PT98725B - Metodo para a producao de virus de arn a partir de adn complementar - Google Patents
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Description
MÉTODO PARADA PRODUÇÃO DE VÍRUS DE ARN A PARTIR DE ADN COMPLEMENTAR
ANTECENTES DA INVENÇÃO
Durante a descrição deste pedido de patente de invenção são feitas referências diversas entre parênteses ou números árabes. As citações bibliográficas totais para estas publicações referidas por numeração árabe, podem-se encontrar no fim da memória descritiva imediatamente antes das reivindicações. A descrição completa destas publicações está aqui citada, pela referên cia neste pedido de patente de invenção, para referir de forma mais completa a situação técnica relacionada com a presente invenção .
Os enterovírus humanos pertencem à família de Picornaviridal que são caracterizados por um genoma de ARN positivo de cadeia única. Os membros desta família de vírus que incluem os poliovírus, ecovírus, coxasacovírus e rinovírus. Entre estes vírus os que têm sido estudados de forma mais aprofundada são os poliovírus.
Os poliovírus são conhecidos por causarem a poliomielite, uma doença paralisante do sistema nervoso central. Conhecem-se três serotipos estáveis, 1,2 e 3, destes vírus. Desde há mais ' de 25 anos que esta doença tem sido controlada pela aplicação da vacina viva oral atenuada Sabin e vacina de vírus inactivada de Salk. A vacina de Sabin ê constituída por vírus atenuados de cada um dos serotipos, nenhum dos quais capaz de provocar a doença. A estirpe utilizada para produzir a vacina foi criada por uma associação de muitas passagens in vivo e in vitro de cada uma das três estirpes de tipo natural em tecido de macaco. Após a administração oral, o vírus vivo contido na vacina de Sabin replica-se no intestino induzindo, portanto, imunidade sistémica local. 0 vírus morto, vacina de Salk, ê administrado por via intramuscular e limita-se a induzir a imunidade sistémica.
Embora se considere a vacina Sabin como segura e oferecendo protecção eficaz contra a poliomielite, um número reduzido de receptores tem desenvolvido doenças associadas com a vacina.
Num esforço de entender a base molecular da atenuação e inversão, compararam-se as sequências nucleótídicas de cADNs correspondentes a cada uma das três estirpes atenuadas e suas progenitoras naturais A. Nomote et al., Complete Nucleotide Sequence of the Attenuated Sabin 1 Strain Genome, Proc. Natl. Acad. Sei USA 79, pp. 5793-97 (1982); G. Stanway et al., Nucleic Acid Sequence of the Region of the Genome Encoding Capsid Proteín VP1 Of Neu rovirulent and Attenuated Type 3 Poiioviruses, Eur. J. Biochem.. 135, pp. 529-33 ( 1983); G. Stanway et al., 11 Comparison of the Complete Nucleotide Sequences of the Genomes of the Neurovirulent Poliovirus P3/Leon/37 and its Attenuated Sabin Vaccine Derivative
-3P3/Leon 12ab, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, pp. 1539-43 (1984); e H. Toyoda et al., Complete Nucleotide Sequences of Ali Three Poliovirus Serotype Genomes, J. Mol. Biol, 174 pp. 561-585 (1984) J. As diferenças observadas nas sequências nucleótíticas entre cada progenitor natural e a sua estirpe atenuada resultante foi depois analisada para se determinar a sua relação com o fenómeno de actuação.
No serotipo 3, por exemplo, a estirpe atenuada diferia da estirpe natural apenas por 10 mutações pontuais [ G. Stanway et al., (1984), Supra ]. Destas diferenças, apenas as alterações nas posições dos nucleotidos 472 e 2034 foram consideradas intimamente associadas com a atenuação / D.M.A. Evans et al., Increased Neurovirulènce - Associated With a Single Nucleotide Change In A Noncoding Region of the Sabin Type 3 Poliovirus Genome, Nature, 314, pp. 548-50 (1985); G.D. Westrop et al.,
Genetic Basis of Attenuation of the Sabin Type 3 Oral Poliovirus Vaccine, J. Virol, 63, pp. 1338-44 (1989)7Antes da identificação dos nucleotidos que estão ligados com a atenuação, demonstrou-se que cADN sintetizado a partir de uma matriz virai de ARN (cADN de vírus ARN) podia ser utilizado para produzir poliovirus viáveis após transfecção de células de mamíferos £ V.R. Racaniello et al., Cloned Poliovirus Complementary DNA Is Infections In Mammalian Cells, Science, 214, pp. 916-19 (1981)7- Estas observações criaram a possibilidade da produção melhorada de poliovacinas mediante a aplicação de técnicas de recombinação genética. Estas puderam alcançar-se por alteração de cADN ã volta de nucleotidos cruciais de forma a minimizar a inversão para o nucleótido do tipo primitivo embora
-4\ mantendo a integridade estrutural e funcional do vírus. ·*
Apesar da descorberta de que se pode utilizar cADN de vírus de ARN, nunca ficou demonstrado que estes cADNs são cópias rigorosas do ARN virai presente no vírus natural ou vírus da vacina. Contudo, o uso de sequências de cADN para se determinar quais os nucleótidos ligados com a atenuação, pode ter causado umà ou mais sítios críticos para serem examinados. Isto porque o processo utilizado para a produção de cADN, designadamente a transcrição inversa, sabe-se estarem sujeitos a erros £ I.M. Verma, Reverse Transcriptase, In The Enzymes, Vol. 14,
P.D, Boyer, ed. Academic Press, New York, pp. 87-104 (1981) J.
Deste modo, existe a necessidade de se produzir cADN de vírus de ARN que sejam verdadeiramente complementares ao ARN do vírus da vacina. Além disso, a aplicação de cADN de vírus de ARN incorrectos pode resultar na redução da atenuação se estes cADNs se destinarem à produção de vacinas, tais como a vacina da polio.
genoma de poliovírus é constituído por uma molécula de ARN de cadeia única de sentido positivo com, aproximadamente,
7500 nucleótidos de comprimento. A frequência de erro associada com a replicação de ARN de cadeia única, como para poliovírus, é especialmente elevada quando se compara com o ADN de cadeia dupla (3). Devido a esta propriedade inerente, cada preparação de poliovírus incluindo as estirpes originais Sabin (SO) deve ser considerada heterogénea relativamente ao genotipo.
As condições culturais, isto é, a temperatura, substrato celular, assim como à homogeneidade da produção do vírus, são
provavelmente influenciadas pelo genotipo predominante durante a ampliação de uma amostra de poliovírus. Não é, portanto, surpreendente que as autoridades que regulam a preparação de OPVs, (isto é, a FDA e WHO) estabeleçam orientações rigorosas relativamente à produção e preparação de sementeiras, assim como aos níveis de passagem das sementeiras representadas na vacina (22,26) Estes regulamentos foram estabelecidos para minimizar a selecção e ampliação das variantes menos atenuadas.
Tem sido bem documentado que o fenotipo atenuado da estirpe 3 de Sabin é geneticamente menos estável que os tipos das estirpes das vacinas 1 e 2 (4, 7, 11). No passado, a preparação de uma nova sementeira (RSO) foi derivada de um vírus 3 de Sabin original, por selecção de uma placa produzida em monocamadas celulares de rim de macaco Vervet extraídas de ARN infeccioso (19).
isolado foi escolhido com base na estabilidade acrescida da sua sensibilidade para desenvolvimento à temperatura de 40,3°C (marcador rct) durante passagens em série assim como a atenuação aumentada nos macacos. E ainda aplicado como teste biológico in vitro a sensibilidade do crescimento a temperaturas superiores a 37°C afim de se analisar a qualidade das estirpes de vacina (rct. marcador) (13).
Um relatório de Kohara et al., (9) sugere que um clone de cADN infeccioso pode ser utilizado para preservar a constância e qualidade da sementeira 1 de Sabin. E credível que uma via idêntica possa também beneficiar a estirpe do tipo 3 atenuada. Até recentemente, a bibliografia referia duas sequências de cADN para Sabin 3 que diferiam nas posições dos nucleótidos 17 e 21. A divergência entres estas sequências pode ser devida à utilização de derivador de passagem e isolados clonaís de Sabin 3 do que ao
vírus da vacina real para preparar os clones de cADN.
RESUMO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona uma vacina útil para imunização de indivíduos, por exemplo, seres humanos, contra infecções por poliovírus, a qual consiste em uma quantidade eficaz de um vírus de ARN produzido por transformação de uma célula hospedeira apropriada com uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica para o vírus; e isolamento do vírus produzido deste modo, eficaz para imunizar esse indivíduo.
Além disso, a presente invenção proporciona um método de imunização do indivíduo tal como o ser humano contra poliovírus infecciosos, o qual consiste na administração a esse indivíduo de uma dose apropriada da vacina citada anteriormente.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 representa o perfil cromatografico de cADN de primeira cadeia sintetizado a partir de ARN da estirpe 3 de poliovírus em uma coluna de Sefarose CL-4B.
A Figura 2 representa clones de cADN mapiados para o genoma P3/Sabin.
A Figura 3 representa a estratégia para a reunião de cADNs parciais em um cADN único de comprimento completo P3/Sabin de acordo com a presente invenção.
-7Ά Figura 4 (painéis A e B) e a Figura 5, conjuntamente, representam a estratégia para a mutagênese de cADN P3/Sabin e a construção de um cADN verdadeiro de comprimento total P3/Sabin de acordo com a presente invenção.
A Figura 4, painel C, representa o seguinte: a sequência de pLED3 representada na Figura 6, A-J deduzido da análise completa de pVR318 que tinha sido depois alterado na posição 2493 por troca de um fragmento SaCI/HindIII do mesmo sub-clone (pLL3-271) utilizado para a construção de pVR318. Contudo, a sequência confirmadora da sequência total de cADN no plasmideo pLED3 revelou uma adenosina A numa região onde um conjunto de 6 adenosinas se encontra normalmente no genoma virai (posições 4133-4138). A adenosina errada A também se encontrou no sub-clone pLL3-271. 0 pVR318 foi mantido para construir o pLEDg-318 e contém o número correcto de adenosinas neste sítio.
Afim de se construir pLEDg com o número correcto de adenosinas, foi clonado um fragmento SaCI/HindIII de pLL3-271 utilizado anteriormente, no bacteriófago M13 para mutagênese oligonucleótidica de delecção dirigida. Para este fim, foi sintetizado um oligonucleótido distribuindo-se desde os nucleótidos 4121 até 4150. 0 oligonucleótido tem a sequência:
5' -CGCCTCAGTAAATTTTTTCAACCAACTATC-3'.
A mutagênese foi realizada utilizando-se um conjunto de mutagenese in vitro T7-GEN (United States Biochemica, Clevelend Ohio) seguindo-se as indicações do preparador. A inserção mutagenizada foi designada por CB2 e demonstrou-se possuir seis adenosinas nas posições 4133 e 4138 assim como C na posição 2493, de-
terminado por análise de sequência. A construção total corrigida foi preparada por ligação do fragmento SaCI/HindlII de CB2 ao fragmento de digestão parcial SaCI/HindlII de pVR318 que tinha sido utilizada na construção inicial de pLED3. 0 produto desta ligação foi designado por pLED3.2. A sequência de cADN inteira de pLED3.2 tinha sido verificada para formar a sequência referida na Figura 6, de A a J.
A Figura 6, painéis de A a J, representa a sequência nucleótídica de um cADN de estirpe da vacina de poliovírus do tipo 3 verdadeiro de acordo com a presente invenção.
A Figura 7, painel A descreve a estrutura do plasmídeo que contém cADN LED3 de comprimento completo e o promotor de T7 ARN polimerase. A grande área sombreada representa cADN de poliovírus. Uma pequena área aberta indica o promotor T7 (pT7) e o sítio de início para a transcrição in vitro de polaridade positiva de cADN. 0 plasmídeo é cortado com PVuI (sítios representados) antes de serem sintetizadas as transcrições. 0 painel B representa ARNs transcritos de clones de cADN por ARN polimerase T7 purificada. Porções da mistura reaccional de transcrição foram analisadas por electroforese em um gel de agarose 0,6% como descrito em Material e Métodos, Exemplo 13. As faixas de 1 a 3 representam 0,75 jig, 0,50 e 0,25 jjg de um marcador ssARN de 7,5 Kb, respec tivamente. ADN de fago lambda digerido com HindIII está representado na faixa 4. As faixas 5 e 6 representam reacções de transcri ção que contêm pLED3 digerido com Pvul e matrizes pVR318, respectivamente. Na faixa 7 representa-se ARN extraído do aglomerado de viriões.
-9ς
A Figura 8, representa a electroforese em gel de poli- r % acrilamida SDS de vírus derivados de cADN LED3 e VR318. Uma amosq c tra marcada com S J7 metionina foi preparada e introduzida na faixa e resolvida por electroforese como descrito posteriormente. 0 gel foi seco e as bandas de proteína visualizadas por auto-radiografia. 0 vírus LED3 nas faixas A; o vírus VR318 nas faixas B. As posições de marcadores de massa molecular previamente corada (Kilodaltons) estão indicados à esquerda. As posições das proteínas da cápsid virai estão identificadas à direita.
A Figura 9, representa o fenotipo da placa de vírus Leon (tipo natural), vírus de VR318 e vírus LED3 em células Vero.
Após a incubação à temperatura de 33,5°C durante 3 dias sob nutriente de agar a 1,0%, as células foram coradas com vermelho neutro para visualização das placas.
A Figura 10 representa as cinéticas de desenvolvimento de vírus à temperatura de 33,5°C. As monocamadas de células Vero foram infectadas com MOI de 4 e um extracelular foi colhido nos tempos indicados pós-infecção. Utilizaram-se ensaios em placa para determinar o título das partículas infecciosas por ml como descrito em Materiais e Métodos, Exemplo 13.
0-O> LED3; A---------Δ ’ VR318.
A Figura 11 representa a estabilidade térmica dos vírus LED3 e VR318 a várias temperaturas. As amostras de vírus que continham aproximadamente 10 ’ unidades formadoras de placa/ml foram incubadas a uma temperatura de 22°C (círculos), 37°C (quadrado) e 42°C (triângulo). As amostras foram retiradas periódica- „ mente e o título do vírus infeccioso foi determinado pelo ensaio em placas. Marcas a tracejado, LED3; marcas a cheio VR318.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona um método para a produção de cADN de vírus de ARN verdadeiro que consiste nas fases de (a) isolamento de ARN genómico a partir de uma fonte de vírus de ARN; (b) utilização de meios de sequenciação de ARN para determinar a sequência nucleotídica de uma porção de ARN genómico isolado; (c) utilização de meios de síntese de cADN para produzir cADN de dupla cadeia a partir de ARN genómico isolado; (d) utilização de meios de sequênciação de ADN para determinar a sequência nucleotídica duma porção do cADN em que a porção de cADN corresponde à porção de ARN sequenciada na fase (b); (e) comparação de cADN sequenciado com ARN sequenciado para determinação das diferenças principais na sequência nucleotídica; e (f) alteração das diferenças importantes no cADN para se produzir cADN de vírus de ARN verdadeiro.
A presente invenção também proporciona um método para a produção de cADN de vírus de ARN que consiste nas fases de a) isolamento de ARN genómico proveniente de vírus duma fonte de ARN, b) utilização de meios de sequenciação de ARN para determinação da sequência nucleotídica de uma porção de ARN genómico isolado, citado, c) utilização de meios de síntese de cADN para produção de cADN de cadeia dupla a partir do referido ARN genómico isolado, d) utilização de meios de sequenciação de ADN para determi^^ *
nação da sequência nucleótídica de uma porção do cADN referido em que a referida porção do cADN, citado, corresponde à porção referida de ARN sequenciado, citado antes, na fase b), e) comparação de cADN sequenciado citado antes com o ARN sequenciado também citado antes para se determinar as principais diferenças da sequência nucleótídica e a alteração dessas diferenças principais no cADN citado para a produção de cADN de vírus de ARN.
A presente invenção também proporciona métodos, descritos anteriormente, em que o vírus de origem de ARN é um Picornavírus, tal como um poliovírus da estirpe 3 da vacina.
