CN106459929B - 冷适应病毒减毒(cava)和新颖减毒脊髓灰质炎病毒株 - Google Patents

冷适应病毒减毒(cava)和新颖减毒脊髓灰质炎病毒株 Download PDF

Info

Publication number
CN106459929B
CN106459929B CN201580032103.9A CN201580032103A CN106459929B CN 106459929 B CN106459929 B CN 106459929B CN 201580032103 A CN201580032103 A CN 201580032103A CN 106459929 B CN106459929 B CN 106459929B
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
poliovirus
cava
cell culture
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580032103.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106459929A (zh
Inventor
B·P·桑德斯
J·H·H·V·屈斯泰
D·埃多马塔斯
T·G·乌伊尔
J·A·刘易斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Vaccines and Prevention BV
Original Assignee
Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Vaccines and Prevention BV filed Critical Janssen Vaccines and Prevention BV
Publication of CN106459929A publication Critical patent/CN106459929A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106459929B publication Critical patent/CN106459929B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/32364—Methods of inactivation or attenuation by serial passage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32621—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32661—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/32664—Methods of inactivation or attenuation by serial passage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

脊髓灰质炎病毒(PV)株通过冷适应病毒减毒(CAVA)的新颖方法减毒。得到的重组减毒PV，CAVA‑PV，示出在30℃下的野生型复制，但是在37℃下没有实质性复制。在37℃下不能复制是在感染期间在此温度下通过滴定(感染单位)，qPCR(病毒RNA)或电子显微镜(感染的视觉迹象)，通过不能定量病毒来定义的。CAVA‑PV在生产条件下是遗传稳定的，并且通过用编码不同PV株的衣壳的序列替换编码CAVA‑PV衣壳的序列，示出出用作生产具有与常规疫苗相同抗原谱的减毒株的骨架的效用。此外，在CAVA‑PV中鉴定的突变可以被工程化成不同的，甚至野生型和神经毒性脊髓灰质炎病毒背景株，以获得另外的CAVA‑PV株。

