BR112017004452B1

BR112017004452B1 - Vírus atenuado, arbovírus atenuado, seus usos, composição de vacina, método de produção de um genoma de vírus atenuado, método de produção de um arbovírus atenuado e genoma de arbovírus atenuado

Info

Publication number: BR112017004452B1
Application number: BR112017004452-8A
Authority: BR
Inventors: Eckard Wimmer; Steffen Mueller; Bruce Futcher; Sam Shen; Charles Stauft; Charles Ward
Original assignee: The Research Foundation For The State University Of New York
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2023-12-12
Also published as: PH12017500419B1; EP3189136A4; EP3189136A1; US20190002837A1; BR112017004452A2; MX2017002949A; US10400220B2; PH12017500419A1; WO2016037187A1

Abstract

VÍRUS ATENUADO, ARBOVÍRUS ATENUADO, SEUS USOS, COMPOSIÇÃO DE VACINA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM GENOMA DE VÍRUS ATENUADO, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ARBOVÍRUS ATENUADO E GENOMA DE ARBOVÍRUS ATENUADO. Esta invenção fornece um vírus atenuado que compreende um genoma viral manipulado projetado para conter várias substituições de nucleotídeos que reduzem a tendência de par de códons de uma sequência codificadora de uma proteína de vírus em relação a um primeiro hospedeiro enquanto a tendência de par de códons em relação a um segundo hospedeiro é não substancialmente reduzido. Noutra modalidade, a invenção fornece um vírus atenuado compreendendo o genoma viral manipulado para conter múltiplas substituições de nucleotídeos que reduzem a tendência de pares de códons de uma sequência codificadora de proteínas de vírus relativamente a um primeiro hospedeiro e a um segundo hospedeiro. O vírus atenuado pode ser utilizado numa composição de vacina para induzir uma resposta imunitária protetora num indivíduo. A invenção também fornece um método de síntese do vírus atenuado. Além disso, esta invenção fornece ainda um método para impedir que um indivíduo se torne afetado por uma doença associada ao vírus compreendendo a administração ao indivíduo de uma dose profilática eficaz de uma composição de vacina (...).

Description

[0001] Este pedido reivindica a prioridade ao Pedido de Patente US N°62/046.565 depositado em 5 de setembro de 2014, e ao Pedido de Patente US N° 62/050.638 depositado em 15 de setembro de 2014, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

FINANCIAMENTO FEDERAL

[0002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob os números de concessão AI07521901 e GM098400 concedidos pelo National Institute of Health. O governo tem certos direitos sobre a invenção.

DECLARAÇÃO DE DIREITOS AUTORAIS

[0003] Uma parte da divulgação deste documento de patente contém material que está sujeito a proteção de direitos autorais. O proprietário dos direitos autorais não tem nenhuma objeção à reprodução fac-símile por qualquer pessoa do documento de patente ou a divulgação de patentes como aparece na Patente e Escritório de Marca Registrada de arquivo ou registros de patentes, mas por outro lado se reserva todos e quaisquer direitos autorais.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0004] A presente invenção proporciona vírus atenuados, métodos para a preparação de vírus atenuados e composições de vacinas compreendendo um ou mais vírus atenuados, em que o vírus atenuado compreende um genoma viral modificado contendo uma pluralidade de substituições de nucleotídeos que resultam no rearranjo de códons de uma ou mais sequências de codificação de proteína de vírus e alterações no tendência de pares de códons em comparação com um ou mais hospedeiros virais. Os vírus atenuados permitem a produção de vacinas melhoradas e são utilizados para provocar resposta imune protetora.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0005] Os vírus que infectam múltiplos hospedeiros filogeneticamente distantes, por exemplo anfitriões de reinos diferentes, filos, ou classes, devem acomodar as diferenças nos hospedeiros de modo que o vírus possa se replicar eficientemente nos anfitriões com processos bioquímicos e moleculares diferentes. Estas diferenças de hospedeiro incluem, por exemplo, termorregulação, padrões de glicosilação de proteínas, características bioquímicas de membranas celulares e frequências de dinucleotídeos CpG. Arbovírus, por exemplo, têm a capacidade de infectar hospedeiros vertebrados e artrópodes.

[0006] O termo arbovirus ("arthropod-borne virus", vírus transmitido por artrópode) aplica-se a qualquer vírus transmitido aos seres humanos e/ou outros vertebrados por determinadas espécies de artrópodes alimentadores de sangue, principalmente insetos (moscas e mosquitos) e aracnídeos (carrapatos). As famílias no atual sistema de classificação que tem alguns membros de arbovírus incluem Bunyaviridae (compreendendo os buniavírus, flebovírus, naitovírus e hantavírus), Flaviviridae (compreendendo somente os flavivírus), Reoviridae (compreendendo os coltivírus e orbivírus) e Togaviridae (compreendendo os alfavírus). Os pássaros são frequentemente reservatórios para arbovírus, que são transmitidos por mosquitos a cavalos, outros animais domésticos, e seres humanos. Certos arbovírus são transmissíveis pelos seres humanos, incluindo dengue, febre amarela e doença chikungunya, que podem ser transmitidos de pessoa para pessoa através de mosquitos.

[0007] O vírus da dengue (DENV) é um arbovírus de RNA de fita e envelopado (genoma ~ 11 kb) do gênero Flavivirus da família Flaviviridae. O DENV é transmitido principalmente pelo mosquito Aedes aegypti que se tornou amplamente distribuído em regiões tropicais e subtropicais. As doenças resultantes da infecção por DENV incluem febre da dengue autolimitante (DF), síndrome de choque de dengue (DSS) com risco de vida e febre hemorrágica de dengue (DHF) caracterizada por aumento da permeabilidade vascular e trombocitopenia. As infecções por DENV são uma das principais causas de doenças humanas causadas por artrópodes no mundo. A cada ano, estima-se que haja 50-200 milhões de infecções por DENV em todo o mundo, resultando em 500.000 casos de DHF/DSS e mais de 20.000 mortes, com 3,6 bilhões de pessoas em risco.

[0008] Existem cinco sorotipos antigenicamente distintos de DENV. A infecção com um sorotipo induz imunidade contra esse sorotipo e algum grau de proteção cruzada contra os outros sorotipos. No entanto, a imunidade de proteção cruzada normalmente persiste apenas durante um tempo relativamente curto. Além disso, os anticorpos reativos cruzados podem ligar-se a mas não neutralizar outros sorotipos, levando a infecções secundárias mais graves. Uma vacina de dengue eficaz seria preferencialmente protetora contra todos os sorotipos conhecidos. Atualmente, não existem vacinas comercializáveis disponíveis capazes de prevenir a infecção humana por qualquer dos sorotipos de DENV.

[0009] A preferência de pares de códons, ou tendência de pares de códons, refere-se a um fenômeno em que certos pares de códons adjacentes são utilizados com mais frequência ou menos frequência num hospedeiro particular do que o esperado depois de se ter considerado a frequência de utilização dos códons individuais (Gutman & Hatfield, 1989, Moura et al., 2007, Coleman et al., 2008). Cada par de códons pode ser atribuído a uma pontuação de pares de códons (CPS), que é o logaritmo natural da proporção da frequência observada do par de códons para a frequência esperada do par de códons (isto é, CPS = ln(Observada/Esperada) Coleman et al., 2008).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] Em um aspecto da invenção se proporciona um vírus atenuado contendo um genoma viral possuindo uma ou mais sequências codificadoras de proteínas virais modificadas, caracterizado pelo fato de que a tendência de pares de códons, relativamente a um primeiro hospedeiro, de pelo menos uma sequência codificadora de proteína viral é menor do que a tendência de pares de códons do ácido nucleico de origem da qual é derivado, e em que a tendência do par de códons de uma ou mais sequências que codificam a proteína do vírus modificada não é substancialmente reduzida relativamente à de um segundo hospedeiro. Numa modalidade, a tendência de pares de códons de uma ou mais sequências codificadoras de proteínas de vírus modificadas no vírus atenuado é reduzida em relação ao primeiro hospedeiro em pelo menos 0,05, pelo menos 0,1, pelo menos 0,2, pelo menos 0,3 ou pelo menos 0,4. Em uma outra modalidade, a tendência de pares de códons de uma ou mais sequências codificadoras de proteínas de vírus modificadas está dentro de 0,002, 0,005, 0,010, 0,020 ou 0,050 do ácido nucleico de origem a partir do qual é derivado em relação ao segundo hospedeiro. Em uma modalidade, a tendência de pares de códons de uma ou mais sequências que codificam a proteína viral modificada é reduzida relativamente ao primeiro hospedeiro por rearranjo de códons do ácido nucleico de origem sem alterar substancialmente a utilização de códons.

[0011] Em outro aspecto, a invenção proporciona um vírus atenuado compreendendo um genoma viral possuindo uma ou mais sequências codificadoras de proteínas virais modificadas caracterizado pelo fato de que a tendência de pares de códons, em relação a um primeiro hospedeiro e a um segundo hospedeiro, de pelo menos uma sequência codificadora de proteína viral é menor do que o par de pares de códons do ácido nucleico de origem de que é derivado. Numa modalidade, a tendência de pares de códons de uma ou mais sequências codificadoras de proteínas de vírus modificadas é reduzida em relação ao primeiro hospedeiro e segundo hospedeiro independentemente em pelo menos 0,05, pelo menos 0,1, pelo menos 0,2, pelo menos 0,3 ou pelo menos 0,4.

[0012] Num aspecto, a invenção proporciona um método de produção de um genoma de vírus atenuado compreendendo os passos: (a) obtenção de uma sequência codificadora de proteína de vírus; (B) reorganizar códons sinônimos da sequência codificadora de proteínas para obter uma sequência codificadora de proteína modificada que (i) codifica a mesma sequência de aminoácidos que a sequência codificadora de proteína não rearranjada, (ii) tem uma tendência de pares de códons reduzida em relação a um primeiro hospedeiro comparado com a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína, (iii) tem uma tendência de pares de códons substancialmente semelhante em relação a um segundo hospedeiro em comparação com a sequência de nucleotídeos não rearranjada; e (c) substitui toda ou parte da sequência de nucleotídeos modificada no genoma não rearranjado de um vírus de origem. Em uma modalidade, a tendência do par de códons da sequência codificadora da proteína modificada relativamente ao primeiro hospedeiro é reduzida em pelo menos 0,05, pelo menos 0,1, pelo menos 0,2, pelo menos 0,3, ou pelo menos 0,4 comparado com a sequência de nucleotídeo codificadora de proteína não rearranjada. Em uma modalidade, a tendência de pares de códons da sequência codificadora da proteína modificada em relação ao segundo hospedeiro está na razão de 0,002, 0,005, 0,010, 0,020 ou 0,050 da sequência nucleotídica não rearranjada. Numa modalidade, um vírus atenuado é feito por inserção do genoma viral atenuado em uma linhagem celular.

[0013] Num outro aspecto, a invenção proporciona um método de produção de um genoma de vírus atenuado compreendendo os passos: (a) obtenção de uma sequência codificadora de proteína de vírus; (B) reorganizar códons sinônimos da sequência codificadora de proteínas para obter uma sequência codificadora de proteína modificada que (i) codifica a mesma sequência de aminoácidos que a sequência codificadora de proteína não rearranjada, (ii) tem uma tendência de pares de códons reduzida em relação a um primeiro hospedeiro comparado com a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína, (iii) tem uma tendência de pares de códons substancialmente reduzida em relação a um segundo hospedeiro em comparação com a sequência de nucleotídeos não rearranjada; e (c) substitui toda ou parte da sequência de nucleotídeos modificada no genoma não rearranjado de um vírus de origem. Em uma modalidade, a tendência do par de códons da sequência codificadora da proteína modificada relativamente ao primeiro hospedeiro e segundo hospedeiro é reduzida em pelo menos 0,05, pelo menos 0,1, pelo menos 0,2, pelo menos 0,3, ou pelo menos 0,4 comparado com a sequência de nucleotídeo codificadora de proteína não rearranjada. Numa modalidade, um vírus atenuado é feito por inserção do genoma viral atenuado em uma linhagem celular.

[0014] Numa modalidade da invenção, o primeiro hospedeiro é um vertebrado. Numa outra modalidade, o primeiro hospedeiro é um mamífero. Numa outra modalidade, o primeiro hospedeiro é um ser humano. Numa modalidade, o segundo hospedeiro é um artrópode. Numa modalidade adicional, o segundo hospedeiro é um aracnídeo. Numa modalidade, o segundo hospedeiro é um carrapato. Numa modalidade o segundo hospedeiro é um inseto. Numa modalidade o segundo hospedeiro é um mosquito.

[0015] Numa modalidade, o vírus é atenuado no primeiro hospedeiro, mas replica eficazmente no segundo hospedeiro e linhagens celulares derivadas do segundo hospedeiro. Numa modalidade, a tendência de par de códons de uma ou mais sequências codificadoras de proteínas de vírus modificadas é aumentada em relação ao segundo hospedeiro.

[0016] Numa modalidade, o vírus atenuado é um arbovírus. Em uma outra modalidade, o arbovírus atenuado é selecionado a partir do grupo constituído por bunyaviridae (compreendendo os buniavírus, flebovírus, nairovírus e hantavírus), Flaviviridae (compreendendo apenas os flavivírus), Reoviridae (compreendendo os coltivírus e orbivírus) e Togaviridae (compreendendo os alfavírus). Numa modalidade, o vírus atenuado é um flavavírus. Numa modalidade, o vírus atenuado é um vírus da dengue.

[0017] Em uma modalidade, as uma ou mais sequências codificadoras de proteínas de vírus modificadas derivam de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência codificadora da proteína do vírus da dengue, ou uma porção da mesma, selecionada de um ou mais do grupo que consiste em C; prM; E; NS1; 2A; 2B; NS3; 4A; 4B, e NS5. Em uma modalidade, a sequência codificadora da proteína do vírus modificada é derivada da sequência de ácido nucleico que codifica a glicoproteína estrutural E. Numa modalidade, a sequência codificadora da proteína viral modificada é derivada da sequência de ácido nucleico codificando a protease multifuncional NS3. Numa modalidade, a sequência codificadora de proteína de vírus modificada é derivada da sequência de ácido nucleico que codifica a polimerase de RNA multifuncional NS5.

[0018] Num aspecto, a invenção proporciona uma composição de vacina para induzir uma resposta imune protetora num sujeito, em que a composição de vacina compreende um vírus atenuado aqui descrito. Numa modalidade, a composição de vacina induz uma resposta imune protetora num sujeito compreendendo um arbovírus atenuado aqui descrito, em que a resposta imune protetora é contra um ou mais sorotipos de vírus da dengue selecionados do grupo consistindo em sorotipos de vírus de dengue 1 a 5. Num aspecto, a invenção proporciona um método para induzir uma resposta imune protetora num indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz da composição de vacina compreendendo um vírus atenuado tal como aqui descrito.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0019] Figura 1. Construção de um vírus de sorotipo 2 da dengue de tipo selvagem sintético. (A) Foi concebido um vírus DENV-2 de tipo selvagem sintético baseado no genoma da cepa 16681 (No. de Acesso U87411) e dividido em quatro fragmentos incorporando 26 mutações silenciosas (listadas na Tabela 4). O fragmento 1 continha um promotor T7 a montante sem 5' G nt estranho inserido entre o promotor T7 e o 5'-terminal A nt do cDNA genômico. Cada fragmento foi projetado com diferentes conjuntos de sítios de restrição nas extremidades 5' e 3' para facilitar a ligação, sintetizado por GenScript e colocado num plasmídeo pUC57 de alta cópia. (B) Para construir o genoma completo DENV-2, cada fragmento foi ligado ao plasmídeo pBR322 de baixa cópia na seguinte ordem utilizando enzimas de restrição especificadas: Fragmento 4 (Aval/SphI), Fragmento 3 (ClaI/StuI), Fragmento 2 (NheI/KpnI), e Fragmento 1 (ClaI/SacI).

