia) og reaksjonene ble inkubert ved 37° C I 90 minutter. DNA-templatet og full-lengde transkripsjonsproduktet ble kvantifisert ved sammenligning av intensiteten til hensiktsmessige bånd med kjente mengder av en standard etter elektroforese i agarosegeler farvet med etidiumbromid.

9,0 kb Hindlll-fragmentet til bakteriofag-X-DNA ble anvendt som standard for templatet og en 7,5 kb enkelt-trådet RNA-markør (Bethesda Research Laboratories) ble anvendt for transkrlpt. Numeriske verdier ble oppnådd ved å utføre densitometri på en fotografisk negativ tatt av gelen. Aliquoter av transkripsjonsreaksjonsblandingen inneholdende 25 pg full-lengde transkrlpt ble anvendt for å transfektere Vero-celle-monolag (25 cm2 ) ifølge prosedyren beskrevet av van der Werf et al. (23). cDNA-avledede viruser ble høstet når cellemonolaget var fullstendig ødelagt (+4 CPE).

Isotopisk merkning av virus og fag:

Vero-celler (6,5 x IO<6>) ble infisert ved en MOI på 16 pfu/celle. Virus ble absorbert i en time, cellene ble deretter vasket to ganger og dekket med LMM før inkubasjon ved 33,5°C. 4tø timer senere ble mediet skiftet til metionin-fritt MEM (Select Amine Kit, GIBCO). Etter en time ble cellene tilført friskt medium supplementert med [<35>S]metionln (spesifikk aktivitet, 1000 CI/mmol; Amersham) til en sluttkonsentrasjon på 60 pCi/ml og inkubasjonene ble fortsatt. Ved +4 CPE (i løpet av 24 timer), ble medium inneholdende virus klaret, først ved sentrifugering med lav hastighet (2500 rpm, 20 min., 4°C) og deretter ved mikro-filtrering (0,22 pm Millex-GV; Milllpore). Virus ble pelletert ved ultrasentrifugerlng ved anvendelse av en Beckman 70.1T1 rotor (70K, 1 t, 4°C), og deretter resuspendert og kokt i Laemmli-prøvebuffer (10). Prøvene ble utsatt for SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og proteinene visualisert ved autoradiografi.

Virus- termostabilltetskurver:

Mutiple 3,0 ml prøver av virus (omtrent IO<7>»<3>pfu/ml i LMM) ble inkubert ved romtemperatur (22°C) eller i vannbad ved 37° C eller 42° C. Ved 24 t. intervaller i løpet av 5 dager, ble en prøve fra hvert inkubasjonssett fjernet og frosset ved —20°C. Når alle Inkubasjoner av prøven var fullført, ble virustitre til hver prøve målt ved plakktltrering på Vero-monolag.

Virusvekstkurver:

Vero-celle-monolag (IO<7>celler/25 cm<2>flaske) ble Infisert med 4 pfu/celle og opprettholdt som beskrevet ovenfor. Ved de angitte tidspunktene etter infeksjonen, ble mediet fra individuelle kulturer høstet og deretter lagret ved 70°C.

Neurovlrulenstest:

Virusprøvene ble testet for neurovirulens i Macca mulatto-aper ved anvendelse av to aksepterte prosedyrer. Som beskrevet i United States Code of Federal Regulations (22), ble 0,2 ml eller 0,5 ml av virusprøve inneholdende minst IO<7>*<6>TCID50/111I injisert inn I ryggraden (IS) eller den talamiske regionen av hver hjernehemisfære (IT) til en ape, for hver test. WHO-testen (26) omfatter intraspinal Injeksjon i aper med 0,1 ml virus (titer på 10<6>»<5->107'5 TCID50</>ml). Etter injeksjonen blir forsøksdyrene observert i 17-21 dager for kliniske tegn på poliomyelitt. Dyrene blir deretter ofret for å muliggjøre histologisk undersøkning av hjernen og ryggraden for poliovlruslesjoner. Nervevevet fra hver ape blir vurdert ved anvendelse av en poengberegningsmetode fra 1 (lav) til 4 (høy) for å reflektere alvorligheten av den observerte neuronale skaden. Gjennomsnittlig lesjonspoeng-beregning er et gjennomsnitt av poengene registrert for aper innenfor en gruppe.

Statistisk analyse:

Forskjeller i gjennomsnittlige lesjonspoeng ble analysert ved Analyse av varians (ANOVA)-modellen med minste kvadrat-bestemmelser anvendt for testing av gjennomsnittlig område. Reaktivitetsfrekvensen i aper injisert intratalamikalsk ble testet for signifikans ved anvendelse av Chi-kvadrattesten.