Description

冷适应病毒减毒(CAVA)和新颖减毒脊髓灰质炎病毒株
技术领域
本发明涉及病毒减毒的领域和开发用作疫苗的新颖减毒脊髓灰质炎病毒株。
发明背景
脊髓灰质炎病毒(PV)属于小核糖核酸病毒科内的肠道病毒属。这些小RNA病毒具有单链正义RNA基因组并且是无包膜的。它们被细分为三种血清型；PV1、PV2和PV3。被PV感染通常是无症状的，然而，1％-2％的病例引起了麻痹性脊髓灰质炎，其中病毒诱导的运动神经元的破坏导致麻痹，通常在四肢中，称为急性弛缓性麻痹(AFP)。在这些AFP病例中，5％-10％是致命的，因为病毒扩散到脑干区域，导致呼吸停止，并最终死亡。(对于PV和发病机理的综述，参见，例如米诺尔(Minor)1999，拉卡涅洛(Racaniello)2006，菲佛(Pfeiffer)2010))。
今天，脊髓灰质炎即将被根除，其中在2013年和2014年在全球分别仅有406和359例。有两种疫苗可用，这两种疫苗已经实现这种对抗PV的成功战斗；灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)(索克(Salk)1953)和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)(赛宾(Sabin)1956)。IPV由来自每种血清型(典型地分别为针对PV1、PV2和PV3的Mahoney、MEF-1和Saukett)的三种福尔马林灭活(杀死)野生型(神经毒性)PV株组成。OPV由三种称为赛宾(Sabin)1、赛宾(Sabin)2和赛宾(Sabin)3的活减毒株组成。赛宾(Sabin)株以艾伯特赛宾(Albert Sabin)命名，他通过细胞培养和甚至整个生物体，通过三种亲本野生型病毒的连续传代产生这些株(赛宾(Sabin)1973)。由于OPV的给予便利性和低成本(约翰2009)，它被世界卫生组织(WHO)和全球根除脊髓灰质炎行动(GPEI)通报为1988年根除计划的首选疫苗(WHO 1988)。然而，OPV的使用与根除和最后阶段策略不一致，因为OPV疫苗株显示减毒表型向神经毒性和可传播的脊髓灰质炎病毒的逆转(亨德森，维特(Henderson,Witte)等人，1964)。这些疫苗相关性麻痹性脊髓灰质炎(VAPP)病例以每500,000个疫苗1例的频率发生(约翰(John)2004)。此外，当逆转的疫苗病毒在易感群体中可传播时，产生循环的疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒(cVDPV)。由于OPV现在通过VAPP和cVDPV现象被认为是脊髓灰质炎的潜在来源，因此如果要实现完全根除脊髓灰质炎，就需要消除使用OPV。事实上，在过去十年中，监管机构已经认识到必须停止OPV使用以根除脊髓灰质炎(WHO 2005)。使用IPV，疫苗免疫原是福尔马林灭活的，并且因此在使用此疫苗时没有观察到VAPP和cVDPV。然而，这种疫苗的20倍更高的成本使其不适用于低收入和中等收入国家(海因斯贝克(Heinsbroek)和卢腾伯格(Ruitenberg)2010，齐朗(Zehrung)2010)。为此，WHO及其许多合作者已经启动了多个项目，以开发使IPV更安全，更经济的战略(齐朗2010，霍肯(Hawken)和特洛伊(Troy)2012，雷希克(Resik)，特赫达(Tejeda)等人，2013)。
相对于VAPP和cVDPV，IPV确实是OPV的更安全的替换品，然而，在来自制造设施的这些病毒意外逃逸的情况下，构成疫苗的野生型病毒可能在根除后的时代期间对全球人群构成威胁。此外，当根除时，野生型脊髓灰质炎病毒将受到严格的生物遏制规则，这可能进一步增加这种已经昂贵的疫苗的商品的成本(WHO 2006，维尔戴克(Verdijk)，罗特(Rots)等人，2011)。事实上，WHO已经规定来自全球各实验室的任何野生型PV株的销毁。这些行动将可能会随着根除拉近而更加强烈地执行(WHO 2009年)。基于减毒株的IPV疫苗的开发是更安全的疫苗生产程序，并且减轻在工业事故的情况下潜在疾病爆发的风险。为此，已经提出了基于减毒株的IPV的生产作为用于根除后时代的IPV的安全和经济生产的策略。已经提出多种减毒株作为新颖IPV疫苗的基础，其中大多数研究已投入从赛宾(Sabin)株制备IPV(维尔戴克(Verdijk)，罗特(Rots)等人，2011)。基于赛宾(Sabin)的IPV最近进行了作为独立疫苗的成功的II期临床试验(廖(Liao)，李(Li)等人，2012)，以及与白喉，破伤风和无细胞百日咳(DTaP)组合的II期和III期试验(奥卡达(Okada)，宫崎(Miyazaki)等人，2013)。此外，在日本，基于赛宾(Sabin)的IPV最近已经与DTaP结合得到许可(马哈茂德(Mahmood)，佩尔考斯基(Pelkowski)等人，2013)。然而，赛宾(Sabin)病毒的衣壳与常规IPV野生型病毒显着不同，并且当福尔马林灭活时，赛宾(Sabin)病毒显示出产生针对PV感染的中和抗体(并因此保护)所需的不同抗原特性。事实上，已经观察到，与针对常规IPV产生的免疫应答相比，赛宾(Sabin)IPV的免疫应答被改变，因此，疫苗的不同剂量是必需的(韦斯特戴克(Westdijk)，布吕格曼(Brugmans)等人，2011)。
存在若干种合理工程化的减毒PV株，然而，它们作为IPV疫苗株的潜力，至今尚未被充分探索。一组这样的候选减毒株是，与用于新颖OPV开发的赛宾(Sabin)株相比，基于遗传稳定化的赛宾(Sabin)株作为优良的活疫苗株，连同用于新颖IPV的基础(例如，麦克亚当(Macadam)等人，2006；WO 2008/017870；WO 2012/090000)。这些株能够在生理温度下生长，然而它们在此温度下示出显着降低的感染性。
针对根除后时代，仍然需要开发基于安全的、减毒的脊髓灰质炎病毒株的IPV，它不恢复神经毒性形式并且诱导与基于野生型株的常规IPV类似的免疫应答。
发明概述
本发明提供了一种用于开发重组减毒脊髓灰质炎病毒株的新颖方法，连同可以用作IPV基础的得到的新颖重组减毒脊髓灰质炎病毒株。可以将减毒的骨架重新工程化以包含用于目前IPV疫苗中的株的野生型衣壳，导致在灭活后的野生型抗原性图谱，同时在病毒生产和放大生产疫苗期间维持减毒表型。重组减毒脊髓灰质炎病毒在生产条件下是遗传稳定的。此外，由于它们不能在37℃下复制，因此在(非)故意从制造设施逃脱的情况下，它们不可能在意外摄入时恢复到神经毒性形式。本发明的重组减毒脊髓灰质炎病毒株可以是福尔马林灭活的，用于IPV疫苗。
本发明针对分别由本文所附独立权利要求和从属权利要求限定的一般和优选实施例，为了简洁起见，将其通过引用并入本文。从下面结合附图的详细描述中，本发明的不同方面的其他优选实施例、特征、和优点将变得明显。
在一个实施例中，本发明提供了一种重组脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖，并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，该株包括来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett的衣壳。
在另一个实施例中，本发明提供了重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒1型株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖。
在另一个实施例中，本发明提供了重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒2型株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖。
在另一个实施例中，本发明提供了重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒3型株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖。
在另一个实施例中，本发明提供了包括脊髓灰质炎病毒株和药学上可接受的载体或赋形剂的组合物，其中该脊髓灰质炎病毒株是重组减毒的温度敏感脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，并且其中该脊髓灰质炎病毒株可以任选地包括来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的衣壳。
在另一个实施例中，本发明提供了包括第一、第二和第三重组脊髓灰质炎病毒株的组合物，其中第一、第二和第三重组脊髓灰质炎病毒株中的每一种可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，并且其中该第一、第二和第三重组脊髓灰质炎病毒株分别包括来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1和Saukett株的衣壳。
在另一个实施例中，本发明提供了包括第一、第二和第三重组脊髓灰质炎病毒株的组合物，它进一步包括药学上可接受的载体或赋形剂，其中第一、第二和第三重组脊髓灰质炎病毒株可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，并且其中该第一、第二和第三重组脊髓灰质炎病毒株分别包括来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1和Saukett株的衣壳。
在另一个实施例中，本发明提供IPV组合物，其中该组合物中的脊髓灰质炎病毒被灭活，并且其中在灭活之前，该脊髓灰质炎病毒是重组脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，并且其中该第一、第二和第三重组脊髓灰质炎病毒株分别包括来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1和Saukett株的衣壳。
在另一个实施例中，本发明提供IPV组合物，其中该IPV组合物包括灭活的第一、第二和第三重组脊髓灰质炎病毒株，其中在灭活之前，第一、第二和第三重组脊髓灰质炎病毒株中的每一种可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，并且其中该第一、第二和第三重组脊髓灰质炎病毒株分别包括来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1和Saukett株的衣壳。
在另一个实施例中，本发明提供了包括上述IPV组合物和来自其他病原体(如白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌b型(Hib)、乙型肝炎病毒(HBV)、等)的一种或多种抗原的组合疫苗组合物。
在另一个实施例中，本发明提供了用于针对脊髓灰质炎病毒感染和/或脊髓灰质炎疫苗接种的方法，该方法包括向受试者给予包括如上所述的IPV组合物的组合物或包括如上所述的IPV的组合疫苗组合物。
在另一个实施例中，本发明提供了包括编码脊髓灰质炎病毒基因组或基因组的补体的序列的核酸分子，其中脊髓灰质炎病毒是重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，并且其中该重组减毒的温度敏感脊髓灰质炎病毒包括来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的衣壳。
在另一个实施例中，本发明提供了用于制备包括脊髓灰质炎病毒的制剂的方法，其中该脊髓灰质炎病毒是重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，并且其中该脊髓灰质炎病毒可以任选地包括来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的衣壳，该方法包括
a)用脊髓灰质炎病毒感染细胞培养物中的细胞，
b)培养细胞培养物中的细胞(在允许脊髓灰质炎病毒复制的温度下，例如在约20℃至约33℃之间)以增殖脊髓灰质炎病毒；并且
c)从细胞或从细胞培养物中分离脊髓灰质炎病毒株以获得包括脊髓灰质炎病毒的制剂。
在另一个实施例中，本发明提供了用于制备包括灭活的脊髓灰质炎病毒的制剂的方法，其中在灭活之前，该脊髓灰质炎病毒是重组减毒的温度敏感脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，并且其中该脊髓灰质炎病毒可以任选地包括选自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的衣壳，该方法包括：
a)用脊髓灰质炎病毒感染细胞培养物中的细胞；
b)培养细胞培养物中的细胞(在允许脊髓灰质炎病毒复制的温度下，例如在约20℃至约33℃之间)以增殖脊髓灰质炎病毒；
c)从细胞或从细胞培养物中分离脊髓灰质炎病毒株以获得包括脊髓灰质炎病毒的制剂；并且，
d)灭活该脊髓灰质炎病毒。
在另一个实施例中，本发明提供了用于制备在适合作为药物组合物的配制品中包括灭活的脊髓灰质炎病毒的IPV的方法，其中在灭活之前，该脊髓灰质炎病毒是重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，并且其中该脊髓灰质炎病毒可以任选地包括选自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的衣壳，该方法包括：
a)用脊髓灰质炎病毒感染细胞培养物中的细胞；
b)培养细胞培养物中的细胞(在允许脊髓灰质炎病毒复制的温度下，例如在约20℃至约33℃之间)以增殖脊髓灰质炎病毒；
c)从细胞或从细胞培养物中分离脊髓灰质炎病毒株以获得包括脊髓灰质炎病毒的制剂；
d)灭活该脊髓灰质炎病毒；并且，
e)将该灭活的脊髓灰质炎病毒配制成药物组合物。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于获得重组减毒脊髓灰质炎病毒株的方法，该株可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，该方法包括以下步骤：
a)在<30℃下传代亲本(或起始)脊髓灰质炎病毒株持续足够的代数以产生在37℃下(例如，持续至少5、10、15、20、25、30或35代)具有生长受损的病毒；
b)从在37℃下显示受损生长的病毒群体中分离两种或更多种不同的温度敏感的克隆；
c)测序该温度敏感克隆的基因组；
d)通过比较温度敏感克隆的序列与亲本脊髓灰质炎病毒株的序列，鉴定温度敏感克隆的基因组序列中的突变；
e)通过将来自两种或多种不同的温度敏感克隆的突变组合到(例如，亲本或另一种)脊髓灰质炎病毒株的基因组中来合成重组减毒脊髓灰质炎病毒株；并且，
f)挽救重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖。
在另一个实施例中，本发明提供了用于获得重组减毒脊髓灰质炎病毒株的方法，该株可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中该重组减毒脊髓灰质炎病毒株可以任选地包括选自不同脊髓灰质炎病毒株的衣壳，该方法包括以下步骤：
a)在<30℃下传代亲本脊髓灰质炎病毒株持续足够的代数以产生在37℃下具有生长受损的病毒；
b)从在37℃下显示受损生长的病毒群体中分离两种或更多种温度敏感的克隆；
c)测序该温度敏感克隆的基因组；
d)通过比较温度敏感克隆的序列与亲本脊髓灰质炎病毒株的序列，鉴定温度敏感克隆的基因组序列中的突变；
e)通过将来自两种或多种不同的温度敏感克隆的突变组合到(例如，亲本或另一种)脊髓灰质炎病毒株的基因组中来合成重组减毒脊髓灰质炎病毒株；
f)挽救重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖；并且
g)任选地用编码来自不同脊髓灰质炎病毒株的衣壳的序列替换编码来自挽救的重组减毒脊髓灰质炎病毒株的衣壳的序列。
在某些实施例中，用编码来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的衣壳的序列替换编码来自挽救的减毒脊髓灰质炎病毒株的衣壳的序列。
在某些实施例中，用编码来自赛宾(Sabin)1型、赛宾(Sabin)2型或赛宾(Sabin)3型株的衣壳的序列替换编码来自挽救的减毒脊髓灰质炎病毒株的衣壳的序列。
在另一个实施例中，本发明提供了用于获得重组减毒脊髓灰质炎病毒株的方法，该株可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中该重组减毒脊髓灰质炎病毒株可以任选地包括选自马奥尼(Mahoney)、MEF-1、或Saukett株的衣壳，该方法包括以下步骤：
h)在<30℃下传代亲本脊髓灰质炎病毒株持续足够的代数以产生在37℃下具有生长受损的病毒；
i)从在37℃下显示受损生长的病毒群体中分离两种或更多种温度敏感的克隆；
j)测序该温度敏感克隆的基因组；
k)通过比较温度敏感克隆的序列与亲本脊髓灰质炎病毒株的序列，鉴定温度敏感克隆的基因组序列中的突变；
l)通过将来自两种或多种不同的温度敏感克隆的突变组合到(例如，亲本或另一种)脊髓灰质炎病毒株的基因组中来合成重组减毒脊髓灰质炎病毒株；
m)挽救重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖；并且
n)用编码来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的衣壳的序列替换编码来自挽救的重组减毒脊髓灰质炎病毒株的衣壳的序列。
在另一个实施例中，本发明提供了通过上述方法可获得的重组减毒脊髓灰质炎病毒株。
附图简要说明
图1：通过冷适应病毒减毒(CAVA)减毒脊髓灰质炎病毒株以产生重组减毒脊髓灰质炎病毒株(CAVA-PV骨架)的方法的示意图。代表性线形图示出了在37℃下，亲本或起始脊髓灰质炎病毒株和三个不同的温度敏感克隆的生长。亲本病毒示出为实心圆形，并且3个温度敏感克隆示出为空心菱形、空心圆形和空心正方形。
图2：一组4种不同的1型PV株和代表性的CAVA-PV骨架的悬浮PER.C6(sPER.C6)细胞中的复制动力学。2A：在30℃下生长。2B：在37℃下生长。CAVA-PV、布伦希尔德(Brunhilde)、马奥尼(Mahoney)、Brunenders和赛宾(Sabin)1株的数据分别示出为空心圆形、实心菱形、空心正方形、实心三角形、和实心正方形。
图3：在Brunenders亲本PV和代表性CAVA-PV骨架的sPER.C6细胞中平均复制动力学。误差条表示与平均值相比的标准偏差(N＝3)。图3A示出在30℃下的生长并且图3B示出在37℃下的生长。Brunenders亲本PV示出为实心三角形，并且CAVA-PV骨架示出为空心圆形。
图4：在Brunenders亲本PV和代表性CAVA-PV骨架的HEK293细胞中的复制动力学。4A：在30℃下生长，4B：在37℃下生长，4C：在39.5℃下生长。Brunenders亲本PV示出为实心三角形，并且CAVA-PV骨架示出为空心圆形。
图5：在Brunenders亲本PV和代表性CAVA-PV骨架的L20B细胞中的复制动力学。5A：在30℃下生长，5B：在37℃下生长，5C：在39.5℃下生长。Brunenders亲本PV示出为实心三角形，并且CAVA-PV骨架示出为空心圆形。
图6：在Brunenders亲本PV和代表性CAVA-PV骨架的海拉细胞中的复制动力学。6A：在30℃下生长，6B：在37℃下生长，6C：在39.5℃下生长。Brunenders亲本PV示出为实心三角形，并且CAVA-PV骨架示出为空心圆形。
图7：在Brunenders亲本PV和代表性CAVA-PV骨架的维洛细胞中的复制动力学。7A：在30℃下生长。7B：在37℃下生长。Brunenders亲本PV示出为实心三角形，并且CAVA-PV骨架示出为空心圆形。
图8：在Brunenders亲本PV和代表性CAVA-PV骨架的SK-N-MC细胞中的复制动力学。8A：在30℃下生长。8B：在37℃下生长。Brunenders亲本PV示出为实心三角形，并且CAVA-PV骨架示出为空心圆形。
图9：在Brunenders亲本PV和代表性CAVA-PV骨架的贴壁PER.C6(adPER.C6)细胞中的复制动力学。9A：在30℃下生长。9B：在37℃下生长。Brunenders亲本PV示出为实心三角形，并且CAVA-PV骨架示出为空心圆形。
图10：CAVA-PV骨架(实心圆形)和在8次(空心圆形)传代后(A)在设想的生产条件下(A)在30℃下的复制动力学；和(B)在37℃下在小规模下的复制动力学。
图11：(11A、B)CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、(11C、D)CAVA-PVMEF-1和(E、F)CAVA-PVSaukett和在5次传代后在sPER.C6(N＝3)上在设想的生产条件下(11A、C、E)在30℃下的复制动力学；和(11B、D、E)在37℃下在小规模下的复制动力学。实心菱形代表起始原病毒的生长，而空心正方形、圆形和三角形代表三种传代病毒(分别为N＝1、2和3)中的每一种。
图12：在将编码原始CAVA-PV骨架株的衣壳的序列与编码马奥尼(Mahoney)、MEF-1和Saukett株的衣壳的序列交换后，不同CAVA-PV疫苗株的示意性概览。在衣壳交换后，所得的疫苗株分别称为CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett。
图13：CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett和亲本Brunenders株的复制动力学。12A：在30℃下生长。12B：在37℃下生长。误差条表示与平均值相比的标准偏差(N＝2或3)。Brunenders亲本PV示出为实心三角形，CAVA-PV马奥尼(Mahoney)示出为空心圆形，CAVA-PVMEF-1示出为空心正方形，并且CAVA-PVSaukett示出为空心菱形。
图14：用灭活的14A：CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、14B：CAVA-PVMEF-1或14C：CAVA-PVSaukett免疫的大鼠的病毒中和滴度。
图15：实例1的亲本Brunenders PV、CAVA-PV骨架(与Brunenders亲本株相比具有表1的31个突变)和实例10的另外的CAVA-PV(它对应于具有表4的14个突变的亲本Brunenders株)的复制动力学。15A：在30℃下生长。15B：在37℃下生长。亲本Brunenders PV的数据示出为实心三角形，实例1的CAVA-PV骨架的数据示出为空心圆形，实例10的CAVA-PV数据示出为实心菱形。
图16：实例1的亲本野生型MEF-1，CAVA-PV骨架(在Brunenders背景中具有表1的31个突变)和实例11的另外的CAVA-PV株(它对应于具有如表4中所示的13个突变的亲本MEF-1PV)的复制动力学。16A：在30℃下生长。16B：在37℃下生长。MEF-1的数据示出为实心正方形，实例1的CAVA-PV骨架的数据示出为空心圆形，并且具有13个CAVA突变的MEF-1(实例11的CAVA-PV)的数据示出为空心正方形。
图17：实例1的亲本赛宾(Sabin)3，CAVA-PV骨架(在Brunenders背景中具有表1的31个突变)和实例11的另外的CAVA-PV株(它对应于具有如表4中所示的12个突变的亲本Sabin3 PV)的复制动力学。17A：在30℃下生长。17B：在37℃下生长。赛宾(Sabin)3的数据示出为实心正方形，实例1的CAVA-PV骨架的数据示出为空心圆形，并且具有12个CAVA突变的赛宾(Sabin)3(实例11的CAVA-PV)的数据示出为空心三角形。
图18：(A)在37℃下用PBS(模拟)，(B)在37℃下用马奥尼(Mahoney)，(C)在37℃下用CAVA-PV马奥尼(Mahoney)，和(D)在30℃下用CAVA-PV马奥尼(Mahoney)感染期间的代表性细胞的EM显微照片。
图19：在30℃(空心正方形和圆形)和37℃(实心正方形和圆形)下的感染期间，如通过qPCR所测量的表达为基因组拷贝的在病毒RNA水平中随着时间的CAVA-PV马奥尼(Mahoney)感染(在右Y轴上的Log10Gc，圆形)和如通过滴定所测量的感染单位(在左Y轴上的Log10TCID50/ml，正方形)。
图20：亲本Brunenders，实例1的CAVA-PV骨架，实例6的CAVA-PV马奥尼(Mahoney)和在5’UTR中具有7个CAVA突变抑或在非结构蛋白中具有17个CAVA突变的两个中间病毒的复制动力学。20A：在30℃下生长。20B：在37℃下生长。Brunenders亲本株的数据示出为实心圆，具有在5’UTR中7个CAVA突变的中间病毒的数据示出为实心三角形，在非结构蛋白中具有17个CAVA突变的中间病毒的数据示出为实心正方形，实例1的CAVA-PV骨架的数据显示为空心圆形，CAVA-PV马奥尼(Mahoney)的数据示出为空心三角形。
发明详述
在本发明中，使用冷适应病毒减毒(CAVA)的新颖方法以产生重组减毒脊髓灰质炎病毒株，冷适应病毒减毒脊髓灰质炎病毒(CAVA-PV)。CAVA-PV在低温(30℃)下生长至高滴度，但在生理温度(37℃)下基本上不生长。由于在37℃下基本上不能复制，当在哺乳动物宿主体内时，CAVA-PV株遇到非允许温度，从而赋予适合用作IPV疫苗的基础的减毒表型。CAVA-PV基因组骨架适合于重新工程化以包含编码不同病毒衣壳(例如，用于常规IPV中的三种野生型衣壳)的序列，从而赋予抗原性，并且因此推定具有常规疫苗的相同的免疫原性谱，同时维持CAVA-PV的减毒表型。此外，与市售的常规IPV疫苗相比，本发明的福尔马林灭活的重组减毒脊髓灰质炎病毒株可以用作提供类似免疫应答的IPV，同时消除VAPP和cVDPV的风险。
如本文所定义，“基本上不生长”，“基本上不能复制”，“基本上不复制”和“基本上不能增殖”意指与理论输入/接种(基于计算的MOI)相比，病毒的感染单位的数量增加不超过10％，或优选不超过5％，或更优选不超过1％，或甚至更优选地该病毒的感染单位的数量没有可测量的增加。测量/滴定病毒感染单位的测定(TCID50测定)具有1.7Log10TCID50/ml的检测极限。在某些实施例中，“基本上不生长”，“基本上不能复制”，“基本上不复制”和“基本上不能增殖”定义为与理论输入/接种(计算的基因组拷贝)相比，如通过定量反转录PCR(RT-qPCR)所测量的，病毒RNA(基因组拷贝)没有可测量的增加。在某些实施例中，“基本上不生长”，“基本上不能复制”，“基本上不复制”和“不能基本上增殖”定义为如通过光学显微镜观察到的感染(细胞病变效应)的视觉迹象的缺乏或通过电子显微镜(EM)的感染的视觉迹象(死亡或凋亡细胞与病毒诱导的膜囊泡或病毒晶格)的缺乏。
如本文所定义，“重组体”意指编码脊髓灰质炎病毒的核酸分子已经历了将来自两种或更多种不同来源(例如，不同克隆、不同株、或不同生物体)的遗传成分组合的分子生物操作。本发明的重组减毒脊髓灰质炎病毒可以通过分子DNA克隆产生，或可以通过本领域技术人员熟知和常用的技术化学合成(从头DNA合成)。这甚至可以通过向合同制造商(例如，Genscript公司、GeneArt公司、BaseClear公司)提供希望的重组序列信息来完成，然后可以根据常规技术产生这些分子。关于DNA技术的任何标准手册提供了可以用于产生本发明的重组PV株的详细实验方案。简要地，在下文实例中提供了用于构建这种重组病毒的示例性说明。
如本文所定义的，“减毒”意指脊髓灰质炎病毒的毒力已经降低，这样使得与亲本或起始病毒相比，脊髓灰质炎病毒不致病，但它仍然是有活性的。例如，与野生型株相比，本发明的减毒脊髓灰质炎病毒具有显着更少的神经毒性，并且因此显着降低了引起麻痹的能力(如果有的话)。具体地，本发明的优选的减毒病毒株对于用作疫苗株将是安全的，不仅当如预期的那样以灭活形式给予时，而甚至在偶然感染和/或从制造设施逃逸的情况下。在某些优选的实施例中，当在CD155转基因小鼠中通过脑内(i.c.)给予时，本发明的减毒病毒具有大于1x107TCID50的(P)LD50。
如本文所用，短语“核苷酸”，“核酸”或“核酸分子”是指DNA，RNA，连同任何已知的DNA和RNA的碱基类似物或由其形成的嵌合体。因此，“核苷酸”，“核酸”或“核酸分子”是指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合物形式，它为单链形式、或双链螺旋。双链DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，并且具体地是DNA或RNA分子，仅是指分子的一级和二级结构，并不限于任何具体的三级形式。因此，该术语包括在线性或环状DNA分子(例如，限制性片段或质粒)中发现的双链DNA，连同脊髓灰质炎病毒基因组的单链正义RNA分子及其片段。在讨论具体双链DNA分子或单链RNA分子的结构时，序列可以根据沿着脊髓灰质炎病毒基因组的单链正义RNA分子或DNA的非转录链(即，该链具有与mRNA同源的序列)以5’至3’方向给出序列的一般惯例在本文进行描述。
Brunenders脊髓灰质炎病毒株用作亲本株用于CAVA-PV骨架的生产。Brunenders株是血清型1的，并且最初来源于称为Brunhilde株的临床分离株。在1956年由约翰恩德斯(John Enders)博士在人源的组织培养物中通过十二次连续传代使Brunhilde株传代，得到Brunenders株。该株已经示出部分减毒(恩德斯((Enders)1952，桑德斯(Sanders)，刘(Liu)等人2015))。Brunenders株的代表性序列提供为SEQ ID NO:1。该Brunenders株用作本发明的亲本株，但是一些天然变体在病毒种群中是常见的。
本文还示出CAVA-PV株还可使用MEF-1(为野生型和神经毒性的2型PV)或赛宾(Sabin)3(减毒3型PV)作为亲本株来制备，示出了本发明产生具有在30℃下显着生长且在37℃下没有实质性生长的表型的CAVA-PV株的一般适用性。MEF-1株的代表性序列提供为SEQ ID NO:5并且赛宾(Sabin)3提供为SEQ ID NO:8。根据本文提供的教导，本领域技术人员将清楚，诱导温度敏感表型的突变不是血清型特异性的，并且因此其他脊髓灰质炎病毒株，例如像，马奥尼(Mahoney)或Saukett株，也可以用作亲本株用于产生另外的CAVA-PV株，它具有本发明的表型。
如本文所定义，“亲本株”或“起始株”可以是在自然中循环或从自然中分离的野生型株，已知的标准实验室株，或任何其他尚未经受本发明的CAVA方法的脊髓灰质炎病毒株。亲本株的非限制性实例是Brunenders、MEF-1、马奥尼(Mahoney)、Saukett、赛宾(Sabin)1、赛宾(Sabin)2或赛宾(Sabin)3株。如下为本文的这些株提供了序列的代表性实例：Brunenders(SEQ ID NO:1)、MEF-1(SEQ ID NO:5)、马奥尼(Mahoney)(SEQ ID NO:6)、Saukett(SEQ ID NO:7)、赛宾(Sabin)3(SEQ ID:NO 8)、赛宾(Sabin)1(SEQ ID:NO 9)和赛宾(Sabin)2(SEQ ID NO:10)。
本发明还提供了一种用于获得重组减毒脊髓灰质炎病毒株的方法，该株可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，该方法包括以下步骤：a)在≤32℃的温度下使(亲本)脊髓灰质炎病毒株传代持续足够的代数以产生在37℃下具有生长受损的病毒；b)分离在37℃下显示受损生长的两种或更多种(例如，两种、三种、四种、五种、或更多)不同的温度敏感的克隆；c)测序该温度敏感克隆的基因组，d)通过比较该温度敏感克隆的序列与该亲本脊髓灰质炎病毒株的序列，鉴定该温度敏感克隆的基因组序列中的突变；e)通过将来自两种或多种不同的温度敏感克隆的突变组合到亲本脊髓灰质炎病毒株的基因组中或组合到另一种脊髓灰质炎病毒株的基因组中来合成重组减毒脊髓灰质炎病毒株；并且f)挽救重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖。步骤a)中的传代优选通过以低的感染复数(MOI)的感染进行，例如，在0.0001和1之间的MOI，例如，在0.001至0.1之间，例如，在约0.01。步骤a)中用于传代的温度为32℃或更低，例如，在约20℃和31℃之间，例如，在约24℃和30℃之间，例如，在约30℃。可以使用在该温度下允许脊髓灰质炎病毒生长的任何细胞系，例如，维洛，PER.C6，HEK293、等。本领域技术人员将理解，所需的传代次数不是关键的，并且可以方便地通过筛选分裂的病毒群体的克隆中在37℃下具有受损生长的表型来确定，因为将有助于冷适应表型的突变可以在任何传代中累积。在有限次数的传代后，这种表型可能已经被观察到，并且如果不是，进一步传代可以增加找到具有该表型的克隆的机会。因此，在某些实施例中，步骤a)中的传代次数可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30或更多。如本文所用，在37℃下的“受损生长”被定义为与野生型病毒相比，至少10倍，例如100至1000倍，最大滴度的降低。此外，与野生型或亲本病毒相比，具有受损生长的克隆也可以显示更慢的生长，即，达到最大滴度所需的更长的感染时间。在某些实施例中，与起始(亲本)株相比，温度敏感克隆在更低温度(例如，30℃)的生长动力学会更快。在一个实施例中，为了开发CAVA-PV，将Brunenders亲代株在低温(≤30℃)和低MOI(例如，0.01)下在PER.C6细胞上连续传代超过30次。将得到的病毒群体分裂以在生理温度(37℃)下具有生长受损和在低温(30℃)下具有野生型生长的群体中鉴定温度敏感病毒克隆。通过在37℃下在病毒群体中筛选大约1000个克隆，发现三种温度敏感克隆(与亲本Brunenders株相比，它在37℃下示出生长受损连同在30℃下更快的生长动力学)。
对3种温度敏感克隆进行测序，并且跨越这三个不同克隆发现总共31个突变。每个克隆具有18个核苷酸突变，其中一些在不同克隆中共享，并且一些是每个克隆独特的。将这些突变在PV基因组的4个不同区域中的3个中进行鉴定，它包括5’UTR(非翻译区)，衣壳、和非结构蛋白。在3’UTR中没有鉴定到突变。5’UTR包含三叶草结构，它对于基因组与VpG蛋白(2B)的连接以形成感染性病毒体和将RNA包裹入衣壳是必需的。5’UTR的其余部分是IRES(内部核糖体进入位点)，它对于病毒RNA的翻译是必需的。由于该区域不编码任何蛋白质(非翻译的)，该元件通过直接结合其相互作用的RNA/蛋白质配对物来执行其功能，因此，此结构域的二级结构对其功能是重要的。衣壳区编码病毒颗粒的外表面，并且可以细分为构成病毒体(称为衣壳)的这一外部的四种蛋白质。这四种蛋白质称为VP1、VP2、VP3和VP4。非结构蛋白被细分为蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。蛋白质是病毒复制、多蛋白加工、翻译和与宿主细胞组分相互作用以成功感染所需的。例如，2A蛋白酶经由eIF4G的切割而关闭宿主细胞蛋白质翻译(斯科恩(Skern)和李比希(Liebig)，1994)。3’UTR也是启动互补链合成所需的非翻译区。与5’UTR一样，该元件的结构能够实现其功能。
跨越三个克隆鉴定的31个突变包括IRES中的7个突变，衣壳中的7个突变和非结构蛋白中的17个突变。通过在Brunenders野生型背景中组合所有31个突变开发了第一CAVA-PV骨架(并且因此该第一开发的CAVA-PV是1型脊髓灰质炎病毒)。针对组合以产生这种CAVA-PV骨架的31个突变，参见实例1，表1。针对CAVA方法和如何产生CAVA-PV骨架的示意性概览，还请参见图1。
在一个病毒基因组中的31个突变的组合具有协同效应。通过在37℃下在sPER.C6细胞中没有示出实质性复制，与3个单独的克隆相比，CAVA-PV骨架表现出累积的温度敏感。相反，在相同的细胞中，在30℃下，与Brunenders亲本株和其他PV1株(实例2，图2和3)相比，CAVA-PV骨架示出类似的生长动力学，或甚至更快的生长。随后在不同其他哺乳动物细胞系中测试CAVA-PV骨架的生长特征，并且在所有测试的哺乳动物细胞类型中证实CAVA-PV骨架不能在37℃的生理温度下复制(实例3，图4-9)。
在克隆中发现的突变的合成组合被认为对于获得CAVA-PV表型是必需的(即，与亲本Brunenders株相比在30℃下的类似生长以及在37℃下不能复制)。通过在低温下连续传代Brunenders和MEF-1超过30代，在37℃下完全失去复制的病毒的选择是不可能的。事实上，在Brunenders和MEF-1传代期间获得的大约1000个筛选的克隆中只有2-3个在37℃下示出生长受损(图1)，而与亲本株相比在30℃生长增加的是在Brunenders和MEF-1传代后的克隆中观察到的。因此，这里使用的传代条件为在30℃下改进的生长提供了选择优势，但不利于在37℃下选择具有受损复制的病毒。仅在3个单个克隆中发现的突变合成组合到Brunenders基因组中时才观察到CAVA表型。有趣的是，与亲本株相比，CAVA-PV株在30℃下没有显示出更好的生长(图3)，这是用克隆观察到的。因此，与起始克隆相比，在30℃下的传代期间这些CAVA突变(它对于CAVA表型是必需的)的天然组合将是不利的，并且因此不可能自发地发生。这强调了观察到的突变的合成组合以实现CAVA表型的先决条件。
因此，在某些具体实施例中，本发明提供了重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中与Brunenders株的基因组(SEQ ID NO:1)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括在以下位置中的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个的突变：在5’UTR中的133(A)、142(U)、146(G)、163(A)、579(G)、597(C)、和609(G)；在衣壳中的805(A)、1787(C)、1905(U)、2756(U)、3236(C)、3323(C)、和3376(A)；和在非结构蛋白中的3476(C)、3486(G)、3852(A)、4120(U)、4253(C)、4301(U)、4428(A)、4563(A)、4811(A)、5436(G)、5705(A)、6059(C)、6210(A)、6488(C)、6848(G)、7079(U)、和7102(U)(亲本株的核苷酸在其位置后的括号之间示出，并且因此在此实施例中将其突变成不同的核苷酸)。在其某些具体实施例中，与Brunenders株的基因组(SEQ ID NO:1)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括以下突变中的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个：在5’UTR中的133(A至G)、142(U至C)、146(G至A)、163(A至G)、579(G至A)、597(C至U)、和609(G至A)；在衣壳中的805(A至C)、1787(C至U)、1905(U至C)、2756(U至C)、3236(C至U)、3323(C至U)、和3376(A至G)；和在非结构蛋白中的3476(C至U)、3486(G至A)、3852(A至U)、4120(U至C)、4253(C至U)、4301(U至C)、4428(A至G)、4563(A至U)、4811(A至G)、5436(G至A)、5705(A至G)、6059(C至U)、6210(A至G)、6488(C至U)、6848(G至A)、7079(U至C)、和7102(U至C)。
此外，在用于评估体内脊髓灰质炎病毒神经毒性的转基因CD155小鼠模型(科伊克(Koike)，塔亚(Taya)等人，1991)中，CAVA-PV示出为高度减毒的(实例4，表2)。事实上，没有一个被最高可能剂量的CAVA-PV感染的小鼠示出任何麻痹或任何其他疾病的迹象。赛宾(Sabin)1(也包括在该测试中的已知的减毒PV株)的情况不是这样。在毒力的降序中，在神经毒性小鼠模型中测试的株是马奥尼(Mahoney)、布伦希尔德(Brunhilde)、Saukett、Brunenders、赛宾(Sabin)1-3和CAVA-PV株。已经确定，CAVA-PV比Brunenders(它是部分减毒的株)减毒多出至少100倍，并且至少与赛宾(Sabin)株一样减毒的，赛宾(Sabin)株是熟知的减毒株，它在许多国家中广泛使用，用于针对脊髓灰质炎的口服疫苗接种。
此外，通过重新工程化CAVA-PV骨架以包含来自不同脊髓灰质炎病毒株的衣壳，CAVA-PV适合用作用于开发IPV的减毒疫苗株，该IPV具有目前使用的野生型IPV疫苗的抗原谱，但具有减毒的CAVA-PV表型。例如，CAVA-PV适合用作用于产生减毒脊髓灰质炎病毒的减毒骨架，该减毒脊髓灰质炎病毒包含毒性野生型PV株(1型、2型和3型，例如，1型株马奥尼(Mahoney)，2型株MEF-1和3型株Saukett)的衣壳。这可以例如通过使用常规分子生物学技术用希望的衣壳序列替换来自CAVA-PV株的衣壳序列来完成(参见例如WO 2012/090000中关于将减毒PV株骨架的衣壳重新工程化为野生型株的那些的实例；然而在参考的情况下，与本发明的CAVA-PV株相反，得到的株在37℃下仍然能够进行实质性复制)。因此，CAVA-PV可用于产生用于IPV的重组减毒脊髓灰质炎病毒。优选地，将CAVA-PV工程化为包含与自1952年以来已经成功用于免疫全球群体的野生型IPV株相同的衣壳序列。这将绕过来自针对IPV的其他减毒株的改变的抗原(以及因此推定的免疫原)谱，如在福尔马林灭活时，针对赛宾(Sabin)株所观察到的。因此，在特别优选的实施例中，将CAVA-PV用作骨架，并且将编码衣壳的序列与编码来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的衣壳的序列交换。这产生重组脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，该株包括分别来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett的衣壳。在替代性优选实施例中，将导致CAVA-PV表型的突变(例如，针对Brunenders背景株表4中所示突变中的至少10、11、12、13或14个)工程化到亲本马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的相应位置中，这将分别产生马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株(它们因此具有此类株的原始衣壳)，它们可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖。本发明还提供了此类方法和由此可获得的脊髓灰质炎病毒株。此类株该可用于交换衣壳，例如，已经突变以包含导致CAVA-PV表型的突变的MEF-1株(在30℃下生长，在37℃下没有实质性生长，图11)可以通过进一步的基因工程用作将MEF-1衣壳交换为马奥尼(Mahoney)或Saukett衣壳的基础。
如下文实例6所述，通过替换编码CAVA-PV衣壳(它对应于亲本Brunenders株的衣壳(SEQ ID NO:1的核苷酸747至3389))的序列，将编码来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1和Saukett的衣壳的序列置于CAVA-PV基因组的背景中。得到的疫苗株是CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSauket，它们分别包含马奥尼(Mahoney)、MEF-1和Saukett衣壳。如实例7中所述，将悬浮液PER.C6(sPER.C6)细胞(适合的生产细胞系)中的CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett的生长动力学与Brunenders亲本株的生长进行比较。这些CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett株均在30℃下示出与亲本Brunenders株类似的生长动力学。相反，在37℃下，CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett株示出没有实质性复制。对于没有衣壳交换的第一CAVA-PV骨架观察到这些相同的生长动力学，证明病毒的温度敏感性在衣壳区域外的突变内。
因此，在某些实施例中，本发明提供了重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中与Brunenders株的基因组(SEQ ID NO:1)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括在以下位置中的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个的突变：在5’UTR中的133(A)、142(U)、146(G)、163(A)、579(G)、597(C)、和609(G)；和在非结构蛋白中的3476(C)、3486(G)、3852(A)、4120(U)、4253(C)、4301(U)、4428(A)、4563(A)、4811(A)、5436(G)、5705(A)、6059(C)、6210(A)、6488(C)、6848(G)、7079(U)、和7102(U)(亲本株的核苷酸在其位置后的括号之间示出，并且因此在此实施例中将其突变成不同的核苷酸)。在其某些具体实施例中，与Brunenders株的基因组(SEQ ID NO:1)相比，重组减毒PV株的基因组包括以下突变中的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个：在5’UTR中的133(A至G)、142(U至C)、146(G至A)、163(A至G)、579(G至A)、597(C至U)、和609(G至A)；和在非结构蛋白中的3476(C至U)、3486(G至A)、3852(A至U)、4120(U至C)、4253(C至U)、4301(U至C)、4428(A至G)、4563(A至U)、4811(A至G)、5436(G至A)、5705(A至G)、6059(C至U)、6210(A至G)、6488(C至U)、6848(G至A)、7079(U至C)、和7102(U至C)。在某些实施例中，与Brunenders衣壳相比，已经用来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的衣壳替换此类株的衣壳。代表性衣壳氨基酸序列在本文中提供为马奥尼(Mahoney)(SEQ ID NO:2)、MEF-1(SEQ ID NO:3)、和Saukett(SEQ ID NO:4)，并且技术人员当然知道，一些自然变异在病毒种群体中是常见的。
本领域技术人员还将明白，本文鉴定的CAVA-PV突变可以外推至其他脊髓灰质炎病毒株，因为在许多不同类型的PV株的基因组之间存在相对高度的同源性。因此，通过比对不同株的基因组序列，可以在不同的脊髓灰质炎病毒株中鉴定对应于CAVA-PV中的突变的位置。事实上，已经进行了包含来自所有三种脊髓灰质炎病毒血清型的实例的比对(丰田(Toyoda)，小原(Kohara)等人，1984)。以此方式，CAVA-PV的减毒表型可以转移到其他株以在新的和不同的骨架中产生减毒的CAVA-PV表型。例如，确定CAVA-PV中的31个突变中的11个在CAVA-PV中是独特的，并且在那些位置的亲本Brunenders核苷酸在用于比对的所有其他PV株中是保守的(例如，核苷酸142在CAVA-PV中是C(胞嘧啶)，但该位置的核苷酸在Brunenders亲本株和布伦希尔德(Brunhilde)、马奥尼(Mahoney)、赛宾(Sabin)1、赛宾(Sabin)2、赛宾(Sabin)3、MEF-1和Saukett株中是U(尿苷))。此外，在CAVA-PV中存在6个其他突变，其中在那些位置的亲本Brunenders核苷酸在用于比对的所有PV1株(Brunenders、Brunhilde、Mahoney和Sabin1)中是保守的。还有1个突变在CAVA-PV和赛宾(Sabin)1中是常见的，但是在该位置的核苷酸在所有其他株中是保守的。此外，在用于比对的其他株中不保守的位置的CAVA-PV中存在6个突变。
基于所有CAVA-PV突变的分析，鉴定了14个突变，它们可能对CAVA-PV的温度敏感(并因此减毒)表型提供巨大贡献。14个突变示出在表4中(也参见下文的实例10)。基于以下标准选择突变：a)在其他PV株中的保守；b)基于在37℃下传代后的克隆中的逆转的实验证据；c)与仍然能够在37℃下生长的前述中间传代群体相比，克隆中的新颖突变；并且d)引起氨基酸改变或在必需RNA结构(即，IRES)中的突变。将14个突变工程化到不同的脊髓灰质炎病毒背景株中。因此，本发明的CAVA-PV可以包括表4中的14个突变。本发明的CAVA-PV还可以包括表4中的14个突变和任选地在第一鉴定的CAVA-PV骨架中的另外17个突变中的一个或多个。本发明的CAVA-PV还可以包括表4中的14个突变，以及与野生型株相比在基因组中的任选地另外的其他突变。本发明的CAVA-PV还可以包括表4中的14个突变，并且任选地还可以包括来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的衣壳。还将清楚的是，本领域技术人员可能使用本文的教导制备仅具有表4的14个突变(例如，这些的8、9、10、11、12或13个，在Brunenders背景株中或在其他PV背景株中的相应位置上)的子集的另外的CAVA-PV株，并且测试这些株的CAVA-PV表型，以及以这种方式潜在地获得另外的CAVA-PV株。
因此，在某些实施例中，本发明提供了重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中与Brunenders株的基因组(SEQ ID NO:1)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括在以下位置中的至少10、11、12、13或14个的突变：在5’UTR中的133(A)、142(U)、163(A)、597(C)、和609(G)；和在非结构蛋白中的3486(G)、3852(A)、4120(U)、4428(A)、4563(A)、5436(G)、6210(A)、6848(G)、和7102(U)(亲本株的核苷酸在其位置后的括号之间示出，并且因此在此实施例中将其突变成不同的核苷酸)。在其某些具体实施例中，与Brunenders株的基因组(SEQID NO:1)相比，重组减毒PV株的基因组包括以下突变中的至少10、11、12、13、或14个：在5’UTR中的133(A至G)、142(U至C)、163(A至G)、597(C至U)、和609(G至A)；和在非结构蛋白中的3486(G至A)、3852(A至U)、4120(U至C)、4428(A至G)、4563(A至U)、5436(G至A)、6210(A至G)、6848(G至A)、和7102(U至C)。在某些优选的实施例中，已经用来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1或Saukett株的衣壳替换此类株的衣壳。
通过将突变从CAVA-PV转移到其他脊髓灰质炎病毒株的基因组中的同源核苷酸，本发明的重组减毒脊髓灰质炎病毒株还可以源自除Brunenders株以外的脊髓灰质炎病毒株(例如，布伦希尔德(Brunhilde)、马奥尼(Mahoney)、赛宾(Sabin)1、赛宾(Sabin)2、赛宾(Sabin)3、MEF-1或Saukett株，或源自任何这些的株，或其他株)。此外，本发明的重组减毒脊髓灰质炎病毒株可以源自除Brunenders株以外的脊髓灰质炎病毒株，并且任选地包括来自不同脊髓灰质炎病毒株的衣壳。由于PV株在其基因组长度上示出一些变化，因此突变的确切核苷酸位置可以随各种PV序列的比对而变化。因此，根据如何进行序列比对，当从Brundeners背景外推至MEF-1株或其他脊髓灰质炎病毒毒株时，CAVA突变在核苷酸数上略有不同。与Brunenders株的编号相比，本文提供了马奥尼(Mahoney)(PV1)、MEF-1(PV2)、Saukett(PV3)、赛宾(Sabin)1(PV1)、赛宾(Sabin)2(PV2)和赛宾(Sabin)3(Pv3)株的CAVA突变的相应的核苷酸位置(表4)。
因此，作为另一非限制性实例，在某些实施例中，本发明提供了重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中与MEF-1株的基因组(SEQ ID NO:5)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括在以下位置的中至少10、11、12、13或14个的突变：在5’UTR中的134(A)、143(U)、164(A)、598(C)、和610(G)；和在非结构蛋白中的3481(A)、3847(A)、4115(U)、4423(A)、4558(A)、5431(G)、6205(A)、6843(G)、和7097(U)(亲本MEF-1株的核苷酸在其位置后的括号之间示出，并且因此在此实施例中将其突变成不同的核苷酸)。在其某些具体实施例中，与MEF-1株的基因组(SEQ ID NO:5)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括以下突变中的至少10、11、12、13、或14个：在5’UTR中的134(A至G)、143(U至C)、164(A至G)、598(C至U)、和610(G至A)；和在非结构蛋白中的3481(A至A)、3847(A至U)、4115(U至C)、4423(A至G)、4558(A至U)、5431(G至A)、6205(A至G)、6843(G至A)、和7097(U至C)。在某些实施例中，可以用来自马奥尼(Mahoney)的衣壳或来自Saukett株的衣壳替换此类株的衣壳。
在另外的非限制性实例中，在某些实施例中，本发明提供了重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中与马奥尼(Mahoney)株的基因组(SEQ ID NO:6)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括在以下位置中的至少10、11、12、13或14个的突变：在5’UTR中的131(A)、140(U)、161(A)、593(C)、和605(G)；和在非结构蛋白中的3482(G)、3848(A)、4116(U)、4424(A)、4559(A)、5432(G)、6206(A)、6844(G)、和7098(U)(亲本马奥尼(Mahoney)株的核苷酸在其位置后的括号之间示出，并且因此在此实施例中将其突变成不同的核苷酸)。在其某些具体实施例中，与马奥尼(Mahoney)株的基因组(SEQ ID NO:6)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括以下突变中的至少10、11、12、13、或14个：在5’UTR中的131(A至G)、140(U至C)、161(A至G)、593(C至U)、和605(G至A)；和在非结构蛋白中的3482(G至A)、3848(A至U)、4116(U至C)、4424(A至G)、4559(A至U)、5432(G至A)、6206(A至G)、6844(G至A)、和7098(U至C)。在某些实施例中，可以用来自MEF-1的衣壳或来自Saukett株的衣壳替换此类株的衣壳。
在又另外的非限制性实施例中，本发明提供了重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中与Saukett的基因组(SEQ ID NO:7)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括在以下位置中的至少10、11、12、13或14个的突变：在5’UTR中的133(A)、142(U)、163(A)、596(C)、和608(G)；和在非结构蛋白中的3472(A)、3839(A)、4107(U)、4415(A)、4550(A)、5423(G)、6197(A)、6835(G)、和7089(U)(亲本Saukett株的核苷酸在其位置后的括号之间示出，并且因此在此实施例中将其突变成不同的核苷酸)。在其某些具体实施例中，与Saukett株的基因组(SEQ ID NO:7)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括以下突变中的至少10、11、12、13、或14个：在5’UTR中的133(A至G)、142(U至C)、163(A至G)、596(C至U)、和608(G至A)；和在非结构蛋白中的3472(A至A)、3839(A至U)、4107(U至C)、4415(A至G)、4550(A至U)、5423(G至A)、6197(A至G)、6835(G至A)、和7089(U至C)。在某些实施例中，可以用来自MEF-1的衣壳或来自Mahoney株的衣壳替换此类株的衣壳。
在又另外的非限制性实例，本发明提供了重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中与赛宾(Sabin)3的基因组(SEQ ID NO:8)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括在以下位置中的至少10、11、12、13或14个的突变：在5’UTR中的133(A)、142(U)、163(G)、596(C)、和608(G)；和在非结构蛋白中的3473(A)、3839(A)、4107(U)、4415(A)、4550(A)、5423(G)、6197(A)、6835(G)、和7089(U)(亲本Sabin 3株的核苷酸在其位置后的括号之间示出，并且因此在此实施例中将其突变成不同的核苷酸)。在其某些具体实施例中，与赛宾(Sabin)3株的基因组(SEQ ID NO:8)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括以下突变中的至少10、11、12、13、或14个：在5’UTR中的133(A至G)、142(U至C)、163(G至G)、596(C至U)、和608(G至A)；和在非结构蛋白中的3473(A至A)、3839(A至U)、4107(U至C)、4415(A至G)、4550(A至U)、5423(G至A)、6197(A至G)、6835(G至A)、和7089(U至C)。在某些实施例中，可以用来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1的衣壳或来自Saukett株的衣壳替换此类株的衣壳。
在另外的非限制性实例中，在某些实施例中，本发明提供了重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中与赛宾(Sabin)1株的基因组(SEQ ID NO:9)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括在以下位置中的至少10、11、12、13或14个的突变：在5’UTR中的131(A)、140(U)、161(A)、593(C)、和605(G)；和在非结构蛋白中的3482(G)、3848(A)、4116(C)、4424(A)、4559(A)、5432(G)、6206(A)、6844(G)、和7098(U)(亲本Sabin1株的核苷酸在其位置后的括号之间示出，并且因此在此实施例中将其突变成不同的核苷酸)。在其某些具体实施例中，与赛宾(Sabin)1株的基因组(SEQ ID NO:9)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括以下突变中的至少10、11、12、13、或14个：在5’UTR中的131(A至G)、140(U至C)、161(A至G)、593(C至U)、和605(G至A)；和在非结构蛋白中的3482(G至A)、3848(A至U)、4116(C至C)、4424(A至G)、4559(A至U)、5432(G至A)、6206(A至G)、6844(G至A)、和7098(U至C)。在某些实施例中，可以用来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1的衣壳或来自Saukett株的衣壳替换此类株的衣壳。