[0020] Figura 2. (A) Crescimento de tipo selvagem sintético (D2-syn) em comparação com a cepa 16681 de DENV. A infectividade dos transcritos de RNA foi verificada por imunofluorescência indireta utilizando meios de cultura recolhidos da terceira ou quarta passagens cegas, 7 a 9 dias após a infecção. (B) Para verificar que as 26 mutações silenciosas não alteraram o fenótipo de crescimento e a cinética de D2-syn em comparação com o vírus 16681 de tipo selvagem, realizaram-se titulações de placas em células de rim de macaco rhesus C6/36 e LLC-MK2 a um MOI de 0,01. Os tamanhos das placas e o fenótipo eram semelhantes entre os vírus D2-syn e 16681. (C) A cinética de crescimento também foi encontrada como sendo semelhante, com D2-syn e 16681 alcançando títulos máximos de 1,3 x 107 PFU/mL e 5,5 x 106 PFU/mL respectivamente em células LLC-MK2 no Dia 7 e 6 x 107 PFU/mL e 5 x 107 PFU/mL respectivamente em células C6/36 no Dia 9.

[0021] Figura 3. O uso de pares de códons por dois vírus transmitidos por um vetor de artrópodes infectando hospedeiros primários de plantas ou animais. (A) Correlação da frequência de utilização de pares de códons entre genomas de ovelha(O. aries) e mosquito (A. aegypti) e (B) a frequência com que estes pares de códons são utilizados no genoma do vírus da febre do Vale do Rift. (C) Uma comparação semelhante entre milho (Z. Mays) e cigarrinha (G. nigrifronts) que são hospedeiro para (D) vírus Maize fine streak. As sequências de codificação de DNA para a cigarrinha foram geradas utilizando dados de transcriptoma de NCBI Bioproject PRGNA200322 e do programa de predição de genes Augustus.

[0022] Figura 4. Tendência de par de códons em seres humanos e mosquitos. (A) As preferências de pares de códons estão bem correlacionadas (Spearman rho = 0,95) entre humanos e camundongos. (B) As preferências de pares de códons são pouco correlacionadas (Spearman rho = 0,26) entre humanos e mosquitos. Cada círculo representa um dos 3.721 possíveis pares de códons. (C) Pares de códons efetivamente utilizados pelo vírus da dengue de tipo selvagem natural, tipo 2 (16681). Quanto mais vezes um par de códons específico é usado pelo vírus, maior e mais escuro o ponto. (D) Pares de códons usados por um vírus da dengue recodificado in silico projetado para ter uma boa pontuação de pares de códons em mosquitos, mas uma má (negativa) pontuação de pares de códons em seres humanos (pontos). "hmin" significa um vírus minimizado para humano.

[0023] Figura 5. (A) A pontuação média de pares de códons humanos do vírus de hmin in silico (ponto cinzento) em comparação com WT (ponto negro) e as pontuações médias dos pares de códons> 14,000 genes codificadores humanos. (B) Os mesmos dois vírus que em E (pontos cinzentos e pretos) foram avaliados utilizando pontuações de pares de códons de mosquitos e comparados com todos os genes codificadores de mosquitos Aedes aegypti. I vírus de hmin in silico demonstra que é possível projetar um vírus de dengue sintético drasticamente desotimizado em humanos mas otimizado em mosquitos.

[0024] Figura 6. Projeto e cinética de crescimento de WT (D2-syn) e três vírus da dengue de hmin em mamíferos e linhagens de células de mosquito. (A) (Topo) Diagrama das marcas de genoma de DENV2, a região de codificação de poliproteína e as regiões de codificação de polipeptídios antes do processamento proteolítico. As regiões codificadas por cores indicam regiões recodificadas nos três novos vírus de hmin. Os genomas completos dos três vírus de hmin (Ehmin, NS3hmin, e NS5hmin) estão alinhados com a sequência WT (D2- syn), e as mutações pontuais geradas pela recodificação de pares de códons são indicadas por um diagrama de código de barras. Os dois line plots de CPS (fundo) mostram como a pontuação do par de códons muda ao longo do comprimento do genoma para cada vírus em relação a CPBs de mosquito e humano. Há quatro curvas de LOESS que se sobrepõem: Ehmin, NS3hmin, NS5hmin, e D2-syn. (BD) Curvas de crescimento de vírus em diferentes linhagens celulares produzidas medindo a razão de mudança (fold change) na concentração de RNA do vírus a partir do tempo 0.

[0025] Figura 7. Curvas de crescimento e fenótipos de placas de vírus cultivados em diferentes células. (A) Células de inseto C6/36 ou (B) células LLC-MK2 de mamífero foram infectadas com variantes de vírus a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,001. O título de vírus foi medido por ensaio em placa em células BHK. (C) Cinética de crescimento de NS5hmin em diferentes células. Células C6/36 ou LLC-MK2 foram infectadas com NS5hmin a uma MOI de 1. O título de vírus foi medido por ensaio em placa em células BHK. (D) Fenótipos de placa de células BHK utilizando vírus cultivados em células LLC-MK2 ou (E) C6/36 a 0,01 MOI. (F) Fenótipos de placas foram mais evidentes para NS5hmin utilizando vírus cultivado em células C6/36 a 1 MOI. (G) Títulos de vírus, medidos por ensaios de formação de focos em linhagens celulares C6/36, BHK-21, Vero E6, A549, ou LLC-MK2. (H) Efeito do tratamento com inibidor de Jak 1 no título do vírus. As células LLC-MK2 foram pré-tratadas com o inibidor de Jak 1, e a razão de mudança no título do vírus em relação às células não tratadas foi medida por uma dose infecciosa de cultura de tecidos a 50% (TCID50) aos três e sete dias após a infecção. Diferenças significativas de D2-syn em (G) e (H) são marcadas pelo valor de * P <0,05 pelo teste da pontuação de Wilcox.

[0026] Figura 8. Curvas de sobrevivência mostrando atenuação dos vírus hmin em camundongos recém-nascidos. (A e B) Atenuação de vírus hmin após infecção intracerebral. Grupos de ratinhos ICR recém-nascidos (1-2 dias de idade) foram infectados intracerebralmente com 103 (A) ou 104 PFU (B) de vírus (D2-syn) ou hmin, respectivamente. (C) Dose letal (LD50) mediana em ratinhos recém-nascidos após infecção intracerebral. (D) Título de anticorpo materno PRNT50 em ratinhos juvenis nascidos de mães vacinadas (quando eram animais recém-nascidos) com D2-syn ou EHmin (* valor de P <0,05 pelo teste de pontuação de Wilcox).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0027] Arbovírus exibem ciclos de vida que envolvem tanto vertebrados como artrópodes. Para infectar e replicar nestes dois tipos muito diferentes de hospedeiros, o vírus deve ser capaz de se adaptar a condições de crescimento que são muito diferentes, incluindo temperatura, fatores do hospedeiro, espessura e composição da membrana celular e mesmo diferenças no uso do códon sinônimo de genoma e tendência de par de códons. Todas as espécies têm preferências na forma como codificam proteínas em ácidos nucleicos e depois traduzem-nas. Dada a degenerescência do código genético, diferentes organismos evoluíram preferências divergentes para a codificação de proteínas refletidas por diferenças na tendência de códon (ou uso de códon) e tendência de par de códons (CPB). CPB é a utilização preferencial de certos emparelhamentos de códons para codificar aminoácidos adjacentes em comparação com o que seria de se esperar com base no uso de códons de cada um dos dois códons sinônimos que codificam o par de aminoácidos. WO 08/121992, que é incorporado por referência, fornece uma descrição da tendência de pares de códons.

[0028] Descobriu-se que CPB diverge dramaticamente com o aumento da distância evolutiva, tal como entre mamíferos e insetos. Por exemplo, os pares de códons adjacentes sub ou super-representados em seres humanos tendem a estar sub ou super-representados noutros mamíferos, e os pares de códons adjacentes sub ou super-representados em Aedes aegypti (um vetor de inseto para certos arbovírus) tendem a estar sub ou super-representados em certos outros insetos, mas há pouca semelhança na preferência de pares de códons entre insetos e mamíferos.

[0029] A presente invenção refere-se a vírus atenuados compreendendo um genoma viral que foi modificado por engenharia genética para conter uma ou mais sequências de codificação de proteínas de vírus modificadas que têm uma tendência de pares de códons que é menor do que a sequência de ácido nucleico a partir da qual foi derivada relativamente a um primeiro hospedeiro viral, enquanto não reduz substancialmente a tendência do par de códons da sequência modificada relativamente a um segundo hospedeiro. Nesta modalidade, o vírus é projetado para ser atenuado num hospedeiro enquanto mantém a capacidade do vírus de crescer eficientemente no segundo hospedeiro.

[0030] Numa outra modalidade, a invenção refere-se a um vírus atenuado compreendendo um genoma viral que foi modificado por engenharia genética para conter uma ou mais sequências codificadoras de proteínas de vírus modificadas que têm uma tendência de pares de códons que é menor do que a tendência de pares de códons do ácido nucleico de origem de que é derivada, relativamente a um primeiro hospedeiro e a um segundo hospedeiro. Nesta modalidade, o vírus é projetado para ser atenuado em ambos os hospedeiros.

[0031] A invenção utiliza as diferenças na tendência de pares de códons entre organismos filogeneticamente distantes para (i) desotimizar um vírus para crescimento num hospedeiro enquanto otimiza (ou deixa o crescimento inalterado) noutro hospedeiro; (Ii) desotimizar o vírus para crescimento em ambos os hospedeiros; ou (iii) otimizar o vírus para crescimento em ambos os hospedeiros. Numa modalidade da invenção, as diferenças na tendência de pares de códons entre insetos e mamíferos são utilizadas para projetar e sintetizar um arbovírus vivo (por exemplo, vírus da dengue) que é atenuado num hospedeiro de mamífero, mas replica eficazmente em insetos e em linhagens celulares derivadas de insetos e de insetos. Noutra modalidade, é desenhado um arbovírus que é atenuado em hospedeiros de mamíferos e de insetos. Os métodos aqui descritos podem ser aplicados para produzir outros arbovírus além da dengue, que são atenuados em mamíferos ou outros hospedeiros vertebrados, de um modo específico do filo.

[0032] A presente invenção refere-se à produção de vírus atenuados que podem ser utilizados em vacinas para proteger contra infecção e doença viral. Em conformidade, a invenção proporciona um vírus atenuado, que compreende um genoma viral modificado contendo substituições de nucleotídeos manipuladas em uma ou mais sequências de codificação de proteínas virais, em que as substituições introduzem uma pluralidade de códons sinônimos rearranjados no genoma. Numa modalidade, a ordem dos códons existentes é alterada, em comparação com uma sequência viral de referência (por exemplo, de tipo selvagem), enquanto se mantém a sequência de aminoácidos de referência. A alteração na ordem dos códons altera a ocorrência de pares de códons e, consequentemente, altera a tendência dos pares de códons relativamente a pelo menos um hospedeiro viral.

[0033] A maioria dos aminoácidos são codificados por mais de um códon. Ver o código genético na Tabela 1. Alanina, por exemplo, é codificada por quatro códons: GCU, GCC, GCA e GCG. Três aminoácidos (Leu, Ser e Arg) são codificados por seis códons diferentes, enquanto que apenas Trp e Met têm códons únicos. Os códons "sinônimos" são códons que codificam o mesmo aminoácido. Assim, por exemplo, CUU, CUC, CUA, CUG, UUA e UUG são códons sinônimos que codificam Leu. Códons sinônimos não são usados com frequência igual. Em geral, os códons mais frequentemente utilizados num organismo particular são aqueles para os quais o RNAt cognato é abundante, e a utilização destes códons aumenta a taxa e/ou a precisão da tradução de proteínas. Por outro lado, RNAts para os códons raramente utilizados são encontrados em níveis relativamente baixos, e o uso de códons raros, pensa-se, reduz a taxa de tradução e/ou precisão. Substituir um dado códon num ácido nucleico por um códon sinónimo mas menos frequentemente utilizado é substituir um códon "desotimizado" no ácido nucleico. O primeiro nucleotídeo em cada códon que codifica um aminoácido particular é mostrado na coluna mais à esquerda; o segundo nucleotídeo é mostrado na linha superior; e o terceiro nucleotídeo é mostrado na coluna mais à direita.

[0034] Tendência de Códon

[0035] Tal como aqui utilizado, um códon "raro" é um de pelo menos dois códons sinônimos que codificam um aminoácido particular que está presente num RNAm a uma frequência significativamente mais baixa do que o códon mais frequentemente utilizado para esse aminoácido. Assim, o códon raro pode estar presente numa frequência cerca de 2 vezes inferior à do códon mais frequentemente utilizado. De preferência, o códon raro está presente em pelo menos uma frequência 3 vezes mais baixa, mais preferencialmente pelo menos 5 vezes, do que o códon mais utilizado para o aminoácido. Pelo outro lado, um códon "frequente" é um de pelo menos dois códons sinônimos que codificam um aminoácido particular que está presente num RNAm a uma frequência significativamente mais alta do que o códon menos frequentemente utilizado para esse aminoácido. O códon frequente pode estar presente numa frequência de cerca de 2 vezes, de preferência pelo menos 3 vezes, mais preferencialmente pelo menos 5 vezes, mais elevada do que o códon menos utilizado com frequência para o aminoácido. Por exemplo, os genes humanos utilizam o códon de leucina CTG 40% do tempo, mas utilizam o CTA sinônimo apenas 7% do tempo (ver Tabela 2). Assim, CTG é um códon frequente em seres humanos, enquanto que CTA é um códon raro. Aproximadamente coerente com estas frequências de utilização, existem 6 cópias no genoma humano para o gene para o RNAt que reconhece CTG, enquanto que existem apenas 2 cópias do gene para o RNAt que reconhece CTA. De modo semelhante, os genes humanos utilizam os códons TCT e TCC frequentes para a serina 18% e 22% do tempo, respectivamente, mas o códon raro TCG apenas 5% do tempo. TCT e TCC são lidos, através de oscilação, pelo mesmo RNAt, que tem 10 cópias do seu gene no genoma humano, enquanto TCG é lido por um RNAt com apenas 4 cópias. É bem conhecido que os RNAms que são muito ativamente traduzidos são fortemente polarizados para utilizar apenas os códons mais frequentes. Isto inclui genes para proteínas ribossômicas e enzimas glicolíticas. Por outro lado, os RNAms para proteínas relativamente não abundantes podem utilizar os códons raros.