No aspecto da presente invenção, a fracção de ARN sequenciada na fase (b) consiste em 2493 nucleotídos de uma estirpe de vacina poliovírus 3. Numa outra forma deste aspecto, o ARN consiste em cerca de 100 a 200 nucleotídos. Alternativamente, a sequência nucleótídica do ARN virai isolado completo é determinada na fase (b).
A presente invenção proporciona também um cADN de vírus de ARN verdadeiro ou um cADN de vírus de ARN produzido pelos métodos descritos anteriormente. Por exemplo, um vírus de um cADN de vírus de ARN verdadeiro ou um cADN de vírus de ARN pode ser produzido de forma que derive de uma estirpe de vacina poliovírus 3, sendo o cADN escolhido entre o que está contido em um novo plasmídeo designado por pLED3.2 ou pLED3, respectivamente ou cADNs que codificam uma expressão para polipeptidos codificados para a expressão, por pLED3.2 ou pLED3, respectivamente, e, deste modo, produzindo-se a molécula de ADN recombinante.
-12/
A molécula de ADN recombinante pode ser ligada de forma operacional a um promotor de transcrição de ARN. Promotores apropriados incluem o promotor T7, mas não estão limitados a este.
A presente invenção também proporciona um hospedeiro transformado com uma molécula de ADN recombinante, descrita anteriormente, em que o hospedeiro é escolhido do grupo que consiste em bactérias, tais como E. coli, leveduras ou outros fungos, células de insectos e células de animais·; As células de animais apropriadas incluem as células Vero, células Hela, células COS, células CV-1 e células primárias de rim de macaco.
A presente invenção ainda proporciona um método para a produção de um vírus de ARN viável que consiste nas fases de;
(a) cultura de uma hospedeira, citada anteriormente, sob condições que permitem a produção de vírus de ARN viável; e (b) recolha do vírus de ARN viável a partir da cultura da célula hospedeira.
A presente invenção proporciona um método para a produção de um vírus de ARN viável que consiste nas fases de : (a)
-13utilização de meios de transcrição in vitro para se produzir a ARN a partir de uma molécula de ADN recombinante, citada anteriormente, (b) isolamento de ARN; (c) transfecção de uma hospedeira com ARN isolado em que a hospedeira constitui uma célula animal; (d) cultura da célula hospedeira sob condições que permitem a produção de vírus de ARN viável; e (e) recolha do vírus de ARN viável a partir da cultura da célula hospedeira. Por exemplo, a estirpe da vacina poliovírus 3 pode ser utilizada e o hospedeiro pode ser uma célula primária de rim de macaco.
A presente invenção proporciona também um método para a produção de um vírus de ARN viável que consiste nas fases de: (a) transfecção de um hospedeiro com cADN de vírus de ARN em que o cADN é escolhido entre o que está contido nos plasmídeos pLED3 ou pLED3.2 ou cADNs que codificam para a expressão de polipeptidos codificados para a expressão por pLED3 ou pLED3.2, em que o referido hospedeiro é uma célula animal; (b) cultura do hospedeiro citado sob condições que permitem a produção de vírus de ARN viável a partir da cultura da célula hospedeira, citada anteriormente.
A presente invenção ainda proporciona um vírus de ARN produzido pela transformação de uma célula hospedeira apropriada com uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica para o vírus; cultura da célula hospedeira sob condições que permitem a produção do vírus; e isolamento do vírus produzido deste modo.
Em um aspecto da presente invenção, o vírus de ARN pode ser uma estirpe da vacina poliovírus 3 e a sequência de ácido
-14nucleico recombinante é uma sequência de ácido nucleico completa infecciosa recombinante que codifica para o vírus; cultura da célula hospedeira sob condições que permitem a produção do vírus; e isolamento do vírus obtido deste modo.
Num aspecto da presente invenção, o vírus de ARN pode ser uma estirpe da vacina, poliovírus 3, e a sequência de ácido nucleico recombinante é uma sequência de..ácido nucleico completo infeccioso recombinante que codifica para a estirpe da vacina, poliovírus 3.
Um método de sondagem para variantes de uma estirpe de poliovírus 3, também é proporcionada de forma que consiste nas fases seguintes; (a) isolamento de ARN genómico do poliovírus;
(b) utilização de meio de sequenciação de ARN para se determinar o nucleotido na posição 2493.
Esta invenção também proporciona um método para aumentar a atenuação de uma estirpe de poliovírus 3 codificada por um cADN de vírus de ARN, em que o cADN consiste em uma sequência nucleotídica ATT nas posições 2492 e 2493, método que consiste na fase de mutagénese de cADN no nucleotido 2493 para modificação de T para C. Em um outro aspecto desta invenção, o método pode ainda conter uma fase de mutagénese de cADN no nucleotido 2494 para modificação de T para um nucleótido escolhido no grupo constituído por A, C e G.
A presente invenção proporciona uma vacina útil para o imunização de um indivíduo, por exemplo, de um ser humano, contra infecções por poliovírus, cuja vacina consiste numa quantidade eficaz de um vírus de ARN, produzido pela transformação de uma cé
-15v lula hospedeira apropriada com uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica para o vírus; cultura da célula hospedeira sob condições que permitem a produção do vírus; e isolamento do vírus produzido deste modo de forma a imunizar eficazmente um indivíduo conjuntamente com um veículo apropriado. 0 vírus da ARN pode ser uma estirpe da vacina poliovírus 3 e a sequência de ácido nucleico recombinante é uma sequência de ácido nucleico completo, infeccioso, recombinante que codifica para a estirpe da vacina poliovírus 3.
A sequência de ácido nucleico recombinante que codifica para o vírus de ARN pode ser uma sequência de ADN ou uma sequência de ARN ou, em um aspecto preferido desta invenção, a sequência de ácido nucleico recombinante é uma sequência de cADN. cADNs apropriados são os plasmídeos designados por pLED3.2 ou pLED3, cada um dos quais contém um promotor ligado à sequência de ácido nucleico de cADN que codifica para a estirpe da vacina poliovírus
3. 0 plasmídeo pLED3 foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC), localizada em 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland, 20852, sob as condições do Tratado de Budapeste na International Recognition of the Deposit of Microorganisms para fins de Processo de Patente. 0 plasmídeo pLED3 foi depositado em 17 de Abril de 1990 e foi designado com o número de aceitação 40789.
plasmídeo pLED3.2 foi depositado na ATCC nas e sob as condições do Tratado de Budapeste e foi designado com o N9 de Aceitação.
As células hospedeiras apropriadas incluem células de bactérias como E. coli, leveduras ou outros fungos, células de insectos e células de animais mas não se limitam a estas.
-Ç.
As células de animais apropriadas incluem as células Vero, células Hela, células COS, células CV-1 e células primárias de rim de macaco mas não se limitam a estas.
Veículos apropriados podem ser meios de cultura equilibrados fisiologicamente, tais como, soluções de cloreto de sódio contendo agentes estabi1izantes, por exemplo, dextrose ou lactose ou outras substâncias não tóxicas. Estas vacinas podem ainda conter agentes adjuvantes apropriados tais como alúmen. Para os métodos de preparação de vacinas, consultar J.I. Duffy, Vaccine Preparation Techniques, Noyes Data Corporation (1980), e G.W.
Warr, Preparation of Antigens and Principies of Immunization, em J.J. Marchalonis e G.W. War. eds., Antíbody As A Tool -The Applications of Immunochemistry, pp. 21-58, John Wiley & Sons (1982).
Os vírus de ARN podem ser dissecados, por exemplo', por liofilização para armazenagem ou para composições subsequentes sob a forma de vacinas líquidas.
A presente invenção também proporciona um método para imunização de um indivíduo, tal como um ser humano, contra poliovírus infecciosos, método que consiste na administração a um indivíduo de uma dose apropriada da vacina, descrita anteriormente Métodos apropriados para administração de vacina são os métodos convencionais conhecidos. Contudo, a título de exemplo, estes métodos podem incluir a administração intramuscular, endovenosa, subcutânea, intra-traqueal ou intranasal, mas não se limitam a estas vias de administração.
-17Adicionalmente, uma quantidade para imunização eficaz, consiste numa quantidade necessária para provocar a produção de anticorpos pelo indivíduo, conferindo-lhe deste modo, protecção contra poliovírus infecciosos ou poliomielite.
Através deste pedido de patente de invenção, as referências a nucleótidos específicos nas moléculas de cADN são aos nucleótidos presentes na estirpe codificadora do cADN, isto é, a estirpe que tem uma sequência equivalente à cadeia de ARN no vírus de ARN. As referências a números de posição de nucleótidos específicos na estirpe poliovírus 3 seguem o sistema de numeração de nucleótidos de G.Stanway et al., Comparisom of the Complete Nucleotide Sequences of the Genomes of the Neurovirulent Poliovirus P3/Leon/37 and its Attenuated Sabin Vaccine Derivative P3/Leon 12 alb, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81, pp. 1539-43 (1984).
As abreviaturas padrão são as utilizadas nestas memória descritiva e nas reivindicações para a indicação dos nucleótidos específicos :
C - citosina A - adenosina
T - timidina G - guanosina
U - uracilo
A designação Vírus de origem refere-se a vírus de ARN a partir do qual o ARN é isolado e utilizado como uma matriz para a produção de cADN. A designação de atenuação acrescida é utilizada para indicar uma taxa menor de inversão para o fenotipo neuroviru1ento do que as estirpes de vírus de vacina convencionais.
-18A designação cADN de vírus de ARN verdadeiro é utilizada aqui para referir um cADN que dirige a produção de vírus de ARN viável que é fenotípicamente idêntico ao vírus de origem, deste modo, a presente invenção abrange moléculas de cADN que, em virtude da redundância do código genético, são caracterizadas por uma sequência nucleotídica que difere do ARN de vírus original, mas que codifica polipeptidos, que contêm as mesmas sequências de aminoácidos que as codificadas pelo ARN de vírus original.
A presente invenção também abrange cADNs que codificam sequências de aminoácidos que diferem dos polipeptidos de vírus de origem mas que não produzem modificações fenotipicas. Pósteriormente, estas sequências de aminoácidos alteradas mas fenotípicamente equivalentes são referidas como sequências de aminoácidos equivalentes. E a presente invenção abrange moléculas de cADN caracterizadas por modificações em regiões não codificadoras que não alteram o fenotipo do vírus de ARN, produzido deste modo, quando se compara com o vírus original. As diferenças entre a sequência nucleotidica de um cADN de vírus de ARN e o ARN de vírus original que resulta diferenças no fenotipo do vírus produzido deste modo, são posteriormente referidas como diferenças fundamentais.
A presente invenção proporciona um método para a produção de cADN de vírus que consiste nas fases de: (a) isolamento de ARN genómico de um vírus inicial de ARN, (b) utilização de meios de sequenciação de ARN para determinar a sequência nucleotídica de uma porção do ARN genómico isolado, (c) utilização de meios de síntese de cADN para a produção de cADN de cadeia dupla, a partir de ARN genómico isolado, (d) utilização de meio de sequênciação
-19de cADN para determinar a sequência nucleótídica de uma porção de cADN, em que essa porção de cADN corresponde à porção de ARN sequenciado na fase (b), (e) comparação do cADN sequenciado com ARN sequenciado para determinação das diferenças fundamentais na sequência nucleótídica, e (f) alteração das diferenças fundamentais no cADN para se produzir cADN de vírus de ARN. No aspecto desta invenção, o vírus de ARN é um vírus de ARN verdadeiro e em outro aspecto desta invenção o vírus de ARN é um vírus fenotipicamente equivalente. Em um aspecto desta invenção, o vírus de ARN original é um Picornavírus, por exemplo, uma estirpe da vacina poliovírus 3.
A presente invenção também proporciona um método, como descrito anteriormente, em que a porção de ARN sequenciada na fase (b), consiste em 2493 nucleótidos de uma estirpe da vacina poliovírus 3, ou, de preferência, em que o ARN consiste em 100 a 200 nucleótidos aproximadamente.
Em um outro aspecto desta invenção, o método descrito anteriormente, em que a sequência nucleótídica do ARN virai isolado é completo, determina-se na fase (b).
método da presente invenção pode ser utilizado também para a produção de cADN de vírus de ARN mediante a alteração de nucleótidos em regiões vãrias do genoma do poliovírus, por exemplo, para a correcção de mutações introduzidas na região codificadora para o terminal amino de VP1 do poliovírus Mahoney do tipo 1 C K. Kirkegaard, Mutatíons in VP1 of Poliovírus Specifically Affect Both Encapsulation and Release of Virai RNA, J. Virology, 64, pp. 195-206 (1990) J.
-20Também proporcionado por esta invenção é um cADN de vírus de ARN produzido por qualquer dos métodos descritos anteriormente que podem incluir, mas que não estão limitados a um cADN de vírus de ARN derivado de uma estirpe da vacina poliovírus 3, sendo esse cADN escolhido no grupo constituído por pLED31 ou pLED3.2 e cADNs que codificam a expressão para polipeptidos codificados na expressão por pLED3 ou pLED3.2.
Esta invenção ainda proporciona uma molécula de ADN recombinante que consiste em um cADN de vírus de ARN, como citado anteriormente, que pode incluir, mas que não está limitado a uma molécula de ADN recombinante em que o cADN de vírus de ARN é ligado de forma operacional a um promotor de transcrição de ARN tal como o promotor T7.
Proporciona-se ainda um hospedeiro transformado com uma molécula de ADN recombinante, citada anteriormente, em que esse hospedeiro é recolhido do grupo que consiste em bactérias, leveduras e outros fungos, células de insectos e células animais.
Num aspecto preferido da presente invenção, o hospedeiro é uma célula animal que é escolhida do grupo que consiste em células Vero, células Hela, células COS, células CV-1 e células primárias de rim de macaco. Em um outro aspecto desta invenção a célula hospedeira é uma E. coli.
A presente invenção proporciona também um método para a produção de vírus de ARN viável que consiste nas fases seguintes: cultura de uma hospedeira citada anteriormente, sob condições que permitem a produção de um vírus de ARN viável e recolha do vírus de ARN viável a partir da cultura da célula hospedeira. Es-21- -Ά
Ο ta invenção também proporciona um método para a produção de um * vírus de ARN viável que consiste nas fases de utilização de meios de transcrição in vitro para produção de ARN a partir de uma molécula de ADN recombinante, descrita anteriormente, isolamento de ARN, transfecção de um hospedeiro com o ARN isolado, em que esse hospedeiro consiste numa célula animal, cultura do hospedeiro sob condições que permitem a produção de vírus de ARN viável e recolha do vírus de ARN viável a partir da cultura da célula hospedeira. Num aspecto preferido desta invenção, o vírus de ARN é um vírus da vacina da estirpe poliovirus 3, e o hospedeiro é uma célula primária de rim de macaco, método de sondagem para variantes de uma estirpe de poliovirus 3, é proporcionada por esta invenção, o qual consiste nas fases de isolamento de ARN genómico a partir de poliovirus, e utilização de meios de sequenciação para se determinar o nucleótido na posição 2493.
Esta invenção ainda proporciona um método para aumentar a atenuação de uma estirpe de poliovirus 3, codificada por cADN de vírus de ARN em que o cADN consiste em uma sequência nucleótidica ATT nas posições 2492 a 2494, e o método consiste na fase de mutagénese de cADN no nucleótido 2493 para modificação de T para C. Este método pode ainda compreender a fase de mutagénese de cADN no nucleótido 2494 para modificação de T para um nucleótido escolhido no grupo constituído por A, C e G.
Para a determinação das diferenças no fenotipo podem aplicar-se vários métodos conhecidos. De preferência, um cADN de vírus de ARN verdadeiro de uma estirpe atenuada de poliovirus 3,
-22codificam um vírus que tem o mesmo grau de atenuação do vírus X original. Podem ser utilizados vários marcadores bem caracterizados para determinação das modificações no fenotipo numa estirpe de poliovírus. Estes são marcadores d, os que regulam a capacidade do vírus para se desenvolver sob condições ácidas C M.