在另外的非限制性实例，在某些实施例中，本发明提供了重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中与赛宾(Sabin)2株的基因组(SEQ ID NO:10)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括在以下位置中的至少10、11、12、13或14个的突变：在5’UTR中的131(A)、140(U)、161(A)、594(C)、和606(G)；和在非结构蛋白中的3481(G)、3847(A)、4115(U)、4423(A)、4558(A)、5431(G)、6205(A)、6844(G)、和7098(U)(亲本Sabin 2株的核苷酸在其位置后的括号之间示出，并且因此在此实施例中将其突变成不同的核苷酸)。在其某些具体实施例中，与赛宾(Sabin)2株的基因组(SEQ ID NO:10)相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组包括以下突变中的至少10、11、12、13、或14个：在5’UTR中的131(A至G)、140(U至C)、161(A至G)、594(C至U)、和606(G至A)；和在非结构蛋白中的3481(G至A)、3847(A至U)、4115(U至C)、4424(A至G)、4559(A至U)、5432(G至A)、6206(A至G)、6844(G至A)、和7098(U至C)。在某些实施例中，可以用来自马奥尼(Mahoney)、MEF-1的衣壳或来自Saukett株的衣壳替换此类株的衣壳。
本发明还提供了重组减毒脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下在细胞培养物中增殖，其中与亲本脊髓灰质炎病毒株的基因组相比，重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组在以下位置中的至少10、11、12、13或14个包括以下核苷酸(其中亲本脊髓灰质炎病毒株分别是例如Brunenders/MEF-1/马奥尼(Mahoney)/Saukett/赛宾(Sabin)3/赛宾(Sabin)2/赛宾(Sabin)1株，具有如在例如SEQ IDNO:1/5/6/7/8/9/10中的各自的基因组序列)：在5’UTR中，在位置133/134/131/133/133/131/131的G，在位置142/143/140/142/142/140/140的C，在位置163/164/161/163/163/161/161的G，在位置597/598/593/596/596/593/594的U和在位置609/610/605/608/608/605/606的A；和基于与这四种株的序列比对，在非结构蛋白中，或在其他PV亲本株中的相应位置中，在位置3486/3481/3482/3473/3473/3482/3481的A，在位置3852/3847/3848/3839/3839/3848/3847的U，在位置4120/4115/4116/410741407/4116/4115的C，在位置4428/4423/4424/4415/4415/4424/4423的G，在位置4563/4558/4559/4550/4550/4559/4558的U，在位置5436/5431/5432/5423/5423/5423/5431的A，在位置6210/6205/6206/6197/5197/6206/6205的G，在位置6848/6843/6844/6835/6835/6844/6843的A和在位置7102/7097/7098/7089/7089/7098/7097的C。在某些实施例中，此类株的衣壳包括来自马奥尼(Mahoney)，来自MEF-1或来自Saukett株的衣壳序列。
因此，本发明还提供了用于通过在野生型脊髓灰质炎病毒基因组(例如，来自Brunenders、马奥尼(Mahoney)、MEF-1、Saukett、或其他PV株)中引入突变(例如，经由常规遗传工程或经由完全脊髓灰质炎病毒基因组的从头合成)产生CAVA-PV株的另外的方法，这样使得基因组在以下位置包括至少10、11、12、13或14个以下核苷酸：在5’UTR中，在位置133的G，在位置142的C，在位置163的G，在位置597的U和在位置609的A；和在参照Brunenders株(SEQ ID NO:1)的非结构蛋白中，在位置3486的A，在位置3852的U，在位置4120的C，在位置4428的G，在位置4563的U，在位置5436的A，在位置6210的G，在位置6848的A，和在位置7102的C，或其他PV株中的相应位置，例如，如表4中所提供的。
本发明的重组减毒CAVA-PV株典型地在预想的生产条件下也是遗传稳定的，并且由于其在37℃的生理条件下不能复制，它们当偶然感染和/或从制造设施逃逸时极不可能恢复到神经毒性形式。CAVA-PV株在37℃下的连续传代总是导致在第一次传代后定量病毒的能力，表明在该温度下不能恢复，即使在超过10次的盲传后，也不能恢复在37℃下复制的能力。这使得CAVA-PV比能够在生理温度下复制的其他减毒株具有优势。因此，因为在工业事故的情况下，潜在的疾病爆发的减轻的风险，CAVA-PV提供具有潜在地更低的生物抑制阈值的更安全的疫苗生产程序的IPV疫苗的开发。以此方式，作为IPV的基础，CAVA-PV的固有安全性可以帮助控制IPV制造的成本，连同可以允许在用野生型PV的制造受到限制或造成高风险的国家中制造。此外，CAVA-PV株可以按高密度在PER.C6细胞的悬浮培养物中生长，这提供高产量，并且因此与其他生产细胞系相比，使用此生产细胞系还可以有助于显着降低IPV生产的成本。参见，例如，美国专利号8,546,123和桑德斯(Sanders)，埃多-马塔斯(Edo-Matas)等人，(2012)。
CAVA-PV株可以通过本领域技术人员熟知的方法来增殖。例如，CAVA-PV可以通过在允许的细胞系(例如PER.C6或维洛细胞，HEK293细胞，海拉，L20B，等)中和在允许温度(例如20℃-33℃，26℃-33℃，28℃-32℃，或优选在约30℃)下培养来进行增殖。用于此类细胞系的适合的培养基是广泛已知的并且从不同制造商可获得。优选地，使用无血清培养基，并且在某些实施例中，细胞在悬浮液中培养。典型地在达到最大滴度时进行病毒的收获，这取决于所使用的MOI和孵育温度。通常，在30℃下，1的MOI将在12-48个感染后小时(hpi)之间，例如，18-30hpi，例如，约24hpi达到最大滴度。
用于收获和纯化脊髓灰质炎病毒或病毒组分，以及从其生产疫苗的方法在本领域中使用了数十年，并且因此是熟知的并且已经被充分描述，参见，例如，WO 2007/007344；美国专利号：4,525,349；和(凡维茨尔(van Wezel)，凡斯蒂尼斯(van Steenis)等人，1978，蒙塔尼翁，范格特(Montagnon,Fanget)等人1984)，所有文献通过引用结合在此。
通常，每个脊髓灰质炎病毒株在单独的过程中培养，并且例如，如果制备包含三种类型的脊髓灰质炎病毒的三价疫苗，则将(灭活的，针对IPV)病毒混合并配制用于制备单个剂量。在某些实施例中，例如，每剂量的最终疫苗可以例如包括不同量的每种CAVA-PV。在某些实施例中，这可以用CAVA 1型(CAVA-PV马奥尼(Mahoney))、2型(CAVA-PVMEF-1)和3型(CAVA-PVSaukett)株进行。在某些实施例中，每剂(例如，0.5ml)的最终疫苗可以例如包括10-80，例如1，40，D-抗原单位(DU)的1型，2-20，例如，8DU的2型和8-64，例如，32DU的3型，如通过与参考制剂比较所确定的。
CAVA-PV的灭活可以根据本领域技术人员熟知的方法进行，例如用福尔马林或用β-丙内酯(BPL)，参见，例如(姜(Jiang)，派伊(Pye)等人，1986)。在某些实施例中，用福尔马林进行灭活，例如通过以下方法：将纯化的病毒悬浮液经0.22μm膜进行过滤，在稳定磁力搅拌下加热至37℃持续24小时，此后添加福尔马林溶液以达到1/4,000的浓度。在将病毒悬浮液保持在37℃的同时，磁力搅拌持续前四天。在第六天，将病毒悬浮液经0.22微米膜进行过滤，并在37℃下在悬浮下继续灭活直到第十二天。将灭活的病毒悬浮液匀浆，并可以储存，例如在4℃下。在该步骤之后，可以例如通过混合希望的制剂来制备用于给予的浓缩的和/或最终的批次。
在某些实施例中，将纯化的CAVA-PV或病毒组分配制成药物组合物。这可以根据各种各样方法并使用各种各样缓冲液来进行，所有这些都是根据本领域技术人员在阅读本披露之后所熟知的常规方法。通常，其需要将脊髓灰质炎病毒颗粒引入包括脊髓灰质炎病毒和至少一种药学上可接受的赋形剂的药学上可接受的组合物中。这样的组合物可以在技术人员已知的条件下制备，并且在某些实施例中适合向人类给予。在某些实施例中，组合物可以包括缓冲的培养基，它可以任选地是介质M-199，它用作某些登记的常规IPV的配制品缓冲液。此外，可以使用磷酸盐缓冲盐水，并且最终剂量配制品可以包括例如0.5％的2-苯氧乙醇和最多0.02％的甲醛/剂量作为抗微生物防腐剂。
药学上可接受的载体或赋形剂和稀释剂是本领域熟知的，并且广泛用于广泛的治疗产品中。优选地，应用在疫苗中表现良好的载体。在某些实施例中，疫苗进一步包括佐剂，例如，明矾。佐剂在本领域中已知来进一步提高对一种所施加的抗原决定簇的免疫反应。
为了向人类给予，本发明可以使用包括CAVA-PV和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在本上下文中，术语“医药学上可接受的”意指该载剂或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们给予的受试者中引起任何不必要或不良的影响。此类药学上可接受的载体和赋形剂是本领域熟知的。
纯化的灭活CAVA-PV或其免疫原性部分优选作为无菌溶液被配制并且给予。无菌溶液可以通过，例如，无菌过滤或本领域已知的其他方法来制备。这些溶液然后冻干或填充到药物剂量容器中。溶液的pH通常在pH 3.0到9.5，例如pH 5.0到7.5范围内。脊髓灰质炎病毒或其免疫原性部典型地在具有适合的药学上可接受的缓冲液的溶液中，并且脊髓灰质炎病毒溶液还可以包含盐。任选地，可以存在稳定剂，如白蛋白。在某些实施例中，添加洗涤剂。在某些实施例中，可以将疫苗配制成可注射制剂。这些配制品包含有效量的脊髓灰质炎病毒或其免疫原性部分，是无菌液体溶液，液体悬浮液抑或冻干形式，并任选地包含稳定剂或赋形剂。
根据本发明可获得的CAVA-PV疫苗可以是一价的，其包含一种类型的脊髓灰质炎病毒(1型、2型或3型)，或二价的(包含两种类型的脊髓灰质炎病毒，例如，1型和2型，1型和3型，或2型和3型)，或三价的(包含三种类型的脊髓灰质炎病毒，例如，1型，2型和3型)。
此外，除了用作独立的IPV之外，根据本发明的方法可获得的基于CAVA-PV的IPV可以按常规方式与其他疫苗组合，例如，以组合疫苗的形式，该组合疫苗可以任选地包括另外的疫苗组分，例如，针对白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌b型(Hib)、乙型肝炎病毒(HBV)、等中的一种或多种，像通常对常规IPV所做的那样(参见，例如，“疫苗(Vaccines)”，第5版，S.普洛特金(Plotkin)，W.奥伦斯坦(Orenstein)，P.奥菲特(Offit)，2008，第2部分，针对不同组分和组合疫苗；例如，第25章描述了IPV疫苗[普洛特金(Plotkin)，第605-630页])。因此，根据本发明可获得的CAVA-PV疫苗适合用于扩大免疫规划(EPI)，并且可以与该程序中的疫苗组合。类似于常规IPV，根据本发明的CAVA-PV疫苗可以作为单次剂量给予，或优选在初免-加强方案中给予，其中以适当的时间间隔给予多剂量的疫苗。例如，如WHO对免疫覆盖率高(>90％)的国家所建议的，该时间表可以包括在2个月龄(例如，在2、3和4个月)开始的三个剂量的初级系列。另外，如果初级系列更早开始(例如，以6周，10周和14周的时间表)，可以在至少6个月的间隔后给予加强剂量，即四次剂量的时间表。此外，根据本发明的CAVA-PV疫苗还可以与WHO已经建议的用于常规IPV的OPV组合使用。例如，WHO建议目前仅使用OPV的所有国家向该时间表中添加至少1个剂量的IPV。在脊髓灰质炎流行国家和在引入并随后传播的高风险的国家中，WHO还建议出生时OPV给药(也称为“零剂量”)，随后是3个OPV剂量的初级系列和至少1个IPV剂量。最终，最佳剂量方案可以根据标准医学实践确定，并且将通常遵循与用于可用IPV的方案相同的方案。
本领域技术人员还将明白的是，根据本发明可获得的CAVA-PV疫苗的治疗有效量将取决于给予方案，所给予的重组脊髓灰质炎病毒的单位剂量，重组减毒脊髓灰质炎病毒是否与其他治疗剂组合给予，以及患者的状态和健康。
本发明还包括用于给予包括根据本发明可获得的CAVA-PV疫苗和药学上可接受的载体的组合物的试剂盒。该试剂盒包括本文披露的重组减毒脊髓灰质炎病毒。该试剂盒可以任选地进一步包括药学上可接受的载体，施用器(如注射器)和针对其使用的说明材料。说明书可以提供可用于指导重组减毒脊髓灰质炎病毒的给予或用于增殖该病毒的任何信息。
在括号中的可以包括专利，公开申请，技术文章和学术文章的不同出版物在整个说明书中被引用，并且在说明书结尾处可以找到每个出版物的完整引用。这些引用的出版物中的每一篇通过引用以其全部内容结合在此。
通过参考以下实例进一步说明本发明的其他实施例，特征和优点。
实例
无需进一步描述，据信本领域中的一般技术人员可使用先前描述及以下说明性实例制造且利用本发明并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实例具体指出了本发明的某些实施例，并且不应被解释为以任何方式限制本披露的其余部分。
实例1：用于冷适应病毒减毒(CAVA)和CAVA脊髓灰质炎病毒(CAVA-PV)的生产的方法
针对此实例，将Brunenders亲本株在PER.C6细胞中在低温(≤30℃)和低MOI(0.01)下在补充有4mM L-谷氨酰胺的PermexcisTM介质(经化学定义的无血清培养基，例如，可获自龙沙公司(Lonza)，目录号BE02-039Q)中连续传代34次。将得到的病毒群体分裂以在生理温度(37℃)下具有生长受损和在低温(30℃)下具有野生型生长的群体中鉴定温度敏感病毒克隆。在筛选约1000个克隆时，发现3个克隆(命名为G12P5、F9P4和G11P3)示出在37℃下具有生长受损的温度敏感性。生长受损定义为与亲本病毒相比最大滴度降低100至1000倍。这3个克隆仍然能够在生理温度下复制，但是降低滴度。在更低温度(30℃)下3个克隆的生长动力学与起始亲本株相比更快。对温度敏感克隆进行测序，并且跨越三个不同克隆发现总共31个突变。每个克隆具有18个核苷酸突变，其中一些在不同克隆中共享，并且一些是每个克隆独特的。
为了产生新颖的重组脊髓灰质炎病毒株(本文称为冷适应病毒减毒脊髓灰质炎病毒(CAVA-PV))，使用亲本Brunenders序列作为骨架将3个克隆中鉴定的所有31个突变组合到一个基因组中。亲本Brunenders序列在此提供为SEQ ID NO:1。合成CAVA-PV序列并挽救CAVA-PV骨架。简言之，重组减毒脊髓灰质炎病毒CAVA-PV骨架株的序列以cDNA质粒的形式合成地产生，其中病毒基因组序列直接位于产生病毒RNA所必需的噬菌体T7启动子的下游。为了挽救，将包含CAVA-PV骨架基因组序列的cDNA质粒用作用于由T7聚合酶介导的体外转录的模板，以产生随后用于细胞的转染和病毒挽救的病毒RNA。该挽救程序在本领域中经常使用，参见，例如(范德沃夫(van der Werf)，布兰得利(Bradley)等人，1986)。表1示出组合以产生这种CAVA-PV骨架的31个突变。图1是CAVA方法和如何产生第一CAVA-PV的示意性概览。
实例2：与其他1型PV株相比，sPAER.C6细胞中CAVA-PV骨架的生长动力学
将悬浮液PER.C6(sPER.C6)细胞(生产细胞系)中的CAVA-PV骨架的生长动力学与在30℃和37℃下其他1型PV(PV1)株的生长进行比较。其他PV1株是布伦希尔德(Brunhilde)、Brunenders、马奥尼(Mahoney)和赛宾(Sabin)1。Brunhilde是Brunenders的亲本株，该Brunenders进而又是CAVA-PV骨架的亲本株。马奥尼(Mahoney)是野生型的、神经毒性PV株，它典型地用作索尔克(Salk)的IPV的1型组分的疫苗株。赛宾(Sabin)1是用作活减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)的疫苗株的减毒株。在感染时的悬浮液PER.C6细胞在补充有4mM L-谷氨酰胺的Permexcis介质中具有10x106个细胞/ml的细胞密度。在MOI为2的情况下感染细胞，感染进行一次(N＝1)。使用TCID50测定在30℃下滴定病毒收获物，以给出50％的样品示出感染(CPE)的感染剂量，该感染剂量为组织培养感染剂量50％(TCID50)/ml。sPER.C6细胞中复制动力学的线形图示出于图2中。在30℃下，与其他PV1株相比，CAVA-PV骨架示出野生型生长动力学，或甚至更快的生长。相反，在37℃下，CAVA-PV骨架出人意料地示出没有显着的复制，表明存在将来自将来自3个不同温度敏感克隆的突变组合的协同累积效应。在37℃下，在sPER.C6细胞中，其他PV1株全部正常地复制并且示出类似的生长行为。
在三个独立实验中进一步评估了在sPER.C6细胞中CAVA-PV和Brunenders的生长动力学，并且在30℃和37℃下随时间绘制平均滴度。平均滴度绘制在图3中，其中误差条表示与平均值相比的标准偏差。生长曲线示出在30℃下两种病毒的类似动力学，但是在37℃下CAVA-PV骨架不复制；在此测定期间仅测量输入病毒。亲本Brunenders株在37℃下示出没有生长受损。CAVA-PV骨架在30℃下的平均最大滴度为9.82Log10TCID50/ml，这类似于在sPER.C6细胞上用野生型株获得的滴度(桑德斯(Sanders)，埃多-马塔斯(Edo-Matas)等人，2012)。
实例3：与Brunenders起始病毒相比，CAVA-PV骨架在不同细胞系中的生长动力学
成功的感染是在病毒和宿主细胞之间的复杂相互作用，因此，温度敏感性可能受宿主细胞因子的影响。因此，检查了一组不同哺乳动物细胞系的病毒生长，以证实CAVA-PV骨架在生理条件下不能复制。
图4、5和6分别示出了CAVA-PV骨架和Brunenders在HEK293、L20B和海拉细胞中的复制动力学。针对每种细胞系，在DMEM介质+1％BCS中，在MOI为2的情况下，在3种不同温度(30℃、37℃和39.5℃)下感染1x106个细胞。通过在30℃下对海拉R19细胞进行噬菌斑测定来定量病毒滴度，该测定导致病毒收获物中噬菌斑形成单位(PFU’s)的数量。这结果证实CAVA-PV骨架在所有三种细胞系中在37℃或39.5℃下都不复制。然而，在30℃下，CAVA-PV骨架的生长动力学类似于亲本Brunenders PV株。Brunenders病毒在任何温度下在任何细胞系中示出没有复制受损，但是与更低温度相比，在39.5℃下，滴度略微更低。
图7、8和9分别示出了CAVA-PV骨架和Brunenders在维洛、SK-N-MC和贴壁PER.C6(adPER.C6)细胞中的复制动力学。这些感染在30℃抑或37℃下，在MOI为2，在MEM培养基+5％FBS(维洛和SK-N-MC细胞)或DMEM+10％FBS+4.9mM MgCl2(adPER.C6)中进行。在30℃下使用TCID50测定滴定病毒收获物。维洛和adPER.C6的结果与先前已观察到的结果一致：CAVA-PV骨架仅在30℃下示出与Brunenders株可比较的复制。再次，在37℃下观察到缺乏复制。
针对SK-N-MC细胞系(图8)，CAVA-PV骨架不能在两种温度下复制。此细胞系是源自神经上皮瘤的人神经元细胞系，并且已经用作神经毒性的体外模型(贾汉(Jahan)，威默(Wimmer)等人，2011)。尽管这不是用于神经减毒病毒株的经验证的预测性体外测定，但是在30℃和37℃下在此细胞系中CAVA-PV骨架的抑制的病毒生长可以表明在神经元细胞系中不能复制并且预测神经减毒。
实例4：在CD155转基因小鼠中的神经毒性测试
为了确定体外温度敏感表型是否翻译为神经减毒，使用体内转基因CD155小鼠模型(科伊克(Koike)，塔亚(Taya)等人，1991)。将CD155转基因小鼠遗传修饰以表达脊髓灰质炎病毒受体(PVR或CD155)，它们导致小鼠对PV感染的易感性。用CAVA-PV和其他选择的PV株感染CD155小鼠。将小鼠以不同剂量在脑内(i.c.)，肌内(i.m.)抑或腹膜内(i.p.)进行感染，以确定(麻痹或)致死剂量50((P)LD50)，它对应于在给定测试组中造成50％的小鼠麻痹或死亡所需的感染单位数(以TCID50表示)。(P)LD50越低，病毒的神经毒性越强。表2示出了体内神经毒性测试的结果。针对CAVA-PV(活性CAVA-PV骨架、CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett)，向小鼠给予的病毒的最大量在所注射的任何小鼠中都没有导致任何麻痹迹象，因此，(P)LD50作为大于(>)可以给予的最大剂量给出。作为神经毒性的指示，还确定了其他PV病毒的(P)LD50。Brunenders和布伦希尔德(Brunhilde)是CAVA-PV的亲本株，同时马奥尼(Mahoney)、MEF-1，Saukett和赛宾(Sabin)病毒分别是IPV和OPV的疫苗株。马奥尼(Mahoney)是最强毒性的病毒，其次是布伦希尔德(Brunhilde)、Saukett、Brunenders、MEF-1和赛宾(Sabin)株。这与这些株的文献中的神经毒性数据一致。CAVA-PV比任何野生型株的神经毒性小。经由脑内给予途径(这里使用的最敏感途径，以测量病毒破坏神经元细胞并且引起麻痹的能力)，CAVA-PV比马奥尼(Mahoney)减毒多出至少100万倍。CAVA-PV比Brunenders减毒多出至少100倍，该Brunenders是部分减毒株。为了确定CAVA株是否比赛宾(Sabin)更加减毒，人们将需要使用更敏感的模型来确定神经毒性，因为此模型不够灵敏来区分赛宾(Sabin)和CAVA株。然而，赛宾(Sabin)株确实在给予最高剂量的一些小鼠中诱导麻痹，而CAVA株没有。
在相同的神经毒性模型中，两种已知的减毒病毒(RIPO和赛宾(Sabin)1)的(P)LD50分别已经被报道为>108和5x 107PFU(布沙尔(Bouchard)，拉姆(Lam)等人，1995，贾汉(Jahan)，威默(Wimmer)等人，2011)。然而，这些值没有在相同实验中确定，因此当直接比较这些(P)LD50时，应当谨慎。RIPO株是减毒溶瘤脊髓灰质炎病毒株，它被许可用于临床试验以治疗恶性胶质瘤(贾汉(Jahan)，威默(Wimmer)等人，2011)。CAVA-PV株以与这些减毒株类似的方式表现。事实上，没有一个感染最高可能剂量的CAVA-PV株的小鼠示出任何疾病的迹象，同时这不一定是其他减毒病毒的情况(例如，赛宾(Sabin)1，它是OPV，一种许可的活减毒疫苗的1型组分，每年向数百万儿童给予)。因此，在这种神经毒性模型中，CAVA-PV示出为高度减毒的。
实例5：CAVA-PV在生产条件下的遗传稳定性
CAVA-PV骨架株在预期的生产条件下(在Permexcis介质中具有10x106vc/ml的细胞密度的sPER.C6细胞，MOI为1，在30℃下)以小规模进行传代，并在24hpi收获。传代进行8次，这代表超过理论商业制造批次的5次传代。在这些传代后，对整个基因组进行测序。引入病毒的31个突变中没有一个恢复。除了在3A基因中的核苷酸5206处示出混合群体的一个核苷酸以外，传代后的整个基因组与起始原料相同，引起了氨基酸取代。由于脊髓灰质炎病毒的RNA聚合酶的大错误率，我们假设这种突变是随机的，并且不诱导温度敏感(和减毒)表型的任何逆转。我们随后通过进行复制动力学证实温度敏感表型，并且观察到在30℃和37℃下与CAVA-PV起始原料相比，8x传代的CAVA-PV示出类似的生长曲线(图10)。因此，CAVA-PV骨架的温度敏感表型(神经减毒的体外指示)在生产条件下多次传代后是稳定的。这将使CAVA-PV适合用于生产用于商业用途的批次的制造过程。
使用预想的疫苗株(即，CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett)进行相同的遗传稳定性测试。在此，在预想的生产条件(在Permexcis介质中的细胞密度为10x106vc/ml的sPER.C6细胞，MOI为1，在30℃下，并在24hpi下收获)下，病毒在小规模下传代三次(n＝3)。传代数为5，表示超过理论商业批次的两次传代。图11描绘了与起始原料相比的所有传代病毒的体外表型。所有病毒保持其温度敏感表型，连同它们的体内减毒，其中在延长传代后三种血清型的PLD50仍>108。图11的传代病毒的测序示出只有少数突变出现，并且如上所述，这些突变不影响体内和体外的减毒。
实例6：将常规IPV抗原谱引入CAVA-PV中
为了产生可显示与常规IPV相同的免疫谱的基于CAVA-PV的IPV，通过替换编码原始CAVA-PV骨架衣壳的序列，将编码一些示例性病毒的衣壳的序列置于CAVA-PV基因组的背景中。这种衣壳交换去除了刻意工程化到CAVA-PV中的31个突变中的7个。衣壳交换首先在计算机中设计，并且从而通过新颖基因组的化学合成产生DNA。一旦质粒DNA被合成(外包给Genscript公司)，这被用于经由体外转录产生病毒RNA，并因此经由转染挽救不同的新颖重组CAVA-PV。得到的疫苗株命名为CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSauket，它们分别包含马奥尼(Mahoney)、MEF-1和Saukett衣壳。本文提供了PV 1型株马奥尼(Mahoney)(SEQID NO:2)，PV 2型株MEF-1(SEQ ID NO:3)和PV 3型株Saukett(SEQ ID NO:4)的代表性衣壳氨基酸序列。图12示出了这些不同的CAVA-PV疫苗株的示意性概览。
实例7：与亲本Brunenders株相比，在sPER.C6细胞中CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett的生长动力学
将悬浮液PER.C6(sPER.C6)细胞(生产细胞系)中的CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett的生长动力学与在30℃和37℃下PV1Brunenders的生长进行比较。在感染时的悬浮液PER.C6细胞在补充有4mM L-谷氨酰胺的Permexcis介质中具有10x 106个细胞/ml的细胞密度。在MOI为1的情况下感染细胞，CAVA-PVSaukett和Brunenders(N＝2)进行两次感染，并且CAVA-PV马奥尼(Mahoney)和CAVA-PVMEF-1(N＝3)进行三次感染。在30℃下使用TCID50测定滴定病毒收获物。sPER.C6细胞中复制动力学的线形图示出于图13中。在30℃下，与亲本Brunenders株相比，CAVA-PV示出野生型生长动力学，其中误差条表示与平均值相比的标准偏差。相反，在37℃下，CAVA-PV示出没有实质性复制，如针对CAVA-PV骨架也观察到的，表明病毒的温度敏感位于衣壳区外的突变内。在37℃下，在sPER.C6细胞中，Brunenders株正常复制并且示出类似的生长行为。
CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett在30℃下的平均最大滴度分别为9.94、9.91和9.74Log10TCID50/ml，这类似于在sPER.C6细胞上用野生型株获得的滴度(桑德斯(Sanders)，埃多-马塔斯(Edo-Matas)等人，2012)。
实例8：与常规IPV株马奥尼(Mahoney)、MEF-1和Saukett相比，sPER.C6细胞中CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett的体外抗原含量
IPV给药基于D-抗原单位(DU)，D-抗原单位(DU)通过体外D-抗原酶联免疫吸附测定(ELISA)(比尔(Beale)1961)进行定量，如欧洲药典专论0214中所述来进行。针对野生型IPV，一剂疫苗分别包含灭活的马奥尼(Mahoney)、MEF-1和Saukett病毒的40、8和32Du，对应于在疫苗接受者中诱导保护性免疫应答的剂量(格拉斯里(Grassly)2014)。通过D-抗原酶联免疫吸附测定(ELISA)测定定量活性CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett病毒的D-抗原含量，并因此间接地确定免疫原性效力，并且与常规IPV株、马奥尼(Mahoney)、MEF-1和Saukett进行比较。在细胞密度为10x 106个细胞/ml的情况下，以MOI为1，在悬浮液中的PER.C6细胞中进行感染。感染温度对于CAVA-PV株为30℃，并且对于野生型株为35℃，因为这是常规IPV的生产温度。
表3示出了针对病毒获得的D-抗原值，表示为每毫升感染收获物(DU/ml)和每感染单位(DU/TCID50)。由于每毫升D-抗原性(DU/ml)取决于样品中存在的病毒浓度(滴度或TCID50/ml)，因此计算CAVA-PV株对比野生型株的每感染单位的特异性抗原含量。这对应于株的公平比较。对于CAVA-PV株对比其野生型对应方，特异性抗原含量是类似的，表明可以预期CAVA-PV和其野生型对应方之间的类似的免疫原性谱。由于病毒包含相同的衣壳序列，预期抗原性是类似的，这由获得的D-抗原结果证实。
实例9灭活和纯化的CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett在大鼠中的体内免疫原性。
CAVA疫苗株：将CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett进行纯化和灭活。在设想的生产条件下，使用来自感染的澄清的粗收获材料，通过两个随后的色谱步骤进行纯化(2x 250ml在包含sPER.C6细胞的滚瓶中，其中在Permexcis介质中细胞密度为10x106vc/ml，MOI为1，在30℃下)。使用Sartobind S阳离子膜进行阳离子交换层析(CEX)，此后将洗脱的材料用于尺寸排阻色谱步骤以进一步纯化(精制)和缓冲液交换。在灭活前使用M199和甘氨酸调节SEC洗脱液。通过添加0.009％福尔马林(或3.3mM甲醛)，并在37℃下孵育13天进行灭活。在灭活的第6天和第13天进行过滤。将灭活的大块用于大鼠中的体内免疫原性测试。将四组韦斯特雌性大鼠(n＝10)用每种灭活的CAVA疫苗株的1:1(全人剂量)、1:2、1:4和1:16的稀释液进行免疫。全人剂量分别代表1型、2型和3型的40、8或32个D-抗原单位，它是常规IPV的剂量。将大鼠放置21天，之后将它们放血，并且将血清用于使用赛宾(Sabin)病毒作为激发病毒和Hep2C细胞的病毒中和测定。图14描绘了在用灭活的CAVA-PV马奥尼(Mahoney)、CAVA-PVMEF-1抑或CAVA-PVSaukett免疫后，在大鼠中产生的中和抗体滴度。所有三种疫苗株示出是免疫原性的，因为当完全疫苗剂量稀释时，它们以剂量依赖性方式诱导高滴度的中和抗体的产生。
实例10：另外的CAVA-PV株的产生。
针对源自三个独立克隆(参见，实例1，表1)的31个突变，分析了在一组PV株中的它们的保守性。我们鉴定了14个突变，这些突变可能在提供CAVA-PV种观察到的温度敏感表型中发挥重要作用。这些描绘于表4中。在此表中，单个星号描绘了在CAVA-PV中是独特的并且在那些位置的核苷酸在所有其他用于比对的PV株中是保守的突变，这些所有其他PV株是Brunenders、连同布伦希尔德(Brunhilde)、马奥尼(Mahoney)、赛宾(Sabin)1、赛宾(Sabin)2、赛宾(Sabin)3、MEF-1、和Saukett。该表中的双星号描绘了在CAVA-PV中是独特的并且在那些位置的核苷酸在所有如下用于比对的其他1型PV株中是保守的突变：Brunenders、布伦希尔德(Brunhilde)、马奥尼(Mahoney)和赛宾(Sabin)1。CAVA-PV中位置4120的核苷酸突变与赛宾(Sabin)1共享，但是在该位置的核苷酸在所有其他用于比对的PV株中是保守的。
我们将表4中描述的这14个突变插入Brunenders的亲本序列以确定对温度敏感性的影响。如实例1中所述制备病毒。简言之，合成包含具有14个突变的Brunenders基因组的重组cDNA质粒。将所得质粒进行体外转录和随后的RNA转染。在补充有4mM L-谷氨酰胺的Permexcis介质中，在MOI为1并且细胞密度为10x 106个细胞/ml的情况下，在30℃抑或37℃下，通过感染细胞，在PER.C6细胞中进行复制动力学。在感染后0、2、8、24和48小时取样并且进行滴定。
图15示出与其野生型对应方(Brunenders亲本株)相比，具有此实例中所述的14个突变的新CAVA-PV株和实例1的CAVA-PV骨架株(具有31个突变)的生长曲线。Brunenders亲本菌株示出了在37℃和30℃下如从野生型菌株中预期的生长曲线，分别在感染后10和24小时内达到平台期滴度。当引入14个突变时，新CAVA-PV株显示与实例1的CAVA-PV骨架株类似的生长表型，其与亲本株相比具有超过两倍量(即，31个)的突变。在37℃下观察到没有复制，而在30℃下，复制与野生型可比较。
这些结果示出，在生理温度下的适应性的丧失已经可以通过这些14个突变来诱导。此外，进一步对于上述不同实施例，此实例提供了根据本发明的CAVA-PV株的又另一个实施例，即，重组脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下增殖。
实例11：从来自不同血清型的不同亲本株产生CAVA-PV株
前述实例都描述了使用Brunenders株(部分减毒的1型PV株)作为用于产生不同CAVA-PV株的起始的或亲本的株。在此实例中，使用两种非常不类似的亲本株，即2型神经毒性、野生型MEF-1株、和3型神经减毒赛宾(Sabin)3株作为背景(亲本)株。常规将MEF-1用作常规IPV制剂的2型免疫原，而赛宾(Sabin)3是OPV制剂的组分。
将表4中关于Brunenders株描述的14个突变中的十三个在相应的核苷酸位置插入MEF-1株(SEQ ID NO:5；因为MEF-1株在位置3481处已经包含A，此位置未突变，因此是13个而不是14个突变)中以确定对温度敏感性的影响。使用赛宾(Sabin)3基因组序列(SEQ IDNO:8，因为用赛宾(Sabin)3株已经分别在位置163和3473处包含G和A，这些核苷酸没有突变，因此是12个而不是14个突变，针对每个株的CAVA突变的详细描述，参见表4)进行相同的操作。
如实例1中所述制备MEF-1和赛宾(Sabin)3病毒。简言之，首先合成包含具有13和12个突变的MEF-1和赛宾(Sabin)3基因组的重组cDNA质粒。将得到的质粒进行体外转录和随后的RNA转染。在补充有4mM L-谷氨酰胺的Permexcis介质中，在MOI为1并且细胞密度为10x 106个细胞/ml的情况下，在30℃抑或37℃下，通过感染细胞，在PER.C6细胞中进行复制动力学。在感染后0、2、8、24和48小时取样并且进行滴定。
图16示出了与野生型MEF-1株相比，基于具有本实例中描述的13个突变的MEF-1的新株和实例1的CAVA-PV骨架株(即具有31个突变的Brunenders株)的生长曲线。MEF-1亲本株示出了在37℃和30℃下如从野生型菌株中预期的生长曲线，分别在感染后10和24小时内达到平台期滴度。当引入13个突变时，新的基于MEF-1的株开发了类似于实例1的CAVA-PV骨架株的生长表型，CAVA-PV骨架株基于Brunenders背景株，并且与其亲本株相比具有超过两倍量的突变。在37℃下观察到没有复制，而在30℃下，复制与野生型可比较。
图17示出与减毒的赛宾(Sabin)3株相比，与实例1的CAVA-PV骨架(即，具有31个突变的Brunenders株)相比，基于此实例中描述的具有12个突变的赛宾(Sabin)3的新株的生长曲线。赛宾(Sabin)3OPV株在37℃和30℃下均示出与野生型PV生长可比较的生长曲线，分别在感染后10和24小时内达到平台期滴度。当引入12个突变时，新的基于赛宾(Sabin)3的株显示出类似于基于Brunenders背景株的实例1的CAVA-PV骨架株的生长表型。在37℃下观察到没有复制，而在30℃下，复制与野生型可比较。
数据证明，具有13和12个突变的新的MEF-1和赛宾(Sabin)3株分别还具有CAVA-PV表型，并且因此是根据本发明的CAVA-PV株的又一个另外的实施例，即重组脊髓灰质炎病毒株，它可以在30℃下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37℃下增殖。因此，总共14个突变(其中1和2已经存在于新的MEF-1和赛宾(Sabin)3亲本株中)足以将CAVA-PV生长表型传递到野生型脊髓灰质炎病毒株中。该实例还证明了产生另外的CAVA-PV株的替代性方式，并且示出此类株可以从不同的脊髓灰质炎病毒亲本株制备。值得注意的是，这些数据示出，亲本株既不需要是1型PV株，也不需要是野生型的或部分减毒的株，因为此实例的亲本株是2型的，神经毒性的和野生型的PV株连同3型减毒菌株。此实例的新株具有MEF-1野生型衣壳序列，并且因此可以直接用于产生针对2型PV的安全和有效的IPV。它也可以用作将这种衣壳交换为其他野生型衣壳如马奥尼(Mahoney)或Saukett衣壳的起点。技术人员还将理解，此实例使得表4的14个突变(或其子集)引入马奥尼(Mahoney)、Saukett、赛宾(Sabin)1和赛宾(Sabin)2株的基因组中的相应位置将产生另外的CAVA-PV株显得可信，该另外的CAVA-PV株可以用作用于IPV生产的安全和有效的疫苗株。
实例12：通过EM定量CAVA-PV感染
通过在37℃下CAVA-PV株的滴定(TCID50)定量病毒感染没有导致观察到细胞病变效应(CPE)，因此滴定必须在30℃下进行。这被CAVA-PV菌株的复制动力学曲线的证实，证明在37℃下感染期间感染单位没有增加(图2-11、13、15-17)。这表明病毒在此温度下不能复制。然而，为了进一步了解在37℃下复制的阻断，我们执行电子显微镜(EM)作为表征PV感染的替代性方法。图18描绘了在细胞密度为10x 106个细胞/ml，在MOI为1的的情况下，在30℃和37℃下，使用马奥尼(Mahoney)、CAVA-PV马奥尼(Mahoney)或PBS(模拟感染)感染sPER.C6细胞后EM的结果。
将EM样品在0.1M二甲胂酸盐缓冲液(pH 7.4)中的1.5％戊二醛中固定，并用1％四氧化锇染色。然后将样品在0.14M二甲胂酸缓冲液中洗涤，并且在3％琼脂中沉淀，此后将沉淀用乙醇系列逐渐脱水。然后将样品用环氧丙烷和环氧化物LX-112树脂的1:1混合物(LaddResearch公司)浸润一小时，并且在100％环氧树脂LX-112中再浸泡另外1小时，此后将样品在60℃下聚合48h。切割50nm厚度的细胞切片，置于碳包被的formvar网格上，并用7％乙酸双氧铀和柠檬酸铅复染色。使用在120kV下操作的Tecnai12BioTwin透射电子显微镜(FEI公司)用于成像。
图18中的EM数据描绘了来自每次感染的代表性细胞。在30℃下用CAVA-PV马奥尼(Mahoney)感染的细胞类似于用野生型马奥尼(Mahoney)株感染的那些，大多数细胞已经死亡并裂解或凋亡。凋亡细胞具有尺寸收缩并且颜色非常暗。这些凋亡细胞包含ER膜的重连同病毒诱导的囊泡形成。当细胞中的脊髓灰质炎病毒浓度高时，可以形成高度结构化的病毒晶格，这在马奥尼(Mahoney)和CAVA-PV马奥尼(Mahoney)(在30℃下)样品中可见。
然而，在37℃下，CAVA-PV马奥尼(Mahoney)感染的细胞没有示出与PV感染相关的任何这些特征。事实上，在样品中的任何细胞中，在没有感染的迹象的情况下，这些细胞示出是健康的。在37℃下孵育的CAVA-PV马奥尼(Mahoney)感染的细胞类似于PBS模拟感染的样品。该37℃下孵育的样品的CAVA-PV马奥尼(Mahoney)滴度测量为4.32TCID50/ml，这小于理论输入(7.0TCID50/ml，如已知滴度的输入病毒的添加体积的所计算的MOI)，然而它证实了CAVA-PV马奥尼(Mahoney)病毒确实已经添加到感染中，而不诱导任何感染的迹象。
实例13：通过qPCR定量CAVA-PV感染
将用于EM(实例12)的样品样品进行定量PCR以确定感染期间病毒RNA的水平。使用QIAamp病毒RNA分离试剂盒从感染收获物中分离病毒RNA，之后使用与3D聚合酶基因结合的引物，将PowerSYBR GreenRNA-to-Ct 1步骤试剂盒用于RT-qPCR。图19描绘了通过滴定感染收获物观察到的vRNA水平，当在37℃下维持CAVA-1马奥尼(Mahoney)感染时，病毒RNA水平降低，然而，当感染温度为30℃时不是这种情况，其中观察到vRNA的增加。因此，可以得出结论，RNA复制存在缺陷，并且可能在37℃下完全阻断。因此CAVA-PV复制中的阻断发生在RNA复制水平，或在感染周期中更早。
实例14：不显示CAVA表型的PV的产生。
为了进一步了解CAVA表型中涉及哪些突变，在亲本Brunenders株的背景中，新中间病毒在5’UTR中构建了7个CAVA突变抑或在非结构蛋白中建了17个突变(SED ID NO:1，参见表4，关于这两个区域中的CAVA突变)。实例6的CAVA-PV株已经证明，可以除去衣壳中的CAVA突变而不影响CAVA表型，因此这里仅检查5’UTR和非结构区中的突变。与亲本Brunenders株，实例1的CAVA-PV骨架和实例6的CAVA-PV马奥尼(Mahoney)相比，在30℃和37℃下测试中间病毒的复制动力学。
如实例1所述制备中间病毒。简言之，首先合成包含在5’UTR中具有7个CAVA突变或在非结构蛋白中具有17个CAVA突变的Brunenders基因组的重组cDNA质粒。将得到的质粒进行体外转录和随后的RNA转染。在补充有4mM L-谷氨酰胺的Permexcis介质中，在MOI为1并且细胞密度为10x 106个细胞/ml的情况下，在30℃抑或37℃下，通过感染细胞，在PER.C6细胞中进行复制动力学。在感染后0、2、8、24和48小时取样并且进行滴定。
图20示出了与野生型Brunenders株相比，基于Brunenders亲本株具有如此实例中所描述的突变的新株，连同实例1的CAVA-PV骨架株(即，具有31个突变的Brunenders株)的生长曲线。中间株在37℃下示出生长受损的曲线，其中与Brunenders亲本株相比，复制受阻，但与CAVA-PV骨架相比未废除。在此，与Brunenders亲本株相比，中间病毒以更慢的速率生长连同降低最大滴度。在30℃下，分别与Brunenders亲本株连同实例1和6的CAVA-PV骨架和CAVA-PV马奥尼(Mahoney)株相比，中间病毒示出相同的生长曲线。在感染后24小时内达到平台期滴度。在引入5’UTR或非结构突变时，新株不具有与CAVA-PV骨架和CAVA-PV马奥尼(Mahoney)株相同的表型，因此可以得出结论，CAVA表型只能在来自两个区域(5’UTR或非结构蛋白)的突变组合到一个亲本基因组时被诱导。
表1：具有总共31个突变的CAVA-PV，包括5'UTR中的7个突变，衣壳中的7个突变，和非结构蛋白中的17个突变。表1中描述的核苷酸位置参考Brunenders株的基因组，针对其他PV，确切的核苷酸编号可能略微不同。
Figure BDA0001181090240000351
非结构蛋白中的17个突变
Figure BDA0001181090240000352
Figure BDA0001181090240000361
表2：针对CD155转基因小鼠中体内神经毒性的小鼠模型
Figure BDA0001181090240000362
Figure BDA0001181090240000371
表3：CAVA-PV马奥尼(Mahoney)，CAVA-PVMEF-1和CAVA-PVSaukett的抗原含量
Figure BDA0001181090240000372
表4：针对一些CAVA-PV株的温度敏感性的14个突变(例如，实例10和11)。*：在CAVA-PV中是独特并且在那些位置的亲本Brunenders核苷酸在所有其他用于比对的PV株中是保守的的突变。**：在CAVA-PV中是独特并且那些位置的亲本Brunenders核苷酸在所有其他用于比对的PV1株中是保守的突变。代表性亲本株基因组序列被提供为SEQ ID NO:1(Brunenders)，SEQ ID NO:5(MEF-1)，SEQ ID NO:6(马奥尼(Mahoney))，SEQ ID NO:7(Saukett)，SEQ ID NO:8(赛宾(Sabin)3)，SEQ ID NO:9(赛宾(Sabin)1)和SEQ ID NO:10(赛宾(Sabin)2)。针对所有株和相应位置，所述的所有核苷酸变化是相同的，除了：在编码2A蛋白的序列中的突变，它分别在MEF-1、Saukett和赛宾(Sabin)3株中在位置3481和3473已经是腺嘌呤，在表中注释为“a”。IRES结构域II中的突变已经是赛宾(Sabin)3中在位置163的鸟嘌呤，在表中注释为“b”。在赛宾(Sabin)1中的2B蛋白中位置4120的突变在此位置已经是“C”。
5'UTR中的5个突变
Figure BDA0001181090240000373
Figure BDA0001181090240000381
非结构蛋白中的9个突变
Figure BDA0001181090240000382
参考书目
美国专利文献：
美国专利号8,546,123(2013年10月1日)“以高滴度生产用于疫苗生产的脊髓灰质炎病毒(Production of poliovirus at high titers for vaccine production)”路易斯(Lewis)
美国专利号4,525,349(1985年7月25日)，“用于大规模生产针对脊髓灰质炎的疫苗和所得疫苗的过程(Process for the large-scale production of a vaccineagainst poliomyelitis and the resulting vaccine)”蒙塔尼翁(Montagnon)和范格特(Fanget)。
外国专利文献：
WO 2007/007344(2007年1月18日)，“源自脊髓灰质炎病毒赛宾(Sabin)株的灭活脊髓灰质炎疫苗(Inactivated Poliomyelitis Vaccine Derived From Sabin Strain OfPolio Virus)”，简安(Jain)，乔拉(Chawla)，和坤拉(Kumraj)。
其他参考文献：
比尔(Beale)，A.J.(1961)，“脊髓灰质中的D-抗原含量作为效力的量度(The D-antigen content in poliovaccine as a measure of potency)”柳叶刀(Lancet)2(7213):1166-1168。
布沙尔(Bouchard)，M.J.，D.H.拉姆(Lam)和V.R.拉卡涅洛(1995)，“1型脊髓灰质炎病毒赛宾(Sabin)疫苗的减毒和温度敏感性的决定因素(Determinants of attenuationand temperature sensitivity in the type 1 poliovirus Sabin vaccine)”，病毒学杂 志(J Virol)69(8):4972-4978。
恩德斯(Enders)J.,F.；威乐(Weller)，T.,H.；罗宾斯(Robbins)，F.,C.(1952)，“在人组织中培养后，对脊髓灰质炎病毒的布伦希尔德(Brunhilde)株的猴的致病性的改变(Alteration in pathogenicity for monkeys of Brunhilde strain of poliomyelitisvirus following cultivation in human tissues)”，实验生物学联合会会报(Fed Proc)11:467。
格拉斯利(Grassly)，N.C.(2014)，“用1个或2个剂量的灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗的常规免疫的免疫原性和有效性：系统评价和荟萃分析(Immunogenicity andEffectiveness of Routine Immunization With 1 or 2 Doses of InactivatedPoliovirus Vaccine:Systematic Review and Meta-analysis”，传染病期刊(J Infect Dis)。
霍肯(Hawken)，J.和S.B.特洛伊(Troy)(2012)，“佐剂和灭活脊髓灰质炎疫苗：系统综述(Adjuvants and inactivated polio vaccine:a systematic review)”，疫苗 (Vaccine)30(49):6971-6979。
海因斯贝克(Heinsbroek)，E.和E.J.卢腾伯格(Ruitenberg)(2010)，“全球引入灭活脊髓灰质炎疫苗可以规避口服脊髓灰质炎疫苗悖论(The global introduction ofinactivated polio vaccine can circumvent the oral polio vaccine paradox)”，疫 苗28(22):3778-3783。
亨德森(Henderson)，D.A.，J.J.维特(Witte)，L.莫里斯(Morris)和A.D.朗缪尔(Langmuir)(1964)，“与口腔脊髓灰质炎疫苗相关的麻痹性疾病(Paralytic DiseaseAssociated with Oral Polio Vaccines)”，美国医学会杂志(Jama)190:41-48。
贾汉(Jahan)，N.,E.威默和S.穆勒(Mueller)(2011)，“宿主特异性，温度敏感性翻译缺陷确定人鼻病毒/脊髓灰质炎病毒嵌合体PV1(RIPO)的减毒表型(A host-specific,temperature-sensitive translation defect determines the attenuation phenotypeof a human rhinovirus/poliovirus chimera,PV1(RIPO))”，病毒学杂志85(14):7225-7235。
姜(Jiang)，S.D.,D.派伊(Pye)和J.C.考克斯(Cox)(1986)，“用β-丙内酯灭活脊髓灰质炎病毒(Inactivation of poliovirus with beta-propiolactone)”，生物标准化杂 志(J Biol Stand)14(2):103-109。
约翰(John)，J.(2009).“注射用和口服脊髓灰质炎疫苗在脊髓灰质炎根除中的作用(Role of injectable and oral polio vaccines in polio eradication)”，疫苗专家 评论(Expert Rev Vaccines)8(1):5-8。
约翰(John)，T.J.(2004).“关于与疫苗相关的麻痹性脊髓灰质炎的发展中国家的观点(A developing country perspective on vaccine-associated paralyticpoliomyelitis)”，世界卫生组织简报(Bull World Health Organ)82(1):53-57；论述57-58。
科伊克(Koike)，S.,C.塔亚(Taya)，T.仓田(Kurata)，S.亚伯(Abe)，I.伊势(Ise)，H.米川(Yonekawa)和A.野本(Nomoto)(1991).“易感脊髓灰质炎病毒的转基因小鼠(Transgenic mice susceptible to poliovirus)”，美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci U S A)88(3):951-955。
廖(Liao)，G.,R.，李(Li)，C.李(Li)，M.孙(Sun)，Y.李(Li)，J.朱(Chu)，S.姜(Jiang)和Q.李(2012)，“由赛宾(Sabin)株制备的灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗的安全性和免疫原性：II期，随机，阳性对照试验(Safety and immunogenicity of inactivatedpoliovirus vaccine made from Sabin strains:a phase II,randomized,positive-controlled trial)”，传染病杂志205(2):237-243。
马哈茂德(Mahmood)，K.,S.佩尔考斯基(Pelkowski)，D.阿瑟利(Atherly)，R.思特琳(Sitrin)和J.J.唐纳利(Donnelly)(2013).“用于低资源国家公共部门市场的基于六价IPV的组合疫苗：产品审查(Hexavalent IPV-based combination vaccines for public-sector markets of low-resource countries:A product review)”，人类疫苗和免疫治 疗(Hum Vaccin Immunother)9(9)。
米诺尔(Minor)，P.D.(1999).“脊髓灰质炎病毒疫苗接种：目前对脊髓灰质炎病毒在人类中的相互作用的理解和对根除脊髓灰质炎的影响(Poliovirus vaccination:current understanding of poliovirus interactions in humans and implicationsfor the eradication of poliomyelitis)”，分子医学的专家点评(Expert Rev Mol Med)1999:1-17。
蒙塔尼翁(Montagnon)，B.J.,B.范格特(Fanget)和J.C.文森特-费尔奎特(Vincent-Falquet)(1984)，“工业规模生产通过在微载体上培养维洛细胞制备的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(Industrial-scale production of inactivated poliovirus vaccineprepared by culture of Vero cells on microcarrier)”传染病评论(Rev Infect Dis)6附刊2:S341-344。
奥卡达(Okada)，K.,C.宫崎(Miyazaki)，Y.基诺(Kino)，T.奥萨基(Ozaki)，M.广濑(Hirose)和K.上田(Ueda)(2013).“包含来自Sabin株的无活化脊髓灰质炎疫苗的白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗(DTaP-sIPV)的II期和III期临床研究(Phase II and IIIClinical Studies of Diphtheria-Tetanus-Acellular Pertussis Vaccine ContainingInactivated Polio Vaccine Derived from Sabin Strains(DTaP-sIPV))”，传染病杂志208(2):275-283。
法伊弗(Pfeiffer)，J.K.(2010).“对病毒运输和人口多样性的先天宿主屏障：从脊髓灰质炎病毒中吸取的经验教训(Innate host barriers to viral trafficking andpopulation diversity:lessons learned from poliovirus)”，病毒研究进展(Adv Virus Res)77:85-118。
拉卡涅洛(Racaniello)，V.R.(2006).“一百年的脊髓灰质炎病毒发病机制(Onehundred years of poliovirus pathogenesis)”，病毒学(Virology)344(1):9-16。
雷希克(Resik)，S.,A.特赫达(Tejeda)，R.W.萨特(Sutter)，M.迪亚兹(Diaz)，L.萨缅托(Sarmiento)，N.阿雷曼尼(Alemani)，G.加西亚(Garcia)，M.丰塞卡(Fonseca)，L.H.亨(Hung)，A.L.卡恩(Kahn)，A.伯顿(Burton)，J.M.兰德沃德(Landaverde)和R.B.艾尔沃德(Aylward)(2013).“部分剂量的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗后的预激(Priming after afractional dose of inactivated poliovirus vaccine)”，新英格兰医学期刊(N Engl J Med)368(5):416-424。
赛宾(Sabin)，A.B.(1956).“减毒活病毒脊髓灰质炎疫苗的现状(Present statusof attenuated live-virus poliomyelitis vaccine)”，美国医学会杂志(J Am Med Assoc)162(18):1589-1596。
赛宾(Sabin)，A.B.B.,L.R.(1973).“赛宾(Sabin)减毒脊髓灰质炎病毒口服活疫苗株的历史(History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccinestrains)”，生物标准化杂志(Journal of Biological Standardization)1:115-118。
索尔克(Salk)，J.E.(1953).“研究人类受试者对抗脊髓灰质炎的主动免疫。I.进行中的实验初步报告(Studies in human subjects on active immunization againstpoliomyelitis.I.A preliminary report of experiments in progress)”，美国医学会 杂志151(13):1081-1098。
桑德斯(Sanders)，B.P.,D.埃多-马塔斯(Edo-Matas)，J.H.卡斯特(Custers)，M.H.克尔戴克(Koldijk)，V.克拉伦(Klaren)，M.特克(Turk)，A.鲁特延斯(Luitjens)，W.A.巴克(Bakker)，F.(Uytdehaag)，J.古德斯米特(Goudsmit)，J.A.路易斯(Lewis)和H.舒特马克尔(Schuitemaker)(2012).“PER.C6((R))细胞作为用于生产高滴度脊髓灰质炎病毒的无血清悬浮细胞平台：世界供应灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗的良好选择的潜在低成本(PER.C6((R))cells as a serum-free suspension cell platform for the productionof high titer poliovirus:a potential low cost of goods option for worldsupply of inactivated poliovirus vaccine)”，疫苗31(5):850-856。
桑德斯(Edo-Matas)，B.P.，Y.刘，A.布朗詹斯(Brandjes)，V.凡霍克(van Hoek)，I.德·洛桑里奥斯奥克斯(de Los Rios Oakes)，J.路易斯(Lewis)，E.威默(Wimmer)，J.H.卡斯特(Custers)，H.舒特马克尔(Schuitemaker)，J.塞洛(Cello)和D.埃多-马塔斯(Edo-Matas)(2015).“Brunenders：部分减毒的历史脊髓灰质炎病毒I型疫苗株(Brunenders:Apartially attenuated historic poliovirus Type I vaccine strain)”，普通病毒学杂 志(J Gen Virol)。