[0036] A propensão para genes altamente expressos para usar códons frequentes é chamada de "tendência de códon". Um gene para uma proteína ribossomal pode utilizar apenas os 20 a 25 mais frequentes dos 61 códons, e tem uma tendência de códon elevado (uma tendência de códon próxima de 1), enquanto um gene mal expresso pode utilizar todos os 61 códons e ter pouca ou nenhuma tendência de códon (uma tendência de códon próximo de 0). Pensa-se que os códons frequentemente utilizados são códons onde são expressas quantidades maiores do RNAt cognato e que a utilização destes códons permite que a tradução prossiga mais rapidamente, ou mais precisamente, ou ambas. A proteína da cápside PV é muito ativamente traduzida, e tem um tendência de códon elevado.

[0037] Tendência dos pares de códons

[0038] Além da tendência do códon, um dado organismo tem uma preferência para o vizinho de códon mais próximo de um dado códon, referido como tendência na utilização de pares de códons. Uma alteração na tendência do par de códons, sem alterar os códons existentes, pode influenciar a taxa de síntese de proteínas e produção de uma proteína.

[0039] A tendência de pares de códons pode ser ilustrada considerando o par de aminoácidos Ala-Glu, que pode ser codificado por 8 pares de códons diferentes. Se nenhum fator diferente da frequência de cada códon individual (tal como apresentado na Tabela 2) é responsável pela frequência do par de códons, a frequência esperada de cada uma das 8 codificações pode ser calculada multiplicando as frequências dos dois códons relevantes. Por exemplo, por este cálculo em seres humanos o par de códons GCA-GAA seria esperado ocorrer a uma frequência de 0,097 de todos os pares de codificação Ala-Glu (0,23 x 0,42, com base nas frequências na Tabela 2). De forma a relacionar a frequência (hipotética) esperada de cada par de códons com a frequência efetivamente observada no genoma humano, utilizou-se a base de dados Consensus CDS (CCDS) de regiões de codificação humana anotadas consistentemente, contendo um total de 14,795 genes humanos. Utilizando este conjunto de genes, as frequências de utilização de códons foram recalculadas dividindo o número de ocorrências de um códon pelo número de todos os códons sinônimos que codificam o mesmo aminoácido. Como esperado, as frequências correlacionaram-se estreitamente com as anteriormente publicadas, como as apresentadas na Tabela 2. As variações ligeiras da frequência são possivelmente devido a um efeito do oversampling nos dados fornecidos pela base de dados do uso do códon no Kazusa DNA Research Institute (http://www.kazusa.or.jp/codon/codon.html) onde foram incluídas 84949 sequências de codificação humana no cálculo (muito mais do que o número real de genes humanos). As frequências de códon assim calculadas foram então utilizadas para calcular as frequências esperadas de pares de códons multiplicando primeiro as frequências dos dois códons relevantes entre si (ver Tabela 3, frequência esperada), e depois a multiplicação deste resultado com a frequência observada (em todo o conjunto de dados CCDS) com que ocorre o par de aminoácidos codificado pelo par de códons em questão. No exemplo do par de códons GCA-GAA, este segundo cálculo dá uma frequência esperada de 0,098 (comparado com 0,97 no primeiro cálculo usando o conjunto de dados Kazusa). Finalmente, as frequências reais de pares de códons observadas num conjunto de 14,795 genes humanos foram determinadas contando o número total de ocorrências de cada par de códons no conjunto e dividindo-o pelo número de todos os pares de codificação sinônimos no conjunto codificando o mesmo aminoácido (Tabela 3, frequência observada). Frequência e valores observados/esperados para o conjunto completo de 3721 (612), com base no conjunto de 14,795 genes humanos, são fornecidos como Tabela 1 suplementar na Pub. US N° US2010/0209454 (Ser. 12/594,173) aqui incorporada por referência.

[0040] Se a razão de frequência observada/frequência esperada do par de códons for superior a um, o par de códons é dito super-representado. Se a razão for menor do que um, é dito ser sub-representado. Na Tabela 3, o par de códons GCA-GAA é super-representado 1,65 vezes enquanto o par de codificação GCC-GAA é mais do que 5 vezes sub-representado.

[0041] Muitos outros pares de códons mostram uma tendência muito forte nos seres humanos; alguns pares estão sub-representados, enquanto outros pares são super-representados. Por exemplo, os pares de códons GCCGAA (AlaGlu) e GATCTG (AspLeu) estão três a seis vezes sub-representados nos seres humanos (sendo os pares preferidos GCAGAG e GACCTG, respectivamente), enquanto os pares de códons GCCAAG (AlaLys) e AATGAA AsnGlu) são cerca de duas vezes super-representados em seres humanos. Vale ressaltar que a tendência de pares de códons não tem nada a ver com a frequência de pares de aminoácidos, nem com a frequência de códons individuais. Por exemplo, o par sub-representado GATCTG (AspLeu) passa a utilizar o códon Leu mais frequente, (CTG).

[0042] Descobriu-se que tendência de par de códons diverge dramaticamente com o aumento da distância evolutiva, tal como entre mamíferos e insetos. Por exemplo, os pares de códons adjacentes sub ou super- representados em seres humanos tendem a estar sub ou super-representados noutros mamíferos, e os pares de códons adjacentes sub ou super-representados em Aedes aegypti (um vetor de inseto para certos arbovírus) tendem a estar sub ou super-representados em certos outros insetos, mas há pouca semelhança entre insetos e mamíferos. A análise aqui revelada revelou que as preferências de pares de códons em insetos e mamíferos são muito diferentes e quase não correlacionadas uma com a outra (compare a Fig. 4A com a Fig. 4B). Por exemplo, em mamíferos o CPS de GCG GGC (Ala Gly) é +0,655, enquanto que em insetos é -0,651; em contraste, o CPS de CTT CCC (Leu Pro) em mamíferos é -0,021, enquanto que em insetos é +0,615. Uma pontuação de pares de códons negativa denota que o par está sub-representado (Coleman et al., 2008), sugerindo que estes pares são desfavoráveis para o organismo. De fato; a recodificação de um segmento de poliovírus com pares de códons sub- representados produziu um vírus morto (Coleman et al., 2008), embora a região retirada contivesse exatamente os mesmos códons sinônimos e se traduzisse exatamente na mesma proteína.

[0043] Os valores observados e esperados de pares de códons e as pontuações de pares de códons para o conjunto completo de 3721 pares de códons em mosquito são fornecidos na Tabela 1 suplementar e estão disponíveis em http://www.pnas.org/content/suppl/2015/03/24/1502864112.DCSupplemental/pnas .1502864112.sd01.pdf.

[0044] Conforme discutido mais completamente a seguir, a tendência de pares de códons leva em consideração a pontuação para cada par de códons numa sequência de codificação calculada em média ao longo de todo o comprimento da sequência codificadora. A tendência do par de códons é determinada por

[0045] De acordo com isto, uma tendência de pares de códons semelhante para uma sequência de codificação pode ser obtida, por exemplo, por pontuações de pares de códons minimizadas sobre uma subsequência ou pontuações de pares de códons moderadamente diminuídas ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação.

[0046] Cálculo do Desvio de Pares de códons.

[0047] Cada par de códons individual dos possíveis 3721 pares de códons não contendo "STOP" (por exemplo, GTT-GCT) carrega uma "pontuação de pares de códons" atribuída ou "CPS" que é específica para um determinado conjunto de genes de um determinado organismo. A CPS de um dado par de códons é definida como a razão de log do número observado de ocorrências sobre o número que seria esperado neste conjunto de genes (neste exemplo, o genoma humano). A determinação do número real de ocorrências de um determinado par de códons (ou, por outras palavras, a probabilidade de um par de aminoácidos particular ser codificado por um par de códons particular) é simplesmente uma questão de contar o número real de ocorrências de um par de códons num conjunto particular de sequências de codificação. No entanto, a determinação do número esperado requer cálculos adicionais. O número esperado é calculado de modo a ser independente tanto da frequência de aminoácidos quanto da tendência de códon de forma semelhante a Gutman e Hatfield (1989). Isto é, a frequência esperada é calculada com base na razão relativa do número de vezes que um aminoácido é codificado por um códon específico. Um valor de CPS positivo significa que o par de códons dado é estatisticamente super-representado, e um valor de CPS negativo indica que o par está estatisticamente sub-representado no genoma humano.

[0048] Para realizar estes cálculos dentro do contexto humano, utilizou-se o banco de dados Consensus CDS (CCDS) mais recente de regiões codificadoras humanas anotadas consistentemente, contendo um total de 14.795 genes. Este conjunto de dados proporcionou par de códons e códon e, assim, as frequências de pares de aminoácido e aminoácido numa escala genômica.

[0049] O paradigma de Federov et al. (2002), foi utilizado para melhorar ainda mais a abordagem de Gutman e Hatfield (1989). Isto permitiu o cálculo da frequência esperada de um dado par de códons independente da frequência do códon e associações não aleatórias de códons vizinhos que codificam um par de aminoácidos particular.

[0050] No cálculo, Pij é um par de códons que ocorre com uma frequência de NO(Pij) em seu grupo sinônimo. Ci, e Cj são os dois códons que compreendem Pij, ocorrendo com frequências F(Ci) e F(Cj) em seus grupos sinônimos respectivamente. Mais explicitamente F(Ci) é a frequência em que o correspondente aminoácido Xi é codificado pelo códon Ci em todas as regiões codificadoras e F (Ci) = NO(Ci)/NO(Xi), onde NO(Ci) e NO(Xi) são o número observado de ocorrências de códons Ci e aminoácido Xi respectivamente. F (Cj) é calculado em conformidade. Mais distante, NO(Xij) é o número de ocorrências de pares de aminoácidos Xij em todas as regiões codificadoras. A pontuação de tendência do par de códons S(Pij) do Pij foi calculada como a razão log- probabilidades da frequência observada NOPij) sobre o número esperado de ocorrências de NEPij).

[0051] Utilizando a fórmula acima, é então determinado se os pares de códons individuais em sequências de codificação individuais estão super ou sub-representados quando comparados com os correspondentes valores genômicos NEPij) que foram calculados usando todo o conjunto de dados CCDS humano (ou conjunto de dados de outro hospedeiro). Este cálculo fornece valores de pontuação de S (Pij) para valores super-representados e negativos para pares de códons sub-representados nas regiões codificadoras humanas.

[0052] A tendência de pares de códons "combinada" de uma sequência de codificação individual é calculada fazendo a média de todas as pontuações de pares de códons de acordo com a seguinte fórmula:

[0053] A tendência do par de códons de uma região de codificação completa é assim calculada por adição de todas as pontuações de pares de códons individuais compreendendo a região e dividindo esta soma pelo comprimento da sequência de codificação.

[0054] Cálculo da tendência de pares de códons, implementação de algoritmos para produzir sequências desativadas de pares de códons (em relação a um único hospedeiro).

[0055] Um algoritmo foi desenvolvido para quantificar a tendência de pares de códons. Cada par de códons individuais possíveis recebeu uma "pontuação de pares de códons" ou "CPS". CPS é definido como o log natural da razão do número observado sobre o número esperado de ocorrências de cada par de códons em todas as regiões codificadoras de um organismo particular.

[0056] Embora o cálculo das ocorrências observadas de um determinado par de códons seja simples (a contagem real dentro do conjunto de genes), o número esperado de ocorrências de um par de códons requer um cálculo adicional. Este número esperado é calculado como sendo independente tanto da frequência de aminoácidos quanto da tendência de códon, semelhante a Gutman e Hatfield. Isto é, a frequência esperada é calculada com base na razão relativa do número de vezes que um aminoácido é codificado por um códon específico. Um valor de CPS positivo significa que o par de códons dado é estatisticamente super-representado, e um valor de CPS negativo indica que o par está estatisticamente sub-representado no genoma humano.

[0057] Utilizando estas CPSs calculadas, qualquer região de codificação pode então ser classificada como utilizando pares de códons super ou sub-representados tomando a média das pontuações dos pares de códons, dando assim uma tendência de Pares de códons (CPB) para toda a sequência de codificação.

[0058] De acordo com isto, uma tendência de pares de códons semelhante para uma sequência de codificação pode ser obtida, por exemplo, por pontuações de pares de códons minimizadas sobre uma subsequência ou pontuações de pares de códons moderadamente diminuídas ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação.

[0059] A tendência de pares de códons, que é uma medida do uso de pares de códons, pode ser avaliada para uma sequência de codificação, quer sejam ou não efetuadas substituições de códons como descrito abaixo. Para além do exemplo anterior de CPB em relação a seres humanos, a CPB em relação a outros organismos pode ser calculada utilizando a sequência genômica de referência para esse organismo.

[0060] Atenuação do Vírus por tendência de Par de códons de Otimização/Desotimização Relativa a Dois Hospedeiros

[0061] A presente invenção utiliza as diferenças na tendência do par de códons entre dois hospedeiros virais que são filogeneticamente distintos para recodificar uma ou mais sequências que codificam a proteína do vírus manipulando a tendência do par de códons da sequência(s) em relação aos dois hospedeiros. As uma ou mais sequências que codificam a proteína viral são recodificadas para (i) desotimizar o vírus para crescimento num hospedeiro enquanto otimiza (ou deixa o crescimento inalterado) noutro hospedeiro; (Ii) desotimizar o vírus para crescimento em ambos os hospedeiros; ou (iii) otimizar o vírus para crescimento em ambos os hospedeiros. Os métodos da presente invenção são utilizados para gerar uma ou mais sequências de codificação de proteínas de vírus modificadas em que a tendência de pares de códons, em relação a um primeiro hospedeiro, é menor do que a tendência de pares de códons do ácido nucleico de origem de que é derivado (por exemplo, a sequência de tipo selvagem), e em que a tendência de pares de códons de uma ou mais sequências que codificam a proteína viral modificada não é substancialmente reduzida em relação àquela do segundo hospedeiro. Os métodos da presente invenção são também utilizados para gerar uma ou mais sequências codificadoras de proteínas de vírus modificadas em que a tendência de pares de códons, em relação a ambos os hospedeiros, é menor do que a tendência de pares de códons do ácido nucleico de origem de que é derivada (por exemplo, a sequência do tipo selvagem).

[0062] Numa modalidade, o vírus compreende uma proteína que codifica a sequência de ácido nucleico que é recodificada para desotimizar a sequência relativamente à replicação num hospedeiro ou célula de mamífero, ao mesmo tempo que otimiza as suas propriedades de replicação num hospedeiro ou célula de inseto. Noutra modalidade, uma sequência de ácido nucleico codificadora de proteína recodificada para desotimizar a sequência com respeito à expressão em um hospedeiro mamífero de uma célula, e suas propriedades de replicação em um hospedeiro inseto ou célula também são desotimizadas. De modo semelhante, noutras modalidades, as sequências de ácido nucleico que codificam a proteína podem ser recodificadas para manter ou otimizar a replicação num hospedeiro ou célula de mamífero enquanto se desotimiza, mantém ou otimiza as propriedades de replicação num hospedeiro ou célula de inseto.