Resultater

Konstruksjon av et autentisk LED3 cDNA:

Screening av cDNA-biblioteket ved restrlksjonsanalyse og nukleotidsekvensering, identifiserte fire cDNA-kloner som representerte alle unntatt 5' seks nukleotider fra Sabin 3- genomet. Den 5'-mest cDNA-klonen ble modifisert slik at de første seks nukleotidene av Sabin 3 cDNA ble rekonstruert og satt under kontroll av bakteriofag T7-promoteren ved inkorporering av et syntetisk DNA-oligonukleotid

[5'—CTGCAGTAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCTCTGGGGTTTG-3'] ved

anvendelse av polymerase-kjedereaksjonen. Orientering av promoteren forsikrer syntese av positive-sens RNA-transkripter av klonet cDNA. Når den fullstendige nukleotidsekvensen til de fire cDNA-klonene ble sammenlignet med LED3 RNA-sekvensen (24) ble fire nukleotidforskjeller identifisert. Det er uklart om nukleotidforskjellene representerer feil utført i løpet av reverstranskripsjon eller sekvens-divergens av en mindre populasjon innenfor vaksinevirus-prøven. Full-lengde ukorrigert cDNA var derimot ikke infektiøs på grunn av at hverken virus eller CPE resulterte fra transfeksjon av celler med T7-avledede transkripter dannet av cDNA. Sekvensen ble korrigert ved anvendelse av oligonukleotid-rettet mutagenese (se Materialer og Metoder, eksempel 13) ved tre av disse posisjonene: 198 (G til A), 4466 (T til C) og 6334 (T til C). Den siste feilen, TJ istedenfor C i posisjon 2493, representerer det Leon-lignende nukleotidet i denne posisjonen og ble latt stå urørt i full-lengde cDNA i pVR318. Denne klonen er forskjellig fra LED3 RNA-sekvensen bare ved n2493. Det siste trinnet i produksjonen av autentisk LED3 cDNA (pLED3.2) ble oppnådd ved cDNA-fragmentutveksling (SacI ved nl895 til Hindlll ved n4241) mellom pVR318 og en vaksine cDNA-subklon funnet å inneha C i posisjon 2493.

Full-lengde LED3 cDNA-konstruksjonen ved kloning av vektor pBR322 er oppført i figur 7, panel A. Nukleotidsekvensanalyse over grense mellom 3'-terminus til Sabin 3 cDNA og plasmid pBR322 indikerte en poly-A-hale bestående av 27 A. En rad 15 C avledet fra cDNA-kloningstrinnene fulgte rett etter poly-A-halen.

In vitro- transkripsjon av cDNA i pLED3 ogPVR318:

Plasmid DNA ble spaltet med Pvul for 1) danne et lineært DNA-templat inneholdende hele poliovirus cDNA for transkripsjon ved T7 RNA-polymerase og 2) danne et templat med det korteste området av ytre vektorsekvens etter 3'-enden av cDNA. Pvul tilsvarer det første restriksjonssetet etter 3'-enden av cDNA (nøyaktig 126 bp) som ikke er til stede innenfor cDNA. To Pvul-fragmenter (4,4 kb og 8,1 kb) blir produsert fra pLED3 og pVR318, men bare 8,1 kb-fragmentet inneholder T7-promoteren basert på sekvensanalyse. (Det refereres til figur 7, A.) Panel B i figur 7 demonstrerer at RNA blir effektivt syntetisert av T7 RNA-polymerase fra Pvul-spaltet pLED3 og pVR318 og deres størrelse matcher det som antas for "run off"-transkripter fra 8,1 kb-fragmentet. I kolonnene 5 og 6 tilsvarer de to øvre båndene (lav intensitet) 8,1 kb- og 4,4 kb-fragmentene produsert ved spaltning av plasmid DNA med Pvul. Kolonne 4 inneholder HindIII/X-DNA for en ds DNA-størrelsesreferanse. Transkripsjonsproduktet (mest intense bånd i kolonnene 5 og 6) migrerer sammen med 7,5 kb ssRNA-markøren (kolonnene 1-3) som er i samsvar med full-lengde (7585 nukleotider) RNA. Sammenlignet med virus RNA (kolonne 7), migrerer in vitro-transkriptene til poliovirus cDNA noe hurtigere, muligens på grunn av fravær av kovalent koblet VPg-protein. En transkripsjonsreaksjon inneholdende 1 pl templat produserte reproduserbart 20-25 pg full-lengde transkrlpt. Som vist her, er båndet som tilsvarer 1 pg av en 50 pl reaksjonsblanding (kolonne 5 eller 6) omtrent samme intensitet som båndet som representerer 500 ng av 7,5 kb ssRNA (kolonne 2). Direkte sekvensanalyse av disse transkriptene viste det var to ekstra guaniner i 5'-enden rett før det første poliovirus-nukleotidet og bekreftet tilstede-værelsen av 126 bp av ytre pBR322-sekvens ved 3'-enden etter poly-A, poly-C-halen.