斯科恩(Skern)，T.和H.D.李比希(Liebig)(1994).“细小核糖核酸病毒内肽酶2A和3C(Picornains 2A and 3C)”，酶学方法(MethodsEnzymol)244:583-595。
丰田(Toyoda)，H.,M.小原(Kohara)，Y.片冈(Kataoka)，T.菅沼(Suganuma)，T.小俣(Omata)，N.井村(Imura)和A.野本(Nomoto)(1984).“所有三种脊髓灰质炎病毒血清型基因组的完整核苷酸序列。遗传关系，基因功能和抗原决定簇的含义(Complete nucleotidesequences of all three poliovirus serotype genomes.Implication for geneticrelationship,gene function and antigenic determinants)”，分子生物学杂志174(4):561-585。
范德沃夫(van der Werf)，S.,J.布兰得利(Bradley)，E.威默(Wimmer)，F.W.斯图迪尔(Studier)和J.J.邓恩(Dunn)(1986).“通过纯化的T7RNA聚合酶合成感染性脊髓灰质炎病毒RNA(Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNApolymerase)”，美国科学院院报83(8):2330-2334。
凡维茨尔(van Wezel)，A.L.,G.凡斯蒂尼斯(van Steenis)，C.A.汉尼克(Hannik)和H.科恩(Cohen)(1978).“生产浓缩和纯化的灭活脊髓灰质炎和狂犬病组织培养疫苗的新方法(New approach to the production of concentrated and purified inactivatedpolio and rabies tissue culture vaccines)”生物学标准化的发展(Dev Biol Stand)41:159-168。
维尔戴克(Verdijk)，P.,N.Y.罗特(Rots)和W.A.巴克(Bakker)(2011).“基于减毒的赛宾(Sabin)脊髓灰质炎病毒株的新颖灭活脊髓灰质炎疫苗的临床开发(Clinicaldevelopment of a novel inactivated poliomyelitis vaccine based on attenuatedSabin poliovirus strains)”，疫苗专家评论(Expert Rev Vaccines)10(5):635-644。
韦斯特戴克(Westdijk)，J.,D.布吕格曼(Westdijk)，J.马丁(Martin)，A.万特欧弗(van’t Oever)，W.A.巴克(Bakker)，L.莱弗斯(Levels)和G.克斯滕(Kersten)(2011).“基于赛宾(Sabin)的灭活脊髓灰质炎疫苗的表征和标准化：针对灭活脊髓灰质炎疫苗的新抗原单元的提议(Characterization and standardization of Sabin basedinactivated polio vaccine:proposal for a new antigen unit for inactivatedpolio vaccines)”疫苗29(18):3390-3397。
WHO(1988).到2000年脊髓灰质炎根除(Polio eradication by the year 2000).会议决议(Rep.Resolution)41.28.W.H.集会(Assembly)，日内瓦，WHO。
WHO(2005)，在全球脊髓灰质炎根除后停止常规口服脊髓灰质炎疫苗的使用(Cessation of routine oral polio vaccine use after global polio eradication)，使用OPV的国家中国家政策制定者的框架(Framework for National Policy Makers in OPV-Using Countries)，日内瓦，WHO。
WHO(2006).“口服脊髓灰质炎病毒疫苗停止后灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(Inactivated poliovirus vaccine following oral poliovirus vaccinecessation.)”每周流行病学记录(Wkly Epidemiol Rec)81(15):137-144。
WHO(2009).WHO全球行动计划在根除野生脊髓灰质炎病毒和停止常规OPV使用后，最小化脊髓灰质炎病毒设施相关的风险。(WHO global action plan to minimizepoliovirus facility-associated risk after eradication of wild poliovirusesand cessation of routine OPV use.)日内瓦，WHO。
Zehrung(齐朗)，D.(2010).进用于低收入和中等收入国家的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)的负担能力(Improving the affordability of inactivated poliovirusvaccines(IPV)for use in low-and middle-income countries.)，对降低常规IPV免疫接 种成本的策略进行经济分析(An economic analysis of strategies to reduce the cost of routine IPV immunization)PATH。
序列表
<110> 荷兰克鲁塞尔生物制药公司( Crucell Holland B.V.)
<120> 冷适应病毒减毒（CAVA）和新颖减毒脊髓灰质炎病毒株
<130> 0235 WO 00 ORD
<150> US 62/013,379
<151> 2014-06-17
<150> EP14176071.0
<151> 2014-07-08
<160> 10
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 7444
<212> RNA
<213> 脊髓灰质炎病毒
<400> 1
uuaaaacagc ucugggguug uucccacccc agaggcccac guggcggcca guacaccggu 60
accacgguac ccuuguacgc cuguuuuaua cuccccuccc cguaaacuag aagcacgaaa 120
cacaaguuca auagaagggg guacagacca guaccaccac gaacaagcac uucuguuccc 180
ccggugaggu cacauagacu guccccacgg ucaaaaguga cugauccguu auccgcucac 240
guacuucgga aagccuagua ccaccuugga aucuacgaug cguugcgcuc agcacucgac 300
cccggagugu agcuuaggcu gaugagucug gacguucccc acuggugaca gugguccagg 360
cugcguuggc ggccuaccug ugguccaaaa ccacaggacg cuaguaguga acaaggugug 420
aagagcccac ugagcuaccu gagaauccuc cggccccuga augcggcuaa ucccaaccac 480
ggagcaggua aucgcaaacc agcggucagc cugucguaac gcguaagucu guggcggaac 540
cgacuacuuu ggguguccgu guuuccuuuu auuuuuaugg uggcugcuua uggugacaau 600
cauagauugu uaucauaaag caaauuggau uggccauccg gagugagcua aacuaucuau 660
uucucugagu guuggauucg uuucacccac auucugaaca aucagccuca uuaguguuac 720
ccuguuaaua agacgauauc aucacgaugg gugcucaggu uucaucacag aaagugggcg 780
cacacgaaaa cucaaauaga gcauauggug guucuaccau caauuacacc accauuaauu 840
auuauagaga uucagcuagc aaugcggcuu cgaaacagga cuucucucaa gauccaucca 900
aguucaccga gcccgucaag gacgucuuga uaaagacagc cccaaugcua aacucgccaa 960
acauagaggc uugcggguau agcgauagag uccugcaauu aacacuggga aacuccacua 1020
uaaccacaca ggaagcggcu aauucaauag ucgcuuaugg gcguuggccu gaguaccuga 1080
gagacagcga agccaaucca guggaucaac cgacagaacc agacgucgcu gcauguaggu 1140
uuuauacacu agacaccgug ucuuggacga aagagucgcg aggguggugg uggaaguugc 1200
cugaugcacu gagggacaug ggacuguuug ggcaaaauuu guacuaccac uaccuaggua 1260
gguccgggua cacuguacau guacagugua acgccuccaa auuccaccag ggagcgcuug 1320
ggguauucgc cguaccagag augugcuugg ccggggacag uaacaccacu accacacaca 1380
ccagcuauca aaaugccaau ccuggcgaga aaggaggcac uuucacaggu acguucaccc 1440
cugacaacaa ccagacaucg ccugcccgca gguuuugccc gguggauuac cuuuuuggaa 1500
acggcacauu guuggggaac gccuuugugu ucccgcacca gauaauaaac uuacggacca 1560
auaacugugc cacauuggug cucccuuacg ugaacucccu cucgauagau aguaugguga 1620
agcacaauaa uuggggaauc gcaauaguac cauuggcccc auuaaauuuu gcuaaugagu 1680
ccuccccaga aauuccaauc accuuaacca uagccccuau gugcugugag uucaauggau 1740
uaagaaacau uacccugcca cguuuacagg gccugccggu caugaacacc ccugguagua 1800
aucaauaucu uacugcagac aacuuccagu caccgugugc gcugccugaa uuugacguaa 1860
ccccaccuau ugacauaccc ggugaaguua agaacaugau ggaauuggcu gaaauugaca 1920
ccaugauucc cuuugacuua agugccacga aaaagaacac cauggaaaug uauaggguuc 1980
gguuaaguga caaaccacac acagacgacc ccauacucug ucugucgcuu ucuccagcuu 2040
cagauccuag guugucacau accaugcuag gagaaauccu aaauuacuac acacacuggg 2100
caggaucccu gaaguucacg uuucuguucu guggguccau gauggcaacu ggcaaacugu 2160
uggugucaua cgcgccuccu ggagccgacc caccaaagaa gcguaaggag gcaauguugg 2220
gaacacaugu gaucugggac auaggacugc aauccucaug cacuauggua guaccaugga 2280
uaagcaacac cacguaccgg cagaccauug augauaguuu caccgaaggc ggauacauca 2340
gcgucuucua ccaaaccaga auaguggugc cccuuucgac gcccagggag auggacaucc 2400
uugguuuugu gucagcgugu aaugacuuca gugugcgcuu guugcgagac acuacacaca 2460
uagagcaaaa agcgcuagca cagggguuag gucagaugcu ugaaagcaug auugacaaca 2520
caguccguga gacgaugggg gcggcaacgu cuagagacgc ucucccaaac accgaagcca 2580
guggaccggc acacuccaag gaaaucccgg cacucaccgc aguggaaacu ggggcuacaa 2640
auccacuagu cccuucugac acagugcaaa ccagacaugu uauacaacac aggucuaggu 2700
cagagucuag cauagagucu uucuucgcgc ggggcgcaug cgugaccauc augacuguag 2760
acaacucagc uuccaccaca aacaaggaca agcuauuuuc aguguggaaa aucacguaua 2820
aagacacugu ucaguuacgg aggaaauugg aguuuuucac cuauucuaga uuugauaugg 2880
aauuuaccuu uguagucacu gcaaauuuca cugagacuaa caaugggcau gcuuuaaauc 2940
agguguacca aauuauguac guaccaccag gcgcuccagu gccugagaaa ugggacgacu 3000
acacauggca aaccucauca aacccaucaa uuuuuuacac cuacggaaca gcuccagccc 3060
ggaucucggu accguauguu gguauuucga acgccuauuc acacuuuuac gacgguuuuu 3120
cuaaaguacc acugaaggac cagucggcag cacuaggcga cucccucuau gguguagcau 3180
cucuaaacga uuucgguauu uuggcuguua gaguagucaa ugaucacaac ccgaccaaag 3240
ucaccuccaa agucagagug uaucuaaaac ccaagcacau cagagucugg ugcccgcguc 3300
caccgagggc aguggcguac uacggcccug gaguggauua caaggauggu acgcucacac 3360
cccuuuccac caaggaacug accacauaug gauucggaca ccaaaacaaa gcgguguaca 3420
cugcagguua uaaaauuugc aacuaccauu uggccacuca ggaggauuug caaaacgcag 3480
ugaaugucau guggaacaga gaucuuuuag uuacagaauc aaaagcccag gguacggacu 3540
cgauugccag gugcaguugu aaugcaggag uguauuacug cgaguccaga aggaaauacu 3600
acccaaucuc cuucgucggc cccacuuucc aguauaugga ggccaacgac uacuacccag 3660
cuagauacca aucccauaug uugauugggc auggcuuugc uucgcccggc gauuguggug 3720
guauccucag gugucaacau ggugucauug ggauugugac agcuggugga gaggguuugg 3780
ucgcguucuc ugacauaagg gaccuauaug cuuaugagga ggaagcuaug gagcagggca 3840
uuacaaauua cauugaguca cuuggcgcug cauucgguag cggguucacc cagcaaauag 3900
gggauaagau aucagaacua acuagcaugg uaaccagcac aaucacagag aaacuacuaa 3960
aaaaucuaau caaaauuauu ucaucucugg ugauaaucac cagaaauuau gaagacacua 4020
ccacagugcu ugccacuuua gcucuccuug ggugugacgu uucaccgugg cagugguuga 4080
agaagaaggc augugacauc uuggagauuc ccuauguuau uaaacagggu gauaguuggu 4140
uaaagaaauu cacugaggca uguaacgcag ccaagggguu ggagugggug uccaacaaaa 4200
uuucaaaauu caucgacugg cugaaggaga gaaucauccc acaagccagg gacaagcuug 4260
aauuuguaac caaauugaaa caguuggaaa ugcuugagaa ucaaauaucc acaauacacc 4320
aguccugccc aagucaggaa caccaggaag uuuuauucaa caauguacgc ugguugucca 4380
uccaaucuaa aagauucgcu ccauuauacg cgcucgaagc caagagaaua caaaagcugg 4440
aacacaccau uaauaacuac auacaguuca agagcaaaca ccguauugaa ccaguauguu 4500
uguuggugca ugggagccca ggcacaggga aaucaguugc gaccaaucug auugcuaggg 4560
ccauagcuga gaaagagaac accuccacuu acucacuacc accagauccg ucucacuuug 4620
augguuauaa acaacaaggc gugguuauua uggaugaccu gaaccaaaac ccagacgggg 4680
cagacaugaa gcucuucugu caaauggugu ccacugugga guuuauccca ccuauggccu 4740
cacuggaaga aaagggcauu uuguucacau ccaacuaugu cuuagccucu accaacucca 4800
gucguaucac accacccaca guagcucaca gugacgcgcu ggcccggaga uuugcuuuug 4860
auauggacau acaggugaug ggcgaauacu ccagagaugg uaaacucaau auggcaaugg 4920
cuacagaaau gugcaagaac ugccaccaac cggcaaacuu uaaaagaugc uguccuuuag 4980
uguguggcaa ggcaauucaa uuaauggaca aaucuucuag aguuagauac aguauugauc 5040
agaucacuac aaugauuauc aaugagagaa acagaagauc caacauuggu aauugcaugg 5100
aggcuuuguu ccaaggacca cuccaauaca aagacuugaa aauugauauc aagacgaguc 5160
ccccuccuga auguauuaau gauuugcucc aagcaguuga cucccaggaa gugagggauu 5220
auugcgaaaa gaaagguugg aucgucaaua uuacuaguca agugcaaaca gagagaaaca 5280
ucaaucgagc aaugaccauc uugcaagcag uaacaacuuu ugcugcagug gcuggugucg 5340
uguauguuau guacaaguua uucgcuggac accagggagc auacacuggu cuaccaaaca 5400
aaagacccaa ugugccuacc auuagaacag caaaagugca aggaccuggg uuugacuacg 5460
caguggcuau ggcuaaaaga aacauuguua cagcaacuac uaguaaagga gaguucacaa 5520
ugcugggggu ucaugacaac guggccauuu uaccaacuca ugccucaccu ggugagagua 5580
uugugauuga uggcaaagag guugagauuc uggacgcuaa agcccucgaa gaccaggcag 5640
guacuaaucu ggaaaucacc auaauaaccc ucaaaagaaa ugaaaaauuc agagauauca 5700
gaccacauau acccacucaa aucaccgaga cgaaugaugg aguucugauu gugaacacua 5760
guaaguaccc caauauguau guuccugucg gugcugugac ugagcaggga uaucuaaauc 5820
ucgguggacg ccaaaccgcu cguacuuuaa uguacaacuu uccaaccaga gcagggcagu 5880
gugguggagu caucacaugu acugggaagg ucaucgggau gcauguuggu gggaacgguu 5940
cacacggguu ugcagcggcc cugaagcgau cauacuucac ucagagucaa ggugaaauuc 6000
aguggaugag accaucgaag gaagugggau acccaauuau aaacgccccg uccaaaacca 6060
agcuugaacc cagugcuuuu cacuauguau uugaaggagu gaaggaacca gcaguccuua 6120
ccaaaaacga ucccaggcuu aaaacagacu uugaggaggc aauuuucucc aaguacgugg 6180
gcaacaagau cacugaagug gaugaguaca ugaaagaggc aguagaccac uaugcuggcc 6240
aacucauguc acuagacauu gacacagaac agauguguuu ggaggaugcc auguauggca 6300
cugauggucu ggaagcacuu gauuuaucca ccagugcugg cuacccuuau guaacaaugg 6360
gaaagaagaa aagagauauu uuaaacaaac aaaccaggga caccaaggaa augcaaaaac 6420
ucuuagauac uuauggaauc aauuuaccgu uaguaacgua ugucaaagau gagcuaaggu 6480
cuaaaaccaa aguggagcag ggaaaaucca gauugauuga agccuccagc uuaaaugauu 6540
caguagcuau gagaauggca uuuggaaauc ucuaugcagc auuccauaaa aacccaggag 6600
uuauuacugg cagugcaguu gguugugacc cagaucuguu cuggagcaag auuccaguac 6660
ugauggaaga aaagcuuuuc gccuuugacu auacaggcua ugaugcauca cucagcccag 6720
cuugguuuga ggcacucaaa augguauugg agaaaauugg auucggggac agaguggacu 6780
acauugacua ccucaaucau ucacaccacu uguacaagaa caaaacauac ugugucaagg 6840
gcggcaugcc aucuggcugc ucuggcaccu caaucuucaa cucgaugauc aacaaucuga 6900
ucauuaggac gcuuuugcua aaaaccuaca agggcauaga cuuagaccac cuaaaaauga 6960
uugccuaugg ugaugaugua aucgcuuccu acccccauga gguugacgcu agucuccuag 7020
cccaaucagg aaaagacuau ggacuaacua ugacuccagc agauaaaucu gccacuuuug 7080
aaacagucac augggagaau guaacauuuu ugaaaagauu cuucagagca gacgagaagu 7140
auccauuucu uauucaucca guaaugccaa ugaaggaaau ucaugaauca aucagaugga 7200
ccaaggaucc uagaaacaca caggaucacg uacgcucuuu gugcuuauug gcuuggcaca 7260
auggagaaga agaauacaac aaguuccuag cuaaaauuag gagcgugcca auuggaagag 7320
ccuugcugcu cccagaguac ucaacauugu accgacguug gcucgacucg uuuuaguaac 7380
ccuaccucag ucgaauugga uugggucaua cuguuguagg gguaaauuuu ucuuuaauuc 7440
gggg 7444
<210> 2
<211> 881
<212> PRT
<213> 脊髓灰质炎病毒
<400> 2
Met Gly Ala Gln Val Ser Ser Gln Lys Val Gly Ala His Glu Asn Ser
1 5 10 15
Asn Arg Ala Tyr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr
20 25 30
Tyr Arg Asp Ser Ala Ser Asn Ala Ala Ser Lys Gln Asp Phe Ser Gln
35 40 45
Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Ile Lys Asp Val Leu Ile Lys Thr
50 55 60
Ala Pro Met Leu Asn Ser Pro Asn Ile Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65 70 75 80
Arg Val Leu Gln Leu Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu
85 90 95
Ala Ala Asn Ser Val Val Ala Tyr Gly Arg Trp Pro Glu Tyr Leu Arg
100 105 110
Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Gln Pro Thr Glu Pro Asp Val Ala
115 120 125
Ala Cys Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Thr Val Ser Trp Thr Lys Glu Ser
130 135 140
Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Ala Leu Arg Asp Met Gly Leu
145 150 155 160
Phe Gly Gln Asn Met Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Val His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly
180 185 190
Val Phe Ala Val Pro Glu Met Cys Leu Ala Gly Asp Ser Asn Thr Thr
195 200 205
Thr Met His Thr Ser Tyr Gln Asn Ala Asn Pro Gly Glu Lys Gly Gly
210 215 220
Thr Phe Thr Gly Thr Phe Thr Pro Asp Asn Asn Gln Thr Ser Pro Ala
225 230 235 240
Arg Arg Phe Cys Pro Val Asp Tyr Leu Leu Gly Asn Gly Thr Leu Leu
245 250 255
Gly Asn Ala Phe Val Phe Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn
260 265 270
Asn Cys Ala Thr Leu Val Leu Pro Tyr Val Asn Ser Leu Ser Ile Asp
275 280 285
Ser Met Val Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Ala Ile Leu Pro Leu Ala
290 295 300
Pro Leu Asn Phe Ala Ser Glu Ser Ser Pro Glu Ile Pro Ile Thr Leu
305 310 315 320
Thr Ile Ala Pro Met Cys Cys Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr
325 330 335
Leu Pro Arg Leu Gln Gly Leu Pro Val Met Asn Thr Pro Gly Ser Asn
340 345 350
Gln Tyr Leu Thr Ala Asp Asn Phe Gln Ser Pro Cys Ala Leu Pro Glu
355 360 365
Phe Asp Val Thr Pro Pro Ile Asp Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met
370 375 380
Met Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Met Ile Pro Phe Asp Leu Ser Ala
385 390 395 400
Thr Lys Lys Asn Thr Met Glu Met Tyr Arg Val Arg Leu Ser Asp Lys
405 410 415
Pro His Thr Asp Asp Pro Ile Leu Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser
420 425 430
Asp Pro Arg Leu Ser His Thr Met Leu Gly Glu Ile Leu Asn Tyr Tyr
435 440 445
Thr His Trp Ala Gly Ser Leu Lys Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser
450 455 460
Met Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Val Ser Tyr Ala Pro Pro Gly Ala
465 470 475 480
Asp Pro Pro Lys Lys Arg Lys Glu Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile
485 490 495
Trp Asp Ile Gly Leu Gln Ser Ser Cys Thr Met Val Val Pro Trp Ile
500 505 510
Ser Asn Thr Thr Tyr Arg Gln Thr Ile Asp Asp Ser Phe Thr Glu Gly
515 520 525
Gly Tyr Ile Ser Val Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Leu Ser
530 535 540
Thr Pro Arg Glu Met Asp Ile Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Asn Asp
545 550 555 560
Phe Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Thr His Ile Glu Gln Lys Ala
565 570 575
Leu Ala Gln Gly Leu Gly Gln Met Leu Glu Ser Met Ile Asp Asn Thr
580 585 590
Val Arg Glu Thr Val Gly Ala Ala Thr Ser Arg Asp Ala Leu Pro Asn
595 600 605
Thr Glu Ala Ser Gly Pro Thr His Ser Lys Glu Ile Pro Ala Leu Thr
610 615 620
Ala Val Glu Thr Gly Ala Thr Asn Pro Leu Val Pro Ser Asp Thr Val
625 630 635 640
Gln Thr Arg His Val Val Gln His Arg Ser Arg Ser Glu Ser Ser Ile
645 650 655
Glu Ser Phe Phe Ala Arg Gly Ala Cys Val Thr Ile Met Thr Val Asp
660 665 670
Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu Phe Ala Val Trp Lys
675 680 685
Ile Thr Tyr Lys Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe
690 695 700
Thr Tyr Ser Arg Phe Asp Met Glu Leu Thr Phe Val Val Thr Ala Asn
705 710 715 720
Phe Thr Glu Thr Asn Asn Gly His Ala Leu Asn Gln Val Tyr Gln Ile
725 730 735
Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Val Pro Glu Lys Trp Asp Asp Tyr
740 745 750
Thr Trp Gln Thr Ser Ser Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Thr Tyr Gly Thr
755 760 765
Ala Pro Ala Arg Ile Ser Val Pro Tyr Val Gly Ile Ser Asn Ala Tyr
770 775 780
Ser His Phe Tyr Asp Gly Phe Ser Lys Val Pro Leu Lys Asp Gln Ser
785 790 795 800
Ala Ala Leu Gly Asp Ser Leu Tyr Gly Ala Ala Ser Leu Asn Asp Phe
805 810 815
Gly Ile Leu Ala Val Arg Val Val Asn Asp His Asn Pro Thr Lys Val
820 825 830
Thr Ser Lys Ile Arg Val Tyr Leu Lys Pro Lys His Ile Arg Val Trp
835 840 845
Cys Pro Arg Pro Pro Arg Ala Val Ala Tyr Tyr Gly Pro Gly Val Asp
850 855 860
Tyr Lys Asp Gly Thr Leu Thr Pro Leu Ser Thr Lys Asp Leu Thr Thr
865 870 875 880
Tyr
<210> 3
<211> 879
<212> PRT
<213> 脊髓灰质炎病毒
<400> 3
Met Gly Ala Gln Val Ser Ser Gln Lys Val Gly Ala His Glu Asn Ser
1 5 10 15
Asn Arg Ala Tyr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr
20 25 30
Tyr Arg Asp Ser Ala Ser Asn Ala Ala Ser Lys Gln Asp Phe Ala Gln
35 40 45
Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Ile Lys Asp Val Leu Ile Lys Thr
50 55 60
Ala Pro Thr Leu Asn Ser Pro Asn Ile Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65 70 75 80
Arg Val Met Gln Leu Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu
85 90 95
Ala Ala Asn Ser Val Val Ala Tyr Gly Arg Trp Pro Glu Tyr Ile Lys
100 105 110
Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Gln Pro Thr Glu Pro Asp Val Ala
115 120 125
Ala Cys Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Thr Val Thr Trp Arg Lys Glu Ser
130 135 140
Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Ala Leu Lys Asp Met Gly Leu
145 150 155 160
Phe Gly Gln Asn Met Phe Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ala Gly Tyr Thr
165 170 175
Val His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly
180 185 190
Val Phe Ala Val Pro Glu Met Cys Leu Ala Gly Asp Ser Thr Thr His
195 200 205
Met Phe Thr Lys Tyr Glu Asn Ala Asn Pro Gly Glu Lys Gly Gly Glu
210 215 220
Phe Lys Gly Ser Phe Thr Leu Asp Thr Asn Ala Thr Asn Pro Ala Arg
225 230 235 240
Asn Phe Cys Pro Val Asp Tyr Leu Phe Gly Ser Gly Val Leu Ala Gly
245 250 255
Asn Ala Phe Val Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn
260 265 270
Cys Ala Thr Leu Val Leu Pro Tyr Val Asn Ser Leu Ser Ile Asp Ser
275 280 285
Met Thr Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Ala Ile Leu Pro Leu Ala Pro
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Thr Glu Ser Ser Thr Glu Ile Pro Ile Thr Leu Thr
305 310 315 320
Ile Ala Pro Met Cys Cys Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr Val
325 330 335
Pro Arg Thr Gln Gly Leu Pro Val Leu Asn Thr Pro Gly Ser Asn Gln
340 345 350
Tyr Leu Thr Ala Asp Asn Tyr Gln Ser Pro Cys Ala Ile Pro Glu Phe
355 360 365
Asp Val Thr Pro Pro Ile Asp Ile Pro Gly Glu Val Arg Asn Met Met
370 375 380
Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Met Ile Pro Leu Asn Leu Thr Asn Gln
385 390 395 400
Arg Lys Asn Thr Met Asp Met Tyr Arg Val Glu Leu Asn Asp Ala Ala
405 410 415
His Ser Asp Thr Pro Ile Leu Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser Asp
420 425 430
Pro Arg Leu Ala His Thr Met Leu Gly Glu Ile Leu Asn Tyr Tyr Thr
435 440 445
His Trp Ala Gly Ser Leu Lys Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser Met
450 455 460
Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Val Ser Tyr Ala Pro Pro Gly Ala Glu
465 470 475 480
Ala Pro Lys Ser Arg Lys Glu Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp
485 490 495
Asp Ile Gly Leu Gln Ser Ser Cys Thr Met Val Val Pro Trp Ile Ser
500 505 510
Asn Thr Thr Tyr Arg Gln Thr Ile Asn Asp Ser Phe Thr Glu Gly Gly
515 520 525
Tyr Ile Ser Met Phe Tyr Gln Thr Arg Val Val Val Pro Leu Ser Thr
530 535 540
Pro Arg Lys Met Asp Ile Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Asn Asp Phe
545 550 555 560
Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Thr His Ile Ser Gln Glu Ala Met
565 570 575
Pro Gln Gly Leu Gly Asp Leu Ile Glu Gly Val Val Glu Gly Val Thr
580 585 590
Arg Asn Ala Leu Thr Pro Leu Thr Pro Ala Asn Asn Leu Pro Asp Thr
595 600 605
Gln Ser Ser Gly Pro Ala His Ser Lys Glu Thr Pro Ala Leu Thr Ala
610 615 620
Val Glu Thr Gly Ala Thr Asn Pro Leu Val Pro Ser Asp Thr Val Gln
625 630 635 640
Thr Arg His Val Ile Gln Lys Arg Thr Arg Ser Glu Ser Thr Val Glu
645 650 655
Ser Phe Phe Ala Arg Gly Ala Cys Val Ala Ile Ile Glu Val Asp Asn
660 665 670
Asp Ala Pro Thr Lys Arg Ala Ser Lys Leu Phe Ser Val Trp Lys Ile
675 680 685
Thr Tyr Lys Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr
690 695 700
Tyr Ser Arg Phe Asp Met Glu Phe Thr Phe Val Val Thr Ser Asn Tyr
705 710 715 720
Thr Asp Ala Asn Asn Gly His Ala Leu Asn Gln Val Tyr Gln Ile Met
725 730 735
Tyr Ile Pro Pro Gly Ala Pro Ile Pro Gly Lys Trp Asn Asp Tyr Thr
740 745 750
Trp Gln Thr Ser Ser Asn Pro Ser Val Phe Tyr Thr Tyr Gly Ala Pro
755 760 765
Pro Ala Arg Ile Ser Val Pro Tyr Val Gly Ile Ala Asn Ala Tyr Ser
770 775 780
His Phe Tyr Asp Gly Phe Ala Lys Val Pro Leu Ala Gly Gln Ala Ser
785 790 795 800
Thr Glu Gly Asp Ser Leu Tyr Gly Ala Ala Ser Leu Asn Asp Phe Gly
805 810 815
Ser Leu Ala Val Arg Val Val Asn Asp His Asn Pro Thr Lys Leu Thr
820 825 830
Ser Lys Ile Arg Val Tyr Met Lys Pro Lys His Val Arg Val Trp Cys
835 840 845
Pro Arg Pro Pro Arg Ala Val Pro Tyr Tyr Gly Pro Gly Val Asp Tyr
850 855 860
Lys Asp Gly Leu Ala Pro Leu Pro Gly Lys Gly Leu Thr Thr Tyr
865 870 875
<210> 4
<211> 878
<212> PRT
<213> 脊髓灰质炎病毒
<400> 4
Met Gly Ala Gln Val Ser Ser Gln Lys Val Gly Ala His Glu Asn Ser
1 5 10 15
Asn Arg Ala Tyr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr
20 25 30
Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ala Ala Ser Lys Gln Asp Tyr Ser Gln
35 40 45
Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Leu Lys Asp Val Leu Ile Lys Thr
50 55 60
Ala Pro Thr Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65 70 75 80
Arg Val Leu Gln Leu Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu
85 90 95
Ala Ala Asn Ser Val Val Ala Tyr Gly Arg Trp Pro Glu Phe Ile Arg
100 105 110
Asp Asp Glu Ala Asn Pro Val Asp Gln Pro Thr Glu Pro Asp Val Ala
115 120 125
Thr Cys Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Thr Val Met Trp Gly Lys Glu Ser
130 135 140
Lys Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Ala Leu Arg Asp Met Gly Leu
145 150 155 160
Phe Gly Gln Asn Met Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Val His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly
180 185 190
Val Phe Ala Ile Pro Glu Tyr Cys Leu Ala Gly Asp Ser Asp Lys Gln
195 200 205
Arg Tyr Thr Ser Tyr Ala Asn Ala Asn Pro Gly Glu Lys Gly Gly Lys
210 215 220
Phe Tyr Ser Gln Phe Asn Arg Asp Thr Ala Val Thr Ser Pro Lys Arg
225 230 235 240
Glu Phe Cys Pro Val Asp Tyr Leu Leu Gly Cys Gly Val Leu Leu Gly
245 250 255
Asn Ala Phe Val Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn
260 265 270
Ser Ala Thr Ile Val Leu Pro Tyr Val Asn Ala Leu Ala Ile Asp Ser
275 280 285
Met Val Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Ala Ile Leu Pro Leu Ser Pro
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Gln Asp Ser Ser Val Glu Ile Pro Ile Thr Val Thr
305 310 315 320
Ile Ala Pro Met Cys Ser Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Val Thr Ala
325 330 335
Pro Lys Phe Gln Gly Leu Pro Val Leu Asn Thr Pro Gly Ser Asn Gln
340 345 350
Tyr Leu Thr Ser Asp Asn His Gln Ser Pro Cys Ala Ile Pro Glu Phe
355 360 365
Asp Val Thr Pro Pro Ile Asp Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met Met
370 375 380
Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Met Ile Pro Leu Asn Leu Glu Asn Thr
385 390 395 400
Lys Arg Asn Thr Met Asp Met Tyr Arg Val Thr Leu Ser Asp Ser Ala
405 410 415
Asp Leu Ser Gln Pro Ile Leu Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser Asp
420 425 430
Pro Arg Leu Ser His Thr Met Leu Gly Glu Val Leu Asn Tyr Tyr Thr
435 440 445
His Trp Ala Gly Ser Leu Lys Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser Met
450 455 460
Met Ala Thr Gly Lys Ile Leu Val Ala Tyr Ala Pro Pro Gly Ala Gln
465 470 475 480
Pro Pro Thr Ser Arg Lys Glu Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp
485 490 495
Asp Leu Gly Leu Gln Ser Ser Cys Thr Met Val Val Pro Trp Ile Ser
500 505 510
Asn Val Thr Tyr Arg Gln Thr Thr Gln Asp Ser Phe Thr Glu Gly Gly
515 520 525
Tyr Ile Ser Met Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Leu Ser Thr
530 535 540
Pro Lys Ser Met Ser Met Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Asn Asp Phe
545 550 555 560
Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Thr His Ile Ser Gln Ser Ala Leu
565 570 575
Pro Gln Gly Ile Glu Asp Leu Ile Thr Glu Val Ala Gln Gly Ala Leu
580 585 590
Thr Leu Ser Leu Pro Lys Gln Gln Asp Ser Leu Pro Asp Thr Lys Ala
595 600 605
Ser Gly Pro Ala His Ser Lys Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu
610 615 620
Thr Gly Ala Thr Asn Pro Leu Val Pro Ser Asp Thr Val Gln Thr Arg
625 630 635 640
His Val Ile Gln Arg Arg Ser Arg Ser Glu Ser Thr Ile Glu Ser Phe
645 650 655
Phe Ala Arg Gly Ala Cys Val Ala Ile Ile Glu Val Asp Asn Glu Glu
660 665 670
Pro Thr Thr Arg Ala Gln Lys Leu Phe Ala Thr Trp Arg Ile Thr Tyr
675 680 685
Lys Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ser
690 695 700
Arg Phe Asp Met Glu Phe Thr Phe Val Val Thr Ala Asn Phe Thr Asn
705 710 715 720
Thr Asn Asn Gly His Ala Leu Asn Gln Val Tyr Gln Ile Met Tyr Ile
725 730 735
Pro Pro Gly Ala Pro Thr Pro Lys Ser Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln
740 745 750
Thr Ser Ser Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Thr Tyr Gly Ala Ala Pro Ala
755 760 765
Arg Ile Ser Val Pro Tyr Val Gly Leu Ala Asn Ala Tyr Ser His Phe
770 775 780
Tyr Asp Gly Phe Ala Lys Val Pro Leu Lys Thr Asp Ala Asn Asp Gln
785 790 795 800
Ile Gly Asp Ser Leu Tyr Ser Ala Met Thr Val Asp Asp Phe Gly Val
805 810 815
Leu Ala Ile Arg Val Val Asn Asp His Asn Pro Thr Lys Val Thr Ser
820 825 830
Lys Val Arg Ile Tyr Met Lys Pro Lys His Val Arg Val Trp Cys Pro
835 840 845
Arg Pro Pro Arg Ala Val Pro Tyr Tyr Gly Pro Gly Val Asp Tyr Lys
850 855 860
Asp Asn Leu Asn Pro Leu Ser Glu Lys Gly Leu Thr Thr Tyr
865 870 875
<210> 5
<211> 7502
<212> RNA
<213> 脊髓灰质炎病毒
<400> 5
uuaaaacagc ucugggguug uucccacccc agaggcccac guggcggcca guacacuggu 60
auugcgguac cuuuguacgc cuguuuuaua cucccuuccc ccguaacuua gaagcacaau 120
guccaaguuc aauaggaggg gguacaaacc aguaccacca cgaacaagca cuucuguucc 180
cccggugagg cuguauaggc uguuuccacg gcuaaaagcg gcugauccgu uauccgcuca 240
uguacuucga gaagccuagu aucaccuugg aaucuucgau gcguugcgcu caacacucaa 300
ccccagagug uagcuuaggu cgaugagucu ggacguuccu caccggcgac ggugguccag 360
gcugcguugg cggccuaccu guggcccaaa gccacaggac gcuaguugug aacaaggugu 420
gaagagccua uugagcuacc ugagaguccu ccggccccug aaugcggcua auccuaacca 480
cggagcaggc aguggcaauc cagcgaccag ccugucguaa cgcgcaaguu cguggcggaa 540