[0063] De acordo com a invenção, os vírus podem ser descritos, pelas suas propriedades de replicação. A manutenção das propriedades replicativas num hospedeiro particular significa os títulos virais obtidos para o vírus recodificado a níveis semelhantes, por exemplo, dentro de 2x ou 5x de títulos virais do vírus original. A desotimização de um vírus em relação a um hospedeiro significa reduzir os títulos virais por 5x ou mais, por exemplo 10x, 50x, 100x, 500x ou 1000x ou mais. Do mesmo modo, a otimização de um vírus em relação a um hospedeiro significa aumentar os títulos virais por 5x ou mais, por exemplo 10x, 50x, 100x, 500x ou 1000x ou mais.

[0064] De acordo com a invenção, a tendência de pares de códons pode ser alterada independentemente da utilização de códons. Por exemplo, numa sequência codificadora de proteínas de interesse, a tendência de pares de códons pode ser alterada simplesmente por rearranjo dirigido dos seus códons. Em particular, os mesmos códons que aparecem na sequência de origem, que podem ser de frequência variável nos organismos hospedeiros, são utilizados na sequência alterada, mas em posições diferentes. Na forma mais simples, porque os mesmos códons são utilizados como na sequência de origem, a utilização de códon na região de codificação de proteína que está a ser considerada permanece inalterada (tal como a sequência de aminoácidos codificada). No entanto, certos códons aparecem em novos contextos, isto é, precedidos por e/ou seguidos por códons que codificam o mesmo aminoácido como na sequência parente, mas empregando um tripleto de nucleotídeo diferente.

[0065] O rearranjo de um códon pode resultar em dois pares de códons que são ambos menos frequentes num hospedeiro do que na sequência de origem. Na prática, a reordenação de códons resulta frequentemente num par de códons menos frequente num local e num par mais frequente num segundo local. Por rearranjo judicioso de códons, a tendência de utilização de pares de códons por um dado comprimento de sequência de codificação pode ser reduzida em relação à sequência original. Alternativamente, os códons podem ser rearranjados de modo a produzir uma sequência que faça uso de pares de códons que são mais frequentes no hospedeiro do que na sequência de origem.

[0066] A tendência de pares de códons é avaliada considerando cada par de códons por sua vez, pontuando cada par de acordo com a frequência em que o par de códons é observado nas sequências de codificação de proteínas de um hospedeiro, e depois determinando o par de pares de códons para a sequência, como aqui revelado. Será apreciado que se pode criar muitas sequências diferentes que têm a mesma tendência de pares de códons. Também, a tendência de pares de códons pode ser alterado para uma maior ou menor extensão, dependendo da maneira na qual os códons são rearranjados. A tendência do par de códons de uma sequência de codificação pode ser alterada recodificando a sequência de codificação completa ou recodificando uma ou mais subsequências. Tal como aqui utilizado, a "tendência de pares de códons" é avaliada ao longo do comprimento de uma sequência codificadora, mesmo que apenas uma porção da sequência possa ser mutada. Uma vez que os pares de códons são pontuados no contexto da utilização de códons do organismo hospedeiro, um valor de tendência de pares de códons pode ser atribuído a sequências virais de tipo selvagem e sequências virais mutantes. Um vírus pode ser atenuado recodificando todas ou partes das sequências que codificam a proteína do vírus de modo a reduzir o seu tendência de pares de códons.

[0067] A tendência de pares de códons é uma propriedade quantitativa determinada a partir do uso de um par de códons de um hospedeiro. Em conformidade, valores de tendência de pares de códons absolutos podem ser determinados para qualquer sequência de codificação de proteína viral determinada para um determinado hospedeiro. E uma sequência de codificação de proteínas virais pode ter diferentes valores de tendência de pares de códons absolutos em relação a diferentes hospedeiros, em particular quando os diferentes hospedeiros são filogeneticamente distintos (por exemplo, os hospedeiros são de diferentes reinos, filos ou classes). Alternativamente, podem ser determinadas alterações relativas nos valores de tendência de pares de códons que relacionam uma sequência codificante de proteína viral desotimizada com uma sequência "de origem" a partir da qual é derivada. Como os vírus vêm em uma variedade de tipos (isto é, tipos I a VII pela classificação de Baltimore), e isolados naturais (ou seja, virulentos) de diferentes vírus produzem valores diferentes de tendência de pares de códons absolutos, são mudanças relativas na tendência de pares de códons que são normalmente mais relevantes para determinar os níveis desejados de atenuação para um determinado hospedeiro. Em conformidade, a invenção proporciona vírus atenuados e métodos para a sua preparação, em que os vírus atenuados compreendem genomas virais nos quais uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam a proteína têm um tendência de par de códons reduzido por mutação. Nos vírus que codificam apenas uma única proteína (isto é, uma poliproteína), a totalidade ou parte da poliproteína pode ser mutada para um grau desejado para reduzir a tendência do par de códons e a totalidade ou uma porção da sequência mutada pode ser proporcionada num vírus recombinante construir. Para um vírus que codifica separadamente múltiplas proteínas, pode-se reduzir a tendência do par de códons de todas as sequências que codificam a proteína simultaneamente, ou selecionar apenas uma ou algumas das sequências que codificam a proteína para modificação. A redução na tendência do par de códons é determinada ao longo do comprimento de uma proteína que codifica sequências, e é pelo menos cerca de 0,05, ou pelo menos cerca de 0,1, ou pelo menos cerca de 0,15, ou pelo menos cerca de 0,2, ou pelo menos cerca de 0,3, ou pelo menos cerca de 0,4. Dependendo do vírus, a tendência de pares de códons absolutos, com base no uso de par de códons do hospedeiro, pode ser cerca de -0,05 ou menos, ou cerca de 0,1 ou menos, ou cerca de -0,15 ou menos, ou cerca de -0,2 ou menos, ou cerca de -0,3 ou menos, ou cerca de -0,4 ou menos.

[0068] Os vírus da invenção podem ser descritos por alterações na preferência de par de códons ou tendência de par de códons. Tal como aqui descrito, a pontuação de pares de códons (CPS) e a tendência de pares de códons (CPB) referem-se à frequência observada vs. esperada de pares de códons adjacentes num hospedeiro. Para os vírus da invenção, que replicam em mais de um hospedeiro, CPS e CPB são avaliadas independentemente para cada hospedeiro. As sequências de ácido nucleico codificando proteína de vírus que são desotimizadas para um hospedeiro particular podem ter CPB reduzida, em outras palavras valores de CPB que são substancialmente mais negativo do que a sequência codificadora de proteína viral avaliada para aquele hospedeiro. Por exemplo, o vírus atenuado pode ter pontuações de CPB que são pelo menos 0,05, pelo menos 0,1, pelo menos 0,2, pelo menos 0,3, pelo menos 0,4, de 0,5 a 0,1, de 0,1 a 0,2, de 0,2 a 0,3, de 0,3 A 0,4, ou de 0,5 a 0,5 mais negativas do que os vírus originais avaliados para esse hospedeiro. De acordo com a invenção, uma sequência de ácido nucleico pode ser desotimizada e ter uma CPB que é reduzida para um hospedeiro, sem uma alteração substancial na CPB para um segundo hospedeiro. Por exemplo, a CPB em relação ao segundo hospedeiro pode estar dentro de 0,002, 0,005, 0,010, 0,020 ou 0,050 de um vírus de origem com respeito ao segundo hospedeiro. Os valores acima não são limitações estritas nas alterações do valores de CPB, conforme efeitos na replicação podem variar dependendo de quais sequências codificadoras do vírus são modificadas. Embora em certas modalidades, as alterações em CPB em comparação com um vírus de origem resultem de rearranjo, ou embaralhamento, dos códons dos vírus originais, noutras modalidades o vírus recodificado também pode conter substituições de códons sinônimas e/ou codificar substituições de aminoácidos.

[0069] Será evidente que a tendência de pares de códons também pode ser sobreposto a outra variação de sequência. Por exemplo, uma sequência de codificação pode ser alterada para codificar uma proteína ou polipeptídio que contém uma ou mais alterações de aminoácidos e também foi recodificada por embaralhamento de códons sinônimos de modo a alterar a tendência de pares de códons. Além disso, pode-se embaralhar os códons para se manter exatamente o mesmo perfil de utilização do códon numa sequência de codificação da proteína reduzida do par de códons como numa sequência de codificação da proteína de origem. Alternativamente, a seleção de códons pode resultar numa alteração global no uso de códons numa sequência de codificação.

[0070] De acordo com a invenção, a atenuação viral pode ser conseguida por alterações na tendência do par de códons, bem como pela tendência dos códons. Tanto o desvio do códon desativado como o desvio do par de códons desativado criam, separadamente, vírus não viáveis provavelmente causando uma tradução ineficaz da sequência recodificada. Contudo, espera-se que o ajustamento da tendência de pares de códons seja particularmente vantajoso. Por exemplo, a atenuação de um vírus através de tendência de códons geralmente requer a eliminação de códons comuns, e assim a complexidade da sequência de nucleotídeos é reduzida. Em contraste, a redução ou minimização de tendência de pares de códons pode ser realizada mantendo uma diversidade de sequências muito maior e consequentemente um maior controle sobre a estrutura secundária de ácido nucleico, a temperatura de recozimento e outras propriedades físicas e bioquímicas. O trabalho aqui divulgado inclui sequências de tendência de par de códons reduzida ou minimizada atenuadas em que os códons são embaralhados mas o perfil de utilização de códon é inalterado ou substancialmente inalterado.

[0071] Durante a recodificação, os sinais essenciais de ácido nucleico no genoma viral são preservados, mas a eficiência da tradução de proteínas em um ou em ambos os hospedeiros é sistematicamente reduzida pela desotimização da tendência de pares de códons. Outros parâmetros podem também ser desmotivados tais como tendência de códons, estrutura secundária de RNA e conteúdo de dinucleotídeo de CpG, conteúdo de C+G, sítios de mudança de quadro de tradução, sítios de pausa de tradução ou qualquer combinação destes. Esta desotimização pode envolver centenas ou milhares de mudanças, cada uma com um pequeno efeito. Geralmente, a desotimização é realizada até um ponto em que o vírus pode ainda ser cultivado em algumas linhagens de células (incluindo linhagens especificamente manipuladas para serem permissivas para um vírus particular), mas onde o vírus é avirulento em um ou mais hospedeiros. Tais vírus avirulentos são excelentes candidatos para uma vacina morta ou viva uma vez que codificam exatamente as mesmas proteínas que o vírus totalmente virulento e, consequentemente, provocam exatamente a mesma resposta imune que o vírus totalmente virulento. Além disso, a presente invenção oferece a perspectiva de ajustar com precisão o nível de atenuação em cada hospedeiro; Isto é, proporciona a capacidade de projetar vírus sintéticos que são desativados para uma extensão aproximadamente previsível num ou mais hospedeiros. O projeto, a síntese e a produção de partículas virais podem ser alcançadas num período de semanas, uma vez que a sequência genômica é conhecida, o que tem vantagens importantes para a produção de vacinas em emergências potenciais. Além disso, espera-se que os vírus atenuados não tenham praticamente nenhum potencial para reverter a virulência devido ao número extremamente grande de alterações de nucleotídeos prejudiciais envolvidas.

[0072] A extensão e a intensidade da recodificação de um vírus podem ser variadas dependendo do comprimento da proteína que codifica o ácido nucleico, se tudo ou uma porção pode ser recodificada, e a redução desejada da tendência do par de códons. Numa modalidade da invenção, uma sequência codificadora da proteína é modificada ao longo de um comprimento de pelo menos cerca de 100 nucleotídeos, ou pelo menos cerca de 200 nucleotídeos, ou pelo menos cerca de 300 nucleotídeos, ou pelo menos cerca de 500 nucleotídeos, ou pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos.

[0073] Um vírus atenuado de acordo com a presente invenção foi modificado para reduzir a patogenicidade num ou mais hospedeiros. O vírus atenuado tem reduzida virulência em um ou mais hospedeiros, mas pode estimular uma resposta imune num indivíduo. A atenuação viral pode ser confirmada de modos que são bem conhecidos por aquele versado na técnica. Exemplos não limitativos incluem ensaios de placa, medições de crescimento e letalidade reduzida em animais de teste. O presente pedido demonstra que os vírus atenuados são capazes de induzir respostas imunes protetoras num hospedeiro.

[0074] O termo vírus "de origem" ou a sequência codificadora de proteína "de origem" é aqui utilizado para se referir a genomas virais e sequências codificadoras de proteínas a partir das quais se derivam novas sequências, que podem ser mais ou menos atenuadas. Os vírus e sequências parentais são normalmente protótipos de "tipo selvagem" ou "de ocorrência natural" ou isolados de variantes para as quais se deseja obter um vírus mais altamente atenuado. No entanto, os vírus parentais também incluem mutantes especificamente criados ou selecionados no laboratório com base em propriedades desejáveis percebidas ou reais. Em conformidade, os vírus parentais que são candidatos à atenuação incluem mutantes de vírus de tipo selvagem ou de ocorrência natural que têm deleções, inserções, substituições de aminoácidos e semelhantes e também incluem mutantes que têm substituições de códons. Numa modalidade, tal sequência de origem difere de um isolado natural por cerca de 30 aminoácidos ou menos. Noutra modalidade, a sequência original difere de um isolado natural por cerca de 20 aminoácidos ou menos. Ainda noutra modalidade, a sequência original difere de um isolado natural por cerca de 10 aminoácidos ou menos.

[0075] A descrição de um vírus como tendo um primeiro hospedeiro e um segundo hospedeiro não pretende significar ordem de infecção ou qualquer valor relativo dos dois hospedeiros. Em vez disso, o uso dos termos primeiro hospedeiro e segundo hospedeiro identifica hospedeiros virais que estão filogeneticamente distantes e assim têm preferências de pares de códons suficientemente diferentes que a sequência viral pode ser manipulada para, por exemplo, simultaneamente favorecer um hospedeiro sobre o outro. Numa modalidade, o primeiro hospedeiro e o segundo hospedeiro são de diferentes reinos. Noutra modalidade, o primeiro hospedeiro e o segundo hospedeiro são de diferentes filos. Noutra modalidade, o primeiro hospedeiro e o segundo hospedeiro são de classes diferentes.

[0076] Algoritmo para produzir sequências recodificadas com CPB rebalanceada em relação a dois hospedeiros.

[0077] Conforme exemplificado aqui, um algoritmo baseado em computador pode ser utilizado para manipular a tendência de pares de códons de qualquer região de codificação em relação a dois hospedeiros. O algoritmo tem a capacidade de embaralhar os códons existentes e avaliar a CPB resultante em relação a dois hospedeiros, e depois reembaralhar a sequência, bloqueando opcionalmente pares de códons particularmente "valiosos". O algoritmo também emprega uma forma de "recozimento simulado" para não ficar preso em pontos extremos mínimos. Outros parâmetros, tais como a energia livre de enovelamento de RNA, podem opcionalmente estar sob o controle do algoritmo também, de modo a evitar a criação de estruturas secundárias indesejadas. O algoritmo pode ser utilizado para encontrar uma sequência com tendência de pares de códons que é minimizada independentemente, maximizada ou substancialmente inalterada, em relação a dois hospedeiros não relacionados. No caso de tal sequência não proporcionar um vírus viável, o algoritmo pode ser ajustado para encontrar sequências com tendência reduzido, mas não minimizada.

