TW201333196A - 新穎減毒小兒麻痺病毒：ｐｖ－１單－ｃｒｅ－ｘ - Google Patents

新穎減毒小兒麻痺病毒：ｐｖ－１單－ｃｒｅ－ｘ Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種新穎及穩定的減毒小兒麻痺病毒，其產生方式如下：將固有複製元件(cre)以遺傳工程方式置入至位於2C編碼區中帶有失活的天然cre元件之5'非轉譯基因組區(單-crePV)，並利用具有低密碼對偏好性之替換性P1編碼區取代所有或部分衣殼編碼區(P1)的核酸序列。該經穩定減毒的小兒麻痺病毒可有效用於疫苗及免疫。

Description

新穎減毒小兒麻痺病毒：PV-1單-CRE-X
本發明係關於一種新穎性經減毒小兒麻痺病毒。該經減毒小兒麻痺病毒在組織培養中能展現極佳的生長表型，同時穩定地維持極低的神經毒力。因此，該經減毒病毒較佳用於疫苗中。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2011年12月16日申請之美國申請案第61/576,706號之優先權，該案之全文以引用的方式併入本文中。
小兒麻痺病毒(poliovirus；PV)基因組含有一個髮夾形狀的結構，稱之為順式作用複製元件(cis acting replication element；cre)，其在基因組複製時是不可或缺的。該cre元件係位於2C ATP酶蛋白質(在P2域內)的編碼序列中，此環狀結構中的特定突變會導致無法複製的表型。藉由將合成性cre插入至PV基因組別處(例如5'非轉譯區(5'NTR))可使P2處帶有失活cre的PV基因體再度恢復活性。將合成性cre插入在介於5'NTR的苜蓿葉結構(cloverleaf)與IRES之間會產生變異體稱為PV-1(單-cre)，該變異體會以野生型病毒的動力學方式在海拉細胞(HeLa)中進行複製。對可表現CD155(小兒麻痺病毒受體)的轉基因小鼠而言，PV-1(單-cre)是減毒性的，其LD50大於107病毒顆粒。然而，在33℃及37℃下，PV-1(單-cre)於Vero及MRC5細胞中生長良好。該病毒可以耐受減毒性的損失，因為必須保持cre元件用 於病毒的複製作用。
人類mRNA開放閱讀框架中應對密碼緊鄰下個密碼出現的頻率會與每一密碼單獨使用所統計預期的頻率不同。人類基因組的每個基因中有的密碼對是過度出現，而有的密碼對則是出現不足。利用整體基因組化學合成法，吾人業已證明，太多出現不足的密碼對會衰減病毒基因之表現。此外，病毒中一或多個ORF中密碼對之去最佳化作用(相對於過度出現的密碼對，係增加出現不足的密碼對)會導致明顯的減毒作用。
先前吾人已構築了密碼對經去最佳化的小兒麻痺病毒基因組，PV-X。在該PV基因組中，與野生株PV基因組相比，759核苷酸的「X」部分(衣殼域的三分之一)含有181個核苷酸的變化。此PV基因組設計不僅係經減毒，而且具有因為X中的許多突變作用而不會讓經減毒表型回復成完全毒力的優點。在整段背景中，如果有的話，單一核苷酸的回復僅會使表型具有非常小的差異。
本發明提供經減毒小兒麻痺病毒，該病毒在組織培養中會展現出極佳的生長表型，同時能穩定地維持極低的神經毒力。本發明提供一種經減毒小兒麻痺病毒基因組，該基因組包括單一活性順式作用複製元件(cre)，該元件係位於介於苜蓿葉結構與內部核糖體進入位點(IRES)之間的5'-NTR間隔區；及小兒麻痺病毒蛋白質編碼序列，該序列所具有的密碼對偏好性小於從其衍生而來的親本小兒麻痺病 毒蛋白質編碼序列之密碼對偏好性。在本發明之一實施例中，該活性cre元件係插在核苷酸102/103。在本發明之一實施例中，該cre元件所在位置如SEQ ID NO：1所示。
在本發明之一實施例中，該蛋白質編碼序列具有的密碼對偏好性較親本蛋白質編碼序列的密碼對偏好性小至少約0.05，或至少約0.1，至少約0.2。在本發明之一實施例中，該蛋白質編碼序列具有約-0.05或更小，或約-0.1或更小，或約-0.3或更小，或約-0.4或更小的密碼對偏好性。在本發明之一實施例中，該蛋白質編碼序列與親本病毒之蛋白質編碼序列一致性小於90%或小於80%。
在本發明之一實施例中，雖然密碼會在序列內進行交換，但所得蛋白質編碼序列與親本蛋白質編碼序列係編碼相同的蛋白質。在本發明之一實施例中，該蛋白質序列係自然分離株的蛋白質序列。在本發明之一實施例中，所編碼的蛋白質係出自病毒株Mahoney。
在某些實施例中，該經減毒小兒麻痺病毒基因組所編碼的蛋白質不同於天然分離者，相差約10個或更少之胺基酸或約20個或更少之胺基酸。在某些實施例中，該經減毒小兒麻痺病毒基因組編碼的蛋白質不同於從其所衍生而來的親本蛋白質，相差約10個或更少之胺基酸或約20個或更少之胺基酸。在本發明之一實施例中，該經減毒小兒麻痺病毒基因組包括從核苷酸755至核苷酸1514之PV-Min核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。在另一實施例中，該經減毒小兒麻痺病毒基因組包括SEQ ID NO：3。
本發明提供一種包括該等上述小兒麻痺病毒基因組中任一者之經減毒小兒麻痺病毒。本發明進一步提供一種包括此等經減毒小兒麻痺病毒之疫苗組合物，以及藉由投與個體有效劑量之疫苗組合物以引發該個體免疫反應之方法。