ccgacuacuu uggguguccg uguuuccuuu uauuuuuaca auggcugcuu auggugacaa 600
ucauugauug uuaucauaaa gcaaauugga uuggccaucc ggugagaauu ugauuauuaa 660
auuacucucu uguugggauu gcuccuuuga aauccugugc acucacaccu auuggaauua 720
ccucauuguu aagauaucau caccacuaug ggcgcccaag ucucaucaca gaaaguugga 780
gcccaugaga auucaaacag agcuuauggc ggauccacca uuaauuacac uacuauuaau 840
uauuacaggg auucugcgag caaugccgcu aguaagcagg acuuugcaca agacccaucc 900
aaguucacug aaccuauuaa agauguucuc auuaagaccg cucccacgcu aaacucuccu 960
aauaucgagg cgugugggua uagcgacaga gugaugcaac uaacccuagg caauuccacc 1020
auuaccacac aggaggcggc caauucuguc guugcauacg gccgguggcc cgaguacauc 1080
aaggacucag aagcaaaucc uguggaccag ccaacugaac cggacguugc cgcgugcagg 1140
uuuuacacac uagacacugu uacuuggcgc aaggagucca gaggguggug guggaaacug 1200
ccugaugcac uaaaggacau gggauuauuc ggccagaaca uguucuacca cuaccucggg 1260
agggcuggcu auacugugca cguacagugu aaugcuucaa aguuucacca gggcgcccuc 1320
gggguauucg caguuccaga aaugugccug gcaggcgaca gcacaaccca cauguuuaca 1380
aaauaugaga augcaaaucc gggugagaaa gggggugaau ucaaagggag uuuuacucug 1440
gauacuaacg cuaccaaccc ugcacgcaac uuuugucccg uugauuaucu cuucgggagc 1500
ggaguacugg cgggaaaugc guuuguuuac ccacaucaga uaauuaaucu gcgcaccaac 1560
aacugugcca cguuggugcu gccauacguu aauucacuuu ccauagacag caugacaaaa 1620
cacaacaauu ggggaauugc uauccuuccg cuggcaccac uugacuuugc caccgagucc 1680
uccacugaga uacccauuac ucuaacuauu gccccuaugu guugugaauu caauggguug 1740
cgcaacauca cuguacccag aacucaaggg uugccagucu uaaacacucc aggaagcaac 1800
caguacuuaa cagcagacaa cuaucaaucc ccaugugcga uacccgaguu ugauguaaca 1860
ccacccauag acaucccggg ggaagugcgc aacaugaugg aauuggcaga gauagacacc 1920
augauaccuc ucaaucugac gaaccagcgc aagaacacca uggauaugua cagagucgaa 1980
cugaaugaug cggcucacuc ugacacacca auauuguguc ucucacuguc uccagcauca 2040
gauccuaggc uagcacacac uaugcuaggu gaaauacuga acuacuacac acacugggca 2100
gggucauuga aguucacauu ucucuucugc ggcucaauga uggccacugg uaaauugcua 2160
guguccuaug caccuccugg ugcggaagcc ccuaaaagcc gcaaagaagc gaugcucggc 2220
acccacguga ucugggacau cggauuacag ucaucaugca cuaugguggu accuuggauu 2280
agcaacacca cauacagaca aaccaucaac gauagcuuca cagaaggagg guacaucagu 2340
auguuuuacc aaacuagagu uguugugcca uuguccaccc cuagaaagau ggacauauug 2400
ggcuuugugu cagccugcaa ugacuucagu gugcgccugu ugcgugacac gacgcacaua 2460
agccaagagg cuaugccaca aggauugggu gauuuaauug aagggguugu ugagggaguc 2520
acgagaaaug ccuugacacc acugacaccu gccaacaacu ugccugauac acaaucuagc 2580
ggcccagccc acucuaagga aacaccagcg cuaacagccg uagagacagg ggccaccaac 2640
ccauuggugc cuucagacac gguacaaacu cgucacguca uccaaaagcg gacgcggucg 2700
gagucuacgg uugagucuuu cuucgcaaga ggagcuugug uggccauuau ugaaguggau 2760
aaugaugcuc caacaaagcg ugccaguaaa uuauuuucag ucuggaagau aacuuacaaa 2820
gacaccguuc aguuaagacg uaaguuggag uucuuuacau auucaagguu ugacauggag 2880
uucaccuuug ugguuacauc caauuauacc gaugcaaaca augggcacgc acuaaaucaa 2940
guuuaccaga uaauguacau accaccuggg gcaccgaucc cuggcaagug gaaugauuac 3000
acauggcaaa cgucaucuaa cccaucagug uuuuacacuu acggggcacc uccagcuaga 3060
auaucagugc ccuacguggg cauugccaau gcauauucuc auuuuuacga uggguuugcc 3120
aaaguaccac uagcaggcca agccucaaca gagggugacu cgcuguaugg agcggcuuca 3180
uugaaugacu ucggaucacu ggcuguucga guggugaaug accacaaccc uacgaaacuc 3240
acuucaaaaa ucagagugua caugaaacca aagcacguca gaguguggug uccgcgaccc 3300
ccucgagcag ucccauacua cggaccaggg guugacuaca aggauggacu agccccacug 3360
ccagggaaag gcuugacaac cuaugguuuu ggccaccaaa auaaggcagu guacacggca 3420
gguuacaaaa uuugcaauua ccaccucgcc acccaggaag acuuacaaaa ugcgguaaac 3480
auuaugugga uuagagaccu uuuaguagug gaauccaaag cccaaggcau agacacaauu 3540
gcuagaugua acugccacac uggaguguac uacugugaau ccaggaggaa guacuacccg 3600
gucucuuuua cuggccccac cuuucaguac auggaagcaa augaguacua uccagcccga 3660
uaccaauccc acauguuaau uggccauggu uuugcaucuc caggggacug uggugggauu 3720
cucaggugcc aacauggagu aauuggaauc auuacagcug gaggagaagg ccuagucgcu 3780
uucgcggaca ucagagaucu guacgcauac gaggaggagg cuauggagca gggagucucc 3840
aacuauauug agucccuugg ggcugcauuu gggaguggau ucacucagca aauaggaaac 3900
aaaauuucag aacucacuag cauggucacc agcacuauaa cugagaaacu acuaaagaau 3960
cucauuaaaa uaauuucauc ccuuguuauc aucaccagaa acuaugaaga cacgaccaca 4020
gugcuggcua cccuugcucu ccucgguugu gaugcguccc cauggcaaug gcuaaagaag 4080
aaagccugug acaucuugga aauccccuac aucaugcgac agggcgauag cugguugaag 4140
aaguuuacag aggcaugcaa ugcagccaag ggauuggaau gggugucuaa uaaaauaucc 4200
aaauuuauug acuggcucaa agagaagauc auuccacagg cuagagacaa gcuagaguuu 4260
guuaccaaac ugaagcaacu agaaauguug gagaaccaaa uugcaaccau ucaucaaucg 4320
ugcccaaguc aggagcauca agaaauccug uucaauaacg ugagaugguu auccauacag 4380
ucaaagagau uugccccgcu cuaugcgguu gaggcuaaga gaauacaaaa guuagagcac 4440
acgauuaaca acuacguaca guucaagagc aaacaccgua uugaaccagu auguuuguug 4500
gugcacggua gcccaggcac gggcaaguca guugccacca auuuaauugc cagagcaaua 4560
gcagagaagg agaacaccuc cacauacuca cuaccaccag aucccuccca uuucgauggg 4620
uacaagcaac aagguguggu gaucauggau gauuugaauc agaacccaga cggagcagac 4680
augaagcugu uuugucagau ggucuccacu guagaauuca uaccaccaau ggcuucgcua 4740
gaagaaaagg guauuuuguu cacaucuaau uacguuuugg ccucaaccaa uuccagucgc 4800
aucaccccac caacuguugc gcacagcgau gcccuagcca ggcgcuuugc auuugacaug 4860
gacauacaaa ucaugagcga guauucuaga gauggaaaau ugaacauggc gauggcaacu 4920
gaaaugugua agaacuguca ucaaccagca aacuucaaga gauguugccc auuggugugu 4980
ggcaaagcca uccagcugau ggacaaaucu uccagaguca gauauaguau agaucagauu 5040
acuaccauga uuauuaauga gaggaacaga agaucaagua ucgguaauug cauggaggca 5100
cuuuuccaag guccucuuca auacaaagac cugaaaauag acauuaagac cacaccuccu 5160
ccugagugca ucaaugauuu gcuccaagca guugauucuc aagagguaag agacuacugu 5220
gagaagaagg guuggauagu agacaucacu agucaggugc aaaccgaaag aaacaucaau 5280
agagcaauga cuauucuuca ggcggucacc acauuugccg caguugcugg agugguguau 5340
gugauguaca aacucuuugc agggcaucaa ggagcguaua cagggcuucc caauaagaga 5400
cccaaugucc ccaccaucag gacugccaag guucagggcc caggauuuga cuacgcagug 5460
gcaauggcca aaagaaacau ucuuacggca acuaccauua agggagaguu cacaaugcuc 5520
ggagugcaug auaauguggc cauucuacca acccacgcau caccggguga aacaauaguc 5580
auugauggca aggaaguaga gguacuggau gcuaaagccc uggaggacca ggccgggacc 5640
aaccuagaaa ucaccaucgu cacucuuaag agaaaugaga aguucaggga caucagacca 5700
cacaucccca cucaaaucac ugagacaaau gauggaguuu uaauugugaa cacuaguaag 5760
uaccccaaca uguauguucc ugucggugcu gugacugaac agggguaucu caaucucggu 5820
ggacgccaaa cugcucguac uuuaauguac aacuuuccaa cgagagcagg ucaauguggu 5880
ggaguuauca ccugcacugg caaggucauc gggaugcaug uuggugggaa cgguucacau 5940
ggguucgcag cagcccugaa gcgauccuau uucacucaga gucaagguga aauccagugg 6000
augagaccau caaaagaagu gggcuacccc guuauuaaug cuccaucuaa aacuaaacug 6060
gaacccagug cauuccauua uguguuugaa ggugucaagg aaccagcugu gcucaccaaa 6120
agugacccca gauugaagac agauuuugaa gaggcuaucu uuuccaagua ugugggaaau 6180
aagauuacug aaguggauga guacaugaaa gaagcugucg aucauuacgc aggccagcuc 6240
augucacuag acaucaacac agaacaaaug ugccuugagg augcaaugua uggcacugac 6300
ggucucgaag cucuagaccu caguaccagu gcuggguauc ccuauguggc aauggggaaa 6360
aagaaaagag acauuuugaa uaagcaaacc agagacacaa aggaaaugca aaggcuucug 6420
gacaccuaug guauuaauuu accuuuaguc accuauguga aagaugagcu uagauccaag 6480
accaaagugg aacagggcaa guccaggcua auugaggccu caagucucaa ugacucuguc 6540
gccaugagga uggcuuuugg caacuuguac gcagcauucc acaagaaccc agguguagug 6600
acaggaucgg cuguuggcug ugacccagau uuguuuugga guaaaauacc aguccucaug 6660
gaggaaaaac ucuuugcauu ugauuacacg gguuaugaug cuucacuaag ccccgccugg 6720
uuugaggcuc ucaagauggu ucuagagaaa auuggguuug gugacagagu ggauuacauu 6780
gauuaucuga aucacucgca ccaucuauau aaaaauaaga cauauugugu uaagggcggc 6840
augccaucug gcugcucugg caccucaauu uuuaauucaa ugauuaauaa ucuaauaauc 6900
aggacucucu uacugaaaac cuacaagggc auagauuuag accaccugaa gaugauagcc 6960
uauggugaug auguaauugc uuccuacccc caugagguug augcuagucu ccuagcccaa 7020
ucaggaaaag acuauggacu aaccaugaca ccagcugaca aaucagccac cuuugaaaca 7080
gucacauggg agaauguaac auucuugaaa agauucuuua gagcagauga aaaguauccc 7140
uuucugauac auccagugau gccaaugaaa gaaauucacg aaucaauuag auggacuaaa 7200
gaucccagaa acacucagga ucauguucgc ucacugugcu uauuggcuug gcacaauggc 7260
gaggaagagu acaauaaauu uuuagcuaag auuagaagug ugccaaucgg aagagcauua 7320
cugcucccug aguacuccac auuguaccgc cguuggcucg acucauuuua guaacccuac 7380
cucagucgaa uuggauuggg ucauacuguu guagggguaa auuuuucuuu aauucggaga 7440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7500
aa 7502
<210> 6
<211> 7440
<212> RNA
<213> 脊髓灰质炎病毒
<400> 6
uuaaaacagc ucugggguug uacccacccc agaggcccac guggcggcua guacuccggu 60
auugcgguac ccuuguacgc cuguuuuaua cucccuuccc guaacuuaga cgcacaaaac 120
caaguucaau agaagggggu acaaaccagu accaccacga acaagcacuu cuguuucccc 180
ggugaugucg uauagacugc uugcgugguu gaaagcgacg gauccguuau ccgcuuaugu 240
acuucgagaa gcccaguacc accucggaau cuucgaugcg uugcgcucag cacucaaccc 300
cagaguguag cuuaggcuga ugagucugga caucccucac cggugacggu gguccaggcu 360
gcguuggcgg ccuaccuaug gcuaacgcca ugggacgcua guugugaaca aggugugaag 420
agccuauuga gcuacauaag aauccuccgg ccccugaaug cggcuaaucc caaccucgga 480
gcaggugguc acaaaccagu gauuggccug ucguaacgcg caaguccgug gcggaaccga 540
cuacuuuggg uguccguguu uccuuuuauu uuauuguggc ugcuuauggu gacaaucaca 600
gauuguuauc auaaagcgaa uuggauuggc cauccgguga aagugagacu cauuaucuau 660
cuguuugcug gauccgcucc auugagugug uuuacucuaa guacaauuuc aacaguuauu 720
ucaaucagac aauuguauca uaaugggugc ucagguuuca ucacagaaag ugggcgcaca 780
ugaaaacuca aauagagcgu auggugguuc uaccauuaau uacaccacca uuaauuauua 840
uagagauuca gcuaguaacg cggcuucgaa acaggacuuc ucucaagacc cuuccaaguu 900
caccgagccc aucaaggaug uccugauaaa aacagcccca augcuaaacu cgccaaacau 960
agaggcuugc ggguauagcg auagaguacu gcaauuaaca cugggaaacu ccacuauaac 1020
cacacaggag gcggcuaauu caguagucgc uuaugggcgu uggccugaau aucugaggga 1080
cagcgaagcc aauccagugg accagccgac agaaccagac gucgcugcau gcagguuuua 1140
uacgcuagac accgugucuu ggacgaaaga gucgcgaggg ugguggugga aguugccuga 1200
ugcacugagg gacaugggac ucuuugggca aaauauguac uaccacuacc uagguagguc 1260
cggguacacc gugcauguac aguguaacgc cuccaaauuc caccaggggg cacuaggggu 1320
auucgccgua ccagagaugu gucuggccgg ggauagcaac accacuacca ugcacaccag 1380
cuaucaaaau gccaauccug gcgagaaagg aggcacuuuc acggguacgu ucacuccuga 1440
caacaaccag acaucaccug cccgcagguu cugcccggug gauuaccucc uuggaaaugg 1500
cacguuguug gggaaugccu uuguguuccc gcaccagaua auaaaccuac ggaccaacaa 1560
cugugcuaca cugguacucc cuuacgugaa cucccucucg auagauagua ugguaaagca 1620
caauaauugg ggaauugcaa uauuaccauu ggccccauua aauuuugcua gugaguccuc 1680
cccagagauu ccaaucaccu ugaccauagc cccuaugugc ugugaguuca auggauuaag 1740
aaacaucacc cugccacgcu uacagggccu gccggucaug aacaccccug guagcaauca 1800
auaucuuacu gcagacaacu uccagucacc gugugcgcug ccugaauuug augugacccc 1860
accuauugac auacccggug aaguaaagaa caugauggaa uuggcagaaa ucgacaccau 1920
gauucccuuu gacuuaagug ccacaaaaaa gaacaccaug gaaauguaua ggguucgguu 1980
aagugacaaa ccacauacag acgaucccau acucugccug ucacucucuc cagcuucaga 2040
uccuagguug ucacauacua ugcuuggaga aauccuaaau uacuacacac acugggcagg 2100
aucccugaag uucacguuuc uguucugugg auucaugaug gcaacuggca aacuguuggu 2160
gucauacgcg ccuccuggag ccgacccacc aaagaagcgu aaggaggcga uguugggaac 2220
acaugugauc ugggacauag gacugcaguc cucauguacu augguagugc cauggauuag 2280
caacaccacg uaucggcaaa ccauagauga uaguuucacc gaaggcggau acaucagcgu 2340
cuucuaccaa acuagaauag ucgucccucu uucgacaccc agagagaugg acauccuugg 2400
uuuuguguca gcguguaaug acuucagcgu gcgcuuguug cgagauacca cacauauaga 2460
gcaaaaagcg cuagcacagg gguuagguca gaugcuugaa agcaugauug acaacacagu 2520
ccgugaaacg gugggggcgg caacaucuag agacgcucuc ccaaacacug aagccagugg 2580
accaacacac uccaaggaaa uuccggcacu caccgcagug gaaacugggg ccacaaaucc 2640
acuagucccu ucugauacag ugcaaaccag acauguugua caacauaggu caaggucaga 2700
gucuagcaua gagucuuucu ucgcgcgggg ugcaugcgug accauuauga ccguggauaa 2760
cccagcuucc accacgaaua aggauaagcu auuugcagug uggaagauca cuuauaaaga 2820
uacuguccag uuacggagga aauuggaguu cuucaccuau ucuagauuug auauggaacu 2880
uaccuuugug guuacugcaa auuucacuga gacuaacaau gggcaugccu uaaaucaagu 2940
guaccaaauu auguacguac caccaggcgc uccagugccc gagaaauggg acgacuacac 3000
auggcaaacc ucaucaaauc caucaaucuu uuacaccuac ggaacagcuc cagcccggau 3060
cucgguaccg uauguuggua uuucgaacgc cuauucacac uuuuacgacg guuuuuccaa 3120
aguaccacug aaggaccagu cggcagcacu aggugacucc cuuuauggug cagcaucucu 3180
aaaugacuuc gguauuuugg cuguuagagu agucaaugau cacaacccga ccaaggucac 3240
cuccaaaauc agaguguauc uaaaacccaa acacaucaga gucuggugcc cgcguccacc 3300
gagggcagug gcguacuacg gcccuggagu ggauuacaag gaugguacgc uuacaccccu 3360
cuccaccaag gaucugacca cauauggauu cggacaccaa aacaaagcgg uguacacugc 3420
agguuacaaa auuugcaacu accacuuggc cacucaggau gauuugcaaa acgcagugaa 3480
cgucaugugg aguagagacc ucuuagucac agaaucaaga gcccagggca ccgauucaau 3540
cgcaaggugc aauugcaacg caggggugua cuacugcgag ucuagaagga aauacuaccc 3600
aguauccuuc guuggcccaa cguuccagua cauggaggcu aauaacuauu acccagcuag 3660
guaccagucc cauaugcuca uuggccaugg auucgcaucu ccaggggauu gugguggcau 3720
acucagaugu caccacgggg ugauagggau cauuacugcu gguggcgaag gguugguugc 3780
auuuucagac auuagagacu uguaugccua cgaagaagaa gccauggaac aaggcaucac 3840
caauuacaua gagucacuug gggccgcauu uggaagugga uuuacucagc agauuagcga 3900
caaaauaaca gaguugacca auauggugac caguaccauc acugaaaagc uacuuaagaa 3960
cuugaucaag aucauauccu cacuaguuau uauaacuagg aacuaugaag acaccacaac 4020
agugcucgcu acccuggccc uucuugggug ugaugcuuca ccauggcagu ggcuuagaaa 4080
gaaagcaugc gauguucugg agauaccuua ugucaucaag caaggugaca guugguugaa 4140
gaaguuuacu gaagcaugca acgcagcuaa gggacuggag ugggugucaa acaaaaucuc 4200
aaaauucauu gauuggcuca aggagaaaau uaucccacaa gcuagagaua aguuggaauu 4260
uguaacaaaa cuuagacaac uagaaaugcu ggaaaaccaa aucucaacua uacaccaauc 4320
augcccuagu caggaacacc aggaaauucu auucaauaau gucagauggu uauccaucca 4380
gucuaagagg uuugccccuc uuuacgcagu ggaagccaaa agaauacaga aacuagagca 4440
uacuauuaac aacuacauac aguucaagag caaacaccgu auugaaccag uauguuugcu 4500
aguacauggc agccccggaa cagguaaauc uguagcaacc aaccugauug cuagagccau 4560
agcugaaaga gaaaacacgu ccacguacuc gcuacccccg gauccaucac acuucgacgg 4620
auacaaacaa cagggagugg ugauuaugga cgaccugaau caaaacccag auggugcgga 4680
caugaagcug uucugucaga ugguaucaac aguggaguuu auaccaccca uggcaucccu 4740
ggaggagaaa ggaauccugu uuacuucaaa uuacguucua gcauccacaa acucaagcag 4800
aauuuccccc cccacugugg cacacaguga ugcauuagcc aggcgcuuug cguucgacau 4860
ggacauucag gucaugaaug aguauucuag agaugggaaa uugaacaugg ccauggcuac 4920
ugaaaugugu aagaacuguc accaaccagc aaacuuuaag agaugcuguc cuuuagugug 4980
ugguaaggca auucaauuaa uggacaaauc uuccagaguu agauacagua uugaccagau 5040
cacuacaaug auuaucaaug agagaaacag aagauccaac auuggcaauu guauggaggc 5100
uuuguuucaa ggaccacucc aguauaaaga cuugaaaauu gacaucaaga cgaguccccc 5160
uccugaaugu aucaaugacu ugcuccaagc aguugacucc caggagguga gagauuacug 5220
ugagaagaag gguuggauag ucaacaucac cagccagguu caaacagaaa ggaacaucaa 5280
cagggcaaug acaauucuac aagcggugac aaccuucgcc gcaguggcug gaguugucua 5340
ugucauguau aaacuguuug cuggacacca gggagcauac acugguuuac caaacaaaaa 5400
acccaacgug cccaccauuc ggacagcaaa gguacaagga ccaggguucg auuacgcagu 5460
ggcuauggcu aaaagaaaca uuguuacagc aacuacuagc aagggagagu ucacuauguu 5520
aggaguccac gacaacgugg cuauuuuacc aacccacgcu ucaccuggug aaagcauugu 5580
gaucgauggc aaagaagugg agaucuugga ugccaaagcg cucgaagauc aagcaggaac 5640
caaucuugaa aucacuauaa ucacucuaaa gagaaaugaa aaguucagag acauuagacc 5700
acauauaccu acucaaauca cugagacaaa ugauggaguc uugaucguga acacuagcaa 5760
guaccccaau auguauguuc cugucggugc ugugacugaa cagggauauc uaaaucucgg 5820
ugggcgccaa acugcucgua cucuaaugua caacuuucca accagagcag gacagugugg 5880
uggagucauc acauguacug ggaaagucau cgggaugcau guugguggga acgguucaca 5940
cggguuugca gcggcccuga agcgaucaua cuucacucag agucaaggug aaauccagug 6000
gaugagaccu ucgaaggaag ugggauaucc aaucauaaau gccccgucca aaaccaagcu 6060
ugaacccagu gcuuuccacu auguguuuga aggggugaag gaaccagcag uccucacuaa 6120
aaacgauccc aggcuuaaga cagacuuuga ggaggcaauu uucuccaagu acguggguaa 6180
caaaauuacu gaaguggaug aguacaugaa agaggcagua gaccacuaug cuggccagcu 6240
caugucacua gacaucaaca cagaacaaau gugcuuggag gaugccaugu auggcacuga 6300
uggucuagaa gcacuugauu uguccaccag ugcuggcuac ccuuauguag caaugggaaa 6360
gaagaagaga gacaucuuga acaaacaaac cagagacacu aaggaaaugc aaaaacugcu 6420
cgacacauau ggaaucaacc ucccacuggu gacuuaugua aaggaugaac uuagauccaa 6480
aacaaagguu gagcagggga aauccagauu aauugaagcu ucuaguuuga augacucagu 6540
ggcaaugaga auggcuuuug ggaaccuaua ugcugcuuuu cacaaaaacc caggagugau 6600
aacagguuca gcaguggggu gcgauccaga uuuguuuugg agcaaaauuc cgguauugau 6660
ggaagagaag cuguuugcuu uugacuacac aggguaugau gcaucucuca gcccugcuug 6720
guucgaggca cuaaagaugg ugcuugagaa aaucggauuc ggagacagag uugacuacau 6780
cgacuaccua aaccacucac accaccugua caagaauaaa acauacugug ucaagggcgg 6840
uaugccaucu ggcugcucag gcacuucaau uuuuaacuca augauuaaca acuugauuau 6900
caggacacuc uuacugaaaa ccuacaaggg cauagauuua gaccaccuaa aaaugauugc 6960
cuauggugau gauguaauug cuuccuaccc ccaugaaguu gacgcuaguc uccuagccca 7020
aucaggaaaa gacuauggac uaacuaugac uccagcugac aaaucagcua cauuugaaac 7080
agucacaugg gagaauguaa cauucuugaa gagauucuuc agggcagacg agaaauaccc 7140
auuucuuauu cauccaguaa ugccaaugaa ggaaauucau gaaucaauua gauggacuaa 7200
agauccuagg aacacucagg aucacguucg cucucugugc cuuuuagcuu ggcacaaugg 7260
cgaagaagaa uauaacaaau uccuagcuaa aaucaggagu gugccaauug gaagagcuuu 7320
auugcuccca gaguacucaa cauuguaccg ccguuggcuu gacucauuuu aguaacccua 7380
ccucagucga auuggauugg gucauacugu uguaggggua aauuuuucuu uaauucggag 7440
<210> 7
<211> 7471
<212> RNA
<213> 脊髓灰质炎病毒
<400> 7
uuaaaacagc ucugggguug uacccacccc agaggcccac guggcggcua guacuccggu 60
accacgguac ccuuguacgc cuguuuuaua cucccuuccc ccgcaauuua gaagcucaug 120
aucaaguuca auaggagggg guacaaacca guaccaccac gaacaagcac uucuguuucc 180
ccggugaugu uguauagacu gcucgcgcgg uuaaaagcga cggauccguu auccgcucau 240
guacuucgag aagccuagua uuaccucggg aucuucgacg cguugcgcuc agcacucaac 300
cccagagugu agcuuagguc gaugagucug gacauuccuc accggcgacg gugguccagg 360
cugcguuggc ggccuaccua uggcuaacgc cauaggacgc uaguugugaa caagguguga 420
agagccuauu gagcuacaug agaguccucc ggccccugaa ugcggcuaau cccaaccucg 480
gagcaggcga ucacaagcca gugauuggcc ugucguaaug cguaaguccg agacggaacc 540
gacuacuuug gguguccgug uuuccuuuua uuuuuaucau ggcugccuau ggugacaauc 600
agugauuguu gucauagagc gaauuggauu ggccauccgg ugaaaacaaa gucaauuacu 660
uucucacuug uuggaccuac acccgauacg cuuuaccccc aagcuaauua aaauuauuag 720
aaguuaggac uacgguguca caaugggagc ucaaguuucg ucccaaaaag uaggcgcuca 780
ugaaaauucc aaccgggccu ccgguggcuc caccaucaac uacaccacaa uuaauuauua 840
uaaagauucu gcuaguaaug cggcgucuaa gcaagacuac ucacaggacc cuucaaaguu 900
caccgagccg cuaaaggaug ugcucauaaa gacagcucca gcacucaauu caccaaaugu 960
ggaggcgugc ggguauagcg auagaguguu acaacucacu uuaggcaauu ccaccauuac 1020
uacacaggag gcagccaacu caguaguagc cuacggacgg uggccugaau ucauuagaga 1080
ugaugaagca aacccagugg aucaaccaac ugagccagac guugccacau gcagauuuua 1140
cacucuagac acuguaaugu ggggcaagga guccaaaggu ugguggugga aguugccuga 1200
ugcacugaga gacauggguc uguuuggaca aaacauguau uaccacuacc uaggaagauc 1260
uggguacacu gugcacgugc agugcaacgc uucuaaauuu caucaaggcg cacuaggggu 1320
guuugcgauu ccugaruauu gucuggcagg cgacagugac aagcaaaggu acacuaguua 1380
ugcaaaugca aauccaggcg aaaagggagg gaaauuuuac ucccaguuca acaaggauaa 1440
cgcaguaacg uccccaaaaa gagaguuuug cccaguggau uaucuccugg gaugcggggu 1500
guugcuggga aaugccuuug uauacccaca ccagaucauu aaucugagga ccaauaacag 1560
cgcaaccauu guccuaccau acgugaaugc uuuagcuauu gacucaaugg uuaaacacaa 1620
caacuggggc auugccauuu ugcccuuauc accguuggac uuugcucagg auucaucagu 1680
ugaaauuccg auuaccguga caauugcccc aauguguagu gaguucaaug gucuccgcaa 1740
cgugacugca cccaaauuuc aaggrcuacc agugcugaau acaccuggaa guaaccagua 1800
ccuaacauca gacaaccacc aaucaccaug cgcaaucccu gaauuugaug ucacuccgcc 1860
uaucgauauc ccaggygagg uuaaaaacau gauggagcuc gccgagauag acaccaugau 1920
cccccucaau uuggagaaua cuaagagaaa uacaauggac auguacaggg ucacucugag 1980
cgacagugcc gaucuaucgc aaccaauucu gugcuugucg cuaucuccgg caucugaucc 2040
gcgcuugucg cacaccaugc uuggggaagu gcugaacuau uauacucauu gggcuggauc 2100
uuugaaguuc acuuuucugu ucuguggcuc aaugauggcu acagggaaaa ucuuaguggc 2160
cuaugcacca ccgggcgcac aaccccccac cagucguaag gaggccaugu ugggcacaca 2220
ucucauuugg gaucuugguc ugcaaucauc cugcaccaug gugguaccau ggauuagcaa 2280
cgugacauac agacagacua cacaagauag cuucacugaa ggcggauaua uuagcauguu 2340
uuaccaaaca aggauuguag ugccacuauc cacccccaag aguaugaaca ugcugggguu 2400
ugugucagcc uguaacgacu uuagugugcg auugcuacga gacaccacuc acauuucaca 2460
aucagcgcuu ccacagggca uugaagaauu gauuuccgaa gucgcgcaag gcgcccuaac 2520
uuuaucacuc cccaagcagc aggacagcuu accugacacc aaggccagug gcccggcgca 2580
cuccaaggag gugccugcac ucacugcagu cgagacuggg gcuaccaauc cucugguacc 2640
auccgacaca guucaaacgc gccauguaau ccaacggcgu agcaggucag aguccacgau 2700
agaaucauuc uucgcacgcg gggcgugcgu ugcuaucauu gagguagaca acgaacaacc 2760
aaccacccgg gcacagaaac uuuuugccac guggcgcauu acguacaaag auacaguaca 2820
auuacgccgc aaauuggagu ucuuuacaua cucccguuuu gacauggaau ucaccuuugu 2880
aguaacugcu aacuucacca acgccaauaa cgggcaugcc cugaaccaag uguaccagau 2940
aauguacauc cccccaggag caccuacacc aaagucaugg gacgacuaca ccuggcaaac 3000
aucuuccaac ccgucuauau ucuacaccua uggggcugca ccggcgcgaa uuucaguacc 3060
auacgugggg uuggccaaug cuuacucaca cuuuuacgac ggcuuugcca aggugccacu 3120
gaaaacagac gccaacgacc aaauugguga uuccuuguac agugcuauga caguggacga 3180
cuuuggugug uuggcaauuc gaguugucaa ugaucacaac cccacuaarg uaaccuccaa 3240
aauccgcauu uacaugaaac ccaaacacgu gcgugucugg ugcccuagac caccacgcgc 3300
gguaccuuuu uauggaccag ggguggacua caaagacaac uugaaccccu ugucugygaa 3360
agguuugacc accuauggcu uuggacauca gaauaaggcu guuuauaccg cuggauacaa 3420
gauuuguaac uaucaccuug cuacccaaga ggaucuacaa aaugcugugu guaucaugug 3480
gaacagagau cuugugguug uugauucaaa agcucaaggc accgacucga uagcuagaug 3540
uaacugcaac gcaggggugu auuacuguga guccaggaga aaauacuacc cugugucauu 3600
cauaggaccc accuuucagu uuauggaggc caaugacuau uacccugcaa gguaucaguc 3660
ccacauguua auugggcacg guuuugccuc accaggcgau uguggcggca uucuuagaug 3720
ccagcauggc guuauuggga uuauaacagc ugguggugaa ggcuuggucg cauuuucaga 3780
cauaagagau cuuuaugcau augaagagga agcuauggag cagggaauau ccaauuacau 3840
agagucgcuc ggagcagcgu ucggcagcgg guuuacucag caaauagggg acaagaucuc 3900
agagcugacu agcaugguga ccagcacaau uacggagaaa uuacuaaaga accuaaucaa 3960
gaucaucuca ucacugguga ucauaaccag aaacuacgag gacaccacca cagugcuugc 4020
caccuuagcu cuccuuggau gugacaucuc gccauggcag ugguuaaaga agaaggcaug 4080
ugauauucug gaaauaccau augucauuaa acagggugau agcugguuga agaaguuuac 4140
ugaggcaugc aacgccgcca aggggcuaga gugggugucu aauaaaauuu caaaguuuau 4200
ugauugguua aaggagaaaa uuauuccaca ggcgagagau aaacuugagu uugucaccaa 4260
acuuaaacaa uuggaaaugc ucgaaaauca gauuuccacg auacaucaau cuugccccag 4320
ccaggaacac caggaaguuc uguucaacaa cgugcggugg uugucaauuc agucuaagaa 4380
guuugcgcca cuuuaugcgc uugaggccaa gagaauacaa aaguuagaac acaccaucaa 4440
uaauuacaua caguucaaga gcaaacaccg uauugaacca guguguuugu uggugcacgg 4500
gagcccaggc accggaaaau caguugcgac caaucuaauu gcuagagcca uagcagagaa 4560
agagaacaca uccaccuacu cacugccacc agacccgucu cacuuugaug guuauaaaca 4620
gcaaggugug gucaucaugg augauuugaa ccaaaaccca gauggggcag auaugaaacu 4680
cuuuugucaa augguaucua cuguggaguu caucccgccu auggccucac uggaagaaaa 4740
aggcauuuug uucacaucca auuaugucuu ggcuuccacc aacuccaguc guaucacacc 4800
acccacagua gcccauagug acgcgcuggc uaggagauuc gccuucgaua uggacauaca 4860
aguaaugggc gaguauucca gagaugguaa acucaacaug gcaauggcca cugagaugug 4920
uaaaaacugc caccaaccag caaacuucaa gagaugcugc ccuuuggugu guggcaaggc 4980
uauucaguug auggacaaau ccucuagagu uagauacagu auugaccaga ucaccacuau 5040
gauuaucaau gagagaaaca gaagauccaa cauagguaau ugcauggagg cucuauucca 5100
aggaccacuc caguacaaag accugaaaau ugacaucaaa acgagucccc ccccugagug 5160
uaucaaugac cugcuacaag caguugacuc ccaagaagug agggauuauu gugaaaagaa 5220
agguuggauu guuaacauua ccagucaagu ucaaacagag agaaacauua aucgggcaau 5280
gacuauuuua caagcaguga caacauucgc ugcaguggcc ggugucgugu acguuaugua 5340
caaacuguuc gcuggccacc agggagcaua cacuggacug ccaaacaaaa gaccuaaugu 5400
acccaccauu agaacagcaa aagugcaagg gccuggauuu gacuacgcug uggcuauggc 5460
caaaagaaac auuguuacag caaccacuag uaagggagag uucaccaugc ugggagugca 5520
cgacaacgug gccauacuac cgacccaugc cucgccuggu gagagcaucg ugaucgaugg 5580
caaggagguu gaaauuuuag acgccaaagc ccucgaagau caagcaggca ccaaucugga 5640
aaucacuaua auaacccuca aaagaaauga gaaguucaga gacaucagau cucacauacc 5700
cacccaaauc acugagacaa augauggagu cuugaucgua aacacuagua aguaccccaa 5760
cauguauguu ccuguuggug cugugaccga acagggauau cucaaucucg gcggacguca 5820
gaccgcgcgu acauugaugu acaacuuucc aacacgagcg ggucaaugcg guggagucau 5880
caccugcacu ggcaaaguca ucgggaugca ugucgguggg aacgguucac auggguucgc 5940
agcagcccua aagcgaucuu acuucacuca gagucaaggu gagauucagu ggaugagacc 6000
aucaaaagag gugggguacc ccaucaucaa ugccccaucu aaaaccaagc uugagcccag 6060
cgccuuucac uauguguuug aagguguuaa agaaccagca guacucacau ggaaugaccc 6120
cagauugaaa acggacuuug aagaagccau cuucuccaag uauguaggga acaagauuac 6180
ugaaguggau gaguacauga aagaagcugu ugaccacuau gcuggucagc ucaugucccu 6240
ggacaucaac acugagcaga ugugccuaga agaugccaug uacggaacug auggauugga 6300
ggccuuggac cuaagcacua gugcaggaua ucccuaugug gcgaugggaa agaagaaaag 6360
agacaucuug aacaaacaga ccagagacac uaaggagaug cagagacugc ucgacaccua 6420
uggaaucaac cuuccguugg ugacguaugu caaagaugag cucagaucaa aagugaaggu 6480
ggaacagggc aagucuagac uaauugaggc auccagcuug aaugauuccg uugccaugag 6540
aauggcauuu gggaaucugu acgcugccuu ucauaagaau ccaggcguug uaacagguuc 6600
cgcaguugga ugugauccag accuauuuug gagcaggauc ccagugcuaa uggaggagaa 6660
gcuuuuugcc uuugauuaca cagguuauga cgccucgcuc aguccugcgu gguuugaggc 6720
acuuaaaaug gugcuugaga aaauuggcuu uggagacaga guagauuaca ucgacuaucu 6780
caaccauucu caccauuugu acaagaacaa aaccuauugu guuaagggug gcaugccauc 6840
uggcugcucu ggcacuucaa uuuucaauuc uaugauuaau aacuuaauua uuaggacacu 6900
auuacugaaa accuacaagg gcauagauuu agaccgccua aagaugaucg ccuaugguga 6960
ugauguaauu gcuuccuacc cccaugaggu ugacgcuagu cuccuagccc aaucaggaaa 7020
agacuaugga cuaaccauga caccagccga uaagucaacg acuuuugaaa cugucacaug 7080
ggagaaugua acauucuuga aaagauucuu cagagcagau gaaaaguacc ccuuucuaau 7140
acacccagua augccaauga aggagauuca cgaaucaauu agauggacaa aagauccaag 7200
gaacacacag gaucauguuc gcucacuaug ccuauuggcg uggcauaaug gcgaagaaga 7260
auauaacaaa uuuuuagcua aaauuagaag ugugccaauc ggaagagcuu uguugcuccc 7320
agaguacucu acacuguacc gccguuggcu ugacucauuu uaguaacccu accucagucg 7380
aauuggauug ggucauacug uugugggggu aaauuuuucu uuaauucgga gaaaaaaaaa 7440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 7471
<210> 8
<211> 7452
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎病毒
<400> 8
ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtacactggt 60
atcacggtac ctttgtacgc ctgttttata ctccctcccc cgcaacttag aagcatacaa 120
ttcaagctca ataggagggg gtgcaagcca gcgcctccgt gggcaagcac tactgtttcc 180
ccggtgaggc cgcatagact gttcccacgg ttgaaagtgt ccgatccgtt atccgctcat 240