Vogt et al., Mutants of Poliomyelitis Viruses With Reduced Efficiency of Plating in Acid Médium and Reduced Neuropathogenicity, Virology, 4, pp. 141-55 (1957)7; θ marcador rct^ que regula a capacidade do vírus para se desenvolver a temperaturas elevadas [ h. Lwoff, Factors Influncing the Evolution of Virai Diseases at the Cellular Levei and in the Organism, Bact. Rev., 23, pp. 109-24 (1959) 7.
método mais preferido para determinação das modificações no fenotipo entre uma estirpe atenuada de poliovírus original e o vírus produzido a partir de cADN de vírus de ARN verdadeiro, é a comparação da neurovirulência. São conhecidos vários protocolos para a avaliação da neurovirulência [ Code of Federal Regulations, Title 21, Chapter 1, pp. 91-93 (April 1, 1987 edition) 7Produção de um cADN de vírus de ARN verdadeiro
De acordo com um aspecto da presente invenção, descreve-se um método para a produção de cADN de vírus de ARN verdadeiro.
A produção de um cADN de vírus de ARN verdadeiro de acordo com esta invenção pode utilizar qualquer vírus de origem de ARN - cadeia única positiva, cadeia única negativa ou dupla cadeia. De preferência, o vírus de origem é um vírus de cadeia única positiva.
-23Com maior preferência o vírus é um enterovírus humano pertencente à família dos Picornaviridae. Ainda mais preferido é um tipo atenuado da estirpe da vacina do tipo poliovírus 3 (aqui também referido como P3/Sabin).
A. Proliferação e Isolamento de Vírus
A fase inicial na produção de cADN de vírus de ARN verdadeiro, envolve a proliferação e purificação do vírus original e o isolamento do ARN daí obtido. As técnicas para a proliferação e isolamento do vírus são bem conhecidas dos técnicos [ R.J. Kuchler Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., Strovdsburg, PA (1977) J. É bem entendido que o método de desenvolvimento virai, incluindo a escolha da célula hospedeira, selecção de um meio de crescimento e condições de desenvolvimento, diferem dependendo do vírus original em causa. Num aspecto preferido, a estirpe de poliovírus 3 atenuada prolifera em células primárias de rim de macaco, de acordo com métodos conhecidos /* A. Sabin et al., Studies on Variants of Poliomyelitis Virus, J. Exp. Med., 99, pp. 551-76 (1954) J. Os processos seguintes são aplicáveis para qualquer estirpe de poliovírus. Contudo, o uso de um vírus original de ARN alternativo, nestes processos pode requerer certas modificações específicas do vírus que são conhecidas para os técnicos.
A proliferação virai do vírus de ARN é permitida para avançar para um ponto em que uma quantidade suficiente de vírus pode ser recolhida por isolamento de ARN. 0 meio de cultura que contém o vírus original é depois recolhido e os fragmentos célula-
res removidos, de preferência, por centrifugação com uma velocidade que não aglomere o vírus. Esta é habitualmente cerca de 2.500 rpm durante cerca de 20 minutos. Em seguida, pode ser purificado o sobrenadante por uItrafi1 tração aplicando-se um filtro contendo um poro maior que as partículas virais. De preferência, o filtro utilizado é de 0,22 yuM, aproximadamente.
Após a filtração, as partículas virais são recolhidas por precipitação com polietílenoglicol, seguidas de centrifugação ou, com maior preferência, por centrifugação a alta velocidade, cerca de 70.000 rpm. As partículas virais são em seguida ressuspensas num pequeno volume de tampão, de preferência TNE (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4). Pode utilizar-se um agente tensioactivo não iónico, eventualmente adicionado à suspensão de partículas virais para dissolver quaisquer contaminações. Embora o aglomerado virai proveniente da alta velocidade, seja suficientemente puro para se utilizar como uma ponte de ARN virai, pode, eventualmente, purificar-se mais a suspensão virai, mediante a centrifugação com um gradiente de densidade de sacarose.
Se se utilizar a centrifugação com um gradiente de densidade, as fracções são recolhidas do gradiente e analisadas para determinação da presença do vírus inicial. Pode-se utilizar qualquer ensaio convencional que detecte as proteínas específicas do vírus original. Estes ensaios, incluem, por exemplo, as manchas Western, ELISA, ensaio de radioimunidade, ou electroforese em gel de poliacrilamida e a comparação com um padrão de vírus original. Esta última técnica é a mais preferida porque é a mais económica.
-25B. Isolamento e Sequenciação de ARN Virai
Uma vez purificado o vírus, como descrito anteriormente pode depois isolar-se o ARN virai. Isto consegue-se por dissociação, primeiro das proteínas da cãpside virai, mediante o tratamento com o agente tensioactivo, de preferência, dodecil sulfato de sódio (SDS) com uma concentração final de 0,5%. As proteínas dissociadas são depois extraídas por tratamento da amostra com dissolventes orgânicos. A extracção consegue-se, de preferência, com uma mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico. 0 ARN presente na fase aquosa, pode depois isolar-se por qualquer método convencional £ T. Maniatis, The Molecular Guide To Cloning, Cold Spring Harbor Press (1983) J. De preferência,- o ARN virai é precipitado com 0,5 volumes de acetato de amónio 7,5 M e 2,5 volumes de etanol à temperatura de -20°C. A quantificação e integridade do ARN virai pode ser determinada por electroforese em gel de agarose. Deve notar-se que, tal como bem se conhece, das técnicas de biologia molecular, deve tomar-se grande cuidado na preparação e manuseamento das amostras de ARN devido à prevalência de RNases. Os métodos para a inactivação de RNases que podem estar presentes nos reagentes e nos recipientes utilizados na preparação de ARN são métodos conhecidos T. Maniatis. supra 7.
Uma vez isolado o ARN de vírus original, este é submetido a sequenciação nucleótidica didesoxi [ F. Sanger et al., DNA Sequencing With Chain-Terminating Inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-67 (1977) £ que utiliza modificações para ARN £ D.c. Deborde et al., Resolution of A Common ARN Sequencing Ambiguity By Terminal Deoxinucleotidyl Transferase, Anal. Biochem,
-26- ,
157, ρρ. 275-82 (1986) }. De acordo com um aspecto preferido desta invenção, o genoma total de ARN total do vírus é sequenciado e comparado com a sequência de cADN por métodos que são descritos aqui posteriormente. Neste aspecto, desta invenção o vírus inicial é com maior preferência um poliovírus do tipo 3 da estirpe da vacina associado.
C. Síntese e Sondagem de uma Biblioteca de cADN de vírus ARN
Após a sequenciação de ARN, o ARN de vírus original ê utilizado como uma matriz para a síntese de um cADN de cadeia dupla de comprimento total. Para sintetizar o cADN pode utilizar-se qualquer método convencional ou qualquer conjunto para síntese de ADN comercializado. De prefeência o cADN é sintetizado pelo método de V.R. Racaniello et al., Molecular Cloning of Poliovírus cADN and Determination of the Complete Nucleotide Sequence of the Virai Genome, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, pp. 4887-91 (1981). Para facilidade de detecção, as primeiras cadeias de cADN podem ser, eventualmente, marcadas com radioactividade utilizando-se um nucleótido radioactivo durante a síntese de cADN. Uma vez sintetizado, o cADN de cadeia única é, de preferência, fraccionado quer por electroforese em gel agarose ou, mais preferencialmente, por cromatografia em gel. Os cADNs maiores são isolados e utilizados como matrizes para a síntese da segunda cadeia. Em seguida, é fraccionado o cADN de cadeia dupla, como descrito anteriormente e as moléculas maiores são utilizadas para a criação de uma biblioteca de cADN de vírus original. Os cADNs são depois acrescentados
-27quer pelo método de óleo dG/dC ou pela adição de adaptadores de enzimas de restrição e clonados em um vector apropriado. A escolha do vector depende da técnica a utilizar para a sondagem da biblioteca. Por exmeplo, o uso de uma técnica de imunosondagem requer que o cADN se insira em um vector de expressão, tal como gt 11 lambda (número de aceitação da ATCC 37194). Se se utiliza um método de sondagem por hibridação, vectores tais como plasmídeos bacteríanos são os mais convenientes. De preferência, os cADNs são caldados pelo método óleo dG/dC e clonados em o sítio PstI de pBR322.
Uma vez criada a biblioteca de cADN de vírus de ARN, esta é sondada para detecção de um clone de cADN de comprimento total. Isto pode alcançar-se por métodos de sondagem conhecidos, tais como a sondagem com anti-corpos ou a hibridação com uma sonda marcada. A maior preferência é a sondagem da biblioteca por hibridação de colónias utilizando-se sondas de cADN específicas do vírus £ M. Grunstein et al., Colony Hybridization: A Method for the Isolation of Cloned DNAs That Contain A Specific Gene, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72, pp. 3961 -65 (1975) J, com base em sequências nucleótídicas conhecidas ou em sequências de aminoácidos do vírus. Uma vez identificado um clone contendo cADN de vírus de ARN e este isolado, pode ser removido do vector e analisado para determinação se este representa um cADN de vírus de ARN completo. Num aspecto preferido deste invenção, o cADN-dC, acrescentado é removido de um corte Pst I, um vector dG acrescentado por digestão com PstI. Os cADNs parcais podem ser utilizados para re- sondagem da biblioteca e para localizar cADN maio-28res ou de comprimento total. Se não se conseguem detectar cADNs ' completos, podem-se ligar vários cADNs parciais de diversas sobreposições que representam o genoma do vírus original completo conjuntamente, em sítios de restrição comuns para se obter um cADN completo £ V.R. Racaniello et al., Cloned Poliovírus cADN Is Infections In Mammalian Cells, Science, 214, pp. 916-19 (1981) ]. Qualquer porção do genoma virai que não é representada por um cADN isolado, pode ser sintetizado utilizando-se técnicas de síntese de oligonucleotidos padrão e ligados subsequentemente nas suas posições adequadas para se formar um cADN completo.
D. Sequenciação e Alteração de cADN para Corresponder a ARN de Vírus Original
Porções de cADN de comprimento completo que correspondem à porção sequenciada de ARN de vírus original são em seguida sequenciadas por métodos de sequenciação de ADN convencionais. Em seguida, comparam-se as regiões sequenciadas do ARN e de cADN de vírus de ARN. Teoricamente, o cADN deve corresponder exactamente à ARN que serviu como sua matriz. Contudo, é conhecido que a Trans criptase inversa pode causar erros quando na transcrição de cADN a partir de ARN fl‘.'M. Verma, Reverse Transcriptase, In The Enzymes, Vol. 14, P.D. Boyer, ed., Academic Press, New York, pp. 87-104 (1981) 7· Portanto, de acordo com o método desta invenção é necessário alterar a sequência nucleótídica do cADN de forma a corresponder ao ARN sequenciado.
A presente invenção abrange a alteração de sequência de cADN nos sítios que são responsáveis pelas modificações fenotípi-29cas. Deste modo, as fracções de cADN que codificam polipeptídos com sequências de aminoácidos equivalentes às codificadas pelo ARN de vírus inicial não necessitam ser alteradas. De preferência, qualquer mutação nucle tídica de cADN que podem potencialmente afectar a produção de vírus ou a síntese de polipeptídos virais, deve ser alterada para corresponder ao ARN de vírus inicial .
Os métodos para alteração da sequência nucleotidica de uma molécula de cADN, são conhecidos e incluem a mutagénese de sítio dirigida ΖΓC.A. Hutchinson, III et al., Mutagenesis At A Specific Position In A DNA Sequence, J. Bio. Chem. 253, pp. 6551-60 (1978); A. Razin et al., Efficient Correction of A Mutation By Use A Chemically Sinthesized DNA, Proc. Natl. Acad.
Sei, USA, 75, P. 4268 (1978) J. Alternativamente, um clone parcial de cADN contendo a sequência desejada pode ser isolado a partir da biblioteca de cADN e o seu ADN ou uma sua fraeção, ser substituído no clone completo para as sequências que se destinam a ser alteradas. Uma vez alterada a sequência de cADN, esta é utilizada noutras realizações desta invenção.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, o cADN de vírus de ARN verdadeiro pode ser inserido em um vector apropriado e utilizado para transformar um hospedeiro apropriado.
A escolha do vector depende do fim a que se destina o cADN. Identicamente, a escolha do hospedeiro dependerá do vector escolhido e do objectivo final da transformação.
Por exemplo, se se pretende simplesmente armazenar cADN e criar um seu suprimento ilimitado, o cADN deverá ser inserido
-30em um vector capaz da transformação de um organismo unicelular, por exemplo uma bactéria, uma levedura ou um outro fungo, numa célula animal ou numa célula de insecto. De acordo com um aspecto desta invenção, o cADN é inserido em um sítio PstI de pBR322 e o hospedeiro a transformar é E.col i.
De acordo com outro aspecto desta invenção, cADN de vírus de ARN verdadeiro, pode ser ligado de forma operacional a um promotor de transcrição. Tal como aqui se utiliza o termo ligado de forma operacional significa posicionada de tal forma que o promotor dirigirá a transcrição de ARN do cADN de vírus verdadeiro. Exemplos destes promotores são SP6, T4 e T7. 0 promotor mais preferido é o promotor T7 £ J.J. Dunn et al., Complete Nucleotide Sequence of Bacteriophage T7 DNA and the Locations of T7 Genetic Elements, J. Mol. Biol. 166, pp. 477-535 ( 1983) £.
Os vectores que contêm o promotor e um sítio de clonagem em que uma fraeção inserida de ADN está ligada de forma operacional a esse promotor, são bem conhecidos. De preferência, estes vectores são capazes da transcrição de ARN in vitro. Exemplos destes vectores são as séries pGEM £ Promega Biotec, Madison, WI J7.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, descrevem-se métodos para a produção de vírus de ARN de cadeia positiva viáveis. Estes podem conseguir-se por transfecção de uma hospedeira apropriada com um cADN de vírus de ARN verdadeiro. Qualquer método convencional de transfecção de células animais com ADN, pode ser utilizada £ F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Intersciences (1987) J. 0 hospedeiro é em seguida cultivado sob
condições que conduzem à produção de vírus de ARN. Estas condições são conhecidas pelos técnicos e variam dependentes do vírus a produzir. Identicamente, a escolha da célula hospedeira deve ser de forma a estar compatível com o vírus, de preferência, células de primatas em cultura. Num aspecto preferido desta invenção, em que cADN de vírus de ARN verdadeiro codifica uma estirpe atenuada de poliovírus 3, o hospedeiro escolhido num grupo constituído por células Vero, células Hela, células COS, células CV-1, linhas de células diploides humanas, tais como as linhas WI-38 e MRC5 e células de rim de macaco primárias. Os hospedeiros mais preferidos são as células de rim de macaco. Uma vez que as células tenham produzido um nível desejável de vírus, o vírus é recolhido da cultura celular de acordo com protocolos padrão.
De acordo com um aspecto alternativo da presente invenção, ARN virai, que ê produzido por transcrição in vitro de cADN de vírus ARN verdadeiro de acordo com esta invenção, pode utilizar-se em métodos para a produção de vírus de ARN viáveis. 0 ARN transcrito in vitro é isolado por métodos convencionais e utilizado para transfectar um hospedeiro apropriado. A utilização de ARN para transfectar células é bem conhecida dos técnicos £ S.van der Werf et al., Synthesis of Infections Poliovírus RNA by Purified T7 RNA Polymerase, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, pp. 2330-34 (1986) J. Uma vez obtidas as células transfectadas estas desenvolvem-se e o vírus é recolhido de acordo com protocolos padrão.
De acordo com um outro aspecto desta invenção, descreve-se um método de sondagem de variantes de uma estirpe 3 de poliovírus. Através da sequenciação de ARN, descobriu-se que a presença de um C na posição de um nucleótido 2493 deste vírus, está li-32gada ao genotipo da estirpe 3 atenuada. Análises anteriores desta estirpe não conseguiram reconhecer a importância desta posição na atenuação devida a uma associação de dois factores: as sequências do tipo selvagem e da estirpe 3 atenuada de poliovírus foram comparadas com o nível de cADN, preferencialmente ao nível de ARN genómico; e alguns destes cADNs foram obtidos a partir de isolados de placa de amostras de vírus original [. Stanway et al, Comparison of the Complete Nucleotide Sequences of the Genomes of the Neurovirulent Poliovirus P3/Leon/37 ans its Attenuated Sabin Vaccine Derivative P3/Leon 12 a 1b, Proc. Natl.