本發明提供一種製造經減毒小兒麻痺病毒基因組之方法，該方法包括製備：包括位於介於苜蓿葉結構與內部核糖體進入位點(IRES)之間的5'-NTR間隔區之順式作用複製元件(cre)之核酸序列，及密碼對偏好性小於從其衍生而來的親本小兒麻痺病毒蛋白質編碼序列之密碼對偏好性之小兒麻痺病毒蛋白質編碼核苷酸序列。根據本發明，藉由再排列親本小兒麻痺病毒核苷酸序列之密碼可製得經降低密碼對偏好性之蛋白質編碼序列。在本發明之一實施例中，該經再排列序列係編碼一如親本小兒麻痺病毒核苷酸序列所編碼的相同蛋白質。本發明進一步提供用以將該小兒麻痺病毒引入至適當的宿主細胞中並培養該宿主細胞以產生小兒麻痺病毒。本發明亦提供包括此等重組小兒麻痺病毒之套組及該等用途之說明材料。
本發明提供一種高度經減毒小兒麻痺病毒，該病毒適宜用於疫苗及治療或改善人類實體腫瘤，例如兒童神經母細胞瘤。本發明經減毒小兒麻痺病毒包括兩個可調整減毒性之特徵。一個特徵係將稱為順式作用複製元件(cre)之髮夾形狀結構插入至該小兒麻痺病毒基因組之5'非轉譯區(5'NTR)中。第二個特徵係減少小兒麻痺病毒基因組之蛋 白質編碼部分中之密碼對偏好性。
根據本發明，小兒麻痺病毒分離株可穩定地經減毒，且複製特性會增強。此小兒麻痺病毒可以是自然存在的病毒株或其衍生株。本文所例示的是小兒麻痺病毒型1(Mahoney)(PV1(M))。其他非限制性的神經毒力小兒麻痺病毒實例包括P3/Leon/37(經減毒沙賓疫苗係衍生自該病毒株)及彼等P3/Leon/37及Mahoney之神經毒力衍生株。例如，經減毒小兒麻痺病毒(諸如沙賓)中所存在的非減毒性突變作用在此項技術中業已可與會導致減毒性之彼等突變作用區分。另外的實例係從會慢性分泌出源自疫苗之小兒麻痺病毒的個體所分離之小兒麻痺病毒分離株。
將cre插入至5'NTR
當小兒麻痺病毒基因組中之苜蓿葉結構與IRES之間之間隔區被該病毒不能刪除的必需RNA複製元件中斷時，就會產生穩定的經減毒表型。此元件係cre，即位在天然小兒麻痺病毒中病毒蛋白質2CATP酶編碼區的莖環結構(圖1，上圖)。根據本發明，單一活性cre元件係提供在會導致該小兒麻痺病毒減毒之病毒基因組的5'-NTR位置上，且其中可以回復減毒性之元件中任一突變作用會導致該cre元件失活，如此該小兒麻痺病毒會變得不具生命力。根據本發明，係將活性cre元件插入至苜蓿葉結構與內部核糖體進入位點(IRES)之間之5'-NTR間隔區中。在一特定實施例中，係將該cre元件插入至核苷酸102/103之間隔區。此cre元件之再遺傳加工處理描述於美國專利8,066,983中，其以 引用的方式併入本文中。
應瞭解，減毒性的穩定性係取決於位於該5'-NTR之cre元件，該元件係唯一的具有活性的cre元件。因此，位於該小兒麻痺病毒基因組中的2C編碼區之天然cre元件是不具活性的。典型地，編碼區中之天然cre元件的序列係經突變而使得該cre元件失活，但並不會改變由該cre元件之核苷酸所編碼的胺基酸。然而，會產生保守性胺基酸取代作用的突變是可允許的。保守性胺基酸取代作用通常係經具有類似特性(例如酸性、鹼性、芳族、大小、正或負電荷、極性或非極性)之胺基酸取代作用，如此該等取代作用實質上不會改變肽、多肽或蛋白質特性(例如電荷、等電點、親和性、結合性、構象及溶解性)或活性。針對此保守性胺基酸取代作用所進行的典型取代作用可為下列胺基酸群之中：甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、亮胺酸(L)及異亮胺酸(I)；天冬胺酸(D)及穀胺酸(E)；丙胺酸(A)、絲胺酸(S)及蘇胺酸(T)；組胺酸(H)、賴胺酸(K)及精胺酸(R)：天冬醯胺(N)及穀胺醯胺(Q)；苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。
根據本發明，係將cre元件插入至苜蓿葉結構與內部核糖體進入位點(IRES)之間的5'-NTR中，如此會產生經減毒病毒。如本文所示例，係將cre元件插入至PV1(M)之5'- NTR中核苷酸102/103上所創建之NheI位點(參見SEQ ID NO：1)，但無需如此精確定位。(例如)藉由斑塊分析或此項技術中已知用於測量病毒複製作用之其他技術可用以測定減毒性。多種小核糖核酸病毒(包括小兒麻痺病毒類型1及3、人類鼻病毒(例如HRV2及HRV14)、心肌病毒)的基因組中已鑑別出cre元件。該cre元件經預測會與髮夾形狀環位置部分的約14個核苷酸之保守性序列形成髮夾結構。在本發明之一實施例中，該cre元件係來自名為PV1(M)之小兒麻痺病毒1型。
如本文所示例，藉由試管內及活體內之傳代培養可增強經減毒小兒麻痺病毒之複製性質。如本文所證明，在傳代培養期間，突變作用會發生在本發明經減毒病毒中，但未觀察到會出現在經遺傳加工至5'-NTR之cre元件中。因此，病毒減毒性不會被壓制。相反，該等突變作用可提供增強之複製特性，此對於以溶瘤方式治療腫瘤是有利的。另外，此等突變作用可輕易地獲得。因此，本發明提供一種在5'-NTR中含有單一活性cre調控元件之穩定性經減毒小兒麻痺病毒。
密碼對偏好性