gtacttcgag aagcctagta tcgctctgga atcttcgacg cgttgcgctc agcactcaac 300
cccggagtgt agcttgggcc gatgagtctg gacagtcccc actggcgaca gtggtccagg 360
ctgcgctggc ggcccacctg tggcccaaag ccacgggacg ctagttgtga acagggtgtg 420
aagagcctat tgagctacat gagagtcctc cggcccctga atgcggctaa ttctaaccat 480
ggagcaggca gctgcaaccc agcagccagc ctgtcgtaac gcgcaagtcc gtggcggaac 540
cgactacttt gggtgtccgt gtttcctttt attcttgaat ggctgcttat ggtgacaatc 600
atagattgtt atcataaagc gagttggatt ggccatccag tgtgaatcag attaattact 660
cccttgtttg ttggatccac tcccgaaacg ttttactcct taacttattg aaattgtttg 720
aagacaggat ttcagtgtca caatgggagc tcaagtatca tcccaaaaag taggcgctca 780
cgagaattct aaccgagcct acggtggttc tacgatcaac tacaccacaa ttaattatta 840
taaagattcc gcaagtaatg cggcgtccaa acaagattac tcacaggatc catcaaaatt 900
caccgagcca ctaaaggacg tgctcataaa aacagctcca gcactcaatt caccaaatgt 960
ggaagcgtgt gggtatagtg atagagtgtt gcaactcact ttaggcaatt ccactattac 1020
tacacaggag gcagcaaatt cagtagtggc ttacggacgt tggcctgagt ttattagaga 1080
tgacgaagca aacccggtgg accaaccaac tgaaccagat gtggctacat gcagattcta 1140
cacactagac actgtaatgt ggggtaagga gtcgaaaggc tggtggtgga agttacctga 1200
cgcactgaga gacatgggtc tgtttggaca aaacatgtat taccactacc taggaagatc 1260
cgggtacact gtgcacgtgc agtgtaatgc atccaaattt caccaaggtg cactcggggt 1320
gtttgcgatt cctgagtatt gtctggcggg tgacagtgac aagcaaaggt acactagtta 1380
tgcaaatgcg aatccaggtg aaagaggggg aaaattttac tcccaattca acaaggataa 1440
cgcagtaaca tccccaaaaa gagagttctg cccagtggat tatctcctgg gatgtggggt 1500
gttactggga aatgcctttg tatacccaca tcaaatcatt aatctgagga ccaacaacag 1560
cgcaactatt gtcctaccat atgtgaatgc tttggccatt gattcaatgg ttaaacacaa 1620
caactggggc attgccattc tgcccttatc accgctggat tttgctcaag attcatcagt 1680
tgaaattcca attactgtga caattgcccc aatgtgtagc gagttcaacg gccttcgcaa 1740
cgtgactgca cctaaatttc aaggactacc agtgttgaac actcctggta gtaaccagta 1800
cctgacgtca gacaaccacc aatcaccatg cgcaatccca gaatttgatg tcactccgcc 1860
tattgatatc ccaggtgagg ttaaaaacat gatggagctc gccgagatag acaccatgat 1920
tcctctcaat ttggagagca ccaagagaaa cacaatggac atgtacagag ttactctgag 1980
cgacagtgcc gatctatcgc aaccaatttt gtgcttgtca ctatccccag catttgatcc 2040
gcgcttgtca cacaccatgc ttggggaagt actgaactat tatactcatt gggccgggtc 2100
cttgaaattt accttcctgt tctgtggttc aatgatggct acggggaaaa tcctagtggc 2160
ctatgcacca ccaggtgcac aaccccccac cagccgtaag gaggctatgt tgggcacaca 2220
tgtcatttgg gatcttggcc tgcaatcatc ttgtactatg gtggtgccgt ggattagtaa 2280
tgtgacatac agacagacta cacaagatag tttcactgag ggcggatata tcagcatgtt 2340
ctaccaaaca agaattgtgg tgccactgtc cacccctaag agtatgagca tgctggggtt 2400
tgtgtcagcc tgtaatgatt tcagtgtgcg attgctgcga gacaccactc acatttcaca 2460
atctgcgctt ccacagggta ttgaagattt gatttctgaa gttgcacagg gcgccctaac 2520
tttgtcactc ccgaagcaac aggatagctt acctgatact aaggccagtg gcccggcgca 2580
ttccaaggag gtacctgcac tcactgcagt cgagactgga gccaccaatc ctctggcacc 2640
atccgacaca gttcaaacgc gccacgtagt ccaacgacgc agcaggtcag agtccacaat 2700
agaatcattc ttcgcacgcg gggcgtgcgt cgctattatt gaggtggaca atgaacaacc 2760
aaccacccgg gcacagaaac tatttgccat gtggcgcatt acatacaaag atacagtgca 2820
gttgcgccgt aagttggagt ttttcacata ctctcgtttt gacatggaat tcaccttcgt 2880
ggtaaccgcc aacttcacca acgctaataa tgggcatgca ctcaaccagg tgtaccagat 2940
aatgtacatc cccccagggg cacccacacc aaagtcatgg gacgactaca cttggcaaac 3000
atcttccaac ccgtccatat tttacaccta tggggctgcc ccggcgcgaa tctcagtgcc 3060
atacgtgggg ttagccaatg cttactcgca cttttacgac ggcttcgcca aggtgccatt 3120
gaagacagat gccaatgacc agattggtga ttccttgtac agcgccatga cagttgatga 3180
ctttggtgta ttggcagttc gtgttgtcaa tgatcacaac cccactaaag taacctccaa 3240
agtccgcatt tacatgaaac ccaaacacgt acgtgtctgg tgccctagac cgccgcgcgc 3300
ggtaccttat tatggaccag gggtggacta taggaacaac ttggacccct tatctgagaa 3360
aggtttgacc acatatggct ttgggcatca gaataaagct gtgtacactg ctggttacaa 3420
gatctgcaac taccatctcg ccactaagga ggatttacaa aatgctgtaa gcatcatgtg 3480
gaatagagac ctcttggttg ttgaatcaaa agctcaaggt accgactcaa tagcaaggtg 3540
caattgcaat gcaggggtgt actattgtga gtccagaagg aaatactacc ctgtgtcgtt 3600
tgtgggaccc accttccaat acatggaggc taatgactac tacccagcta gataccaatc 3660
ccacatgtta atcgggcacg gctttgcctc accaggtgac tgtggtggta tccttaggtg 3720
tcaacatggc gtcatcggaa tcgtgacagc tggtggagag ggattagtcg cattctctga 3780
cataagggac ttgtatgctt acgaggaaga ggccatggag cagggcattt caaactatat 3840
tgagtcactc ggtgctgcgt tcggtagtgg gttcactcag caaatagggg ataagatatc 3900
agaactaacc agcatggtga ccagcacgat tacagagaag ctacttaaaa acctaatcaa 3960
aattatttca tctctggtga ttatcactag aaattacgaa gataccacca cagtgctcgc 4020
cactctagct cttcttgggt gtgatgtttc accgtggcaa tggctgaaga agaaagcatg 4080
tgacactttg gagattccct atgttattag acagggtgat agttggttga aaaaatttac 4140
tgaggcgtgc aacgcagcta aggggttgga atgggtgtcc aacaaaatct caaaatttat 4200
tgactggttg agagaaagaa tcatcccaca agccagggac aagcttgagt ttgtaaccaa 4260
attgaaacag ttggaaatgc tagagaatca gatatccaca atacaccaat cttgtccaag 4320
tcaggaacac caggaaattt tgttcaacaa tgtacgctgg ttgtccattc aatccaagag 4380
attcgctcca ttgtacgcac ttgaggccaa gagaatacaa aagttggaac acaccattaa 4440
taattacata cagttcaaga gcaaacaccg tattgagcca gtatgtttgt tagtgcatgg 4500
gagcccaggt acaggaaaat cagttgcgac taacctaatt gctagagcca tagctgagaa 4560
agagaacacc tccacctact cgctaccacc ggacccgtct cactttgatg gatacaaaca 4620
acaaggtgtg gttatcatgg acgacctaaa ccaaaacccg gatggggcag atatgaagct 4680
cttttgtcaa atggtgtcca ctgtggagtt tatcccacct atggcctcgc tggaagagaa 4740
aggcattctg ttcacatcca actatgtttt agcctccacc aactccagtc gcatcacacc 4800
acctacagta gcccacagtg acgctctggc caggaggttc gctttcgata tggatattca 4860
agtgatgggc gagtactcca gagatggtaa actcaacatg gcaatggcta ctgagacgtg 4920
caaggactgc caccaaccag caaacttcaa aagatgctgt cctttagtgt gtggtaaggc 4980
aattcagtta atggacaaat cttccagagt taggtacagt gttgaccaga ttactacaat 5040
gattatcaac gagagaaaca gaagatctaa cattggcaat tgcatggagg ctttgttcca 5100
aggaccactc cagtacaaag acctgaaaat tgacatcaag acgaggcccc cccctgaatg 5160
catcaatgat ctgcttcaag cagttgactc ccaggaagtg agggattatt gtgaaaagaa 5220
aggatggatc gtcaacatca ctagccaagt tcaaacagag agaaacatta accgagcaat 5280
gaccattttg caggcagtga caactttcgc cgcagtggct ggtgtcgtgt acgtcatgta 5340
caagttattc gctggacacc agggagcata cactggtctg ccaaacaaaa gacccaatgt 5400
gcccaccatt agagcagcaa aagtgcaagg gcctgggttt gactatgcag tggctatggc 5460
taaaagaaac attgttacag caactactag caaaggggag ttcacaatgc taggagtcca 5520
cgacaacgtg gccattttac caactcatgc ctcacctggt gagagtattg taattgatgg 5580
caaagaggtt gaaatcctag acgctaaagc cctcgaagat caggcaggca ctaatctgga 5640
aatcaccata ataaccctca aaagaaatga aaagttcaga gatatcagac aacacatacc 5700
cactcaaatc accgagacga atgatggagt tctgattgtg aacactagta agtaccccaa 5760
catgtatgtt cctgtcggtg ctgtgactga gcagggatac ctaaatctcg gtgggcgcca 5820
gactgctcgt attctaatgt acaactttcc aaccagagct ggtcagtgtg gtggagtcat 5880
cacatgcact gggaaagtca tcgggatgca cgttggtggg aatggttcac atgggtttgc 5940
agcggccctg aagcggtcat acttcactca gagccaaggt gaaatccagt ggatgagacc 6000
atcaaaggag gcagggtatc caattataaa cgccccaacc aagaccaagc tcgagcccag 6060
tgctttccac tatgtgtttg aaggagtaaa ggaaccagca gtcctcacaa agaatgatcc 6120
cagactcaaa acagactttg aagaagcaat cttctctaag tatgtaggga acaagatcac 6180
tgaggtggat gagtacatga aagaggcagt ggaccattat gctggacaac ttatgtcgct 6240
ggatatcagc acagagcaaa tgtgtctaga agacgccatg tatggtactg atggtctgga 6300
ggcgctagat ctgtctacca gtgccgggta cccctacgtg gcaatgggga agaagaagag 6360
agatatccta aacaagcaaa ccagagacac caaagaaatg caaagacttt tggacgctta 6420
cggaatcaac ctaccattag tgacatatgt caaggacgag ctgaggtcca aaacaaaagt 6480
ggaacaggga aaatccagac tgattgaagc ttccagtcta aatgactcag tggccatgag 6540
aatggcattt ggaaaccttt atgcagcatt ccacaggaat ccaggggtcg tcactggtag 6600
tgcagttgga tgcgatccag acctattctg gagcaagatc ccagtgttga tggaagaaaa 6660
gctatttgcc tttgattaca caggatacga cgcatcactt agcccagctt ggtttgaggc 6720
actcaagatg gtgttagaga aaattggttt tggagataga gtggattaca tagactacct 6780
taaccattca caccacttgt acaaaaacaa gatatattgt gttaagggcg gcatgccatc 6840
tggctgctcc ggcacttcaa tttttaattc aatgattaac aatttgatca ttaggacgct 6900
tttactgaaa acctacaagg gcatagattt ggaccactta aaaatgattg cctatggtga 6960
cgatgtaata gcttcctatc cccatgaggt tgacgctagt ctcctagccc aatcaggaaa 7020
agactatgga ctaaccatga ctccggcaga taaatctgcc acttttgaga cagtcacatg 7080
ggagaatgta actttcttga aaagattctt cagagcagat gagaaatacc ccttcctcat 7140
acatccagta atgccaatga aggaaattca tgaatcaatc agatggacaa aagatcctcg 7200
gaatacgcag gaccatgtac gctccttgtg tctattggct tggcacaacg gggaagaaga 7260
atacaacaaa tttttagcta aaattaggag tgtgccaatc ggaagagctt tgttgctccc 7320
agagtactca acattgtacc gccgttggct tgactcattt tagtaaccct acctcagtcg 7380
aattggattg ggtcatactg ttgtaggggt aaatttttct ttaattcgga ggaaaaaaaa 7440
aaaaaaaaaa aa 7452
<210> 9
<211> 7462
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎病毒
<400> 9
ttaaaacagc tctggggttg cacccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactccggt 60
attgcggtac ccttgtacgc ctgttttata ctcccttccc gtaacttaga cgcacaaaac 120
caagttcaat agaagggggt acaaaccagt accaccacga acaagcactt ctgtttcccc 180
ggtgatgttg tatagactgc ttgcgtggtt gaaagcgacg gatccgttat ccgcttatgt 240
acttcgagaa gcccagtacc acctcggaat cttcgatgcg ttgcgctcag cactcaaccc 300
cagagtgtag cttaggctga tgagtctgga catccctcac cggtgacggt ggtccaggct 360
gcgttggcgg cctacctatg gctaacgcca tgggacgcta gttgtgaaca aggtgtgaag 420
agcctattga gctacataag aatcctccgg cccctgaatg cggctaatcc caacctcggg 480
gcaggtggtc acaaaccagt gattggcctg tcgtaacgcg caagtccgtg gcggaaccga 540
ctactttggg tgtccgtgtt tccttttatt ttattgtggc tgcttatggt gacaatcaca 600
gattgttatc ataaagcgaa ttggattggc catccggtga aagtgagatt cattatctat 660
ctgtttgctg gattcgctcc attgagtgtg tttactctaa gtacaatttc aacagttatt 720
tcaatcagac aattgtatca taatgggtgc tcaggtttca tcacagaaag tgggcgcaca 780
tgaaaactca aatagagcgt atggtggttc taccattaat tacaccacca ttaattatta 840
tagagattca gctagtaacg cggcttcgaa acaggacttc tctcaagacc cttccaagtt 900
caccgagccc atcaaggatg tcctgataaa aacatcccca atgctaaact cgccaaacat 960
agaggcttgc gggtatagcg atagagtact gcaattaaca ctgggaaact ccactataac 1020
cacacaggag gcggctaatt cagtagtcgc ttatgggcgt tggcctgaat atctgaggga 1080
cagcgaagcc aatccagtgg accagccgac agaaccagac gtcgctgcat gcaggtttta 1140
tacgctagac accgtgtctt ggacgaaaga gtcgcgaggg tggtggtgga agttgcctga 1200
tgcactgcgg gacatgggac tctttggcca aaatatgtac taccactacc taggtaggtc 1260
cgggtacacc gtgcatgtac agtgtaacgc ctccaaattc caccaggggg cactaggggt 1320
attcgccgta ccagagatgt gtctggccgg ggatagcaac accactacca tgcacaccag 1380
ctatcaaaat gccaatcctg gcgagaaagg aggcactttc acgggtacgt tcactcctga 1440
cgacaaccag acatcacctg cccgtaggtt ctgcccggtg gattacctct ttggaaatgg 1500
cacgttattg gggaatgcct ttgtgttccc gcaccagata ataaacctac ggaccaacaa 1560
ctgtgctaca ctggtactcc cttacgtgaa ctccctctcg atagatagta tggtaaagca 1620
caataattgg ggaattgcaa tattaccatt ggccccatta aattttgcta gtgagtcctc 1680
cccagagatt ccaatcacct tgaccatagc ccctatgtgc tgtgagttca atggattaag 1740
aaacattacc ctgccacgct tacagggcct gccggtcatg aacacccctg gtagcaatca 1800
atatcttact gcagacaact tccagtcacc gtgtgcgctg cctgaatttg atgtgacccc 1860
acctattgac atacccggtg aagttaagaa catgatggaa ttggcagaaa tcgacaccat 1920
gattcccttt gacttaagtg caaaaaaaaa gaacaccatg gaaatgtata gggttcggtt 1980
aagtgacaaa ccacatacag acgatcccat actctgcctg tcactctctc cagcttcaga 2040
tcctaggttg tcacatacta tgcttggaga aatcctaaat tactacacac actgggcagg 2100
atccctgaag ttcacgtttc tgttctgtgg atccatgatg gcaactggca aactgttggt 2160
gtcatacgcg cctcctggag ccgacccacc aaagaagcgt aaggaggcga tgttgggaac 2220
acatgtgatc tgggacatag gactgcagtc ctcatgtact atggtagtgc catggattag 2280
caacaccacg tatcggcaaa ccatagatga tagtttcacc gaaggcggat acatcagcgt 2340
cttctaccaa accagaatag tcgtccctct ttcgacaccc agagagatgg acatccttgg 2400
ttttgtgtca gcgtgtaatg acttcagcgt gcgcttgatg cgagatacca cacatataga 2460
gcaaaaagcg ctagcacagg ggttaggtca gatgcttgaa agcatgattg acaacacagt 2520
ccgtgaaacg gtgggggcgg caacgtctag agacgctctc ccaaacactg aagccagtgg 2580
accagcacac tccaaggaaa ttccggcact caccgcagtg gaaactgggg ccacaaatcc 2640
actagtccct tctgatacag tgcaaaccag acatgttgta caacataggt caaggtcaga 2700
gtctagcata gagtctttct tcgcgcgggg tgcatgcgtg gccattataa ccgtggataa 2760
ctcagcttcc accaagaata aggataagct atttacagtg tggaagatca cttataaaga 2820
tactgtccag ttacggagga aattggagtt cttcacctat tctagatttg atatggaatt 2880
tacctttgtg gttactgcaa atttcactga gactaacaat gggcatgcct taaatcaagt 2940
gtaccaaatt atgtacgtac caccaggcgc tccagtgccc gagaaatggg acgactacac 3000
atggcaaacc tcatcaaatc catcaatctt ttacacctac ggaacagctc cagcccggat 3060
ctcggtaccg tatgttggta tttcgaacgc ctattcacac ttttacgacg gtttttccaa 3120
agtaccactg aaggaccagt cggcagcact aggtgactcc ctctatggtg cagcatctct 3180
aaatgacttc ggtattttgg ctgttagagt agtcaatgat cacaacccga ccaaggtcac 3240
ctccaaaatc agagtgtatc taaaacccaa acacatcaga gtctggtgcc cgcgtccacc 3300
gagggcagtg gcgtactacg gccctggagt ggattacaag gatggtacgc ttacacccct 3360
ctccaccaag gatctgacca catatggatt cggacaccaa aacaaagcgg tgtacactgc 3420
aggttacaaa atttgcaact accatttggc cactcaggaa gatttgcaaa acgcagtgaa 3480
cgtcatgtgg aatagagacc tcttagtcac agaatcaaga gcccagggca ccgattcaat 3540
cgcaaggtgc aattgcaacg caggggtgta ctactgcgag tctagaagga aatactaccc 3600
agtatccttc gttggcccaa cgttccagta catggaggct aataactatt acccagctag 3660
gtaccagtcc catatgctca ttggccatgg attcgcatct ccaggggatt gtggtggcat 3720
actcagatgt caccacgggg tgatagggat cattactgct ggtggagaag ggttggttgc 3780
atttacagac attagagact tgtatgccta cgaagaagaa gccatggaac aaggcatcac 3840
caattacata gagtcacttg gggccgcatt tggaagtgga tttactcagc agattggaga 3900
caaaataaca gagttgacta atatggtgac cagtaccatc actgaaaagc tacttaagaa 3960
cttgatcaag atcatatcct cactagttat tataactagg aattatgaag acaccacaac 4020
agtgctcgct accctggccc ttcttgggtg tgatgcttca ccatggcagt ggcttagaaa 4080
gaaagcatgc gatgttctgg agatacctta tgtcaccaag caaggtgaca gttggttgaa 4140
gaagtttact gaagcatgca acgcagctaa gggactggag tgggtgtcaa acaaaatctc 4200
aaaattcatt gattggctca aggagaaaat tatcccacaa gctagagata agttggaatt 4260
tgtaacaaaa cttagacaac tagaaatgct ggaaaaccaa atctcaacta tacaccaatc 4320
atgccctagt caggaacacc aggaaattct attcaataat gtcagatggt tatccatcca 4380
gtctaagagg tttgcccctc tttacgcagt ggaagccaaa agaatacaga aactagagca 4440
taccattaac aactacatac agttcaagag caaacaccgt attgaaccag tatgtttgct 4500
agtacatggc agccccggaa caggtaaatc tgtagcaacc aacctgattg ctagagccat 4560
agctgaaaga gaaaacacgt ccacgtactc gctacccccg gatccatcac acttcgacgg 4620
atacaaacaa cagggagtgg tgattatgga cgacctgaat caaaacccag atggtgcgga 4680
catgaagctg ttctgtcaga tggtatcaac agtggagttt ataccaccca tggcatccct 4740
ggaggagaaa ggaatcctgt ttacttcaaa ttacgttcta gcatccacga actcaagcag 4800
aatttccccc cccactgtgg cacacagtga tgcattagcc aggcgctttg cgttcgacat 4860
ggacattcag gtcatgaatg agtattctag agatgggaaa ttgaacatgg ccatggctac 4920
tgaaatgtgt aagaactgtc accaaccagc aaactttaag agatgctgtc ctttagtgtg 4980
tggtaaggca attcaattaa tggacaaatc ttccagagtt agatacagta ttgaccagat 5040
cactacaatg attatcaatg agagaaacag aagatccaac attggcaatt gtatggaggc 5100
tttgttccaa ggaccactcc agtataaaga cttgaagatt gacatcaaga cgagtccccc 5160
tcctgaatgt atcaatgact tgctccaagc agttgactcc caggaggtga gagattactg 5220
tgagaagaag ggttggatag tcaacatcac cagccaggtt caaacagaaa ggaacatcaa 5280
cagggcaatg acaattctac aagcggtgac aaccttcgcc gcagtggctg gagttgtcta 5340
tgtcatgtat aaactgtttg ctggacacca gggagcatac actggtttac caaacaaaaa 5400
acccaacgtg cccaccatta ggacagcaaa ggtacaaggg ccagggttcg attacgcagt 5460
ggctatggct aaaagaaaca ttgttacagc aactactagc aagggagagt tcactatgtt 5520
aggagtccac gacaacgtgg ctattttacc aacccacgct tcacctggtg aaagcattgt 5580
gatcgatggc aaagaagtgg agatcttgga tgccaaagcg ctcgaagatc aagcaggaac 5640
caatcttgaa atcactataa tcactctaaa gagaaatgaa aagttcagag acattagacc 5700
acatatacct actcaaatca ctgagacaaa tgatggagtc ttgatcgtga acactagcaa 5760
gtaccccaat atgtatgttc ctgtcggtgc tgtgactgaa cagggatatc taaatctcgg 5820
tgggcgccaa actgctcgta ctctaatgta caactttcca accagagcag gacagtgtgg 5880
tggagtcatc acatgtactg ggaaagtcat cgggatgcat gttggtggga acggttcaca 5940
cgggtttgca gcggccctga agcgatcata cttcactcag agtcaaggtg aaatccagtg 6000
gatgagacct tcgaaggaag tgggatatcc aatcataaat gccccgtcca aaaccaagct 6060
tgaacccagt gctttccact atgtgtttga aggggtgaag gaaccagcag tcctcactaa 6120
aaacgatccc aggcttaaga caaactttga ggaggcaatt ttctccaagt acgtgggtaa 6180
caaaattact gaagtggatg agcacatgaa agaggcagta gaccactatg ctggccagct 6240
catgtcacta gacatcaaca cagaacaaat gtgcttggag gatgccatgt atggcactga 6300
tggtctagaa gcacttgatt tgtccaccag tgctggctac ccttatgtag caatgggaaa 6360
gaagaagaga gatatcttga acaaacaaac cagagacact aaggaaatgc aaaaactgct 6420
cgacacatat ggaatcaacc tcccactggt gacttatgta aaggatgaac ttagatccaa 6480
aacaaaggtt gagcagggga aatccagatt aattgaagct tctagtttga atgactcagt 6540
ggcaatgaga atggcttttg ggaacctata tgctgctttt cacaaaaacc caggagtgat 6600
aacaggttca gcagtagggt gcgatccaga tttgttttgg agcaaaattc cggtattgat 6660
ggaagagaag ctgtttgcct ttgactacac agggtatgat gcatctctca gccctgcttg 6720
gttcgaggca ctaaagatgg tgcttgagaa aatcggattc ggagacagag ttgactacat 6780
cgactaccta aaccactcac accacctgta caagaataaa acatactgtg tcaagggcgg 6840
tatgccatct ggttgctcag gcacttcaat ttttaactca atgattaaca acttgattat 6900
caggacactc ttactgaaaa cctacaaggg catagattta gaccacctaa aaatgattgc 6960
ctatggtgat gatgtaattg cttcctaccc ccatgaagtt gacgctagtc tcctagccca 7020
atcaggaaaa gactatggac taactatgac tccagctgac aaatcagcta tatttgaaac 7080
agtcacatgg gagaatgtaa cattcttgaa gagattcttc agggcagacg agaaataccc 7140
atttcttatt catccagtaa tgccaatgaa ggaaattcat gaatcaatta gatggacaaa 7200
agatcctagg aacactcagg atcacgttcg ctctctgtgc ctattagctt ggcacaatgg 7260
cgaagaagaa tataacaaat tcctagctaa aatcaggagt gtgccaattg gaagagcttt 7320
attgctccca gagtactcaa cattgtaccg ccgttggctt gactcatttt agtaacccta 7380
cctcagtcga attggattgg gtcatactgc tgtaggggta aatttttctt taattcggag 7440
gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 7462
<210> 10
<211> 7468
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎病毒
<400> 10
ttaaaacagc tctggggttg tacccacccc agaggcccac gtggcggcta gcactccggt 60
attacggtac ccttgtgcgc ctgttttata ctcccctccc gcaacttaga agcacgaaac 120
caagttcaat agaagggggt acaaaccagt accactacga acaagcactt ctgtttcccc 180
ggtgacattg catagactgc tcacgcggtt gaaagtgatc gatccgttac ccgcttgtgt 240
acttcgaaaa gcctagtatc gccttggaat cttcgacgcg ttgcgctcag cacccgaccc 300
cggggtgtag cttaggctga tgagtctgga cattcctcac cggtgacggt ggtccaggct 360
gcgttggcgg cctacctatg gctaacgcca taggacgtta gatgtgaaca aggtgtgaag 420
agcctattga gctacataag agtcctccgg cccctgaatg cggctaatcc taaccacgga 480
acaggcggtc gcgaaccagt gactggcttg tcgtaacgcg caagtctgtg gcggaaccga 540
ctactttggg tgtccgtgtt tcctgttatt tttatcatgg ctgcttatgg tgacaatcag 600
agattgttat cataaagcga attggattgg ccatccggtg agtgttgtgt caggtataca 660
actgtttgtt ggaaccactg tgttagcttt acttctcatt taaccaatta atcaaaaaca 720
atacgaggat aaaacaacaa tactacaatg ggcgcccaag tttcatcaca gaaagttgga 780
gcccacgaaa attcaaacag agcctatggc gggtccacca tcaattacac tacaatcaat 840
tactataggg actctgcaag caatgcagca agcaagcaag attttgcaca agatccgtcc 900
aagttcaccg aacccattaa ggacgtcctt attaagaccg ctcccatgct aaactcccca 960
aacattgagg cgtgtggtta tagtgacagg gtaatgcagc taactctggg caattcaacg 1020
atcaccaccc aagaagcggc caattctgtt gttgcctacg gtagatggcc tgaatacatc 1080
agagataccg aggcaaatcc tgtagaccaa ccaaccgagc ccgatgtagc cgcgtgcagg 1140
ttctacacat tagataccgt cacttggcgc aaggagtcca gagggtggtg gtggaaacta 1200
ccagacgctt taaaagacat ggggttattt ggtcaaaaca tgttttatca ctatcttggg 1260
agggctggct acacagtgca cgtacagtgc aatgcttcaa agtttcatca aggagctcta 1320
ggggtgtttg cagttccaga aatgtgttta gctggtgata gcacaactca catgttcaca 1380
aagtacgaga atgcgaatcc aggcgaaaaa ggaggtgaat tcaaagggag tttcaccctt 1440
gataccaacg ccactaaccc tgcacggaac ttctgcccag ttgattacct cttcgggagt 1500
ggagtgctgg tagggaatgc atttgtttat ccacatcaaa taataaacct gcgcactaac 1560
aactgtgcta cgctagtatt gccctatgta aactcactct caatagatag catgacaaag 1620
cacaacaact gggggatcgc tatcctcccc ctggcgccac tagactttgc cactgaatct 1680
tccactgaga tacccattac actgaccatt gctcccatgt gctgcgaatt caatggttta 1740
cgcaacatca ctgtgccaag aacccaagga ttaccagtcc tgaacactcc agggagtaac 1800
cagtacctga ccgcagacaa ttaccagtct ccgtgtgcga tacctgagtt tgatgtcact 1860
ccacccatag acataccagg ggaggtgcgc aacatgatgg aattggcgga aatagacacc 1920
atgatacccc tcaacttgac aagtcaacgc aagaacacaa tggacatgta tagagtcgag 1980
ttgagcgaca cggctcactc tgacacgccg atcttgtgtc tctcgttgtc ccccgcttca 2040
gaccccagat tggcacacac tatgttgggt gagatattaa attactacac acactgggca 2100
gggtccttga aatttacctt tctcttttgc ggctcaatga tggccaccgg aaagttattg 2160
gtttcttacg caccacccgg agcagaggcc cccaagagtc gcaaagaagc aatgcttggg 2220
acacatgtga tatgggacat tgggttgcag tcttcatgca ctatggtggt accttggatc 2280
agtaatacca catacagaca aaccatcaac gatagtttca cagaaggtgg ctacattagc 2340
atgttctatc aaactagggt tgttgtcccg ttgtccacac ccagaaagat ggacatcctg 2400
ggttttgtgt cagcttgcaa tgacttcagt gtgcgcttac tgcgagatac aacacacatt 2460
agtcaagagg ctatgccaca aggaattggt gacatgattg agggggccgt tgaagggatt 2520
actaaaaatg cattggttcc cccgacttcc accaatagcc tgcctgacac aaagccgagc 2580
ggtccagccc actccaagga gatacctgca ttgacagccg tggagacagg ggctaccaat 2640
ccgttggtgc cttcggacac cgtgcaaacg cgccatgtca tccagagacg aacgcgatca 2700
gagtccacgg ttgagtcatt ctttgcaaga ggggcttgcg tggctatcat tgaggtggac 2760
aatgatgcac cgacaaagcg cgccagcaga ttgttttcgg tttggaaaat aacttacaaa 2820
gatactgttc aactgagacg caaactggaa tttttcacat attcgagatt tgacatggag 2880
ttcacttttg tggtcacctc aaactacatt gatgcaaata acggacatgc attgaaccaa 2940
gtttatcaga taatgtatat accacccgga gcacctatcc ctggtaaatg gaatgactat 3000
acgtggcaga cgtcctctaa cccgtcggtg ttttacacct atggggcgcc cccagcaaga 3060
atatcagtgc cctacgtggg aattgctaat gcgtattccc acttttatga tgggtttgca 3120
aaagtaccac tagcgggtca agcctcaact gaaggcgatt cgttgtacgg tgctgcctca 3180
ctgaatgatt ttggatcact ggctgttcgc gtggtaaatg atcacaaccc cacgcggctc 3240
acctccaaga tcagagtgta catgaagcca aagcatgtca gagtctggtg cccacgacct 3300
ccacgagcag tcccatactt cggaccaggt gttgattata aagatgggct caccccacta 3360
ccagaaaagg gattaacgac ttatggattt ggacaccaaa acaaagctgt gtacacagct 3420
ggctacaaaa tttgcaatta ccacctagct acacaagaag acttgcaaaa tgccgtgagt 3480
gtcatgtgga acagagacct cttagtggct gaatcaaggg cccttggcac cgactcgatc 3540
gcaaggtgca gctgtaacac gggtgtgtac tactgtgaat ccaggagaaa atattatcca 3600
gtttctttca ttgggcccac cttccaatac atggaagcca atgaatatta cccggctaga 3660
tatcaatcac acatgcttat tggtcatggg tttgcatcac cgggtgattg tggtggcata 3720
cttagatgtc aacacggggt gataggaata atcactgctg gtggggaagg cttggttgca 3780
ttttcagaca ttagagacct gtatgcttat gaggaggaag ctatggagca gggcatttcc 3840
aactatattg agtcacttgg tgctgcattt ggtagtggat tcactcaaca aattggtgat 3900
aaagtttccg agctaaccag catggtaact agcaccatta cagagaagtt gcttaaaaac 3960
ttaatcaaaa ttatctcatc acttgtgatc attaccagga attatgagga cactaccaca 4020
gtgcttgcca ccctcgccct ccttgggtgc gacatctcac cgtggcagtg gctaaagaag 4080
aaggcatgtg acatcctgga aattccatac gccatcaaac aaggagatag ttggttgaag 4140
aaattcactg aggcatgtaa tgctgcaaag ggactggagt gggtgtccaa taagatatcc 4200
aaattcatta gttggttgca ggataaaatc atcccacaag cgagagacaa attagagttt 4260
gtcactaaac taaagcaatt agaaatgctt gaaaatcaga tttccaccat acaccaatct 4320
tgtccaagtc aagaacatca ggagatctta ttcaacaatg tgcggtggct atctatccag 4380
tccaagaggt ttgcaccact atatgcacat gaagctaaaa ggattcaaaa gctggagcat 4440
accataaata attacgtaca gttcaagagc aagcaccgta ttgagccagt atgtttgtta 4500
gtacatggca gtccagggac aggaaaatca gttgcaacca atctaattgc tagagcaata 4560
gccgagaaag agaacacctc cacatactca ctgccacctg atccgtctca ctttgatggc 4620
tacaagcaac agggtgtggt tattatggat gacctaaacc aaaatccaga cggagcagac 4680
atgaaacttt tttgtcaaat ggtgtccact gtggagttta ttccaccgat ggcctcgcta 4740
gaagagaaag gcattttgtt cacatctaat tacgttttag cctccaccaa ctccagtcgg 4800
atcacaccac ccacggtggc tcacagtgat gcgctggcca ggagattcgc atttgacgtg 4860
gacatacaag tcatgagcga gtactccaga gacggaaagc tcaacatggc aatggctact 4920
gaaatgtgca aaaactgtca tcaaccagca aacttcaaaa gatgttgtcc tttagtgtgt 4980
ggcaaggcaa ttcagttaat ggataaatct tccagggtta gatacagcat tgatcagatc 5040
actacaatga ttgttaatga gagaaacaga agatcaaaca ttggtaattg catggaagct 5100
ctattccagg gaccactgca gtataaagat ctaaaaatag atgttaagac cagtccccct 5160
ccggagtgta tcaacgattt gctccaggca gttgattccc aggaagtgag agattactgt 5220
gaaaagaaag gctggattgt taacattacc agtcaggttc aaacagagag gaacatcaac 5280
cgggcgatga ctatcctaca agcagtaact actttcgctg cagtagccgg tgtcgtgtac 5340
gttatgtaca agctgttcgc tgggcaccag ggtgcataca ctggtttgcc aaataaacga 5400
cccaatgtac ccactatcag gacagcaaaa gtgcaaggcc ctgggtttga ttacgcagtg 5460
gccatggcta aaagaaacat tgttacagca accaccagca aaggggagtt tacgatgttg 5520
ggagtctatg ataatgtggc catcttgcca acccacgcct cacctggtga aagcattgcg 5580
atcgacggta aagaggtgga aattcttgac gccaaagccc ttgaagatca ggcaggaact 5640
aatcttgaaa ttaccataat tacactaaag aggaacgaga agttcagaga tatcaggcca 5700
cacattccca cccaaatcac cgaaacaaat gatggagttt tgatcgtgaa cactagtaag 5760
taccccaaca tgtatgttcc cgttggtgct gtgaccgaac aggggtatct taatctcggt 5820
ggacgacaaa ccgctcgtac gctaatgtac aactttccaa ctagagcagg tcagtgtggt 5880
ggtgtcatca cgtgcactgg taaagtcatt gggatgcatg ttggtgggaa cggttcacat 5940
gggttcgcgg cggccctaaa gcggtcatac ttcactcaga ttcaaggtga gattcaatgg 6000
atgaaaccat caaaagaagt gggatacccg atcataaatg ctccgtccaa aaccaaactt 6060
gaacccagcg cttttcacta tgtgtttgaa ggggtgaagg aaccagcagt ccttaccaaa 6120
aatgatccca ggctcaggac agactttgaa gaagcaatat tctctaagta tgtaggcaac 6180
aagatcactg atgtggatga gtacatgaaa gaggcagtgg atcattacgc tggccaactc 6240
atgtctctag acatcaacac agaacaaatg tgcttggagg acgccatgta cggcaccgat 6300
ggcctggaag cacttgactt gaccactagt gctggatacc cttatgtagc aatgggaaag 6360
aaaaagagag acatcttgaa taagcagact agagacacca aggaaatgcg gagactctta 6420
gatacttatg gaattaactt accgcttgta acatatgtta aagatgaact aaggtcaaaa 6480
actaaggtgg agcagggaaa atccagattg attgaagcct ccagtttgaa tgattcagtg 6540
gccatgagaa tggcatttgg aaatctctat gcagcatttc acaaaaaccc aggagttgtc 6600
actggcagtg cagttggttg tgatccagat ctattttgga gcaagatccc agtgctaatg 6660
gaagagaagc tctttgcttt tgactacaca ggttatgatg catcactcag cccggcctgg 6720
tttgaggcac tcaaaatggt gctagagaaa atcggatttg gggacagggt ggattatatt 6780
gattacctca accattccca ccacctgtac aaaaacaaaa cttattgcgt aaaaggcggc 6840
atgccatctg gctgctcagg cacatcaatt tttaactcaa tgattaacaa cttaatcatt 6900
aggacactcc tactgaaaac ctacaagggc atagatttag atcacctaaa gatgattgcc 6960
tatggtgatg atgtaattgc ttcctacccc catgaggttg atgctagtct cctagcccaa 7020
tcaggaaaag actatggact aaccatgact ccagcagaca agtcagctac ctttgaaaca 7080
gtcacatggg agaatgtaac attcttgaaa agattcttta gagcggatga gaagtatccc 7140
ttcctcatac atccagtaat gccaatgaag gagattcatg aatcaattag atggacaaag 7200
gatcccagaa acacacagga tcacgtgcgc tcattgtgcc tattggcctg gcacaacggc 7260
gaagaagaat acaacaagtt cttagctaaa atcaggagtg tgccaattgg gagagcttta 7320
ttgctcccag agtactctac attgtaccgc cgttggctcg actcttttta gtaaccctac 7380
ctcagtcgaa ttggattggg tcatgctgtt gtaggggtaa atttttcttt aattcgggga 7440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 7468