Når Vero-cellene ble transfektert med RNA beskrevet ovenfor, ble cytopatiske virkninger i samsvar med poliovirusinfeksjon observert i løpet av 24 timer og virus ble høstet (+ 4 CPE) i løpet av 48-72 timer. Den spesifikke ineffektiviteten til transkriptene ble funnet å utgjøre 1-2 x IO<2>pfu/pg, omtrent 3$ i forhold til vaksine RNA. Som bestemt ved sekvensering mangler RNA fra isolerte viruser den ytre pBR322-sekvensen ved 3'-enden. I tillegg ble genomene til disse virusene verifisert å inneha de attenuerte nukleotidene ved posisjonene 472(U), 2034(U) og 6061(U); nukleotid 2493 var den eneste kjente forskjellen mellom LED3 (2493-C) og VR318 (2493-U).

Mutasjone ved n2493 korrelerer med endret VPl- mobilitet: Mutasjon identifisert i posisjon 2493 i konsensusgenomet til Sabin 3-vaksinevirus foreslår en Ile-6 -» Thr-substitusjon i VP1 (24). For å bestemme om de biologiske egenskapene til VP1 vil bli endret ved denne aminosyresubstitusjonen, ble VP1-proteinene til LED3 endret ved denne aminosyresubstitusjonen. VPl-proteinene til LED og VR318 sammenlignet. VP1 fra LED3 inneholder treonin ved residuet 6, mens VR318 har isoleucin i dette setet. Forskjellen i molekylvekter mellom disse aminosyrene er minimal og VPl-proteinene fra disse virusene kan skjelnes ved SDS-PAGE (figur 8). En mulig forklaring på denne observerte forskjellen i VPl-migrering har oppstått fra det faktumet at Thr-sidekjeden har en hydroksylgruppe som kan danne en hydrogenbinding, mens Ile-sidekjeden er hydrofobisk. Som et resultat av dette kan VP1 til VR318-viruset med Ile-6 binde mer SDS og derfor migrere hurtigere enn VP1 til LED3. Disse data assosierer minst en biofysisk forandring med 2493-mutasjonen. Om denne endringen i VP1 påvirker 3D-strukturen til viruset er under vurdering.

Termostabllitet til LED3- og VR318- vlruser:

I den tredimensjonale strukturen til poliovirus, er den N-terminale regionen til VP1 begravet på innsiden av det native viruset i nære tilknytning til terminale regioner av de andre kapsidproteinene (6). I et forsøk på å vurdere om 2493-mutasjonen endrer virusstabiliteten ble LED3- og VR318- virusene sammenlignet for mottagelighet overfor termisk inaktivering ved flere temperaturer. Som illustrert i figur 9 ble det ikke observert noe tap i titer i virusprøvene over en 5 dagers periode ved romtemperatur (22°C). Ved 37 ° C og 420 C ble titrene til begge virusprøvene redusert. Til tross for varmebehandling ble forskjellene i plakkmorfologi mellom LED3- og VR318-virusene konservert (se nedenfor).

Virkning n2493 på fenotypiske markører:

Liten plakkstørrelse ble ofte anvendt for å differensiere attenuerte vaksinestammer fra virulente stammer (13). Ved utførelse av en enkelt plakktitrering på cDNA-avledede virusprøver på Vero-celle-monolag fremkom det at VR318-viruset produserer plakk som er tydelig større enn de til LED3-virus. Når sammenligningen inkluderte den patogeniske foreldre-Leon-stammen, var det klart at VR318-plakkene har intermediaer størrelse (se figur 10). Disse data foreslår at enkelt-nukleotidforskjell i posisjon 2493 mellom LED3 (C) og VR318 (U) er ansvarlig for økningen i plakkstørrelse vist ved VR318 sammenlignet med LED3.