Acad. Sei. USA, 81, pp. 1539-43 (1984); H. Toyoda et al., Complete Nucleotide Sequences of Ali Three Poliovirus Serotype Genomes, J. Mol. Biol, 174, pp. 561-85 (1984) Como resultado ou de erros de transcrição inversa ou de mutações que resultam da passagem dos vírus, os cADNs produzidos anteriormente continham um T na posição 2493. Portanto, o ARN do tipo 3 da estirpe da vacina de poliovirus, foi erradamente considerada como contendo U nesta posição, o mesmo nucleótido presente na estirpe de tipo selvagem C Stanway et al., supra; H. Toyoda et al., supra 7Deste modo, a posição 2493 jamais fora considerada como contribuindo para atenuação do genoma da estirpe 3 de poliovirus.
Portanto, o método de sondagem para variantes de uma estirpe 3 de poliovirus de acordo com esta invenção consiste nas fases de sequenciação de ARN do vírus e na determinação do nucleótido na posição 2493. Com maior preferência a porção de ARN a ser sequenciada consiste em cerca de 100 a 200 nucleotidos que flanqueiam o nucleótido 2493. Este método, pode ser utilizado durante a amplificação do vírus original, por exmeplo, na produção
da vacina, para assegurar a manutenção do nucleótido C na posição 2493 no genoma virai.
Esta invenção também se refere a um método para aumentar a atenuação de uma estirpe 3 de poliovírus produzida a partir de cADN de vírus de ARN verdadeiro, em que o cADN contém a sequência ATT nas posições 2492 a 2494. 0 método consiste na mutagénese do nucleótido na posição de 2493 de um T para um C e subsequentemente a utilização de CADN mutagenizado para produzir vírus viáveis.
A presença de um C em substituição de um U na posição 2493 no ARN de poliovírus da estirpe 3, deve esperar-se que altere o sexto aminoácido da proteína da cápside virai, VP1, de isoleucina para tríonina com base do código genético. 0 códão que codifica este aminoácido abrange os nucleótidos de 2492 a 2494. Portanto, o método para aumentar a atenuação da estirpe 3 de poliovírus de acordo com esta invenção pode também incluir a mutagénese do nucleotido 2494 de um T para um A, C ou G.
A fim desta invenção, aqui descrita, ser totalmente entendida, descrevem-se os exemplos seguintes. Deve entender-se que estes exemplos têm fins de compreensão apenas, e não foram construídos como limitando esta invenção em qualquer sentido.
Exemplo 1
Purificação de uma Estirpe de Poliovírus 3
Todo o material de vidro utilizado nos métodos descritos em seguida ou é esterilizado ou tratado com percarbonato de die-34( 5 tilo para destruir RNases. Todos os reagentes são preprarados com ãgua tratada com policarbonato de dietilo antes da sua utilização.
Infectaram-se células de rim de macaco primárias com uma estirpe de poliovírus 3 atenuada, isolada por purificação em placa a partir de Vacina ORIMUNE (Lederle Laboratories,
Pearl River, NY ), com uma multiplicação de infecção baixa (MOI). As culturas infectadas são mantidas à temperatura de 34°C em meio de manutenção lácteo de Earle's modificado, pH 7,3, até destruir a monocamada celular (efeito citopático +4 CPA). 0 meio de cultura, 120 ml, recolheu-se e centrifugou-se a 2.500 rpm por um período de 20 minutos para remover quaisquer fragmentos celulares.
Em seguida, filtrou-se o sobrenadante através de um filtro de disco Millex GV de 0,22 yuM. Em sequida, colocou-se o filtrado em tubos de alta velocidades fechados e accionados por um rotor 70,1 Ti a 70.000 rpm, à temperatura de 4°C durante uma hora.
aglomerado de vírus ressuspendeu-se . em 4 ml de TNE isento de RNase (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) e transferiu-se a suspensão para um tubo de 15 ml de polipropileno. Em seguida, dissociou-se a cápside virai por adição de SDS isento de RNase com uma concentração final de 0,5%.
Exemplo 2
Isolamento e Sequenciação de ARN virai
Em seguida isolou-se ARN'viral por extracção da cápside dissolvida, como preparada no Exemplo 1, com igual volume de fe-35nol: clorofórmio: álcool isoamílico a 25:24:1. Removeu-se a camada aquosa e extraiu-se de novo com a mesma solução orgânica. Adicionou-se metade do volume de acetato de amónio 7,5 M e 2,5 volumes de etanol a 100%, ao extracto aquoso e precipitou-se o ARN à temperatura de -20°C, por pelo menos 30 minutos. Em seguida, aglomerou-se o ARN por centrifugação a 12.000 rpm durante 30 minutos. 0 aglomerado de ARN lavou-se duas vezes com etanol a 70% arrefecido com gelo, secou-se sob vácuo e ressuspendeu-se em 20; jjM de água. Avaliou-se a integridade e a concentração em ARN apli cando-se a electroforese em gel de agarose.
Em seguida, sequenciou-se o ARN virai, pelo método como essencialmente descrito por DeBorde C D.C. DeBorde et al., Anal. Biochem., 157, pp. 275-82 (1986) 7» cuja descrição aqui se cita pela referência. Os pormenores específicos da sequenciação estão descritos em seguida.
Aqueceram-se, aproximadamente 500 mg de ARN virai purificado, desnaturada à temperatura de 100°C durante 3 minutos em 200 mM Tris-HCl, pH 8,3, 200 mM de KC1, 20 mM MgCl2, 10 mM DTT e em seguida congelou-se rapidamente por imersão em banho de gelo . Iniciador, dATP e enzimas foram em seguida misturados com ARN, como descrito por DeBorde et al. Dois e meio yil da mistura de iniciador -ARN foram em seguida associados com igual volume de misturas reaccionais diversas, em tubos separados, para se obterem as concentrações de componentes seguintes:
Tubo A: 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1, 5 mM MgCl, 10 mM DTT,
100 yiM de cada de dCTP, dGTP e dTTP, 5 yuCi de f 35S 7-dATP, 1,25 juM ddATP, 100 ng de ARN, 15 ng de iniciador
e 2,8 unidades de transcriptase inversa;
Tubo C; o mesmo que o Tubo A, com excepção de 20 jiM de dCTP,
2,5 ^iM de ddCTP e isento de ddATP;
Tubo G: o mesmo que no Tubo A com excepção de 20 jiM de dGTP, 3,0 yjM de ddGTP e sem ddATP;
Tubo T: o mesmo que no Tubo A com excepção de 20 jiM dTTP, 7,5 ^iM de ddTTP e isento de ddATP;
Tubo Ν: o mesmo que no Tubo A com excepção de ddATP.
Cada tubo, foi incubado à temperatura de 42°C durante 20 minutos. Após esta incubação, adicionou-se 1 jí\ de solução de aprisionamento (1 mM de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP e 2 unidades de desoxinucleótidi 1 transferase terminal) em cada um dos tubos e incubaram-se os tubos por mais 30 minutos à temperatura de 37°C. detiveram-se as reacções por congelamento a -20°C. Antes da electroforese adicionaram-se à mistura, em cada tubo, jjl de corante de formamida. Em seguida, aqueceram-se as amostras à temperatura de 100°C durante 3 minutos e introduziram-se 5 jil de cada uma das amostras por faixa de gel.
gel de sequênciação (35 cm x 13 cm x 0,1 mm) são geles de poliacrilamida a 6% (38:2; acrilamida: bis-acrilamida) contendo ureia 7 M em TBE (89 mM Tris, 89 mM de ácido bórico, 2 mM EDTA).
Quando completa a sequência do genoma da estirpe de poliovírus 3 atenuada, comparou-se com as sequências de cADN de P3/ /Sabin [ Stanway et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, pp.
-371539-43 (1984)7, observando-se duas diferenças de nucleótidos, uma das quais provoca uma alteração de aminoácidos. Estas apresentam-se no quadro seguinte
Posição de Nucleótido
P3/Sabin
Stanway
P3/Sabin Alteração
ARN de aminoácido
2493
6061
T C
C U(T)
Ile para Thr (VPI)
Silencioso
A diferença observada na posição 2493 é importante por diversos motivos. Primeiro, codifica uma modificação significativa de aminoácido na proteína VP1 da cápside virai. Além disso, devido à estirpe de tipo selvagem poliovírus 3 ter U nesta posição (T no cADN), a presença significativa de um T na posição 2493 da estirpe 3 de poliovírus atenuada no cADN pode ter obscurecido uma diferença significativa entre o tipo selvagem e os genomas atenuados.
Exemplo 3
Síntese de um cADN de poliovírus de comprimento completo
Utilizou-se ARN virai obtido no Exemplo anterior como uma matriz para a síntese de um cADN de cadeia dupla utilizando-se o método de V.R. Racaniello et al., Molecular Cloning of Poliovírus cADN And Determination of The Complete Nucleotide Sequence of The Virai Genome, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, pp. 4887-38-91 (1981). Especificamente, utilizaram-se 2,5 de ARN virai para produzir a primeira cadeia de cADN em uma reacção de 100 jjI contendo 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 10 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,5 mM de cada um de dAPT, dTTP, dSTP e dCTP, 0,4 mM de DTE, 30 pg/ml de olio dT (comprimento de 12 a 18 nucleótidos), 4 mM de pirofosfato de sódio, 10 jjCí/jjI de f o(-32P J-dATP, 1 unidade/jil de RNasin e 2 unidades/^1 de transcriptase inversa £ Boehringer-Mannheim, Indianapolis, INIncubou-se a reacção à temperatura de 42°C durante 60 minutos. Deteve-se a reacção por adição de EDTA com uma concentração final de 50 yuM. Em seguida, extraiu-se a solução com fenol e aplicou-se a fase aquosa a uma coluna de sefarose CL-4B de 5 X 0,7 cm. Desenvolveu-se a coluna com NaCl 0,3 M, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA. 0 perfil obtido deste modo está representado na Figura 1.
Reuniram-se as fracções da coluna de 5 a 13 e adicionaram-se em seguida 20 ^ig de glicogênio. Em seguida, precipitou-se o cADN à temperatura de -20°C mediante a adição de 2,5 volumes de etanol, reuniram-se por centrifugação e ressuspendeu-se em 25 yul de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA (TE) para se utilizar na síntese da segunda cadeia.
Realizou-se a síntese da segunda cadeia numa reacção de 100 jjI contendo cADN de cadeia simples, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, mM MgCl2, 0,1 M KC1, 50 yjg/ml de albumina de soro bovino (BSA), 0,1 mM de cada um de dNTP, 150 juM β-NAD, 5 jjg/ml de ADN ligase de E.coli, 250 unidades/ml de ADN polimerase I de E.coli e 90 unidades/ml de RNase H. Incubou-se a mistura à temperatura de 15°C durante 60 minutos seguidos de 90 minutos à temperatura ambiente.
-39Em seguida, extraiu-se o cADN com fenol e submeteu-se a cromato- r * grafia sobre sefarose CL-4B, como descrito anteriormente. As fracções do volume foram reunidas, precipitadas com etanol e ressuspensas com 25 jil TE, como anteriormente descrito.
cADN de cadeia dupla resultante foi caldado com desoxicitidina (dc) numa reacção de 100 jjl contendo 140 mM de cacodilato de potássio, 30 mM Tris-HCl, 1 mM CoCl^, 1 mM DTT, 50 yjg/ml BSA, 150 ^iM dcTP e 800 unidades/ml de desoxinuc 1 eotidi 1 o transferase terminal. Incubou-se a reacção à temperatura de 37°C durante 60 minutos e em seguida extraiu-se a solução fenol. Retirou-se a fase aquosa, extraiu-se com éter dietílico e cADN de calda precipitado deste modo com etanol contendo 20 yjg de glicogênio. 0 aglomerado resultante foi ressuspenso em 50 yjl de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,
100 mM NaCl, 1 mM EDTA.
Exemplo 4
Produção de uma Biblioteca de cADN de poliovírus
Quantidades crescentes (1, 2, 5, 10 ^jl) de dc-acrescentado, cADN de cadeia dupla, produzido de acordo com o método descrito no Exemplo 3 foram circularizadas para 10 ng de Pstl-cindido, pl)C9 acrescentado com dG (Pharmacia, Piscataway, Nd) em NTE mediante aquecimento da mistura à temperatura de 68°C em banho de água durante 5 minutos, seguido de arrefecimento em banho de água a 42°C e em seguida reduzindo-se lentamente a temperatura para a temperatura ambiente durante a noite, eliminando-se o banho de água. Permitiu-se deste modo uma hidridação óptima entre as caídas dc do cADN e as caídas dG de pUC9. As misturas circularizadas são em seguida utilizadas ·* para transformar células de E.coli DH5 O( (Bethesda Research Labs Gaithersburg, MD) utilizando-se processos convencionais. Escolheram-se por sondagem as colónias resistentes a ampicilina.
Exemplo 5
Isolamento de clones de Poliovírus
Repicaram-se colónias bacterianas nas placas gradiadas e sondadas por hidridação de colónias utilizando-se o plasmídeo linearizado pOLIO (Sabin) como uma sonda £ J.W.Almond et al., Attenuation and Reversion to Neurovirulence of the Sabin Poliovírus Type-3 Vaccine, In Vaccines, 85, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 271-77 (1985) 7. 0 plasmídeo pOLIO (Sabin) é um plasmídeo que contém um cADN de comprimento completo proveniente de P3/Leon 12 a1b £ G. Stanway et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, pp. 1539-43 (1984) J. De 600 colónias sondadas por hidridação, 140 forneceram sinais positivos de hidridação. Pequenas culturas (5 ml; meio LB + ampicilina) de cada destes clones positivos foram preparados e isolado o ADN plasmidico pelo método de ebulição rápida £ T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) J. Os plasmideos isolados cindiram-se com PstI, que está previsto excisar a inserção clonada. De 140 clones que foram analisados por esta via, a grande maioria continha ou inserções pequenas ( < 1 Kb) ou não libertaram inserções após clivagem com
PstI. Contudo, conseguiu-se identificar e mapear três clones de
cADN para o genoma P3/Sabin (pLL3-51, 69 e 82; ver Figura 2). Oitocentas colónias foram sondadas por hidridação de colónias utilizando-se um fragmento EcoRI de cADN de pOLIO (Sabin) que contém a maior parte de 747 nucleótidos 5' como uma sonda. De trinta e três colónias que hidridaram com a sonda, cinco dos cADNs representavam os nucleótidos de 85 a 779 de P2/Sabin. A origem destes clones de cADN é desconhecida.
Em seguida, circularizou-se o cADN adicional para pUC9 e transformou-se em células de DH50f. Oitocentas colónias foram sondadas por hidridação de colónias utilizando-se cADN pOLIO (Sabin) de comprimento completo como sonda. Vinte e nove clones positivos foram analisadas por cisão de enzima de restrição.
Oito dos clones positivos que continham inserções de cADN foram submetidos a sequenciação nucleotidica a partir de qualquer das extremidades do ADN inserido. Cinco destes clones (pLL3-239, 251 254 e 255) contêm um cADN que mapeia para a extremidades 3' do genoma de P3/Sabin (Figura 2).
Como representado na Figura 2 (traços abertos) os oito clones de cADN isolados e analisados representam nucleotidas e de 3630 através da estremidade 3' do genoma de ARN virai de P3/Sabin.
Para se obterem outros clones de cADN 5', sintetizou-se um oligonucleótido complementar com uma cadeia de bases desde o nucleótido 4317 a 4334 (ver a parte sombreada a escuro da Figura 2, pLL3-253).Este oligonucleótido é utilizado para iniciar a síntese de cADN no ARN virai P3/Sabin isolado de acordo com o método descrito no Exemplo 2 utilizando-se métodos de síntese de cADN como descritos no Exemplo 3.
Os cADNs resultantes são caldados com dc e clonados em p C9 dG-caldado de corte PstI. Os plasmideos resultantes foram em seguida utilizados para transformar células DH5o(. As células transformadas foram sondadas por hidridação para pOLIO (Sabin 3). Onze clones de cADN positivos foram isolados e analisados por digestão com enzimas de restrição e sequenciados (Figura 2, traços a cheio).
Os onze clones correspondem a 6 nucleotídos através de 4329 de ARN virai P3/Sabin.