Claims (16)

1.一种重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒株，它可以在30°C下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖，包括来自Mahoney、MEF-1或Saukett株的衣壳，其中与Brunenders株的SEQ ID NO:1的基因组相比，所述重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组仅存在以下位置的突变：在5’UTR中的133 (A至G)、142 (U至C)、163 (A至G)、597 (C至U)和609 (G至A)；和在非结构蛋白中的3486 (G至A)、3852 (A至U)、4120 (U至C)、4428(A至G)、4563 (A至U)、5436 (G至A)、6210 (A至G)、6848 (G至A)和7102 (U至C)，其中所述基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖是指与理论输入/接种相比，病毒的感染单位的数量增加不超过10%，或者与理论输入/接种相比，通过定量反转录PCR所测量的病毒RNA没有可测量的增加，或者通过光学显微镜观察到的感染的视觉迹象的缺乏或通过电子显微镜的感染的视觉迹象的缺乏。
2.一种重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒1型株，它可以在30°C下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖，其中与Mahoney株的SEQ ID NO:6的基因组相比，所述重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组仅存在以下位置的突变：在5’UTR中的131 (A至G)、140 (U至C)、161 (A至G)、593 (C至U)和605 (G至A)；和在非结构蛋白中的3482 (G至A)、3848 (A至U)、4116 (U至C)、4424 (A至G)、4559 (A至U)、5432 (G至A)、6206(A至G)、6844 (G至A)和7098 (U至C)，其中所述基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖是指与理论输入/接种相比，病毒的感染单位的数量增加不超过10%，或者与理论输入/接种相比，通过定量反转录PCR所测量的病毒RNA没有可测量的增加，或者通过光学显微镜观察到的感染的视觉迹象的缺乏或通过电子显微镜的感染的视觉迹象的缺乏。
3.一种重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒2型株，它可以在30°C下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖，其中与MEF-1株的SEQ ID NO:5的基因组相比，所述重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组仅存在以下位置的突变：在5’UTR中的134(A至G)、143 (U至C)、164 (A至G)、598 (C至U)和610 (G至A)；和在非结构蛋白中的3847 (A至U)、4115 (U至C)、4423 (A至G)、4558 (A至U)、5431 (G至A)、6205 (A至G)、6843 (G至A)和7097 (U至C)，其中所述基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖是指与理论输入/接种相比，病毒的感染单位的数量增加不超过10%，或者与理论输入/接种相比，通过定量反转录PCR所测量的病毒RNA没有可测量的增加，或者通过光学显微镜观察到的感染的视觉迹象的缺乏或通过电子显微镜的感染的视觉迹象的缺乏。
4.一种重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒3型株，它可以在30°C下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖，其中与Saukett株的SEQ ID NO:7的基因组相比，所述重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组仅存在以下位置的突变：在5’UTR中的133 (A至G)、142 (U至C)、163 (A至G)、596 (C至U)和608 (G至A)；和在非结构蛋白中的3839 (A至U)、4107 (U至C)、4415 (A至G)、4550 (A至U)、5423 (G至A)、6197 (A至G)、6835(G至A)和7089 (U至C)，其中所述基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖是指与理论输入/接种相比，病毒的感染单位的数量增加不超过10%，或者与理论输入/接种相比，通过定量反转录PCR所测量的病毒RNA没有可测量的增加，或者通过光学显微镜观察到的感染的视觉迹象的缺乏或通过电子显微镜的感染的视觉迹象的缺乏。
5.一种重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒1型株，它可以在30°C下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖，其中与Sabin 1株的SEQ ID NO:9的基因组相比，所述重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组仅存在以下位置的突变：在5’UTR中的131 (A至G)、140 (U至C)、161 (A至G)、593 (C至U)和605 (G至A)；和在非结构蛋白中的3482 (G至A)、3848 (A至U)、4424 (A至G)、4559 (A至U)、5432 (G至A)、6206 (A至G)、6844(G至A)和7098 (U至C)，其中所述基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖是指与理论输入/接种相比，病毒的感染单位的数量增加不超过10%，或者与理论输入/接种相比，通过定量反转录PCR所测量的病毒RNA没有可测量的增加，或者通过光学显微镜观察到的感染的视觉迹象的缺乏或通过电子显微镜的感染的视觉迹象的缺乏。
6.一种重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒2型株，它可以在30°C下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖，其中与Sabin 2株的SEQ ID NO: 10的基因组相比，所述重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组仅存在以下位置的突变：在5’UTR中的131 (A至G)、140 (U至C)、161 (A至G)、594 (C至U)和606 (G至A)；和在非结构蛋白中的3481 (G至A)、3847 (A至U)、4115 (U至C)、4423 (A至G)、4558 (A至U)、5431 (G至A)、6205(A至G)、6843 (G至A)和7097 (U至C)，其中所述基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖是指与理论输入/接种相比，病毒的感染单位的数量增加不超过10%，或者与理论输入/接种相比，通过定量反转录PCR所测量的病毒RNA没有可测量的增加，或者通过光学显微镜观察到的感染的视觉迹象的缺乏或通过电子显微镜的感染的视觉迹象的缺乏。
7.一种重组减毒温度敏感脊髓灰质炎病毒3型株，它可以在30°C下在细胞培养物中增殖并且基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖，其中与Sabin 3株的SEQ ID NO: 8的基因组相比，所述重组减毒脊髓灰质炎病毒株的基因组仅存在以下位置的突变：在5’UTR中的133 (A至G)、142 (U至C)、596 (C至U)和608 (G至A)；和在非结构蛋白中的3839 (A至U)、4107 (U至C)、4415 (A至G)、4550 (A至U)、5423 (G至A)、6197 (A至G)、6835 (G至A)和7089(U至C)，其中所述基本上不能在37°C下在细胞培养物中增殖是指与理论输入/接种相比，病毒的感染单位的数量增加不超过10%，或者与理论输入/接种相比，通过定量反转录PCR所测量的病毒RNA没有可测量的增加，或者通过光学显微镜观察到的感染的视觉迹象的缺乏或通过电子显微镜的感染的视觉迹象的缺乏。
8.一种组合物，包括根据权利要求中1-7中任一项所述的脊髓灰质炎病毒株和药学上可接受的载体。
9.一种组合物，包括根据权利要求1-7中任一项所述的脊髓灰质炎病毒株和赋形剂。
10.一种灭活脊髓灰质炎病毒疫苗组合物，包括根据权利要求8或9所述的组合物，其中该组合物中的脊髓灰质炎病毒株被灭活。
11.一种组合疫苗组合物，包括根据权利要求10所述的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗组合物，并且进一步包括来自白喉、破伤风、百日咳、b型流感嗜血杆菌或乙型肝炎病毒中的一种或多种抗原。
12.如权利要求10或11所述的疫苗组合物在制备药物中的用途。
13.一种重组核酸分子，包括编码根据权利要求1-7中任一项所述的脊髓灰质炎病毒株的基因组或所述基因组的互补序列。
14.一种用于制备包括根据权利要求1-7中任一项所述的脊髓灰质炎病毒株的制剂的方法，该方法包括：
a)用根据权利要求1-7中任一项所述的脊髓灰质炎病毒株感染细胞培养物中的细胞，
b)在该细胞培养物中培养这些细胞以增殖该脊髓灰质炎病毒株，并且
c)从这些细胞或从该细胞培养物中分离该脊髓灰质炎病毒株以获得包括该脊髓灰质炎病毒株的制剂。
15.根据权利要求14所述的方法，进一步包括灭活该脊髓灰质炎病毒株。
16.一种用于制备灭活脊髓灰质炎病毒疫苗的方法，该方法包括根据权利要求15所述的方法，并将灭活脊髓灰质炎病毒株配制成药物组合物。
CN201580032103.9A 2014-06-17 2015-06-16 冷适应病毒减毒(cava)和新颖减毒脊髓灰质炎病毒株 Active CN106459929B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462013379P 2014-06-17 2014-06-17
US62/013,379 2014-06-17
EP14176071 2014-07-08
EP14176071.0 2014-07-08
PCT/EP2015/063489 WO2015193324A1 (en) 2014-06-17 2015-06-16 Cold-adapted-viral-attenuation (cava) and novel attenuated poliovirus strains