Den tradisjonelle temperatur-følsomheten (rct/40°C) og "d"-markør-fenotypene til LED3- og VR318-virusene ble også vurdert. Til tross for at disse virusene ikke skjelnes ved noen av disse testene, utviste begge den attenuerte fenotypen sammenlignet med Leon-virus (data ikke vist).

Vekstkurvene til LED3 og VR318:

For å sammenligne LED3- og VR318-replikasjonene ble vekst-kinetikkene til disse virusene sammenlignet i Vero-celler under betingelsene kjent for å være akseptable for attenuert poliovirus (dvs. lav temperatur, høy pH). Figur 11 demonstrerer at det er ingen dramatisk forskjell mellom kine-tikkene til virus frigjort fra Vero-celler infisert med LED3 og VR318. Titrene oppnådd ved 24 timers etter-infeksjon (10<8>pfu/ml) indikerte at ingen av disse virusene blir alvorlig svekket under disse betingelsene. En bestemt forskjell ble observert i ganger økning i titer mellom 8 og 12 timer etter-infeksjon som forslår at VR318 kan ha evnen til å replikere hurtigere enn LED3. I løpet av denne tidsperioden økte titere til VR318 200-ganger sammenlignet med bare en 30-ganger økning for LED3. Om modifikasjon av dyrkningsbetingelsene (dvs. lavere pH) overdriver den observerte forskjellen mellom LED3- og VR318-vekstkinetikker er under vurdering.

Neurovirulensen til LED og VR318 1 aper:

Gjennom konstruksjon og neurovirulenstesting av rekombinante viruser avledet fra full-lengde Sabin 3 og Leon cDNA, har Westrop et al. (25) korrelert den attenuerte fenotypen til Sabin 3 med punktmutasjonene i posisjonene 472 og 2034. Søkerens identifikasjon av Sabin 3-spesifikt punktmutasjon ved 2493 (24) førte til spørsmålet om denne mutasjonen også kan være en derminant for attenuering.

cDNA-avledede viruser, LED3 og VR318, ble sammenlignet med hensiktsmessig kontroller for neurovirulens ifølge tester i aper ved prosedyrer innbefattet i enten WHO eller United States CFR-kravene for akseptering av vaksinemengder (se Materialer og Metoder, eksempel 13). Forskjellene mellom disse prosedyrene omfatter inokuleringsveien (intratalamisk og intraspinalt i forhold i bare intraspinalt) samt mengde (volum og titer) til den injiserte prøven.

Tabell IA viser neurovirulensdata fra CFR-intraspinal (IS)-testen der LED 3 og VR318 ble testet samtidig og sammenlignet med testresultatene til den virkelige vaksinen (RSO+2) produsert på primære apenyreceller (PCMK). Testing av RSO+2 (Vero)-vaksinen demonstrerte at anvendelsen av Vero-celler for å produsere vaksinevirus som beskrevet hadde ingen virkning på attenueringen. Gjennomsnittlige lesjonspoeng produsert av RSO+2 (PCMK), RSO+2 (Vero) og LED3+2 (Vero) var 0,52, 0,36 og 0,34. Disse data demonstrerte at LED3 ikke er mer neurovirulent enn for tiden gjeldende vaksinevirus. Gjennomsnittlige lesjonspoeng til aper som mottok VR318 var 1,31 som var betraktelig høyere (p < 0,01) enn poengene produsert av andre viruser. Disse data indikerer at VR318-virus ikke er ekvivalent til gjeldende RS0+2-vaksine og at tilstedeværelse av C (LED3 og RSO+2) istedenfor U (VR318) i nukleotidposisjon 2493 er attenuerende.