[0078] Escolhendo-se um códon aleatório e trocá-lo com outro códon sinônimo escolhido aleatoriamente a heurística funciona em uma sequência particular em várias centenas de milhares de iterações. Se a alteração de códon é "boa", a alteração é mantida, enquanto que se a alteração é "má", pode ainda ser mantida, com uma probabilidade dependente de uma "temperatura" especificada (daí a analogia ao recozimento metalúrgico). Ao contrário da desotimização de pares de códons para um único hospedeiro descrito anteriormente, neste caso há um problema de otimização de bi-critérios não trivial, no qual, por exemplo, a pontuação cumulativa de pares de códons é minimizada de acordo com a tabela de tendência de pares de códons humanos, ao mesmo tempo não permitindo que a pontuação cumulativa de acordo com a tabela de insetos se desloque substancialmente. Combinando ambos os critérios em uma única função: min (a * humano_pontuação + b * abs (inseto_pontuação - inseto_pontuação_wt)c) onde a, b e c são coeficientes. Variando a, b e c, pode-se, por exemplo, controlar a importância de minimizar a pontuação humana (a), e limitar a variação da pontuação do inseto do tipo selvagem (b e c). A mesma abordagem pode ser utilizada para reduzir simultaneamente a pontuação do par de códons relativamente a ambos os hospedeiros para produzir um vírus que é atenuado, por exemplo, tanto em seres humanos como em insetos.

[0079] A otimização/desotimização de sequências em relação a dois hospedeiros pode ser realizada com ou sem o auxílio de um computador, utilizando, por exemplo, uma descida de gradiente, ou um recozimento simulado, ou outra rotina de minimização. Um exemplo do procedimento que rearranja os códons presentes numa sequência inicial pode ser representado pelas seguintes etapas:

[0080] (1) Obter a sequência de genoma viral de origem (por exemplo, de tipo selvagem).

[0081] (2) Selecionar a(s) sequência(s) para direcionamento a projeto atenuado.

[0082] (3) Bloquear segmentos de DNA conhecidos ou conjeturados com funções não codificantes.

[0083] (4) Selecionar coeficientes de função heurística para determinar a importância relativa de minimizar a pontuação de CPB em relação a um primeiro hospedeiro versus manter uma pontuação de CPB neutra em relação a um segundo hospedeiro; ou, alternativamente, minimizar os resultados de CPB relativamente a um primeiro hospedeiro e relativamente a um segundo hospedeiro.

[0084] (5) Realizar embaralhamento aleatório de pelo menos duas posições de códon desbloqueadas sinônimas e calcular duas pontuações de tendência de pares de códons em relação a um primeiro e segundo hospedeiro.

[0085] (6) Computar a alteração resultante na função heurística (por exemplo, por recozimento simulado) e manter ou rejeitar o embaralhamento de códon sinônimo.

[0086] (7) Repetir os passos (5) e (6) para o número desejado de iterações.

[0087] Para além dos passos acima, pode-se realizar uma ou mais das seguintes etapas para gerar um vírus que tem propriedades de crescimento alteradas em relação a pelo menos um de dois hospedeiros:

[0088] (8) Inspecionar o projeto resultante para estrutura secundária excessiva e sítio de restrição indesejado: se sim -> vá para a etapa (5) ou corrija o projeto substituindo as regiões problemáticas por sequências de tipo selvagem e vá para a etapa (9).

[0089] (9) Sintetizar a sequência de DNA correspondente ao projeto do vírus.

[0090] (10) Criar construção viral e avaliar fenótipo viral: se demasiado atenuado, preparar o construção de subclone e ir para 10; se insuficientemente atenuado, vá para 2.

[0091] Usando as fórmulas acima, desenvolveu-se um algoritmo baseado em computador para manipular a CPB de qualquer região de codificação em relação a dois hospedeiros que têm preferências divergentes de pares de códons enquanto se mantém a sequência de aminoácidos original. O algoritmo tem a capacidade de manter a utilização do códon da sequência selecionada (isto é, preservar a frequência de utilização de cada códon existente), mas "embaralhar" os códons existentes para que a CPB possa ser aumentada, diminuída ou permanecer substancialmente inalterada em relação a cada um dos dois hospedeiros. O algoritmo utiliza recozimento simulado, um processo matemático adequado para otimização de comprimento total (Park, et al., 2004). Outros parâmetros também estão sob o controle deste algoritmo; por exemplo, a energia livre da enovelamento do RNA. Esta energia livre é mantida dentro de um intervalo estreito, para evitar grandes alterações na estrutura secundária como uma consequência do rearranjo dos códons. O processo de otimização exclui especificamente a criação de quaisquer regiões com grandes estruturas secundárias, tais como hairpins ou stem loops, que de outra forma poderiam surgir no RNA personalizado. Usando este software de computador, o usuário simplesmente precisa inserir a sequência de DNAc de um determinado gene e a CPB do gene pode ser personalizada conforme o experimentador achar adequado.

[0092] Alternativamente, pode-se conceber um procedimento que permita que cada par de aminoácidos seja desotimizado escolhendo um par de códons sem o requisito de que os códons sejam trocados para fora de qualquer outro lugar na sequência codificadora da proteína.

[0093] Esta invenção proporciona um método de produção de um genoma de vírus atenuado, compreendendo o método: (a) a obtenção de uma sequência codificadora de proteínas de vírus; (B) reorganizar códons sinônimos das sequências de nucleotídeos para obter sequências de nucleotídeos modificadas que (i) codificam a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de nucleotídeos não rearranjada, (ii) tem uma tendência de par de códons reduzida relativamente a um primeiro hospedeiro em comparação com o nucleotídeo não reagido (iii) tem uma tendência de pares de códons substancialmente semelhante ou uma tendência de pares de códons reduzida relativamente a um segundo hospedeiro em comparação com a sequência de nucleotídeos não rearranjada; e (c) substituir toda ou parte da sequência de nucleotídeos modificada no genoma não rearranjado de um vírus original.

[0094] Em certas modalidades dos presentes métodos, a etapa (b) é guiada por um algoritmo baseado em computador descrito acima que permite o projeto de um genoma viral variando conjuntos de padrões especificados de distribuição de códon desotimizada e/ou distribuição de pares de códons desotimizada dentro dos limites preferidos. A invenção também proporciona um método em que conjuntos de padrões alternativamente ou adicionalmente compreendem a densidade de códons desativados e pares de códons desativados, estrutura secundária de RNA, conteúdo de dinucleotídeo de CpG, o conteúdo de C+G, quadros de codificação sobrepostos, a distribuição de locais de restrição, os locais de mudança de quadros ou qualquer combinação destes.

[0095] Numa modalidade, a sequência codificadora de proteínas de vírus recodificada é gerada por síntese de novo de DNA contendo os pares de códon e/ou códons sinônimos.

[0096] Arbovirus Atenuados

[0097] Arbovírus, por exemplo, exibem ciclos de vida que envolvem tanto vertebrados como artrópodes como hospedeiros. Para infectar e replicar nestes dois tipos muito diferentes de hospedeiros, o vírus deve ser capaz de se adaptar a condições de crescimento que são muito diferentes, incluindo temperatura, fatores do hospedeiro, espessura e composição da membrana celular e mesmo diferenças no uso do códon sinônimo de genoma e tendência de par de códons.

[0098] Um aspecto da presente invenção envolve a "recodificação" de genomas de arbovírus incluindo mas não se limitando a DENV de modo a alterar ou interromper a utilização finamente equilibrada de pares de códons que permite ao vírus utilizar eficientemente máquinas de tradução de insetos e mamíferos. Numa modalidade, são utilizados pares de códons que são igualmente favoráveis como o vírus de tipo selvagem para expressão em insetos (permitindo assim a produção de vacinas em cultura de células de inseto) enquanto, ao mesmo tempo, são prejudiciais para a expressão em hospedeiro humano (atenuação). Numa outra modalidade, a técnica descrita pode ser utilizada para produzir arbovírus que são atenuados em ambos os hospedeiros como candidatos à vacina.

[0099] Numa modalidade, o vírus atenuado da presente invenção é um arbovírus. As famílias no atual sistema de classificação que tem alguns membros de arbovírus incluem Bunyaviridae (compreendendo os buniavírus, flebovírus, naitovírus e hantavírus), Flaviviridae (compreendendo somente os flavivírus), Reoviridae (compreendendo os coltivírus e orbivírus) e Togaviridae (compreendendo os alfavírus). Os pássaros são frequentemente reservatórios para arbovírus, que são transmitidos por mosquitos a cavalos, outros animais domésticos, e seres humanos. Certos arbovírus são transmissíveis pelos seres humanos, incluindo dengue, febre amarela e doença chikungunya, que podem ser transmitidos de pessoa para pessoa através de mosquitos.

[0100] Numa modalidade da invenção o arbovírus é o vírus da febre amarela, o vírus do Nilo Ocidental, o vírus da dengue, o vírus chikungunya, o vírus da peste suína africana, o vírus da encefalite japonesa, o vírus da febre do Vale do Rift, o vírus da encefalite transmitida por carrapatos, o vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, o vírus de Bunyamwera, vírus da encefalite de Califórnia, vírus de Jamestown Canyon, encefalite de La Crosse, vírus da Toscana, vírus HRTV, vírus da doença da floresta de Kyasanur, vírus da encefalite de Murray Valley, vírus da encefalite de St. Louis, vírus da doença equina africana, vírus da doença da língua azul, vírus da encefalose equina, vírus banna, vírus da febre do carrapato do Colorado Coltivírus, vírus da encefalite equina oriental, vírus do rio Ross, vírus da encefalite equina venezuelana e vírus da encefalite equina ocidental.

[0101] Numa modalidade o arbovírus é o vírus da dengue. Existem quatro sorotipos do vírus da dengue (DENV 1-4) que comumente infectam seres humanos. Um quinto sorotipo DENV foi recentemente relatado na Malásia, embora apenas uma infecção humana tenha sido documentada.

[0102] De acordo com a invenção, podem ser modificadas uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma proteína de vírus, ou porções das mesmas. A este respeito, por exemplo, o vírus da dengue codifica várias proteínas num quadro de leitura aberta: C; PrM; E; NS1; 2A; 2B; NS3; 4A; 4B, e NS5. DENV C é uma proteína da cápside; a proteína DENV E (envelope) é encontrada na superfície viral e é importante na ligação inicial da partícula viral à célula hospedeira; a proteína prM (membrana) de DENV é importante na formação e maturação da partícula viral; DENV NS3 é uma serina protease, bem como uma RNA helicase e RTPase/NTPase; DENV NS5 é um peptídeo de 900 resíduos com um domínio de metiltransferase na sua extremidade N-terminal e uma RNA-polimerase dependente de RNA (RdRp) na sua extremidade C- terminal; NS4B é uma pequena proteína hidrofóbica que pode bloquear a fosforilação de ST AT1 e inibir a sinalização de interferon; NS5 inativa e degrada STAT2.

[0103] A invenção é exemplificada por recodificação da glicoproteína E estrutural (SEQ ID NO: 3, recodificada E), protease multifuncional NS3 (SEQ ID NO:4, NS3 recodificado) e polimerase de RNA multifuncional NS5 (SEQ ID NO: 5, NS5 recodificado) do sorotipo 2 de DENV (cepa 16681; SEQ ID NO: 1). Como exemplificado, foi sintetizado um genoma de vírus de sorotipo 2 DENV baseado na cepa 16681 ab initio com 26 mudanças de nucleotídeos silenciosas para proporcionar sítios de restrição convenientes (SEQ ID NO:2) (aqui referido como "D2-syn" e também chamado de D2SAM1). As características de crescimento do vírus sintetizado em células de macaco e mosquito são indistinguíveis da cepa 16681. O genoma do vírus foi recodificado in silico para produzir três quadros de leitura abertos recodificados tendo pontuações de pares de códons humanos fortemente negativas em comparação com o tipo selvagem, mas pontuações de pares de códons de mosquito semelhantes ao tipo selvagem.

[0104] Em conformidade, a invenção proporciona arbovírus adaptados para utilização em vacinas, assim como métodos para a preparação e utilização de tais vírus. De acordo com a invenção, as sequências que codificam a proteína do vírus podem ser recodificadas para alterar as propriedades de replicação num ou mais dos seus mamíferos e hospedeiros de insetos. Numa modalidade, o vírus compreende uma proteína que codifica a sequência de ácido nucleico que é recodificada para desotimizar a sequência relativamente à replicação num hospedeiro ou célula de mamífero, ao mesmo tempo que mantém as suas propriedades de replicação num hospedeiro ou célula de inseto. Numa modalidade, a invenção proporciona um arbovírus que é atenuado num ser humano e pode ser produzido em títulos elevados em células de um segundo hospedeiro evolutivamente distante. Por exemplo, os códons sinônimos existentes de um arbovírus são rearranjados de modo a substituir pares de códons adjacentes existentes com pares que são desfavoráveis em seres humanos e favoráveis em insetos.

[0105] Montagem de DNA de Grande Escala

[0106] Nos últimos anos, os custos de imersão e a qualidade crescente da síntese de oligonucleotídeos tornaram prática a montagem de grandes segmentos de DNA (pelo menos até cerca de 10 kb) a partir de oligonucleotídeos sintéticos. Vendedores comerciais como a Blue Heron Biotechnology, Inc. (Bothwell, WA) (e também muitos outros) atualmente sintetizam, montam, clonam, verificam a sequência e distribuem um grande segmento de DNA sintético de sequência conhecida pelo relativamente baixo preço de cerca de US $ 1,50 por base. Assim, a compra de genomas virais sintetizados de fornecedores comerciais é uma opção conveniente e rentável, e os preços continuam a diminuir rapidamente. Além disso, estão surgindo novos métodos de síntese e montagem de moléculas de DNA muito grandes a custos extremamente baixos (Tian et al., 2004). O laboratório Church foi pioneiro num método que utiliza síntese paralela de milhares de oligonucleotídeos (por exemplo, em microplaquetas foto-programáveis microfluídicas, ou em microarranjos disponíveis a partir de Nimblegen Systems, Inc., Madison, WI, ou Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA), seguido por redução de erro e montagem por PCR de sobreposição. Estes métodos têm o potencial de reduzir o custo de DNAs sintéticos grandes para menos de 1 centavo por base. A eficiência e a precisão melhoradas, e o custo rapidamente decrescente, da síntese de DNA em larga escala proporcionam um ímpeto para o desenvolvimento e aplicação alargada da criação de vírus atenuados pelas estratégias aqui reveladas.

[0107] Composições de vacina

[0108] A presente invenção proporciona uma composição de vacina para induzir a produção de anticorpos neutralizantes num indivíduo. Numa modalidade, a presente invenção proporciona uma composição de vacina para induzir uma resposta imune protetora num indivíduo compreendendo qualquer um dos vírus atenuados aqui descritos e um carreador farmaceuticamente aceitável. Num aspecto da invenção, o vírus atenuado é um arbovírus. Numa outra modalidade, o vírus atenuado é um vírus da dengue. Num aspecto da invenção, a composição de vacina compreende um DENV atenuado e é afetiva na indução de imunidade protetora contra um ou mais sorotipos de DENV. Num aspecto, a composição de vacina compreende um ou mais sorotipos de DENV. Numa modalidade, o arbovírus atenuado é uma construção quimérica (ver Caufour et al, 2001; Osorio et al., 2011; Durbin et al., 2011) utilizada para desenvolver uma vacina multivalente (por exemplo, tetravalente).