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106459929A CN106459929A (zh) 2017-02-22
CN106459929B true CN106459929B (zh) 2021-10-15

Family

ID=51136381

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580032103.9A Active CN106459929B (zh) 2014-06-17 2015-06-16 冷适应病毒减毒(cava)和新颖减毒脊髓灰质炎病毒株

Country Status (11)

Country Link
US (1) US10238730B2 (zh)
EP (1) EP3157556B1 (zh)
JP (1) JP6591461B2 (zh)
KR (1) KR102423993B1 (zh)
CN (1) CN106459929B (zh)
AU (1) AU2015276235B2 (zh)
BR (1) BR112016028936A2 (zh)
CA (1) CA2951351C (zh)
EA (1) EA039012B1 (zh)
SG (2) SG10201810846WA (zh)
WO (1) WO2015193324A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3157556B1 (en) 2014-06-17 2019-10-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Cold-adapted-viral-attenuation (cava) and novel attenuated poliovirus strains
CN109414023A (zh) * 2016-06-29 2019-03-01 杜克大学 用嵌合脊髓灰质炎病毒激活抗原呈递细胞的组合物和方法
GB201700825D0 (en) 2017-01-17 2017-03-01 Sec Dep For Health Poliovaccine
US20210128713A1 (en) * 2018-03-30 2021-05-06 Biological Mimetics, Inc. Irradiation-inactivated poliovirus, compositions including the same, and methods of preparation
CN110812366B (zh) * 2019-11-18 2023-11-17 珠海丽凡达生物技术有限公司 一种可用于激素补充的mRNA药物及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3125489A (en) * 1964-03-17 Suckling rodent and chick embryo at-
CN103391788A (zh) * 2010-12-29 2013-11-13 卫生署秘书局 灭活的脊髓灰质炎疫苗

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4525349A (en) 1981-12-29 1985-06-25 Societe Anonyme Dite: Institut Merueux Process for the large-scale production of a vaccine against poliomyelitis and the resulting vaccine
US20080193478A1 (en) 2004-08-27 2008-08-14 Rajesh Jain Inactivated Poliomyelitis Vaccine Derived From Sabin Strain Of Polio Virus
GB0615933D0 (en) * 2006-08-10 2006-09-20 Nat Inst Biological Standards & Control Attenuated polioviruses
WO2011006823A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Crucell Holland B.V. Production of polio virus at high titers for vaccine production
EP3157556B1 (en) 2014-06-17 2019-10-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Cold-adapted-viral-attenuation (cava) and novel attenuated poliovirus strains

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3125489A (en) * 1964-03-17 Suckling rodent and chick embryo at-
CN103391788A (zh) * 2010-12-29 2013-11-13 卫生署秘书局 灭活的脊髓灰质炎疫苗

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cold-Adapted Genetic Variants of Polio Viruses;Dubes G R等;《Science》;19560928;第124卷(第3222期);第586页第3栏最后一段、第587页第2栏第1段、第3栏第3段、图1 *
Dubes G R等.Cold-Adapted Genetic Variants of Polio Viruses.《Science》.1956,第124卷(第3222期),第586-588页. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6591461B2 (ja) 2019-10-16
EA201692468A1 (ru) 2017-05-31
EA039012B1 (ru) 2021-11-22
US20170087240A1 (en) 2017-03-30
JP2017519506A (ja) 2017-07-20
US10238730B2 (en) 2019-03-26
AU2015276235B2 (en) 2021-02-18
WO2015193324A1 (en) 2015-12-23
CA2951351C (en) 2023-03-14
KR102423993B1 (ko) 2022-07-22
CN106459929A (zh) 2017-02-22
AU2015276235A1 (en) 2016-12-08
BR112016028936A2 (pt) 2017-10-31
KR20170012566A (ko) 2017-02-02
SG11201610366UA (en) 2017-01-27
SG10201810846WA (en) 2019-01-30
EP3157556B1 (en) 2019-10-23
CA2951351A1 (en) 2015-12-23
EP3157556A1 (en) 2017-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Konopka-Anstadt et al. Development of a new oral poliovirus vaccine for the eradication end game using codon deoptimization
McMinn Recent advances in the molecular epidemiology and control of human enterovirus 71 infection
Georgescu et al. Evolution of the Sabin type 1 poliovirus in humans: characterization of strains isolated from patients with vaccine-associated paralytic poliomyelitis
CN106459929B (zh) 冷适应病毒减毒(cava)和新颖减毒脊髓灰质炎病毒株
Tatem et al. A mutation present in the amino terminus of Sabin 3 poliovirus VP1 protein is attenuating
Sanders et al. Cold-adapted viral attenuation (CAVA): highly temperature sensitive polioviruses as novel vaccine strains for a next generation inactivated poliovirus vaccine
Blomqvist et al. Recurrent isolation of poliovirus 3 strains with chimeric capsid protein Vp1 suggests a recombination hot-spot site in Vp1
DK2658571T3 (en) Inactivated polio vaccine
EP0496875B1 (en) METHODS FOR PRODUCING RNA VIRUSES FROM cDNA
Yang et al. Development of a full-length cDNA-derived enterovirus A71 vaccine candidate using reverse genetics technology
JP2020513840A (ja) ポリオワクチン
Sanders et al. Brunenders: a partially attenuated historic poliovirus type I vaccine strain
CN108055827B (zh) 高成长肠病毒71型病毒株及其疫苗
EP3149158B1 (en) Live attenuated african horsesickness virus
Sanders et al. Synthetic virus seeds for improved vaccine safety: Genetic reconstruction of poliovirus seeds for a PER. C6® cell based inactivated poliovirus vaccine
Alirezaie et al. Phenotypic and genomic analysis of serotype 3 sabin poliovirus vaccine produced in MRC‐5 Cell substrate
Andino et al. Developing genetically stable live-attenuated vaccine candidates against type 1 and 3 poliovirus
JP7420339B2 (ja) 変異ノロウイルス粒子とその生産方法
CN110430895B (zh) 脊髓灰质炎疫苗
WO2017090762A1 (ja) デングウイルス弱毒株をバンク化した生ウイルス、及びそれらを抗原とするデングワクチン
Yee Rational design of live attenuated vaccine by site-directed mutagenesis and deletion in the 5’-non coding region of the enterovirus 71 (EV-A71) genome
JP2006121948A (ja) 組換えウイルス

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant