BR112019014613A2

BR112019014613A2 - vacina da pólio

Info

Publication number: BR112019014613A2
Application number: BR112019014613A
Authority: BR
Inventors: Macadam Andrew
Original assignee: Sec Dep For Health And Social Care
Priority date: 2017-01-17
Filing date: 2018-01-17
Publication date: 2020-04-14
Also published as: AU2018209333A1; WO2018134584A1; EP3570880A1; CN110430895A; US20190358315A1; JP2020513840A; CA3050192A1; GB201700825D0; US11938180B2; CN110430895B

Abstract

a presente invenção refere-se a partículas parecidas com o vírus da pólio, as quais compreendem capsídeos do vírus da pólio vazios estabilizados que retêm as suas propriedades antigênicas nativas. a invenção também se refere a métodos de identificação das mutações úteis na produção de tais vírus da pólio como partículas, a métodos de produção de tais vírus da pólio como partículas, e ao uso de tais vírus da pólio como partículas em métodos de vacinação contra o vírus da pólio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para VACINA DA PÓLIO.

Campo da Invenção [0001] A presente invenção refere-se a vacinas da pólio. Em particular, a invenção refere-se a partículas parecidas com o vírus da pólio, a métodos de identificação de modificações úteis na produção de tais partículas parecidas com o vírus da pólio, a métodos de produção de tais partículas parecidas com o vírus da pólio e ao uso de tais partículas parecidas com o vírus da pólio nos métodos de vacinação contra o vírus da pólio.

Antecedentes da Invenção [0002] A iniciativa de erradicação global da poliomielite da Organização Mundial da Saúde (WHO) tem feito um grande progresso. A ferramenta principal usada na iniciativa da erradicação tem sido a vacina da pólio oral atenuada viva. Em consequência da iniciativa, o vírus da pólio do tipo 2 selvagem de ocorrência natural não tem sido visto globalmente desde 1999, do tipo 3 desde 2012, e o Afeganistão e o Paquistão são os únicos países onde o vírus do tipo 1 endógeno ainda está circulando.

[0003] No entanto, a situação é complexa principalmente como consequência da natureza atenuada viva da vacina. Em particular, a vacina atenuada viva foi conhecida por muitos anos como a causa da poliomielite associada à vacina em uma proporção pequena de receptores ou seus contatos, e mais recentemente para poder reverter a um fenótipo transmissível, causando surtos em várias partes do mundo onde os programas de vacinação se tornaram menos vigorosos uma vez que a poliomielite desapareceu. A excreção prolongada dos vírus da pólio derivados de vacina por alguns pacientes imunodeficientes também foi bem documentada. O uso da vacina da

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2/113 pólio oral e sua capacidade de alterar o seu fenótipo, portanto, é um problema na erradicação da poliomielite em todo o mundo.

[0004] Seria extremamente desaconselhável parar imediatamente a vacinação do último vírus do tipo selvagem sue se acredita ter sido isolado porque o vírus do tipo selvagem pode circular indetectado devido à vigilância pobre em algumas áreas. Além disso, os indivíduos imunodeficientes podem continuar a excretar o vírus por um tempo muito longo após a vacinação e podem ser uma fonte para a reemergência. Além disso, ainda podem ocorrer surtos causados pela vacina oral das últimas rodadas do seu uso.

[0005] A vacinação e a vigilância, portanto devem continuar por algum tempo depois que a erradicação do vírus do tipo selvagem é declarada. Os processos estão sendo colocados no lugar para assegurar que quando a poliomielite é erradicada ela não reemerja, e isso engloba a contenção do trabalho no vírus vivo e da produção da vacina necessária para assegurar que a cobertura seja mantida para proteger contra uma possível re-emergência. Os problemas foram colocados no foco pela decisão da WHO de retirar o componente do tipo 2 da vacina pólio oral (OPV) a partir de meados do ano 2016, introduzir uma única imunização com uma vacina da pólio inativada (IPV).

[0006] Todas as vacinas em uso corrente dependem do crescimento do vírus, e a maior parte das vacinas não replicantes (isto é, IPV) envolve o vírus do tipo selvagem conhecido como a causa da poliomielite. Em mais detalhes, a produção de IPV envolve o crescimento de grandes quantidades de vírus da pólio vivo, os quais são inativados então com formalina. As cepas do vírus da pólio em uso corrente são principalmente tipos selvagens conhecidos como capazes de causar a poliomielite nos seres humanos, embora duas empresas tenham produtos licenciados baseados nas cepas Sabin atenuadas vivas na vacina da pólio oral atual. A produção segura de IPV é

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3/113 essencial e a pesquisa convencional é focalizada na elaboração da produção viável de cepas que são intrinsecamente mais seguras do que as cepas vivas atenuadas atualmente em uso.

[0007] A vacina Salk é baseada em três cepas selvagens, do tipo selvagem virulento de vírus da pólio, ou seja, Mahoney (vírus da pólio do tipo 1), MEF-1 (vírus da pólio do tipo 2) e Saukett (vírus da pólio do tipo 3), crescidas em células Vero ex vivo (Wood et al., Biologicals 25:59-64, 1997). Os vírus da pólio do tipo selvagem são então inativados com formalina para produzir a IPV. É sabido que as cepas do tipo selvagem usadas atualmente na produção de IPV são paralíticas nos seres humanos e usadas em grandes quantidades na produção de IPV. Isto apresenta um sério problema de contenção, que pode não ser fácil de solucionar com as escalas de produção requeridas para a IPV. Algum interesse foi expresso no uso das mesmas cepas na manufatura da vacina inativada tal como é usado na vacina oral com base em que são atenuadas e, portanto, apresentam um perigo menor caso escapem. No entanto, a sua instabilidade na replicação nos seres humanos significa que elas permanecem perigosas, e as suas propriedades imunogênicas são diferentes daquelas das cepas do tipo selvagem usadas atualmente de modo que um grande programa de desenvolvimento clínico se faz necessário para desenvolver uma IPV baseada nessas cepas.

[0008] As vacinas de vírus da pólio atenuadas vivas desenvolvidas por Sabin nos anos 50 ao usar procedimentos essencialmente empíricos têm sido usadas em todo o mundo como vacinas da pólio orais vivas. Nos últimos anos passados, os cientistas empregaram uma série de técnicas biológicas moleculares em uma tentativa de elucidar o mecanismo por meio do qual a neurovirulência dessas cepas de vacina é reduzida. A maior parte do trabalho se concentrou nos sorotipos 1 e

3. Para ambas essas sequências completas de nucleotídeos as cepas

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4/113 de vacina foram comparadas com as aquelas de seus progenitores neurovirulentos. No caso do vírus da pólio do tipo 1, a cepa de vacina difere de seu progenitor em 47 posições no genoma de 7441 bases (Nomoto et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 79:5793-5797, 1982). Os estudos análogos no vírus da pólio do tipo 3 revelam apenas 10 diferenças de sequências de nucleotídeos no genome de 7432 bases entre a vacina e a sua cepa progenitora (Stanway et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:1539-1543, 1984). A cepa do tipo 2 foi desenvolvida de um pai naturalmente atenuado, mas a análise de uma cepa revertente neurovirulenta, isolada de um caso de poliomielite associada à vacina, identificou 17 diferenças da Sabin 2 (Pollard et al., J. Virol. 63: 4949-4951, 1989). Tal como descrito acima, há, no entanto, estímulos associados com o uso de vírus atenuados vivos, tal como o risco de reversão a uma forma transmissível virulenta.

[0009] Portanto, seria altamente desejável desenvolver uma vacina que não envolvesse o vírus da pólio infeccioso em nenhum estágio no processo de produção.

Sumário da Invenção [0010] Uma solução possível à necessidade do crescimento do vírus seria a geração de capsídeos virais vazios pela tecnologia recombinante. No entanto, até o presente tais partículas são tão instáveis que não são utilizáveis. Os autores da presente invenção desenvolveram um método que permite a identificação de modificações dentro do capsídeo do vírus da pólio que modulam a estabilidade do capsídeo, em particular as modificações que estabilizam o capsídeo do vírus da pólio. Tais modificações são tipicamente mutações na sequência de aminoácidos do capsídeo. Ao usar esse método, os autores da presente invenção manipularam geneticamente o capsídeo do vírus da pólio, para produzir capsídeos vazios estáveis, também conhecidos como partículas parecidas com o vírus da pólio (VLP) para

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5/113 todos os três sorotipos. Os autores da presente invenção demonstraram que as ditas VLPs são extremamente estáveis e geram níveis elevados de anticorpos protetores nos modelos animais. Esses VLPs conferem, portanto, grandes vantagens em comparação às atuais OPV e IPV em termos de segurança e propriedades do produto.

[0011] Por conseguinte, a presente invenção provê uma partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) que compreende pelo menos uma modificação em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada, em que pelo menos uma dita modificação estabiliza a VLP. Pelo menos uma dita modificação pode ser uma modificação tal como definido na Tabela 1, 2 ou 3. Tipicamente, há pelo menos uma modificação em cada uma dentre (a) uma interface de protômero; e (b) uma interface de pentâmero, em que pelo menos uma dita modificação em cada uma dentre a interface de protômero e a interface de pentâmero é uma modificação tal como definido na Tabela 1,2 ou 3. A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção pode ser/é derivada de um vírus da pólio do tipo selvagem ou de uma cepa de vacina, e pode ser derivada de um vírus da pólio tipo 1, tipo 2 ou tipo

3. A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção pode ser derivada de: (a) um vírus da pólio do tipo 1 selecionado de Mahoney e Sabin 1; (b) um vírus da pólio do tipo 2 selecionado de MEF e Sabin 2; ou (c) um vírus da pólio do tipo 3 selecionado de Saukett e Sabin 3.

[0012] Em modalidades preferidas, a invenção provê a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) que compreende pelo menos três modificações em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada que estabilizam a VLP, em que há pelo menos uma modificação em cada uma dentre: (a) uma interface de protômero; e (b) uma interface de pentâmero.

[0013] A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção

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6/113 também pode compreender pelo menos uma modificação em um domínio de bolsa em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada, em que a dita modificação pode ser tal como definido na Tabela 1,2 ou 3.

[0014] A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 1, em que: (a) a interface de protômero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 3178 e 1248 ou em resíduos que correspondem aos mesmos; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 2025 e 2057 ou em resíduos que correspondem aos mesmos; em que opcionalmente a dita VLP compreende uma modificação em um domínio de bolsa, e a dita modificação é de preferência uma mutação no resíduo 1196 ou em um resíduo que corresponde ao mesmo. Em algumas modalidades: (a) a interface de protômero compreende uma ou ambas as mutações Q3178L e H1248P; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma ou ambas as mutações T2025A e D2057E; em que opcionalmente a dita VLP compreende uma modificação em um domínio de bolsa, e a dita modificação é de preferência a mutação V1196L. A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) pode compreender ambas as mutações nos resíduos 3178 e 1248 da interface de protômero ou resíduos que correspondem aos mesmos, ambas as mutações nos resíduos 2025 e 2057 da interface ou resíduos de pentâmero que correspondem aos mesmos e opcionalmente a mutação no resíduo 1196 do domínio de bolsa ou em um resíduo que corresponde ao mesmo.

[0015] A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 2, em que: (a) a interface de protômero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 3178 e 1107 ou em resíduos que correspondem aos mesmos; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma mutação em um ou mais

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7/113 dos resíduos 3085, 1041 e 2057 ou em resíduos que correspondem aos mesmos; em que opcionalmente a dita VLP compreende uma modificação em um domínio de bolsa, e a dita modificação é de preferência uma mutação em um ou mais dos resíduos 1134, 1159 e 1183 ou em resíduos que correspondem aos mesmos. Em algumas modalidades: (a) a interface de protômero compreende uma ou ambas as mutações Q3178L e V1107I; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma ou mais das mutações L3085F, T10411 e D2057A; em que opcionalmente a dita VLP compreende uma modificação em um domínio de bolsa, e a dita modificação é de preferência um ou mais das mutações F1134L, Y1159F e V1183L. A partícula parecida com o vírus da pólio pode compreender (a) as mutações no resíduo 3178 da interface de protômero ou em um resíduo que corresponde ao mesmo, mutações em ambos os resíduos 3085 e 1041 da interface ou resíduos de pentâmero que correspondem aos mesmos e opcionalmente mutações em ambos os resíduos 1134 e 1159 do domínio ou resíduos de bolsa que correspondem aos mesmos; ou (b) ambas as mutações nos resíduos 3178 e 1107 da interface de protômero ou resíduos que correspondem aos mesmos, a mutação no resíduo 2057 da interface de pentâmero ou em um resíduo que corresponde ao mesmo, e opcionalmente mutações em ambos os resíduos 1134 e 1183 de domínio de bolsa ou resíduos que correspondem aos mesmos.

[0016] A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 3, em que: (a) a interface de protômero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 2215 e 3091 ou em resíduos que correspondem aos mesmos; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 2018 e 3085 ou em resíduos que correspondem aos mesmos; em que opcionalmente a dita VLP compreende uma modificação em um domínio de bolsa, e a dita modificação é de

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8/113 preferência uma mutação no resíduo 1132 (VP1 132) ou em um resíduo que corresponde ao mesmo. Em algumas modalidades: (a) a interface de protômero compreende uma ou ambas as mutações L2215M e F3091S; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma ou ambas as mutações L2018I e L3085F; em que opcionalmente a dita VLP compreende uma modificação em um domínio de bolsa, e a dita modificação é de preferência a mutação F1132L. A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) pode compreender ambas as mutações nos resíduos 2215 e 3091 da interface de protômero ou em resíduos que correspondem ao mesmos, ambas as mutações nos resíduos 2018 e 3085 da interface de pentâmero ou em resíduos que correspondem aos mesmos, e opcionalmente da mutação no resíduo 1132 do domínio de bolsa, ou em um resíduo que corresponde ao mesmo.

[0017] A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção também pode compreender uma ou mais modificações adicionais dentro de um ou mais o domínio de bolsa, a interface de protômero e/ou a interface de pentâmero, em que opcionalmente uma ou mais ditas modificações adicionais consistem em uma modificação tal como definido na Tabela 1,2 ou 3.

[0018] A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção também pode compreender pelo menos uma modificação adicional em um ou mais domínios estruturais adicionais, em que opcionalmente uma ou mais ditas modificações adicionais consistem em uma modificação tal como definido na Tabela 1, 2 ou 3. Um ou mais ditos domínios estruturais adicionais podem ser selecionados de: (a) uma interface de VP2/VP3; (b) uma rede interna; e/ou (c) um cânion. A rede interna pode compreender um eixo tríplice, um eixo quintuple e/ou um tubo abaixo do eixo quintuple, e em que pelo menos uma dita modificação adicional fica localizada em ou bastante próxima do dito eixo tríplice, do eixo quintuple ou do tubo abaixo do eixo quintuple.

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9/113 [0019] A VLP da invenção pode ser derivado de um vírus da pólio do tipo 1, em que: (a) a interface de VP2/VP3 compreende uma mutação no resíduo 3119 ou em um resíduo que corresponde ao mesmo; e/ou a rede interna compreende uma mutação no resíduo 4018 ou em um resíduo que corresponde ao mesmo. Em algumas modalidades: (a) a interface de VP2/VP3 compreende a mutação L3319M; e/ou (b) a rede interna compreende a mutação R4018G. A VLP da invenção pode ser derivado de um vírus da pólio do tipo 2, em que a rede interna compreende uma mutação no resíduo 4057, ou em um resíduo que corresponde ao mesmo. Em algumas modalidades, a rede interna compreende a mutação I4057V. A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 3, em que:

(a) a interface de VP2/VP3 compreende uma mutação no resíduo 2241 ou em um resíduo que corresponde ao mesmo; (b) a rede interna compreende uma mutação em um ou mais dos resíduos 1054, 4067 e 3019 ou em resíduos que correspondem aos mesmos; e/ou (c) o cânion compreende uma mutação no resíduo 1105 ou em um resíduo que corresponde ao mesmo. Em algumas modalidades: (a) a interface de VP2/VP3 compreende a mutação D2241E; (b) a rede interna compreende uma ou mais mutações de alanina em valina VP1 54, T4067A e H3019Y; e/ou (c) o cânion compreende a mutação T1105M. A partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) também pode compreender uma ou mais modificações adicionais dentro de uma ou mais dentre a interface de VP2/VP3, a rede interna e/ou o cânion, em que opcionalmente uma ou mais ditas modificações adicionais consistem em uma modificação tal como definido na Tabela 1,2, ou 3. [0020] Em algumas modalidades, a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção: (a) é derivada de um vírus da pólio do tipo 1 e compreende (i) as mutações Q3178L e H1248P na interface de protômero, (ii) as mutações T2025a e D2057E na interface de

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10/113 pentâmero, (iii) a mutação L3119M na interface de VP2/VP3, e (iv) a mutação R4018G na rede interna; em que a dita VLP também compreende opcionalmente a mutação V1196L no domínio de bolsa; (b) é derivado de um vírus da pólio do tipo 2 e compreende (i) as mutações F1134L e Y1159F no domínio de bolsa, (ii) a mutação Q3178L na interface de protômero, e (iii) as mutações L3085F e T10411 na interface de pentâmero; (c) é derivado de um vírus da pólio do tipo 2 e compreende (i) as mutações F1134L e V1183L no domínio de bolsa, (ii) as mutações Q3178Le V11071 na interface de protômero, (iii) a mutação D2057A na interface de pentâmero; e (iv) a mutação I405V na rede interna; ou (d) é derivado de um vírus da pólio do tipo 3 e compreende (i) a mutação F1132L no domínio de bolsa, (ii) as mutações L2215M e F3091S na interface de protômero, (iii) as mutações L2018I e L3085F na interface de pentâmero, (iv) a mutação D2241E na interface de VP2/VP3, (v) as mutações T4067A, H3019Y e opcionalmente A1054V na rede interna, e (vi) a mutação T1105M no cânion.

[0021] Em algumas modalidades, a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção é: (a) uma VLP do tipo 1 derivada de um vírus da pólio do tipo 1 com (i) uma P1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 16 ou 17; (ii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 1, uma VP0 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 5, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 3; (iii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q:1, uma VP2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 2, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 3, e uma VP4 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 4; e/ou (iv) uma P1; VP1, VP0 e VP3; ou uma VP1, uma VP2, uma VP3 e uma VP4 que tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de com identidade de sequência em relação às sequências de aminoácidos de (i) a (iii); (b)

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11/113 uma VLP do tipo 2 derivado de um vírus da pólio do tipo 2 com (i) uma P1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 18 ou 19; (ii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 6, uma VPO que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 10, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 8; (iii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 6, uma VP2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 7, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 8, e uma VP4 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 9; e/ou (iv) uma P1; VP1, VPO e VP3; ou uma VP1, uma VP2, uma VP3 e uma VP4 que tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de com identidade de sequência em relação às sequências de aminoácidos de (i) a (iii); ou (c) uma VLP do tipo 3 derivada de um vírus da pólio do tipo 3 com (i) uma P1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 20 ou 21; (ii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 11, uma VPO que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 1, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 13; (iii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q:11, uma VP2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 12, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 13, e uma VP4 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 14; e/ou (iv) uma P1; VP1, VPO e VP3; ou uma VP1, uma VP2, uma VP3 e uma VP4 que tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de com identidade de sequência em relação às sequências de aminoácidos de (i) a (iii).

[0022] A invenção também provê um método de identificação de uma modificação dentro de um capsídeo do vírus da pólio que aumenta a estabilidade do dito capsídeo do vírus da pólio, o qual compreende:

(a) a introdução de uma mutação desestabilizante no capsídeo de uma cepa do vírus da pólio; (b) o crescimento da dita cepa do vírus da pólio

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12/113 a temperaturas semipermissivas; e (c) a seleção dos vírus da pólio resultantes para identificar uma ou mais modificações que revertem o efeito da mutação desestabilizante. A temperatura semipermissiva pode estar a uma temperatura na faixa de cerca de 38°C a cerca de 40°C. O dito método também pode compreender a etapa de introdução de uma ou mais modificações identificadas na etapa (c) em um vírus da pólio do tipo selvagem e a verificação se uma ou mais ditas modificações aumentam a estabilidade do capsídeo do vírus da pólio.

[0023] A invenção também provê um método de produção de uma partícula parecida com o vírus da pólio (VLP), o qual compreende: (a) a introdução de um transcrito de RNA infeccioso que codifica a VLP em uma célula de mamífero hospedeira; ou (b) a produção recombinante dos polipeptídeos derivados de capsídeos do vírus da pólio que compreendem uma ou mais modificações identificadas pelo método da invenção, e a montagem dos ditos polipeptídeos para formar uma VLP.

[0024] A invenção também provê uma partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) que pode ser obtida pelo método da invenção. A dita VLP pode tal ser como definido no presente documento.

[0025] A invenção também provê uma composição que compreende a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção e um excipiente ou um diluente farmaceuticamente aceitável.

[0026] A invenção também provê uma vacina, a qual compreende: (i) a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção; ou (ii) um ácido nucleico que codifica a VLP da invenção; e um adjuvante. A dita vacina pode ser um vetor de ácido nucleico que compreende o polinucleotídeo ou o vetor de expressão da invenção. A dita vacina pode ser uma vacina de RNA que compreende um RNA P1 que codifica para a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) e que também codifica uma protease viral para a divagem do precursor de P1.

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13/113 [0027] A invenção também provê a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP), a composição, ou a vacina da invenção para ser usadas em um método de vacinação contra o vírus da pólio.

[0028] A invenção também provê o uso de uma partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) ou da composição da invenção na manufatura de um medicamento para ser usado em um método de vacinação contra o vírus da pólio.

[0029] A invenção também provê um método de vacinação de um indivíduo contra o vírus da pólio, em que o método compreende a administração, a um indivíduo com necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz da partícula parecida com o vírus da pólio (VLP), da composição ou da vacina da invenção.

[0030] A invenção também provê uma molécula de polinucleotídeo que codifica a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção. [0031] A invenção também provê um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da invenção, o qual é ligado operavelmente a um promotor.

[0032] A invenção também provê uma célula que produz a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) da invenção, em que opcionalmente a dita célula compreende um polinucleotídeo ou vetor de expressão da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos [0033] Figura 1: O alinhamento do polipeptídeo do precursor do capsídeo P1 das cepas de Mahoney, Sabin 1, MEF, Sabin 2, Saukett e Sabin 3. As proteínas VP maduras são clivadas do precursor de P1 tai como indicado a seguir: VP0 (resíduos 1-341 de Mahoney) mostrado em negrito (realce); VP3 (resíduos 342-579 de Mahoney) mostrado como sublinhado; VP1 (resíduos 580-882 de Mahoney) mostrado em itálico. O VP0 também é clivado no vírion maduro do vírus da pólio em VP2 (resíduos 70-341 de Mahoney), mostrado como pontilhadoPetição 870190083657, de 27/08/2019, pág. 16/144

14/113 sublinhado; e VP4 (resíduos 1-69 de Mahoney), mostrado como duplamente-sublinhado· [0034] Figura 2: Localização de mutações estabilizantes em três estereótipos do vírus da pólio, (a) Uma ilustração de desenho animado do tipo 1 (capsídeo do vírus da pólio da cepa de Mahoney) em focalização cinzenta na área que circunda uma subunidade protomérica individual (cadeias de proteína coloridas com azul VP1, verde VP2 e vermelho VP3). As características do capsídeo descritas nas Tabelas 6 e 7 são identificadas no capsídeo tal como segue - anel amarelo: cânion, estrela ciano: volso de VP1, linha roxa: interface de pentâmero, pentágono preto: eixo quintuple, triângulo preto: eixo tríplice, VP1 betacoroa de círculo vermelho, linha alaranjada: interface de VP2/VP3, linha preta: interface de protômero e linha magenta: interface de VP1/VP2;

(b) uma subunidade protomérica ampliada em cinza com as mutações para todos os três estereótipos mostrados com codificação em cores como: azul: Mahoney-SC7 (tipo 1), verde: MEF-SC5a (tipo 2) e vermelho: Saukett-SC8 (tipo 3).

[0035] Figura 3: A estabilização de partículas do vírus reduz a infectividade. Os números e as combinações diferentes das mutações estabilizantes descritas nas Tabelas 4 e 6/7, assim como outros identificados de maneiras similares, foram introduzidos em sequências de codificação de capsídeo de clones infecciosos. Células HEp2c foram transfectadas com transcritos de RNA infecciosos e incubadas a 37°C até que o efeito citopático de 100% (CPE) foi observado, ou congeladas depois de 7 dias se nenhum CPE fosse aparente. Os sobrenadantes clarificados dessas culturas de células foram passados de modo cego para células HEp2c frescas e as células foram incubadas a 37°C até que 100% CPE foram observados ou por mais 7 dias. (A) mutantes de capsídeos de Mahoney do tipo 1, (B) mutantes de capsídeos MEF-1 do tipo 2, (C) mutantes de

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15/113 capsideos Leon do tipo 3. * Nenhum CPE observado após a passagem de modo cego.

[0036] Figura 4: Termoestabilidade de partículas de Leon do tipo 3. A reatividade de (A) vírus e (B) de alíquotas de capsídeos vazios com MAb 520 e MAb 517 em ELISA após a incubação a temperaturas diferentes por 10 minutos. MAb 520 é específico para o antígeno de D, e MAb 517 é específico para o antígeno de C.

[0037] Figura 5: A estabilidade a longo prazo do vírus e preparados de capsídeos vazios comparada à referência de IPV. A proporção de reatividade do antígeno de D remanescente após a incubação a 37°C em relação à incubação a 4°C. As alíquotas de IPV, vírus e amostras de capsídeos vazios foram incubadas a 37°C e as amostras foram removidas a intervalos e analisadas por ELISA com Antígeno D; a reatividade é expressaem relação às amostras incubadas a 4°C para o mesmo período. (A) Tipo 1, (B) Tipo 2, (C) Tipo 3.

[0038] Figura 6: A soroconversão e a proteção contra o estímulo induzido pelas VLPs. Camundongos transgênicos que expressam o receptor de vírus da pólio humano foram imunizados intraperitonealmente uma vez ou duas vezes (x2) com PBS ou doses equivalentes humanas de 0,5 de IPV ou de VLPs (A, B - tipo 1; C, D tipo 2; E, F - tipo 3) e em seguida estimulados intramuscularmente com 25 PD50 de vírus do tipo selvagem homólogo. Os gráficos A, C e E mostram a neutralização de títulos de anticorpos contra aos vírus de sorotipos homólogos nas amostras de sangue tiradas um dia antes do estímulo. Os gráficos B, D e F mostram a taxa de sobrevivência depois do estímulo com (B) Mahoney do tipo 1 (D), MFE-1 do tipo 2 e (F) Saukett do tipo 3. As barras (A, C e E) indicam o Cl de 95% do título médio geométrico.

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Descrição Detalhada da Invenção

Vírus da pólio e partículas parecidas com o vírus da pólio [0039] O vírus da pólio é um enterovirus humano da família Picornaviridae. A partícula viral é tem cerca de 30 nm de diâmetro e um formato icosaédrico. O genoma do vírus da pólio é uma única molécula de RNA linear. Essa molécula de RNA compreende uma extremidade 5' longa, altamente estruturada, a qual não codifica para um produto de polipeptídeo e contém seis domínios, I a VI. Vários desses domínios (incluindo o domínio V) compreendem em cojunto um Sítio de Entrada de Ribossoma Interno (IRES) que determina a iniciação da translação. A região de codificação do RNA do vírus da pólio é dividida em duas regiões, uma que codifica para as proteínas estruturais que compõem o capsídeo viral, e a outra que codifica para as proteínas não estruturais tais como proteases virais e um polimerase de RNA dependente do RNA viral. A região 3' não transladada é menos complexa do que a região que não de codificação 5'.

[0040] A molécula de RNA do vírus da pólio é transladada pela célula hospedeira como um polipeptídeo longo que é então clivado por proteases virais como proteínas virais individuais. O capsídeo do vírus da pólio é codificado pela região de codificação do capsídeo, P1. O precursor do capsídeo P1 também é clivado nas proteínas VP0, VP1 e VP3 por uma protease viral (3C ou 3CD) com uma divagem final de VP0 em VP4 e VP2 que ocorre na encapsidação do RNA por um mecanismo que não é totalmente compreendido. O capsídeo de uma partícula completa do vírus da pólio é de formato icosaédrico, e formado por doze pentâmeros. Cada pentâmero de uma partícula completa do vírus da pólio consiste em cinco protômeros, em que cada protômero compreende uma única cópia de cada uma de VP1, VP2, VP3 e VP4.

[0041] Antes da encapsidação do RNA, as proteínas VP0, VP1 e VP3 estão presentes dentro da célula infectada em subunidades

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17/113 analogous de protômero e pentâmero, bem como nas partículas icosaédricas que consistem em doze pentâmeros, mas sem conter nenhum RNA viral. Essas partículas são conhecidas como capsídeos vazios. Os capsídeos vazios não apresentam um número de interações intersubunidades em comparação às partículas de vírus infecciosas; essas interações são formadas somente após a encapsidação do RNA e a divagem da VPO em VP2 e VP4 (a chamada divagem de maturação). Essas interações desempenham um papel importante na termoestabilidade da partícula de vírus infecciosa.

[0042] Uma partícula completa do vírus da pólio, também conhecida como um virion do vírus da pólio, é a forma infediva completa do vírus da pólio, a qual compreende o capsídeo do vírus da pólio e a molécula do RNA do vírus da pólio. Tal como definido no presente documento, a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) é uma partícula do vírus da pólio vazia, isto é, uma VLP compreende um capsídeo do vírus da pólio, mas não apresenta a molécula do RNA do vírus da pólio. Uma VLP da invenção pode compreender ou consistir em um capsídeo do vírus da pólio. Desse modo, o capsídeo de uma VLP compreende tipicamente doze pentâmeros, cada um deles composto por cinco protômeros. Cada protômero de uma VLP compreende tipicamente uma única cópia de cada um de VPO, VP1 e VP3. Deve ser observado que uma VLP tal como definido no presente documento não pode ser derivada de uma partícula completa do vírus da pólio, por exemplo, mediante a remoção do RNA.

[0043] Tal como descrito no presente documento, uma VLP da invenção compreende um VPO, um VP1 e um VP3. Algumas das modificações estabilizantes identificadas pelos autores da presente invenção são indicadas por suas posições dentro do VP2 ou do VP4 da partícula madura do vírus da pólio a partir da qual as VLPs da invenção foram derivadas. Em mais detalhes, tal como descrito no presente

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18/113 documento, o vírus da pólio VPO é clivado durante a montagem de virions para produzir VP2 e VP4. Desse modo, onde é feita referência no presente documento às modificações em posições particulares em VP2 e em VP4, as posições dessas modificações podem ser lidas de imediato na sequência VPO de uma maneira direta. Como um exemplo não limitador, 2025 na cepa de Mahoney (tipo 1) é o resíduo 25 de VP2 de Mahoney (SEQ ID N².: 2), que corresponde ao resíduo 93 de VPO de Mahoney (SEQ ID N².: 5). Similarmente, 4067 na cepa de Saukett (tipo

3) é o resíduo 67 de VP4 de Saukett (SEQ ID N².: 14), que corresponde ao resíduo 67 de VPO de Saukett (SEQ ID N².: 15). Desse modo, referências no presente documento a um resíduo dentro de VP2 (por exemplo, 2025, 2057, 2067, 2197, 2139, 2215, 2016, 2018, 2124 e 2241) ou VP4 (por exemplo, 4017, 4018, 4023, 4046, 4055, 4057, 4065 e 4067) podem ser imediata e intercambiavelmente indicadas pelo resíduo correspondente dentro da sequência de VPO de uma VLP. Isto fica evidente a partir da Figura 1, que fornece um alinhamento de várias sequências de polipeptídeos P1 de precursor de capsídeo do vírus da pólio do tipo 1, tipo 2 e tipo 3, em que as sequências de aminoácidos de VPO, VP2 e VP4 são indicadas claramente. Para fins de consistência com a nomenclatura convencional para o vírus da pólio, as modificações que podem ser encontradas dentro da proteína de VP2 e/ou VP4 madura em um virion do vírus da pólio são tipicamente indicadas no presente documento a título de referência às suas posições em VP2/VP4. No entanto, tal como explicado acima, nas VLPs da invenção essas modificações serão de fato encontradas em posições correspondentes dentro de VPO.

[0044] As partículas do vírus da pólio expressam dois antígenos distintos. O antígeno D é associado principalmente com o vírus infeccioso e o antígeno C com partículas não infecciosas em uma conformação diferente, por exemplo, resultante do aquecimento; os

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19/113 capsídeos vazios do tipo selvagem, fora da célula, são particularmente passíveis de ser convertidos na especificitdade do antígeno C.

[0045] As partículas do vírus da pólio vazias em uma conformação nativa (D) são produzidas pelo vírus da pólio e por outros picornavírus aparentemente como uma parte necessária do processo de montagem, para prover possivelmente um reservatório de subunidades de capsídeo em uma forma que seja resistente às passagens celulares que são focadas em motivos não desdobrados ou hidrofóbicos para a degradação proteolítica. As partículas vazias naturais não apresentam algumas das interações intersubunidades presentes em partículas de vírus maduras e são dissociáveis em subunidades de pentâmeros, presumivelmente de modo que possam então ser remontadas em torno do RNA viral durante a encapsidação do genoma. Desse modo, as partículas vazias naturais são extremamente instáveis e, portanto, inadequadas para a produção de vacina. Fora da célula, essas partículas são convertidas facilmente à temperatura fisiológica em uma conformação antigênica não nativa diferente, conhecida como Cantigênica (ou algumas vezes H-antigênica). A forma D-antigênica nativa (algumas vezes conhecida como N-antigênica) é responsável por induzir uma imuno resposta protetora e a forma C-antigênica não nativa não possui imunogenicidade protetora.

[0046] Para resolver este problema, os autores da presente invenção desenvolveram um método que permite a identificação de modificações (tipicamente mutações) dentro do capsídeo que modulam a estabilidade do capsídeo, em particular as mutações do vírus da pólio que estabilizam o capsídeo do vírus da pólio nativo antigênico.

[0047] Ao usar este método, os autores da presente invenção produziram VLPs (isto é, partículas virais vazias) com as propriedades antigênicas e imunogênicas corretas, mas que compreendem modificações no capsídeo do vírus da pólio que estabilizam o capsídeo,

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20/113 e desse modo as VLPs. Desse modo, as VLPs da invenção tipicamente: (i) são pelo menos tão estáveis quanto a IPV; (ii) têm a mesma estrutura antigênica que o vírus nativo; e (iii) são pelo menos tão imunogênicas quanto a IPV.

[0048] As VLPs da invenção podem ser expressas pela tecnologia recombinante e podem ser usadas na produção da vacina do vírus da pólio sem requerer o vírus infeccioso em qualquer estágio na produção de vacina. Desse modo, as VLPs da invenção conferem grandes vantagens em comparadas às atuais IPV e OPV e aos métodos de produção em termos de segurança e das propriedades do produto de vacina.

Sorotipos do Vírus da Pólio [0049] Há três sorotipos do vírus da pólio conhecidos: tipos 1,2 e 3. Os exemplos do vírus da pólio do tipo selvagem incluem Mahoney (tipo

1), MEF-1 (tipo 2) e Saukett (tipo 3). As cepas do vírus da pólio atenuadas vivas foram desenvolvidas a partir de cepas do tipo selvagem por Sabin nos anos 50 e são indicadas como Sabin 1 (tipo 1), Sabin 2 (tipo 2) e Sabin 3 (tipo 3).

[0050] Uma VLP da invenção pode ser derivada de qualquer sorotipo do vírus da pólio, isto é, o sorotipo 1,2 ou 3. Além disso, uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo selvagem ou de uma cepa de vacina. Desse modo, uma VLP da invenção pode ser derivada de uma cepa do tip1 selvagem 1 (por exemplo, Mahoney), uma cepa de vacina do tipo 1 (por exemplo, Sabin

1), uma cepa do tipo selvagem 2 (por exemplo, MEF-1), uma cepa de vacina do tipo 2 (por exemplo, Sabin 2), uma cepa do tipo selvagem 3 (por exemplo, Saukett) ou uma cepa de vacina do tipo 3 (por exemplo, Sabin 3).

[0051] No contexto da presente invenção, uma VLP pode ser tipicamente considerada como derivada de um vírus da pólio particular

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21/113 se as proteínas do capsídeo do vírus da pólio, o polipeptídeo do vírus da pólio ou a molécula correspondente do RNA do vírus da pólio que codifica proteína(s) do capsídeo do vírus da pólio ou dito polipeptídeo do vírus da pólio do dito vírus da pólio forem modificados de modo a compreender uma ou mais modificações divulgadas no presente documento. Como um exemplo não limitador, uma VLP da invenção é derivada de Sabin 3 se compreender as proteínas do capsídeo de Sabin 3 (ou se for produzida ao usar o polipeptídeo de Sabin 3 ou a molécula do RNA de Sabin 3) modificadas de modo a incluir uma ou mais das modificações divulgadas no presente documento. Por exemplo, uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 1, que tem: (a) uma sequência de aminoácidos VP1 que corresponde à SEQ ID N².: 1, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 1; (b) uma sequência de aminoácidos VP3 que corresponde à SEQ ID N².: 3, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 3; (c) uma sequência de aminoácidos VPO que corresponde à SEQ ID N².: 5, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 5; (d) uma sequência de aminoácidos VP2 que corresponde à SEQ ID N².: 2, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 2; e/ou (e) uma sequência de aminoácidos

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VP4 que corresponde à SEQ ID N².: 4, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 4, ou qualquer combinação destas. Uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 1, que tem uma sequência de aminoácidos P1 que corresponde à SEQ ID N².: 16 ou 17, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 16 ou 17. Tipicamente, uma VLP do tipo 1 da invenção tem uma sequência de aminoácidos VP1 que corresponde à SEQ ID N².: 1, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 1; uma sequência de aminoácidos VP3 que corresponde à SEQ ID N².: 3, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 3; e uma sequência de aminoácidos VP0 que corresponde à SEQ ID N².: 5, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 5. De preferência, as ditas sequências de aminoácidos VP1, VP2, VP3 têm pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO. recitada. De preferência uma VLP do tipo 1 da invenção tem uma sequência de aminoácidos VP1 que corresponde à SEQ ID N².: 1, ou

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23/113 uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 1; uma sequência de aminoácidos VP3 que corresponde à SEQ ID N².: 3, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².:3; uma sequência de aminoácidos VP2 que corresponde à SEQ ID N².: 2, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².:2; e uma sequência de aminoácidos VP4 que corresponde à SEQ ID N².: 4, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 4. De preferência, as ditas sequências de aminoácidos VP1, VP3, VP2 e/ou VP4 têm pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a ID SEQ NO. recitada. Desse modo, uma VLP do tipo 1 da invenção pode ter uma P1, VP0, VP1, VP2, VP3 e/ou VP4 (ou qualquer combinação destas) com uma sequência de aminoácidos tal como definido acima, mas contendo uma ou mais modificações estabilizantes tal como descrito no presente documento.

[0052] Uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 2, que tem: (a) uma sequência de aminoácidos VP1 que corresponde à SEQ ID N².: 6, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos

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99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 6; (b) uma sequência de aminoácidos VP3 que corresponde à SEQ ID N².: 8, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 8; (c) uma sequência de aminoácidos VPO que corresponde à SEQ ID N².: 10, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 10;

(d) uma sequência de aminoácidos VP2 que corresponde à SEQ ID N².: 7, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 7; e/ou (e) uma sequência de aminoácidos VP4 que corresponde à SEQ ID N².: 9, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 9, ou qualquer combinação destas. Uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 2, que tem uma sequência de aminoácidos P1 que corresponde à SEQ ID N².: 18 ou 19, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 18 ou 19. Tipicamente, uma VLP do tipo 2 da invenção tem uma sequência de aminoácidos VP1 que corresponde à SEQ ID N².: 6, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos

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99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 6; uma sequência de aminoácidos VP3 que corresponde à SEQ ID N².: 8, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 8; e uma sequência de aminoácidos VPO que corresponde à SEQ ID N².: 10, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².:10. VP1, VP3 e/ou VPO. De preferência, as ditas sequências de aminoácidos têm pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N². recitada. De preferência uma VLP do tipo 2 da invenção tem uma sequência de aminoácidos VP1 que corresponde à SEQ ID N².: 6, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 6; uma sequência de aminoácidos VP3 que corresponde à SEQ ID N².: 8, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 8; uma sequência de aminoácidos VP2 que corresponde à SEQ ID N².: 7, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 7; e uma sequência de aminoácidos VP4 que corresponde à SEQ ID N².: 9, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos

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85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 9. De preferência, as ditas sequências de aminoácidos VP1, VP3, VP2 e/ou VP4 têm pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N². recitada. Desse modo, uma VLP do tipo 2 da invenção pode ter uma P1, VPO, VP1, VP2, VP3 e/ou VP4 (ou qualquer combinação destas) com uma sequência de aminoácidos tal como definido acima, mas contendo uma ou mais modificações estabilizantes, tal como descrito no presente documento. [0053] Uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 3, que tem: (a) uma sequência de aminoácidos VP1 que corresponde à SEQ ID N².: 11, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 11; (b) uma sequência de aminoácidos VP3 que corresponde à SEQ ID N².: 13, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 13; (c) uma sequência de aminoácidos VPO que corresponde à SEQ ID N².: 15, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 15; (d) uma sequência de aminoácidos VP2 que corresponde à SEQ ID N².: 12, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 12; e/ou (e) uma sequência de

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27/113 aminoácidos VP4 que corresponde à SEQ ID N².:14, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 14. ou qualquer combinação destas. Uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 3, que tem uma sequência de aminoácidos P1 que corresponde à SEQ ID N².: 20 ou 21, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 20 ou 21. Tipicamente, uma VLP do tipo 3 da invenção tem uma sequência de aminoácidos VP1 que corresponde à SEQ ID N².: 11, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 11; uma sequência de aminoácidos VP3 que corresponde à SEQ ID N².: 13, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 13; e uma sequência de aminoácidos VP0 que corresponde à SEQ ID N².: 15, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².:15. De preferência, as ditas sequências de aminoácidos VP1, VP3 e/ou VP0 têm pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO. recitada. De preferência, uma VLP do tipo 3 da invenção tem uma sequência de aminoácidos VP1 que corresponde à SEQ ID N².: 11,

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28/113 ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 11; uma sequência de aminoácidos VP3 que corresponde à SEQ ID N².: 13, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 13; uma sequência de aminoácidos VP2 que corresponde à SEQ ID N².: 12, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 12; e uma sequência de aminoácidos VP4 que corresponde à SEQ ID N².: 14, ou uma sequência que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID N².: 14. De preferência, as ditas sequências de aminoácidos VP1, VP3, VP2 e/ou VP4 têm pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO. recitada. Desse modo, uma VLP do tipo 3 da invenção pode ter uma P1, VP0, VP1, VP2, VP3 e/ou VP4 (ou qualquer combinação destas) com uma sequência de aminoácidos tal como definido acima, mas contendo uma ou mais modificações estabilizantes, tal como descrito no presente documento.

Estrutura da Partícula Parecida com o Vírus da Pólio (VLP) [0054] Os autores da presente invenção são os primeiros a obter uma VLP estabilizada apropriada para ser usada em uma vacina do vírus da pólio. A dita VLP tem utilidade em vacinas do vírus da pólio, uma vez que tem as características necessárias de estabilidade e

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29/113 imunogenicidade tal como definido no presente documento. Estas características são conferidas pela presença de uma ou mais modificações dentro do capsídeo da VLP, em relação ao vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada.

[0055] Por conseguinte, a invenção provê uma VLP que compreende pelo menos uma modificação em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada, em que pelo menos uma dita modificação estabiliza a VLP.

[0056] Uma VLP da invenção pode compreender uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, ou mais modificações em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada, contanto que as ditas modificações (independentemente ou em combinação) estabilizem a VLP em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada. De preferência, uma VLP da invenção compreende pelo menos três modificações em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada, em que as ditas modificações estabilizam a VLP.

[0057] Toda e qualquer combinação de modificações, em particular mutações/substituições de aminoácidos nos resíduos de aminoácidos preferidos descritos no presente documento dentro de qualquer um dos domínios identificados da VLP, estão englobadas pela presente invenção, contanto que a VLP resultante seja estável e retenha as propriedades imunogênicas necessárias tal como definido no presente documento. Em outras palavras, a referência a uma VLP da invenção é uma referência a uma VLP estável e imunogênica.

[0058] O capsídeo vazio do vírus da pólio é composto de múltiplas cópias das proteínas VP0, VP1 e VP3, tal como descrito no presente documento.

[0059] As múltiplas proteínas de capsídeo são montadas de modo

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30/113 a formar um capsídeo com simetria icosaédrica, que compreende a várias características/regiões distintas tal como segue:

• interfaces entre as proteínas de capsídeo diferentes, VPO, VP1 e VP3 (que correspondendo a VP2 e VP4, a VP1 e VP3 no vírion maduro do vírus da pólio), por exemplo, as interfaces entre VPO e VP1, VPO e VP3 e/ou VP1 e VP3 (isto é, as interfaces entre VP1 e VP2; VP1 e VP3; VP1 e VP4; VP2 e VP3; VP2 e VP4; e VP3 e VP4 no vírion maduro do vírus da pólio);

• as interfaces entre as subunidades de protômeros;

• as interfaces entre as subunidades do pentâmeros;

• um domínio de bolsa que contém uma molécula hidrofóbica (por exemplo, ácido graxo);

• uma rede de polipeptídeo interna que liga as subunidades; e • uma depressão na superfície externa conhecida como cânion.

[0060] Esses domínios são bem conhecidos no campo da pesquisa do vírus da pólio, e são certamente comuns a todos os Picornavírus (vide, por exemplo, Ehrenfeld, Domingo and Roos (2010) The Picronaviruses, Washington, DC: ASM Press, capítulo 10, Virion Structure da autoria de Fry, E. E. and Stuart, D. I.; e Koch, F. e Koch, G. (1985) The Molecular Biology of Poliovirus, New York: SpringerVerlag Wien, capítulo 3 Composition and Structure of the Virion e capítulo 10 Assembly of the Virion, ambos os quais são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade). Além disso, estes domínios podem ser identificados de imediato ao usar o software comercialmente disponível e as estruturas cristalinas publicadas do vírus da pólio, incluindo, mas sem ficar a eles limitados, Protein Data Bank (PDB) ID N^Q: 1HXS (cepa de Mahoney, depositada em 16 de janeiro de 2001), PDB ID N^Q: 1EAH (cepa de Lansing do tipo

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2, depositada em 22 de julho de 1997) e PDB ID N²: 1PVC (cepa de Sabin 3, depositada em 30 de março de 1995). As entradas de PDB estão livremente disponíveis no site da Web de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure). Desse modo, uma referência a qualquer um dos domínios acima pode ser interpretada como no contexto de qualquer estrutura cristalina conhecida do vírus da pólio, incluindo o PDB ID N².: 1HXS, 1EAH e/ou 1PVC. Como um exemplo não limitador, uma referência a uma interface de protômero, a interface de pentâmero e/ou o domínio de bolsa podem ser uma referência a uma interface de protômero, a uma interface de pentâmero e/ou a um domínio de bolsa tal como definido por qualquer um dos PDB ID nos.: 1HXS, 1EAH e/ou 1PVC.

[0061] Uma VLP da invenção pode compreender uma ou mais modificações em uma ou mais dessas regiões. Uma VLP da invenção pode compreender uma ou mais modificações em qualquer uma, quaisquer duas, quaisquer três, quaisquer quatro, quaisquer cinco, quaisquer seis, quaisquer sete, quaisquer oito ou mais dessas regiões. Tipicamente, uma VLP da invenção compreende uma ou mais modificações em uma interface de protômero e/ou um ou mais modificações em uma interface de pentâmero, de preferência uma ou mais modificações em uma interface de protômero e um ou mais modificações em uma interface de pentâmero, e opcionalmente uma ou mais modificações em qualquer um dos outros domínios ou combinações destas. Como um exemplo não limitador, uma VLP da invenção pode compreender uma ou mais modificações no domínio de bolsa, a interface entre uma ou mais subunidades de protômeros (também indicada no presente documento como uma interface de protômero), a interface entre uma ou mais subunidades de pentâmeros (também indicada no presente documento como uma interface de pentâmero), a interface de VP2/VP3 (tal como definido no virion do vírus

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32/113 da pólio maduro, que corresponde à interface de VP0/VP3 em uma VLP, de modo que os termos interface de VP0/VP3 e interface de VP2/VP3 podem ser usados intercambiavelmente no presente documento), a rede interna ou o cânion.

[0062] Alternativamente, uma VLP da invenção pode compreender uma ou mais modificações em quaisquer dois, quaisquer três, quaisquer quatro, quaisquer cinco ou todos os seis destes domínios. Como um exemplo não limitador, uma VLP da invenção pode compreender uma ou mais modificações em uma interface de protômero, uma ou mais modificações em uma interface de pentâmero, e opcionalmente uma ou mais modificações no domínio de bolsa.

[0063] Tipicamente, uma VLP da invenção compreende pelo menos três modificações, de preferência pelo menos quatro modificações, com mais preferência pelo menos cinco modificações e ainda com maior preferência pelo menos seis modificações em relação ao vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada, e compreende de preferência pelo menos uma modificação em cada uma de uma interface de protômero, uma interface de pentâmero, com opcionalmente pelo menos uma modificação no domínio de bolsa.

[0064] Uma VLP da invenção pode compreender (a) uma interface de protômero; e (b) uma interface de pentâmero; em que cada um de (a) e (b) compreende pelo menos uma modificação em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada. Por exemplo, a VLP pode compreender uma, duas, três, quatro, cinco ou mais modificações na interface de protômero e/ou uma, duas, três, quatro, cinco ou mais modificações na interface de pentâmero, contanto que cada uma dentre a interface de protômero e a interface de pentâmero compreenda pelo menos uma modificação (tal como definido no presente documento), de preferência pelo menos uma substituição de aminoácido. A dita VLP compreende tipicamente pelo menos três

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33/113 modificações em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada.

[0065] Como um exemplo não limitador, uma VLP da invenção pode compreender (a) um domínio de bolsa; (b) uma interface de protômero; e (c) uma interface de pentâmero; em que cada um de (a) a (c) compreende pelo menos uma modificação em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada. Por exemplo, a VLP pode compreender uma, duas, três, quatro, cinco ou mais modificações no domínio de bolsa, uma, duas, três, quatro, cinco ou mais modificações na interface de protômero e/ou uma, duas, três, quatro, cinco ou mais modificações na interface de pentâmero, contanto que cada um dentre o domínio de bolsa, a interface de protômero e a interface de pentâmero compreenda pelo menos uma modificação (tal como definido no presente documento), de preferência pelo menos uma substituição de aminoácido.

[0066] Os resíduos de aminoácidos particulares nas proteínas do capsídeo de cada um dos vírus da pólio do tipo 1, do tipo 2 e do tipo 3 que podem ser modificados para produzir a VLP estabilizada foram identificados pelos autores da presente invenção e são descritos no presente documento. A presente invenção engloba qualquer combinação de modificações em qualquer combinação dos resíduos de aminoácidos apresentados dentro das proteínas do capsídeo do vírus da pólio do tipo 1, do tipo 2 e do tipo 3, uma vez que a combinação das modificações resulta em uma VLP com as propriedades necessárias (por exemplo, estabilidade, antigenicidade e/ou imunogenicidade) para que elas se torne apropriada para ser usada como uma vacina da poliomielite. Como um exemplo, a notação 1134 refere-se ao resíduo 134 de VP1, ou VP1-134). Similarmente, a notação 1132 refere-se ao resíduo 132 de VP1, também indicado como VP1 -132.