Embora os clones de cADN que não representam todos mas apenas os primeiros cinco nucleótidos do genoma de P3/Sabin estarem identificados, mostraram-se difíceis as tentativas de ligação de vários dos cADNs 5' em um único cADN devido à ausência de sítios de restrição apropriadas. Portanto, uma fase final da clonagem de cADN foi considerada na tentativa de se obter um clone de um único cADN que representasse aproximadamente os nucleótidos de 1 a 1900.
Um ol igonucleótido complementar das bases 1904 a 1922 foi sintetizado e utilizado para iniciar a síntese de cADN em ARN P3/Sabin. Em seguida, o cADN foi dC-acrescentado, inserido em pUC9 cortado com PstI, dG-acrescentado e usado o plasmideo resultante para transformar células DH5^f. Os transformantes foram de novo sondados com pOLIO (Sabin 3). Um dos clones de cADN resultantes foi identificado como contendo os nucleótidos de 9 a 1900 de ARN virai (Figura 2, pLL3-307). Isto completa a clonagem cADN do genoma de P3/Sabin.
Exemplo 6
Construção de um cADN de Poliovírus de Comprimento Completo.
A estratégia para a reunião de cADNs de P3/Sabin em um cADN de comprimento completo está representada na Figura 3. Primeiro, reuniram-se os clones pLL3-253 e pLL3-271 em um único clone utilizando-se um sítio comun Hindi11 no nucleótido 4241 .
clone de cADN resultante, que representa os nucleótidos 1500 através de 3'poli (A) do genoma, é designado pLL3-I.
Em seguida, sintetizaram-se os primeiros 5 nucleótidos do genoma virai P3/Sabin que estavam ausentes do cADN pLL3-277. Alcançou-se isto, sintetizando-se dois oligonucleótidos complementares utilizando-se um sintetizador de oligonucleótidos automatizado e em seguida circularizando-se os ilogonucleótidos um com o outro. 0 oligonucleótido de dupla cadeia resultante, continha 5' a 3', um sítio PstI, nucleótidos 1 através de 34 de cADN de P3/Sabin e uma extremidade colectiva Bge I e em seguida utilizado para repôr a maior parte do fragmento 5' PstI/Bgl I de pLL3-277. Daqui resultou um clone cADN que representa os nucleótidos de 1 a 1085. Este clone é designado por pLL3-II.
A fase final foi a ligação de três fragmentos SaCI que representam os nucleótidos 1-747, 747-1895 e 1895 até à extremidade 3' para se formar um cADN de P3/Sabin de comprimento completo, designado por pLL3-FL. Esta construção realiza-se em várias fases separadas utilizando-se inserções apropriadas de cADN de pLL3-II, pLL3-307 e pLL3-I.
-*
Exemplo 7
Análise de Sequência de cADN P3/Sabin
-44-A análise de sequência de cADNs P3/Sabin, utilizadas para construir o cADN de comprimento total, foi realizada utilizando-se três vias.
Na primeira via, subclonaram-se cADNs em vectores M13. Em seguida, isolaram-se deleções alojadas de cADN subclonado utilizando-se exonuclease III e nuclease de feijão £ E. Ozkaynak et al.,
A Unidirectional Deletion Technique for the Generation of Clones for Sequencing, Biotechniques, 5' pp. 770-73 (1987) £.
Na segunda via, isolaram-se cADNs e digeriram-se com Rsal. Os fragmentos resultantes foram em seguida empurrados para M13 para análise de sequência. A última via utilizou fragmentos de cADN que foram isolados dos clones e subclonados em M13 para análise de sequência.
Após a sequenciação nucleótidica do clone de cADN de P3/Sabin completo, verificaram-se três diferenças quando a sequência de cADN se comparou com a sequência de ARN. Estas diferenças estão resumidas no quadro seguinte:
Posição de P3/Sabin Nucleótido cADN
P3/Sabin Mudança de
ARN Aminoácido
198
4466
6334
5' não traduzido His para Tyr (2C) Si lenciosa
-45-.
nucleótido errado na posição 198 do cADN situava-se na região 5' não traduzida do genoma. A função desta região permanece desconhecida. A presença de um T e não de um C no cADN na posição 4466 criaria uma modificação no resíduo 118 da pro1 teína 2C de histidina para tirosina. Embora a função da proteína 2C permaneça por definir, a modificação do aminoácido prevista, parece ser significativa. A modificação nucleótídica na posição 6334 está no gene da polimerase, mas é silenciosa relativamente à modificação do aminoácido.
A fim de se obter um clone de cADN de comprimento total correspondendo exactamente ã sequência de ARN de poliovírus, seguiu-se o protocolo apresentado na Figura 4, painéis A e B. Especificamente, a inserção de cADN P3/Sabin pLL3-II foi subclonado no sitio PstI do bacteriófago M13 para mutagénese de oligonucleótido dirigida do nucleótido 198 de G para A como descrito em seguida. Um oligonucleótido abrangendo os nucleótidos de 190 a 206 e contendo um A na posição 198 foi sintetizado para este fim. 0 oligonucleótido tem a sequência seguinte:
3'-GGCGTATCTGACAAGGG-5'.
Realizou-se a mutagénese utilizando-se um conjunto para mutagénese In Vitro T7-GEN (United States Biochemical, Cleveland, OH) e seguindo-se as direcções do preparador. A inserção mutagenizada é designada por pLL3-II (A). Após a mutagénese, sequenciou-se pLL3-II (A) para confirmar a presença de um A na posição 198. Em seguida removeu-se pLL3-II (A) de M13 com PstI e digeriu-se subsequentemente com SacI que corta no nucleótido 747. 0 fragmento abrangendo os nucleótidos de 1 a 747 é utilizado para subs-
-46tituir o fragmento correspondente em pLL3-FL. 0 cADN de comprimento total resultante que contém um nucleótido mutagenizado na posição 198 é designado como pLL3-FL (A).
Em seguida, digeriu-se pLL3-FL (A) com PstI e isolou-se o fragmento abrangendo os nucleótidos de 1 a 2604. Uma fracção de fragmento PstI isolado de pLL3-FL(A)--nucleótidos de 1 a 1922-- submeteu-se em seguida a uma reacção de cadeia de polimerase (PCR) utilizando-se como iniciadores os dois oligonucleótidos seguintes:
1) 5'- CTGCAGTAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCTCTGGGGTTG-31;
e
2) 5'- GAATCATGGTGTCTATCTC-3'.
oligonucleótido 1) representa, na orientação 5' para 3', um sitio PstI, o promotor T7 e os nucleótidos de 1 a 20 da cadeia positiva de cADN de P3/Sabin. 0 oligonucleótido 2 representa os nucleótidos 1904 a 1922 da cadeia negativa do cADN de P3/Sabin. Realizou-se a reacção de cadeia polimerase utilizando-se um conjunto GeneAMp de Perkin-Elmer Cetus.
Em seguida, cindiu-se o ADN de cadeia dupla produzido por reacção de cadeia polimerase, com EcoRI, que corta no nucleótido 784 de cADN de P3/Sabin. 0 fragmento resultante de 0,8 Kb que representa o promotor T7 e a extremidades 5' de cADN de P3/ /Sabin, isolou-se e subclonou-se em pBR322 cortado com SspI/EcoRI. 0 plasmídeo resultante, designado por pVR309 foi confirmado como contendo um promotor T7 e os nucleótidos de 1 a 784 de cADN de P3/Sabin.
Em seguida, cortou-se pLL3-FL com EcoRI que corta nos nucleótidos 784 e 2867. 0 fragmento abrangendo estes nucleótidos foi isolado e ligado com pVR309 no corte EcoRI. 0 plasmídeo resultante, pVE312, contém os primeiros 2867 nucleótidos do cADN de P3/Sabin. :
A fim de se modificar os nucleótidos em 4466 e 6334 para corresponderem à sequência de ARN virai, realizou-se uma mutagénese oligonucleótídica dirigida, como descrita anteriormente. A inserção pLL3-253 foi subclonada no sitio PstI de M13. Utilizou-se o oligonucleõtido 31-CTCGTTTGTGGCATAAC-51 para alterar o nucleótido 4466 de um T para um C. Utilizou-se o oligonucleõtido 3'-CCCATGGGGATGCACCG-51 para modificar o nucleótido 6334 de um T para um C. Os nucleótidos mutageneizados foram confirmados por sequenciação nucleótídica. 0 fragmento cADN corrigido resultante designa-se por pLL3-253 (C).
Em seguida, reuniram-se pLL3-253 (C) e pLL3-271 em um único clone, por cisão de cada um Hind III e ligando-se os grandes fragmentos resultantes, conjuntamente. 0 ADN resultante, referido como pLL3-I (C), representa os nucleótidos 1500 da extremidade de 3-poly (A) de P3/Sabin. A inserção de cADN completo de pLL3-I (C) foi em seguida isolada por digestão parcial com pstl.
E necessária a digestão parcial por causa da presença de um sítio Pstl no nucleótido 2604. Em seguida, ligou-se pl_L3-I (C) no corte Pstl de pBR322. Em seguida, removeu-se uma porção daquela inserção de pBR322 por uma digestão com Smal/NruI. A fracção excisada abrange os nucleótidos 2766 através da extremidade 3' de cADN de pBR 322. Também se excisou de pVR312 um fragmento Smal/NruI. Este
ADN representa as sequências do sítio NruI de pBR322 através do
-48V \
promotor Τ7 e a extremidade 5' do cADN de P3/Sabin e até ao sítio Smal no nucleótido 2766. Estes dois fragmentos Smal/NruI foram em seguida ligados entre si para formarem um cADN de P3/Sabin verdadeiro. 0 plasmídeo resultante designa-se por pVR318. A presença de uma inserção de comprimento total em pVR318 confirmou-se por análise de enzimas de restrição. Contudo, após a sequenciação de pVR318 verificou-se que a posição 2493 continha um T preferencialmente a um C.
A fim de se converter o nucleótido 2493 para um C removeu-se o fragmento de restrição Scal/HindIII abrangendo os nucleótidos de 1895 a 4241, de PVR318, e substituiu-se com um fragmento correspondente, proveniente do subclone pLL3-271. Este esquema está representado na Figura 5. Especificamente, pLL3-271 digeriu-se com SacI e HindIII, isolando-se um fragmento de 2346 Kb abrangendo os nucleótidos de 1895 a 4241, por electroforese em gel de agarose. Digeriu-se parcialmente o plasmídeo PVR318 com Saci e HindIII para remover o fragmento de 2346 bases entre os nucleótidos 1895 e 4241. 0 fragmento restante de 10.007 Kb foi isolado por electroforese em gel de agarose e em seguida ligado ao fragmento SacI/HindIII de pLL3-271.0 produto de ligação resultante, pLED3, representa um cADN da estirpe da vacina de poliovírus 3 de comprimento total de tipo verdadeiro. A sequência de pLED3 está representada na Figura 6, painéis de A a J.
Exemplo 8
Transfecção de Células com cADN de P3/Sabin de Poliovírus
Desenvolveram-se células de rim de macaco primárias para
-49ν.
uma confluência de 80% em duplicado, em frascos de 25 cm2 com meio básico de Eagle (BME) contendo uma solução de sal equilibrada de Hank, carbonato de hidrogénio e sódio a 0,35% e soro de vitela a 10%. Mantiveram-se as culturas à temperatura de 37°C. Em seguida, removeu-se o meio e transfectaram-se as células com pLED3, preparado como descrito no Exemplo 7, adicionadas sob a forma de um precipitado de fosfato de cálcio em solução de cloreto de sódio tamponada com HEPES. Após 20 minutos à temperatura ambiente cobriram-se as células com meio de manutenção lácteo de Earle e incubaram-se durante 4 horas à temperatura de 37°C. Retirou-se o meio e lavaram-se as células uma vez com meio recente aquecido.
Em seguida, adicionaram-se 2 ml de glicerol a 15% na solução de cloreto de sódio tamponada com HEPES, às células e continuou-se a incubação durante 3,5 minutos à temperatura de 37°C. Removeu-se o glicerol e lavaram-se as células de novo com meio recente. Uma das culturas em duplicado foi depois coberta com meio aquecido contendo 1% de agar Noble (Difco, Detroit, MI), enquanto que se cobriu a outra com meio isento de agar. Incubaram-se as culturas à temperatura de 34°C durante 1 a 5 dias. Visualizaram-se as placas por coloração das células com vermelho neutro a 0,01%. Analisou-se o meio da cultura líquida para verificação de poliovírus infecciosos por titulação em placa sobre células Vero.
Exemplo 9
Transcrição In Vitro de cADN P3/5abin
Realizou-se a transcrição In Vitro pelo método de Van der
-50- / ττ
Werf et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, pp. 2330-34 (1986) pLED3 contendo o promotor T7 da construção P3/Sabin foi linearizado num sitio de restrição apropriado fora das sequências de poliovírus e purificou-se por extraeção com fenol e precipitação com etanol. Este ADN matriz foi em seguida adicionado a uma mistura contendo 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,7, 8 mM de MgCl^, mM de DTT, 1 mM de cloridrato de espermidina, 50 mM de cloreto de sódio e 1 mM de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dUTP. Iniciou-se a síntese de ARN por adição de 10 a 15 unidades de T7 ARN pol imerase/yug de matriz linearizada e contínuou-se durante 30 minutos à temperatura de 37°C.
Após a síntese de ARN, a matriz de ADN foi digerida com Drase I. Purificou-se o ARN restante por extraeção com fenol e precipitação com etanol na presença de acetato de amónio 2,5 M. Quantificou-se o ARN purificado por espectrofotometria UV.
Exemplo 10
Transfecção de Células com ARN P3/Sabin Transcrito, In Vitro
Prepararam-se monocamadas de semi-confluentes de células de rim de macaco primárias como descrito no Exemplo 8. Transfectaram-se as células com ARN preparado como descrito no Exemplo 9, utilizando-se o método de A. Vaheri et al., Infections Poliovirus ARN: A Sensitiv Method of Assay, Virology, 27, pp. 434-36 (1965). Especificamente, as monocamadas celulares foram lavadas com solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato isotónica.
-51Após 15 minutos removeu-se completamente a solução de cloreto de sódio por aspiração. Em seguida cobriu-se a monocamada com 0,25 ml de inoculo contendo ARN e 500 jjg/ml de DEAE-dextrano em PBS (Sigma, St. Louis, MO; 500.000 MW). As monocamadas infectadas foram mantidas em repouso à temperatura ambiente durante 15 minutos, lavadas uma vez com meio de manutenção lácteo Earle e em seguida cobertas com meio recente ou com meio contendo 1% de agar, como descrito no Exemplo 8. Após 4 a 5 dias à temperatura de 34°C, detectou-se o vírus por formação de placa, em culturas contendo agar ou por efeito citopático.
Isolou-se e purificou-se em seguida o vírus. Isolou-se ARN virai por técnicas descritas anteriormente. 0 ARN isolado foi sequenciado e confirmado como citosina o nucleótido na posição 2493, o mesmo como no vírus de origem.
Exemplo 11
Avaliação do Efeito do Nucleótido 2493 na Atenuação de uma Estirpe de Poliovirus 3
Um derivado de cADN de uma estirpe 3 atenuada, contendo um T em substituição de um C no nucleótido 2493 foi construído tal como pVR318. Os vírus foram produzidos a partir de cADNs com Tor C a 2493, como nos Exemplos 8 e 10. Os vírus resultantes foram em seguida testados para verificação da neurovirulência em macacos, de acordo com protocolos padrão.
Exemplo 12
Aumento da Atenuação de uma Estirpe de Poliovírus 3
Submeteu-se cADN de uma estirpe 3 de poliovírus contendo um T na posição 2493, a mutagénese de sítio dirigida para converter T para C. Por exemplo, digeriu-se pLED3 com PstI para remover a sequência codificadora de poliovírus. 0 cADN de poliovírus continha um único sítio interno de PstI no nucleótido 2604. Portanto, uma digestão com PstI gerou um fragmento de cADN virai 5' de 2,6 Kilobases, e um fragmento de cADN virai de 3' de 4,8 Kilobases. Isolou-se o fragmento 2,6 Kilobases por técnicas convencionais e subclonou-se no único sítio PstI do vector M13 mp 18. Em seguida, converteu-se o nucleótido 2493 de T para C por mutagénese de sítio dirigida, utilizando-se um conjunto de mutagénese In Vitro T7-GEN (United States Biochemical, Cleveland, OH) e seguindo-se as orientações do preparador. Após a mutagénese, removeu-se o cADN de 2,6 Kilobases do vector, ligou-se de novo com o bocado 3'de cADN virai e clonou-se o cADN intacto em pBR322. o cADN mutagenizado e o cADN original foram utilizados para produzir poliovírus viáveis, como descrito no Exemplo 8. Os vírus resultantes foram analisados para determinação da atenuação de acordo com os protocolos padrão. 0 vírus mutagenizado produzido por cADN contendo um C no nucleótido 2493, esperava-se estar mais atenuado do que o vírus original.
A confirmação da sequenciação da sequência de cADN completo no plasmídeo pLED3 revelou uma adenosina adicional (A) numa região onde se encontram normalmente seis A1s no genoma virai, posições 4133-4138. As fases seguintes descrevem o método para derivar pLED3.1 de pLED3:
Isolamento e Mutagénese da Sequência de pLED3 Incorrecta:
Partindo-se de ADN plasmidico pLED3 purificado, digeriu-se o ADN totalmente com enzimas de restrição Saci e HindIII.
Pelo método de escolha, isto é, electroforese em gel, HPLC, purificou-se o fragmento SacI/HindIII de 2.346 pares de bases representando nucleótidos de cADN de 1895 a 4241.
Subclonou-se o fragmento de restrição purificado no bacteriofago M13 para permitir a mutagénese de delecção oligo-dirigida. Um oligonucleótido de ADN abrangendo 4121 a 4150 nucleótidos foi sintetizado com esta finalidade. A sequência deste oligómero ê: 5'- CGCCTCAGTAAATTTTTTCAACCAACTATC-31.
Realizou-se a mutagénese utilizando-se um conjunto de mutagénese in vitro T7-GEN (United States Biochemical, Cleveland, Ohio) e seguindo-se as directivas do preparador. A inserção mutagenizada foi confirmada como possuindo 6 adenosinas em vez de 7 nas posições de 4133 a 4138, de acordo com a análise de sequência. Como referido anteriormente, o fragmento SacI/HindIII alterado foi purificado por gel numa preparação para ligação no corpo do plasmídeo a que faltava este fragmento de restrição.
Preparação do plasmídeo pLED3.2 a partir do plasmídeo pLED3:
Partindo-se de ADN plasmidico de pLED3 purificado, digerindo-se o ADN parcialmente com as enzimas de restrição Saci e
-54c
HindIII, purificou-se um fragmento SacI/HindIII de 10.007 par de bases correspondendo ao plasmideo menos 2.346 par de bases do fragmento Sacl/Hind III, descrito anteriormente.
Construção de pLED3.2
Ligaram-se entre si o corpo do plasmideo purificado e o fragmento mutageneizado de 2.346 pares de bases. Transformaram-se células competentes de E. coli Dh5 com produtos de ligação e escolheram-se as colónias resistentes à tetraciclina. A identificação de pLED3.2 foi baseada na confirmação de 6 adenosinas nas posições 4133 a 4138.
Vírus LEP3 e VR318 utilizados no teste de macaco NV.
cADN de comprimento total em pLED3, não corrigido, era infeccioso embora uma adenosina adicional, descrita anteriormente, prevê-se uma alteração na cadeia de leitura para as proteínas virais 2C, 3A, 3B, 3C e 3D. A transcrição in vitro de cADN de pLED3 utilizando-se T7 ARN polimerado, produziu ARN1s que possuíam sete adenosinas incorrectas como determinado pela analise de sequência directa. Quando estas transcrições se utilizaram para transfectar células de rim de macaco, o vírus recuperado possuía o número correcto de adenosinas, nesse sítio.
Embora os cADNs de pLED3 e pVR318 diferissem na composição nucleótidica na posição 2493 e pelo número das adenosinas entre 4130 e 4136, a mutação 2493 era a única diferença que se encontrou como destinguindo os vírus gerados utilizando-se estes
cADNs. Estes cADNs derivados de vírus foram utilizados para a realização de estudos de avaliação do significado da mutação 2493, descrita correntemente no manuscrito sob revisão.
Sabem-se que as polimerases têm problemas de cópias nas regiões em que um único nucleótido se repete várias vezes. Propôs-se que a T7 ARN polimerase pudesse ser gerada por erro de alguns ARNs que continham 6 em vez de 7 adenosinas durante a transcrição das 7 adenosinas de pLED3. Apenas estas transcrições possuindo 6 adenosinas, podiam produzir vírus após transfecção de células. Esta explicação proposta parece grandemente provável para um cientista que manuseie polimerase de fago-T.
ADN recombinante preparado pelos processos da presente invenção é exemplificado por uma amostra depositada na American Type Culture Collection, locatizada em 12.301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852, sob as condições do Tratado de Budapeste de Reconhecimento Internacional do Deposito Microorganismos para Fins de Processos de Patentes. Esta amostra foi depositada em 17 de Abril de 1990, identificada como um plasmidico contendo uma cópia infecciosa completa da estirpe 3 da Vacina Sabin e designada por pLED3. Este depósito foi registado com o número de aceitação na ATCC 40789.
Exemplo 13
Métodos Experimentais
Mutação Especifica de Sabin 3 com a Região N-Terminal de VP1 Atenuada
Preparação de clones cADN: Extraíu-se ARN virai de virus
da Vacina Sabin 3 (Lederle-Praxis Biologicals, NY) após aglomeração e fragmentação em SDS como descrito anteriormente (20). Preparou-se uma biblioteca de cADN a partir de uma matriz de ARN virai, utilizando-se transcriptase inversa e o processo descrito algures (12). Realizou-se mutagénese oligonucleótidica dirigida em subclones em ADNs subclonados em M13, desenvolvidos em E.coli CJ236, para alterar a sequência de cADN para posições de base simples (16). Para esta finalidade, sintetizaram-seol igonucleóti dos antisentido (17-mers) com o nucleótido alvo colocado no centro da sequência. Utilizaram-se sitios de cisão por enzimas de restrição correntes, EcoRI, HindIII, Saci, Smal, para construir clones de cADN completos. Os cADNs completos, (7,459 pares de base) foram construídos no vector pBE322, escolhido e ampliado utilizando-se E.coli DH5^f (Bethesda Research Laboratories).
Células: Propagaram-se células Vero em monocamadas em MEM de Eagle com sais Eagle suplementado com carbonato de hidrogénio e sódio a 0,11% e soro bovino fetal a 10%. Iniciaram-se células de rim de macacdo verde africano primárias (PCMK) em BME com saias de Hank contendo 0,035% de bicarbonato e 10% de soro.
Na confluência de 70% as células foram suplementares com BME (sais de Earle) contendo soro a 5%. Durante a infecção com poliovírus, mantiveram-se todas as culturas em meio de manutenção hidrolizado de lactobumina de Earle modificado (LMM; pH 7,34 isento de soro).
Vírus: Preparou-se vírus da Vacina Sabin 3 (RS0+2; Lederle-Praxis Biologicals, Pearl River, NY) por uma única passagem da sementeira preparada pelo derivado (RS0+1) em células PCMK.
-57Para experiências, utilizou-se a mesma sementeira para produzir o vírus de vacina RSO+2 em células Vero. 0 vírus MCI representa a vacina (SO+2) produzida em células PCMK da sementeira de preparação original (SO+1). Os vírus derivados de cADN recuperados das células Vero transfectadas com transcrições de T7 ARN polimerase de pLED3 ou pVR318 foram designados por LED3+1 e VR318+1. Estes vírus de sementeira foram ampliados de novo em células Vero com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 a 33,5 + 0,5° para criar stocks de vírus LED3+2 e VR318+2. Prestou-se por especial atenção na preparação de amostras de vírus LED3+2 e VR318+2 de uma forma tão similar quanto possível à vacina real, isto ê, nível de passagem e condições de cultura. Os estudos de caracterização foram realizados utilizando-se estes stocks de vírus finais.
Determinação do título do vírus 0 título de vírus infeccioso nas amostras, foi determinado com maior frequência por microtitulação em células HEp-2 e expresso co^o a dose infecciosa de cultura de tecido por ml (TCID)5Q (1). Em alguns casos, o título infeccioso foi determinado por titulação em monocamadas de células Vero em placa e, portanto, expresso como unidades formadoras de placas (p f u) por ml. Diluições em séries de dez vezes de vírus preparado em LMM foram utilizadas para inocular 25 cm2 de monocamadas confluentes deixando-se a absorver à temperatura de 22°C. As células foram cobertas com agar Noble a 1,0% (Difco Laboratories) em MEM (Hank) mais 2% de soro de vitela fetal e depois incubadas à temperatura de 33,5° í 0,5°C. Decorridos 3 dias, visualizaram-se as placas e cortaram-se após exploração das células com vermélho neutro, solução a 0,01%. Para uma dada amostra,
-58existia rotineiramente uma diferença de logaritmo de 0,6 em nú- > meros absolutos determinada utilizando-se os dois métodos descritos anteriomente; o valor de TCIDgg é sempre maior.
Determinação da sequência nucleótídica: determinou-se a sequência de ARN utilizando-se oligonucleótidos sintéticos e o método de determinação da cadeia de didesoxinucleótido como descrito anteriormente (20). Realizou-se a sequenciação de cADNs clonados, utilizando-se um conjunto de sequenciação de ADN sequenase (U.S. Biochemical).
Síntese de ARN in vitro e transfecção: prepararam-se matrizes de ADN por digestão de ADN plasmídico completamente, com enzima de restrição PVuI seguida de extracção com fenol e precipitação com etanol. As misturas de reacção de transcrição contendo 1 yjg de matriz de ADN, foram preparadas como descrito por Moss et al. (12), Iniciou-se a síntese de ARN por adição de 30 unidades de T7 ARN polimerase purificada (Farmacia) e incubaram-se as reacções à temperatura de 37°C durante 90 minutos. A matriz de ADN e o produto de transcrição completo, foram quantificados por comparação da intensidade de bandas apropriadamente dimensionadas com quantidades conhecidas de um padrão, após electroforese em geles de agarose corados com brometo de etídio. Utilizou-se o fragmento Hind III de 9,0 Kb de ADN do bacteriófago lambda como padrão para a matriz. 0 marcador de ARN de cadeia simples de 7,5 Kb (Bethesda Research Laboratories) foi utilizado para transcrição. Os valores numéricos foram obtidos por densitometría num fotográfico negativo obtido do gel. Alíquotas da mistura de reacção de transcrição contendo 25 ug da transcrição de comprimento completo, foram uti-
lizadas para transfectar monocamadas de células acordo com o processo descrito por van der Werf vírus derivados de cADN foram recolhidos quando lular estava completamente destruída (+4 CPE).
Vero (25 cmz) de et al. (23). Os a monocamada ceMareagem Isotópica de Vírus e PAGE: infectaram-se 6,5 χ 10 de células Vero com uma MOI de 16 unidades formadoras de placa por células. Os vírus permaneceram a absorver durante 1 hora e em seguida lavaram-se as células duas vezes e cobriram-se com LMM antes da incubação à temperatura de 33,5°C. Decorridas quatro horas e trinta minutos mudou-se o meio para MEM isento de metionina (Select Amine Kit, GIBCO). Após uma hora, reabasteceram-se n r as células com meio recente suplementado com Γ'a 7 metionina de actividade especifica superior a 1000 Ci/mmol, Amersham, para uma concentração final de 60 yjci/ml e continuou-se a incubação. A +4 CPE, nas 24 horas, o meio que continha o vírus foi clarificado primeiro por centrifugação a baixa velocidade, 2500 rpm, 20 minutos a 4°C e em seguida por microfiItração com Millipore 0,22 yum Millex-GV. 0 vírus foi reunido por ultracentrifugação utilizando-se um rotor Beckman 70,1 Ti (70 K, 1 h, 4°C), e em seguida ressuspenso e levado a ebulição em tampão de amostra Laemmli (10). Submeteram-se as amostras a electroforese em gel SDS-poliacrilamida e visualizaram-se as proteínas por auto^adiografi a.
Curvas de estabilidade térmica do vírus: Amostras múltiplas de 3,0 ml de vírus (aproximadamente 10.7,3 pfu/ml em LMM) foram incubadas à temperatura ambiente, 22°C, ou em banho de água à
-60temperatura de 37°C ou 42°C. Com intervalos de 24 horas num período de 5 dias, foi retirada uma amostra de cada incubação e congelada à temperatura de -20°C. Logo que se completou a amostragem de todas as incubações, determinou-se o título do vírus em cada amostra por titulação em placa, sobre monocamadas Vero.
Curvas de crescimento do vírus: as monocamadas de células Vero, 10* 7/25 cm2 por frasco, foram infectadas com 4 pfu/células e mantidas como descrito anetriormente. Nos tempos indicados após infecção o meio das culturas individuais foi recolhido e depois conservado à temperatura de 70°C.
Teste de Neurovirulência: Testaram-se as amostras de vírus relativamente à neurovirulência em macacos Macca mulatto utilizando-se dois processos estabelecidos. Como descrito no Código dos
Estados Unidos de Federal Regulation (22), injectaram-se 0,2 ml ou 0,5 ml da amostra de vírus contendo pelo menos 10 ’ TCID^/ml na medula ou na região talamica de cada hemisfério do macaco para, respectivamente, cada teste. 0 teste WHO (26) envolve a injecção £ r y pintraspinal de macacos com 0,1 ml de vírus (título de 10 ’ - 10 ’
TCID^g/ml). Após a injecção os animais em teste foram observados durante 17 a 21 dias para determinação de sinais clínicos de poliomielite. Em seguida, sacrificaram-se os. animais para obtenção do exame histológico do cérebro e da medula espinal para observação de lesões de poliovírus. Avaliou-se o tecido nervoso de cada macaco utilizando-se um método de classificação de 1 (baixo) a 4 (alto) reflectindo a gravidade do dano neurológico observado. A classificação média da lesão constituia uma média das classifica-61ções registadas para macacos de cada grupo.
Análise estatística: as diferenças nas classificações médias da lesão foram analisadas por análise de variancia (ANOVA) com determinações dos mínimos quadrados empregados para testar o valor médio. As frequências de reactividade nos macacos injectados por via intratalarnica foram testados para a significância utilizando-se o teste de Chi-quadrado.
Resultados
Construção de um cADN de LED3 autêntico: a sondagem da biblioteca de cADN por análise de restrição e sequenciação nucleótidica, identificou quatro clones de cADN em que seis nucleotidos 5' de todos, representavam o genoma de Sabin 3. A maior parte 5' do clone cADN estava modificada de forma que os primeiros seis nucleotidos de cADN de Sabin 3, foram reconstruídos e colocados sob o controlo do promotor do bacteriófago T7 por incorporação de um oligonucleótido de ADN sintético 5’- CTGCAGTAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCTCTGGGGTTTG-31 utilizando-se a reacção de cadeia de polimerase. A orientação do promotor assegura a síntese de transcrições de ARN de sentido positivo do cADN clonado. Quando a sequência nucleótidica completa dos quatro subclones de cADN se comparou com a sequência de ARN de LED3 (24), identificaram-se quatro diferenças de nucleotidos. Não está claro se as diferenças de nucleotidos representam erros realizados durante a transcrição inversa ou divergências de sequência de uma população menor na amostra de vírus da vacina. Contudo, cADN não corrigido de compri-62mento total não era infeccioso, uma vez que o vírus CPE nem resultou da transfecção de células com transcrições derivadas de T7 preparadas do cADN. A sequência foi corrigida utilizando-se a mutagénese oligonucleótidica dirigida (ver Materiais e métodos, Exemplo 13) em três destas posições: 198 (G para A), 4466 (T para C) e 6334 (T para C). 0 último erro, U em lugar do C na posição 2493, representada, por acaso, o nucleótido idêntido a Leon nesta posição e foi mantido intocável no cADN de comprimento completo em pVR318. Este clone difere da sequência de ARN de LED3 apenas em n2493. A fase final na produção de um cADN de LED3 (pLED3) autêntico, foi realizada por troca de um fragmento de cADN (Saci em n1895 para HindIII em n4241) entre pVR318 e um subclone de cADN de vacina que se verificou possuir-se na posição 2493.
A construção de cADN de LED3 de comprimento total no vector de clonagem pBR322, está representada pelo diagrama da Figura 7, painel A. A análise de sequência nucleótídica através da junção entre o terminal 3' do cADN de Sabin 3 e o plasmídio pBR322 indicou uma calda poly-A constituída por 27 adenosinas. Uma cadeia de 15 c's derivada de fases de clonagem de cADN segue imediatamente a calda de poly-A.
Transcrição In Vitro de cADNs em pLED3 e pVR318:
Os ADNs plasmidicos foram digeridos com PVu I para:
1) gerarem uma matriz de ADN linear contendo um cADN de poliovírus total para transcrição por T7 ARN polimerase; e para 2) criar uma matriz com um domínio menor de sequência do vector externo
-63após a extremidade 3' do cADN. PVuI corresponde ao primeiro sitio de restrição após a extremidade 3' dum cADN (exactamente 126 pares de bases) que não está presente no cADN. dois fragmentos PVuI (4,4 Kb e 8,1 Kb) são produzidos de pLED3 e pVR318 mas apenas o fragmento de 8,1 Kb contém o promotor T7, com base na análise de sequência, (referir a figura 7, A). 0 painel B da Figura 7 demonstra que os ARNs são eficientemente sintetizados pela T7 ARN polimerase a partir de pLED3 e pVR318 restrito por Pvul e a sua dimensão coincide com as transcrições resultantes do fragmento de 81 Kb. Nas pistas 5 e 6, as duas bandas superiores (intensidade baixa) correspondem aos fragmentos de 8,1 Kb e 4,4 produzidos por digestão de ADNs plasmídicos com Pvul. A faixa 4 contém ADN HindIII/lambda para uma referência de tamanho de ADN ds. 0 produto de transcrição ( a banda mais intensa nas faixas 5 e 6) migra em conjunto facilmente com o marcador ssARN de 7,5 Kb (faixas 1-3) o que é consistente com os ARNs de comprimento total (7585 nucleótidos). em comparação com ARN virião (faixa 7), as transcrições in vitro de cADNs de poliovírus migram ligeiramente mais rápido provavelmente devido à ausência da ligação covalente com a proteína VPg. Uma reacção de transcrição contendo 1 yjl de matriz produziu de forma reprodutível 20 a 25 pg de transcrição de total comprimento. Como demonstrado, a banda que corresponde a 1 jjg de uma mistura de reacção de 50 pl (bandas 5 ou 6) tem aproximadamente a mesma intensidade que a banda que representa 500 ng de ARNs de
7,5 Kb (faixa 2). A análise directa de sequência destas transcrições determinou que existem duas guaninas extra na extremidade 5' imediatamente antes do primeiro nucleótido de poliovírus e confirmou a presença de 126 pares de bases de uma sequência de pBR322
-64externa, na extremidade 3' após a poly-A, calda poly-C.
Quando se transfectaram células Vero com os ARNs citados anteriormente, observaram-se efeitos citopáticos consistentes com a infecção por poliovírus nas 24 horas e os vírus foram recolhidos (+4 CPE) no período entre 48 a 72 horas. Verificou-se que a infectividade especifica das transcrições era de 1 a 2 x 102 ufp/jjg, cerca de 3% do ARN da vacina. Como determinado por sequenciação, o ARN dos vírus recolhidos não possuia a sequência de pBR322 estranha na extremidade 3'. Além disso, os genomas destes vírus verificou-se que possuíram nucleótidos atenuados nas posições 472 (U), 2034 (U) e 6061 (U); a única diferença conhecida era entre LED3 (2493-C) e VR 318 (2493-U) era o nucleótido 2493.
Relação da mutação em n2493 com mobilidade de VP1 alterada:
a mutação identificada na posição 2493 no genoma de consenso do vírus da vacina Sabin 3, previa uma substituição de Ile-6 --> Thr em VP1 (24). Para se determinar se as propriedades bioquímicas de VP1 estariam alteradas por esta substituição de aminoácidos, compararam-se as proteínas UPI de LED3 alterado por uma substituição neste aminoácido, com as proteínas VP1 de LED3 e VR318. VP1 proveniente de LED3 continha treonina no resíduo 6, enquanto que VR318 tinha uma leucina neste sítio. A diferença de peso molecular destes aminoácidos é mínima e as proteínas de VP1 destes vírus são distringuíveis por SDS-PASE (Figura 8). Uma explicação possível para esta diferença observada na migração de VP1 deriva do facto de a cadeia lateral de Thr ter um grupo hidroxilo que pode
-65formar uma ligação hidrogénio, enquanto que a cadeia lateral de Ile é hidrofóbica. como resultado, a VP1 do vírus VR318 com Ile-6 pode ligar-se melhor com SDS e, portanto, migrar mais rapidamente que VP1 de LED3. Estes dados associam, pelo menos, uma modificação biofísica com a mutação 2493. Se esta alteração em VP1 tem impacto na estrutura de 3D do virião que estã sob apreciação.
Termoestabi1idade dos vírus LED3 e VR318: na estrutura tridimensional do poliovírus, a região N-terminal de VP1 estã introduzida no lado interior dos viriões naturais numa associação muito próxima com as regiões terminais das outras proteínas da cápside (6). Numa tentativa de avaliar se a mutação 2493 altera a estabilidade do virião, compararam-se vírus LED3 e VR318 para determinar a sua susceptibi1 idade à inactivação pelo calor a várias temperaturas. Como representado na Figura 9, não houve perda no título observado em qualquer das amostras de vírus durante um período de cinco dias, à temperatura ambiente (22°C). A 37°C e 42°C, os títulos de ambas as amostras de vírus diminuíram de forma idêntica. Apesar do tratamento pelo calor, a diferença na morfologia da placa entre os vírus LED3 e VR318 permaneceu preservada, (ver em seguida).
Efeito de n2492 nos marcadores fenotípicos: a placa de pequena dimensão é frequentemente utilizada para diferenciar as estirpes da vacina atenuada das estirpes virolentas (13). Na realização de uma titulação em placa simples das amostras de vírus derivados de cADN sobre monocamadas de células Vero, tounou-se evidente que o vírus VR318 produz placas que são, obviamente maiores do que as produzidas pelo vírus LED3. Quando a comparação incluiu a estirpe
-66- f . . .Ρ..Λ y
patogénica original Leon, tornou-se evidente que as placas de VR318 são de dimensão intermédia (ver Figura 10). Estes resultados sugerem que a única diferença de nucleótido na posição 2493 entre LED3 (C) e VR318 (U) é a responsável pelo aumento da dimensão da placa apresentado por VR318 quando comparado com LED3.
Também se avaliou a sensibilidade a temperaturas tradicionais (temperatura ambiente/ 40°C) dos fenotipo do marcador d dos vírus LED3 e VR318. Embora estes vírus não se distingam por qualquer destes testes, ambos exibiram o fenotipo atenuado comparativamente ao vírus Leon (dados não apresentados).
Curvas de crescimento de LED3 e VR318: para comparar a replicação de LED3 e VR318, compararam-se as cinéticas de desenvolvimento destes vírus em células Vero sob condições que se sabem ser permissivas para os poliovírus atenuados (isto é, temperatura baixa, pH alto). A Figura 11 demonstra que não existe diferença acentuada entre as cinéticas de vírus libertados das células Vero infectadas com LED3 ou VR318. Os títulos alcançados às 24 horas
O pós-infecção (10 ufp/ml) indicaram que nenhum destes vírus é gravemente enfraquecido sob estas condições. Observou-se uma diferença consistente, embora subtil, num aumento do título entre 8 a 12 horas pós-infecção, sugerindo que VR318 pode apresentar a capacidade de replicação mais rápida do que LED3. Durante este periodo, o título de VR318 aumentou 200 vezes comparadas apenas com o aumento de 30 vezes para LED3. Ele está sob apreciação e a modificação das condições de cultura, isto é, pH inferior , exagera a diferença observada nas cinéticas de desenvolvimento entre LED3 e VR318.
-67- /
ν., .
ί *
Neurovirulência de LED3 e VR318 no macaco: através da construção de testes de neurovirulência de vírus recombinantes derivados de cADNs de comprimento total de Sabin 3 e Leon, Westrop et al., (25) relacionaram o fenotipo atenuado de Sabin 3 com as mutações pontuais nas posições 472 e 2034. A recente identificação da mutação pontual específica de Sabin 3 em 2493 (24), fez surgir a questão de saber se esta mutação deve também ser uma determinante de atenuação.
Os vírus derivados de cADN, LED3 e VR318, foram comparados com controlos apropriados para determinação da neurovirulência testada em macacos por processos designados pela WHO ou por normas United States CFR para aceitação de lotes de vacina (ver Materiais e Métodos, Exemplo 13). As diferenças entre estes processos incluem a via de inoculação (intratalâmica e intraspinal versus apenas intraspinal) assim como a quantidade (volume e título), da amostra injectada.
No quadro 1A enumera-se os dados de neurovirulencia de o teste intraspinal CFR (IS) em que LED3 e VR318 foram testados correntemente e comparados com os resultados de teste de vacina real (RSO+2) produzida em células de rim de macaco primárias (PCMK). A comprovação da vacina RSO+2 (Vero) demonstrou que a utilização de células Vero para produzir vírus de vacina, como descrito, não teve efeito sob a atenuação. Os valores de lesão média produzidos por RSO+2 (PCMK), RSO+2 (Vero) e LED3+2 (Vero foram de 0,52, 0,36 e 0,34, respectivamente. Estes dados demonstram que LED3 não é mais virulento que o vírus de vacina corrente.
De forma interessante, a classificação de lesão média de macacos
-68- ξ
X Λ que receberam VR318 foi 1,31 o que é significativamente mais alto (p < 0,01) do que os valores produzidos por outros vírus. Estes dados indicam que o vírus VR318 não é equivalente à vacina RSO+2 corrente e que a presença de C (LED3 e RSO+2) em lugar de U (VR318) na posição do nucleótido 2493 é factor de atenuação.
Como citado anteriormente, a neurovirulência de LED3 e VR318 após a injecção por via intratalâmica em macacos, foi comparada com os dados obtidos de quatro testes completos de vacina RSO+2 corrente (Quadro 1B). Uma vez que o tecido cerebral é menos susceptivel do que o tecido espinal à infecção de poliovírus, a neurovirulência utilizando-se este processo é baseada essencialmente em se quaisquer lesões são visíveis e qual a percentagem de macacos em vez de uma classificação da lesão. Como demonstrado pela vacina RSO+2 real, um nível baixo de reactividade num grupo de macacos (4,0%) é típica e desejável. Dos 10 macacos que recebem LED3 nenhum exibiu lesões. Contudo, VR318 produziu lesões em 2 de 10 dos animais testados (20%). Embora um grupo de 30 macaeos seja necessário para um teste IT completo, a percentagem acrescida de macacos positivos no grupo VR318 é muito pouco corrente.e, vaticina que VR318 falhará os resultados de IT CFR o que indica que quando comparado com a vacina RSO+2 corrente, o vírus LED3 é equivalente e VR318 é mais neurovirulento.
Utilizando-se o processo do teste da Organização Mundial de Saúde (WHO), foram aval iados corcorrentemente LED3 e VR318 como o vírus NC1 que é equivalente à referência do teste da WHO, o tipo 3 atenuado. Como enunciado no Quadro 2, as classificações de lesão médias para LED3 e VR318 foram 0,21 e 1,51, respectivamente Por três métodos diferentes foi confirmada a demonstração inequí-69voca de que LED3 é mais atenuado que VR318. A interpretação de resultados do teste da Organização Mundial de Saúde tem, contudo, alguma dificuldade devido ao comportamento da referência atenuada, NC1. Neste teste, NC1 produziu um valor de lesão médio de 1,08 que se situa entre os valores calculados para LED3 e VR318. Embora um valor médio de 1,08 seja alto para referência deste tes te, a comparação da reactividade entre NC1, LED3 e VR318 é válida uma vez que foram testados de forma habitual. Uma comparação estatística dos valores máximos resultantes com o facto de que por este processo de prova, VR318 não pode destinguir-se da referência atenuada. Com base nestes dados preliminares,, não está claro se VR318 se falhará num teste completo da Organização Mundial de Saúde que envolve 24 macacos por grupo. Por outro lado, a classificação da lesão associada com LEd3 ficou demonstrado ser significativamente menor do que a correspondente VR318 ou à referência NC1 ( p < 0,01).
Interessantemente, o vírus da referência NC1 representa material de vacina preparado, utilizando-se Sabin original (SO), e não a sementeira derivada de Sabin original (RSO). A determinação da sequência nucleótidica na posição 2493 da vacina de S0+2 (Lederle; o mesmo que NC1) revelou uma mistura a 1:1 de C e a variante U. A avaliação idêntica de vacina RSO+2 corrente (Lederle) demonstrou apenas C nesta posição, suportando o facto de que a sementeira de RSO é um derivado purificado da estirpe SO (24). Uma vez que as amostras de teste LED3, VR318 e NC1 não diferem na composição de nucleótidos na posição 472 com base na determinação da sequência de ARN, o valor acrescido de não virulência exibido por NC1 comparado com o de LED3 utilizando o processo WHO, provavelmente deriva da subpo-70pulação de variantes U-2493 na pool NC1 do vírus.
A identificação de uma nova mutação específica Sabin 3 na posição 2493 que codifica uma isoleucina para trionina no sexto aminoácido de VP1 (24) demonstra-se aqui ser uma determinante de atenuação. Quanto à atenuação de poliovírus Sabin 3 tem sido relacionada com mutações pontuais nas posições 472 e 2034, anteriormente por outros (25). Para avaliar a contribuição da mutação 2493, foi produzido um vírus utilizando-se um cADN de vacina completamente verificada (LED3) e comparou-se este com um derivado VR318, que era o mesmo excepto no facto de possuir um nucleótido idêntico a Leon (U) em substituição de C nesta posição.
A mutação adicional em LED3 relaciona-se com o tamanho menor de placa, assim como com a neurovirulência decrescida nos macacos.
Os resultados apresentados aqui demonstram que as propriedades biológicas associadas com a atenuação da estirpe da vacina Sabin 3 foram preservadas em LED3. Há diversos benefícios associados com o uso da estirpe da sementeira derivada de cADN de Sabin 3. Os volumes de estoque de sementeiras originais e derivadas de Sabin, SO e RSO, respectivarrente, são limitados, devido ao facto de serem isolados de'placas de vírus quando as sementeiras são conservadas em forma de um cADN, definitivo geneticamente clonado, as limitações no suprimento de sementeira são eliminadas; além disso, estas sementeiras podem ser conservadas indefinidamente. Sem restrição de suplemento de sementeira existe uma flexibilidade acrescida na multiplicidade de infecção (MOI) que se pode utilizar para produzir a vacina. Weeks-Levy et al. (24) demonstraram que as amostras de vírus produzidos utilizando-se sementeiras de preparação aceite com MOI mais
-71í alto, são geneticamente mais homogéneos. Uma vez que os vírus de ARN por natureza geram variantes com maior frequência do que os vírus de ADN, a sementeira de vírus de ARN estabelecida sob a forma de um ADN definido geneticamente clonado, deve apresentar maior homogeneidade. Por esta via, a quantidade de variantes não desejáveis que podem ser selectivarnente ampliadas durante as passagens tem sido minimizada o que se traduz numa estabilidade genética acrescida. Os estudos de passagem para avaliação se LED3 constitui uma sementeira geneticamente mais estável quando comparada com outras sementeiras de preparação para a vacina Sabin 3 está habitualmente sob apreciação.
Com base na determinação da sequência nucleótídica, as variantes Sabin 3 que possuem U em 2493 durante a passagem in vitro demonstraram-se acumular mais rapidamente do que as variantes que possuem C na posição 472 (24). No mesmo estudo, o componente de Sabin 3 de diferentes OPVs verificou-se variar grandemente na proporção de C e U na posição 2493. Embora os dados aqui apresentados não indiquem como a proporção de variante 2493 afecta a aceitabilidade dos lotes de vacina, os dados que comparam os vírus LED3 (2493-C) e VR318 (2493-U) sugerem que o resultado dependerá do método do teste de neurovirulência aplicado para a avaliação. Tem particular interesse a capacidade do método do teste intratalâmico CFR para distinguir LED3 e VR318. A reactividade muito pouco usual de VR318 no cérebro, comparada com a vacina LED3 ou RSO+2 sugere que a interacção do vírus com o tecido do cérebro é reforçada quando o vírus possui U na posição 2493 Uma vez que o método da Organização Mundial de Saúde não avalia
a vacina pela injecção por via intratalâmica, os presentes resultados sugerem que este teste é provavelmente menos apto a detectar subpopulações de vírus 2493 em lotes de vacina.
método de detecção incorporando a reacção de cadeia de polimerase, foi utilizada recentemente por Chumakov et al.(2) para determinar se os lotes de vacina continham variantes 472-C contendo mais do que 1,17% do vírus total não correspondeu ao teste de neurovirulência WHO. A determinação de equivalência na posição 472 para LED3 e VR318 foi baseada na análise de sequência do ARN virai. Determinou-se que uma subpopulação variante de 10% é o limite de detecção utilizando-se este método (20). E possível que o método PCR mais sensível detecte subpopulação 472 em prepa✓ rações de vírus LED3 e vírus VR318. E, contudo, pouco provável que estas amostras de vírus difiram na proporção da variante 472-C, porque LED3 e VR318 têm níveis de passagem equivalentes de cADN clonado e foram gerados sob condições idênticas. Uma avaliação preliminar de LED3 e VR318 utilizando-se um método PCR para detectar variantes 472-C mostra que estas amostras não podem ser destinguidas.
Existem várias linhas de dados que apoiam a vantagem selectiva para variantes Sabin 3 possuindo U na posição 2493, in vivo assim como in vitro. 0 isolado KW4 recuperado 5 dias após vacinação, foi previamente demonstrado que difere da estirpe de vacina administrada nas 3 posições: 472=C, 2493=U e 6061=U/C (20). Com base nos resultados apresentados, o nível intermédio de neurovirulência observado para KW4 neste estudo não pode ser atribuído à mutação em 2493 assim como em 472.
-73Weeks-Levy et al. (24) descobriram que dois de três isolados de vírus recuperados no tecido nervoso (cérebro e medula espinal), de macacos que tinham sido injectados por via intraspinal com NC1, o vírus de referência atenuado possuía U na posição 2493. Porque o isolado NC1-679 B tem U em 2493 sem perda do U atenuado a 472 pode especificamente relatar como este vírus se dissemina e replica no cérebro. Os resultados são consistentes com observações de neurovirulência acrescida para VR318 comparativamente a LED3 quando submetidos ao método intratalâmico de teste CFR.
Não está esclarecido o mecanismo pelo qual a modificação de U para C na posição 2493 atenua a LED3 quando comparado com VR318. Esta mutação altera o sexto aminoácido da proteína VP1 da cápside. Na estrutura tridimensional de poliovírus, Hogle et al. (6) demonstrou que esta região de VP1 está introduzida no interior do virião nativo. Mais recentemente Fricks e Hogle (5) demonstraram que após a ligação com células susceptíveis, o virião inicia alterações de conformação resultante numa libertação da proteína VP4 da cápside e a externaiização do terminal amino VP1. Estes autores demonstraram também que a exposição do terminal amino de VP1 foi necessária para a ligação com liposomas e propuseram que estes inventos desempenhassem um papel no mecanismo de entrada na célula. Consistente com estas observações, Kirkegaard (8) descreveu duas mutantes de poliovírus que diferem com diferentes pequenas delecções na região do terminal amino de VP1 que flanqueia qualquer dos lados do sexto resíduo como defeito na libertação fisica de ARN virai da cápside durante a infecção normal. Ambas estas mutantes de delecção exibiram fenotipo de placa pequeno. Desde estes dados, é facil especular
-74que a mutação de Sabin 3 na posição 2493 também afecta o não revestimento virai.
Além da mutação em VP3 (2034) de Sabin 3, determinantes de atenuação foram mapeados nas proteínas da cápside em Sabin 1 (14) e uma estirpe do tipo 2 (P2/712) que se relaciona muito aproximadamente com Sabin 2 (16). Embora estas outras mutações ocorram na proteína VP1 da cápside, a mutação estrutural descrita neste estudo é a primeira das quais a ser mapeada na região do terminal amino de VP1.
Enquanto que, embora um grande número de aspectos da presente invenção tenha aqui sido descrito, é evidente que as construções básicas podem ser alteradas para proporcionar outras realizações que utilizem os processos de moléculas de ADN recombinante, moléculas de cADN e hospedeiras transformadas, da presente invenção. Portanto, deve ser entendido que no âmbito deste invenção é definido pelas reivindicações apensas, mais do que pelos aspectos específicos que foram apresentados como via de exemplo.
-75Quadro 1
Neurovirulência das estirpes LED3 e VR318 utilizando-se o processo de teste CFR NV
A) Intraspinal3
| Grupo | V í rus | Substrato celular | Nucleótido | N9 de macacos | classificação média da lesão | |
| a 472 | 2493 | |||||
| 1 | RSO+2 | PCMK | U | C | 24 | 0,52 |
| 2 | RSO+2 | VERO | U | C | 12 | 0,36 |
| 3 | LED3+2 | VERO | U | C | 16 | 0,34 |
| 4 | VR318+2 | VERO | U | C | 16 | 1 ,31 b |
a administração de 0,2 ml de vírus por via intraspinal (título £.7,6 log TCID^g/ml).
Grupo 4 > 1,2,3 (p < 0,01) por ANOVA e teste de classificação média.
B) Intratalâmicoc
| Grupo | Vírus | Substarto celular | Nucleótido | Νθ de macacos | percentagem positiva | |
| a 472 | 2493 | |||||
| 5 | RSO+2 | PCMK | U | C | 120 | 4 |
| 6 | LED3+2 | VERO | u | C | 10 | 0 |
| 7 | VR318+2*j VERO | u | U | 10 | 20d | |
| 1 |
0,5 ml de vírus administrado por via intracerebral na região talamica de cada hemisfério (título > 7,6 log TCID^g/ml). grupo 7 > 5,6 (p < 0,05) pelo teste de Chi-quadrado.
-76/ ί
V.
Quadro 2
Neurovirulência das estirpes LED3 E VR318 utilizando-se o processo de teste WHO NV
| Grupo | Vírus | Substrato celular | Nucleótido | N2 de macacos | Classificação média da lesão | |
| a 472 | 2493 | |||||
| 1 | LED3+2 | VERO | U | C | 6 | 0,21b |
| 2 | NC1C | PCMK | U | U/C | 6 | 1,08 |
| 3 | VR318+2 | VERO | u | U | 6 | 1,51 |
| I |
a 0,1 ml de vírus administrado por via intraspinal do título 6,5 a 7,5 log TCID^g/ml.
L
Grupo 2 < 1,3 (p < 0,1) por ANOVA e teste de valor médio.
NC1 (SO+2) em uma referência de tipo 3 atenuada para o teste WHO NV.
-77REFERENCIAS
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Claims (3)
1.- Método para a produção de cADN de vírus de ARN verdadeiro, caracterizado pelo facto:
a) de se isolar ARN genómico de um vírus de origem de ARN;
b) de se utilizarem meios de sequenciação de ARN para determinar a sequência nucleotídica de uma fracção do referido ARN genómico isolado;
c) de se utilizarem meios de síntese de cADN para produzir cADN de cadeia dupla a partir do referido ARN genómico isolado;
d) de se utilizarem meios de sequenciação de ADN para determinar a sequência nucleotídica de uma fracção do referido cADN, fracção essa que corresponde â fracção do referido ARN, sequenciada na fase b);
e) de se comparar o referido cADN sequenciado com o referido ARN sequenciado para determinar as diferenças reais na sequência nucleotídica; e
f) de se alterarem as referidas diferenças reais nes se cADN para se obter cADN de vírus de ARN verdadeiro.
2. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o referido vírus que origina o ARN ser um Picornavírus.
3. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto de o referido vírus de origem do ARN, ser uma estirpe de vacina poliovírus 3.
4. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a referida fracção de ARN sequenciada na fa se b) incluir o nucleotido 2493 de uma estirpe de vacina poliovírus 3.
5. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado pelo facto de o referido ARN conter entre cerca de 100 e
200 nucleótidos.
-84/f
6. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se determinar a sequência nucleotídica do ARN virai isolado completo na fase h) .
7. - cADN de vírus de ARN verdadeiro derivado de uma estirpe de vacina poliovírus 3, caracterizado pelo facto de se escolher o referido cADN no grupo constituído por:
a) pLED3.2; e
b) cADNs que codificam por expressão para os polipeptidos codificados para expressão por pLED3.2.
8. - Método para a produção de cADN de vírus de ARN, caracterizado pelo facto:
a) de se isolar ARN genómico de um vírus de origem do ARN;
b) de se utilizarem meios de sequenciação de ARN para determinar a sequência nucleotídica de uma fracção desse ARN genómico isolado;
c) de se utilizarem meios de síntese de cADN para pro duzir um cADN de cadeia dupla a partir do referido ARN genómico isolado;
d) de se utilizarem meios de sequenciação de ADN para determinar a sequência nucleotídica de uma fracção do referido cADN a qual corresponde à referida fracção de ARN sequenciada na fase b);
e) de se comparar a referida sequência de cADN com a referida sequência de ARN para determinar as diferenças reais na sequência nucleótídica; e
f) de se alterarem essas diferenças reais no referido cADN para se obter um cADN de vírus de ARN.
9. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado pelo facto de o referido vírus de origem de ARN ser um Picornavírus.
10. - Método de acordo com a reivindicação 9, caracte rizado pelo facto de o referido vírus de origem de ARN ser uma estirpe de vacina poliovírus 3.
11. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a referida fracção de ARN sequenciada na fase b) conter o nucleótido 2493 de uma estirpe de vacina poliovírus 3.
12. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o referido ARN consistir em cerca de
100 a 200 nucleótidos.
13. - Método de acordo com a reivindicação 8, carac terizado pelo facto de se determinar a sequência nucleótídica do
-86ARN virai isolado completa na fase b).
14. - cADN de vírus de ARN derivado de uma estirpe de vacina poliovírus 3, caracterizado pelo facto de o referido cADN ser escolhido no grupo constituído por:
a) pLED3; e
b) cADNs que codificam por expressão para polipepti dos codificados para expressão por pLED3.
15. - Moléc.ula de ADN recombinante, caracterizada pe lo facto de conter um cADN de vírus de ARN de acordo com uma das reivindicações 7 ou 14.
16. - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo facto de o referido cADN de vírus de ARN estar ligado de forma operativa a um promotor de transcrição de ARN.
17. - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo facto de o referido promotor, ser o promotor T7.
18. - Hospedeiro transformado com uma molécula de ADN recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo facto de o referido hospedeiro ser
-87escolhido entre bactérias, leveduras e outros fungos, células de insectos e células de animais.
19. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de ser uma célula de animal e de ser escolhido no grupo constituído por células Vero, células HeLa, células COS, células CV-1 e células primárias de rim de macaco.
20. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de ser E. coli.
21. - Método para a produção de vírus de ARN viável, caracterizado pelo facto:
a) de se cultivar um hospedeiro de acordo com a reivindicação 18, sob condições que permitem a produção de vírus de ARN viável; e
b) de se recolher o referido vírus de ARN viável da cultura da célula hospedeira referida antes.
22. - Método para a produção de vírus de ARN viável, caracterizado pelo facto:
a) de se aplicarem meios de transcrição in vitro pa ra produzir ARN de uma molécula de ADN recombinante como definida em uma qualquer das reivindicações 8 ou 14;
b) de se isolar esse ARN;
-88c) de se transfectar um hospedeiro com o referido ARN isolado sendo esse hospedeiro uma célula animal;
d) de se cultivar esse hospedeiro sob condições que permitem a produção de vírus de ARN viável; e
e) de se recolher o referido vírus de ARN viável da referida cultura da célula hospedeira.
23. - Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo facto de o referido vírus de ARN ser uma estirpe de vacina poliovírus 3.
24. - Método de acordo com a reivindicação 21 ou
22, caracterizado pelo facto de o referido hospedeito ser uma cé lula primária de rim de macaco.
25. - Método para sondar variantes de uma estirpe de poliovírus 3, caracterizado pelo facto:
a) de se isolar ARN genómico do referido poliovírus ; e
b) de se utilizarem meios de sequenciação de ARN para determinar o nucleótido na posição 2493.
26. - Método para aumentar a atenuação de uma estirpe de poliovírus 3 codificada por um cADN de vírus de ARN, carac terizado pelo facto desse cADN conter a sequência nucleótídica
-89ATT nas posições 2492 a 2494 e de se incluir a fase de mutagénese do referido cADN no nucleótido 2493 para mudar o referido T, para C.
27. - Método de acordo com a reivindicação 26, carac terizado pelo facto de se incluir também a fase de mutagénese do referido cADN no nucleótido 2494 para mudar o referido nucleotido T, para um nucleótido escolhido entre os nucleótidos A, C e
G.
28. - Método para a produção de um vírus de ARN viável, caracterizado pelo facto:
a) de se transfectar um hospedeiro com cADN de vírus de ARN de acordo com a reivindicação 8 ou 14, em que esse hospedeiro é uma célula animal;
b) de se cultivar esse hospedeiro sob condições que permitem a produção de vírus de ARN viável; e
c) de se recolherem os referidos vírus viáveis de ARN da referida cultura da célula hospedeira.
29. - Método de acordo com a reivindicação 28, carac terizado pelo facto de o referido vírus de ARN ser uma estirpe de vacina poliovírus 3.
30.- Método de acordo com a reivindicação 28, carac terizado pelo facto de o referido hospedeiro ser uma célula pri mária de rim de macaco.
31. - Vírus de ARN viável, caracterizado pelo facto de ser produzido de acordo com as fases seguintes:
a) cultura de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 18, sob condições que permitem a produção de vírus de ARN viável; e
b) recolha desse vírus de ARN viável da referida cul tura da célula hospedeira.
32, - Vírus de ARN viável, caracterizado pelo facto de ser produzido de acordo com as fases seguintes:
a) utilização de meios de transcrição in vitro para a produção de ARN a partir de uma molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 15 ou 16;
b) isolamento desse ARN;
c) transfecção de um hospedeiro, constituído por uma célula animal, com o referido ARN isolado;
d) cultura do referido hospedeiro, sob condições que permitem a produção de vírus de ARN viável; e
e) recuperação do referido vírus de ARN viável da referida cultura da célula hospedeira.
33.- Vírus de ARN de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo facto de ser uma estirpe de vacina de poliovírus 3.
34. - Vírus de ARN de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo facto de a referida célula hospedeira ser uma célula primária de rim de macaco.
35. - Vírus de ARN viável, caracterizado pelo facto de ser produzido de acordo com as fases seguintes:
a) transfecção de um hospedeiro com cADN de vírus de ARN verdadeiro, de acordo com a reivindicação 8 ou 14, sendo o referido hospedeiro uma célula animal;
b) cultura desse hospedeiro sob condições que permitem a produção de vírus de ARN viável; e
c) recolha desse vírus de ARN viável da referida cultura da célula hospedeira.
36. - Vírus de ARN de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo facto de ser uma estirpe de vacina poliovírus 3.
37. - Vírus de ARN de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo facto de a referida célula hospedeira ser uma célula primária de rim de macaco.
-9238.- Processo para a preparação de uma vacina eficaz para a imunização contra a infecção por poliovírus, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de um vírus de
ARN produzido do seguinte modo:
a) transformação de uma célula hospedeira apropriada com uma sequência de ãcido nucleico recombinante que codifica para o vírus;
b) cultura da célula hospedeira sob condições que permitem a produção de vírus; e
c) isolamento do vírus produzido desse modo; e sendo esse vírus eficaz para imunizar um indivíduo-, com um veículo apropriado.
3 9.- Método para imunizar um indivíduo contra polioví^ rus infeccioso, caracterizado pelo facto de se administrar a esse indivíduo uma dose apropriada da vacina preparada pelo proces. so de acordo com a reivindicação 38, podendo administrar-se a vacina por via intramuscular, endovenosa, sub-cutânea, intratraqueal ou intranasal, e podendo ó indivíduo ser um ser hd mano.
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