[0109] Numa modalidade da invenção, é proporcionada uma composição de vacina para induzir uma resposta imune protetora num indivíduo, em que a composição de vacina compreende um arbovírus tal como definido acima. Numa modalidade da invenção, a composição de vacina compreende ainda pelo menos um adjuvante. A invenção proporciona um método para provocar uma resposta imune protetora num indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina estabelecida acima.

[0110] Deve ser entendido que um vírus atenuado da invenção, quando utilizado para induzir uma resposta imune protetora num indivíduo ou para evitar que um indivíduo se torne afetado por uma doença associada ao vírus, é administrado ao indivíduo na forma de uma composição que compreende adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos daqueles versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a um ou mais de 0,01-0,1 M e preferencialmente 0,05 M de tampão de fosfato, solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina a 0,9%. Esses carreadores incluem também soluções aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões. Os carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, suspensões ou emulsões, solução salina e meios tamponados. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etil. Os carreadores parenterais incluem a solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer e óleos fixos. Os carreadores intravenosos incluem repositores de fluido e nutrientes, repositores de eletrólitos, tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer e semelhantes. As composições sólidas podem compreender carreadores sólidos não tóxicos tais como, por exemplo, glicose, sacarose, manitol, sorbitol, lactose, amido, estearato de magnésio, celulose ou derivados de celulose, carbonato de sódio e carbonato de magnésio. Para administração em aerossol, tal como para administração pulmonar e/ou intranasal, um agente ou composição é de preferência formulado com um surfactante não tóxico, por exemplo, ésteres ou ésteres parciais de ácidos graxos C6 a C22 ou glicerídeos naturais e um propulsor. Carreadores adicionais, tais como lecitina, podem ser incluídos para facilitar a administração intranasal. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem ainda compreender pequenas quantidades de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsionantes, conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes e agentes quelantes, que aumentam a vida útil e/ou a eficácia dos ingredientes ativos. As presentes composições podem, como é bem conhecido na técnica, serem formuladas de modo a proporcionar uma liberação rápida, sustentada ou retardada do ingrediente ativo após a administração a um sujeito.

[0111] Em várias modalidades da presente composição de vacina, o vírus atenuado (i) não altera substancialmente a síntese e processamento de proteínas virais numa célula infectada; (Ii) produz quantidades semelhantes de vírus por célula infectada como vírus de tipo selvagem; e/ou (iii) exibe uma infecciosidade especifica do virion substancialmente inferior à do vírus do tipo selvagem. Em modalidades adicionais, o vírus atenuado induz uma resposta imune substancialmente semelhante num animal hospedeiro como o vírus de tipo selvagem correspondente.

[0112] Esta invenção também proporciona uma linhagem celular hospedeira modificada especialmente isolada ou modificada para ser permissiva para um vírus atenuado que é inviável numa célula hospedeira de tipo selvagem ou de outra forma não replicada de forma eficiente em cultura de células. Uma vez que o vírus atenuado não pode crescer em células hospedeiras normais (tipo selvagem), é dependente da linhagem celular auxiliar específica para crescimento. Isto proporciona um nível muito elevado de segurança para a geração de vírus para a produção de vacinas. Várias modalidades da linhagem celular modificada instantânea permitem o crescimento de um vírus atenuado, em que o genoma da referida linhagem celular foi alterado para aumentar o número de genes que codificam RNAts raros.

[0113] Além disso, a presente invenção proporciona um método para induzir uma resposta imune protetora num indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições de vacina aqui descritas. Esta invenção também proporciona um método para impedir que um indivíduo se torne afetado com uma doença associada a vírus compreendendo a administração ao indivíduo de uma dose profiláctica eficaz de qualquer das presentes composições de vacina. Em modalidades dos métodos acima, o indivíduo foi exposto a um vírus patogênico. "Exposto" a um vírus patogénico significa contato com o vírus de tal forma que uma infecção pode resultar.

[0114] A invenção proporciona ainda um método para retardar o início, ou retardar a taxa de progressão, de uma doença associada a vírus num sujeito infectado com vírus, compreendendo administrar ao sujeito uma dose terapeuticamente eficaz de qualquer das presentes composições de vacina.

[0115] Tal como aqui utilizado, "administrar" significa entregar utilizando qualquer dos vários métodos e sistemas de administração conhecidos pelos versados na técnica. A administração pode ser realizada, por exemplo, por via intraperitoneal, intracerebral, intravenosa, oral, transmucosa, subcutânea, transdérmica, intradérmica, intramuscular, tópica, parentérica, via implante, intratecal, intralifaticamente, intralesional, de maneira pericárdica ou epidural. Um agente ou composição pode também ser administrado num aerossol, tal como para administração pulmonar e/ou intranasal. Administração pode ser realizada, por exemplo, uma vez, uma pluralidade de tempos e/ou sobre um ou mais períodos prolongados.

[0116] A obtenção de uma resposta imune protetora num indivíduo pode ser conseguida, por exemplo, administrando uma dose primária de uma vacina a um sujeito, seguida, após um período de tempo adequado, por uma ou mais administrações subsequentes da vacina. Um período de tempo adequado entre as administrações da vacina pode ser facilmente determinado por aqueles versados na técnica e é usualmente da ordem de várias semanas a meses. A presente invenção não está limitada, contudo, a qualquer método particular, via ou frequência de administração.

[0117] Por "sujeito" entende-se qualquer animal ou animal artificialmente modificado. Os animais incluem, mas não estão limitados a seres humanos, primatas não humanos, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, cães, gatos, coelhos, furões, roedores tais como camundongos, ratos e porquinhos-da-índia e aves. Em uma modalidade preferencial, o sujeito é um paciente humano.

[0118] Uma "dose profilaticamente eficaz" é qualquer quantidade de uma vacina que, quando administrada a um sujeito propenso a infecção viral ou propenso a aflição com um distúrbio associado ao vírus, induz no indivíduo uma resposta imune que protege o indivíduo de se infectar pelo vírus ou ser afligido com o distúrbio. "Proteger" o sujeito significa reduzir a probabilidade de o sujeito se infectar com o vírus, ou diminuir a probabilidade do início da doença no sujeito, pelo menos duas vezes, de preferência pelo menos dez vezes. Por exemplo, se um sujeito tem uma probabilidade de 1% de se infectar com um vírus, uma redução de duas vezes na probabilidade de o sujeito se infectar com o vírus resultaria no sujeito com uma probabilidade de 0,5% de se infectar com o vírus. Mais preferencialmente, uma "dose profiláctica eficaz" induz no sujeito uma resposta imune que impede completamente que o sujeito se torne infectado pelo vírus ou impeça totalmente o aparecimento do distúrbio no sujeito.

[0119] Como aqui utilizada, uma "dose terapeuticamente eficaz" é qualquer quantidade de uma vacina que, quando administrada a um sujeito afetado com um distúrbio contra o qual a vacina é eficaz, induz no sujeito uma resposta imune que faz com que o sujeito experimente uma redução, remissão ou regressão do distúrbio e/ou dos seus sintomas. Em modalidades preferidas, a recorrência do distúrbio e/ou dos seus sintomas é impedida. Noutras modalidades preferidas, o sujeito é curado do distúrbio e/ou dos seus sintomas.

[0120] Certas modalidades de qualquer um dos métodos de imunização e terapêuticos atuais compreendem ainda administrar ao sujeito pelo menos um adjuvante. Um "adjuvante" significa qualquer agente adequado para aumentar a imunogenicidade de um antígeno e estimular uma resposta imune num sujeito. São bem conhecidos dos versados na técnica numerosos adjuvantes, incluindo adjuvantes em partículas, adequados para utilização com vacinas à base de proteínas e ácidos nucleicos e métodos de combinação de adjuvantes com antígenos. Os adjuvantes adequados para vacinas com base em ácidos nucleicos incluem, mas não estão limitados a Quil A, imiquimod, resiquimod e interleucina-12 entregues na forma de proteína purificada ou de ácido nucleico. Os adjuvantes adequados para utilização com imunização de proteínas incluem, mas não estão limitados a alum, adjuvante incompleto de Freund (FIA), saponina, Quil A e QS-21.

[0121] A invenção também proporciona um kit para imunização de um sujeito com um vírus atenuado da invenção. O kit compreende o vírus atenuado, um carreador farmaceuticamente aceitável, um aplicador e um material instrucional para a sua utilização. Em modalidades adicionais, o vírus atenuado pode ser um ou mais poliovírus, um ou mais rinovírus, um ou mais vírus da gripe, etc. Mais do que um vírus pode ser preferido onde é desejável imunizar um hospedeiro contra um número de isolados diferentes de um vírus particular. A invenção inclui outras modalidades de kits que são conhecidas pelos versados na técnica. As instruções podem fornecer qualquer informação que seja útil para dirigir a administração dos vírus atenuados.

[0122] Ao longo deste pedido, foram referidas várias publicações, textos de referência, manuais, manuais técnicos, patentes e pedidos de patentes. Os ensinamentos e divulgações destas publicações, patentes, pedidos de patente e outros documentos na sua totalidade são aqui incorporados por referência neste pedido para descrever mais completamente o estado da técnica ao qual a presente invenção se refere. No entanto, a citação de uma referência aqui não deve ser interpretada como um reconhecimento de que tal referência é estado da técnica da presente invenção.

[0123] Deve ser entendido e esperado que variações nos princípios de invenção aqui descritos possam ser feitas por aquele versado na técnica e pretende-se que tais modificações sejam incluídas dentro do âmbito da presente invenção. Os exemplos que seguem ilustram adicionalmente a invenção, mas não devem ser interpretados de forma a limitar o escopo da invenção de qualquer maneira. Descrições detalhadas de métodos convencionais, tais como os empregues na construção de plasmídeos recombinantes, transfecção de células hospedeiras com construções virais, reação em cadeia de polimerase (PCR) e técnicas imunológicas podem ser obtidas a partir de numerosas publicações, incluindo Sambrook et al. (1989) e Coligan et al. (1994). Todas as referências aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade neste pedido.

EXEMPLOS

[0124] Exemplo 1. Comparação de Tendência de Pares de Códons entre Insetos, Mamíferos e Plantas

[0125] O vírus da febre do vale do Rift (RVFV) é um vírus de RNA de cadeia negativa de Bunyaviridae, que infecta mosquitos e ovelhas (e outros mamíferos). A comparação da tendência de pares de códons do mosquito com a dos ovinos mostra uma correlação fraca entre as preferências de pares de códons entre ovelhas e mosquitos (Figura 3A). Os pares de códons no genoma de RVFV, um vírus de RNA de cadeia negativa de Bunyaviridae, foram comparados aos pares de códons utilizados pelos seus dois hospedeiros, mosquitos e ovelhas. Verificou-se que os pares de códons utilizados por RVFV tinham forte tendência ao conjunto relativamente pequeno de pares de códons que têm pontuações de pares de códons elevadas (isto é, que são preferidas) tanto em ovelhas como em mosquitos (Figura 3B).

[0126] A transmissão de vírus transmitida por insetos também é difundida no reino Plantae (12). Um exemplo é o vírus da raia fina do milho (MFSV), um nucleorhabdovírus que infecta cigarrinhas (um inseto) e é transmitido para Zea mays (com, uma planta) e outras plantas. Uma comparação semelhante foi realizada examinando pares de códons utilizados pelo milho (Z. mays) e cigarrinha (G. nigrifronts). As sequências de codificação de DNA para a cigarrinha foram geradas utilizando dados de transcriptoma de NCBI Bioproject PRGNA200322 e do programa de predição de genes Augustus. Uma comparação entre a tendência de códons de milho e de cigarrinhas revelou baixa correlação na preferência de pares de códons entre os dois hospedeiros (Figura 3C). Os pares de códons presentes no genoma do MFSV tinham forte tendência aos pares que possuíam pontuações de pares de códons elevados tanto em cigarrinhas como em com (Fig. 3D).

[0127] As preferências de pares de códons estão bem correlacionadas entre humanos e camundongos, mas são pouco correlacionadas entre humanos e mosquitos (Figura 4 AB). As preferências de pares de códons humanos foram calculadas como descrito antes (Coleman et al., 2008) e as de insetos foram calculadas utilizando sequências genômicas de Aedes aegypti. O vírus da dengue (DENV), um vírus de RNA de cadeia positiva de Flaviviridae, que infecta mosquitos e seres humanos, tem uma tendência em relação aos pares de códons com altas pontuações em ambos os hospedeiros (Figura 4C). Estes resultados sugerem que os vírus com múltiplos hospedeiros que têm diferentes preferências de pares de códons utilizam um conjunto restrito e equilibrado de pares de códons para comprometerem os seus hospedeiros.

[0128] Exemplo 2. Construção de um Vírus da Dengue de Tipo Selvagem Sintético

[0129] Um cDNA infeccioso sintético, com 10.723 nt de comprimento, foi projetado com base na sequência do vírus da dengue, tipo 2 (estirpe 16681) (número de acesso n°. U87411, SEQ ID NO: 1). O cDNA foi projetado para conter 26 alterações silenciosas de nucleotídeos (Tabela 4) a jusante da região codificadora do capsídeo e a montante da UTR 3'. Essas alterações colocam locais de restrição convenientes (únicos) a cada 1 kb e fornecem marcas d'água para identificação (ver FIG. 1B). Estas mutações não conduzem a alterações de aminoácidos na poliproteína. Além disso, nenhum promotor de E. coli foi criado por estas 26 mutações como determinado pelo programa de promotor de Rede Neural do Projeto de Genoma de Drosophila de Berkeley (http:/ jwww.fruitfly.org/ seq_tools/promoter.html). TABELA 4 - lista de 26 mudanças de nucleotídeos silenciosos no vírus sintético de tipo selvage ** Sítio de StuI formado como resultado do sítio de SbfI manipulado

[0130] O genoma do sorotipo 2 do vírus da dengue (DENV2) foi dividido em quatro fragmentos começando na extremidade 5', englobando cada um de 2.008 nt, 2.490 nt, 3.379 nt e 2.846 nt (DENV2 F1-4, respectivamente). Cada fragmento foi projetado para transportar uma região de sobreposição e um local de clonagem múltipla em cada extremidade do fragmento para facilitar a ligação de cada fragmento num plasmídeo bacteriano de baixo número de cópias, pBR322, independentemente da ordem. (Fig. 1 A). O clone infeccioso de comprimento completo foi montado por ligação nos fragmentos de ordem 4-3-2-1 como mostrado na Fig. 1B e verificado por análise de sequência. Este vírus de dengue sintético é referido como "D2-syn" (ou alternativamente como D2SAM1) (SEQ ID NO: 2).

[0131] O cDNA sintético foi linearizado, in vitro transcrito e transfectado em células de mosquito C6/36. A infectividade dos transcritos de RNA foi verificada por imunofluorescência indireta utilizando meios de cultura recolhidos da terceira ou quarta passagens cegas, 7 a 9 dias após a infecção (Fig. 2A). Para verificar ainda que este vírus foi derivado de células permissivas transfectadas, o RNA viral genômico completo foi extraído, analisado por RT-PCR e sequenciação de DNA, e verificado para conter todas as 26 mutações silenciosas.

[0132] Para verificar que as 26 mutações silenciosas não alteraram o fenótipo de crescimento e a cinética de D2-Syn em comparação com o vírus 16681, realizaram-se titulações de placas em células de rim de macaco rhesus C6/36 (CRL-1660; ATCC) e LLC-MK2 a um MOI de 0,01. Os vírus foram cultivados em C6/36 em meio essencial mínimo de Eagle (MEM) e 10% de soro bovino fetal (FBS). Os ensaios de placas foram realizados em rim de hamster de bebê (BHK-21) cultivado em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) mais 10% de soro bovino de vitelo (BCS). O crescimento viral foi também avaliado em LLC-MK2 (CCL-7, ATCC) mantido em Meio 199 mais 1% de soro de cavalo. Todas as células foram mantidas a 37°C e 5% de CO2 exceto para C6/36 que foi mantido a 28°C e 5% de CO2.

[0133] Conforme ilustrado na Fig. 2B, verificou-se que o tamanho das placas e o fenótipo eram semelhantes entre os vírus D2-syn e 16681. Os ensaios de placa para C6/36 e LLC-MK2 foram realizados separadamente e portanto não são comparáveis. A cinética de crescimento também foi encontrada como sendo semelhante, com D2-syn e 16681 alcançando títulos máximos de 1,3 x 107 PFU/mL e 5,5 x 106 PFU/mL respectivamente em células LLC-MK2 no Dia 7 e 6 x 107 PFU/mL e 5 x 107 PFU/mL respectivamente em células C6/36 no Dia 9, como mostrado na Fig. 2C. Assim, os fenótipos de crescimento do vírus de dengue de tipo selvagem sintético, "D2-syn", em células de macaco LLC-MK2 e mosquito C6/36, eram indistinguíveis daqueles da estirpe 16681 de sorotipo 2 de tipo selvagem natural.

[0134] Exemplo 3. Projeto e Construção de Vírus da Dengue de Códon de Par Desotimizado

[0135] Os quadros de leitura abertos de três proteínas de dengue, E, NS3 e NS5 foram recodificados independentemente pela reorganização de códons de dengue existentes, substituindo os pares de códons existentes (aceitáveis tanto em seres humanos como em insetos) com pares desfavoráveis em seres humanos e favoráveis em insetos. Estas recodificações, embora mudando os pares de códons, nem alteraram a sequência polipeptídica codificada, nem o uso do códon. As três proteínas de dengue selecionadas para recodificação, E, NS3 e NS5, desempenham papéis múltiplos no ciclo replicativo de DENV. A glicoproteína E funciona na ligação viral, entrada e fusão da membrana; NS3 é uma enzima multifuncional com atividade serina protease/helicase/NTPase; ENS5 é a RNA-polimerase RNA-dependente crucial para a replicação do genoma viral que também abrange a atividade da metiltransferase. As três ORFs recodificadas abrigam cada uma mais de 300 alterações de nucleotídeos e têm resultados de pares de códons humanos fortemente negativos, mas são semelhantes ao tipo selvagem em relação às pontuações de pares de códons de mosquito (Fig. 2A e Tabela 1). Cada um dos três segmentos recodificados foi sintetizado e clonado, separadamente, na síntese de tipo selvagem D2 para criar três novos vírus, referidos como Ehmin, NS3hmin, e NS5hmin, em que "hmin" significa uma pontuação de pares de códons minimizados humanos, enquanto a pontuação de pares de códons para mRNA de insetos é mantida.

[0136] Obtiveram-se os desenhos de CP-desotimizado (com CPB de tipo selvagem mantido) de E, NS3 e NS5 in silica por métodos de recozimento simulado semelhantes às implementações SAVE anteriormente relatadas (Coleman et al., 2008; Meuller et al., 2010). Em resumo, o recozimento simulado é uma busca heurística através de um espaço de solução de sequências genéticas que procuram encontrar uma boa solução como definida por uma determinada função heurística. Em contraste com trabalhos anteriores, aqui foram utilizados dois critérios para otimizar, nomeadamente minimizar a tendência de pares de códons de acordo com a tabela de tendência de pares de códons humanos, mantendo de perto a tendência de pares de códons de tipo selvagem de acordo com a tabela de insetos. As pontuações de pares de códons calculados (CPS) para todas as 3721 combinações possíveis de pares de códons (excluindo códons de Paragem) no ORFeome de inseto são mostradas na Tabela 1 Suplementar. As tendências de pares de códons humanos e de insetos são suficientemente diferentes para que muitas boas soluções aproximadas sejam possíveis.

[0137] Uma heurística de recozimento simulada foi implementada para projetar vírus de dengue sintéticos recodificados destinados a serem atenuados em seres humanos. Cada códon foi trocado com um códon sinônimo escolhido aleatoriamente com certa probabilidade de reter a alteração mesmo que um aumento na CPS ocorra durante a desotimização para se atingir um CPS mínimo global. Este processo foi iterado várias centenas de milhares de vezes em uma sequência particular. Se a alteração de códon é boa, a alteração é mantida, enquanto que se a alteração é ruim, pode ainda ser mantida, com uma probabilidade dependente de uma temperatura especificada (daí a analogia ao recozimento metalúrgico). Em um problema de otimização bicritério não trivial, a pontuação cumulativa de pares de códons foi minimizada de acordo com a tabela de polarização de pares de códons humanos, ao mesmo tempo que não permitia que a pontuação cumulativa de acordo com a tabela de insetos se desviasse demais. Combinando ambos os critérios em uma única função, min (a * humano_pontuação + b * abs (inseto_pontuação - inseto_pontuação_wt)c), onde a, b e c são coeficientes. Variando a, b e c, é possível controlar a importância de minimizar a pontuação humana (a), e limitar a variação da pontuação do inseto do tipo selvagem (b e c).

[0138] O processo de projeto de sequências também implica o controle da energia de dobra do RNA, evitando assim a formação de estruturas de RNA de ordem superior. TABELA 5. Tendência de Pares de Códons Recodificados E, NS3 e NS5 * região de codificação completa do genoma da dengue

[0139] Conforme mostrado na Tabela 5, as alterações na pontuação de CBP para E, NS3 e NS5 em relação ao sistema humano são altamente significativas, enquanto que as do mosquito são insignificantes. As diferenças na CPB entre os D2-syn sintéticos e 16681 DENVs de tipo selvagem para ambos os sistemas de mosquitos e humanos também foram negligenciáveis. Cada ORF (E, NS3, NS5) foi CP-desotimizada separadamente.

[0140] Foram utilizados fragmentos de DNA sintéticos contendo as sequências desotimizadas com CP e as sequências de tipo selvagem circundantes para substituir individualmente a sequência correspondente em D2- syn. As regiões de recodificação foram limitadas por localizações de sítios de restrição únicos manipulados no genoma D2-syn. Adicionalmente, não é conhecida a existência de nenhuma estrutura secundária de RNA importante na proliferação viral nestas regiões de codificação. O NS3hmin foi inserido num plasmídeo pUC57 de alta cópia e ligado a D2-syn para produzir vírus NS3hmin . No entanto, tanto os fragmentos Ehmin e NS5hmin foram altamente instáveis e, portanto, a inserção no vetor de cópia única pCC1BAC induzível foi feita. Além disso, a clonagem bem-sucedida de D2-syn-E de comprimento totalhmin e cDNA de D2-syn-NS5hmin foi realizado utilizando E. coli estirpe BD1528, que foi utilizada para amplificar de forma estável o cDNA de comprimento completo de um DENV4 altamente instável (Lai et al., 1991). cDNAs de alta qualidade foram então linearizados, in vitro transcritos e transfectados em células C6/36 de mosquito. A infectividade dos transcritos de RNA foi verificada por imunofluorescência indireta utilizando meios de cultura recolhidos da terceira ou quarta passagens cegas, 7 a 9 dias após a infecção. A precisão dos genotipos dos três vírus construídos (Ehmin, NS3Hmin e NS5Hmin) foi confirmada por sequenciação.

[0141] As sequências de tendência de par do códon descritas acima têm os seguintes números de adesão GenBank: D2-syn, KP161064; Ehmin, KP161065; NS3hmin, KP161066; e NS5hmin, KP161067.

[0142] Exemplo 4. Cinética de Crescimento do Vírus da Dengue de Tipo Selvagem e Recodificado

[0143] As infecções por DENV foram realizadas em meio de cultura com soro parcialmente esgotado à temperatura ambiente com balanço durante 1 hora (C6/36 em MEM + 2,5% PBS e BHK em DMEM + 2,5% FBS). Os meios de cultura para infecções por LLC-MK2 retinham soro de cavalo a 1%. Para o fenótipo cinética e placa de crescimento, LLC-MK2 ou C6/36 (cerca de 50-60% de confluência) foram infectados com DENV no MOI de 0,01 (exceto NS5hmin no MOI de 1) e sobrenadantes de amostras de células foram coletadas a cada 24 horas durante 9 dias e armazenadas a-80°C, com no máximo um ciclo de congelar/descongelar. As titulações de placas destas amostras foram realizadas em células BHK. Resumidamente, as infecções de uma série de diluição viral foram realizadas em PBS +1% FBS durante 2 horas à temperatura ambiente com balanço. Depois de 2 horas, sobreposição de agarose a 1% (com final 5% FBS e o meio Eagle modificado 1X) foi adicionado diretamente à células BHK infectadas crescidas a confluência de 60-90% em placas de 6-poços. As células foram incubadas a 37°C e 5% de CO2 durante 7 dias. No Dia 2, adicionou-se 1 mL de DMEM + 10% de BCS a cada poço para evitar a secagem. Após 7 dias, os tampões de agarose foram cuidadosamente extraídos e as células coradas com violeta de cristal durante a noite. Utilizou-se um método semelhante para FFAs em células A549, BHK, LLC-MK2 e Vero E6. As células C6/36 foram incubadas durante 7 d a 28°C, CO2 a 5%.

[0144] As células LLC-MK2 de macaco ou células C6/36 de mosquito cultivadas foram infectadas com D2-syn e os vírus desotimizados e a replicação viral foi seguida usando RT-PCR quantitativa (Figura 6B-C). Realizou-se RT-PCR quantitativa em culturas de células que foram infectadas separadamente com o vírus indicado a 0,01 MOI em cada linhagem celular. O RNA total foi extraído das células infectadas após congelamento-descongelamento. O RNA foi então amplificado usando o Kit de Amplificação de RNA LightCycler SYBR Verde I de uma etapa da Roche com um Sistema ABI StepOnePlus PCR em Tempo Real e um iniciador de ligação de dengue comum na região B NS4,

[0145] F7050-AATGGGTCTCGGGAAAGGATG

[0146] R7153-CTGCTGT G AG AGTT NA GGGGT A concentração de RNA de vírus foi quantificada utilizando uma curva padrão feita a partir de diluições em série de 10 vezes de uma concentração de transcrição de vírus determinada por espectrofotometria (NanoDrop). Quantidade de RNA de DENV em todos os pontos de tempo foi normalizada em relação ao ponto zero de tempo para cada curva de crescimento.

[0147] Como medido por RT-PCR quantitativo na linhagem de células C6/36, os três vírus humanos desotimizados Ehmin, NS3hmin, NS5hmin cresceram e com a mesma cinética como o vírus D2-syn (dia 3) (ver Fig. 6B), demonstrar que a replicação nas células de inseto se correlaciona com uma pontuação boa de par de códons para mosquitos. Em contraste, quando as células de primata (macaco rhesus) LLC-MK2 foram infectadas, os três vírus desotimizados de mamífero cresceram nitidamente menos bem do que o vírus D2-syn (Figura 6C). Além disso, o grau de atenuação era proporcional ao comprimento da região desotimizada (comparar Fig. 6C a 6A).

[0148] As células BHK de mamífero (rim de hamster bebê) também foram infectadas com D2-syn e os vírus desotimizados (hmin). Surpreendentemente, resultou em replicação robusta de todas as variantes desotimizadas (Fig. 6D). As células BHK, no entanto, têm um defeito na sinalização RIG-I (Habjan, et al., 2008), levando a um defeito tanto na produção de interferon como na resposta imune inata robusta. É mais provável devido a estas deficiências que as células BHK foram encontradas como sendo altamente sensíveis a infecções de dengue com a capacidade de produzir títulos virais relativamente elevados (Malewicz & Jenkin, 1979). Possivelmente, essas razões também explicam por que os três vírus humanos desativados cresceram bem neste tipo de célula. De fato, todas as quatro variantes de dengue deram placas relativamente claras e bem definidas em células BHK, permitindo-nos determinar títulos em unidades formadoras de placas (PFU).

[0149] A formação de placas em monocamadas de células BHK foi comparada utilizando vírus produzido por infecções de células C6/36 de inseto e células LLC-MK2 de macaco. Os resultados espelharam aqueles obtidos pelo ensaio quantitativo de RT-PCR, isto é, os três vírus desotimizados de mamífero foram especificamente atenuados em células LLC-MK2, em proporção ao comprimento da sequência desativada, mas comportaram-se como D2-syn e o tipo selvagem natural em células de inseto (Fig. 7A-F). Resultados adicionais sugerem que os vírus hmin também crescem de forma semelhante à D2-syn de tipo selvagem numa linhagem de células de mosquito diferente, Aag-2. Para estes três vírus hmin, a capacidade de formar um foco (sugerindo formação e dispersão de virion) também foi atenuada em pelo menos duas outras linhagens de células de mamífero, células Vero E6 e A549 (Figura 7G).

[0150] Exemplo 5. Os Vírus Recodificados São Atenuados em Camundongos Recém-Nascidos e Conferem Imunidade Protetora.

[0151] A dengue é uma doença de primatas, e nenhum outro bom modelo animal existe. No entanto, os mamíferos neonatais são mais suscetíveis às infecções que os mamíferos adultos. Camundongos recém-nascidos foram frequentemente utilizados para estudos de virulência viral para os quais não estavam disponíveis modelos animais adequados [por exemplo, vírus coxsackie (Dalldorf et al., 1949) ou DENV(Lai, et al., 2007; Kinney et al., 1997). Portanto, a análise das variantes dehmin D2-syn para atenuação foi realizada por injeção intracraniana em camundongos recém-nascidos ICR (camundongos e os seres humanos têm CPB quase idêntico; Fig. 4A).

[0152] Desafio Intracraniano de Camundongos Recém-Nascidos. Camundongos recém-nascidos, de 1 dia ou 2 dias de idade, endogâmicos de uma colônia foram desafiados intracranialmente em grupos de 5-12 dependendo do tamanho da ninhada com 104, 103, 102, 101, ou 100 PFU de cada vírus (D2-syn, EHmin, NS3Hmin, E NS5Hmin) diluída em 20 μL de PBS (Fig. 8). Os animais foram monitorizados diariamente para a mortalidade durante as 5 semanas após a infecção. A dose letal 50% (LD50) para cada vírus foi calculado usando o método de Reed e Muench (Reed e Muench, 1938). As curvas de sobrevivência Kaplan- Meier foram criadas usando GraphPad Prism versão 6.03 para Windows, Software GraphPad, La Jolla Califórnia EUA, www.graphpad.com. O D2-syn de tipo selvagem, foi altamente virulento nestes camundongos ICR neonatais, com um LD50 de 5 unidades de formação de placa (PFU). Observou-se uma atenuação dramática com os vírus desotimizados de pares de códons (Fig. 8A e B), revelando 100 vezes (NS3Hmin), 200 vezes (NS5Hmin) e aumentos de 2.000 vezes (Ehmin) em LD50 comparado com D2-syn (Fig. 8C).