[0067] Onde é feita referência a um determinado resíduo de

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34/113 aminoácido dentro de um sorotipo particular do vírus da pólio, a invenção também engloba modificações em posições correspondentes dentro de dois outros sorotipos. Como um exemplo não limitador, o resíduo 1134 em um vírus da pólio de sorotipo do tipo 1/2 corresponde ao resíduo 1132 em um vírus da pólio de sorotipo do tipo 3 (há uma deleção de dois aminoácidos em VP1 do vírus da pólio do tipo 3 (resíduos 15 e 16) em comparação com os tipos 1 e 2), de maneira tal que uma referência a uma modificação em um resíduo que corresponde ao resíduo 1134 de um vírus da pólio do tipo 2 também engloba uma modificação no resíduo 1132 de um vírus da pólio do tipo 3. Há duas outras inserções/deleções nas sequências VP1 dos três sorotipos de modo que a numeração dos resíduos equivalentes é tal como segue:

Resíduos equivalentes nas sequências de VP1
Tipo 1	Tipo 2	Tipo 3
1 a 14	1 a 14	1 a 14
17 a 221	17 a 221	15a219
222 a 289	222 a 289	221 a 288
291 a 302	290 a 301	289 a 300

[0068] Desse modo, uma referência a uma mutação ou modificação no resíduo específico em uma VLP do tipo 1 ou 2 engloba não somente a dita mutação na VLP do tipo 1 ou 2, mas também a mesma mutação no resíduo correspondente em uma VLP do tipo 3 (por exemplo, a subtração 2 da posição em VP1 de uma VLP do tipo 1 ou 2 entre os resíduos 17 e 221 irá indicar a posição correspondente em uma VLP do tipo 3). Vice-versa, uma referência a uma mutação ou modificação no resíduo específico em uma VLP do tipo 3 engloba não somente a dita mutação na VLP do tipo 3, mas também a mesma mutação no resíduo correspondente em uma VLP do tipo 1 ou 2, que pode não ter o mesmo

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35/113 número se estiver na VP1 (a posição correspondente pode ser derivada da tabela acima). Qualquer mutação descrita no presente documento com relação a qualquer tipo particular de vírus da pólio, portanto, também é divulgada no contexto do outro tipo do vírus da pólio. Em particular, uma mutação em um resíduo específico em um vírus da pólio do tipo 1/VLP também é divulgada no contexto de um vírus da pólio/VLP do tipo 2 ou do tipo 3; uma mutação em um resíduo específico em um vírus da pólio/VLP do tipo 2 também é divulgada no contexto de um vírus da pólio/VLP do tipo 1 ou do tipo 3; e uma mutação em um resíduo específico em um vírus da pólio/VLP do tipo 3 também é divulgada no contexto de um vírus da pólio/VLP do tipo 1 ou do tipo 2.

[0069] Uma VLP da invenção é suficientemente estável para que seja apropriada para ser usada em uma vacina da poliomielite. A estabilidade de uma VLP pode ser medida em relação a um controle. Tipicamente, o controle é um preparado de referência de IPV que contem uma forma não modificada do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada. A forma não modificada do vírus da pólio no preparado da referência foi tratada tipicamente com formaldeído. Como um exemplo não limitador, se uma VLP da invenção for derivada de Mahoney, ela será tipicamente pelo menos tão estável quanto o componente do tipo 1 do IPV, isto é, o vírus de Mahoney tratado com formaldeído. A VLP da invenção pode ser pelo menos tão estável quanto o controle, e pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais estável do que o controle.

[0070] A estabilidade de uma VLP pode ser medida ao usar qualquer técnica apropriada. As técnicas padrão são conhecidas no estado da técnica, incluindo, mas sem ficar a elas limitadas, a retenção da estrutura antigênica D nativa no aquecimento (expresso como a

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36/113 temperatura à qual a reatividade ELISA com os anticorpos monoclonais específicos de antígeno D (MAbs) é reduzida em 50% em uma incubação por 10 minutos) ou a retenção da estrutura antigênica D nativa na incubação de longa duração a 37°C (denotado como o período de tempo em dias depois do qual a reatividade ELISA com os MAbs específicos de antígeno D é reduzida em 50%). Por exemplo, a temperatura à qual a reatividade ELISA com os anticorpos monoclonais específicos de antígeno D (MAbs) é reduzida em 50% em uma incubação por 10 minutos para uma VLP da invenção pode ser maior do que 45°C, maior do que 46°C, maior do que 47°C, maior do que 48°C, maior do que 49°C, maior do que 50°C, maior do que 51 °C, maior do que 52°C, maior do que 53°C, maior do que 54°C, maior do que 55°C, maior do que 56°C, ou mais. Tipicamente, a temperatura à qual a reatividade ELISA com os anticorpos monoclonais específicos de antígeno D (MAbs) é reduzida em 50% em uma incubação por 10 minutos para uma VLP da invenção é maior do que 50°C, maior do que 51 °C, maior do que 52°C, maior do que 53°C, maior do que 54°C, maior do que 55°C, maior do que 56°C, ou mais; de preferência maior do que 54°C, maior do que 55°C, maior do que 56°C, ou mais.

[0071] Em uma modalidade preferida, uma VLP da invenção é estável o bastante para não requerer armazenagem a frio, o que é vantajoso em termos de suprimento/distribuição. Por conseguinte, a estabilidade de uma VLP da invenção pode ser quantificada em termos da perda do antígeno D quando exposta a altas temperaturas (por exemplo, 37°C) por períodos prolongados. Tipicamente, uma VLP da invenção retém pelo menos 50% de sua atividade, pelo menos 51%, pelo menos 52%, pelo menos 53%, pelo menos 54%, pelo menos 55%, pelo menos 56%, pelo menos 57%, pelo menos 58%, pelo menos 59%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%,

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37/113 pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90% ou mais da sua atividade após a armazenagem a 37°C por pelo menos 50 dias, pelo menos 100 dias, pelo menos 150 dias, pelo menos 180 dias ou mais (em comparação com a VLP correspondente armazenada a 4°C pelo mesmo período). De preferência, uma VLP da invenção retém pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90% ou mais de sua atividade depois da armazenagem a 37°C por pelo menos 50 dias (em comparação com a VLP correspondente armazenada a 4°C pelo mesmo período), e/ou pelo menos 50%, pelo menos 51%, pelo menos 52%, pelo menos 53%, pelo menos 54%, pelo menos 55%, pelo menos 56%, pelo menos 57%, pelo menos 58%, pelo menos 59%, pelo menos 60% ou mais de sua atividade após a armazenagem a 37°C por pelo menos 180 dias (em comparação com a VLP correspondente armazenada a 4°C pelo mesmo período).

[0072] Uma VLP da invenção é imunogênica o bastante para ser apropriada para ser usada em uma vacina da poliomielite. A imunogenicidade de uma VLP pode ser medida em relação a um controle. Tipicamente, o controle é um preparado de referência de IPV que contém uma forma não modificada do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada ou a IPV atual do sorotipo relevante. A forma não modificada do vírus da pólio no preparado de referência foi tratada tipicamente com formaldeído. Como um exemplo não limitador, se uma VLP da invenção for derivada de Mahoney, sela erá tipicamente pelo menos tão imunogênica quanto o componente do tipo 1 de IPV, ou seja, o vírus de Mahoney tratado com formaldeído. A VLP da invenção pode ser pelo menos tão imunogênica quanto, e de preferência pelo menos

1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 3

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38/113 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais imunogênica do que o controle. De preferência, a VLP da invenção pode ser pelo menos tão imunogênica quanto, e de preferência pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais imunogênica do que o controle. A imunogenicidade de uma VLP pode ser medida ao usar qualquer técnica apropriada. As técnicas padrão são conhecidas no estado da técnica, incluindo, mas sem ficar a elas limitadas, ELISA com antígeno C/D e teste da potência in vivo em ratos (uma potência relativa de >1,0 significa uma imunogenicidade pelo menos tão boa quanto aquela de um preparado de referência internacional).

Modificações [0073] Tal como descrito no presente documento, o termo modificação engloba as modificações no ácido nucleico e no nível de aminoácido. Tipicamente, a modificação refere-se a uma modificação no nível de aminoácido. Cada modificação de aminoácido pode ser independentemente selecionada de uma substituição de aminoácido, uma inserção de aminoácido e uma deleção de aminoácido. Em modalidades preferidas, a dita modificação de aminoácido é uma substituição de aminoácido, também indicada intercambiavelmente no presente documento como uma mutação de aminoácido.

[0074] Em uma substituição de aminoácido, um resíduo de aminoácido que faz parte da sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo do vírus da pólio é substituído por um resíduo de aminoácido diferente. O resíduo de aminoácido da substituição pode ser um dos 20 aminoácidos padrão na tabela a seguir.

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AMINOÁCIDO			CADEIA LATERAL
Ácido aspártico	Asp	D	Carregado (ácida)
Ácido glutâmico	Glu	E	Carregado (ácida)
Arginina	Arg	R	Carregado (básica)
Lisina	Lys	K	Carregado (básica)
Histidina	His	H	Não Carregado (polar)
Asparagina	Asn	N	Não Carregado (polar)
Glutamina	Gin	Q	Não Carregado (polar)
Serina	Ser	S	Não Carregado (polar)
Treonina	Thr	T	Não Carregado (polar)
Tirosina	Tyr	Y	Não Carregado (polar)
Metionina	Met	M	Não Carregado (polar)
Triptofano	Trp	W	Não Carregado (polar)
Cisteína	Cys	C	Não Carregado (polar)
Alanina	Ala	A	Não Carregado (Hidrofóbico)
Glicina	Gly	G	Não Carregado (Hidrofóbico)
Valina	Vai	V	Não Carregado (Hidrofóbico)
Leucina	Leu	L	Não Carregado (Hidrofóbico)
Isoleucina	He	1	Não Carregado (Hidrofóbico)
Prolina	Pro	P	Não Carregado (Hidrofóbico)
Fenilalanina	Phe	F	Não Carregado (Hidrofóbico)

[0075] Os aminoácidos a seguir são considerados como aminoácidos carregados: ácido aspártico (negativo), ácido glutâmico (negativo), arginina (positiva), e lisina (positiva).

[0076] Os aminoácidos a seguir são considerados como

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40/113 aminoácidos polares não carregados (o que significa que eles podem participar da ligação de hidrogênio): asparagina, glutamina, histidina, serina, treonina, tirosina, cisteína, metionina e triptofano.

[0077] Os aminoácidos a seguir são considerados como aminoácidos hidrofóbicos não carregados: alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, prolina e glicina.

[0078] Alternativamente, o aminoácido de substituição em uma substituição de aminoácido pode ser um aminoácido não padrão (um aminoácido que não faz parte do conjunto padrão de 20 descrito acima). A título de exemplo, o aminoácido de substituição pode ser um aminoácido não padrão básico, por exemplo, a L-ornitina, o ácido L-2amino-3-guanidino propiônico, ou D-isômeros de lisina, arginina e ornitina). Os métodos para introduzir aminoácidos não padrão em proteínas são conhecidos no estado da técnica, e incluem a síntese de proteína recombinante que usa hospedeiros de expressão auxotrófica de E. coli.

[0079] Em uma inserção de aminoácido, um resíduo de aminoácido adicional (um que não esteja normalmente presente) é incorporado na sequência de aminoácidos do polipeptídeo, aumentando desse modo o número total de resíduos de aminoácido na dita sequência. Em uma deleção de aminoácido, um resíduo de aminoácido é removido da sequência de aminoácidos do polipeptídeo, reduzindo desse modo o número total de resíduos de aminoácido na dita sequência.

[0080] Os métodos para modificar proteínas por meio da substituição, inserção ou deleção de resíduos de aminoácidos são conhecidos no estado da técnica. A título de exemplo, as modificações de aminoácidos podem ser introduzidas pela modificação de uma sequência do DNA que codifica o polipeptídeo. Isto pode ser obtido ao usar técnicas de clonagem molecular padrão, por exemplo, pela mutagênese dirigida a sítio onde os cordões curtos do DNA

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41/113 (oligonucleotídeos) codificam para o(s) aminoácido(s) desejado(s) são usados para substituir a sequência de coding original ao usar uma enzima de polimerase, ou por meio da inserção/deleção do gene com várias enzimas (por exemplo, ligases e endonucleases de restrição). Alternativamente, uma sequência de genes modificada pode ser sintetizada quimicamente.

[0081] Cada substituição de aminoácido de acordo com a presente invenção pode ser independentemente ser uma substituição conservadora, isto é, uma substituição por qualquer aminoácido com a mesma classe de cadeia lateral (por exemplo, ácida com ácida, básica com básica, polar com polar, hidrofóbica com hidrofóbica, tal como definido na tabela acima). Alternativamente, cada substituição de aminoácido da invenção pode ser independentemente uma substituição não conservadora, isto é, uma substituição por qualquer aminoácido com uma classe diferente de cadeia lateral (por exemplo, ácida com básica, polar ou hidrofóbica; básica com ácida, polar ou hidrofóbica; polar com ácida, básica ou hidrofóbica; ou hidrofóbica com ácida, básica ou polar, tal como definido na tabela acima). Como exemplos não limitadores, pelo menos uma modificação de aminoácido pode ser selecionada de: substituição de um resíduo ácido de aminoácido por um resíduo básico de aminoácido; substituição de um resíduo ácido de aminoácido por um resíduo de aminoácido não carregado; substituição de um resíduo de aminoácido não carregado por um resíduo básico de aminoácido; inserção de um resíduo básico de aminoácido; e deleção de um resíduo ácido de aminoácido.

[0082] Em uma modalidade preferida, pelo menos uma modificação de aminoácido é tipicamente uma substituição, que mantém vantajosamente o mesmo número de resíduos de aminoácido no polipeptídeo. Para alguns resíduos de aminoácidos, a modificação preferida é uma deleção. Um exemplo de uma modificação preferida

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42/113 que é uma deleção é a deleção do resíduo de leucina na posição 1104 (isto é, o resíduo 104 de VP1) em uma VLP do tipo 2, ou a posição correspondente em uma VLP do tipo 1 ou do tipo 3 (vide a Tabela 2).

[0083] Uma VLP da invenção pode compreender uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, ou mais modificações em uma ou mais das posições listadas na Tabela 1,2 ou 3 a seguir, ou qualquer combinação destas, e de preferência pelo menos quatro modificações, com mais preferência pelo menos cinco modificações e ainda com maior preferência pelo menos seis modificações nas posições listadas nas Tabelas 1,2 ou 3 a seguir. Em particular, uma VLP da invenção pode compreender uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, ou mais das modificações particulares listadas na Tabela 1, 2 ou 3 a seguir, ou qualquer combinação destas, e de preferência pelo menos quatro modificações, com mais preferência pelo menos cinco modificações e ainda com maior preferência pelo menos seis modificações nas posições listadas nas Tabelas 1, 2 ou 3 a seguir. Alternativa ou adicionalmente, uma VLP da invenção pode compreender uma ou mais modificações estabilizantes adicionais, que podem consistir em qualquer modificação identificada por um método da invenção tal como descrito no presente documento.

[0084] Uma VLP da invenção compreende tipicamente pelo menos uma (de preferência uma ou duas modificações) em uma interface de protômero e/ou pelo menos uma (de preferência uma ou duas) modificações em uma interface de pentâmero, opcionalmente com pelo menos uma (de preferência uma ou duas) modificações no domínio de bolsa. A dita VLP também pode compreender uma ou mais modificações adicionais em uma ou mais das posições listadas na

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Tabela 1,2 ou 3 a seguir, ou qualquer combinação destas, tal como pelo menos uma (de preferência uma) modificação em uma interface de VP2/VP3 e/ou pelo menos uma (de preferência uma, duas ou três) modificação em uma rede interna e/ou pelo menos uma (preferência uma) modificação no domínio de cânion.

[0085] Uma VLP do tipo 1 da invenção pode compreender uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, ou mais modificações em uma ou mais das posições listadas na Tabela 1 a seguir, em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada. A mutação particular em qualquer uma destas posições pode ser tal como indicado na Tabela 1 a seguir.

[0086] Uma VLP do tipo 1 da invenção pode compreender qualquer combinação das modificações em qualquer combinação das posições de aminoácidos divulgadas tal como indicado na Tabela 1 a seguir, uma vez que a combinação das modificações resulta em uma VLP com as propriedades necessárias (por exemplo, estabilidade, antigenicidade e/ou imunogenicidade) para se tornar apropriada para ser usada como uma vacina da poliomielite. Em algumas modalidades, uma VLP pode compreender no máximo duas modificações em qualquer região particular, independentemente do número total de modificações na dita VLP. Uma VLP do tipo 1 da invenção pode compreender múltiplas modificações na interface de pentâmero, por exemplo, pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais modificações na interface de pentâmero, por exemplo, em qualquer uma das posições na interface de pentâmero listadas na Tabela 1 a seguir, ou qualquer combinação destas, de preferência qualquer uma das mutações específicas na interface de pentâmero listadas na Tabela 1 a seguir, ou qualquer combinação destas.

[0087] Uma VLP do tipo 1 da invenção compreende tipicamente

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44/113 pelo menos uma modificação em uma interface de protômero e pelo menos uma modificação em uma interface de pentâmero, opcionalmente com pelo menos uma modificação em um domínio de bolsa. De preferência, uma VLP do tipo 1 da invenção compreende pelo menos uma (de preferência uma ou duas) modificação em uma interface de protômero e/ou pelo menos uma (de preferência uma ou duas) modificação em uma interface de pentâmero, opcionalmente com pelo menos uma (de preferência uma) modificação no domínio de bolsa e/ou pelo menos uma (de preferência uma) modificação em uma interface de VP2/VP3 e/ou pelo menos uma (de preferência uma) modificação em uma rede interna. Como um exemplo não limitador, uma VLP do tipo 1 da invenção pode compreender seis modificações em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual é derivada: duas modificações em uma interface de protômero (por exemplo, em 3118 e 1248), duas modificações em uma interface de pentâmero (por exemplo, em 2025 e 2057), uma modificação em uma interface de VP2/VP3 (por exemplo, em 3119) e uma modificação em uma rede interna (por exemplo, em 4018). Como um exemplo adicional, uma VLP do tipo 1 da invenção pode compreender essas seis modificações e além disso uma sétima modificação em um domínio de bolsa (por exemplo, em 1196).

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Região	Posição da modificação modificação	Mutação estabilizante
Interface de Protomer	3108	T310Â
3178	Q3178L
1101	K1101E
1168	E1168K
1231	A1231V, A1231T
1232	A1232V
1236	D1236Y
1247	D1247Y
1248	H1248P, H1248L
Interface do pentâmero	2014	L2014M
2025	T202Ã
2057	D2057E
2067	D2067N
2251	L2251V
2252	T2252S
1040	E1040K
1041	11041V
1218	K1218R
Bolsa hidrofóbica	1196	V1196L
Rede interna: em torno do eixo quíntuplo	4017	N4017T
4018	R4018G
4023	S402Y
4046	F4046L
4055	E4055Q
1009	M1009V
Interface VP2/VP3	1295	S1295P
2197	12197V
3119	L3119M
Interface VP1/VP2	2127	V2127I
Cânion	1090	M1090L
1252	K1252T
Outro	3059	A3059D
2159	G2159S
2168	S216Â
2228	G2228V

Tabela 1: A posição do capsídeo de sorotipo 1 que estabiliza as modificações e as mutações de estabilização particulares

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46/113 [0088] Uma VLP do tipo 2 da invenção pode compreender uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, ou mais modificações em uma ou mais das posições listadas na Tabela 2 a seguir, em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada. A mutação particular em qualquer uma dessas posições pode ser tal como indicado na Tabela 2 a seguir.

[0089] Uma VLP do tipo 2 da invenção pode compreender qualquer combinação de modificações em qualquer combinação das posições de aminoácidos divulgadas tal como indicado na Tabela 2 a seguir, uma vez que a combinação das modificações resulta em uma VLP com as propriedades necessárias (por exemplo, estabilidade, antigenicidade e/ou imunogenicidade) para se tornar apropriada para ser usada como uma vacina da poliomielite. Em algumas modalidades, uma VLP pode compreender no máximo duas modificações em qualquer região particular, independentemente do número total de modificações na dita VLP. Uma VLP do tipo 2 da invenção pode compreender múltiplas modificações no domínio de bolsa, por exemplo, pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais modificações no domínio de bolsa, por exemplo, em qualquer uma das posições no domínio de bolsa listadas na Tabela 2 a seguir, ou qualquer combinação destas, de preferência qualquer uma das mutações específicas no domínio de bolsa listadas na Tabela 2 a seguir, ou qualquer combinação destas.

[0090] Uma VLP do tipo 2 da invenção compreende tipicamente pelo menos uma modificação em uma interface de protômero e pelo menos uma modificação em uma interface de pentâmero. De preferência, uma VLP do tipo 2 da invenção compreende pelo menos uma (de preferência uma) modificação em uma interface de protômero e/ou pelo menos uma (de preferência uma ou duas) modificação em

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47/113 uma interface de pentâmero, opcionalmente com pelo menos uma (de preferência uma ou duas) modificação no domínio de bolsa, e/ou pelo menos uma (de preferência uma) modifcação na rede interna. Como um exemplo não limitador, uma VLP do tipo 2 da invenção pode compreender cinco modificações em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual é derivada: uma modificação em uma interface de protômero (por exemplo, em 3178), em duas modificações em uma interface de pentâmero (por exemplo, em 3085 e em 1041), e duas modificações em um domínio de bolsa (por exemplo, em 1134 e em 1159). Como um outro exemplo não limitador, uma VLP do tipo 2 da invenção pode compreender seis modificações em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual é derivada: duas modificações em uma interface de protômero (por exemplo, em 3178 e 1107), em uma modificação em uma interface de pentâmero (por exemplo, em 2057), duas modificações em um domínio de bolsa (por exemplo, em 1134 e 1183) e uma modificação na rede interna (por exemplo, em 4057).

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Região	Posição da modificação	Mutação estabilizante
Interface de Protômero	2139	S2139L
3108	T3108A
3141	A3141G
3175	T3175A
3178	Q3178L
3180	I3180T
3184	F3184Y
3229	T3229P
1030	T1030S
1041	T1041I
1067	I1067L
1104	deleção 1104L
1107	711071
1160	I1160V
1179	S1179C
1199	71199M
1222	S1222P
1223	T1223S
1231	A12317
1232	A12327
	1234	-1234M
Interface do pentâmero	2013	72013L
2014	I2014M
2057	D2057E, D2057A, D2057N
2246	I2246L
2251	T2251S
3073	N3073H
3085	_3085F
3141	A3141G
1039	K1039R
Bolsa Hidrofóbica	1134	F1134L
1159	Y1159F
1183	71183L
1194	111947
Rede interna: em torno do eixo tríplice	4055	E4055A, E4055Q
4057	I4057L, I40577
2033	72033I
3161	Q3161E
Rede interna: em torno do eixo quíntuplo	1021	-1021P
Interface VP1/2/3	2191	121917
Cânion	2140	M2140T
Outro	2161	T2161S
3094	R3094K
1100	R1100C

Tabela 2: A posição de modificações estabilizante do capsídeo do sorotipo 2 e de mutações estabilizante particulares

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49/113 [0091] Uma VLP do tipo 3 da invenção pode compreender uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, ou mais modificações em uma ou mais das posições listadas na Tabela 3 a seguir, em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada. A mutação particular em qualquer uma dessas posições pode ser tal como indicado na Tabela 3 a seguir.

[0092] Uma VLP do tipo 3 da invenção pode compreender qualquer combinação das modificações em qualquer combinação das posições de aminoácidos divulgadas tal como indicado na Tabela 3 a seguir, uma vez que a combinação das modificações resulta em uma VLP com as propriedades necessárias (por exemplo, estabilidade, antigenicidade e/ou imunogenicidade) para se tornar apropriada para ser usada como uma vacina da poliomielite. Em algumas modalidades, uma VLP pode compreender no máximo duas modificações em qualquer região particular, independentemente do número total das modificações na dita VLP. Uma VLP do tipo 3 da invenção compreende tipicamente pelo menos uma modificação em uma interface de protômero e pelo menos uma modificação em uma interface de pentâmero, opcionalmente com pelo menos uma modificação em um domínio de bolsa. De preferência uma VLP do tipo 3 da invenção compreende pelo menos uma (de preferência uma ou duas) modificação em uma interface de protômero e/ou pelo menos uma (de preferência uma ou duas) modificação em uma interface de pentâmero, opcionalmente com pelo menos uma (de preferência uma) modificação em um domínio de bolsa e/ou pelo menos uma (de preferência uma) modificação em uma interface de VP2/VP3 e/ou pelo menos uma (de preferência uma, duas ou três) modificação em uma rede interna e/ou pelo menos uma (de preferência uma) modificação em um domínio de cânion. Como um exemplo não limitador, uma VLP do tipo 3 da invenção pode compreender nove

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50/113 modificações em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual é derivada: duas modificações em uma interface de protômero (por exemplo, em 2215 e 3091), duas modificações em uma interface de pentâmero (por exemplo, em 2018 e 3085), uma modificação em um domínio de bolsa (por exemplo, em 1132), uma modificação em uma interface de VP2/VP3 (por exemplo, em 2241), duas modificações em uma rede interna (por exemplo, em 4067 e ...) e uma modificação em um domínio do cânion (por exemplo, em 1105). Em um exemplo adicional, uma VLP do tipo 3 da invenção pode compreender essas nove modificações e além disso uma outra (décima) modificação na rede interna (por exemplo, em 1054).

