CN109414023A - 用嵌合脊髓灰质炎病毒激活抗原呈递细胞的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
嵌合脊髓灰质炎病毒能够活化抗原呈递细胞。该抗原呈递细胞的活化可以在体外、离体或体内。活化抗原呈递细胞可以单独施用或与抗原或疫苗一起施用。可以在体外或离体用抗原负载该活化抗原，以形成抗原负载的活化抗原呈递细胞。这些可以在治疗上施用。抗原呈递细胞的治疗性施用可以用作其他疗法的佐剂。
Description
交叉引用
本申请要求2016年6月29日提交的序列号为62/356,012的美国专利申请的权益，该专利申请的内容明确地并入本文。
技术领域
本发明涉及能够感染和激活抗原呈递细胞的减毒嵌合脊髓灰质炎病毒。更具体地，本发明涉及用于辅助免疫应答的治疗组合物和方法。
背景技术
抗原呈递细胞(APC)，例如树突细胞和巨噬细胞，在诱导先天免疫和适应性免疫中起重要作用。树突细胞是最有效的APC并且在适应性免疫应答中协调T细胞应答和B细胞应答。树突细胞的活化和成熟的刺激以及树突细胞的活化类型直接影响树突细胞抗原呈递功能，包括由活化的树突细胞诱导的免疫应答的耐久性和类型。目前，树突细胞疫苗涉及从血液中富集CD34+前体细胞，在体外用各种细胞因子组合(例如，TNFα和IL-3，GM-CSF，或GM-CSF和TNFα)培养细胞以形成未成熟的树突状细胞；用各种细胞因子混合物(例如IL-1β，TNFα，IL-6和PGE2；或IFNγ；或PGE2，TNFα和半乳糖神经酰胺)在体外培养未成熟树突细胞以产生成熟的树突细胞；用抗原在体外培养成熟的树突细胞，产生包含树突细胞疫苗的抗原负载的树突细胞。
本领域仍然需要活化树突细胞和其他抗原产生细胞的其他方法来产生诱导有效和持久的适应性免疫应答的疫苗。
发明内容
抗原呈递细胞，例如巨噬细胞和树突细胞，表达脊髓灰质炎病毒受体(称为PVR，或Necl-5，或CD155)，并且对1型脊髓灰质炎病毒株和Sabin 1疫苗株高度敏感。病毒在感染后数小时内发生最大细胞相关的病毒滴度。随后发生细胞死亡和裂解(例如，感染后24-36小时)。然而，嵌合脊髓灰质炎病毒，例如在其三叶草结构和开放阅读框之间的脊髓灰质炎病毒的5'非翻译区中插入的具有外源核苷酸序列(即，来自脊髓灰质炎病毒以外的来源)的脊髓灰质炎病毒株Sabin I型株，表现不同。令人惊讶的是，发现与野生型1型脊髓灰质炎病毒和对其感染的抗原呈递细胞致细胞病变的Sabin 1疫苗株不同，以PVSRIPO为例的嵌合脊髓灰质炎病毒感染并活化抗原呈递细胞(包括成熟)而没有细胞毒性。
提供了用于活化抗原呈递细胞的方法和组合物。
提供了使用活化的抗原呈递细胞诱导免疫应答的方法和组合物。
本发明的一个方面是包含体外或离体活化的抗原呈递细胞的组合物，其中活化的抗原呈递细胞包含嵌合脊髓灰质炎病毒。嵌合脊髓灰质炎病毒可任选地包含Sabin I型脊髓灰质炎病毒株，该脊髓灰质炎病毒在其三叶草结构和开放阅读框之间的5'非翻译区具有人鼻病毒2型内部核糖体进入位点。活化的抗原呈递细胞可能已被嵌合脊髓灰质炎病毒感染，或被衍生自嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA转导。
本发明的一个方面是体外或离体活化抗原呈递细胞的方法，包括向分离的抗原呈递细胞中引入嵌合脊髓灰质炎病毒。一方面，嵌合脊髓灰质炎病毒包含Sabin I型脊髓灰质炎病毒株，该脊髓灰质炎病毒在其三叶草结构和开放阅读框之间的5'非翻译区具有人鼻病毒2型内部核糖体进入位点。将嵌合脊髓灰质炎病毒引入抗原呈递细胞中可以通过用该嵌合脊髓灰质炎病毒作为病毒进行感染，或通过用来自嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA转导。细胞因子混合物中的抗原呈递细胞不需要成熟，因为在本领域中用于使抗原呈递细胞成熟的方法是先前已知的。
本发明的一个方面是包含活化的抗原呈递细胞和抗原的组合物或组合，其中活化的抗原呈递细胞包含含有嵌合脊髓灰质炎病毒的抗原呈递细胞。一方面，嵌合脊髓灰质炎病毒包含Sabin I型脊髓灰质炎病毒株，该脊髓灰质炎病毒在其三叶草结构和开放阅读框之间的5'非翻译区具有人鼻病毒2型内部核糖体进入位点。抗原可包含免疫原。嵌合脊髓灰质炎病毒可以包含感染性病毒，或者可以包含从嵌合脊髓灰质炎病毒中分离的RNA。
本发明的一个方面是用于皮肤递送的组合物，其包含抗原性或免疫原性试剂，和包含嵌合脊髓灰质炎病毒的佐剂。嵌合脊髓灰质炎病毒可包含Sabin I型脊髓灰质炎病毒株，该脊髓灰质炎病毒在其三叶草结构和开放阅读框之间的5'非翻译区具有人鼻病毒2型内部核糖体进入位点。该组合物可进一步包含药学上可接受的载体。皮肤递送可任选地包括积存注射，任选地使用药学上可接受的载体，其包括油、乳液、凝胶、半固体、粘性液体、聚合物、微粒等，从其中组合物逐渐被周围组织吸收。与不是积存注射的注射相比，这些载体可以延长抗原呈递细胞暴露于抗原性或免疫原性剂的时间。包含嵌合脊髓灰质炎病毒的佐剂能够感染抗原呈递细胞，并活化它们，使得在抗原存在下，产生针对抗原(包括携带抗原的生物体或细胞)的免疫应答。皮肤施用该组合物的方法可以接种接受者以抵抗抗原。
本发明的一个方面是在个体中引发对免疫原性组合物的免疫应答的方法。该方法包括将免疫原性组合物递送到个体皮肤的真皮隔室中。免疫原性组合物包含抗原和包含嵌合脊髓灰质炎病毒的佐剂。一方面，嵌合脊髓灰质炎病毒包含Sabin I型脊髓灰质炎病毒株，该脊髓灰质炎病毒在其三叶草结构和开放阅读框之间的5'非翻译区具有人鼻病毒2型内部核糖体进入位点。在一个方面，免疫原性组合物是疫苗。
本发明的一个方面是免疫原性组合物，其包含作为单独的组分，然后可以将它们配制在一起以产生免疫原性组合物，抗原和包含嵌合脊髓灰质炎病毒的佐剂。一方面，嵌合脊髓灰质炎病毒包含Sabin I型脊髓灰质炎病毒株，该脊髓灰质炎病毒在其三叶草结构和开放阅读框之间的5'非翻译区具有人鼻病毒2型内部核糖体进入位点。在一个方面，免疫原性组合物是疫苗组合物。分离的免疫原性组合物可以通过离体或体外组合其组分来生产。
本发明的一个方面是包含如本文所述的本发明的免疫原性组合物的试剂盒。在一些方面，本发明提供了试剂盒，其包含一个或多个装有一种或多种本发明组合物组分的容器，例如包含嵌合脊髓灰质炎病毒的抗原和/或佐剂。另一方面，试剂盒包含两个容器，一个容器含有抗原，另一个容器含有包含嵌合脊髓灰质炎病毒的佐剂。该试剂盒还可包含皮肤给药装置和皮肤疫苗制剂。试剂盒可以进一步包含一种或多种组分，以促进试剂盒内容物的重构、施用、递送或使用。
本发明的一个方面是活化和抗原负载抗原呈递细胞的方法。使抗原呈递细胞与抗原和嵌合脊髓灰质炎病毒接触。一方面，嵌合脊髓灰质炎病毒包含Sabin I型脊髓灰质炎病毒株，该脊髓灰质炎病毒在其三叶草结构和开放阅读框之间的5'非翻译区具有人鼻病毒2型内部核糖体进入位点。嵌合脊髓灰质炎病毒可包含感染性病毒(病毒颗粒)，或可包含衍生自嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA。可以将活化的和抗原负载的抗原呈递细胞施用于个体，作为在个体中诱导免疫应答的手段或作为治疗抗原相关的疾病的手段。
本发明的一个方面是治疗个体的方法，包括给个体施用有效量的免疫原性组合物。免疫原性组合物包含抗原和嵌合脊髓灰质炎病毒。一方面，嵌合脊髓灰质炎病毒包含Sabin I型脊髓灰质炎病毒株，该脊髓灰质炎病毒在其三叶草结构和开放阅读框之间的5'非翻译区具有人鼻病毒2型内部核糖体进入位点。嵌合脊髓灰质炎病毒可以包含感染性病毒，或者可以包含源自嵌合脊髓灰质炎病毒的脊髓灰质炎病毒RNA。在一个方面，免疫原性组合物的组分可以同时或依次施用。在一个方面，治疗包括疫苗接种。另一方面，免疫原性组合物包含疫苗组合物。
对于本文提供的方法和组合物，抗原可包含肿瘤抗原，或病原体抗原(例如，细菌抗原、寄生虫抗原、病毒抗原)或自身免疫疾病抗原。在一些实施方案中，病毒抗原不是脊髓灰质炎病毒抗原，而是其他非脊髓灰质炎病毒的抗原。
对于涉及个体治疗的方法和组合物，可以治疗个体以预防疾病或治疗疾病。该疾病可以是癌症、致病性感染、细菌感染、寄生虫感染、病毒感染或自身免疫疾病。通常该疾病不是脊髓灰质炎。
对于将包含抗原呈递细胞的组合物施用于个体的方法，抗原呈递细胞与个体相容或被处理为与个体相容。通常，细胞是自体的，但可以是同种异体的或以其他方式使其免疫学相容。
本发明的一个方面是在患有或怀疑患有肿瘤或具有发展肿瘤的高风险(例如，使用商业可获得的基因测试确定肿瘤的预测风险)的个体中引发、增强或诱导免疫应答的方法，该免疫应答包括抗肿瘤免疫应答。该方法包括向个体施用有效量的包含含有嵌合脊髓灰质炎病毒的抗原呈递细胞的组合物。在一个方面，嵌合脊髓灰质炎病毒包含Sabin I型脊髓灰质炎病毒株，该脊髓灰质炎病毒在其三叶草结构和开放阅读框之间的5'非翻译区具有人鼻病毒2型内部核糖体进入位点。抗原呈递细胞可以进一步包含负载肿瘤抗原(包括肿瘤相关抗原)的抗原呈递细胞。
根据以下描述，本发明的其他方面、目的和特征将显而易见。
附图说明
图1是嵌合脊髓灰质炎病毒的示意图，其包含Sabin I型脊髓灰质炎病毒株，其具有人鼻病毒2型内部核糖体进入位点(IRES)，其位于脊髓灰质炎病毒的三叶草结构(cloverleaf)和开放阅读框(ORF，实心黑线)之间的5'非翻译区域。
图2A是显示在指定的感染复数(MOI)下用嵌合脊髓灰质炎病毒感染后72小时内人肿瘤细胞系DM6(▲)和MDA-MB231(▼)和人树突细胞(“DC”；●,■)的裂解百分比的图。
图2B是显示在指定的感染复数(MOI)下用嵌合脊髓灰质炎病毒感染后72小时内人肿瘤细胞系DM6(▲)和MDA-MB231(▼)和人树突细胞(“DC”；■)的病毒产生(噬斑形成单位；pfu)的图。
图2C是人树突细胞的免疫印迹，其显示各种蛋白质(eIF4G、2BC、2C、MDA5、p-STAT1(Y701)、STAT1、IFIT1、ISG15、TAP1、CD40、PD-L1和微管蛋白)在用嵌合脊髓灰质炎病毒感染后8、24、48和72小时的表达。
图3A是人树突细胞裂解物的免疫印迹，其显示无处理(M)、使用嵌合脊髓灰质炎病毒(PV，MOI＝10)、LPS(100ng/ml)或聚肌胞苷酸(pIC，10μg/ml)、或成熟细胞因子混合物(CC，TNF-α，10ng/ml；IL-1β，10ng/ml；IL-6，1000U/ml；以及PGE2，1μg/ml)处理后的8、24、48、72、86和120小时的各种蛋白质(p-STAT1(Y701)、STAT1、IFIT1、TAP1和微管蛋白)的表达。
图3B是显示在无处理(M,●)或使用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVRIPO,★)、LPS(▲)或聚肌胞苷酸(pIC，■)处理后的8、24、48、72、86和120小时通过ELISA测量的人树突细胞分泌的IFN-β的浓度的图。
图3C是显示在无处理(M,●)或使用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVRIPO,★)、LPS(▲)或聚肌胞苷酸(pIC，■)处理后的8、24、48、72、86和120小时通过ELISA测量的人树突细胞分泌的IL-12的浓度的图。
图3D是显示在无处理(M,●)或使用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVRIPO,★)、LPS(▲)或聚肌胞苷酸(pIC，■)处理后的8、24、48、72、86和120小时通过ELISA测量的人树突细胞分泌的TNF-α的浓度的图。
图3E是显示在无处理(M,●)或使用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVRIPO,★)、LPS(▲)或聚肌胞苷酸(pIC，■)处理后的8、24、48、72、86和120小时通过ELISA测量的人树突细胞分泌的IL-10的浓度的图。
图4A是显示由从DM6黑素瘤细胞(DM6CM)收获的细胞培养基或者单独的细胞培养基中孵育48小时且随后不处理(Mock，空白对照)、或用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVSRIPO)、或聚肌胞苷酸处理的人树突细胞表达细胞活化标记物CD86(实心黑条)、CD80(白条)和CD40(阴影条)的树突细胞百分比的柱状图。
图4B是显示通过ELISA测量的由从DM6黑素瘤细胞(DM6CM)收获的细胞培养基或者单独的细胞培养基中孵育48小时且随后不处理(Mock，空白对照)、或用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVSRIPO)、或聚肌胞苷酸处理的人树突细胞分泌的IFN-β的量的柱状图。
图4C是显示通过ELISA测量的由从DM6黑素瘤细胞(DM6CM)收获的细胞培养基或者单独的细胞培养基中孵育48小时且随后不处理(Mock，空白对照)、或用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVSRIPO)、或聚肌胞苷酸处理的人树突细胞分泌的IL-12的量的柱状图。
图4D是显示通过ELISA测量的由从DM6黑素瘤细胞(DM6CM)收获的细胞培养基或者单独的细胞培养基中孵育48小时且随后不处理(Mock，空白对照)、或用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVSRIPO)、或聚肌胞苷酸处理的人树突细胞分泌的TNF-α的量的柱状图。
图5A是巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)单独或与MCSF+IL10、IL 4、TGF-β一起分化的巨噬细胞裂解物的免疫印迹，显示在无处理(M)、或者使用嵌合脊髓灰质炎病毒(PV，MOI＝10)、或者LPS(100ng/ml)和聚肌胞苷酸(10μg/ml)(LPS+pIC)处理后24、72小时的各种蛋白质(eIF4G、*eIF4G(Ct)、2BC、2C、MDA5、p-STAT1(Y701)、STAT1、IFIT1、TAP1、IL1-β、CD36和微管蛋白)的表达。
图5B是显示通过ELISA测量的在无处理(空白对照，黑色条)、或者使用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVSRIPO，MOI＝10，阴影条)处理、或者LPS(100ng/ml)和聚肌胞苷酸(10μg/ml)(LPS+pIC，白色条)处理后24、72小时的巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)单独或与MCSF+IL10、IL 4、TGF-β一起分化的巨噬细胞分泌的IFN-β的量的柱状图。
图5C是显示通过ELISA测量的在无处理(空白对照，黑色条)、或者使用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVSRIPO，MOI＝10，阴影条)处理、或者LPS(100ng/ml)和聚肌胞苷酸(10μg/ml)(LPS+pIC，白色条)处理后24、72小时的巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)单独或与MCSF+IL10、IL 4、TGF-β一起分化的巨噬细胞分泌的TNF-α的量的柱状图。
图6A是显示通过自体(关于树突细胞)或MHC匹配(关于肿瘤细胞)的用SM149肿瘤溶解物脉冲的自体DC刺激的效应人T细胞介导的SUM149人肿瘤细胞(阴影条)、用EGFR RNA转染的自体人树突细胞(DC)(阳性对照；(黑色条))和用PSA RNA转染的自体人树突细胞(DC)(阴性对照；(白色条))的裂解百分比的柱状图。
图6B是显示通过自体(关于树突细胞)或MHC匹配(关于肿瘤细胞)的用LNCaP肿瘤溶解物脉冲的自体DC刺激的效应人T细胞介导的LNCaP人肿瘤细胞(阴影条)、用PSA RNA转染的自体人树突细胞(DC)(阳性对照；(黑色条))和用EGFR RNA转染的自体人树突细胞(DC)(阴性对照；(白色条))的裂解百分比的柱状图。