Som ovenfor ble neurovirulensen til LED3 og VR318 etter intratalamisk injeksjonsvei i aper sammenlignet med data oppnådd fra fire fullstendige tester av gjeldende RS0+2-vaksine (tabell IB). På grunn av at hjernevevet er mindre mottagelig enn spinalvev for poliovirusinfeksjon, er neurovirulens ved anvendelse av denne prosedyren basert hovedsakelig på om lesjonene er synlige og i hvilken prosent-andel av apene istedenfor lesjonspoeng. Som demonstrert ved den gjeldende RS0+2-vaksinen, er et lavt reaktivitetsnivå i en apegruppe (4,0$) typisk og ønskelig. Ut fra de 10 apene som mottok LED3, utviste ingen lesjoner. VR318 produserte lesjoner i 2 av 10 (20$) testdyr. Til tross for at en gruppe på 30 aper er nødvendig for en fullstendig IT-test, er den økte prosentandelen av positive aper i VR318-gruppen meget uvanlig og tyder på at VR318 vil svikte CFR IT-data som indikerer at når sammenlignet med gjeldende RS0+2-vaksine, er LED3-virus ekvivalent og VR318 er mer neurovirulent. Ved anvendelse av WHO-testprosedyren ble LED3 og VR318 vurdert samtidig med virus NC1, som er ekvivalent med attenuert type 3 WHO-testreferansen. Som oppført i tabell 2, var de gjennomsnittlige lesjonspoengene for LED3 og VR318 0,21 og 1,51. Bekreftet ved tre forskjellige metoder, er demonstra-sjonen om at LED3 er mer attenuert enn VR318 utvetydig. Tolkningen av WHO-testdataene er noe vanskelig ved yteevnen til den attenuerte referansen NC1. I denne test produserte NC1 et gjennomsnittlig lesjonspoeng på 1,08, som faller mellom verdiene beregnet på LED3 og VR318. Til tross for en gjennomsnittlig poengsum på 1,08 er høyere for denne testreferansen, er sammenligningen av reaktiviteten mellom NC1, LED og VR318 sann på grunn av at de ble undersøkt samtidig. En statistisk sammenligning av resulterende poenger viser til det faktum at ved denne testprosedyren kan VR318 ikke bli sammenlignet med den attenuerte referansen. Basert på disse preliminære data er det uklart om VR318 vil svikte i en full WHO-test som Involverer 24 aper pr. gruppe. Derimot ble lesjonspoengene assosiert med LED3 vist å være betraktelig lavere enn hverken VR318- eller NCl-referansen (p < 0,01).

NCl-referansevirusene representerer vaksinematerialet fremstilt ved anvendelse av Sabin original (SO), ikke gjenoppnådde Sabin opprinnelige (RSO) avkom. Nukleotidsekvens-bestemmelsen i posisjon 2493 i S0+2-vaksinen (Lederle; samme som NC1) viste en l:l-blanding av C og varianten U. Lignende vurdering av gjeldende RS0+2-vaksine (Lederle) demonstrerte bare C i denne posisjonen og dette understøtter det faktum at RSO-avkommet er et renset derivat av SO-stammen (24). På grunn av at testprøvene LED3, VR318 og NC1 ikke var forskjellig i nukleotidsammensetning i posisjon 472 basert på RNA-sekvens-bestemmelse, kommer det økte nivået av neurovirulens utøvd av NC1 sammenlignet med LED3 ved anvendelse av WHO-prosedyren sannsynligvis fra subpopulasjonen til 2493-U-variantene i NCl-blandingen av virus.

Identifikasjonen av en ny Sabin 3-spesifikk mutasjon ved posisjon 2493 som koder for en isoleucin til treonln-utveksllng ved den sjette aminosyren til VP1 (24) er her vist å være en determinant av attenuering. Attenueringen av Sabin 3 poliovirus har vært korrelert med punktmutasjonene i posisjonene 472 og 2034 av andre tidligere (25). For å vurdere bidraget av 2493-mutasjonen ble en virus produsert ved anvendelse av et fullstendig verifisert vaksine cDNA (LED3) og ble sammenlignet med dets derivat, VR318, som har samme unntatt at det har Leon-lignende nukleotid (U) istedenfor C i denne posisjonen. Den ytterligere mutasjon i LED3 er i samsvar med den mindre plakkstørrelsen samt øket neurovirulens i aper.

Data presentert heri demonstrerer at de biologiske egenskapene assosiert med attenuering av Sabin 3 vaksinestamme ble konservert i LED3. Det er mange fordeler assosiert med anvendelse av en Sabin 3 cDNA-avledet frøstamme. Stamvolumene til både de opprinnelige og nyoppnådde Sabinavkom, SO og RSO, er begrenset på grunn av at de er virusplakkisolater. Når avkom blir lagret i form av et klonet, genetisk definert cDNA, blir begrensningene på avkomtilførselen fjernet og slike avkom kan i tillegg bli konservert i ubegrenset tid. Uten restriksjon på avkommengden er en øket fleksibilitet i multiplisiteten for infeksjonen (MOI) som kan bli anvendt for å produsere vaksine. Weeks-Levy et al. (24) viste at virus-prøvene som ble produsert ved en anvendelse aksepterte fremstillende avkom ved høyere MOI er genetisk mer homogene. På grunn av at RNA-viruser i kraft av deres natur danner varianter med høyere frekvens enn DNA-virus, bør et RNA-virusavkom. etablert i form av et klonet, genetisk definert DNA være det mest homogene. Ved denne metoden har mengden av uønskede varianter som kan bli selektivt amplifisert i løpet av passeringen blitt minimalisert og translateres til øket genetisk stabilitet. Passasjestudiene for å vurdere om LED3 utgjør et mer genetisk stabilt avkom sammenlignet med andre fremstillingsavkom for Sabin 3 vaksine er for tiden under vurdering.