Região	Posição da modificação	Mutação estabilizante
Interface de Protômero	2215	L2215M
3091	F3091S
3178	Q3178L
3190	13190V
1075	I1075V
1181	11181L
1199	L1199I
1155	I1155M
Interface do pentâmero	2016	L2016I
2018	L2018M
3085	L3085F
3190	13190V
1034	A1034V
Bolsa de ligação a fármaco	1132	F1132L
1260	M1260I
Rede interna: em torno do eixo tríplice	4055	E4055Q
4067	T4067A
2124	M2124A
1054	A1054V, A1054T
Rede interna: em torno da leixo quintuple	3019	H3019Y
1265	V1265I
1075	I1075V
externo (3 vezes) (interface VP2/VP3)	2241	D2241E
externo (protômero perto da interface)	2269	K2269R
cânion	1105	M1105T
Tabela 3: A posição de modil	icações estabilizante do capsídeo do

sorotipo 3 e de mutações estabilizante particulares

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51/113 [0093] Tal como descrito no presente documento, uma VLP da invenção compreende de preferência pelo menos três modificações em relação ao vírus da pólio a partir do qual a partícula de VLP é derivada, em que há pelo menos uma modificação em cada uma de (a) uma interface de protômero; e (b) uma interface de pentâmero. Como um exemplo não limitador, uma VLP da invenção pode compreender (a) um domínio de bolsa; (b) uma interface de protômero; e (c) uma interface de pentâmero; em que cada uma de (a) a (c) compreende pelo menos uma modificação em relação à partícula do vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada. As ditas modificações podem consistir em qualquer combinação das modificações identificadas no presente documento, em particular em qualquer uma das Tabelas 1 a 3. Com mais preferência, uma VLP da invenção compreende pelo menos quatro, com mais preferência pelo menos cinco e ainda com maior preferência pelo menos seis modificações em relação à partícula do vírus de pólio a partir do qual é derivada; em que as ditas modificações incluem pelo menos uma modificação em uma interface de protômero e pelo menos uma modificação em uma interface de pentâmero, e opcionalmente pelo menos uma modificação em um domínio de bolsa. Novamente, as ditas modificações podem consistir em qualquer combinação das modificações identificadas no presente documento, em particular em qualquer uma das Tabelas 1 a 3.

[0094] Por exemplo, a interface de protômero pode compreender uma modificação em um ou mais dos resíduos de aminoácidos 3108 (tipo 1 ou 2), 3178 (tipo 1,2 ou 3), 1101 (tipo 1), 1168 (tipo 1), 1231 (tipo 1 ou 2), 1232 (tipo 1 ou 2), 1236 (tipo 1), 1247 (tipo 1), 1248 (tipo 1),

2139 (tipo 2), 3141 (tipo 2), 3175 (tipo 2), 3180 (tipo 2), 3184 (tipo 2),

3229 (tipo 2), 1030 (o tipo 2), 1041 (tipo 2), 1067 (tipo 2), 1104 (tipo 2), 1107 (tipo 2), 1160 (tipo 2), 1179 (tipo 2), 1199 (tipo 2), 1222 (tipo 2),

1223 (tipo 2), 1234 (tipo 2), 2215 (tipo 3), 3091 (tipo 3), 3190 (tipo 3),

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1075 (tipo 3), 1181 (tipo 3), 1199 (tipo 3) e/ou 1155, ou resíduos de aminoácidos que correspondem aos mesmos. De preferência, a interface de protômero pode compreender uma modificação em um ou mais dos resíduos de aminoácidos 1248, isto é, o resíduo 248 de VP1 (tipo 1), 2215, isto é, o resíduo 215 de VP2 (tipo 3), 3178, isto é, o resíduo 178 de VP3 (tipos 1 e 2), 1107, isto é, o resíduo 107 de VP1 (tipo 2) e/ou 3091, isto é, o resíduo 91 de VP3 (tipo 3), ou resíduos de aminoácidos que correspondem aos mesmos.

[0095] Por exemplo, a interface de pentâmero pode compreender uma modificação em um ou mais dos resíduos de aminoácidos 2014 (tipo 1 ou 2), 2025 (tipo 1), 2057 (tipo 1), 2067 (tipo 1), 2251 (tipo 1 ou

2), 2252 (tipo 1), 1040 (tipo 1), 1041 (tipo 1), 2013 (tipo 2), 2057 (tipo 2), 2246 (tipo 2), 3073 (tipo 2), 3085 (tipo 2 ou 3), 3141 (tipo 2), 1039 (tipo

2), 2016 (tipo 3), 2018 (tipo 3), 3190 (tipo 3) e/ou 1034 (tipo 3), ou resíduos de aminoácidos que correspondem aos mesmos. De preferência, a interface de pentâmero pode compreender uma modificação em um ou mais dos resíduos de aminoácidos 1041, isto é, o resíduo 41 de VP1 (tipo 2), 2018, isto é, o resíduo 18 de VP2 (tipo 3), 2025, isto é, o resíduo 25 de VP2 (tipo 1), 2057, isto é, o resíduo 57 de VP2 (tipos 1 e 2), 3085, isto é, o resíduo 85 de VP3 (tipos 2 e 3), ou resíduos de aminoácidos que correspondem aos mesmos.

[0096] A presente invenção engloba VLPs que compreendem modificações em qualquer um dos resíduos de aminoácidos acima, contanto que haja pelo menos uma modificação, de preferência pelo menos uma mutação (substituição de aminoácido) em cada uma dentre a interface de protômero e a interface de pentâmero.

[0097] Nas modalidades em que o domínio de bolsa compreende uma ou mais modificações, as ditas uma ou mais modificações podem compreender uma modificação em um ou mais dos resíduos de aminoácidos 1196 (tipo 1), 1134 (tipo 2), 1159 (tipo 2), 1183 (tipo 2),

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1194 (tipo 2), 1132 (tipo 3) e/ou 1260 (tipo 3), ou resíduos de aminoácidos que correspondem aos mesmos. De preferência em tais modalidades, o domínio de bolsa compreende uma modificação em um ou mais dos resíduos de aminoácidos 1132, isto é, o resíduo 132 de VP1 (tipo 3), 1134, isto é, o resíduo 134 de VP1 (tipo 2), 1159, isto é, o resíduo 159 de VP1 (tipo 2), resíduo 1183, isto é, o resíduo 183 de VP1 (tipo 2) e/ou 1196, isto é, o resíduo 196 de VP1 (tipo 1), ou resíduos de aminoácidos que correspondem aos mesmos.

[0098] Em uma modalidade preferida a VLP é derivada de um vírus da pólio do tipo 1, em que: (a) a interface de protômero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 3178 (isto é, o resíduo 178 de VP3) e 1248 (isto é, o resíduo 248 de VP1) ou em resíduos que correspondem aos mesmos; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 2025 (isto é, o resíduo 25 de VP2) e 2057 (isto é, o resíduo 57 de VP2) ou em resíduos que correspondem aos mesmos. Em uma modalidade particularmente preferida, a interface de protômero compreende uma ou ambas as mutações Q3178L e H1248P; e/ou a interface de pentâmero compreende uma ou ambas as mutações T2025A e D2057E. Nas modalidades em que a VLP é derivada de um vírus da pólio do tipo 1 e o domínio de bolsa também compreende uma ou mais modificações, a dita modificação compreende de preferência uma mutação no resíduo 1196 (isto é, o resíduo 196 de VP1) ou em um resíduo que corresponde ao mesmo; e com mais preferência o domínio de bolsa compreende a mutação V1196L.

[0099] Em uma outra modalidade preferida, a VLP é derivada de um vírus da pólio do tipo 2, em que: (a) a interface de protômero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 3178 (isto é, o resíduo 178 de VP3) e 1107 (isto é, o resíduo 107 de VP1) ou em resíduos que correspondem aos mesmos; e/ou (b) a interface de

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54/113 pentâmero compreende uma mutação em um ou mais dos resíduos 3085 (isto é, o resíduo 85 de VP3), 1041 (isto é, o resíduo 41 de VP1) e 2057 (isto é, o resíduo 57 de VP2) ou os resíduos que correspondem aos mesmos. Em uma modalidade particularmente preferida, a interface de protômero compreende uma ou ambas as mutações Q3178L e V110I; e/ou a interface de pentâmero compreende uma ou mais das mutações L3085F, T1041I e D2057A. Nas modalidades em que a VLP é derivada de um vírus da pólio do tipo 2 e o domínio de bolsa também compreende uma ou mais modificações, a dita modificação compreende de preferência uma mutação em um ou mais dos resíduos 1134 (isto é, o resíduo 134 de VP1), 1159 (isto é, o resíduo 159 de VP1) e 1183 (isto é, o resíduo 183 de VP1) ou os resíduos que correspondem aos mesmos; com mais preferência, o domínio de bolsa compreende uma ou mais das mutações F1134L, Y1159F e V1183L. Em uma modalidade particularmente preferida, a interface de protômero compreende uma modificação no resíduo 3178 (por exemplo, Q3178L), e/ou a interface de pentâmero compreende modificações em ambos os resíduos 1041 (por exemplo, T1041I) e 3085 (por exemplo, L3085F), e opcionalmente o domínio de bolsa também compreende modificações em ambos os resíduos 1134 (por exemplo, F1134L) e 1159 (por exemplo, Y1159F). Em uma outra modalidade particularmente preferida, a interface de promotor compreende uma modificação em ambos os resíduos 3178 (por exemplo, Q3178L) e 1107 (por exemplo, V11071), e/ou a interface de pentâmero compreende uma modificação no resíduo 2057 (por exemplo, D2057A), e opcionalmente o domínio de bolsa também compreende modificações em ambos os resíduos 1134 (por exemplo, F1134L) e 1183 (por exemplo, V1183L).

[0100] Em uma outra modalidade preferida, a VLP é derivada de um vírus da pólio do tipo 3, em que: (a) a interface de protômero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 2215 (isto é,

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55/113 o resíduo 215 de VP2) e 3091 (isto é, o resíduo 91 de VP3) ou em resíduos que correspondem aos mesmos; e/ou (c) a interface de pentâmero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 2018 (isto é, o resíduo 18 de VP2) e 3085 (isto é, o resíduo 85 de VP3) ou em resíduos que correspondem aos mesmos. Em uma modalidade particularmente preferida, a interface de protômero compreende uma ou ambas as mutações L2215M e F3091S; e/ou a interface de pentâmero compreende uma ou ambas as mutações L2018I e L3085F. Nas modalidades em que a VLP é derivada de um vírus da pólio do tipo 3 e o domínio de bolsa também compreende uma ou mais modificações, a dita modificação compreende de preferência uma mutação no resíduo 1132 (isto é, o resíduo 132 de VP1) ou em um resíduo que corresponde ao mesmo; com mais preferência, o domínio de bolsa compreende a mutação F1132L. No caso de uma mutação estabilizante no resíduo 3091 (isto é, o resíduo 91 de VP3), a mutação estabilizante pode existir no vírus da pólio do tipo 3 a partir do qual a VLP é derivada, ou pode ser introduzida na VLP de acordo com os métodos da presente invenção. Por exemplo, os vírus da pólio do tipo 3 de Leon e Saukett compreendem uma serina no resíduo 3091, ao passo que o vírus da pólio de Sabin 3 tem uma fenilalanina nessa posição. 3091F torna o vírus da pólio de Sabin 3 sensível à temperatura, isto é, ele é desestabilizante em seu efeito, ao passo que 3091S é estabilizante. Portanto, em uma VLP da invenção que é gerada de uma cepa que compreende 3091F (por exemplo, Sabin 3), uma mutação estabilizante (por exemplo, F3091S) pode ser introduzida. Alternativamente, partindo de Leon ou de Saukett, o resíduo estabilizante 3091S já está presente. Onde é feita referência no presente documento a uma mutação estabilizante no resíduo 3091, esta engloba VLPs em que ou que o resíduo estabilizante está presente na cepa original do vírus da pólio, ou então em que a mutação é introduzida de acordo com a presente

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56/113 invenção. O mesmo também se aplica para outras posições que podem compreender aminoácidos estabilizantes em algumas cepas de vírus da pólio (tipo 1, 2 ou 3), mas mutações desestabilizantes em outras. Em cada caso, onde é feita referência no presente documento a uma mutação estabilizante em um determinado resíduo, isto engloba VLPs em que ou o resíduo estabilizante está presente na cepa original do vírus da pólio, ou então em que a mutação é introduzida de acordo com a presente invenção. Como um exemplo não limitador adicional, o vírus da pólio do tipo 3 de Saukett compreende um resíduo estabilizante de valina na posição 1054, ao passo que o vírus da pólio do tipo 3 de Leon e de Sabin 3 não compreendem. Neste exemplo, onde uma VLP do tipo 3 da invenção compreende uma mutação estabilizante na posição 1054, isto engloba as VLPs derivadas de Saukett, quejá devem englobar 1054V estabilizante, e também as VLPs derivadas de Leon ou Sabin 3, em que a mutação estabilizante A1054V é introduzida.

[0101] Além de aminoácidos particulares descritos acima, uma VLP da invenção pode compreender uma ou mais modificações adicionais entre uma ou mais dentre a interface de protômero, a interface de pentâmero e/ou o domínio de bolsa.

[0102] Além disso, além de compreender pelo menos uma modificação dentro de cada uma dentre a interface de protômero e a interface de pentâmero, uma VLP da invenção pode compreender pelo menos uma modificação adicional em um ou mais domínios estruturais adicionais.Tipicamente, um ou mais ditos domínios estruturais adicionais são selecionados de um domínio de bolsa, uma interface de VP2/VP3, uma rede interna e/ou um cânion, tal como descrito no presente documento, mas podem compreender uma modificação dentro de uma dobra externa, uma interface de VP1/VP2 ou um outro domínio definido no presente documento. Quando a VLP compreende uma ou mais modificações adicionais em uma rede interna, a dita rede interna

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57/113 pode compreender interações entre as cadeias de polipeptídeos derivadas de proteínas de capsídeos diferentes, perto do eixo tríplice, e/ou uma coroa anular beta (estrutura parecida com um tubo) abaixo do eixo quintuple, e pelo menos uma dita modificação adicional pode ficar localizada em ou bastante próxima do dito eixo tríplice, do eixo quintuple e/ou do tubo abaixo do eixo quintuple.

[0103] Nos aspectos da invenção onde a VLP é derivada de um vírus da pólio do tipo 1, pelo menos uma dita modificação adicional em um ou mais domínios estruturais adicionais pode ser selecionada de: (a) uma mutação no resíduo 3119 (isto é, o resíduo 119 de VP3) ou em um resíduo que corresponde ao mesmo na interface de VP2/VP3; e/ou (b) uma mutação no resíduo 4018 (isto é, o resíduo 18 de VP4) ou em um resíduo que corresponde ao mesmo na rede interna; e/ou (c) uma mutação no resíduo 1196 (isto é, o resíduo 196 de VP1) ou em um resíduo que corresponde ao mesmo no domínio de bolsa. Em uma modalidade preferida, a interface de VP2/VP3 compreende a mutação L3119M; e/ou a rede interna compreende a mutação R4018G; e/ou o domínio de bolsa compreende a mutação V1196L.

[0104] Em aspectos da invenção em que a VLP é derivada de um vírus da pólio do tipo 2, pelo menos uma dita modificação adicional em um ou mais domínios estruturais adicionais pode ser uma mutação no resíduo 4057 (isto é, o resíduo 57 de VP4) ou em um resíduo que corresponde ao mesmo na rede interna. Em uma modalidade preferida, a rede interna compreende a mutação I4057V.

[0105] Nos aspectos da invenção em que a VLP é derivada de um vírus da pólio do tipo 3, pelo menos uma dita modificação adicional em um ou mais domínios estruturais adicionais pode ser selecionada de: (a) uma mutação no resíduo 2241 (isto é, o resíduo 241 de VP2) ou em um resíduo que corresponde ao mesmo na interface de VP2/VP3; (b) uma mutação em um ou mais dos resíduos 1054 (isto é, o resíduo 54 de

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VP1), 4067 (isto é, o resíduo 67 de VP4) e 3019 (isto é, o resíduo 19 de VP3) ou os resíduos que correspondem aos mesmos na rede interna; e/ou (c) uma mutação no resíduo 1105 (isto é, o resíduo 105 de VP1) ou em um resíduo que corresponde ao mesmo no cânion; e/ou (d) uma mutação no resíduo 1132 (isto é, o resíduo 132 de VP1) ou em um resíduo que corresponde ao mesmo no domínio de bolsa. Em uma modalidade preferida, a interface de VP2/VP3 compreende a mutação D2241E; a rede interna compreende uma ou mais das mutações A1054V, T4067A e H3019Y; e/ou o cânion compreende a mutação T1105M; e/ou o domínio de bolsa compreende a mutação F1132L.

[0106] Tipicamente, as modificações descritas acima na interface de VP2/VP3, na rede interna, no cânion e/ou no no domínio de bolsa são adicionais às modificações na interface de protômero e/ou na interface de pentâmero tal como descrito no presente documento. Nas modalidades preferidas, uma VLP da invenção compreende pelo menos uma modificação nos resíduos de aminoácidos preferidos dentro da interface de protômero e/ou da interface de pentâmero, ou as suas combinações tal como descrito no presente documento, e pelo menos uma modificação adicional em um dos resíduos de aminoácidos preferidos dentro da interface de VP2/VP3, da rede interna, do cânion e/ou do domínio de bolsa tal como descrito no presente documento. Em modalidades particularmente preferidas, uma VLP da invenção compreende pelo menos um das mutações de aminoácidos preferidas nos resíduos de aminoácidos preferidos dentro da interface de protômero e/ou da interface de pentâmero, ou suas combinações tal como descrito no presente documento, e pelo menos uma outra mutação de amoniácido preferida em um dos resíduos de aminoácidos preferidos dentro da interface de VP2/VP3, da rede interna, do cânio e/ou do domínio de bolsa tal como descrito no presente documento. Toda e qualquer uma das combinações de modificações, em particular

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59/113 as mutações/substituições de aminoácidos nos resíduos de aminoácidos preferidos descritos no presente documento dentro de alguns dos domínios identificados da VLP são englobdas pela presente invenção. Como um exemplo não limitador, uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 1 e compreender modificações (i) nos resíduos 3178 e 1248 na interface de protômero, (ii) os resíduos 2025 e 2057 na interface de pentâmero, e também opcionalmente (iii) os resíduos 1196 no domínio de bolsa, (iv) os resíduos 3119 na interface de VP2/VP3, e (v) os resíduos 4018 na rede interna, e em particular (i) as mutações Q3178L e H1248P na interface de protômero, (ii) as mutações T2025A e D2057E na interface de pentâmero, e também opcionalmente (iii) a mutação V1196L no domínio de bolsa, (iv) a mutação L3119M na interface de VP2/VP3, e (v) a mutação R4018G na rede interna. Em uma modalidade preferida, uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 1 e compreender (i) Q3178L e H1248P na interface de protômero, (ii) as mutações T2025A e D2057E na interface de pentâmero, (iii) a mutação L3119M na interface de VP2/VP3, (iv) a mutação R4018G na rede interna, e opcionalmente (v) a mutação V1196L no domínio de bolsa.

[0107] Outros exemplos não limitadores de VLPs derivadas de um vírus da pólio do tipo 1 de acordo com a presente invenção podem ter as mutações ou combinações de mutações a seguir: (i) uma mutação na rede interna (por exemplo, no resíduo 4018, de preferência R4018G) e uma mutação na interface de pentâmero (por exemplo, no resíduo 2025, de preferência T2025A ou no resíduo 2057, de preferência D2057E); (ii) uma mutação na rede interna (por exemplo, no resíduo 4018, de preferência R4018G) e duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 2025 e 2057, de preferência T202Ã e D2057E); (iii) uma mutação na rede interna (por exemplo, no resíduo 3119, de preferência L3119M) e três mutações na interface de

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60/113 protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L, no resíduo 1231, de preferência A1231V e no resíduo 1248, de preferência H1258P); (iv) uma mutação na rede interna (por exemplo, no resíduo 4018, de preferência R4018G), duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 2025 e 2057, de preferência T2025A e D2057E) e duas mutações na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L e no resíduo 1248, de preferência H1258P); (v) uma mutação na rede interna (por exemplo, no resíduo 4018, de preferência R4018G), duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 2025 e 2057, de preferência T2025A e D2057E), duas mutações na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L e no resíduo 1248, de preferência H1258P) e uma mutação em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1196, de preferência V1196L); (vi) uma mutação na rede interna (por exemplo, no resíduo 4018, de preferência R4018G), duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 2025 e 2057, de preferência T2025A e D2057E), e três mutações na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L, no resíduo 1231, de preferência A1231V e no resíduo 1248, de preferência H1258P); (vii) uma mutação na rede interna (por exemplo, no resíduo 4018, de preferência R4018G), duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 2025 e 2057, de preferência T2025A e D2057E), duas mutações na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L e no resíduo 1248, de preferência H1258P) e uma mutação em uma rede interna (por exemplo, no resíduo 3119, de preferência L3119M); (viii) duas mutações na rede interna (por exemplo, no resíduo 4018, de preferência R4018G e no resíduo 3119, de preferência L3119M), uma mutação na interface de pentâmero (por exemplo, no resíduo 2025, de preferência T2025A ou no resíduo 2057, de preferência D2057E), três

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61/113 mutações na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L, no resíduo 1231, de preferência A1231V e no resíduo 1248, de preferência H1258P); (ix) duas mutações na rede interna (por exemplo, no resíduo 4018, de preferência R4018G e no resíduo 3119, de preferência L3119M), duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 2025 e 2057, de preferência T2025A e D2057E), duas mutações na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L e no resíduo 1248, de preferência H1258P) e uma mutação em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1196, de preferência V1196L); (x) duas mutações na rede interna (por exemplo, no resíduo 4018, de preferência R4018G e no resíduo 3119, de preferência L3119M), duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 2025 e 2057, de preferência T2025A e D2057E), e três mutações na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L, no resíduo 1231, de preferência A1231V, e no resíduo 1248, de preferência H1258P); (xi) duas mutações na rede interna (por exemplo, no resíduo 4018, de preferência R4018G e no resíduo 3119, de preferência L3119M), uma mutação na interface de pentâmero (por exemplo, no resíduo 2025, de preferência T2025A ou no resíduo 2057, de preferência D2057E), três mutações na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L, no resíduo 1231, de preferência A1231V e no resíduo 1248, de preferência H1258P) e uma mutação em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1196, de preferência V1196L); e (xii) duas mutações na rede interna (por exemplo, no resíduo 4018, de preferência R4018G e no resíduo 3119, de preferência L3119M), duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 2025 e 2057, de preferência T2025A e D2057E), três mutações na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L, no resíduo 1231, de preferência A1231V, e no resíduo 1248, de

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62/113 preferência H1258P) e uma mutação em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1196, de preferência V1196L).

[0108] Como um outro exemplo não limitador, uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 2 e compreender modificações (i) no resíduo 3178 na interface de protômero, e (ii) nos resíduos 3085 e 1041 na interface de pentâmero, e opcionalmente (iii) nos resíduos 1134 e 1159 no domínio de bolsa, e em particular (i) a mutação Q3178L na interface de protômero, e (ii) as mutações L3085F e T1041I na interface de pentâmero, e opcionalmente (iii) as mutações F1134L e Y1159F no domínio de bolsa. Alternativamente, uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 2 e compreender modificações (i) nos resíduos 3178 e 1107 na interface de protômero, e (ii) no resíduo 2057 na interface de pentâmero, e opcionalmente (iii) nos resíduos 1134 e 1183 no domínio de bolsa e (iv) nos resíduo 4057 na rede interna, e em particular (i) as mutações Q3178L e V1107I na interface de protômero, e (ii) a mutação D2057A na interface de pentâmero, e opcionalmente (iii) as mutações F1134L e V1183L no domínio de bolsa e (iv) a mutação I4057V na rede interna.

[0109] Outros exemplos não limitadores de VLPs derivadas de um vírus da pólio do tipo 2 de acordo com a presente invenção podem ter as mutações ou combinações de mutações a seguir: (i) duas mutações em um domínio de bolsa (por exemplo, em quaisquer dois dos resíduos 1134, de preferência F1134L, 1159, de preferência Y1159F, 1183, de preferência V1183L e 1194, de preferência 11194V, e de preferência dos resíduos 1134 e 1159 ou resíduos 1134 e 1194); (ii) três mutações em um domínio de bolsa (por exemplo, em quaisquer três dos resíduos 1134, de preferência F1134L, 1159, de preferência Y1159F, 1183, de preferência V1183L e 1194 de preferência 11194V, e de preferência dos resíduos 1134, 1159 e 1194); (iii) duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 3085, de preferência L3085F e

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63/113 no resíduo 1041, de preferência T10411) e uma mutação na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L); (iv) uma mutação na interface de pentâmero (por exemplo, no resíduo 1041, de preferência T1041), uma mutação na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L) e uma mutação em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1134, de preferência F1134L); (v) duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 3085, de preferência L3085F e no resíduo 1041, de preferência T1041I), uma mutação na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L) e uma mutação em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1134, de preferência F1134L); (vi) mutações na interface de pentâmero (por exemplo, no resíduo 1041, de preferência T1041I), uma mutação na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L) e duas mutações em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1134, de preferência F1134L e no resíduo 1159, de preferência Y1159F); (vii) duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 3085, de preferência L3085F e no resíduo 1041, de preferência T10411), uma mutação na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L) e duas mutações em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1134, de preferência F1134L e no resíduo 1159, Y1159F preferível); (viii) uma mutação na interface de pentâmero (por exemplo, no resíduo 1041, de preferência T1041I), uma mutação na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L) e três mutações em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1134, de preferência F1134L, no resíduo 1159, de preferência Y1159F e no resíduo 1194, de preferência 11194V); (ix) duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, nos resíduos 3085, de preferência L3085F e no resíduo 1041, de preferência T1041I), uma mutação na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de

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64/113 preferência Q3178L) e três mutações em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1134, de preferência F1134L, no resíduo 1159, de preferência Y1159F e no resíduo 1194, de preferência I1194V); e (x) uma mutação na interface de pentâmero (por exemplo, em resíduos 2057, de preferência D2057A, duas mutações na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 3178, de preferência Q3178L e no resíduo 1107, de preferência V11071), duas mutações em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1134, de preferência F1134L e no resíduo 1183, de preferência V1183L) e uma mutação em uma rede interna (por exemplo, no resíduo 4057, de preferência I4057V).