图6C是显示通过自体(关于树突细胞)或MHC匹配(关于肿瘤细胞)的用MDA-MB231肿瘤溶解物脉冲的自体DC刺激的效应人T细胞介导的MDA-MB231人肿瘤细胞(阴影条)、用CEA RNA转染的自体人树突细胞(DC)(阳性对照；(黑色条))和用MART RNA转染的自体人树突细胞(DC)(阴性对照；(白色条))的裂解百分比的柱状图。
图6D是显示通过自体(关于树突细胞)或MHC匹配(关于肿瘤细胞)的用SM149肿瘤溶解物脉冲的自体DC刺激的效应人T细胞介导的SM149人肿瘤细胞(阴影条)、用MART RNA转染的自体人树突细胞(DC)(阳性对照；(黑色条))和用CEA RNA转染的自体人树突细胞(DC)(阴性对照；(白色条))的裂解百分比的柱状图。
具体实施方式
虽然本发明说明书中使用的术语被认为是药学领域普通技术人员很好理解的，但本文提供的定义是为了便于本发明的描述，并提供使用这些术语的说明性实例。
如本文所用，除非明确指定单数(例如，单数明确指定，例如，在短语“单个制剂”中)，术语“一”，“一个”和“该”意指“一个或多个”。
如本文所用，术语“第一”和“第二”是出于区分两种化合物或两种组合物的目的，这将从说明书中更清楚。
如本文所用，术语“试剂盒”是指包装的组分组合，例如嵌合脊髓灰质炎病毒或抗原；并且可以进一步包含一种或多种组分以促进试剂盒内容物的重构、施用、递送或使用。
如本文所用，术语“引发”、“增强”、“促进”或“诱导”用于表示增加或介导治疗效果，例如治疗后的免疫应答。例如，用本文提供的组合物治疗可以介导、促进或诱导与该组合物中的单一组分的单一疗法相比更强的治疗效果。
嵌合脊髓灰质炎病毒是任何脊髓灰质炎病毒，其包含在三叶草结构和开放阅读框之间的5'非翻译区含有来自人鼻病毒内部核糖体进入位点的区段。如同Sabin疫苗株，优选这种嵌合脊髓灰质炎病毒因安全性和缺乏神经毒力而减毒。该内部核糖体进入位点可以来自任何人鼻病毒或其他合适的病毒。还优选的是在抗原呈递细胞如树突细胞的感染后缺乏细胞毒性。
可以使用病毒的裸基因组核酸，其加工的基因组核酸，其转录组(由mRNA组成)或其病毒颗粒形式将病毒施用于、递送于或接触靶细胞。可能需要感染来活化抗原呈递细胞。然而，如果需要低于感染，则嵌合脊髓灰质炎病毒的蛋白质组可能是有效的。
任何形式的病毒RNA都可用于转染细胞。RNA可以是双链基因组(复制形式)，单链基因组或亚基因组RNA。RNA可以作为mRNA分子加工。RNA可以具有改变但仍编码病毒蛋白的密码子，例如优化的密码子。该方法中使用的RNA可以是从病毒颗粒获得的RNA，或者由未包装的细胞产生进入病毒颗粒中的RNA。
如本文所用，术语“皮肤”和“皮肤用地”施用或接种组合物用于表示引入皮肤的一个或多个层或隔室中。这种施用通常进入表皮或真皮，或表皮和真皮层之间。这可以通过本领域已知的任何方法给药来完成，包括但不限于注射方法，或通过局部应用。关于局部应用，例如使用本领域已知的方法，微小剥离法可以去除表皮层并产生足够的炎症以将DC集中到治疗区域。然后可以在疫苗接种或免疫接种或诱导本文提供的免疫应答的过程中将本文提供的组合物局部施用于治疗区域。在一个方面，皮肤施用的免疫原性组合物被设计用于靶向递送免疫原性组合物，优选地，选择性地和特异性地递送至个人皮肤的皮内隔室。
例如，可以以直接或靶向方式对皮肤或粘膜给药，无论是在鼻子，胃，肺或肠中。这种给药不是全身性的，而是可能涉及在体内的靶点直接滴注药物(例如嵌合脊髓灰质炎病毒)。或者，它可以包括局部、皮内或皮下给药。直接或靶向给药可以通过例如鼻喷雾、内窥镜检查或支气管镜检查来完成。也可以靶向体内具有抗原呈递细胞(特别是树突细胞)的其他部位。为了获得血液中的抗原呈递细胞，可以全身施用诸如嵌合脊髓灰质炎病毒的药物或使用嵌合脊髓灰质炎病毒制备的药物。例如，全身给药可用于获得多灶性或转移性病变。其他散播性疾病也可用该方式治疗。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可用于本文所述的组合物或组合的施用、递送、配制、储存、稳定性中的任何一种或多种的任何化合物或组合物或载体介质。本领域已知这些载体包括但不限于稀释剂、水、盐水、合适的载体(例如脂质体、微粒、纳米颗粒、乳剂、胶囊)、缓冲剂、追踪剂、医用肠胃外载体、赋形剂、水溶液、悬浮液、溶剂、乳液、洗涤剂、螯合剂、增溶剂、盐、着色剂、聚合物、水凝胶、表面活性剂、乳化剂、渗透剂、助剂、填料、防腐剂、稳定剂、油、粘合剂、崩解剂、吸收剂、调味剂、以及在制药领域中广泛已知的类似物。
如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”是指在哺乳动物(例如人)中发现的所有类型的癌症、肿瘤或恶性肿瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、癌和肉瘤。肿瘤抗原是指与周围正常组织相比，在肿瘤上具有更高表达水平的特异性相关的肿瘤抗原。或者，使用的肿瘤抗原可以是独特存在于肿瘤中的抗原，例如由肿瘤中的体细胞突变产生的抗原。其他有用的肿瘤抗原可以是在由病毒(例如HPV)引起的肿瘤中表达的病毒抗原。
如本文所用，术语“个体”用于指哺乳动物，优选人或需要本文所述组合物、方法、治疗或药物的人。在一些实施方案中，人类没有脑肿瘤。
如本文所用，术语“抗原”在本文中是指能够诱导免疫应答的分子。在一个方面，分子可包含免疫原。分子可以是多糖、碳水化合物、脂质、蛋白质(例如，蛋白质、糖蛋白、脂蛋白，其片段(肽)或重组蛋白质)，或编码抗原的核酸分子(例如，DNA、RNA、mRNA、表达载体)。抗原可以是来自菌种的抗原，包括但不限于来自分枝杆菌物种的抗原(例如结核分枝杆菌或含有交叉反应抗原的物种，例如BCG)(例如，32A、39A、Ag85A、Ag85B和TB 10.4)和来自疏螺旋体属(例如伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、梅奥型包柔氏螺旋体(Borreliamayonii)，Borrelia afzelii和Borrelia garini)的抗原(例如，外表面蛋白A(OspA)OspB、OspC、DpbA和Bbk32)，辐射或加热灭活细菌和化学灭活细菌。抗原可以来自病毒，包括但不限于来自人免疫缺陷病毒的抗原(例如，gp120、gp41、tat、vif、rev、vpr)，来自呼吸道合胞病毒的抗原(例如，F糖蛋白、G糖蛋白)，来自流感病毒的抗原(例如，神经氨酸酶、血凝素)，来自单纯疱疹病毒的抗原(例如，糖蛋白，如gB、gC、gD和gE)，来自乳头瘤病毒的抗原(例如，L1、E6、E7)，来自肝炎病毒(A、B、C)的抗原，来自寨卡病毒的抗原(例如，NS-1、E)，来自基孔肯雅病毒的抗原(例如，NS1、E1、E2、C)，被辐射或加热灭活的病毒和化学灭活的病毒。抗原可以来自寄生虫，包括但不限于来自疟原虫物种的抗原(例如，MSP-1、CSP、TRAP、CyRPA)，经辐射或加热灭活的寄生虫和化学灭活的寄生虫。抗原可以是肿瘤抗原，其包含：突变基因的产物；在肿瘤细胞中过表达或异常表达的细胞表面蛋白；致癌病毒产物；癌胚抗原；具有异常糖基化的细胞表面糖脂或糖蛋白；肿瘤细胞裂解物(oncolysate)；脱落的肿瘤抗原(例如，从培养的肿瘤细胞的细胞培养基中收集或脱落，或从肿瘤周围的体液中收集)，来自肿瘤细胞的外来体；从肿瘤细胞中纯化的RNA；或编码肿瘤抗原的核酸分子。此类抗原的实例是本领域公知的，包括MUC-1、甲胎蛋白、卵巢癌抗原(CA125)、癌胚抗原(CEA)、Lewis抗原、神经节苷脂N-羟乙酰基-GM3、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、EGFRviii、RAGE-1、HER2(人表皮生长因子受体2)和Melan-A/MART-1。鉴于树突细胞迁移到中枢神经系统的能力，抗原可包含与自身免疫疾病相关的抗原，例如神经炎症疾病，如阿尔茨海默氏病(例如、肽Aβ1–42、Aβ1–6、Aβ1–42.Tau-peptide C-294–305、AV-1959R、AV-1980R、AV-1953R)。要使用的抗原通常不是脊髓灰质炎病毒或脊髓灰质炎病毒的Sabin株或称为PVSRIPO的嵌合脊髓灰质炎病毒的一部分。
如本文所用，术语“抗原负载”用于指抗原和抗原呈递细胞彼此接触，并促进抗原摄入抗原呈递细胞以供抗原呈递细胞进一步处理的方法。用于抗原负载的技术是本领域技术人员已知的，包括但不限于用抗原脉冲(例如通过接触或孵育)树突细胞；和电穿孔、转染、转导或以其他方式引入DNA或RNA或mRNA编码抗原，和免疫复合物负载(与具有结合特异性的抗体结合的抗原)。
如本文所用，术语感染复数或“MOI”是指在感染期间每个细胞添加的病毒体数。例如，如果将100万个病毒颗粒添加到一百万个细胞中，则MOI为1。亚致死剂量(MOI)是不会在靶细胞中诱导细胞毒性的剂量。亚致死剂量可用于实现方法中使用的活化。嵌合病毒间的精确水平可能不等，并且可能随细胞类型而变化。然而，使用本领域已知的简单方法确定亚致死水平完全在普通技术人员的技能范围内。在一些实施方案中，致死水平可以是大于1、大于10或大于100的MOI。在一些实施方案中，亚致死水平可以是小于1、小于0.5、小于0.1、小于0.05或小于0.01的MOI。
术语“树突细胞”在本领域中是已知的，意指能够在活化时诱导免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。树突细胞可以包含分离的树突细胞，其可以是富含树突细胞或含有纯化的树突细胞的组合物，该纯化的树突细胞为从任何含有树突细胞的来源分离，例如非淋巴器官，外周血，皮肤和其他组织，包括来自肺、胃、鼻子和肠道的粘膜。树突细胞由至少三个不同的亚群组成，其中两个在髓系中，一个在淋巴/浆细胞样谱系中。髓样树突细胞存在于大多数非淋巴组织中，包括真皮、表皮(称为“朗格汉斯细胞”)、胃肠粘膜、呼吸道粘膜和血管器官的间质。当提及真皮树突细胞或皮肤树突细胞时，包括朗格汉斯细胞(通常为CD1Q 高)，CD141高真皮树突细胞和CD1c+树突细胞。浆细胞样树突状细胞在血液中循环并在外周淋巴器官中发现。它们构成少于0.4％的外周血单核细胞，并从骨髓造血干细胞发育。树突细胞表达CD155，脊髓灰质炎病毒感染的受体。在暴露于炎性刺激后，树突细胞经历表型和功能变化，其表征它们从未成熟树突细胞到成熟树突细胞的转变。在这方面，树突细胞活化和成熟的特征在于共刺激分子CD40、CD80、CD86的上调，HLA I类和II类的细胞表面表达的增加，以及特异性树突细胞标记物CD83的上调。增强的共刺激分子(例如CD80CD86)的表达扩增T细胞受体(TCR)信号传导并促进T细胞活化。树突细胞成熟的过程还涉及趋化因子、细胞因子和蛋白酶的分泌，以及粘附分子和趋化因子受体的表面表达。例如，树突细胞迅速开始产生IL-12，这是一种有助于将幼稚CD4T细胞导向Th1表型的信号。趋化因子反应性和产生的调节也是活化的树突细胞从外周组织迁移到次级淋巴组织和器官的能力的原因，其中活化的树突细胞发挥其抗原呈递功能并在适应性免疫的发展中提供关键步骤。可以从组织或体液中分离抗原呈递细胞，例如但不限于树突细胞，然后使用本文所述的佐剂或免疫原性组合物活化。可以使用其他抗原呈递细胞，无论是专职抗原呈递细胞还是非专职抗原呈递细胞。专职抗原呈递细胞包括巨噬细胞和B细胞。
如本文所用，关于抗原或组合物的术语“免疫应答”是在对抗原或组合物中存在的抗原的免疫应答的个体中的发展。引发的免疫应答可选自体液免疫应答、细胞免疫应答、适应性免疫应答及其组合。本文提供的用于引发免疫应答的治疗方法可称为免疫疗法。本文提供的用于引发免疫应答的组合物在本文中可称为免疫原性组合物。
如本文所用，术语“治疗”，或“处理”包括预防性(预防疾病)或治疗性(缓和性)程序中的一种或多种。治疗致病性疾病或传染病的个体包括但不限于治疗由选自细菌、病毒、寄生虫及其组合的病原体引起的感染。
如本文所用，“有效量”是指在给予需要这种组合物或组合的个体后产生所需治疗效果的组合物或组合的量。在免疫疗法中，治疗效果可以通过诱导免疫应答来表示。可以通过抗体滴度的增加诱导的免疫应答的一种或多种类型(例如，体液和/或细胞免疫应答)，一种或多种T细胞亚群的增加(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞)，活化的树突细胞的增加或其他相关细胞群(例如，B细胞，巨噬细胞)的变化来测量这种诱导，其可以使用本领域已知的方法测量(例如，用可检测标记物标记随后通过免疫测定或流式细胞术分析)。或者，还可以通过调节性T细胞(例如，CD25+FoxP3+、CD4+细胞)的数量或功能的减少来测量免疫应答。因此，在一个方面，可以通过临床结果评估治疗功效；与治疗前或不治疗的数量相比的活化的T细胞数量增加，抗原抗体的血清滴度增加等。在治疗癌症中，治疗效果可包括但不限于以下的一种或多种：(a)免疫相关反应中的，如本领域技术人员已知的相对于总肿瘤负荷的免疫相关完全反应或免疫相关部分反应；以及(b)传统的总体目标反应率，其使用本领域技术人员已知的适当反应评估标准，并且取决于所治疗癌症的类型(例如，对于淋巴瘤，参见Cheson等，2014,J.Clin.Oncology 32(27):3059-3067；对于实体非淋巴组织肿瘤，参见实体瘤反应评估标准(RECIST))。
在本文提供的任何治疗组合物和方法中，抗原和嵌合脊髓灰质炎病毒的剂量或用量将取决于诸如给药方式，给药制剂，免疫疗法的类型，抗原的免疫原性，接受这种组合物的个体的体型、健康和免疫能力，以及在确定适当治疗剂量的领域熟练的执业医师可以考虑的其他因素。例如，对于本文提供的治疗方法，嵌合脊髓灰质炎病毒可以以约1×104TCID至约1×1010TCID(组织培养感染剂量)或范围从约0.01到约10的MOI的剂量范围施用。本领域技术人员可以应用已知的药物递送和药代动力学的原理和模型，以确定在临床前和临床研究中待测试的剂量的可能范围，从而确定本文提供的治疗方法中使用的组合物或组合的治疗有效量。可用于本文提供的治疗方法的组合物或组合可进一步包含药学上可接受的载体，以促进储存、制剂稳定性、施用和递送中的一种或多种。载体可以是颗粒状的，因此组合物或组合可以是例如粉末或固体形式。载体可以是半固体、凝胶或液体配方，以便可以注射、施用或以其他方式施用组合物或组合。可用于本文提供的治疗方法的组合物或组合施用于需要其的个体(例如人)的方式可以是本领域已知的适于递送药物组合物的任何方式，特别是适合通过免疫疗法治疗的方式。取决于免疫疗法的类型，施用可包括但不限于肿瘤内、皮肤、皮内、腔内、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、通过灌注和通过蠕动技术。
本文所述的组合物的给药频率、给药顺序、剂量和给药方案可以由医生考虑医学文献，个体的健康、年龄和性别，免疫疗法的类型，组合物或组合或治疗的给药方式和给药方案，以及其他相关考虑因素予以确定。在本文提供的治疗方法中，免疫原性组合物可以以合适的频率给予个体以有效诱导免疫应答。例如，免疫接种或疫苗接种可以是一次施用或一系列施用。例如，嵌合脊髓灰质炎病毒可以施用一次、以与抗原相同的频率施用、或以与抗原不同的频率施用。在使用本文提供的免疫原性组合物的治疗方法的一个实例中，施用抗原之前施用嵌合脊髓灰质炎病毒。在使用本文提供的免疫原性组合物的治疗方法的另一个实例中，抗原的施用与嵌合脊髓灰质炎病毒的施用同时或并发发生。在使用本文提供的免疫原性组合物的治疗方法的另一个实例中，在施用嵌合脊髓灰质炎病毒之前施用抗原。
实施例1
图1显示了包含Sabin I型脊髓灰质炎病毒株的嵌合脊髓灰质炎病毒的构建体，该Sabin I型脊髓灰质炎病毒株在其三叶草结构和开放阅读框之间的5'非翻译区中的人鼻病毒2型内部核糖体进入位点。这种说明的嵌合脊髓灰质炎病毒，也称为PVSRIPO，在患有复发性胶质母细胞瘤的个体的I期试验中显示出治疗表达脊髓灰质炎病毒受体(CD155)的肿瘤的功效。例如，用PVS-RIPO治疗的复发性胶质母细胞瘤患者的36个月存活率(95％置信区间)为21.1％，而复发性胶质母细胞瘤的历史对照组为4％(截至2017年3月1日)。有两个人在治疗五年后似乎没有复发肿瘤的证据。制备嵌合脊髓灰质炎病毒的方法，包括但不限于PVS-RIPO，是本领域已知的(参见例如WO2016/201224)。因此，嵌合脊髓灰质炎病毒已经证明在治疗个体，特别是人类中是安全的，并且已经根据GMP和FDA规范成功地制备。
分离树突状细胞。可以使用本领域已知的方法从组织或外周血中分离未成熟的树突细胞。为了用于本文所示的实施例，如下产生未成熟的树突细胞。从人血液中分离外周血单核细胞(PBMC)，然后冷冻。将冷冻的PBMC解冻，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，并以2×108个细胞重悬于T-150培养瓶中的培养基中。将细胞在37℃，5％CO2培养箱中温育1小时。通过从一侧到另一侧摇动培养瓶来收获非贴壁细胞以移除它们。用30ml含有800U/ml人GM-CSF和500U/ml IL-4的培养基补充贴壁细胞，然后在37℃下培养。在7天的培养期后，通过稳固地敲击烧瓶使松散贴壁的DC簇脱落。用冷PBS洗涤贴壁DC，用解离缓冲液处理并在37℃下孵育15-20分钟，并通过稳固地敲击烧瓶然后强烈移液来收获。将收获的DC制剂合并、洗涤、沉淀、并重悬浮，得到未成熟DC的制剂。通过流式细胞术染色和分析显示未成熟的DC是CD155+。
用嵌合脊髓灰质炎病毒感染树突状细胞。表达CD155的抗原呈递细胞对脊髓灰质炎病毒产生病毒和致死性感染敏感。用嵌合脊髓灰质炎病毒(例如PVSRIPO)感染表达CD155的肿瘤细胞产生致死性感染，导致溶瘤作用。因此，未预料到用嵌合脊髓灰质炎病毒(如PVSRIPO)感染抗原呈递细胞，如树突细胞和巨噬细胞，不会导致致命的感染(感染的树突状细胞不会被嵌合脊髓灰质炎病毒杀死)，如本实施例所示。此外，用嵌合脊髓灰质炎病毒感染DC导致感染的DC活化，如本文实施例2中所示。
在本实施例中，CD155+人肿瘤细胞系DM6(Duke Melanoma 6)和MDA-MB231(人乳腺癌)和未成熟的人DC各自用嵌合脊髓灰质炎病毒感染。将五十万个细胞接种在35mm培养皿中，并通过向细胞培养基中加入嵌合脊髓灰质炎病毒(PVSRIPO)以指定的感染复数(MOI；如图2所示)感染。在感染后8小时、24小时、48小时和72小时，分析细胞的细胞裂解和病毒产生。通过使用比色测定法测量培养基中乳酸脱氢酶(LDH)的量来评估细胞裂解(LDH是仅在细胞死亡时释放到培养细胞培养基中的细胞内酶；即，LDH用作细胞死亡标记物)。为了测量病毒产生，使用本领域已知的方法使用标准噬斑测定法测定噬斑形成单位。
如图2A所示，且通过LDH释放测量，CD155+人肿瘤细胞(▲,▼)的感染导致细胞死亡和裂解，而人树突细胞(■,●)的感染未显示细胞死亡或裂解的迹象。如图2B所示，CD155+人肿瘤细胞(▲,▼)的感染导致感染性嵌合脊髓灰质炎病毒的产生，而人树突细胞(■)的感染显示出感染性嵌合脊髓灰质炎病毒的最低产生。然后将用嵌合脊髓灰质炎病毒感染的人DC进行凝胶电泳和免疫印迹。如图2C所示，嵌合脊髓灰质炎病毒感染DC的最显著效果是由STAT1(Y701)磷酸化与STAT1和IFN刺激基因(ISG)诱导(IFIT1，ISG15；图2C)表明的稳定、持久的I型干扰素(IFN)反应，而非病毒细胞毒性。还观察到TAP1的显著上调(图2C)，TAP1是细胞中MHCI类限制性抗原加工所需的蛋白质，其可被IFN-β诱导。这些指示增强的DC活化状态的变化也伴随着CD40的诱导(图2C)。作为T细胞活化中的共同受体(例如CD80，CD86和CD40)，嵌合脊髓灰质炎病毒感染的DC上的细胞表面受体的上调，极大地增强了这些活化的DC活化T细胞诱导免疫响应的能力。
本文证明，出乎意料地，用嵌合脊髓灰质炎病毒(例如PVSRIPO)感染DC不会导致致死性感染，并且用嵌合脊髓灰质炎病毒进一步感染DC导致通过I型IFN应答活化感染的DC。
实施例2
通过嵌合脊髓灰质炎病毒活化抗原呈递细胞。除了本文实施例1中提供的证据之外，该实施例中说明的是用嵌合脊髓灰质炎病毒感染的DC活化的额外证据。DC是专职抗原呈递细胞，其能够刺激幼稚免疫细胞以产生抗原特异性免疫应答。因此，不管体内还是离体，已显示DC的活化增强了疫苗接种策略的成功。决定DC疫苗或免疫原性组合物成功的因素包括DC活化/炎症的寿命，以及DC活化的类型(例如，用于促进Th2免疫应答或Th1免疫应答)。目前用于活化DC的标准方法涉及暴露于细胞因子混合物；TLR激动剂，如聚肌胞苷酸，其为一种活化TLR3的双链RNA模拟物；或脂多糖(LPS)，其为一种活化TLR4的细菌细胞壁成分。这些方法在诱导免疫应答中可能是次优的，因为它们仅人工活化一种先天性受体而不提供与病原体感染相同的额外炎症环境，并且因为它们仅瞬时诱导DC活化。
将嵌合脊髓灰质炎病毒对DC的佐剂效应与通过使用脂多糖(LPS)、聚肌胞苷酸或用于基于DC疫苗的临床应用的成熟细胞因子混合物进行TLR刺激途径成熟和活化人未成熟DC的标准方法进行比较。对于该比较，未成熟的人树突细胞未经处理(空白对照)或用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVSRIPO；MOI＝10)、或LPS(100ng/ml)、或聚肌胞苷酸(10μg/ml)或成熟细胞因子混合物(TNF-α，10ng/ml；IL-1β，10ng/ml；IL-6,1000U/ml；以及PGE2，1μg/ml)处理。在处理后24、48、72、96和120收获细胞和上清液。通过免疫印迹分析细胞裂解物的IFN反应和DC活化蛋白。使用酶联免疫测定(ELISA)测量处理后DC上清液中的IFN-β、TNF-α、IL-12和IL-10(数据表示在指定时间点累积的细胞因子释放)。如图3A所示，与用TLR刺激(LPS和聚肌胞苷酸，pIC)处理的DC或空白对照处理的细胞(M)或用成熟细胞因子混合物(CC)处理的细胞相比，嵌合脊髓灰质炎病毒(PV)对DCs的感染在效力、持续的STAT1(Y701)-磷酸化和在整个5天测量期间诱导干扰素刺激的基因方面有明显区别。如图3B所示，有效的1型干扰素响应与超过在活化DC中测试的所有其他试剂的水平的IFN-β释放一致，因为在用聚肌胞苷酸或LPS处理的DC中IFN-β释放最小或检测不到。相对于DC空白对照处理或用聚肌胞苷酸或LPS处理，DC的嵌合脊髓灰质炎病毒感染还导致IL-12(图3C)和TNF-α(图3D)的更高水平和持续产生，以及更高水平的IL-10(图3E)。注意，在该实验中未测定CC刺激的DC的细胞因子产生，因为混合物含有TNF-α；然而，图3A显示用细胞因子混合物(CC)处理的DC缺乏诱导I型IFN活性的能力。
在免疫抑制环境中活化抗原呈递细胞。病原体可通过干扰DC成熟来损害未成熟的DC。例如，体外未成熟的人DC的单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染已经显示出抑制它们的成熟型，并因此抑制它们诱导抗病毒免疫应答的能力。类似地，寄生虫可以干扰DC成熟。例如，感染疟疾寄生虫恶性疟原虫的红细胞调节DC的成熟，并因此调节它们在抗寄生虫免疫应答中活化T细胞的能力。此外，对包柔氏螺旋体属螺旋体的DC反应受蜱半胱氨酸蛋白酶抑制剂的影响，其影响DC的成熟，因此损害适应性免疫应答。在肿瘤微环境的免疫抑制环境中，树突细胞活化也受到阻碍。在本实施例中，将嵌合脊髓灰质炎病毒(PVSRIPO)与聚肌胞苷酸在活化已遭受免疫抑制条件的未成熟DC的活化能力进行比较。
将人未成熟树突细胞在单独的培养基中或在癌细胞条件培养基中培养24小时(培养48小时后从DM6黑素瘤细胞收获的细胞培养基；DM6CM)。DM6CM含有一系列涉及抑制抗原呈递细胞和其他免疫细胞功能的细胞因子，包括VEGF-A、M-CSF、CCL2 CXCL1和可溶性IL-6R。与仅在细胞培养基中孵育的未成熟DC相比，在DM6CM中孵育的未成熟DC显示降低的CD40、CD80、CD86的基础水平。尽管树突细胞活化和成熟具有这种免疫抑制作用，但是用嵌合脊髓灰质炎病毒感染的DM6CM暴露的未成熟DC显示出活化标记物CD40、CD80和CD86的表达增强，其水平与仅在细胞培养基(普通AIM V培养基)中培养的未成熟树突细胞诱导并用嵌合脊髓灰质炎病毒(PVSRIPO)感染的水平相当(图4A)。相反，与仅在细胞培养基中培养并用聚肌胞苷酸处理的未成熟DC相比，在DM6CM培养的DC中使用聚肌胞苷酸处理后CD40、CD80和CDβ86的表达显著降低(图4A)。仅用嵌合脊髓灰质炎病毒感染未成熟DC，而不使用聚肌胞苷酸刺激，导致DM6CM暴露的未成熟DC中有效的，在DM6CM暴露的未成熟DC中持续的IFN-β释放(图4B)。有趣的是，在DM6CM中培养的DC在聚肌胞苷酸处理后不产生显著量的IFN-β(图4B)、IL-12(图4C)或TNF-α(图4D)，但在嵌合脊髓灰质炎病毒感染后保留IFN-β(图4B)、IL-12(图4C)或TNF-α(图4D)的释放。虽然与仅暴露于细胞培养基并感染嵌合脊髓灰质炎病毒的DC的产生相比，嵌合脊髓灰质炎病毒感染诱导的IFN-β和IL-12的产生在DM6CM培养的DC中得到缓和，但TNF-α的产生实际上在免疫抑制中得到增强。条件(图4D)。这些数据表明，虽然免疫抑制的DC对聚肌胞苷酸刺激具有抗性，但它们对由嵌合脊髓灰质炎病毒感染介导的活化保持敏感性。换言之，即使在免疫抑制的情况下，嵌合脊髓灰质炎病毒也会活化DC。
病原体以及肿瘤可以诱导其他抗原呈递细胞(例如巨噬细胞)的免疫抑制。例如，包柔氏疏螺旋体可通过TLR受体使人巨噬细胞对活化刺激物脱敏，部分原因是IL-10产生的诱导。巨噬细胞活化在疟疾感染中也受到抑制，有助于在患有疟疾的人中观察到免疫抑制。肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤免疫抑制有关。研究了嵌合脊髓灰质炎病毒(例如PVSRIPO)感染对体外巨噬细胞的影响。
单独使用巨噬细胞集落刺激因子(MCSF；25ng/ml)或使用MCSF加TGF-β、IL-10和IL-4(均为20ng/ml)分化纯化的人单核细胞(从PBMC中分离)七天成为巨噬细胞。这些额外的细胞因子在体外诱导与IFIT1、TAP1和CD36(一种与巨噬细胞活性相关的清道夫受体)的基础表达降低相关的免疫抑制表型。用嵌合脊髓灰质炎病毒(MOI为10)处理巨噬细胞或用LPS(100ng/ml)和聚肌胞苷酸(10μg/ml)的组合处理24小时或72小时。如在DC中，用嵌合脊髓灰质炎病毒(PV)感染巨噬细胞产生了强烈的I型IFN应答(图5A和图5B)和TNF-α产生(图5C)，其在免疫抑制的随后用嵌合脊髓灰质炎病毒感染的巨噬细胞中反常增强(图5B和5C，MCSF+IL10，IL 4，TGF-β)。在仅用MCSF衍生的嵌合脊髓灰质炎病毒感染的巨噬细胞中未检测到病毒翻译或致细胞病变(图5A)，但长期感染后与增强的病毒翻译和明显的致细胞病变(图5A，eIF4G裂解，微管蛋白丢失)相关的免疫抑制的巨噬细胞中IFN-β释放增加(图5B)。用聚肌胞苷酸和LPS的组合(聚肌胞苷酸+LPS)处理巨噬细胞诱导在MCSF衍生的巨噬细胞中的IL1-β(图5A)、IFN-β(图5B)和TNF-α应答(图5C)。然而，与在用组合的聚肌胞苷酸+LPS处理巨噬细胞后72小时相比，在用组合的聚肌胞苷酸+LPS处理免疫抑制的巨噬细胞后72小时会导致IL1-β(图5A)、IFN-β(图5B)和TNF-α产生(图5C)降低。如在MCSF衍生的巨噬细胞中那样，对未分化的人单核细胞的分析揭示了对嵌合脊髓灰质炎病毒感染相似的I型IFN响应。这些发现表明巨噬细胞(和单核细胞)的嵌合脊髓灰质炎病毒感染产生I型IFN显性活化，其通过免疫抑制性巨噬细胞表型被反常地增强。换句话说，即使在免疫抑制存在的情况下，嵌合脊髓灰质炎病毒也会活化巨噬细胞。
实施例3
该实施例说明了活化的DC在促进免疫应答中的用途。可以与嵌合脊髓灰质炎病毒同时、并行或依次使抗原与DC接触以活化。将抗原负载到DC中的技术是本领域技术人员已知的，包括但不限于用抗原(例如纯化的抗原或含有抗原的细胞裂解物)与树突细胞一起脉冲(通过与其一起孵育)；电穿孔、转染、转导或以其他方式引入编码抗原的DNA或RNA或mRNA；或免疫复合物负载(与具有结合特异性的抗体结合的抗原)。
编码免疫原性试剂的RNA的制备。通过添加含有64个A-T碱基对的寡核苷酸，然后在pGEM4Z的EcoRI和Narl位点之间放置SpeI限制性位点以产生质粒pGEM4Z/A64，从而产生pSP73-Sph/A64。将pGEM4Z/A64的HindIII-NdeI片段克隆到pSP73中，用HindIII和NdeI消化以产生pSP73/A64。通过用SphI消化pSP73/A64，用T4DNA聚合酶填充末端，然后重新连接，从而产生pSP73-Sph。pSP73-Sph/A64/不包含与SpeI位点相邻的NotI限制位点。使用聚合酶链式反应(PCR)克隆将编码全长肿瘤抗原(PSA、MART-A27L和CEA)的开放阅读框(ORF)插入pSP73-Sph/A64质粒中。为了产生编码具有A27L突变的MART-1的cDNA，将天然MART-1DNA用作DNA模板。进行重叠PCR以将编码氨基酸#27的密码子从GCC丙氨酸替换至CTC亮氨酸。然后将扩增的重叠突变PCR产物克隆到pSP73-Sph/A64质粒中。采用PCR克隆将编码肿瘤抗原EGFR的ORF插入pcDNA3.1/A64质粒。该修饰的pcDNA3.1质粒含有插入位点5'的T7启动子，其中64-腺苷合成的多聚腺苷酸(poly(A))尾段插入多克隆位点的3'末端。SpeI限制性位点位于pcDNA3.1/A64质粒的64-腺苷区段的3'末端，用于在体外RNA转录之前线性化DNA。使用市售试剂盒按照制造商的说明书使用SpeI线性化质粒制备RNA；用市售的mini试剂盒纯化mRNA。使用类似方法进行克隆和产生编码肿瘤抗原TRP-2、OVA和GFP的mRNA。
使用mRNA的电穿孔负载抗原。将悬浮在200μl培养基中的DC(2×106)与2-mm比色皿中的25μg/ml体外转录的RNA混合，并使用电穿孔仪在340V下电穿孔500μs。
通过用免疫原性试剂脉冲负载抗原。在本说明中，使用的是人CD155+，HLA-A2+，MHC I类表达肿瘤细胞系SUM149炎性乳腺癌，MDA-MB231三阴性乳腺癌，DM6黑素瘤和LNCaP前列腺癌。通过向细胞培养基中75％汇合的100mm培养皿中加入病毒(MOI＝0.1)，孵育48小时，然后离心以除去细胞碎片，并收集用于处理DC的上清液，来制备用于负载DC中使用的癌细胞裂解物(肿瘤溶解物)。空白对照类似地生成，仅未添加病毒。由于使用的嵌合脊髓灰质炎病毒PVSRIPO可以感染肿瘤细胞，复制产生更多的嵌合脊髓灰质炎病毒，然后裂解感染的肿瘤细胞，产生的是含有嵌合脊髓灰质炎病毒的肿瘤细胞裂解物。为了产生嵌合脊髓灰质炎病毒的肿瘤溶解物负载的DC，将1ml裂解物加入到1×106个未成熟DC中，然后在培养基中培养24小时。
通过抗原负载的活化抗原呈递细胞诱导免疫应答。检测暴露于含嵌合脊髓灰质炎病毒的肿瘤溶解物的人DC在细胞裂解物(例如，肿瘤溶解物)中负载肿瘤抗原的能力，使用体外DC-T细胞刺激测定法使其呈现并引发自体T细胞。为了用PVSRIPO肿瘤溶解物处理的DC体外刺激T细胞，将PBMC解冻，温育1小时，并收获非贴壁细胞。然后在25ng/ml IL-7存在下，使用负载嵌合脊髓灰质炎病毒诱导的肿瘤溶解物的DC刺激非贴壁细胞，响应细胞与刺激物DC之比为10:1。所有刺激均在含有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、20mM HEPES、1mM丙酮酸钠、0.1mM MEM非必需氨基酸、100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素和5×10-5M的β-巯基乙醇(细胞毒性T淋巴细胞(CTL)刺激培养基)的RPMI 1640中进行。响应细胞浓度为2×106个细胞/ml。在第3天以100U/ml加入IL-2，每4-5天加入50U/ml。在CTL刺激培养基中将T细胞维持在1-2×106个细胞/ml。在一些测定中，在7天后，用含嵌合脊髓灰质炎病毒的肿瘤溶解物负载的DC再刺激T细胞，响应细胞与刺激物比率为10：1。在第12-14天收获T细胞，计数并在CTL测定中用作效应细胞。在CTL测定中，使用上述人肿瘤细胞系和RNA-电穿孔的DC作为靶标。收获细胞，洗涤以除去所有痕量的培养基，然后使用本领域已知的方法标记铕(Eu)。将10千Eu标记的靶标(T)和不同E:T比例的效应细胞(E)的连续稀释液在96孔V底板中的200μl不含抗生素的CTL刺激培养基中温育。将板离心并孵育4小时。收获上清液(50μl)并加入到96孔平底板中的增强溶液(150μl；旨在用于定量测定Eu3+的酸性螯合洗涤剂溶液)中，并使用VICTOR3多标记计数器(Perkin-Elmer)通过实践分辨荧光测量Eu-释放。使用下式确定特异性细胞毒活性：