大多數的胺基酸是由一個以上的密碼所編碼。例如，丙胺酸係由GCU、GCC、GCA、GCG所編碼，3種胺基酸(亮胺酸、絲胺酸及精胺酸)係由6個不同的密碼所編碼，而只有色胺酸及甲硫胺酸具有獨特的密碼。「同義」密碼意指編碼相同胺基酸的密碼。因此，例如CUU、CUC、CUA、 CUG、UUA及UUG係編碼亮胺酸的同義密碼。同義密碼並非以相同頻率使用。一般而言，特定生物中之最頻繁使用的密碼係為同源tRNA富含該密碼之彼等，且使用此等密碼可以增強蛋白質轉譯作用的速率及/或準確性。相反地，針對稀少使用密碼的tRNA而言，被發現的含量相對低，且稀少使用密碼的用途被認為會降低轉譯作用的速率及/或準確性。因此，以同義密碼但不常使用的密碼置換核酸中特定的密碼是將「去最佳化」的密碼取代至該核酸中。
此外，特定生物對特定密碼之最鄰近密碼具有偏愛性的話，其在密碼對的使用上稱為偏好性。密碼對偏好性的改變會影響蛋白質合成及蛋白質製造的速率。重要的是，可以出現不足的密碼對設計基因，並未利用不同密碼(密碼偏好性沒改變)及/或未改變所編碼蛋白質的胺基酸序列。因此，以可編碼相同胺基酸之較低頻率使用的密碼對替換特定密碼對係為了去最佳化密碼對的使用。
藉由思考由8個不同的密碼對所編碼的胺基酸對Ala-Glu來說明密碼對偏好性。如果除了每一個別密碼的頻率之外，沒有其他因素會影響該密碼對頻率的話，則該等8個密碼對的每一者之預期頻率係將該等兩個相關密碼之頻率相乘計算求得。例如，以此計算法，該密碼對GCA-GAA預期會以佔所有Ala-Glu編碼對之0.097的頻率出現(0.23x0.42；以表1中的頻率為基礎)。為建立每一密碼對的預期(假設)頻率與人類基因組中實際觀察到的頻率關聯性，本發明使用共計含有14,795個人類基因之恆定性經註釋之共識性CDS(CCDS)數據庫。此套基因資料庫是人類編碼序列的最全面代表。利用此套基因資料庫，藉由將密碼出現的次數除以可編碼相同胺基酸的所有同義密碼出現的次數即可重新計算求得密碼使用的頻率。如所預期者，該等頻率與先前公布者(如在表1中所示)具有密切關聯性。因為Kazusa DNA研究所(Kazusa DNA Research Institute)密碼使用數據庫所提供的數據中具有過量樣本的影響，其中在計算法中係包括了84949個編碼人類編碼序列(遠遠超過人類基因的實際數目)，因此可能會導致些微頻率差異(http：//www.kazusa.or.jp/codon/codon.html)。因此隨後使用該密碼頻率來計算預期密碼對頻率係先將兩個相關密碼之頻率彼此相乘)(參見表2預期頻率)，且隨後將此結果與對應所討論密碼對出現時所編碼胺基酸對的觀察頻率(在整個CCDS數據庫)相乘。在密碼對GCA-GAA之實例中，此第二次計算是計算求得0.098之預期頻率(與第一次使用 該Kazusa數據庫計算求得0.097相比)。最後，一套14,795人類基因中所發現的實際密碼對頻率係如下計算求得：計數該套資料庫中每一密碼對的出現總次數，並將該總次數除以該套資料庫中編碼相同胺基酸對之所有同義編碼對的數目(表3，觀察頻率)。以14,795個人類基因資料庫為基礎，針對完整資料庫中3721(612)密碼對之頻率及觀察/預計值隨本文提供作為補充表1。
如果密碼對之觀察頻率/預期頻率之比率大於1，則該密碼對稱為過度出現的；如果該比率小於1，則該密碼對稱為出現不足的。在該實例中，該密碼對GCA-GAA係過度出現1.65倍，而該密碼對GCC-GAA係出現不足高於5倍。
許多其他密碼對會呈現極強的偏好性；有的密碼對出現不足，而其他密碼對則過度出現。例如，密碼對GCCGAA(AlaGlu)及GATCTG(AspLeu)係3至6倍出現不足(該等較佳密碼對分別為GCAGAG及GACCTG)，而密碼對 GCCAAG(AlaLys)及AATGAA(AsnGlu)約2倍過度出現。應注意，密碼對偏好性與胺基酸對的頻率無關，也與個別密碼的頻率無關。例如，該等出現不足的密碼對GATCTG(AspLeu)碰巧係使用最頻繁使用的亮胺酸密碼(CTG)。
如以下更充分地討論，密碼對偏好性要考慮到該編碼序列的整個長度上平均編碼序列中之每個密碼對之分數。根據本發明，密碼對偏好性係由測定。
因此，(例如)藉由最小化某段序列中密碼對分數或適度減少全長編碼序列中的密碼對分數可獲得某一編碼序列中類似密碼對偏好性。例如圖4A係顯示針對含有PV-Min的「XY」或「Z」片段之P1序列的密碼對偏好性具有中等程度降低情況。由PV-MinZ所達到的相同密碼對偏好性降低情況可藉由在整個P1序列內交換密碼來實現，但每一密碼對具有低於最大量的降低程度。藉由降低密碼對偏好性使小兒麻痺病毒進行減毒作用係揭示於PCT/US/2008/058952，其以引用之方式併入本文。
密碼對偏好性的計算
每一含有可能非「STOP」之密碼對(例如GTT-GCT)之個別密碼對係帶有一經分配「密碼對分數」或「CPS(codon pair score)」，其對特定「訓練集」基因而言是獨特的。特定密碼對之CPS係定義為在這套基因(在此實例中為人類基因組)中觀察到的密碼對出現次數比上預期次數之對數 比。測定特定密碼對出現的實際次數(換言之，係由特定密碼對所編碼特定胺基酸對的可能性)僅為計數特定基因庫之編碼序列中之密碼對出現的實際次數。然而要測定所預期次數則需要另外的計算。計算所預期次數無關乎胺基酸頻率及密碼偏好性二者(類似於Gutman及Hatfield)。即，預期頻率係根據特定密碼所編碼的胺基酸次數數目之相對比例加以計算的。正CPS值表示該特定密碼對在統計學上係過度出現於基因組中，而負CPS表示該密碼對在統計學上係出現不足於基因組中。