Basert på nukleotidsekvens-bestemmelse ble Sabin 3-varianter som innehar U i 2493 i løpet av passasje in vitro vist å akkumulere hurtigere enn varianter med C i 472 (24). I samme studium ble Sabin 3 komponenten til forskjellige OPV funnet å variere meget i proporsjon av C og U ved 2493. Til tross for at data presentert heri ikke beskriver hvordan proporsjonen av 2493-U-varianten påvirker aksepterbarheten av vaksinemengdene, foreslår data som sammenligner virusene LED3 (2493-C) og VR318 (2493-U) at resultatet vil avhenge av neuro-virulenstestmetoden anvendt for vurderingen. Av spesiell Interesse var evnen som CFR intratalamlske testmetoden har til å skjelne LED3 og VR318. Uvanlig høy reaktivitet til VR318 i hjernen sammenlignet med LED3 eller RSO+2-vaksinen foreslår at interaksjonen mellom virus og hjernevev blir forsterket når viruset har U i 2493. På grunn av at WHO-testmetoden ikke vurderer vaksinen ved den intratalamiske injeksjonsveien, foreslår våre data at denne testen mindre sannsynlig detekterer 2493-U-virus-subpopulasjonen i vaksinemengdene.

En deteksjonsmetode som inkorporerer polymerase-kjedereaksjonen ble anvendt nylig av Chumakov et al. (2) for å bestemme at vaksinemengdene inneholdende 472-C-varIantene omfatter mer enn 1,17$ av total virus ikke oppfylte WHO-neurovirulenstesten. Bestemmelse av ekvivalens i posisjon 472 for LED3 og VR318 var basert på sekvensanalyse av viralt RNA. Det ble bestemt at en 10$ variant subpopulasjon er grensen for deteksjon ved anvendelse av denne metoden (20). Det er mulig at den mer sensitive PCR-metoden vil detektere 472-C-subpopulasjonen i både LED3- og VR318-viruspreparatene. Det er derimot usannsynlig at disse virusprøvene vil ha forskjellige proporsjoner av 472-C-varianten på grunn av at LED3 og VR318 har ekvivalente passeringsnivåer fra klonet cDNA og ble dannet under identiske betingelser. En preliminær vurdering av LED3 og VR318 ved anvendelse av en PCR-metode for å detektere 472-C-variantene viser at disse prøvene ikke kan skjelnes.

Det er flere forskjellige dataer som understøtter den selektive fordelen for Sabin 3-variantene som har U i 2493 in vivo, samt in vitro. KW4 isolert fra avføringen 5 dager etter vaksinasjonen, ble tidligere vist å være forskjellig i forhold til den administrerte vaksinestammen i tre posi-sjoner: 472=C, 2493=U og 6061=U/C (20). Basert på data presentert heri, kan det intermediære nivået av neurovirulens som blir observert for KW4 i den studien nå fylle mutasjonen i 2493 samt 472. Weeks-Levy et al. (24) fant at to av tre virusisolater isolert fra nervevevet (hjerne eller ryggraden) til aper som var blitt injisert intraspinalt med NC1, det attenuerte referanseviruset, hadde U i 2493. Det isolert NC1-679B hadde U i 2493 uten tap av attenuert U i 472 og kan spesifikt relateres til hvordan dette virus spres og replikeres i hjernen. Dataene er i samsvar med observasjonene angående øket neurovirulens for VR318 sammenlignet med LED3 testet ved den CFR-intratalamiske metoden.