[0110] Em um outro exemplo não limitador, uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 3 e compreender modificações (i) nos resíduos 2215 e 3091 na interface de protômero, (ii) nos resíduos 2018 e 3085 na interface de pentâmero, e opcionalmente (iii) nos resíduos 1132 no domínio de bolsa, (iv) nos resíduos 2241 na interface de VP2/VP3, (v) nos resíduos 4067, 3019 e 1054 na rede interna, e (vi) nos resíduos 1105 no cânion, e em particular (i) as mutações L2215M e F3091S na interface de protômero, (ii) as mutações L2018I e L3085F na interface de pentâmero, e opcionalmente (iii) a mutação F1132L no domínio de bolsa, (iv) a mutação D2241E na interface de VP2/VP3, (v) as mutações T4067A, H3019Y e A1054V na rede interna, e (vi) a mutação T1105M no cânion. Em uma modalidade preferida, uma VLP da invenção pode ser derivada de um vírus da pólio do tipo 3 e compreender (i) as mutações L2215M e F3091S na interface de protômero, (ii) as mutações L2018I e L3085F na interface de pentâmero, (iii) a mutação F1132L no domínio de bolsa, (iv) a mutação D2241E na interface de VP2/VP3, (v) as mutações T4067A, H3019Y e opcionalmente A1054V na rede interna, e (vi) a mutação T1105M no cânion.

[0111] Um outro exemplo não limitador de uma VLP derivada de um

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65/113 vírus da pólio do tipo 3 de acordo com a presente invenção pode ter as combinações de mutações a seguir: (i) duas mutações na interface de pentâmero (por exemplo, no resíduo 2018, de preferência L2018I e no resíduo 3085, de preferência L3085F), uma mutação na interface de protômero (por exemplo, no resíduo 2215, de preferência L2215M), duas mutações na rede interna (por exemplo, no resíduo 4067, de preferência T4067A e no resíduo 3019, de preferência H3019Y), uma mutação na interface de VP2/VP3 (por exemplo, no resíduo 2241, de preferência D2241E), uma mutação em um domínio de bolsa (por exemplo, no resíduo 1132, de preferência F1132L) e uma mutação em um domínio do cânion (por exemplo, no resíduo 1105, de preferência T1105M).

[0112] Além dos resíduos de aminoácidos particulares descritos acima, uma VLP da invenção pode compreender uma ou mais modificações adicionais entre uma ou mais dentre a interface de VP2/VP3, da rede interna, do cânion e/ou do domínio de bolsa. Tipicamente uma ou mais ditas modificações adicionais são identificadas ao usar um método da invenção tal como descrito no presente documento.

Polinucleotídeos da Invenção [0113] A presente invenção também provê um polinucleotídeo que codifica a VLP da invenção. O termo polinucleotídeo engloba sequências de DNA e de RNA, embora tipicamente o polinucleotídeo compreenda uma sequência de DNA.

[0114] Um polinucleotídeo da invenção codifica desse modo tipicamente um precursor de capsídeo (P1) para o capsídeo modificado da VLP da invenção, junto com uma protease apropriada. Os exemplos de proteases apropriadas incluem 3C e 3CD do vírus da pólio ou de um outro enterovirus. O nível de expressão da protease é controlado para assegurar a expressão adequada (para permitir o processamento

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66/113 completo do precursor P1 como proteínas VPO, VP1 e VP3 maduras), enquanto minimiza a toxicidade da célula devido à divagem circunstante de proteínas de células hospedeiras. Tal controle pode ser praticado de imediato por métodos convencionais. Um polinucleotídeo da invenção pode ser usado para a expressão recombinante de uma VLP da invenção, ou como uma vacina de DNA/RNA.

[0115] A invenção também provê um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da invenção. Tipicamente, no vetor de expressão, o polinucleotídeo da invenção é ligado operavelmente a um promotor apropriado. O polinucleotídeo também pode ser ligado a uma sequência de terminadores apropriada. As sequências de terminadores e promotores apropriadas são bem conhecidas no estado da técnica.

[0116] A escolha do promotor depende neste caso dos sistemas de expressão usados para a expressão. Em geral, os promotores constitutivos são os preferidos, mas os promotores induzíveis também podem ser analogamente usados. A construção produzida desta maneira inclui pelo menos uma porção de um vetor, em particular elementos reguladores. O vetor é de preferência capaz de expressar o ácido nucleico em uma determinada célula hospedeira. Qualquer célula hospedeira apropriada pode ser usada, tais como células hospedeiras de mamíferos, insetos, leveduras e/ou de plantas. Além disso, a síntese da proteína livre de células pode ser usada. Tais sistemas de expressão e células hospedeiras são um padrão no estado da técnica.

[0117] A expressão livre de vírus em células de mamíferos deve ser o sistema mais próximo ao ambiente natural em que as VLPs são processadas e montadas durante o crescimento normal do vírus. Uma expressão de mamífero exemplificadora para as VLPs do vírus da pólio é o sistema de expressão do vírus de vaccinia (cepa Ancara - MVA). Este sistema permite níveis elevados de expressão de proteína recombinante, com a vantagem de manter a modificação pós

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67/113 translacional autêntica dos produtos expressos no ambiente mais autêntico: a célula de mamífero.

[0118] As VLPs da invenção, e os polinucleotídeos que codificam as ditas VLPs, podem ser expresss em células de insetos ao usar vetores de baculovírus. A produção de vacina humana em células de insetos através de um vetor de baculovírus tem a vantagem da precedência, uma vez que uma vacina de pailoma humano comercialmente disponível agora em uso é produzida desta maneira. Os exemplos não limitadores de linhagens de células de insetos apropriadas incluem Sf9, T.Ni e Ao38.

[0119] As VLPs da invenção, e os polinucleotídeos que codificam as ditas VLPs, podem ser expressos em levedura. As vantagens potenciais de rendimentos elevados e baixo custo de produção tornam os sistemas de expressão de levedura atraentes. A tecnologia da expressão de levedura ao usar Saccharomyces ou Pichia é possível ao usar técnicas padrão.

[0120] As VLPs da invenção, e os polinucleotídeos que codificam as ditas VLPs, podem ser expressos em células de plantas. As plantas têm uma série de vantagens potenciais: são robustas, de produção barata, e qualquer produto derivado das mesmas tem baixo risco de contaminação com endotoxinas ou patógenos de mamíferos. Outra vez, os métodos e as técnicas são conhecidos no estado da técnica.

[0121] Alternativamente, um sistema de síntese de proteínas livres de células pode ser usado. Tais sistemas têm vantagens distintas em relação aos métodos tradicionais in vivo para a produção de proteínas. A ausência do requisito para manter a viabilidade da célula permite a otimização da capacidade sintética da proteína do extrato livre de célula de produzir proteínas. Além disso, a falta de uma membrana celular permite a adição direta de fatores não naturais que podem ser usados para manipular a transcrição, a tradução e a multiplicação, e provê a

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68/113 modulação precisa do processo de expressão de proteína. Os sistemas livres de células exemplificadores de E. colisão conhecidos no estado da técnica. A coexpressão de N-miristil transferase de mamífero dentro das células bacterianas pode ser requerida para obter a modificação correta da proteína do precursor viral para facilitar a duplicação e a montagem de capsídeo apropriadas.

[0122] As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser obtidas ao usar qualquer processo apropriado conhecido no estado da técnica. Desse modo, as moléculas de ácido nucleico podem ser obtidas ao usar técnicas de síntese química. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser obtidas ao usar técnicas de biologia molecular.

[0123] O vetor de expressão da presente invenção é de preferência projetado in silico, e então sintetizado por técnicas convencionais de síntese de polinucleotídeos.

[0124] A informação da sequência de polinucleotídeo é opcionalmente modificada para o deslocamento de códons de acordo com o sistema de expressão de célula hospedeira final (por exemplo, uma célula de planta, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de mamífero, E. coli) que deve ser empregado.

[0125] A presente invenção também provê polipeptídeos codificados por sequências de polinucleotídeo tal como descrito acima. [0126] A porcentagem de identidade de sequência entre duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos consistem em uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências. Desse modo, a % de identidade pode ser calculada como o número de nucleotídeos/aminoácidos idênticos divididos pelo número total de nucleotídeos/aminoácidos multiplicado por 100. Os cálculos da % de identidade de sequência também podem levar em conta o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna que precisa ser introduzida

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69/113 para otimizar um alinhamento de duas ou mais sequências. As comparações das sequências e a determinação de uma porcentagem de identidade entre duas ou mais sequências podem ser realizadas ao usar algoritmos matemáticos específicos, tais como BLAST, que serão familiares a um elemento versado na técnica.

Métodos de Identificação de Modificações que Modulam a Estabilidade de Capsídeo de Vírus da Pólio [0127] Os autores da presente invenção planejaram um método inovador para identificar modificações estabilizantse, em particular as mutações estabilizantes dentro do capsídeo do vírus da pólio. Em particular, a abordagem dos autores da presente invenção começa com a seleção de uma cepa do vírus da pólio que tem um defeito de montagem. Um exemplo não limitador de tal cepa inicial é Sabin 3, que compreende uma mutação no resíduo 91 de VP3 (isto é, uma mutação em 3091). Na cepa de Leon do tipo selvagem, essa posição é uma serina, ao passo que na cepa de Sabin 3 o resíduo é uma fenilalanina. Essa mutação torna o conjunto de Sabin 3 sensível à temperatura (ts) ao inibir a montagem dos intermediários de montagem de capsídeo, em que quanto mais elevada a temperatura maior a inibição. Os autores da presente invenção verificaram de modo surpreendente que as mutações que superam essa sensibilidade à temperatura, quando introduzidas nas proteínas de capsídeos do tipo selvagem, estabilizam as VLPs.

[0128] Desse modo, a presente invenção também provê um método de identificação de uma ou mais modificações dentro de um capsídeo do vírus da pólio que modulam (tipicamente aumentam) a estabilidade do dito capsídeo do vírus da pólio. O dito método compreende as etapas de: (a) introdução de uma mutação desestabilizante (tal como S3091F) no capsídeo de uma cepa do vírus da pólio; (b) o crescimento da dita cepa do vírus da pólio a temperaturas semipermissivas; e (c) a seleção de vírus da pólio (não sensíveis à temperatura) resultantes para

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70/113 identificar uma ou mais modificações que revertem o efeito da mutação desestabilizante. Em algumas modalidades, a cepa do vírus da pólio usada no dito método é uma cepa do vírus da pólio que já tem um defeito de montagem. Em tais modalidades, a etapa (a) do método não é requerida e a invenção provê um método em que essa etapa é omitida. Essa cepa pode ser uma cepa (de vacina ou de ocorrência natural) existente. Um exemplo não limitador de uma cepa do vírus da pólio de partida apropriada é Sabin 3. Caso contrário, o defeito de montagem pode ser introduzido em uma cepa desejada como ponto de partida para o método (etapa (a)). Um exemplo não limitador de uma cepa de partida do vírus da pólio apropriada desse tipo é Mahoney e um defeito de montagem apropriado seria aquele que resulta de uma substituição de serina por fenilalanina no resíduo 91 de VP3 (S3091F). Desse modo, o método desenvolvido pelos autores da presente invenção é singular: é baseado da introdução de uma mutação desestabilizante a uma cepa de teste do vírus da pólio (ou ao uso de uma cepa existente com tal mutação) e o crescimento da dita cepa de teste a temperaturas semipermissivas para gerar vírus com mutações reestabilizantes. Tipicamente, o dito método envolve o arranjo em sequência profundo (isto é, sem purificação) das cepas do vírus da pólio estabilizadas resultantes para identificar as mutações estabilizantes.

[0129] Tal como descrito no presente documento, essas mutações estabilizantes podem então ser introduzidas na região P1 do genoma do vírus da pólio em combinações diferentes, e a expressão recombinante deve permitir então a produção de VLPs estáveis para serem usadascomo vacinas sem a necessidade de vírus vivo. Por conseguinte, o método da invenção também pode compreender a etapa de introdução de uma ou mais modificações identificadas na etapa (c) em um vírus da pólio do tipo selvagem e de verificação se uma ou mais ditas modificações aumentam a estabilidade do capsídeo do vírus da pólio.

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71/113 [0130] O método pode envolver a introdução de qualquer mutação desestabilizante apropriada a uma cepa do teste do vírus da pólio, ou o uso de uma cepa de teste existente com quaisquer mutações desestabilizantes apropriadas. As mutações desestabilizantes apropriadas podem ser selecionadas, por exemplo, mediante o crescimento do vírus da pólio sob condições de temperatura baixa/reduzida (tipicamente abaixo de 33°C), o crescimento das células que expressam um receptor do vírus da pólio mutante (PVR) ou a pseudoreversão de mutantes estabilizados. Tipicamente, os efeitos fenotípicos de uma mutação desestabilizante apropriada incluem a sensibilidade à temperatura aumentada para o crescimento, e/ou a sensibilidade fria reduzida (isto é, a temperaturas abaixo de 33°C) e/ou a faixa ampliada de uso do receptor, e a viabilidade aumentada. Em algumas modalidades, uma combinação de mutações desestabilizantes pode ser usada.

[0131] Os exemplos não limitadores de mutações desestabilizantes apropriadas para o uso nos métodos da presente invenção incluem:

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Região	Posição da modificação	Mutação desestabilizante
Interface de Protômero	3026	P3026S
3091	S3091F
3228	T3228A
3232	S3232L
1114 §	V1114A§
1171	Y1171H
1172 §	T1172A §
1248^#	N1248S#
Interface do pentâmero	4065	A4065T, A4065S
2068	T2068N
3130	I3130V
1041 *	11041T*
Rede interna: eixo tríplice	4057	L4057I
4063	K4063R
2029	A2029T
2030	N2030S
2033	V2033L
2124	V2124M
2208	V2208I
1042§	L1042I §
1049§	A1049T §
1051 §	N1051S§
1052§	P1052S,P1052L§
1054§	V1054A §
Rede interna: eixo quíntuplo	4006	S4006T
4048	N4038S
Interface de VP2/VP3	2200	R2200K
2157	Y2157F
Interface de VP2/VP1 (o mesmo protômero)	2184	V2184A
2192	Y2192C
2191	V2191I
Junção de VP1/2/3	2186	L2186M
Cânion	1105 §	M1105T, M1105V§
Outro	2136	S2136G
1122 §	F1122L§

* mutação desestabilizante identificada no vírus da pólio do tipo 2. A posição correspondente no tipo 3 é 1039.

§ mutações desestabilizantes identificadas no vírus da pólio do tipo 3. Para a posição correspondente no tipo ¹/2, adicionar dois às posições listadas na Tabela 4 acima.

# mutação desestabilizante identificada no vírus da pólio do tipo 3. Para a posição correspondente no tipo ¹/2, adicionar um à posição listada na Tabela 4 acima.

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Tabela 4: Mutações desestabilizantes exemplificadoras [0132] O método pode ser executado a qualquer temperatura que seja semipermissiva para o crescimento da cepa do vírus da pólio escolhida. Neste contexto, uma temperatura semipermissiva pode ser definida como qualquer temperatura que permite todas as etapas de replicação exceto a montagem do capsídeo. Por exemplo, uma temperatura semipermissiva pode ficar na faixa de cerca de 38°C a cerca de 40°C.

[0133] Tipicamente, o dito método é usado para identificar as modificações que aumentam a estabilidade do capsídeo do vírus da pólio se o crescimento da cepa do vírus da pólio a temperaturas semipermissivas for reduzido sem a modificação. Outros efeitos das modificações estabilizantes podem incluir a sensibilidade fria aumentada (isto é, sensibilidade aumentada quando crescidos a temperaturas abaixo de 33°C). As mutações estabilizantes podem ser selecionadas ao usar ensaios de placa, ou por outros métodos tais como o arranjo em sequência profundo/ o arranjo em sequência da geração seguinte.

[0134] A presente invenção também engloba outros métodos de identificação de modificações candidatas que modulam a estabilidade de um capsídeo do vírus da pólio. Por exemplo, os mutantss estabilizantes identificados pelo método acima podem ser introduzidos nas cepas do tipo selvagem em combinações diferentes. Quando as ditas combinações de mutantes estabilizam o capsídeo viral além do que é ideal para a montagem ou não cobertura, o crescimento viral às temperaturas que são totalmente permissivas para todas as etapas de replicação do tipo selvagem é tipicamente reduzido. Quando esses vírus são crescidos a temperaturas totalmente permissivas, surgem novas variantes do vírus da pólio de crescimento mais rápido. Essas variantes de crescimento mais rápido perderam tipicamente uma ou mais das

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74/113 mutações estabilizantes originalmente adquiridas, e/ou adquiriram novas mutações desestabilizantes em outros resíduos dentro das proteínas de capsídeos. As posições dessas mutações desestabilizantes podem ser visadas em outros vírus para produzir mutações estabilizantes ao usar as técnicas divulgadas no presente documento.

[0135] Outras abordagens para aà identificação de mutações estabilizantes de capsídeos candidatas incluindo a predição de interações estabilizantes da estrutura atômica e a seleção de mutantes de vírus termoestáveis por exposição limitada a altas temperaturas e podem ser usadas de acordo com a presente invenção.

Métodos de Produção [0136] A invençãotambém provê um método de produção de uma VLP da invenção, em que o dito método envolve: (a) a introdução de um transcrito de RNA infeccioso que codifica a VLP em uma célula de mamífero hospedeira; ou (b) a produção recombinante dos polipeptídeos derivados dos capsídeos do vírus da pólio que compreendem uma ou mais modificações (de preferência uma ou mais mutações) identificadas pelo método de identificação descrito no presente documento e a montagem dos ditos polipeptídeos para formar uma VLP.

[0137] Tipicamente, o dito método (b) compreende a etapa de expressão de um polinucleotídeo da invenção, junto com uma protease apropriada, em uma célula, em que os polipeptídeos derivados de capsídeos serão expressos e, após a divagem, automontados em VLPs, e recuperação das VLPs expressas. Tipicamente, o método também compreende uma etapa de introdução do polinucleotídeo da invenção na célula. Por exemplo, o polinucleotídeo da invenção pode ser introduzido na célula na forma de um vetor de expressão tal como descrito no presente documento.

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75/113 [0138] Por exemplo, o dito método para a produção de uma VLP da invenção pode compreender a expressão de um polinucleotídeo (tal como descrito acima) em uma célula hospedeira apropriada, a lise da célula hospedeira para obter um homogenato da célula hospedeira que contem a VLP, e isolamento da VLP.

[0139] O polinucleotídeo provido/introduzido na célula pode ser DNA, RNA ou misturas dos mesmos. O polinucleotídeo também pode ser modificado no que diz respeito à sua resistência à nuclease, tal como, por exemplo, mediante a inserção de ligações de fosfortioato. O ácido nucleico pode ser produzido a partir de um ácido nucleico de partida, em que este último é acessível, por exemplo, por meoi de clonahem de bancos de dados genômicos ou de DNA. Além disso, o ácido nucleico pode ser produzido diretamente pela síntese de fase sólida. Os métodos apropriados são conhecidos de um elemento versado no estado da técnica. Se for suposto um ácido nucleico de partida, uma modificação específica, por exemplo, por meio de mutagênese específica de localidade, pode ser acarretada, o que resulta em pelo menos uma adição, inserção, deleção e/ou substituição no nível do aminoácido. O ácido nucleico é ligado então operativamente a um promotor apropriado tal como descrito no presente documento.

[0140] Uma VLP da invenção é tipicamente gerada por meios recombinantes. Em particular, as mutações estabilizantes podem ser identificadas pelos métodos descritos no presente documento. O DNA de um vírus da pólio estabilizado gerado pelos ditos métodos pode ser clonado e transcrito para formar o RNA. Esse RNA pode ser introduzido em uma célula de expressão apropriada ao usar técnicas de cultura de célula padrão e usado para gerar VLPs não infeciosas vazias em um método de produção de uma só rodada.

[0141] A VLP da invenção da célula é tipicamente purificada e/ou concentrada após a recuperação da célula. Qualquer(Quaisquer)

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76/113 método(s) apropriado(s) pode(m) ser usado(s) para a recuperação, a purificação e/ou a concentração do polipeptídeo da invenção. As técnicas padrão para a recuperação, a purificação e/ou a concentração são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, métodos de cromatografia e/ou eletroforese.

Células [0142] A VLP da presente invenção pode ser produzida por uma célula apropriada (também conhecida como célula hospedeira), tal como, por exemplo, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou Bacillus megaterium, que multiplica um vetor de expressão recombinante, o vetor que codifica para uma VLP da invenção.

[0143] Por conseguinte, a invenção também provê células, as quais produzem uma VLP da invenção. Tipicamente, as células da invenção contêm um polinucleotídeo ou vetor de expressão da invenção e são apropriadas para expressar o polinucleotídeo ou o vetor. Numerosos sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos são conhecidos no estado da técnica, as células são selecionadas, por exemplo, de células procarióticas tais como E. coliou B. megaterium, de células eucarióticas tais como S. cerevisiae e P. pastoris. Células eucarióticas superiores, tais como células de insetos, célula de plantas ou células de mamíferos, também podem ser usadas.

Composições e Indicações Terapêuticas/Cosméticas [0144] A invenção também provê uma composição farmacêutica que compreende uma VLP da invenção. A composição, que é tipicamente uma composição farmacêutica, pode compreender opcionalmente um excipiente, um diluente, um carreador, um propelente, um sal e/ou um aditivo farmaceuticamente aceitáveis. Tipicamente, a composição da invenção é apropriada para a vacinação contra o vírus da pólio. A composição é particularmente apropriada para a administração subcutânea, intramuscular, de implante e/ou tópica. A

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77/113 administração intramuscular é a preferida. As composições apropriadas para a injeção podem estar na forma de soluções, suspensões ou emulsões, ou pós secos que são dissolvidos ou suspensos em um veículo apropriado antes do uso.

[0145] As faixas de dosagem para a administração da VLP da presente invenção são aquelas para que seja produzido o efeito terapêutico desejado. Deve ser apreciado que a faixa de dosagem requerida depende da natureza precisa da VLP ou da composição, da rota de administração, da natureza da formulação, da idade do paciente, da natureza, da extensão ou da gravidade da condição do paciente, de contraindicações, se existerem, e do julgamento do médico atendente. As variações nesses níveis de dosagem podem ser ajustadas ao usar rotinas empíricas padrão para a otimização.

[0146] As dosagens apropriadas podem ficar na mesma faixa que aquelas de IPVs atuais em termos de unidades de D-antígeno por dose humana (40, 8 e 32 para os tipos 1,2 e 3) ou podem ser mais baixas se as VLPs provarem ser mais imunogênicas do que IPV nos seres humanos, uma vez que parecem estar nos animais.

[0147] As formas de dosagens fluidas são preparadas tipicamente ao utilizar a VLP e um veículo livre de pirogênio estéril. A VLP, dependendo do veículo e da concentração usados, pode ser dissolvida ou suspensa no veículo. Na preparação de soluções, a VLP pode ser dissolvida no veículo, a solução se tornar isotônica se for necessário, mediante a adição de cloreto de sódio, e esterilizada por meio de filtração através de um filtro estéril ao usar técnicas assépticas antes de ser colcoada em frascos ou em ampolas estéreis apropriadas, e lacrada. Vantajosamente, os aditivos tais como agentes tampão, solubilizantes, estabilizantes, conservantes ou bactericidas, em suspensão ou emulsificantes e/ou agentes anestésicos locais podem ser dissolvidos no veículo.

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78/113 [0148] Os pós secos, que são dissolvidos ou suspensos em um veículo apropriado antes do uso, podem ser preparados ao colocar os ingredientes pré-esterilzados em um recipiente estéril ao usar uma técnica asséptica em uma área estéril. Alternativamente os ingredientes podem ser dissolvidos em recipientes apropriados ao usar uma técnica asséptica em uma área estéril. O produto é então secado por congelamento e os recipientes são lacrados assepticamente.

[0149] As suspensões parenterais, apropriadas para a injeção intramuscular, subcutânea ou intradermal, são preparadas substancialmente da mesma maneira, exceto pelo fato que os componentes estéreis são suspendidos no veículo estéril, em vez de ser dissolvidos, e a esterilização não pode ser realizada por meio de filtração. Os componentes podem ser isolados em um estado estéril ou, alternativamente, podem ser esterilizados após o isolamento, por exemplo, por meio de irradiação com raios gama.

[0150] Um agente de suspensão, por exemplo, a polivinil pirrolidona, pode ser incluído na(s) composição(ões) para facilitar a distribuição uniforme dos componentes.

[0151] A administração de acordo com a presente invenção pode tirar vantagem de uma variedade de tecnologias de aplicação, incluindo o encapsulamento de micropartículas, os sistemas de aplicação viral ou a colisão em aerossol de alta pressão.

[0152] A invenção também provê uma VLP, uma composição ou uma vacina tal como descrito no presente documento para ser usada em um método de vacinação contra o vírus da pólio. A invenção também provê o uso de uma VLP e/ou uma composição tal como descrito no presente documento na manufatura de um medicamento para ser usado em um método de vacinação contra o vírus da pólio. A invenção também provê um método de vacinação de um indivíduo contra o vírus da pólio, em que o método compreende a administrando a um indivíduo com

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79/113 necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de uma VLP, composição ou vacina.

Vacinas [0153] As partículas parecidas com o vírus da pólio (VLPs) da invenção podem ser usadas em uma pequena escala, por exemplo, como um antígeno em ensaios de serologia (por exemplo, como parte de estudos de seroprevalência ou outras atividades de vigilância) ou em uma escala maciça na produção de vacina. Uma vez que as VLPs da invenção não são infecciosas (não possuem o genoma do vírus da pólio), e a produção através da expressão recombinante não deve requerer o vírus vivo, a contenção antes da erradicação do vírus da pólio e a pós-erradicação (na categoria de BSL3-pólio tal como necessário pela orientação da WHO atual para as cepas viáveis infecciosas para seres humanos) não deve ser necessária.