為進行人類基因組中此等計算，係使用含有總計14,795個基因之經註釋人類編碼區的共識CDS(CCDS)數據庫。此數據庫係提供基因組量度上之密碼及密碼對頻率，及因此胺基酸及胺基酸對之頻率。
Federov等人(2002)之範例係用以進一步強化Gutman與Hatfield之方法(1989)。此可以使得特定密碼對之預期頻率的計算獨立於密碼頻率，且係與編碼特定胺基酸對之相鄰密碼為非隨機關聯性：
在該計算式中，Pij係在其同義密碼群中以NO(Pij)頻率出現的密碼對。Ci及Cj係兩個包括Pij的密碼，該等分別在其同義密碼群中以頻率F(Ci)和F(Cj)出現。更特定而言，F(Ci)係整個編碼區由密碼Ci所編碼之對應胺基酸Xi的頻 率，且F(Ci)=NO(Ci)/NO(Xi)，其中NO(Ci)及NO(Xi)分別為密碼Ci及胺基酸Xi所觀察到出現的次數，據此計算出F(Cj)。此外，NO(Xij)係整個所有編碼區中胺基酸對Xij出現的次數。Pij之密碼對偏好性分數S(Pij)係以觀察頻率NO(Pij)除上所預期Ne(Pij)出現次數之對數差異比計算出來的。
利用上述公式，與利用整個人類CCDS數據庫計算求得之對應基因組Ne(Pij)值相比，判定個別編碼序列中的個別密碼對是否為過度出現或出現不足。計算結果為正S(Pij)分數係表示在人類編碼區為過度出現的密碼對，而負值係表示出現不足的密碼對(圖4)。
個別編碼序列中的「組合」密碼對偏好性係根據下列公式平均所有密碼對分數求得的：
因此整個編碼區中之密碼對偏好性計算如下：把包括該區域的所有個別密碼對分數加總在一起，並將此總和除以該編碼序列之長度。
該經減毒PV可衍生自小兒麻痺病毒1型(「Mahoney」，「PV(M)」)、小兒麻痺病毒2型(Lansing)、小兒麻痺病毒3型(Leon)、單價口服小兒麻痺病毒疫苗(OPV)病毒或三價OPV病毒。在某些實施例中，該經減毒小兒麻痺病毒包括PV-Min(SEQ ID NO：1)之所有或部分衣殼編碼區(自核苷酸 755至核苷酸3385之P1區)，其是從PV(M)進行再設計以引入最大可能數目之很少使用密碼。在某些實施例中，該經減毒小兒麻痺病毒可包括自核苷酸755至1513(例如PV-Min X)、自核苷酸755至2470(例如PV-Min XY)、自核苷酸1513至3385(例如PV-Min YZ)、自核苷酸2470至3385(例如PV-Min Z)或自核苷酸1513至2470(例如PV-Min Y)之PV-Min之核苷酸。該命名係反映出其中部分PV編碼區係經PV-Min核苷酸取代之小兒麻痺病毒基因體。本發明不限於上述所提的編碼區域部分。
應瞭解，藉由在編碼序列內的進行同義密碼的重組可產生許多核苷酸序列。例如，從任一特定蛋白質編碼核苷酸序列開始，藉由存在於該序列之同義密碼的重組可產生編碼相同蛋白質序列及具有經降低密碼對偏好性之許多核苷酸序列。因此，本發明經減毒病毒包括含有本文特別示例之核苷酸序列，以及編碼相同PV蛋白質之具有經降低密碼對偏好性之其他核苷酸序列之彼等。
本發明亦包含在小兒麻痺病毒蛋白質序列中之變異，其包括在小兒麻痺病毒分離株之中的胺基酸序列變異，以及在疫苗開發中所引入之胺基酸變化。此等變異與該病毒的減毒性或複製適合性可能有關或無關。應瞭解，此等密碼取代作用可提高或降低密碼對分數，但該影響係與該序列中所創造的密碼對或從該序列移除之密碼對有關，而非與經取代之密碼的頻率有關。因此，在其中同義密碼係經重組的核苷酸序列中亦存在密碼取代作用。即便如此，可計 算出能反映病毒減毒性的該序列密碼對偏好性及經降低密碼對偏好性。在本發明一實施例中，具有經降低密碼對偏好性的小兒麻痺病毒蛋白質編碼序列係編碼不同於天然分離株10個或更少胺基酸之蛋白質。在本發明另一實施例中，具有經降低密碼對偏好性之小兒麻痺病毒蛋白質編碼序列係編碼不同於天然分離株20個或更少之胺基酸之蛋白質。在本發明另一實施例中，設計具有經降低密碼對偏好性及係編碼不同於初始蛋白質序列10個或更少胺基酸之經設計蛋白質的小兒麻痺病毒蛋白質編碼序列。在本發明另一實施例中，設計具有經降低密碼對偏好性及係編碼不同於初始蛋白質序列20個或更少胺基酸之經設計蛋白質的小兒麻痺病毒蛋白質編碼序列。在某些實施例中，該等取代作用係如上所述之保守性取代作用。
疫苗組合物
本發明提供一種用於誘發個體保護性免疫反應之疫苗組合物，其包括任何本文所述的經減毒病毒及醫藥上可接受的載體。
應瞭解，用以誘發個體保護性免疫反應或預防個體免受病毒相關疾病侵害之本發明經減毒病毒係以額外包括醫藥上可接受之載體的組合物形式投與個體。醫藥上可接受之載體為熟習此項技術者所熟知的，且其包括(但不限於)0.01至0.1M且較佳為0.05M之磷酸緩衝液、磷酸緩衝鹽水(PBS)或0.9%鹽水中之一或多者。此等載體亦包括水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。水性載體包括水、醇性/水 溶液、乳液或懸浮液、鹽水及緩衝介質。非水性溶劑之實例係丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄欖油)及可注射之有機酯(例如油酸乙酯)。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer's)葡萄糖、葡萄糖及氯化鈉、乳酸化林格氏及固定油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充液、電解質補充液(例如以林格氏葡萄糖為基礎之彼等)及其類似物。固體組合物可包括無毒固體載體，例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、纖維素或纖維素衍生物、碳酸鈉及碳酸鎂。對於以氣溶膠投藥而言(諸如肺及/或鼻內給藥)，藥劑或組合物較佳係經無毒的表面活性劑(例如C6至C22脂肪酸或天然甘油酯中之酯或部分酯)及推進劑調配。為促進鼻內給藥，可包括例如卵磷脂之其他載體。醫藥上可接受之載體可進一步包括少量輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑及其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑及螯合劑，該等可增強該等活性成分之存放期及/或有效性。為了在投藥給個體後能提供快速、持續或延遲釋放該活性成分，可調配如此項技術中所熟知之即時性組合物。
在即時性疫苗組合物之多種實施例中，該經減毒病毒(i)實質上不會改變經感染細胞中病毒蛋白質之合成及加工處理，(ii)如野生型病毒一般，在每個經感染細胞中會產生與類似量之病毒顆粒；及/或(iii)實質上展示比野生型病毒較低之病毒顆粒專一性感染力。在另外的實施例中，該經減毒病毒會誘發宿主動物實質上與對應野生型病毒類似之 免疫反應。
本發明亦提供一種經修飾宿主細胞株，該細胞株係經特別分離或設計成可以讓經減毒病毒繁殖，其中該經減毒病毒在野生型宿主細胞中不具生命力。因為該經減毒病毒無法在正常(野生型)宿主細胞中生長，因此其係完全依賴於特定輔助細胞株來生長，此在製造用於疫苗生產之病毒上提供極高的安全水平。本發明經修飾細胞株之多種實施例可允許該經減毒病毒生長，其中該細胞株的基因組中業經改變以增加編碼罕見tRNA之基因數目。
此外，本發明提供一種用於誘發個體中保護性免疫反應之方法，其包括將本文所述的疫苗組合物中之任一者以預防上或治療上有效劑量投藥給該個體。本發明亦提供一種用於預防個體免受病毒相關疾病侵害之方法，其包括將該等本發明疫苗組合物中之任一者以預防上有效劑量投藥給個體。在以上該等方法之實施例中，該個體係經曝露於致病病毒。「曝露」於致病病毒意指接觸該病毒而產生感染。
本發明進一步提供一種用於延緩經病毒感染個體中病毒相關疾病發作或減慢該疾病進展速度之方法，其包括將該等本發明疫苗組合物中之任一者以治療上有效劑量投藥給該個體。
如本文所使用之「投藥」意指使用為熟習此項技術者所知之多種方法中之任一者給藥及給藥系統。可進行例如腹膜內、腦內、靜脈內、口服、粘膜、皮下、經皮、皮內、 肌內、局部、注射、藉由植入物、膜內、淋巴內、病灶內、心包或硬膜外投藥。藥劑或組合物亦可以氣溶膠投藥，例如用於肺及/或鼻內給藥。投藥可例如1次、複數次及/或經一或多個延長時期的方式進行。
例如藉由將初級劑量之疫苗投藥給個體，隨後在一段適當時間後以一或多次後續疫苗投藥可誘發該個體保護性免疫反應。疫苗投用之間的一段適當間隔時間係可輕易地由熟習此項技術者決定，且其通常約為數個星期至數個月。然而本發明不限制投藥之任何特定方法、路徑或頻率。
「個體」係指任何動物或經人為改造之動物。動物包括(但不限於)人類、非人類的靈長類動物、牛、馬、羊、豬、狗、貓、兔、貂、囓齒類動物(如小鼠、大鼠及天竺鼠)及鳥類。人為改造之動物包括(但不限於)具有人體免疫系統的SCID小鼠及可表現人類小兒麻痺病毒受體CD155的CD155tg轉基因小鼠。在一較佳實施例中，該個體係人類。鳥類之較佳之實施例係包括(但不限於)雞、火雞、鴨及鵝之家禽品種。
「預防上有效劑量」係指當疫苗投予容易受病毒感染或容易受病毒相關病症侵害的個體時，該疫苗可誘發該個體的免疫反應致使該個體免受病毒感染或免受該病症侵害之任何量。「保護」該個體意指降低該個體受該病毒感染的可能性或減少該疾病在該個體中發病的可能性(至少兩倍，較佳係至少十倍)。例如，如果個體具有1%的機會受病毒感染，則降低兩倍該個體受該病毒感染之可能性會產 生該個體具有0.5%的機會受病毒感染。最佳而言，「預防上有效劑量」係誘發個體可徹底預防該個體免受病毒感染或完全預防該病症發作之免疫反應。
如本文所使用之「治療上有效劑量」係指當疫苗投予患有該疫苗可有效治療病症之個體時，該疫苗可誘發該個體的免疫反應致使該個體經歷該病症及/或其症狀減輕、緩解或復原的任何量。在較佳之實施例中，係可預防該病症及/或其症狀的復發。在其他較佳之實施例中，係可治癒該個體之病症及/或其症狀。
任何即時免疫作用及治療方法之某些實施例進一步包括投予個體至少一種佐劑。「佐劑」應意指適宜於增強抗原之免疫原性並促進個體免疫力的任何試劑。許多佐劑(包括適合以蛋白質及核酸為基礎的疫苗之微粒佐劑)及將佐劑與抗原結合的方法是為熟習此項技術者所熟知的。適合用於以核酸為基礎之疫苗的佐劑包括(但不限於)以純化蛋白質或核酸形式傳送的奎爾A(Quil A)、雷西莫特(resiquimod)及白介素-12。適合用於與蛋白質免疫作用使用之佐劑包括(但不限於)明礬、弗氏(Freund's)不完全佐劑(FIA)、皂苷、奎爾A及QS-21。