[0153] Muitos dos camundongos recém-nascidos inoculados com 103 PFU de vírus desotimizados sobreviveram. Em 35 dias pós infecção, soros foram coletados e testados para anticorpos neutralizantes de vírus por um ensaio de50 PRNT modificado. Para os ensaios PRNT50 , os títulos virais foram medidos por ensaio de foco imune de D2-Syn na presença de diluições em série (1:20, 1:40, 1:80, 1: 160, ...) de soro recolhido a partir de sobreviventes de Ehmin, NS3hmin, ou NS5hmin como neonatos. Resumidamente, as infecções de células BHK foram realizadas por balanço à temperatura ambiente durante 30 minutos seguido de incubação a 37°C, 5% de CO2 durante 4 horas. Após a infecção, adicionou-se diretamente às células uma camada de goma de tragacanto a 1,2% constituída por concentração final de FBS a 1%, penicilina/estreptomicina 1x e 1X Meio Modificado de Eagle. As células foram incubadas durante 5 dias antes de serem fixadas em paraformaldeído a 2% e Metanol 50%: Acetona. Após a fixação, os focos de dengue foram desenvolvidos usando um anticorpo anti-dengue 2 IgG (4G2) primário de camundongo e IgG anti-camundongo de cabra conjugado com peroxidase de raiz-forte (HRP) e precipitando o substrato de Vector VIP HRP.

[0154] Surpreendentemente, medida pelo ensaio de50 de PRNT, todos os três vírus desotimizados induzida por níveis elevados de anticorpos neutralizantes em sobreviventes adultos (tabela 6). TABELA 6. Indução de anticorpos neutralizantes pelos vírus hmin

[0155] Os títulos são apresentados como o recíproco da diluição do soro (por exemplo, 500 indica uma diluição 1/500 do soro) ± SEM.

[0156] Uma vez que os camundongos adultos não são suscetíveis à infecção por DENV, se os anticorpos nestes adultos sobreviventes eram protetores não poderiam ser ensaiados diretamente. Para contornar este problema, as fêmeas "vacinadas" foram criadas após terem crescido até à maturidade, e seus filhos recém-nascidos (que receberam antisoros de suas mães) foram submetidos a outros desafios letais com D2-syn (sWT). A Tabela 7 mostra o resultado de uma dessas experiências. Recém-nascidos foram "vacinados" com NS3hmin. Quando estas fêmeas cresceram até a maturidade, tinham camadas de camundongos, e estes camundongos recém-nascidos foram desafiados com uma dose viral 200 vezes LD50 de D2-syn. Os camundongos foram observados diariamente quanto a morbidade (perda de peso) e mortalidade. Notavelmente, estes descendentes de mães que sobreviveram ao DENV intracraniano eram altamente resistentes à injeção intracraniana do vírus sintético de tipo selvagem (Tabela 7). TABELA 7. Indução de anticorpos protetores por NS3hmin

[0157] Isto demonstra que a injeção intracraniana com vírus atenuado induz anticorpos neutralizantes em camundongos recém-nascidos e após estes camundongos estes anticorpos podem ser transmitidos à prole e proteger contra DENV. A escolha da variante NS3hmin foi baseada em amostras de vírus disponíveis. Resultados com variantes Ehmin e NS5hmin apresentaram resultados semelhantes aos da variante NS3hmin .

[0158] Bums et al relataram em 2009 que a substituição na região codificadora do capsídeo de poliovírus com códons sinônicos não preferidos resultou em atenuação acentuada do vírus e atribuiu o principal mecanismo de atenuação a um aumento nas frequências dos pares dinucleotídicos CpG e UpA (Bums et al., 2009) do que mudanças na tendência do códon ou tendência do par de códons. Verificou-se que um aumento nas frequências de CpG e/ou UpA se correlaciona com um declínio na aptidão viral e ambos os dinucleotídeos são normalmente suprimidos não apenas nos genomas virais, mas nos genomas da maioria dos organismos vivos (Nussinov, 1984). De fato, foi bem documentado a partir de análises de vizinhos mais recentes realizadas no laboratório de Arthur Kornberg e continuadas por outros, o desvio da expectativa aleatória das ocorrências de ambos os duplos CpG nos genomas de vertebrados e UpA em todos os genomas (incluindo humanos, insetos, vírus de DNA/RNA) (Nussinov, 1984, Josse et al, 1961, Swartz et al, 1962, Jabbari & Bernardi, 2004). Especificamente relevante para DENV, CpG (enquanto esgotado em seres humanos) são observados com frequência prevista e não mostram tendência descendente em insetos, embora UpA estejam esgotados nos genomas de ambos os insetos e humanos (Simmen, 2008). Estas diferenças, particularmente as frequências de CpG, impõem pressões seletivas contrastantes sobre DENV e outros arbovírus que alternam a replicação em organismos vertebrados e de artrópodes (Lobo et al., 2009). Neste estudo, as frequências CpG e UpA dos vírus de dengue desotimizados com CP aumentaram, conforme mostrado na Tabela 8. Tanto a desotimização da tendência de pares de códons como a tendência de códons provavelmente resultariam em frequências aumentadas de pares de dinucleotídeos CpG e UpA, uma vez que estes dinucleotídeos são comuns em códons raros e são também mais comumente encontrados em códons em pares de códons raros. Este aumento foi inevitável e é muito difícil separar-se completamente das alterações no códon ou na tendência de par de códons. TABELA 8: Alterações nas frequências CpG e UpA *Número total de CpG e UpA no DENV 16681 de tipo selvagem é 233 e 439, respectivamente. Os números acima mostram aumentos CpG e UpA formados na junção dos códons (X3-Y1 para os dois códons,X1X2X3-Y 1Y2Y3) como resultado de CP-desotimização.

[0159] Podem ser encontrados mecanismos potenciais de atenuação como resultado da supra-representação CpG e UpA. A supressão de CpG é usualmente observada em genomas de metilação CpG, como os dos vertebrados (Bird, 1980), enquanto que organismos que não metilam o DNA, incluindo mosquitos, não apresentam depleção em CpG (Lobo et al., 2009). A metilação de citosinas, seguida de desaminação espontânea, resulta na formação de timinas, o que resulta em uma sobre-representação de TpG e CpA nos genomas, como observado (Jabbari & Bernardi, 2004). Outros mecanismos potenciais incluem estimulação do sistema imune inato por DNA não metilado (Dam & Kippenberger, 2008) e potenciais contrações estruturais de DNA/RNA (Shabalina et al., 2006). A depleção UpA, que é comum tanto a seres humanos como a insetos, foi proposta como resultado de uma baixa energia de empilhamento termodinâmica (Breslauer et al., 1986), a presença de Up A em sequências reguladoras tais como a caixa TAT A e o sinal de poliadenilação AA T AAA, bem como em dois dos três códons de paragem, UAA e UAG (a depleção poderia prevenir mutações sem sentido) (Karlin & Mrazek, 1997) e a ação de ribonucleases seletivas para UpA (Butler, E. et al., 1989).

[0160] É possível que estes aumentos nas frequências CpG e UpA contribuam para a atenuação observada nas células LLC-MK2 e nos camundongos recém-nascidos. O aumento das frequências de CpG no DENV desotimizado com CP não parece afetar a cinética de crescimento em células de inseto C6/36 ou nas células BHK com interferon defeituoso, como mostrado nas Figuras 6 e 7. Contudo, não está claro qual fenótipo um aumento nos dinucleotídeos CpG no sistema de insetos se manifestaria uma vez que a depleção de CpG não ocorre em mosquitos. Por outro lado, as UpAs estão esgotadas tanto em seres humanos como em insetos, mas um aumento nas frequências UpA não atenuou os vírus DENV em células C6/36 com os três vírus CP desotimizados crescendo de forma semelhante ao vírus de tipo selvagem e exibindo cinética de crescimento semelhante, como mostrado nas Figuras 6 e 7. Estes resultados sugerem que a atenuação observada, pelo menos em cultura celular, e provavelmente em camundongos foi um resultado da desotimização CP em vez de aumentos em frequências UpA.

[0161] Esses exemplos descrevem uma profunda diferença pela qual os insetos de Arthropoda e os mamíferos de Chordata, dois Phyla do reino animal, relacionados de forma distante, codificam o mRNA. Esta diferença é a preferência inesperada em células de inseto contra mamíferos para pares de códons sinônicos (tendência de pares de códons) que produzem fenótipos de expressão graves quando perturbados por recodificação em larga escala. Arbovírus que proliferam em células de ambos Phyla evoluíram para equilibrar com sucesso o par de códons parciais. Utilizando DENV como exemplo, estes exemplos mostram que o equilíbrio pode ser deslocado para polarização de insetos, atenuando assim o DENV em células de mamífero. Apesar da virulência atenuada, os vírus recodificados induziram níveis elevados de anticorpos neutralizantes em camundongos, e estes anticorpos foram protetores contra a doença. Recodificação pode ser adaptada permitindo diferentes graus de atenuação com pouca chance de reversão à virulência.

REFERÊNCIAS

[0162] Beutler, E., et al., Evolution of the genome and the genetic code: selection at the dinucleotide level by methylation and polyribonucleotide cleavage. Proc Natl Acad Sci US A, 1989. 86(1): 192-6.

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Claims

1. Vírus atenuado caracterizado por compreender um genoma viral possuindo uma ou mais sequências codificadoras de proteínas de vírus modificadas compreendendo uma pluralidade de códons sinônimos rearranjados, em que a tendência de pares de códons, em relação a um primeiro hospedeiro, da uma ou mais sequências codificadoras de proteína de vírus modificadas é/são menor(es) do que a tendência de pares de códons do ácido nucleico de origem da qual é derivado, e em que a tendência do par de códons da uma ou mais sequências codificadoras da proteína do vírus modificadas não é/são substancialmente reduzida(s) em relação à de um segundo hospedeiro, em que o primeiro hospedeiro é um vertebrado e o segundo hospedeiro é um artrópode, e em que o vírus é atenuado no primeiro hospedeiro, mas não atenuado no segundo hospedeiro.

2. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a tendência de pares de códons da uma ou mais sequências codificadoras de proteínas de vírus modificadas é/são reduzida(s) em relação ao primeiro hospedeiro em pelo menos 0,05, pelo menos 0,1, pelo menos 0,2, pelo menos 0,3 ou pelo menos 0,4.

3. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a tendência de pares de códons da uma ou mais sequências codificadoras de proteínas de vírus modificadas está(ão) na faixa de 0,002, 0,005, 0,010, 0,020 ou 0,050 do ácido nucleico de origem a partir do qual é derivado em relação ao segundo hospedeiro.

4. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a tendência de pares de códons da uma ou mais sequências codificadoras de proteína de vírus modificada é/são reduzida(s) em relação ao primeiro hospedeiro por rearranjo de códons do ácido nucleico de origem sem alterar substancialmente a utilização de códons.

5. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro hospedeiro é um mamífero.

6. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro hospedeiro é um ser humano.

7. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo hospedeiro é um inseto.

8. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o segundo hospedeiro é um mosquito.

9. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vírus é atenuado no primeiro hospedeiro, mas replica eficazmente no segundo hospedeiro e linhagens celulares derivadas do segundo hospedeiro.

10. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a tendência de pares de códons da uma ou mais sequências que codificam a proteína de vírus modificadas é/são aumentada(s) em relação ao segundo hospedeiro.

11. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vírus atenuado é um arbovírus.

12. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o arbovírus atenuado é selecionado a partir do grupo consistindo em Bunyaviridae, Flaviviridae, Reoviridae e Togaviridae.

13. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o vírus é um flavavírus.

14. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o vírus é um vírus da dengue.

15. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais sequências codificadoras de proteínas de vírus modificadas é/são derivada(s) de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência codificadora de proteína do vírus da dengue, ou uma porção da mesma, selecionada de um ou mais do grupo que consiste em C; prM; E; NS1; 2A; 2B; NS3; 4A; 4B, e NS5.

16. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a sequência codificadora de proteína do vírus modificada é derivada da sequência de ácido nucleico que codifica a glicoproteína estrutural E.

17. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a sequência codificadora de proteína do vírus modificada é derivada da sequência de ácido nucleico que codifica a protease multifuncional NS3.

18. Vírus atenuado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a sequência codificadora de proteína do vírus modificada é derivada da sequência de ácido nucleico que codifica a polimerase de RNA multifuncional NS5.

19. Composição de vacina para induzir uma resposta imune em um indivíduo caracterizada por compreender o vírus atenuado conforme definido na reivindicação 1.

20. Composição de vacina para induzir uma resposta imune em um indivíduo caracterizada por compreender o vírus da dengue atenuado, conforme definido na reivindicação 14, em que a resposta imune é contra um ou mais sorotipos de vírus da dengue selecionados do grupo consistindo em sorotipos de vírus da dengue 1 a 5.

21. Uso do vírus atenuado, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de uma composição de vacina para proteger um indivíduo contra uma infecção viral compreendendo a administração ao indivíduo da composição de vacina.

22. Uso do vírus atenuado, conforme definido na reivindicação 11, caracterizado por ser na preparação de uma composição de vacina para proteger um indivíduo contra uma infecção viral compreendendo a administração ao indivíduo da composição de vacina.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por a infecção viral ser uma infecção com um vírus de uma família selecionada do grupo que consiste em Bunyaviridae, Flaviviridae, Reoviridae e Togaviridae.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por a infecção viral ser uma infecção com um flavavírus.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por a infecção viral ser uma infecção com um vírus da dengue.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por a infecção viral ser uma infecção com um vírus selecionado do grupo que consiste em é o vírus da febre amarela, o vírus do Nilo Ocidental, o vírus chikungunya, o vírus da peste suína africana, o vírus da encefalite japonesa, o vírus da febre do Vale do Rift, o vírus da encefalite transmitida por carrapatos, o vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, o vírus de Bunyamwera, vírus da encefalite de Califórnia, vírus de Jamestown Canyon, encefalite de La Crosse, vírus da Toscana, vírus HRTV, vírus da doença da floresta de Kyasanur, vírus da encefalite de Murray Valley, vírus da encefalite de St. Louis, vírus da doença equina africana, vírus da doença da língua azul, vírus da encefalose equina, vírus banna, vírus da febre do carrapato do Colorado Coltivírus, vírus da encefalite equina oriental, vírus do rio Ross, vírus da encefalite equina venezuelana e vírus da encefalite equina ocidental.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por o indivíduo ter dengue, febre amarela ou doença da chikungunya.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o indivíduo ter febre da dengue autolimitante (DF), síndrome de choque de dengue (DSS) com risco de vida ou febre hemorrágica da dengue (DHF).