[0154] As VLPs da invenção podem ser produzidas por qualquer método apropriado (tal como descrito no presente documento), tipicamente ao usar técnicas recombinantes. Devido ao fato que as VLPs da invenção não são infecciosas, a inativação não é requerida antes do uso como uma vacina.

[0155] Uma VLP da invenção pode ser combinada com um carreador ou um diluente farmaceuticamente aceitável. Qualquer carreador ou diluente usado convencionalmente em preparados de vírus inativados ou outras vacinas do vírus da pólio, por exemplo, preparados de IPV, pode ser empregado. A preparação de VLPs pode compreender VLPs que compreendem proteínas de capsídeos do tipo 1, tipo 2 e/ou tipo 3.

[0156] A VLP da invenção, portanto, pode ser usada para a vacinação contra a poliomielite em um paciente humano. Por conseguinte, a invenção provê um método de vacinação de um indivíduo contra o vírus da pólio, em que o método compreende a

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80/113 administração a um indivíduo com necessidade da mesma de uma quantidade eficaz de uma VLP da invenção. Uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para uma gerar resposta imune protetora contra o vírus da pólio. Para esta finalidade, ela pode ser administrada por qualquer rota apropriada, tal como parenteralmente. A administração parenteral pode ser por meio de injeção subcutânea, intradermal ou intramuscular. A VLP da invenção pode ser administrada com um adjuvante.

[0157] Uma dose que corresponde à quantidade administrada para uma IPV convencional, tal como 8 a 40 unidades de antígeno D, pode ser administrada.

[0158] A dose da VLP da invenção pode ser ajustada para atingir o grau requerido de imunogenicidade. Por exemplo, quando uma proteína de capsídeo é derivada de Sabin 2 ou de Sabin 3, pode ser usada uma dose mais elevada do que quando a proteína de capsídeo é derivada de Sabin 1, MEF, Mahoney ou Saukett. Por exemplo, uma dose de cerca de 16 a cerca de 80 unidades de antígeno D, tal como cerca de 30 unidades de antígeno D (por exemplo, 32 unidades de antígeno D) ou cerca de 60 unidades de antígeno D (por exemplo, 64 unidades de antígeno D) pode ser usada. Doses mais baixas podem ser usadas se a vacina for administrada com um adjuvante apropriado.

[0159] A presente invenção provê uma vacina que compreende uma ou mais VLPs da invenção e um carreador ou um diluente farmaceuticamente aceitável. A vacina também pode compreender um adjuvante. A vacina pode compreender uma ou mais VLPs recombinantes intertípicas diferentes da invenção. Por exemplo, a vacina pode compreender uma mistura de VLPs que compreende proteínas estruturais de cepas do vírus da pólio do tipo 1 e do tipo 2, do tipo 1 e do tipo 3, do tipo 2 e do tipo 3 ou do tipo 1, do tipo 2 e do tipo 3. Tipicamente, as proteínas de capsídeos do tipo 1 serão de Sabin 1 ou

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Mahoney, de preferência de Mahoney, as proteínas de capsideos do tipo 2 serão de Sabin 2 ou MEF, de preferência MEF, e as proteínas de capsideo do tipo 3 serão de Sabin 3 ou Saukett, de preferência Saukett. [0160] Em vista das imunogenicidades relativas diferentes do virus da pólio do tipo 1, do tipo 2 e do tipo 3 da invenção, a vacina pode compreender quantidades diferentes de VLPs que contêm proteínas de capsideos do tipo 1, do tipo 2 e/ou do tipo 3. Por exemplo, uma razão entre o tipo 1: tipo 2: tipo 3 de x:y:z pode ser usada onde x<y<z. Em um exemplo específico, a razão pode ser de 40:8:32 unidades de antígeno D.

[0161] A VLP da invenção pode ser administrada como um vacina de pólio autônoma ou em uma vacina em combinação que contém outros componentes, tais como DTP (difteria, pertusse, tétano), Hib (Haemophilus influenza do tipo B) ou hepatite B.

[0162] A presente invenção também provê: o uso de uma VLP de acordo com a invenção na manufatura de um medicamento para ser usado em um método de vacinação contra o vírus da pólio; e uma VLP de acordo com a invenção para ser usada em um método de vacinação contra o vírus da pólio.

[0163] Os autores da presente invenção são os primeiros a apreciar que uma VLP estabilizada tem a estabilidade e a imunogenicidade necessárias para a utilidade em uma vacina do vírus da pólio, tal como demonstrado nos exemplos no presente documento. Por conseguinte, a presente invenção provê um método de geração de uma vacina do vírus da pólio que compreende a aplicação de uma VLP estabilizada. Tipicamente, o dito método compreende a etapa de identificação de uma ou mais modificações estabilizantes do capsideo, a introdução de uma ou mais ditas modificações estabilizantes em uma VLP, e a produção de VLPs com uma ou mais modificações estabilizantes. O método de identificação de uma ou mais ditas modificações

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82/113 estabilizantes e/ou o método de produção das ditas VLPs podem ser tal como descrito no presente documento. Uma ou mais modificações estabilizantes de capsídeos podem ser qualquer modificação/mutação tal como descrito no presente documento, ou qualquer combinação das mesmas.

[0164] A presente invenção provê um vetor que expressa uma VLP da invenção. Tipicamente, o vetor está presente na forma de uma formulação de vacina.

[0165] O vetor pode ser um vetor viral. Tal vetor viral pode ser um adenovirus (de um sorotipo humano tal como AdHu5, de um sorotipo símio tal como ChAd63, ChAdOXI ou ChAdOX2, ou uma outra forma) ou um vetor de vírus da varíola (tal como vaccinia Ancara modificado (MVA)). ChAdOXI e ChAdOX2 são divulgados na patente WO2012/172277. ChAdOX2 é um vetor viral à base de AdC68 derivado de BAC e modificado por E4.

[0166] Os vetores virais são normalmente vetores não replicantes ou danificados por replicação, o que significa que o vetor viral não pode se replicar até qualquer extensão significativa em células normais (por exemplo, células humanas normais), tal como medido por meios convencionais - por exemplo, através da medição da síntese do DNA e/ou de título viral. Os vetores não replicantes ou danificados pela replicação podem ter se tornado assim de maneira natural (isto é, eles foram isolados, tal como da natureza) ou artificial (por exemplo, mediante a produção in vitro ou pela manipulação genética). Vai haver geralmente pelo menos um tipo de célula em que o vetor viral danificado por replicação pode ser crescido - por exemplo, vaccinia Ancara modificada (MVA) pode ser crescido em células de CEF. Em uma modalidade, o vetor é selecionado de um adenovirus humano ou símio ou de um vetor de vírus da varíola.

[0167] Tipicamente, o vetor viral é incapaz de causar uma infecção

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83/113 significativa em um indivíduo animal, tipicamente em um indivíduo mamífero tal como um ser humano ou um outro primata.

[0168] A invenção também provê uma vacina de ácido nucleico que codifique uma VLP da invenção. Tal vacina pode compreender o DNA ou o RNA que codifica uma VLP da invenção.

[0169] Por exemplo, um vetor de DNA ou vacina que expressa uma VLP da invenção pode ser uma vacina de DNA à base de plasmídio. Em uma modalidade, o vetor de DNA tem a capacidade de expressão em um sistema de expressão de células de mamíferos, tal como uma célula imunizada.

[0170] O vetor pode ser um vetor de RNA, tal como uma vacina de RNA de autoamplificação (Geall, A.J. et al., Proc Natl Acad Sei EUA 2012; 109(36) páginas 14604-9; incorporado no presente documento a título de referência).

[0171] Uma vacina de ácido nucleico da invenção compreende tipicamente um ácido nucleico (DNA ou RNA) que codifica um polinucleotídeo precursor de capsídeo P1 para uma VLP, junto com uma protease viral que tem a capacidade de clivar o dito precursor de capsídeo P1 nas proteínas de capsídeos VP1, VP3 e VP3 para a montagem de VLP. Os exemplos de proteases virais apropriadas incluem 30 e 3CD. O ácido nucleico na dita vacina de ácido nucleico é tipicamente ligado operavelmente a um promotor apropriado. Os exemplos de promotores apropriados são de disponibilidade imediata no estado da técnica.

Chave para as IP SEQ N^gs [0172] Mahoney do tipo 1 de vírus da pólio humano (genoma completo) N^Q de Acesso no GenBank: V01149 (versão V01149.1, depositado em 10 de fevereiro de 2003).

[0173] Cepa do tipo 3 de vírus da pólio humano MEF-1 (gene de poliproteína, eds completos) N^Q de Acesso no GenBank: AY238473

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84/113 (versão AY238473.1, depositada em 23 de setembro de 2004).

[0174] Saukett do tipo 3 de vírus da pólio humano (proteína de capsídeo H (VP4, VP2, VP3 e VP1) RNA, extremidade 5’) N² de Acesso no GenBank: L23848 (versão L23848.1, depositada em 11 de julho de 1994)

SEQ ID N²:1 - Mahoney VP1

GLGQMLESMIDNTVRETVGAATSRDALPNTEASGPTHSKEIPALTAV ETGATNPLVPSDTVQTRHVVQHRSRSESSIESFFARGACVTIMTVDN PASTTNKDKLFAVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMELTFVVTANF TETNNGHALNQVYQIMYVPPGAPVPEKWDDYTWQTSSNPSIFYTYG TAPARISVPYVGISNAYSHFYDGFSKVPLKDQSAALGDSLYGAASLN DFGILAVRVVNDHNPTKVTSKIRVYLKPKHIRVWCPRPPRQLAYYGP GVDYKDGTLTPLSTKDLTTY

SEQ ID N²: 2 - Mahoney VP2

SPNIEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYLRDSEA NPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVSWTKESRGWWWKLPDALRDMGLF GQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDSN TTTMHTSYQNANPGEKGGTFTGTFTPDNNQTSPARSSARWITSLEM ARCWGMPLCSAQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSLDSMVKHNNWGIAIL PLAPLNFVSESSPEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITLPRLQ

SEQ ID N²: 3 - Mahoney VP3

GLPVMNTPGSNQYLTADNFQSPCALPEFDVTPPIDIPGEVKNMMLAE IDTMIPFDLSATKKNTMEMYRVRLSDKPHTAASILCLSLSPASDPRLS HTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKLLVSYAPPGADPPK KRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNSTYRQTIDDSFTEGGYIS VFYQTRIVVPLSTPREMDILGFVSACNDFSVRLLRDTTHIEQKALAQ

SEQ ID N²: 4 - Mahoney VP4

GAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDFS QDPSKFTEPIKDVLIKTAPMLN

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85/113

SEQ ID N²: 5 - Mahoney VPO

GAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDFS

QDPSKFTEPIKDVLIKTAPMLN

SPNIEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYLRDSEA

NPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVSWTKESRGWWWKLPDALRDMGLF

GQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDSN

TTTMHTSYQNANPGEKGGTFTGTFTPDNNQTSPARSSARWITSLEM

ARCWGMPLCSAQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSLDSMVKHNNWGIAIL

PLAPLNFVSESSPEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITLPRLQ

SEQ ID N²:6-MEF VP1

GLGDLIEGVVEGVTRNALTPLTPANNLPDTQSSGPAHSKETPALTAV

ETGATNPLVPSDTVQTRHVIQKRTRSESTVESFFARGACVAIIEVDND

APTKRASKLFSVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMEFTFVVTSNYT

DANNGHALNQVYQIMYIPPGAPIPGKWNDYTWQTSSNPSVFYTYGA

PPARISVPYVGIANAYSHFYDGFAKVPLAGQASTEGDSLYGAASLND

FGSLAVRVVNDHNPTKLTSKIRVYMKPKHVRVWCPRPPRAVPYYGP

GVDYKDGLAPLPEKGLTTY

SEQ ID N²: 7 - MEF VP2

SPNIEACGYSDRVMQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYIKDSEA

NPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVTWRKESRGWWWKLPDALKDMGLF

GQNMFYHYLGRAGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDST

THMFTKYENANPGEKGGEFKGSFTLDTNATNPARNFCPVDYLFGSG

VLAGNAFVYPHQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSIDSMTKHNNWGIAILP

LAPLDFATESSTEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITVPRTQ

SEQ ID N²: 8 - MEF VP3

GLPVLNTPGSNQYLTADNYQSPCAIPEFDVTPPIDIPGEVRNMMELAE

IDTMIPLNLTNQRKNTMDMYRVELNDAAHSDTPILCLSLSPASDPRLA

HTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKLLVSYAPPGAEAPK

SRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNTTYRQTINDSFTEGGYIS

MFYQTRVVVPLSTPRKMDILGFVSACNDFSVRLLRDTTHISQEAMPQ

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86/113

SEQ ID N²: 9 - MEF VP4

MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDF

AQDPSKFTEPIKDVLIKTAPTLN

SEQ ID N²: 10-MEF VPO

SPNIEACGYSDRVMQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYIKDSEA

NPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVTWRKESRGWWWKLPDALKDMGLF

GQNMFYHYLGRAGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDST

THMFTKYENANPGEKGGEFKGSFTLDTNATNPARNFCPVDYLFGSG

VLAGNAFVYPHQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSIDSMTKHNNWGIAILP

LAPLDFATESSTEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITVPRTQ

SEQ ID N²:11 - Saukett VP1

GIEDLITEVAQGALTLSLPKQQDSLPDTKASGPAHSKEVPALTAVETGATNP

LVPSDTVQTRHVIQRRSRSESTIESFFARGACVAIIEVDNEEPTTRAQKLFAT

WRITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMEFTFVVTANFTNTNNGHALNQVYQIM

YIPPGAPTPKSWDDYTWQTSSNPSIFYTYGAAPARISVPYVGLANAYSHFY

DGFAKVPLKTDANDQIGDSLYSAMTVDDFGVLAIRVVNDHNPTKVTSKVRIY

MKPKHVRVWCPRPPRAVPYYGPGVDYKDNLNPLSEKGLTTY

SEQ ID N²:12 - Saukett VP2

SPNVEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEFIRDDEA

NPVDQPTEPDVATCRFYTLDTVMWGKESKGWWWKLPDALRDMGLF

GQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAIPEYCLAGDSDK

QRYTSYANANPGEKGGKFYSQFNRDTAVTSPKREFCPVDYLLGCGV

LLGNAFVYPHQIINLRTNNSATIVLPYVNALAIDSMVKHNNWGIAILPLS

PLDFAQDSSVEIPITVTIAPMCSEFNGLRNVTAPKFQ

SEQ ID N²:13 - Saukett VP3

GLPVLNTPGSNQYLTSDNHQSPCAIPEFDVTPPIDIPGEVKNMMELAE

IDTMIPLNLENTKRNTMDMYRVTLSDSADLSQPILCLSLSPASDPRLS

HTMLGEVLNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKILVAYAPPGAQPP

TSRKEAMLGTHVIWDLGLQSSCTMVVPWISNVTYRQTTQDSFTEGG

YISMFYQTRIVVPLSTPKSMSMLGFVSACNDFSVRLLRDTTHISQSAL

PQ

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87/113

SEQ ID N²:14 - Saukett VP4

MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYKDSASNAASKQDY

SQDPSKFTEPLKDVLIKTAPTLN

SEQ ID N²:15 - Saukett VPO

MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYKDSASNAASKQDYSQDP

SKFTEPLKDVLIKTAPTLNSPNVEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVV

AYGRWPEFIRDDEANPVDQPTEPDVATCRFYTLDTVMWGKESKGWWWK LPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAIPEYC

LAGDSDKQRYTSYANANPGEKGGKFYSQFNRDTAVTSPKREFCPVDYLLG CGVLLGNAFVYPHQIINLRTNNSATIVLPYVNALAIDSMVKHNNWGIAILPLS PLDFAQDSSVEIPITVTIAPMCSEFNGLRNVTAPKFQ

SEQ ID N²:16-Mahoney P1

MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDF

SQDPSKFTEPIKDVLIKTAPMLNSPNIEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQ

EAANSVVAYGRWPEYLRDSEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVSWT

KESRGWWWKLPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASK

FHQGALGVFAVPEMCLAGDSNTTTMHTSYQNANPGEKGGTFTGTFT

PDNNQTSPARRFCPVDYLLGNGTLLGNAFVFPHQIINLRTNNCATLVL

PYVNSLSIDSMVKHNNWGIAILPLAPLNFASESSPEIPITLTIAPMCCEF

NGLRNITLPRLQGLPVMNTPGSNQYLTADNFQSPCALPEFDVTPPIDI

PGEVKNMMELAEIDTMIPFDLSATKKNTMEMYRVRLSDKPHTDDPIL

CLSLSPASDPRLSHTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKL

LVSYAPPGADPPKKRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNTTYR

QTIDDSFTEGGYISVFYQTRIVVPLSTPREMDILGFVSACNDFSVRLLR

DTTHIEQKALAQGLGQMLESMIDNTVRETVGAATSRDALPNTEASGP

THSKEIPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVVQHRSRSESSIESFFAR

GACVTIMTVDNPASTTNKDKLFAVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFD MELTFVVTANFTETNNGHALNQVYQIMYVPPGAPVPEKWDDYTWQT SSNPSIFYTYGTAPARISVPYVGISNAYSHFYDGFSKVPLKDQSAALG

DSLYG AASLN D FGILAVRVVN D Η N PTKVTSKIRVYLKPKHIRVWCP RP PRAVAYYGPGVDYKDGTLTPLSTKDLTTY

Petição 870190083657, de 27/08/2019, pág. 90/144

88/113

SEQ ID N²:17-Sabin 1 P1

MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDF

SQDPSKFTEPIKDVLIKTSPMLNSPNIEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQ

EAANSVVAYGRWPEYLRDSEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVSWT

KESRGWWWKLPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASK

FHQGALGVFAVPEMCLAGDSNTTTMHTSYQNANPGEKGGTFTGTFT

PDDNQTSPARRFCPVDYLFGNGTLLGNAFVFPHQIINLRTNNCATLVL

PYVNSLSIDSMVKHNNWGIAILPLAPLNFASESSPEIPITLTIAPMCCEF

NGLRNITLPRLQGLPVMNTPGSNQYLTADNFQSPCALPEFDVTPPIDI

PGEVKNMMELAEIDTMIPFDLSAKKKNTMEMYRVRLSDKPHTDDPIL

CLSLSPASDPRLSHTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKL

LVSYAPPGADPPKKRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNTTYR

QTIDDSFTEGGYISVFYQTRIVVPLSTPREMDILGFVSACNDFSVRLM

RDTTHIEQKALAQGLGQMLESMIDNTVRETVGAATSRDALPNTEASG

PAHSKEIPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVVQHRSRSESSIESFFA

RGACVAIITVDNSASTKNKDKLFAVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRF

DMEFTFVVTANFTETNNGHALNQVYQIMYVPPGAPVPEKWDDYTWQ

TSSNPSIFYTYGTAPARISVPYVGISNAYSHFYDGFSKVPLKDQSAAL

GDSLYGAASLNDFGILAVRVVNDHNPTKVTSKIRVYLKPKHIRVWCPR

PPRAVAYYGPGVDYKDGTLTPLSTKDLTTY

SEQ ID N²: 18-MEF P1

MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDF

AQDPSKFTEPIKDVLIKTAPMLNSPNIEACGYSDRVMQLTLGNSTITT

QEAANSVVAYGRWPEYIKDSEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVTW

RKESRGWWWKLPDALKDMGLFGQNMFYHYLGRSGYTVHVQCNAS

KFHQGALGVFAVPEMCLAGDSTTHMFTKYENANPGEKGGEFKGSFT

LDTNATNPARNFCPVDYLFGSGVLAGNAFVYPHQIINLRTNNCATLVL

PYVNSLSIDSMTKHNNWGIAILPLAPLDFATESSTEIPITLTIAPMCCEF

NGLRNITVPRTQGLPVLNTPGSNQYLTADNYQSPCAIPEFDVTPPIDI

PGEVRNMMELAEIDTMIPLNLTNQRKNTMDMYRVELNDAAHSDTPIL

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89/113

CLSLSPASDPRLAHTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKL LVSYAPPGAEAPKSRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNTTYR QTINDSFTEGGYISMFYQTRVVVPLSTPRKMDILGFVSACNDFSVRLL

RDTTHISQEAMPQGLGDLIEGVVEGVTRNALTPLTPANNLPDTQSSG PAHSKETPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVIQKRTRSESTVESFFA

RGACVAIIEVDNDAPTKRASKLFSVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRF

DMEFTFVVTSNYTDANNGHALNQVYQIMYIPPGAPIPGKWNDYTWQ

TSSNPSVFYTYGAPPARISVPYVGIANAYSHFYDGFAKVPLAGQAST

EGDSLYGAASLNDFGSLAVRVVNDHNPTKLTSKIRVYMKPKHVRVW CPRPPRAVPYYGPGVDYKDGLAPLPEKGLTTY

SEQ ID N²:19-Sabin 2 P1

MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDF

AQDPSKFTEPIKDVLIKTAPMLNSPNIEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQ

EAANSVVAYGRWPEYIRDTEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVTWR

KESRGWWWKLPDALKDMGLFGQNMFYHYLGRAGYTVHVQCNASK FHQGALGVFAVPEMCLAGDSTTHMFTKYENANPGEKGGEFKGSFTL

DTNATNPARNFCPVDYLFGSGVLVGNAFVYPHQIINLRTNNCATLVLP YVNSLSIDSMTKHNNWGIAILPLAPLDFATESSTEIPITLTIAPMCCEFN

GLRNITVPRTQGLPVLNTPGSNQYLTADNYQSPCAIPEFDVTPPIDIP GEVRNMMELAEIDTMIPLNLTSQRKNTMDMYRVELSDTAHSDTPILC LSLSPASDPRLAHTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKLL

VSYAPPGAEAPKSRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNTTYRQ

TINDSFTEGGYISMFYQTRVVVPLSTPRKMDILGFVSACNDFSVRLLR DTTHISQEAMPQGIGDMIEGAVEGITKNALVPPTSTNSLPDTKPSGPA HSKEIPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVIQRRTRSESTVESFFARG ACVAIIEVDNDAPTKRASRLFSVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDM

EFTFVVTSNYIDANNGHALNQVYQIMYIPPGAPIPGKWNDYTWQTSS N PSVFYTYG AP PAR ISVPYVGI AN AYSH FYDG FAKVPLAGQASTEG D SLYGAASLNDFGSLAVRVVNDHNPTRLTSKIRVYMKPKHVRVWCPR PPRAVPYFGPGVDYKDGTLTPLPEKGLTTY

Petição 870190083657, de 27/08/2019, pág. 92/144

90/113

SEQ ID N²: 20 - Saukett P1

MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYKDSASNAASKQDYSQDP

SKFTEPLKDVLIKTAPTLNSPNVEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVV

AYGRWPEFIRDDEANPVDQPTEPDVATCRFYTLDTVMWGKESKGWWWK

LPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAIPEYC

LAGDSDKQRYTSYANANPGEKGGKFYSQFNRDTAVTSPKREFCPVDYLLG

CGVLLGNAFVYPHQIINLRTNNSATIVLPYVNALAIDSMVKHNNWGIAILPLS

PLDFAQDSSVEIPITVTIAPMCSEFNGLRNVTAPKFQGLPVLNTPGSNQYLT

SDNHQSPCAIPEFDVTPPIDIPGEVKNMMELAEIDTMIPLNLENTKRNTMDM

YRVTLSDSADLSQPILCLSLSPASDPRLSHTMLGEVLNYYTHWAGSLKFTFL

FCGSMMATGKILVAYAPPGAQPPTSRKEAMLGTHVIWDLGLQSSCTMVVP

WISNVTYRQTTQDSFTEGGYISMFYQTRIVVPLSTPKSMSMLGFVSACNDF

SVRLLRDTTHISQSALPQGIEDLITEVAQGALTLSLPKQQDSLPDTKASGPS

HSKEVPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVIQRRSRSESTIESFFARGACVA

IIEVDNEEPTTRAQKLFATWRITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMEFTFVVTA

NFTNTNNGHALNQVYQIMYIPPGAPTPKSWDDYTWQTSSNPSIFYTYGAAP

ARISVPYVGLANAYSHFYDGFAKVPLKTDANDQIGDSLYSAMTVDDFGVLAI

RVVNDHNPTKVTSKVRIYMKPKHVRVWCPRPPRAVPYYGPGVDYKDNLNP

LSEKGLTTY

SEQ ID N²: 21 - Sabin 3 P1

MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYKDSASNAASKQDY

SQDPSKFTEPLKDVLIKTAPALNSPNVEACGYSDRVLQLTLGNSTITT

QEAANSVVAYGRWPEFIRDDEANPVDQPTEPDVATCRFYTLDTVMW

GKESKGWWWKLPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNAS

KFHQGALGVFAIPEYCLAGDSDKQRYTSYANANPGERGGKFYSQFN

KDNAVTSPKREFCPVDYLLGCGVLLGNAFVYPHQIINLRTNNSATIVL

PYVNSLAIDSMVKHNNWGIAILPLSPLDFAQDSSVEIPITVTIAPMCSE

FNGLRNVTAPKFQGLPVLNTPGSNQYLTSDNHQSPCAIPEFDVTPPI

DIPGEVKNMMELAEIDTMIPLNLESTKRNTMDMYRVTLSDSADLSQPI

LCLSLSPAFDPRLSHTMLGEVLNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATG

KILVAYAPPGAQPPTSRKEAMLGTHVIWDLGLQSSCTMVVPWISNVT

YRQTTQDSFTEGGYISMFYQTRIVVPLSTPKSMSMLGFVSACNDFSV

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91/113

RLLRDTTHISQSALPQGIEDLISEVAQGALTLSLPKQQDSLPDTKASG PAHSKEVPALTAVETGATNPLAPSDTVQTRHVVQRRSRSESTIESFF ARGACVAIIEVDNEQPTTRAQKLFAMWRITYKDTVQLRRKLEFFTYSR FDMEFTFVVTANFTNANNGHALNQVYQIMYIPPGAPTPKSWDDYTW QTSSNPSIFYTYGAAPARISVPYVGLANAYSHFYDGFAKVPLKTDAND QIGDSLYSAMTVDDFGVLAVRVVNDHNPTKVTSKVRIYMKPKHVRV WCPRPPRAVPYYGPGVDYRNNLDPLSEKGLTTY

SEQ ID N²: 22 - Primer P1F

GCGAGTTGGATTGGCCATCCAGTG

SEQ ID N²: 23 - Primer P1R

TGGAAGGTGGGTCCCACAAACGAC

Exemplos [0175] A invenção será ainda esclarecida pelos exemplos a seguir, que se prestam somente como puramente exemplificadores da invenção e não são de nenhuma maneira limitadores.