特异性释放百分比＝[(实验性释放–自发性释放)/(总释放–自发性释放)]x 100
靶细胞中的自发性释放<去垢剂总释放的25％。通过在没有T细胞的培养基中孵育靶细胞来确定靶细胞中的自发性释放。在DC:T细胞体外共培养12-14天后，收获细胞并使用上述标准的4小时铕(Eu)-释放CTL测定法测定肿瘤抗原特异性细胞毒性反应性。为了评估CTL反应性，用下列Eu标记的靶细胞培养T细胞(效应细胞)：(i)产生用于DC负载的含嵌合脊髓灰质炎病毒的肿瘤溶解物的肿瘤细胞系；(ii)用编码已知由肿瘤细胞系表达的肿瘤抗原的mRNA转染的DC(测定阳性对照)；或(iii)用编码不由肿瘤细胞系表达的无关肿瘤抗原的mRNA转染的DC(测定阴性对照)。使用表达自体抗原的DC作为阳性和阴性对照靶标，通过消除T细胞和靶细胞之间的MHC错配，可以确定对已知肿瘤抗原的特异性CTL反应性。通过测量上清液中的Eu释放来评估CTL介导的靶细胞杀伤。
将T细胞与肿瘤裂解物脉冲的自体DC共培养，然后收获刺激的效应T细胞，并在CTL测定中针对相应的肿瘤细胞(图6A-D；阴影条)、用编码相关肿瘤抗原的RNA转染的自体DC(图6A-D；黑色条；阳性对照)、用编码与靶向肿瘤相关的无关肿瘤抗原的RNA转染的自体DC(图6A，PSA；图6B，EGFR；图6C，MART；和图6D，CEA；白色条；阴性对照)进行测试。每个条形代表一式三份样品的平均特异性裂解百分比和标准偏差(SD)。使用配对的双尾Student's t检验对比自体DC表达图6A-D中每一个相关或无关肿瘤抗原的统计学显著性。小于0.05的概率(p<0.05)被认为是统计学上显著的：图6A，SUM149DC靶，p＝0.04；图6B，LNCaP DC靶，p＝0.0008；图6C，MDA-MB231DC靶，p＝0.01；和图6D，DM6DC靶，p＝0.01。用含嵌合脊髓灰质炎病毒的肿瘤溶解物处理的DC产生CTL应答，其有效裂解原始癌症系(图6A-D，阴影条)以及阳性对照(表达相关肿瘤抗原的DC；图6A-D，黑色条)，但不是阴性对照(表达无关肿瘤抗原的DC；图6A-D，白色条)。值得注意的是，含有嵌合脊髓灰质炎病毒的肿瘤溶解物处理的DC的抗原呈递不需要使用细胞因子混合物(CC)的额外成熟步骤，该步骤在这种体外测定中需要并常规用于刺激效应T细胞。可得出在这种情况下DC成熟/活化是由于用溶于肿瘤溶解物中存在的嵌合脊髓灰质炎病毒感染DC。由于肿瘤溶解物代表肿瘤抗原的全部组成部分，因此肿瘤溶解物刺激的T细胞可能靶向多种肿瘤抗原，这可以解释较高水平的肿瘤细胞裂解而不是仅表达1种选定肿瘤抗原的靶DC。值得注意的是，SUM149乳腺癌肿瘤溶解物刺激的T细胞不溶解LNCaP前列腺癌细胞，反之亦然。此外，如靶细胞的最小裂解所示，负载有来自空白对照感染细胞的上清液的DC不刺激抗原特异性T细胞。
总之，这些发现表明嵌合脊髓灰质炎病毒感染和活化的APC：(1)诱导共刺激分子表达；(2)可负载抗原，进行抗原加工和呈递；(3)可以诱导针对这种抗原的免疫应答，包括介导T细胞对表达这种抗原的细胞的细胞毒性。
实施例4
在该实施例中说明的是本文提供的组合物和方法的用途。本文提供的组合物包括(a)分离的免疫原性组合物，其包含嵌合脊髓灰质炎病毒和抗原；(b)用嵌合脊髓灰质炎病毒活化(例如离体或皮肤)的抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)；(c)用嵌合脊髓灰质炎病毒活化并负载抗原(例如离体或皮肤)的抗原呈递细胞。这些组合物中的任何一种都可以用于治疗个体的方法中。具体地，在组合物中的抗原包含肿瘤抗原的情况下，此类组合物可用于治疗患有肿瘤、疑似患有肿瘤或具有发展肿瘤的高风险(例如，通过预测风险的遗传测试确定)。
具体地，当组合物中的抗原包含病原体抗原时，这种组合物可用于治疗(治疗或预防)病原性感染(例如寄生虫、细菌或病毒感染)的方法。例如，组合物可以在感染之前施用以在个体中引发保护性免疫应答，或者在感染之后刺激个体的免疫系统以诱导针对感染的免疫应答。
为了施用组合物，该组合物可以进一步包含药学上可接受的载体以产生药物组合物或药剂。在一个方面中，组合物包含树突细胞作为组合物的组分，首先从含有所需树突细胞的组织或体液中分离树突细胞，然后使分离的树突细胞与嵌合脊髓灰质炎病毒接触，或与嵌合脊髓灰质炎病毒和抗原接触。然后可以通过本领域已知的给药方法将所得的活化树突细胞给予需要治疗的个体；例如，皮肤、皮内、肌肉内、皮下、静脉内、鼻内或通过直接注入淋巴结。所需的或最佳的给药途径和给药量可以由熟练的执业者根据例如待治疗的个体的年龄、体重、免疫状态和健康以及待治疗的疾病为待治疗的任何特定个体来确定。
在一个方面，本文提供的组合物可以用作皮肤疫苗制剂，其被设计用于(优选为选择性地和特异性地)将抗原靶向递送至个体皮肤的皮内隔室。因此，在一个方面，免疫原性组合物直接靶向皮肤的皮内隔室。包含嵌合脊髓灰质炎病毒的免疫原性组合物中的佐剂组分活化抗原呈递细胞，当与免疫原性组合物的抗原组分接触时，所述抗原呈递细胞增强抗原向免疫细胞的呈递和/或可用性，从而引发针对抗原的免疫应答。包含免疫原性的药物组合物或药剂用于皮肤给药可进一步包含用于增强免疫原性组合物有效性的组合物，该组合物由用于产生贮库效应的试剂或渗透促进剂组成。用于产生贮库效应的试剂减缓免疫原性组合物中一种或多种组分在给药部位的释放，以便延长免疫原性组合物的一种或多种组分在给药部位(例如真皮隔室)向抗原呈递细胞的暴露，这可以增强引发的免疫应答。这些组合物是本领域技术人员已知的，包括油、粘性物质、凝胶和聚合物。渗透增强剂是可用于促进皮肤隔室吸收或增强免疫原性组合物渗透或转移至或穿过皮肤的一个或多个皮肤隔室以达到免疫原性组合物的所需递送位点的任何分子。渗透剂或渗透增强剂是本领域技术人员已知的，包括但不限于脂肪酸、聚合物、胆汁盐和去垢剂。
用于将本文提供的免疫原性组合物施用于真皮隔室的递送装置可包括贴剂、注射器、基于微针的注射、输注系统、缺针或无针的弹道注射系统、Mantoux型皮内注射，或任何其他用于靶向所需的真皮隔室的方法。
Claims (64)
1.一种激活抗原呈递细胞的方法，包括：
使抗原呈递细胞与有效活化抗原呈递细胞的量的嵌合脊髓灰质炎病毒或编码嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA接触，其中所述接触以离体或在皮肤上进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中使所述抗原呈递细胞与所述嵌合脊髓灰质炎病毒的病毒颗粒接触。
4.根据权利要求1所述的方法，其中使所述抗原呈递细胞与编码所述嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA接触。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括使所述抗原呈递细胞与抗原接触。
7.一种活化抗原呈递细胞的方法，包括：
使分离的抗原呈递细胞在体外与有效活化所述抗原呈递细胞的量的嵌合脊髓灰质炎病毒或编码所述嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA接触。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
9.根据权利要求7所述的方法，其中使所述抗原呈递细胞与所述嵌合脊髓灰质炎病毒的病毒颗粒接触。