本發明亦提供一種以本發明經減毒病毒免疫個體之套組。該套組包括經減毒病毒、醫藥上可接受的載體、施藥器及其用途之說明材料。在進一步的實施例中，該經減毒病毒可為一或多種小兒麻痺病毒、一或多種鼻病毒、一或多種流感病毒等。其中為使宿主對特定病毒中許多不同分 離株具有免疫力，一種以上的病毒是較佳的。本發明包括為熟習此項技術者所知之套組之其他實施例。該說明書可提供任何有用於指導投予該經減毒病毒之資訊。
本申請案之全文參考多種出版物、參考文本、教材、技術手冊、專利及專利申請案。全文中之此等出版物、專利、專利申請案及其他文獻之教示及揭示係以引用之方式併入此申請案中，以更全面地描述本發明從屬之技術水平。然而，不應將本文所引用的參考文件解釋成本發明之先前技術的公證書。
應瞭解且希望本發明所揭示原則內的變化是為熟習此項技術者可達成的，且意欲此等修飾是被包括在本發明之範疇內。下列實例進一步說明本發明，但不應解釋成以任何方式限制本發明之範疇。常規方法的詳細描述，例如用於重組質粒、病毒構築體轉染宿主細胞、聚合酶鏈反應(PCR)及免疫學技術的方法可獲自包括Sambrook等人(1989)及Coligan等人(1994)之為數眾多出版物。本文中所提及之所有引用以引用之方式全部併入本申請案中。
實例1
小兒麻痺病毒及重組疫苗候選株之特定感染力及減毒性
比較重組小兒麻痺病毒疫苗候選株及PVM野生型小兒麻痺病毒之特定感染力及減毒性。將病毒生長於海拉細胞中，病毒顆粒濃度係藉由光密度測定(1 OD260=9.4x1012顆粒/毫升)。斑塊形成單元/毫升係以海拉(R19)斑塊分析測定，且計算病毒顆粒相對PFU之比率。藉由正常化顆粒 /PFU比野生型數值測定出相對特定感染力。藉由腦內注射法將病毒投予至CD155轉基因小鼠(其可表現PV受體)，且測定會導致50%的小鼠麻痺的劑量(PLD50)。
表3顯示，野生型PV基因組中cre元件之遺傳加工處理會顯著地降低病毒的神經毒力及相對特定感染力。引人注意地，PV1-X的特徵顯示，將PV基因組中第一個三分之一處進行去最佳化作用後不會賦予經神經減毒表型，但會降低經去最佳化病毒之相對特定感染力。
表3顯示，PV1-單-cre-X之每一病毒班塊形成單元較任一經減毒親本病毒產生約3倍多之顆粒。此外，相對於親本經減毒病毒，該特定感染力係顯著降低的。此結果表示，在該cre元件與去最佳化的P1之間有協同效應，其可降低高度經神經減毒PV1-單-cre-X病毒之相對特定感染力。
實例2
具有回復突變的病毒係經神經減毒的
小兒麻痺病毒之神經減毒性通常係起因於少數位置的突變作用。例如，在沙賓小兒麻痺病毒疫苗病毒株之IRES內 發生點突變作用是減毒表型的一個決定因素。因此，此經減毒小兒麻痺病毒會頻繁地回復成完全神經毒力的野生型表型。當重複性在神經元細胞中進行傳代培養時，PV1-單-cre病毒(LD50>108)及PV1-單-cre-X病毒(LD50>108)會顯示出A133G突變作用，雖然該等經突變病毒與野生型小兒麻痺病毒(LD50=101.9)相比仍為減毒性，但仍會增加小鼠的神經致病性。A133G PV1-單-cre病毒及A133G PV1-單-cre-X病毒之LD50分別為104.5及105.6。
PV1-單-cre病毒及PV1-單-cre-X病毒之相對特定感染力分別為0.25及0.084。同時，A133G PV1-單-cre病毒及A133G PV1-單-cre-X病毒的相對感染力分別為0.44及0.25。此等數據表示，A133G突變亦與突變病毒之特定感染力的增加有關，雖然仍低於該野生型PV1(相對特定感染力=1)。
總之，此等結果顯示，如果發生回復作用，在回復突變病毒中去最佳化PV1-單-cre病毒會減緩A133G突變回復之影響，因為A133G PV1-單-cre-X病毒較A133G PV1-單-cre病毒多1個log10的減毒性，且經突變之去最佳化病毒的相對特定感染力比A133G PV-單-cre病毒低。更重要的是，我們的數據意味著，如果發生回復作用，PV1-單-cre-X之回復病毒株仍為高度神經減毒性，其與觀察到會回復到完全野生型神經毒力表型的沙賓病毒株相反。
實例3
構建質粒及DNA處理
實驗室所用的病毒株是神經毒力小兒麻痺病毒類1型 (Mahoney)(Cello,2002)。該小兒麻痺病毒cDNA是Cello等人(2002)用於cDNA合成者(質粒pT7PVM)(van der Werf等人,1986,Proc Natl Acad Sci U S A 83：2330-4)。「pT7PVM cre(2CATP酶)突變體」係完整長度的小兒麻痺病毒cDNA選殖體，其中該2CATP酶編碼區中之天然cre元件係因在核苷酸4462(G至A)、4465(C至U)及4472(A至C)處引入三種突變作用而失活(Yin等人,2003,J.Virol.77：5152-66；Paul,2003,In：Semler BL,Wimmer E,editors.Molecular biology of picornaviruses.Washington(DC)：ASM Press；2002.p.227-46；Rieder等人,2000,J.Virol.74：10371-80)。