Exemplo 1 - identificação de mutações estabilizantes no vírus da pólio do tipo 3

Cepa de vacina Sabin do tipo 3 [0176] Uma das duas mutações atenuantes principais na cepa de vacina Sabin do tipo 3 fica na proteína estrutural VP3 no resíduo 91 (3091), que é uma serina na cepa de Leon do tipo selvagem e uma fenilalanina na cepa de vacina. O aminoácido 91 de VP3 fica na interface entre os protômeros e efetua o crescimento do vírus e a montagem do capsídeo sensível à temperatura in vitro. As crianças que recebem vacina oral da poliomielite excretam eventualmente o vírus em que a mutação é revertida ou então é suprimida, e as mutações de supressor mostraram aumentar a estabilidade de intermediários da montagem de capsídeos.

[0177] Mutações adicionais que suprimem o fenótipo foram identificadas ao crescer a cepa de vacina do tipo 3 a temperaturas

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92/113 semipermissivas. As mutações identificaram essa estabilidade de capsídeo aumentada estão listadas na Tabela 1 no presente documento. Oito das mutações foram selecionadas para um estudo adicional (vide a Tabela 5, junto com o modo no qual foram identificadas e a sua origem). As mutações mostradas na Tabela 5 foram selecionadas do total identificado com base no fato que se duas mutações agiam no mesmo ponto na estrutura, apenas uma ainda foi estudada.

Mutação	Posição	Base da identificação
Leucina-isoleucina 18 de VP2	Folha beta na interface de pentâmero	Isolates dos vacinados e passagem in vitro a altas temperaturas
Leucina-metionina 215 de VP2	Interface de protômero	Isolates dos vacinados
Aspartato-glutamato 241 de VP2	Interface VP2/VP3, enterrada	Passagem in vitro a altas temperaturas
Histidina-tirosina 19 de VP3	Rede interna, coroa anular β abaixo do eixo quintuple	Passagem in vitro a altas temperaturas
Leucina-fenilalanina 85 de VP3	Folha beta na interface de pentâmero	Passagem in vitro a altas temperaturas
fenilalanina-serina 91 de VP3	Interface de Protômero	Isolates dos vacinados e passagem in vitro a altas temperaturas
Alanina-valina 54 de VP1	Rede interna em um eixo tríplice	Isolates dos vacinados e passagem in vitro a altas temperaturas
fenilalanina-leucina 132 de VP1	Bolsa de capsídeo	Passagem in vitro a altas temperaturas

Tabela 5: Mutações que suprimem o efeito da mutação desestabilizante de capsídeo VP3 91F na cepa do tipo 3 de Sabin.

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Cepa de Leon do tipo 3 [0178] As mutações identificadas como mudanças estabilizantes de capsídeos candidatas foram introduzidas em Leon, o precursor virulento da cepa da vacina de Sabin do tipo 3 em combinações diferentes. A derivação do clone de cDNA de pT7/Leon foi descrita anteriormente (Stanwai G, et al. Arch Virol. 1984;81 (1-2):67-78). Resumidamente, uma sequência de ribozima foi introduzida entre o promotor T7 e o cDNA da poliomielite de modo que os transcritos do RNA começam com a extremidade 5' autêntica. A fim de substituir a região de codificação P1, um sítio Sacll foi introduzido ao usar métodos de PCR padrão sem mudança de codificação nos nucleotídeos 3408-13.

[0179] As regiões de capsídeo de Mahoney, MEF-1 e Saukett foram então introduzidas com precisão ao usar métodos de PCR padrão. As mutações foram introduzidas nas regiões de codificação da proteína de capsídeo desses clones ao usar DNA sintético e sítios de divagem de enzima de restrição apropriados.

[0180] Os vírus foram recuperados por meio da transfecção de monocamadas de HEp2C em frascos de 25 cm² com 2 pg de transcritos T7, seguida pela incubação a 33°C, 35°C ou 37°C, até o efeito citopático completo (CPE) ficar aparente. As células transfectadas que não mostraram nenhum sinal de CPE em 7 dias foram congeladas e os lisatos das células foram passados às cegas em células frescas de HEp2c por mais 7 dias.

[0181] Foi suposto que, se o capsídeo fosse estabilizado além do que é ideal para a montagem ou a não cobertura, o crescimento seria desacelerado. Foi verificado que os vírus que possuem três ou mais mutações cresceram de maneira significativamente mais lenta do que o Leon parental quando recuperados e crescidos em células HEp2c a 35°C, uma temperatura inteiramente permissiva para a cepa do tipo selvagem. Na passagem a 37°C, variantes de crescimento mais rápido

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94/113 emergiram, as quais tinham perdido uma ou mais das mutações de cepsídeos estabilizantes ou introduziram mutações adicionais incluindo uma em VP4 no resíduo 67 onde uma treonina substituiu uma alanina, e outra em VP1 no resíduo 105 onde uma treonina substituiu uma metionina, em ambos os casos tal como encontrado no vírus do tipo 3 selvagem, Saukett (tal como mostrado na Tabela 6). Devido ao fato que essas mudanças resgataram um vírus com uma estrutura mais estável, foi concluído que os aminoácidos introduzidos tiveram um efeito desestabilizante. As estruturas com a versão parental desses resíduos (VP4 67A, isto é, a alanina no resíduo 67 de VP4 e 105M de VP1, isto é, a metionina no resíduo 105 de VP1) foram provavelmente consideradas desse modo como sendo mais estáveis do que aquelas que não.

Mutação	Posição
Alanina - treonina VP4 67 *	Rede interna perto de um eixo tríplice
Metionina - treonina VP1 105*	Parede norte do cânion

* aminoácido presente no capsídeo estável

Tabela 6: Mutações que destabilizam os capsídeos em mutantes de Leon super-otimamente estáveis e também estão presentes em Saukett do tipo selvagem.

Origem da cepa SC8 de Saukett do tipo 3 [0182] A cepa do tipo 3 de Saukett do tipo selvagem virulenta que é usada para a produção da vacina de poliomielite inativada (tipo 3) tem proteínas de capsídeos que diferem daquelas de Leon em 14 posições de aminoácidos, algumas em sítios antigênicos. Saukett do tipo selvagem já tem a versão termoestável de duas das mutações identificadas na cepa do tipo 3 de Sabin (serina 91 de VP3 e valina 54 de VP1). Saukett também possui o resíduo desestabilizante das duas mutações identificados pela passagem das construções de Leon. Foram

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95/113 feitas construções, portanto, nas quais os 6 aminoácidos restantes na Tabela 5 e as 2 mutações na Tabela 6 foram trocados pelas formas estabilizantes, desse modo resultando em Saukett-SC8 com oito diferenças de aminoácidos da sequência de Saukett tal como mostrado na Tabela 7.

Mutação	Posição
T4067A	Rede interna perto de um eixo tríplice
L2018I	Folha beta na interface de pentâmero
L2215M	Interface de protômero
D2241E	Interface de VP2/VP3, enterrada
H3019I	Rede interna, tubo abaixo do eixo quintuple
L3085F	Folha beta na interface de pentâmero
T1105M	Parede norte do cânion
F1132L*	Bolsa

Tabela 7: Mutações incluídas em mutantes estabilizados com capsídeos para estudo adicional: Saukett-SC8.

Exemplo 2 - Identificação de mutações estabilizantes em cepas do vírus da pólio do tipo 1 (Mahonev-SC7) e do tipo 2 (MEF-SC5a)

Origem das cepas SC7 de Mahoney do tipo 1 e SC5a de MEF do tipo 2 [0183] As similaridades nas estruturas do vírus da pólio dos tipos 1, e 3 sugeriram que as mutações estabilizantes identificadas para o tipo podiam ter um efeito estabilizante nos tipos 1 e 2. No entanto, a cepa de Mahoney do tipo 1 usada na maior parte da produção de IPV atual já possui quatro das mutações incorporadas em Saukett-SC8. As quatro restantes foram introduzidas além disso, mas a construção não produziu nenhuma proteína de capsídeo ou sinal de infecção detectáveis.

[0184] Uma segunda estratégia de identificação, portanto, foi

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96/113 seguida, a qual envolveu a construção de um mutante de Mahoney que possui uma fenilalanina no resíduo 91 de VP3 (3091), tal como na cepa de Sabin 3; este vírus foi recuperado e mostrou que é sensível à temperatura em seu crescimento in vitro. Células HEp2c foram transfectadas com transcritos de RNA dessa construção, incubadas à temperatura não permissiva de 39°C até o efeito citopático de pelo menos 80% (CPE) sr observado, e a progênie resultante examinada por meio do arranjo em sequência profundo para identificar subpopulações de mutantes não sensíveis à temperatura. A transfecção foi repetida independentemente seis vezes e cada indivíduo da população foi submetido ao arranjo em sequência profundo duas vezes para eliminar problemas de amplificação do arranjo em sequência profundo.

[0185] Para realizar o arranjo em sequência profundo, o RNA foi extraído ao usar kits de RNA viral Roche High Pure. Os controles de água apenas foram extraídos, amplificados e arranjados em sequência em paralelo com cada conjunto de amostras. As regiões de codificação de capsídeo foram amplificadas em duplicata por meio de RT-PCR de uma etapa ao usar um kit SuperScript III HiFi e os primers P1F (5'GCGAGTTGGATTGGCCATCCAGTG-3') e P1R (5'TGGAAGGTGGGTCCCACAAACGAC-3'). Os produtos foram purificados ao usar grânulos magnéticos de AMPure XP (Beckman Coulter), quantificados ao usar o ensaio Qubit High Sensotivity dsDNA (Life Technologies), analisados em urn chip de DNA de Alta Sensibilidade Agilent (Agilent) e diluídos até 0,2 ng/μΙ em Tris-EDTA de grau molecular, pH 8,0.

[0186] As bibliotecas de arranbjos em sequências foram preparadas ao usar reagentes Nextera XT (Illumina) e o protocolo do fabricante, e arranjadas em sequência em um MiSeq ao usar v2 Flow Cell de extremidades emparelhadas de 2 x 251 (Illumina). O aparamento de qualidade e a montagem foram realizados e as leituras foram então

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97/113 mapeadas para as sequências de referência parentais ao usar o software Genious R7 (Biomatters) e SNPs presentes a > 0,5% de identificação. Apenas as SNPs presentes em ambos os âmplicons de réplica foram retidas.

[0187] As mutações identificadas são mostradas na Tabela 1 no presente documento. Algumas das mutações identificadas desta maneira foram selecionadas e introduzidas em Mahoney para obter Mahoney SC7, e são mostrados na Tabela 8.

[0188] A mesma estratégia foi seguida para a cepa de MEF-1 do tipo 2, e as mutações identificadas e introduzidas em MEF-SC5a são fornecidas na Tabela 8. A reversão de VP3-91 (F-S) ocorreu em uma proporção significativa de ambas as populações.

Vírus	Mutação	Posição
Mahoney-SC7	R4018G	Rede interna perto de um eixo tríplice
T202Ã	Interface de pentâmero
D2057E	Interface de pentâmero
L3119M	Interface de VP2/VP3
Q3178L	Interface de protômero
V1196L	Bolsa
H1248P	Interface de protômero
MEFSCã	L3085F	Folha beta na interface de pentâmero
Q3178L	Interface de protômero
T1041I	Interface de pentâmero
F1134L *	Bolsa
I1159F	Bolsa
* F1134L no tipo 2 é equivalente a F1132L no tipo 3

Tabela 8: Mutações incluídas em mutantes estabilizados com capsideos para estudo adicional: Mahoney SC7 e MEF SC5a.

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Exemplo 3 - Localização das mutações estabilizantes nos três sorotipos do vírus da pólio [0189] A posição de todos os resíduos alterados dentro de uma subunidade protomérica e a localização das características relevantes do capsídeo foram mapeadas em uma estrutura de cristal de capsídeo do vírus da pólio, tal como mostrado na Figura 2. De maneira significativa, nenhuma das mutações estabilizantes candidatas selecionadas em qualquer um dos três sorotipos ocorreu nos resíduos identificados previamente como contribuindo para os sítios antigênicos. Portanto, elas foram consideradas como improváveis de alterar as estruturas antigênicas das partículas nas quais estavam presentes. Exemplo 4 - Infecção por mutantes termoestáveis candidatos [0190] Foram construídos genomas que incluíam números variados de mutações candidatas identificadas e RNA transfectado em células Hep2C que são permissivos para o crescimento da poliomielite. Os resultados obtidos foram mostrados na Figura 3, onde se pode ver que o tempo para a lise completa da cultura de células a 37°C aumentou com o número de mutações introduzidas até que nenhum CPE pudesse ser detectado nem mesmo após a passagem às cegas (SC8 contendo 8 mutações em Leon do tipo selvagem para o tipo 3, SC5b, SC6a e SC6b contendo 5 ou 6 mutações em MFE1 do tipo selvagem para o tipo 2 e SC7 contendo 7 mutações em Mahoney do tipo selvagem para o tipo 1). A 33°C, os tempos de incubação eram ainda mais longos. A transfecção da construção Saukett SC8 do tipo 3, tal como Leon SC8, não resultou em nenhum CPE detectável. As propriedades de Saukett SC8 (tipo 3) MEF SC5a (tipo 2) e Mahoney SC7 (tipo 1) foram ainda examinadas.

[0191] As Tabelas 9 e 10 mostram o efeito de várias combinações de mutações estabilizantes identificadas nos Exemplos 1 e 2 no vírus da pólio dos tipos 1 e 2, respectivamente. A temperatura à qual a

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99/113 reatividade do antígeno D (DAg) da VLP é reduzida em 50% e o número de dias requeridos para obter 100% de CPE pelo vírus correspondente foram determinados para todos os mutantes. Esses valores são indicadores da estabilidade dos vírus da pólio modificados (um aumento na temperatura para uma redução de 50% em DAg e um aumento no tempo até 100% de CPE são ambos correlacionados com a estabilidade crescente). Os dados correspondentes para o mutante SC8 do tipo 3 são fornecidos na Tabela 11 para fins de comparação.

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Mutação

Local

peso

SC1

SC1a

SC2

SC2a

SC2c

SC2d

SC3

SC4

SC5b

SC6

SC6a

SC6b

SC6c

SC6d

SC7

SC7b

SC7c

SC7d

SC8

R4018G

Rede interna

V

?

T2025A

Interface de pentâmero

V

?

D2057E

Interface de pentâmero

V

?

L3119M

Interno

V

?

Q3178L

Interface de protômero

V

?

V1196L

Bolsa

V

?

A1231V

Protômero

V

?

H1248P

Interface de protômero

V

?

Temperatura à qual DAg reduziu em 50% (°C)

37,5

41,5

40

42,5

42

47

43

43,5

45

53

47

52

47,5

45

51

52

49

45

49

Infectividade (dias até CPE)

1

2

1

2

< 4

<4

5

Nd

12

10

13

12

>7

13

11

13

*

100/113 * Nenhum CPE observado durante o curso do tempo da experiência.

Tabela 9: Combinações adicionais de mutações incluídas nos mutantes do tipo 2 estabilizados com capsídeos

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Mutação

Local

peso

SC1

SP1

SC2

SP2a

SP2b

SP3

SC3a

SC3b

SC4a

SC4b

SCâ

SC5b

SCâ

SC6b

I4057V

rede interna tríplice

?

D2057A

interface de pentâmero

?

L3085F

interface de pentâmero

V

Q3178L

interface de protômero

V

?

T1041I

interface de pentâmero

V

V1107I

interface de protômero

?

F1134L

bolsa

V

?

I1159F

bolsa

V

V1183L

bolsa

?

I1194V

bolsa

V

Temperatura à qual DAg reduziu em 50% (°C)

38

41

44

40

45

43

47

40

43

57

47

55

52

62

58

Infectividade (dias até CPE)

1

<2

1

<2

2

6

<2

2

5

11

*

101/113 * Nenhum CPE observado durante o curso do tempo da experiência.

Tabela 10: Combinações adicionais das mutações incluídas nos mutantes do tipo 2 estabilizados com capsídeos

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Mutação	Local	peso	SC8
T4067A	Rede interna
L2018I	Interface de pentâmero
L2215M	Interface de Protômero
D2241E	Interface de VP2/VP3
H3019I	Rede interna
L3085F	Interface de pentâmero
T1105M	Parede norte do cânion
F1132L	Bolsa
Temperatura à qual DAg reduziu em 50% (°C)	33	55
Infectividade (dias até CPE)	1	*

* Nenhum CPE observado durante o curso do tempo da experiência. Tabela 11: Dados adicionais para o mutante SC8 do tipo 3 Exemplo 5 - Termostabilidade das partículas produzidas pela transfeccão [0192] As partículas do vírus da pólio expressam dois antígenos distintos. O antígeno D é associado principalmente com o vírus infeccioso e o antígeno C com partículas não infecciosas, por exemplo, após o aquecimento; os capsídeos vazios, fora da célula, são particularmente suscetíveis à conversão à especificidade do antígeno C. A potência de IPV é expressa em unidades do antígeno D, uma vez que o antígeno D é considerado como o indutor de uma resposta imune protetora. Um ensaio ELISA desenvolvido para a quantificação do teor de antígeno de vacinas comerciais foi adaptado para medindo o teor de

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103/113 antígeno D ou de antígeno C de preparados de partículas do vírus, com base no uso de anticorpos monoclonais específicos do antígeno D versus os tipos 1,2 e 3, e de anticorpos específicos do antígeno C para os tipos 1 e 3. Nenhum anticorpo C específico estava disponível para o tipo 2.

[0193] Células L de camundongos, que não possuem o receptor para o vírus da pólio, e não são desse modo infectáveis pelo vírus integral, foram submetidas à eletroporação com transcritos de RNA de comprimento integral a partir das construções que codificam os mutantes do tipo selvagem ou estabilizados com capsídeos para obter um único ciclo de infecção. A incubação durante toda a noite produziu partículas vazias antigênicas predominantemente de C para as construções do tipo selvagem, de modo que incubações de 6 horas foram usadas nesses casos; a produção de partículas vazias antigênica predominantemente de D para construções de mutantes após a incubação durante a noite era uma indicação precoce que as mutações introduzidas tiveram um efeito estabilizante significativo.

[0194] As partículas produzidas foram purificadas em gradientes de sacarose. Em mais detalhes, os preparados de partículas foram obtidos por meio de eletroporação de alta eficiência de transcritos de RNA de comprimento integral em células L de camundongos. Os clones linearizados (1 pg) foram transcritos ao usar um kit T7 Megascript (Life Technologies); as células de um frasco de 75 cm² 90% confluente foram removidas por meio de tripsinização, lavadas e resuspensas em HeBS (20 mM de HEPES, 137 mM de NaCI, 5 mM de KCI, 0,7 mM de Na2HPO4, 6 mM de glicose, pH 7,05), submetidos à eletroporação com transcritos de RNA (250V, 250 pF, 360 Ω) e então retornados ao frasco e incubados em DMEM a 37°C durante toda a noite ou por 6 horas. Seis frascos foram usados para cada construção. As folhas de células foram então congeladas a -70°C e descongeladas, e os resíduos das células

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104/113 foram removidos por meio de centrifugação. Igepal foi adicionado aos sobrenadantes a uma concentração final de 0,1%, e as partícula virais foram concentradas por meio de centrifugação a 4°C através de um chumaço de sacarose a 30% de 30 ml composto no tampão de lise (PBS de 6 contendo 0,5% de deoxcolato de sódio, 20 mM de EDTA e 1% de Igepal). As pelotas foram resuspensas em 1 ml de PBS de 6 sais por seis frascos, colocadas em camadas em gradientes de 15% a 30% de sacarose de 10 ml no tampão de lise, e centrifugadas a 4°C por 12 horas a 18.000 rpm em um rotor Beckman SW41 antes da colheita em 20 frações de 0,5 ml.

[0195] As frações foram selecionadas por meio de ensaio ELISA específico de antígeno C ou D para identificar o vírus e os picos de capsídeos vazios. Especificamente, um ensaio ELISA de sanduíche não competitivo foi usado para medir o teor de antígeno D do vírus da pólio. Resumidamente, as diluições duplas de antígeno foram capturadas com um anticorpo policlonal específico do sorotipo, e então detectadas ao usar anticorpos monoclonais específicos de antígeno D ou específicos de antígeno C seguidos por um conjungado de peroxidase anti-camundongo. O teor de antígeno D de cada amostra de teste foi avaliado versus uma referência do teor de antígeno D designado pela análçise de linhas paralelas (Combistats). Para o ensaio ELISA específico de antígeno D, os anticorpos monoclonais usados eram 234 para o tipo 1, 1050 para o tipo 2 e 520 para o tipo 3, e para o ensaio ELISA específico de antígeno C eram de 15848 para o tipo 1 e 517 para o tipo 3. Nenhum anticorpo do tipo 2 específico de C estava disponível.

[0196] As frações de pico do tipo 1 e do tipo 3 também foram selecionadas por meio de imunotransferência com um anticorpo específico de VP2; as frações de vírion continham VP2 e as frações de capsídeos vazias continham VP0. Os anticorpos primários para os

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105/113 imunotransferidos eram os soros de peptídeo anti-VP2 de coelho R271 para o tipo 1 e R268 para o tipo 3.

[0197] As frações que correspondem aos virions e aos capsídeos vazios foram sujeitadas então ao teste de termoestabilidade. A temperatura à qual uma mudança conformacional da antigenicidade de D para C ocorreu foi determinada mediante aquecimento em uma faixa de temperaturas de 30 a 60°C seguido por ensaio ELISA de antígenos D e C (este último onde possível). As amostras foram diluídas em PBS de 6 sais até o dobro da concentração requerida para obter um OD de 1,0 no ensaio ELISA de antígeno D, as amostras duplicadas foram aquecidas por 10 minutos a cada temperatura e a seguir diluídas 1:1 com 4% de leite seco em PBS de 6 sais, e resfriadas em gelo. O teor dos antígenos D e C foi medido por ELISA.

[0198] A estabilidade a longo prazo foi analisada por meio da incubação a 37°C de múltiplas alíquotas de IPV, vírus e amostras de capsídeos vazios, diluídas em PBS de 6 sais até duas vezes a concentração requerida para obter um OD de 1,0 em ELISA de antígeno D. As amostras foram removidas a intervalos e analisadas por ELISA de antígeno D.

[0199] Os resultados para a cepa de Leon do tipo 3 não modificada são mostrados na Figura 4A para o vírus infeccioso e na Figura 4B para os capsídeos vazios onde havia um elevado pano de fundo de partida do antígeno C tal como esperado. A perda do antígeno D foi espelhada por um aumento no teor do antígeno C; para as partículas infecciosas, a temperatura à qual 50% do antígeno D foi perdido era de 42°C, ao passo que era de 33°C para os capsídeos vazios.

[0200] Os resultados para os preparados de capsídeos vazios de todos os mutantes de capsídeos do tipo selvagem e estabilizados selecionados são resumidos na Tabela 12. Os capsídeos vazios modificados foram convertidos da especificidade de antígeno D em C a

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54°C, a 56°C e a 65°C para as formas estabilizadas dos tipos 1, 2 e 3 em comparação respectivamente a 36°C, 42°C e 33°C para as cepas do tipo selvagem correspondentes. As temperaturas em que IPV comercial foi convertido da especificidade de antígeno D em C variou de 49°C a 52°C para os três sorotipos. Por este ensaio, portanto, todos os capsídeos vazios das cepas mutantes selecionadas para a termoestabilidade melhorada eram mais estáveis do que o IPV atualmente introduzido no mercado produzido pelo tratamento de formalin do vírus vivo. Os ensaios que usam MAbs específicos de antígeno D dirigidos contra outros sítios antigênicos acarretaram resultados indistinguíveis e todos os anticorpos testados reagiram igualmente com as partículas do tipo selvagem e estabilizadas em ELISA.