10.根据权利要求7所述的方法，其中使所述抗原呈递细胞与编码所述嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA接触。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
12.根据权利要求7所述的方法，还包括使所述抗原呈递细胞与抗原接触。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗原呈递细胞在与嵌合脊髓灰质炎病毒接触之前与抗原接触。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗原呈递细胞在与抗原接触之前与嵌合脊髓灰质炎病毒接触。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗原呈递细胞同时接触嵌合脊髓灰质炎病毒和抗原。
16.一种进行免疫疗法的方法，包括：
向个体施用已经负载抗原的活化抗原呈递细胞，其中所述活化抗原呈递细胞通过使抗原呈递细胞与有效活化所述抗原呈递细胞的量的嵌合脊髓灰质炎病毒或编码所述嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA接触来制备。
17.根据权利要求16所述的方法，其中使所述抗原呈递细胞与所述嵌合脊髓灰质炎病毒的病毒颗粒接触。
18.根据权利要求16所述的方法，其中使所述抗原呈递细胞与编码所述嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA接触。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗原来自病原体，其中所述病原体选自由细菌、病毒和寄生虫组成的组。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
22.根据权利要求16所述的方法，其中通过将mRNA导入所述抗原呈递细胞来负载所述抗原。
23.根据权利要求16所述的方法，其中通过使所述抗原呈递细胞与所述抗原接触来负载所述抗原，其中所述抗原是蛋白质。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗原与对所述抗原具有结合特异性的抗体结合。
25.根据权利要求23所述的方法，其中含有抗原的细胞裂解物用于负载所述树突细胞。
26.一种治疗疾病的方法，包括：
给个体施用活化抗原呈递细胞，所述活化抗原呈递细胞是通过使抗原呈递细胞与(a)有效活化抗原呈递细胞的量的嵌合脊髓灰质炎病毒或编码所述嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA以及(b)抗原接触而制备的。
27.根据权利要求26所述的方法，其中使所述树突细胞与所述嵌合脊髓灰质炎病毒的病毒颗粒接触。
28.根据权利要求26所述的方法，其中使所述抗原呈递细胞与编码所述嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA接触。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗原来自病原体，其中所述病原体选自由细菌、病毒和寄生虫组成的组。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
32.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗原包括核酸分子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述核酸分子包含mRNA。
34.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗原包括蛋白质。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述蛋白质与对所述抗原具有结合特异性的抗体结合。
36.根据权利要求26所述的方法，其中抗原包含在细胞裂解物中。
37.根据权利要求26所述的方法，其中所述疾病包括传染病。
38.根据权利要求26所述的方法，其中所述疾病是癌症。
39.一种免疫原性组合物，包含：
抗原，其选自由以下组成的组：细菌病原体的抗原，致病性寄生虫的抗原，非脊髓灰质炎病毒的抗原和肿瘤抗原；和
佐剂，其包含嵌合脊髓灰质炎病毒或编码所述嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA。
40.根据权利要求39所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含所述嵌合脊髓灰质炎病毒的病毒颗粒。
41.根据权利要求39所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含编码所述嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA。
42.根据权利要求41所述的免疫原性组合物，其中所述RNA是mRNA。
43.根据权利要求39所述的免疫原性组合物，其中所述抗原来自病原体，其中所述病原体选自由细菌、非脊髓灰质炎病毒和寄生虫组成的组。
44.根据权利要求39所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是肿瘤抗原。
45.根据权利要求39所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包括核酸分子。
46.根据权利要求39所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含mRNA。
47.根据权利要求39所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包括蛋白质。
48.根据权利要求47所述的免疫原性组合物，其中所述蛋白质与对所述抗原具有结合特异性的抗体结合。
49.根据权利要求39所述的免疫原性组合物，其中抗原包含在细胞裂解物中。
50.根据权利要求39所述的免疫原性组合物，还包含药学上可接受的载体。
51.根据权利要求50所述的免疫原性组合物，用于疫苗。
52.一种引发免疫应答的方法，包括给个体施用根据权利要求39所述的免疫原性组合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述免疫原性组合物与药学上可接受的载体一起施用。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述免疫原性组合物是皮肤施用的。
55.根据权利要求7所述的方法，还包括：将所述抗原呈递细胞施用于人受试者。
56.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触是离体进行的，并且所述方法还包括将所述抗原呈递细胞施用于人受试者的步骤。
57.一种活化抗原呈递细胞的方法，包括：
以有效活化人的粘膜或皮肤中的抗原呈递细胞的量将嵌合脊髓灰质炎病毒或编码所述嵌合脊髓灰质炎病毒的RNA直接递送至人的所述粘膜或皮肤。
58.根据权利要求57所述的方法，其中递送至所述粘膜并且所述粘膜在人的肺中。
59.根据权利要求57所述的方法，其中递送至所述粘膜并且所述粘膜在人的胃中。
60.根据权利要求57所述的方法，其中递送至所述粘膜并且所述粘膜在人的鼻中。
61.根据权利要求57所述的方法，其中递送至所述粘膜并且所述粘膜在人的肠中。
62.根据权利要求57所述的方法，其中递送至所述粘膜并且所述粘膜是细胞学上正常的粘膜。
63.根据权利要求57所述的方法，其中递送至所述皮肤并且所述皮肤是细胞学上正常的皮肤。
64.根据权利要求57所述的方法，其中所述人具有多灶性或转移性病变。
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