Mekanismen hvorved forandringen fra U til C i 2493 attenuerer LED3 sammenlignet med VR318 er uklart. Denne mutasjonen endrer det sjette aminosyrekapsidproteinet VP1. I den tredimensjonale strukturen til poliovirus viser Hogle et al. (6) at denne regionen av VP1 er båret på innsiden av det native viruset. Nylig demonstrerte Fricks og Hogle (5) at ved kobling til mottagelige celler gjennomgår viruset konforma-sjonsforandringer som resulterer i frigjøring av kapsidprotein VP4 og fremkomst av aminoterminusen til VPl. Disse forfatterne demonstrerte videre at utsetting av aminoterminusen til VPl var nødvendig for kobling til liposomer og foreslo at disse hendelsene spiller en rolle innen mekanismen for celleinntrengning. I samsvar med disse observasjonene beskrev Kirkegaard (8) to poliovirusmutanter med forskjellige små delesjoner i aminoterminalregionen til VPl som flankerer hver av sidene til residuet seks som defekt ved fysisk frigjøring av viral RNA fra kapsidet i løpet av normal infeksjon. Begge disse delesjonsmutantene utviste liten plakkfenotype. Fra disse data er det lett å spekulere i om det er mutasjonen i Sabin 3 i posisjon 2493 som også påvirker viral ikke-belegning.

I tillegg til mutasjon i VP3 (2034 ) til Sabin 3 har atte-nueringsdeterminanter blitt kartlagt til kapsidproteinene i Sabin 1 (14) og en type 2 stamme (P2/712) som er nært tilknyttet Sabin 2 (16). Til tross for at disse andre mutasjonene oppstår innenfor kapsidprotein VPl, er den strukturelle mutasjonen beskrevet i denne studien den første som blir kartlagt til den aminoterminale regionen til VPl. På grunn av at antall utførelsesformer av oppfinnelsen er blitt beskrevet ovenfor, fremgår det at hovedkonstruksjonene kan bli endret for å tilveiebringe andre utførelsesformer som anvender fremgangsmåten, rekombinante DNA-molekyler, cDNA-molekyler og transformerte verter ifølge denne oppfinnelsen.

REFERANSER

1. Albrecht, P., J.C. Enterline, E.J. Boone og M.J. Kluten. 1983. Poliovirus and polio antibody assay in HEp-2 and Vero cell cultures. J. Biol. Stand. 11:91-97. 2. Chumakov, K.M., L.B. Powers, K.E. Noonan, I.B. Ronison og I.S. Levenbook. 1991. Correlation between amount of virus with altered nucleotide sequence and the monkey test for acceptability of oral poliovirus vaccine. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:199-203. 3. Domingo, E. 1989. RNA virus evolution and the control of viral disease. Prog. Drug Res. 33:93-133. 4. Dunn, G. , N.T. Begg, N. Cammack og P.D. Minor. 1990.

Virus exretion and mutation by infants following primary vaccination with live oral poliovaccine from two sources. J. Med. Virol. 32:92-95. 5. Fricks, CE. og J.M. Hogle. 1990. Cell-induced confor-mational change in poliovirus: Externalization of the amino terminus of VPl is responsible for liposome binding. J. Virol. 64:1934-1945. 6. Hogle, J.M., M. Chow og D.J. Filman. 1985. Three-dimensional structure of poliovirus at 2. 9A resolution. Science 229:1358-1365. 7. Kew, O.M., B.K. Nottay, M.H. Hatch, J.H. Nakano og J.F.