Partícula	Temperatura *
Capsídeo vazio nativo (WT1)	36°C
Capsídeo vazio nativo (Mah SC7)	54°C
Capsídeo vazio nativo (WT2)	42°C
Capsídeo vazio nativo (MEF SCã5a)	56°C
Capsídeo vazio nativo (WT3)	33°C
Capsídeo vazio nativo (Skt SC8)	55°C
IPV (tratado com formaldeído)	Tipo 1	49°C
Tipo 2	52°C
Tipo 3	52°C
* - à qual a antigenicidade nativa é reduzido em 50% depois de uma incubação de 10 minutos

Tabela 12: Termostabilidade de preparados de capsídeos vazios (VLP). [0201] O estudo envolveu a exposição a uma temperatura elevada

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107/113 por dez minutos. Um estudo que deve imitar melhor o uso real envolveu a exposição dos materiais a 37°C por períodos prolongados; os resultados são mostrados na Figura 5 para a perda de antígeno D, em comparação com IPV, do pico de capsídeo vazio (VLP) e do pico de vírus em relação às amostras incubadas a 4°C para o mesmo período. As amostras a 4°C não mostraram nenhuma perda significativa da reatividade durante todo o período de incubação, e foram usadas como controles para a variabilidade entre os ensaios. Para o tipo 3 (Figura 5C) o IPV tinha perdido toda a atividade pelo segundo ponto do tempo em 62 dias; é possível que a perda total tenha ocorrido muito antes. O vírus de Saukett do tipo 3 SC8 reteve a atividade total por 180 dias e os capsídeos vazios de SC8 (SC8 VLP) retiveram 56% da atividade em 62 dias e 13% em 180 dias. O componente do tipo 2 de IPV (Figura 5B) perdeu o teor do antígeno D menos rapidamente do que observado para o tipo 3, mas foi reduzido até 41 % do valor inicial no dia 62 e até 8% no dia 111. A partícula de vírus do vírus do tipo 2 mutante MEF-SC5a reteve 75% do teor de antígeno D inicial no dia 111, e reteve 64% no dia 180. Os capsídeos vazios de MEF-SC5a retiveram 82% do teor de antígeno D inicial no dia 110 e 52% da atividade em 180 dias. O componente de IPV do tipo 1 (Figura 5A) reteve 35% do teor de antígeno D no dia 43 e somente 4% no dia 86; a reatividade foi abolida no dia 182. Nem a partícula de vírus nem os capsídeos vazios do vírus do tipo 1 mutante Mah-SC7 perderam qualquer teor de antígeno D no dia 86; os capsídeos vazios de ME|F-SC7 retiveram 87% do teor de antígeno D no dia 182. Os capsídeos vazios estabilizados, portanto, eram incrivelmente mais estáveis do que IPV a 37°C. Se isto também fosse verdadeiro para um produto comercial, ele podería sobreviver bem fora da cadeia fria.

Exemplo 6 - Imunoqenicidade em ratos [0202] É sabido que o componente do tipo 2 de Sabin IPV é menos

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108/113 imunogênico do que a cepa do tipo 2 selvagem em uma IPV clássica em uma observação que não foi explicada previamente de uma maneira satisfatória. Portanto, era necessário investigar a imunogenicidade de capsídeos vazios (ou VLPs) das cepas estabilizadas para comparar as mesmas a uma IPV clássica.

[0203] O ensaio de imunogenicidade de IPV comercial envolve a medição do teor do antígeno, normalmente por ELISA tal como acima, e então a imunização dos ratos com uma gama de diluições baseadas na dose humana. A proporção dos animais que foram soroconvertidos em um corte específico nos ensaios de neutralização é comparada àquela vista com um preparado de referência testado ao mesmo tempo, e uma potência relativa pode ser calculada. A imunogenicidade foi avaliada ao usar os métodos Pharmacopieal estabelecidos em NIBSC para a liberação de lotes de IPV. O teor de antígeno D foi medido por meio de ELISA e a imunogenicidade foi avaliada em ratos Wistar. A leitura foi baseada na proporção dos animais que têm um título de neutralização acima de um corte predeterminado tal como indicado na Tabela 13.

[0204] Neste teste, a cepa do tipo 2 usada na maior parte da produção atual induz uma resposta sorológica maior e o corte, portanto, é muito maior. Os resultados para os tipos 1, 2 e 3 são mostrados na Tabela 13.

Tipo 1: Proporção dos animais que respondem a um título de ponto extremo de diluição > 4

Amostra	32 Unidades de Antígeno D	16 Unidades de Antígeno D	8 Unidades de Antígeno D	4 Unidades de Antígeno D
Tipo 1 IPV	9/10	5/10	2/10	1/10
Mah SC7 VLP	10/10	10/10	10/10	10/10

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Tipo 2: proporção dos animais que respondem em um títul ode ponto extremo de diluição >512

Amostra	8 Unidades de Antígeno D	4 Unidades de Antígeno D	2 Unidades de Antígeno D	1 Unidade de Antígeno D
Tipo 2 IPV	8/10	8/10	2/10	2/10
MEF SC5a VLP	10/10	9/10	8/10	6/10

Tipo 3: proporção dos animais que respondem a um título de ponto extremo de diluição > 4

Amostra	28 unidades de antígeno D	14 Unidades de Antígeno D	7 Unidades de Antígeno D	3,5 Unidades de Antígeno D
Tipo 3 IPV	9/10	7/10	2/10	3/10
SktSC8 VLP	10/10	10/10	10/10	10/10

[0205] As VLPs termoestáveis MahSC7 (tipo 1) e SktSC8 (tipo 3) causaram a soroconversão em todos os animais em todas as doses aplicadas, ao passo que as respostas nos animais que receberam as mesmas doses de IPV clássico abarcaram 50% da dose de resposta. Para o tipo 2, as respostas nos animais que receberam IPV abarcaram o ponto extremo de 50% e a potência das VLPs de SC5a era pelo menos quatro vezes maior. As VLPs estabilizadas, portanto, são pelo menos quatro vezes mais imunogênicas do que o componentede IPV equivalente.

Exemplo 7 - proteção contra o estímulo em camundongos [0206] Os camundongos transgênicos que contêm o receptor humano para o vírus da pólio (TgPVR) são suscetíveis à infecção e à paralisia.

[0207] Camundongos TgPVR de ambos os sexos (8 por grupo de

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110/113 teste) receberam uma ou dois injeções intraperitoneais de PBS (controles) ou antígeno D equivalente D que corresponde a 0,5 dose do ser humano de VLPs purificadas ou BRP de referência européia de IPV. Os preparados de VLP mostraram ser não infecciosos pela inoculação de monocamadas de HEp2c e a passagem às cegas depois de 7 dias. A segunda dose, onde aplicada, ocorreu no dia 14. No dia 35, amostras de sangue foram tiradas, e os camundongos foram estimulados intramuscularmente com o equivalente a 25 vezes PD50 do sorotipo relevante do vírus da pólio do tipo selvagem (tipo 1 de Mahoney, tipo 2 de MEF-1 ou tipo 3 de Saukett) e então monitorados quanto a quaisquer sinais de paralisa por 14 dias. Os resultados são mostrados nas Figuras 6A-F que também mostram os títulos de anticorpos de neutralização pré-estímulo. Em todos os casos, os capsídeos estabilizados aplicados como uma ou duas doses eram mais imunogênicos do que a IPV e protegeram todos os animais do estímulo com 0 vírus virulento correspondente.

Declaração Ética [0208] Todos os experimentos com animais foram realizados sob licenças concedidas pelo UK Home Office de acordo com 0 Animal (scientific Procedures) Act de 1986 revisado em 2013 e revisto pelo NIBSC Animal Welfare and Ethics Review Board. Os experimentos de imunogenicidade com camundongos TgPVR e ratos foram realizados sob as licenças Home Office PPL 80/2478 e PPL 80/2050 que foram revistas e aprovadas pelo NIBSC Animal Welfare and Ethics Review Board antes da apresentação.

Conclusões [0209] A produção de capsídeos vazios pela expressão de proteínas do vírus da pólio nas células de insetos infectadas com baculovírus recombinantes que não envolvem 0 crescimento do vírus da pólio foi relatada há mais de duas décadas, mas as partículas eram

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111/113 demasiadamente instáveis para serem úteis como um candidato a vacina. VLPs imunogênicas, mas instáveis, também foram produzidas pela expressão recombinante em levedura. O trabalho descrito no presente documento representa o primeiro desenvolvimento de capsideos vazios estáveis, também conhecidos como partículas parecidas com o vírus da pólio (VLPs). Os autores da presente invenção desenvolveram uma abordagem inovadora, na qual as modificações estabilizantes candidatas foram identificadas e então múltiplas mudanças introduzidas em proteínas de capsideos em combinação. Em mais detalhes, os métodos usados no presente documento envolveram uma mutação conhecida como presente na cepa da vacina de Sabin do tipo 3 do vírus da pólio que desestabiliza intermediários da montagem de capsideo (incluindo capsideos vazios) sem afetar a estabilidade do vírion. Desse modo, os elementos de reversão dos vacinados e de outras fontes foram provavelmente considerados como dotados de mutações que restauram a montagem e aumentam a estabilidade dos capsideos vazios. As mutações estabilizantes nas cepas dos tipos 1 e 2 foram identificadas mediante a inserção da mutação do tipo 3 de Sabin desestabilizante, a seleção nas células transfectadas à temperatura não permissiva, e a seleção quanto a genomas de reversão por meio de arranjo em sequência profundo. A abordagem também pode ser usada para guiar a seleção para outros picornavírus que não de poliomielite. Em alguns casos, as mutações estabilizantes encontradas para o tipo 3 já estavam presentes no vírus do tipo 1 e do tipo 2.

[0210] Na maioria dos casos, as localizações estruturais das mutações responsáveis pela estabilização dos capsideos vazios porvêm um vislumbre em seus mecanismos de ação. Desse modo, algumas mutações parecem agir ao estabilizar as interfaces entre as subunidades de partículas; outras podem estabilizar os contatos dentro das subunidades incluindo aqueles com o fator de bolsa, considerado

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112/113 como sendo um ácido graxo de cadeia curta que está presente em todos os vírus da pólio que age para estabilizar as partículas contra as transições conformacionais, embora outros reforcem de maneira plausível as interações entre as subunidades na rede interna que mantêm as subunidades juntas, tal como a estrutura de coroa anular beta parecida com um tubo do eixo quintuple. A estratégia total pode ser útil no desenvolvimento de vacinas VLP estáveis para outros picornavírus.

[0211 ] A licença e a regulação de uma nova vacina devem requerer normalmente uma experimentação clínica que demonstre a eficácia contra a doença alvo. Isto é claramente pouco prático para uma nova vacina da poliomielite onde o número de casos no mundo está se aproximando de zero. Há precedentes para outras abordagen; a IPV à base de Sabin é licenciada na China e no Japão baseada nos resultados de estudos da imunogenicidade, e a orientação é fornecida em diretrizes da WHO sobre os tipos de experimentações clínicas e pré-clínicas que podem ser feitas. A vacina da meningitr C foi licenciada e implementada no Reino Unido com base nos dados de imunogenicidade de experimentações clínicas, e as vacinas do papiloma humano foram licenciadas com base na sua capacidade de prevenir lesões não cancerosas e o câncer não cervical. A decisão se uma vacina pode ser licenciada é da responsabilidade das National Regulatory Authorities (NRAs) e não da WHO, mas estes exemplos provam que é possível obter a aprovação sem a evidência direta da eficacia clínica dos estudos que mostram a proteção contrao estímulo natural.

[0212] As VLPs finais estudadas eram extremamente estáveis em comparação à IPV e têm uma utilidade potencial como uma vacina que não deve requerer uma cadeia fria. Além disso, as VLPs eram mais imunogênicas do que a IPV obtida a partir das cepas equivalentes no modelo animal usado para o testr da potência da IPV e nos estudos de

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113/113 estímulos em camundongos transgênicos. Sem ficar limitado pela teoria, é possível que isto seja parcialmente porque as VLPs, ao contrário da IPV, não foram tratadas com formalina. Os vírus dos quais elas foram derivadas tinham perdido a infectividade presumivelmente porque eles não tinham a capacidade de ficar sem cobertura em virtude de seus capsídeos hiperestáveis. As propriedades das VLPs as tonam um candidato a vacina muito promissor.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP), caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma modificação relativa à partícula do vírus da pólio da qual a VLP é derivada, em que pelo menos uma dita modificação estabiliza a VLP.
2. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma modificação é uma modificação tal como definido na Tabela 1,2 ou 3.
3. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que há pelo menos uma modificação em cada uma dentre (a) uma interface de protômero; e (b) uma interface de pentâmero, em que pelo menos uma dita modificação em cada uma dentre a interface de protômero e a interface de pentâmero é uma modificação tal como definido na Tabela

1,2 ou 3.
4. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que é derivada de um vírus da pólio do tipo selvagem ou de uma cepa de vacina.
5. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que é derivada de um vírus da pólio do tipo 1, tipo 2 ou tipo 3.
6. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é derivada de:

(a) um vírus da pólio do tipo 1 selecionado de Mahoney e Sabin 1;

(b) um vírus da pólio do tipo 2 selecionado de MEF e Sabin 2; ou (c) um vírus da pólio do tipo 3 selecionado de Saukett e Sabin 3.

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7. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos três modificações relativas à partícula do vírus da pólio da qual a VLP é derivada que estabilizam a VLP, em que há pelo menos uma modificação em cada uma de:

(a) uma interface de protômero; e (b) uma interface de pentâmero.
8. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que também compreende pelo menos uma modificação em um domínio de bolso em relação à partícula do vírus da pólio da qual a VLP é derivada.
9. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a modificação na interface de protômero é Q3178L e a modificação no domínio de bolsa é F1134L em uma VLP derivada de um vírus da pólio do tipo 1 ou do tipo 2, ou F1132L em uma CLP derivada de um vírus da pólio do tipo 3.
10. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a modificação em um domínio de bolso é como definida na tabela 1,2 ou 3.
11. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, a qual é derivada de um vírus da pólio do tipo 1, caracterizada pelo fato de que:

(a) a interface de protômero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 3178 e 1248 ou em resíduos que correspondem aos mesmos; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 2025 e 2057 ou em resíduos que correspondem aos mesmos;

em que opcionalmente, a dita VLP compreende uma

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3/13 modificação em um domínio de bolso, e a dita modificação é de preferência uma mutação no resíduo 1196 ou em um resíduo que corresponde ao mesmo.
12. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que:

(a) a interface de protômero compreende uma ou ambas as mutações Q3178L e H1248P; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma ou ambas as mutações T2025A e D2057E;

em que opcionalmente a dita VLP compreende uma modificação em um domínio de bolso, e a dita modificação é de preferência a mutação V1196L.
13. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que compreende ambas as mutações nos resíduos 3178 e 1248 da interface de protômero ou em resíduos que correspondem aos mesmos, ambas as mutações nos resíduos 2025 e 2057 da interface de pentâmero ou em resíduos que correspondem aos mesmos, e opcionalmente a mutação no resíduo 1196 do domínio de bolso ou em um resíduo que corresponde ao mesmo.
14. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, a qual é derivada de um vírus da pólio do tipo 2, caracterizada pelo fato de que:

(a) a interface de protômero compreende uma mutação em um ou ambos os resíduos 3178 e 1107 ou em resíduos que correspondem aos mesmos; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma mutação em um ou mais dos resíduos 3085, 1041 e/ou 2057 ou em resíduos que correspondem aos mesmos;

em que opcionalmente a dita VLP compreende uma

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4/13 modificação em um domínio de bolso, e a dita modificação é de preferência uma mutação em um ou mais dos resíduos 1134, 1159 e 1183 ou em resíduos que correspondem aos mesmos.
15. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que:

(a) a interface de protômero compreende uma ou ambas as mutações Q3178L e V11071; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma ou mais das mutações L3085F, T1041I e/ou D2057A;

em que opcionalmente a dita VLP compreende uma modificação em um domínio de bolso, e a dita modificação é de preferência um ou mais das mutações F1134L, Y1159F e V1183L.
16. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que compreende:

(a) as mutações no resíduo 3178 da interface de protômero ou em um resíduo que correspondem ao mesmo, as mutações em ambos os resíduos 3085 e 1041 da interface de pentâmero ou em resíduos que correspondem aos mesmos e opcionalmente as mutações em ambos os resíduos 1134 e 1159 do domínio de bolso ou em resíduos que correspondem aos mesmos; ou (b) ambas as mutações nos resíduos 3178 e 1107 da interface de protômero ou em resíduos que correspondem aos mesmos, a mutação no resíduo 2057 da interface de pentâmero ou em um resíduo que corresponde ao mesmo, e opcionalmente as mutações em ambos os resíduos 1134 e 1183 do domínio de bolso ou em resíduos que correspondem aos mesmos.
17. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, a qual é derivada de um vírus da pólio do tipo 3, caracterizada pelo fato de que:

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5/13 (a) a interface de protômero compreende uma mutação em um ou ambos dos resíduos 2215 e 3091 ou em resíduos que correspondem aos mesmos; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma mutação em um ou ambos dos resíduos 2018 e 3085 ou em resíduos que correspondem aos mesmos;

em que opcionalmente a dita VLP compreende uma modificação em um domínio de bolso, e a dita modificação é de preferência uma mutação no resíduo 1132 (VP1 132) ou em um resíduo que corresponde ao mesmo.
18. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que:

(a) a interface de protômero compreende uma ou ambas as mutações L2215M e F3091S; e/ou (b) a interface de pentâmero compreende uma ou ambas as mutações L2018I e L3085F;

em que opcionalmente a dita VLP compreende uma modificação em um domínio de bolso, e a dita modificação é de preferência a mutação F1132L.
19. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que compreende ambas as mutações nos resíduos 2215 e 3091 da interface de protômero ou em resíduos que correspondem aos mesmos, ambas as mutações nos resíduos 2018 e 3085 da interface de pentâmero ou em resíduos que correspondem aos mesmos, e opcionalmente a mutação no resíduo 1132 do domínio de bolso, ou em um resíduo que corresponde ao mesmo.
20. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais modificações adicionais dentro de um ou mais

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6/13 dentre o domínio de bolso, a interface de protômero e/ou a interface de pentâmero, em que opcionalmente uma ou mais ditas modificações adicionais consistem em uma modificação tal como definido na Tabela

1,2 ou 3.
21. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma modificação adicional em um ou mais domínios estruturais adicionais, em que opcionalmente uma ou mais modificações adicionais consistem em uma modificação tal como definido na Tabela 1,2 ou 3.
22. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que um ou mais domínios estruturais adicionais são selecionados de:

(a) uma interface VP2/VP3;

(b) uma rede interna; e/ou (c) um cânion.
23. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a rede interna compreende um eixo tríplice, um eixo quintuple e/ou um tubo abaixo do eixo quintuple, e em que pelo menos uma modificação adicional fica localizada em ou bastante próxima do dito eixo tríplice, do eixo quintuple ou do tubo abaixo do eixo quintuple.
24. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, a qual é derivada de um vírus da pólio do tipo 1, caracterizada pelo fato de que:

(a) a interface VP2/VP3 compreende uma mutação no resíduo 3119 ou em um resíduo que corresponde ao mesmo; e/ou (b) a rede interna compreende uma mutação no resíduo 4018 ou em um resíduo que corresponde ao mesmo.
25. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo

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7/13 com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que:

(a) a interface VP2/VP3 compreende a mutação L3319M; e/ou (b) a rede interna compreende a mutação R4018G.
26. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de qualquer uma das reivindicações 21 a 23, a qual é derivada de um vírus da pólio do tipo 2, caracterizada pelo fato de que a rede interna compreende uma mutação no resíduo 4057, ou em um resíduo que corresponde ao mesmo.
27. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a rede interna compreende a mutação I4057V.
28. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, a qual é derivada de um vírus da pólio do tipo 3, caracterizada pelo fato de que:

(a) a interface VP2/VP3 compreende uma mutação no resíduo 2241 ou em um resíduo que corresponde ao mesmo;

(b) a rede interna compreende uma mutação em um ou mais dos resíduos 1054, 4067 e 3019 ou em resíduos que correspondem aos mesmos; e/ou (c) o cânion compreende uma mutação no resíduo 1105 ou em um resíduo que corresponde ao mesmo.
29. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que:

(a) a interface VP2/VP3 compreende a mutação D2241E;

(b) a rede interna compreende uma ou mais das mutações VP1 54 de alanina em valina, T4067A e H3019Y; e/ou (c) o cânion compreende a mutação T1105M.
30. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de qualquer uma das reivindicações 18 a 29, caracterizada pelo fato de que

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8/13 compreende uma ou mais modificações adicionais dentro de uma ou mais dentre a interface VP2/VP3, a rede interna e/ou o cânion, em que opcionalmente uma ou mais ditas modificações adicionais consistem em uma modificação tal como definido na Tabela 1,2, ou 3.
31. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que:

(a) é derivada de um vírus da pólio do tipo 1 e compreende (i) as mutações Q3178L e H1248P na interface de protômero, (ii) as mutações T2025A e D2057E na interface de pentâmero, (iii) a mutação L3119M na interface VP2/VP3, e (iv) a mutação R4018G na rede interna, em que opcionalmente a dita VLP também compreende a mutação V1196L no domínio de bolso;

(b) é derivada de um vírus da pólio do tipo 2 e compreende (i) as mutações F1134L e Y1159F no domínio de bolso, (ii) a mutação Q3178L na interface de protômero, e (iii) as mutações L3085F e T10411 na interface de pentâmero; ou (c) é derivada de um vírus da pólio do tipo 2 e compreende (i) as mutações F1134L e V1183L no domínio de bolso, (ii) as mutações Q3178L e V11071 na interface de protômero, (iii) a mutação D2057A na interface de pentâmero; e (iv) a mutação I405V na rede interna; ou (d) é derivada de um vírus da pólio do tipo 3 e compreende (i) a mutação F1132L no domínio de bolso, (ii) as mutações L2215M e F3091S na interface de protômero, (iii) as mutações L2018I e L3085F na interface de pentâmero, (iv) a mutação D2241E na interface VP2/VP3, (v) as mutações T4067A, H3019Y e opcionalmente A1054V na rede interna, e (vi) a mutação T1105M no cânion.
32. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que é:

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9/13 (a) uma VLP do tipo 1 derivada de um vírus da pólio do tipo

1 com (i) uma P1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO: 16 ou 17; (ii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 1, uma VPO que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 5, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da

SEQ ID N²: 3; (iii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da

SEQ ID N²: 1, uma VP2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 2, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da

SEQ ID N²: 3, e uma VP4 que tem uma sequência de aminoácidos da

SEQ ID N²: 4; e/ou (iv) uma P1; VP1, VPO e VP3; ou uma VP1, VP2, VP3 e VP4 que têm uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade da sequência em relação às sequências de aminoácidos de (i) a (iii);

(b) uma VLP do tipo 2 derivado de um vírus da pólio do tipo

2 com (i) uma P1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 18 ou 19; (ii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 6, uma VPO que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 10, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 8; (iii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 6, uma VP2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 7, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 8, e uma VP4 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 9; e/ou (iv) uma P1; VP1, VPO e VP3; ou uma VP1, VP2, VP3 e VP4 que têm uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade da sequência em relação às sequências de aminoácido de (i) a (iii); ou (c) uma VLP do tipo 3 derivado de um vírus da pólio do tipo

3 com (i) uma P1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 20 ou 21; (ii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 11, uma VPO que tem uma sequência de aminoácidos da

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SEQ ID N^Q: 15, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 13; (iii) uma VP1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma VP2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 12, e uma VP3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 13, e uma VP4 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 14; e/ou (iv) uma P1; VP1, VPO e VP3; ou uma VP1, VP2, VP3 e VP4 que têm uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade da sequência em relação às sequências de aminoácidos de (i) a (iii).
33. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma modificação em relação à partícula de vírus da pólio a partir do qual a VLP é derivada estabiliza a conformação antigênica nativa do capsídeo do vírus da pólio.
34. Método de identificação de uma modificação dentro de um capsídeo do vírus da pólio que aumenta a estabilidade do dito capsídeo do vírus da pólio, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) a introdução de uma mutação desestabilizadora no capsídeo de uma cepa do vírus da pólio;

(b) o crescimento da dita tensão do vírus da pólio a temperaturas semipermissivas; e (c) a seleção dos vírus da pólio resultantes para identificar uma ou mais modificações que revertem o efeito da mutação desestabilizadora.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a temperatura semipermissiva é uma temperatura na faixa de cerca de 38°C a cerca de 40°C.
36. Método de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de introdução de uma ou mais modificações identificadas na etapa (c) em

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11/13 um vírus da pólio do tipo selvagem e a verificação se as ditas uma ou mais modificações aumentam a estabilidade do capsídeo do vírus da pólio.
37. Método de produção de uma partícula parecida com o vírus da pólio-(VLP), caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) a introdução de um transcrito de RNA infeccioso que codifica a VLP em uma célula de um mamífero hospedeiro; ou (b) a produção recombinante de polipeptídeos derivados de capsídeos do vírus da pólio que compreendem uma ou mais modificações identificadas pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, e a montagem dos ditos polipeptídeos para formar uma VLP.
38. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP), caracterizada pelo fato de que pode ser obtida pelo método como definido na reivindicação 37.
39. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que é uma VLP tal como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 33.
40. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 33, 38 ou 39 e um excipiente ou um diluente farmaceuticamente aceitável.
41. Molécula de polinucleotídeo, caracterizada pelo fato de que codifica a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) tal como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 33, 38 ou 39.
42. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo tal como definido na reivindicação 41, o qual é ligado operavelmente a um promotor.
43. Vacina, caracterizada pelo fato de compreende:

(i) partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) como

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12/13 definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 31,36 ou 37; ou (ii) um ácido nucleico que codifica a VLP como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 31,36 ou 37;

e um adjuvante.
44. Vacina de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que é um vetor de ácido nucleico que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 39 ou o vetor de expressão como definido na reivindicação 42.
45. Vacina de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizada pelo fato de que é uma vacina do RNA que compreende um P1 RNA que codifica para a partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) e que também codifica uma protease viral para a divagem do precursor P1.
46. Partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, 38 ou 39, da composição de acordo com a reivindicação 38 ou da vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizada pelo fato de que serve para ser usada em um método de vacinação contra o vírus da pólio.
47. Uso de um vírus da pólio como a partícula (VLP) como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 33, 38 ou 39 ou da composição como definida na reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que serve na manufatura de um medicamento para ser usado em um método de vacinação contra o vírus da pólio.
48. Método de vacinação de um indivíduo contra o vírus da pólio, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo com necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma partícula parecida com o vírus da pólio (VLP) como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 33, 38 ou 39, de uma composição como definida na reivindicação 40 ou uma vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 43 a 45.

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49. Célula, caracterizada pelo fato de que produz partículas parecidas com o vírus da pólio (VLP) tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 33, 38 ou 39.
50. Célula de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo tal como definido na reivindicação 41, ou um vetor de expressão tal como definido na reivindicação 42.