雙-cre PV係pT7PVM的衍生物，其具有兩個活性cre元件；一個在5'-NTR之核苷酸102/103處，其中會產生新的Nhe I酶切位點。第二cre元件係在2CATP酶編碼區中(圖1A)。單-crePV在該間隔區具有活性cre，而2CATP酶編碼區中之天然cre已失活(圖1A)。圖4顯示，單-crePV基因組之結構：單鏈RNA以共價方式連接至非轉譯區之5'末端(5'-NTR)上之編碼病毒蛋白質VPg。5'-NTR係由兩個順式作用區域(苜蓿葉結構及內部核糖體進入位點(IRES))所組成，其係由間隔區分離。IRES可以控制由結構區(P1)及非結構區(P2及P3)所組成的聚蛋白(開放式框格)之轉譯作用及指定複製蛋白質。順式複製元件(cre)顯示是在2CATP酶編碼區內。3'-NTR含有雜聚合區且係經聚腺苷酸化。RNA複製作用需要所有三種結構元件(苜蓿葉結構、cre及3'-NTR)。2CATP酶中天然cre因突變作用失活係以X表示(單-crePV)。
實例4
試管內轉錄作用、轉染作用及一步生長曲線
所有質粒經DraI加以線性化。以噬菌體T7 RNA聚合酶合成RNA，並藉由先前描述的DEAE-葡聚醣法(van der Werf,1986)將RNA轉錄子轉染至海拉單層細胞中。該培養時間至多為2天，且利用斑塊分析測定(Pincus等人,1986,J.Virol.57：638-46.)測定病毒滴度。在海拉細胞、MRC5及293T細胞中的一步生長曲線係按以下進行。單層細胞(1 x 106個細胞)係經以病毒感染量(multiplicity of infection；MOI)為10進行感染。該等培養皿如所示之33℃、37℃或39.5℃下進行培養，且在感染後之0、2、4、6、8、12、24、48及72小時收集該等細胞。該等培養皿經受3次連續的冷凍解凍循環，且該等上清液之病毒滴度係在單層海拉細胞上以如上所述之斑塊分析進行測定(Pincus,1986)。
結果示於圖3。單-cre-X可在所有3個溫度下於海拉細胞中進行有效複製。在33℃及37℃下使用MRC5亦可獲得高滴度之單-cre-X，但在39.5℃下複製作用會降低。在293T細胞中，複製作用於37℃及39.5℃下會受到強烈地限制。
圖1：野生型PV及親本經減毒PV病毒株之基因組結構。圖示說明所用的小兒麻痺病毒型1 Mahoney(「PV(M)」)及嵌合病毒的基因組結構。PVM之IRES序列顯示為黑色。該2C編碼區中之cre元件表示成莖環結構。在單-cre病毒株中，該天然cre(2C)會在其以「X」表示的保守序列中經由 突變作用而失去活性(Toyoda,H.等人,Cancer Res March 15,2007,67；2857)。第二個野生型cre的拷貝本插入在介於苜蓿葉結構與IRES之間。在名為PV-X的病毒株中，部分的P1編碼區(核苷酸755至核苷酸1513，以灰色框表示)含有出現不足的密碼對(Coleman,J.R.等人,Science,Jun.27,2008,320(5884)：1784-7)。
圖2：PVM及PV-1(單-cre-X)之生長表型。左側說明PVM及PV-1(單-cre-X)的基因組結構。將RNA轉錄物轉染至海拉細胞(R19)中，且如果有CPE，則藉由斑塊測定滴定CPE上獲得的病毒。
圖3：單-cre-X病毒在海拉細胞(R19)、MRC5及293T細胞中的一步生長曲線。細胞係以0.5之MOI感染，且在33℃、37℃及39.5℃下培養。該病毒滴度係藉由單層海拉細胞(R19)上進行斑塊分析加以測定。
圖4：PV(M)小兒麻痺病毒、單-crePV及雙-crePV之基因組結構。單股RNA係以共價鍵結方式連結至非轉譯區之5'末端(5'-NTR)之病毒編碼蛋白質VPg。該5'-NTR係由被間隔區所區隔的兩個順式作用域(苜蓿葉結構及內部核糖體進入位點(IRES))所組成。該IRES可控制聚蛋白的轉譯作用(開放框)，其係由結構區(P1)及非結構區(P2及P3)組成，並指引複製蛋白質。在2CATP酶編碼區內顯示出該順式複製元件(cre)。3'-NTR含有雜聚合區且其係經聚腺苷酸化。RNA複製需要所有三個結構元件(苜蓿葉結構、cre及3'-NTR)。將第二個拷貝本cre插入至該苜蓿葉結構與IRES 之間的間隔區(雙-crePV)。藉由莖環處所示X的突變作用可使2CATP酶中之天然cre失去活性(單-crePV)。
圖5：(A)測定人類及病毒ORF之密碼對偏好性。每一點代表根據其長度繪製的ORF之平均每一密碼對中之密碼對分數。計算出14,795個已註釋的人類基因之密碼對偏好性(CPB)。出現不足之密碼對會產生負分。針對多種小兒麻痺病毒P1結構體繪製出CPB，以箭頭符號表示。該圖說明，人類基因簇大部分在0.1左右。CPB顯示：PV(M)-wt(標為「WT」)(-0.02)、訂做的合成性小兒麻痺病毒衣殼PV-MAX(+0.25)、PV-Min(-0.48)，而PV(M)-wt：PV-Min嵌合衣殼PV-Min755-2470(=「PV-MinXY」)(-0.31)及PV-Min2470-3386(=「PV-MinZ」)(-0.20)。(B)描述該等多種嵌合、部分合成性小兒麻痺病毒構築體之結構。本文中PV-Min X亦係指PV-X。
<110> 美國紐約州立大學研究基金會
<120> 新穎減毒小兒麻痺病毒：PV-1單-CRE-X
<130> 14421/48976