Obijeski. 1981. Multiple changes can occur ln the oral polio vaccines upon rellcation in humans. J. Gen. Virol. 56:337-347. 8. Kirkegaard, K. 1990. Mutations in VPl of poliovirus specifically affect both encapsidation and release of viral RNA. J. Virol. 64:195-206. 9. Kohara, M. , A. Shinobu, S. Kuge, B.L. Semler, T. Komatsu, M. Arita, H. Itoh og A. Nomoto. 1985. An infectious cDNA clone of the poliovirus Sabin strain could be used as a stable repository and inoculum for the oral polio live vaccine. Virology 151:21-30. 10. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 227:680-685. 11. Melnick, J.L., M. Benyesh-Melnick og J.C. Brennan. 1959. Studies on live poliovirus vaccine. JAMA. 171:63-70. 12. Moss, E.G., R.E. 0'Neill og V.R. Racaniello. 1989, Mapping of attenuating sequences of an avirulent poliovirus type 2 strain. J. Virol. 63:1884-1890. 13. Nakano, J.H., J.H. Hatch, M.L. Thieme og B. Nottay. 1978. Parameters for differentiating vaccine-derived and wild poliovirus strains. Prog. Med. Virol. 24:178-206. 14. Nomoto, A. og E. Wimmer. 1987. Genetic Studies of the antigenicity and the attenuation phenotype of poliovirus, s. 107-134. I V/.C. Russell og J.W. Almond (utg.), Molecular basis of virus disease. Cambridge University Press, Cambridge. 15. Racaniello, V.R. 1988. Poliovirus neurovirulence. Adv. Virus Res. 34:217-246. 16. Ren, R., E.G. Moss og V.R. Racaniello. 1991. Indenti-fication of two determinants that attenuate vaccine-related type 2 poliovirus. J. Virol. 65:1377-1382. 17. Stanway, G. , A.J. Cann, R. Hauptmann, P. Hughes, L.D. Clarke, R.C. Mountford, P.D. Minor, G.C. Schlld og J.W. Almond. 1983. The nucleotide sequence of poliovirus type 3 leon a^b: comparison with poliovirus type 1. Nucleic Acids Res. 11:5629-5643. 18. Stanway, G., P.J. Hughes, R.C. Mountford, P. Reeve, P.D. Minor, G.C. Schild og J.W. Almond. 1984. Comparison of complete nucleotide sequences of the genomes of the neurovirulent poliovirus P3/Leon/37 and its attenuated Sabin vaccine derivative P3/Leonl2a^b. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:1539-1543. 19. Stones, P.B., CR. Macdonald, J.K. McDougall og P.F. Ramsbottom. 1964. Preparation and properties of a derivative of Sabin's type 3 poliovirus strain Leon 12a^b. 10th Symposium of the European Association against Poliomyelitis, Warsaw, s. 390-397. 20. Tatem, J.M., C. Weeks-Levy, S.J. Mento, S.J. DiMichele, A. Georgiu, W.F. Waterfield, B. Sheip, C. Costalas, T. Davles, M.B. Ritchey og F.R. Cano. J. Med. Virol., in press. 21. Toyoda, H., Kohara, M., Kataoka, Y., Suganuma, T., Ornata, T. , Imura, N. , og Nomoto. A. 1984. Complete nucleotide sequences of all three poliovirus serotype genomes;

Implication for genetic relationship, gene function and antlgenic determinants. J. Mol. Biol. 174:561:585. 22. United States Code of Federal Regulations. 1990. Poliovirus vaccine live oral. Title 21, Sec. 630.10-17. 23. van der Werf, S., J. Bradley, E. Wimmer, F.W. Studier og J.J. Dunn. 1986. Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:2330-2334. 24. Weeks-Levy, C, J.M. Tatem, S.J. DiMichele, W. Waterfield, A.F. Georgiu og S.J. Mento. Submitted for publication. 25. Westrop. G.D., K.A. Wareham. D.M.A. Evans, G. Dunn, P.D. Minor, D.I. Magrath, F. Taffs, S. Marsden, M.A. Skinner, G.C. Schild og J.W. Almond. 1989. Genetic basis' of attenuation of the Sabin type 3 oral poliovirus vaccine. J. Virol. 63:1338-1344. 26. World Health Organization. 1990. Requirements for poliomyelitis vaccine (oral). W.H.O. Tech. Rep. Ser. 800:30-36.

Claims (6)

1. Sant RNA-virus cDNA avledet fra et vaksinestamme 3 poliovirus,karakterisert vedat nevnte cDNA har TJ i posisjon 2493 og velges fra gruppen bestående av: (a) pLED3.2; som angitt i figur 7a og (b) cDNA som ved ekspresjon koder for polypeptidene som blir kodet ved ekspresjon av pLED3.2.

2. Rekombinant DNA-molekyl,karakterisertved at det omfatter et RNA-virus cDNA ifølge krav 1, som er operabelt bundet til en promoter, som eventuelt er T7-promoteren, istand til å dirigere ekspresjon av nevnte RNA virus cDNA.

3. Vert transformert med et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 2,karakterisert vedat nevnte vert velges fra gruppen bestående av bakterier, gjær, sopp, insektsceller og dyreceller.

4. Vert ifølge krav 3,karakterisert vedat nevnte vert er en dyrecelle valgt fra gruppen bestående av Vero-celler, HeLa-celler, COS-celler, CV-l-celler og primære apenyreceller, eller er E.coli.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt levedyktig RNA-virus,karakterisert vedat den omfatter følgende trinn: (a) anvendelse av ln vitro-transkripsjonsmidler for å fremstille RNA fra et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av ovennevnte krav; (b) isolering av RNA; (c) transfektering av en vert med nevnte isolerte RNA, hvori nevnte vert er en dyrecelle; (d) dyrking av nevnte vert ifølge krav 3 under betingelser som muliggjør produksjon av levedyktige RNA-virus; og (e) høsting av nevnte levedyktige RNA-virus fra nevnte vertscellekultur.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, hvor nevnte RNA-virus er et vaksinestamme 3 poliovirus,karakterisertved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.