<140> 101147987
<141> 2012/12/17
<150> 61-576,706
<151> 2011-12-16
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7570
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PV-1(單-cre)減毒小兒麻痺病毒
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(88)
<223> 立體交叉部分
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(169)
<223> PVcre(2C)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4514)..(4574)
<223> Pvcre(2C)失活
<400> 1
<210> 2
<211> 2643
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 減毒小兒麻痹病毒
<400> 2
<210> 3
<211> 7579
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PV-1(單-cre)減毒小兒麻痺病毒
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(88)
<223> 立體交叉部分
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(169)
<223> PVcre(2C)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4503)..(4563)
<223> PVcre(2C)失活
<400> 3

Claims (16)

  1. 一種經減毒小兒麻痺病毒基因組，其包括：單一活性順式作用複製元件(cre)，該cre元件位於介於苜蓿葉結構(cloverleaf)與內部核糖體進入位點(IRES)間的5'-NTR之間隔區，及具有密碼對偏好性小於從其衍生之親本小兒麻痺病毒蛋白質編碼序列之密碼對偏好性之小兒麻痺病毒蛋白質編碼序列。
  2. 如請求項1之經減毒小兒麻痺病毒基因組，其包括插入在核苷酸102/103之單一活性cre元件。
  3. 如請求項1或2之經減毒小兒麻痺病毒基因組，其中該cre元件位置如SEQ ID NO：1所示。
  4. 如請求項1或2之經減毒小兒麻痺病毒基因組，其中該蛋白質編碼序列的密碼對偏好性比親本蛋白質編碼序列之密碼對偏好性小至少約0.05，較佳為至少約0.1，更佳為至少約0.2。
  5. 如請求項1或2之經減毒小兒麻痺病毒基因組，其中該蛋白質編碼序列具有約-0.05或更小，較佳約-0.1或更小，更佳約-0.2或更小，更佳約-0.3或更小，更佳約-0.4或更小之密碼對偏好性。
  6. 如請求項1或2之經減毒小兒麻痺病毒基因組，其中該蛋白質編碼序列與該親本病毒之蛋白質編碼序列之一致性小於90%，較佳係小於80%。
  7. 如請求項1或2之經減毒小兒麻痺病毒基因組，其中該蛋 白質編碼序列與親本蛋白質編碼序列是編碼相同的蛋白質。
  8. 如請求項1或2之經減毒小兒麻痺病毒基因組，其中該親本蛋白質編碼序列是編碼該蛋白質的天然分離物。
  9. 如請求項1或2之經減毒小兒麻痺病毒基因組，其中該親本蛋白質編碼序列係出自菌株Mahoney。
  10. 如請求項1或2之經減毒小兒麻痺病毒基因組，其中該蛋白質編碼序列係編碼不同於天然分離物約10個或更少之胺基酸，較佳係約20個或更少胺基酸之蛋白質。
  11. 如請求項1或2之經減毒小兒麻痺病毒基因組，其中該經修飾蛋白質編碼序列包括自核苷酸755至核苷酸1514之PV-Min之序列(SEQ ID NO：2)。
  12. 如請求項1或2之經減毒小兒麻痺病毒基因組，其包括SEQ ID NO：3。
  13. 一種經減毒小兒麻痺病毒，其包括如請求項1至12中任一項之小兒麻痺病毒基因組。
  14. 一種製造經減毒小兒麻痺病毒基因組之方法，其包括製備包括以下之核酸序列：順式作用複製元件(cre)，該元件位於介於苜蓿葉結構與內部核糖體進入位點(IRES)間之5'-NTR之間隔區，及具有密碼對偏好性小於從其衍生之親本小兒麻痺病毒蛋白質編碼序列之密碼對偏好性之小兒麻痺病毒蛋白質編碼序列。
  15. 如請求項14之方法，其中該經減毒小兒麻痺病毒基因組 之小兒麻痺病毒蛋白質編碼序列係藉由以下製造的：再排列該親本小兒麻痺病毒核苷酸序列之密碼，以獲得可編碼與該親本小兒麻痺病毒核苷酸序列相同的胺基酸序列之經突變核苷酸序列。
  16. 如請求項14或15中任一項之方法，其進一步包括將該小兒麻痺病毒引入至適當的宿主細胞中，並培養該宿主細胞以產生小兒麻痺病毒。
TW101147987A 2011-12-16 2012-12-17 新穎減毒小兒麻痺病毒：ｐｖ－１單－ｃｒｅ－ｘ TW201333196A (zh)

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