BR112020018188A2

BR112020018188A2 - flavivírus atenuados

Info

Publication number: BR112020018188A2
Application number: BR112020018188-9A
Authority: BR
Inventors: John Robert Coleman; Steffen Mueller; Ying Wang
Original assignee: Codagenix Inc.
Priority date: 2018-03-08
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2021-02-02
Also published as: SG11202008126QA; CN112040977A; EP3762021A4; PH12020551355A1; CA3091508A1; RU2020132280A; EP3762021A1; WO2019172982A1; US20210000939A1; AU2018411586A1

Abstract

  FLAVIVÍRUS ATENUADOS. A presente invenção fornece Flavivírus modificado, tal como um vírus Zika modificado. A modificação, de acordo com vários aspectos da invenção resulta em proteínas virais reduzidas em comparação a um vírus parental, em que a redução na expressão é o resultado de recodificar uma ou mais regiões do vírus. Por exemplo, a prM ou a região de envelope (E) ou a região de proteína não estrutural 3 (NS3) ou tanto a região E quanto a região NS3 podem ser recodificadas. Em várias modalidades, uma ou mais regiões são recodificadas reduzindo-se o viés de par de códons ou viés de uso de códon da sequência de codificação de proteína. Esses Flavivírus modificados são usados como composições de vacina para fornecer uma resposta imune protetora.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “FLAVIVÍRUS ATENUADOS” Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[001] O presente pedido reivindica a prioridade disposta sob o título 35 do U.S.C. §119(e) do pedido de patente provisório nº U.S. 62/640.355, depositado em 8 de março de 2018, cuja totalidade é incorporada no presente documento título de referência.

Campo da Invenção

[002] A presente invenção fornece Flavivírus altamente atenuados e, particularmente, vacinas contra vírus Zika. Os vírus atenuados e as vacinas se proliferam bem e têm fatores de alta segurança. Os vírus atenuados fornecem imunidade protetora do desafio pelo vírus da mesma linhagem, assim como proteção cruzada contra os vírus heterólogos.

Fundamentos da Invenção

[003] O vírus Zika (ZIKV) é um vírus de RNA senso positivo de fita simples que pertence à família Flaviviridae , no mesmo gênero (Flavivírus) que inclui vírus da dengue (DENV), vírus do Nilo Ocidental (WNV) e vírus da febre amarela (YFV). O vírus Zika está relacionado de maneira altamente filogenética ao DENV e compartilha um mosquito vetor comum, o Aedes aegypti, tanto com o vírus DENV quanto o vírus Chikungunya (um alfavírus). Embora tenha sido isolado primeiramente a partir de um macaco Rhesus sentinela na

Uganda em 1947, o ZIKV permaneceu bastante desconhecido até há alguns anos. Apesar da esporádica evidência da infecção em humanos na África (3) e Indonésia (4), o ZIKV não estava associado a nenhum grande surto ou epidemia até que surgiu primeiramente da ilha de Yap no Pacífico Sul onde, então, passou de ilha para ilha, se espalhando pela Polinésia e até o Sudeste Asiático. Em 2014 e 2015, o ZIKV se espalhou para as Américas. Recentemente, há transmissão ativa do ZIKV pela América Central e América do Sul, assim como nas ilhas Africanas do Cabo Verde e diversos territórios dos EUA, incluindo as Ilhas Virgens Americanas, Porto Rico e Samoa Americana. A infecção com ZIKV é normalmente branda com uma coceira, em que dores musculares e conjuntivite são os sintomas mais relatados. No entanto, uma questão de saúde pública é a associação da infecção por ZIKV com sequelas neurológicas (síndroma de Guillain-Barré) observadas na Polinésia Francesa e em casos de microcefalia no Brasil. Em um estado de caso-controle preliminar, até 30% dos fetos em mães infectadas exibiram microcefalia, dentre os quais alguns são fatais. Diferentemente dos vírus transmitidos por mosquito, o ZIKV pode ser uma transmissão vertical (da mãe para o feto) e uma possível transmissão horizontal (sexual).

A OMS declarou um estado de alarme à medida que o ZIKV continua a se espalhar “de maneira explosiva” pelas Américas.

Há uma preocupação especial com turistas que correm risco de se infectarem com ZIKV, com mais uma preocupação da importação e difusão da epidemia para lugares como o sul dos EUA. O vetor para o ZIKV, Aedes aegypti, é encontrado no sul dos EUA. O Aedes albopictus, o mosquito-tigre-asiático, também é competente para transmitir o ZIKV e foi implicado como um vetor para transmissão em Singapura. Caso o ZIKV entre em populações de A. albopictus nos EUA, terá um alcance imensamente expandido que se estende no centro-oeste e nordeste dos EUA.

[004] Consequentemente, ainda há uma necessidade na técnica de desenvolver uma vacina para impedir ou reduzir infecção.

[005] O desenvolvimento da vacina contra o Flavivírus é composto pelo fenômeno de Amplificação Dependente de Anticorpo (ADE). A ADE ocorre quando uma infecção anterior com um Flavivírus pré-dispõe um indivíduo a uma gravidade amplificada da doença mediante reinfecção com um serotipo diferente. Durante a ADE, os anticorpos contra o primeiro vírus se ligam ao segundo vírus, porém não o neutralizam, em contrapartida, aumentando sua infectividade. O ZIKV prevalece em países com endemia de DENV, desse modo, qualquer estratégia de vacinação precisa considerar o impacto em uma população com imunidade estabelecida contra dengue. Há evidência in vitro para amplificação cruzada de Flavivírus da infecção com ZIKV por soro imune contra dengue. Portanto, é importante que uma vacina anti-Zika inativada não predisponha o receptor da vacina à ADE de uma infecção por DENV subsequente. Em contrapartida, vale ressaltar que pessoas com imunidade DENV subjacente podem sofrer eventos adversos aumentados de uma vacina viva contra ZIKV, visto que sua imunidade contra DENV pode amplificar a infectividade da cepa da vacina contra ZIKV, o que leva a eventos adversos aumentados. Os dois são cenários plausíveis que precisam ser considerados durante a implantação de uma vacina contra ZIKV, seja vivam, inativada ou à base de carreador do tipo antígeno/VLP/cadeia principal.

Devido à alta probabilidade de amplificação da infecção por Flavivírus devido à ADE, todas as estratégias de desenvolvimento da nação devem considerar como qualquer vacina contra ZIKV precisa interagir com anticorpos existentes para um Flavivírus ou uma infecção por Flavivírus subsequente.

[006] O vírus Zika é um vírus que pertence ao sorogrupo Spondweni do Flavivírus transmitido por mosquito na família Flaviviridae. Os vírus Zika são vírus envelopados com um vírion icosaédrico compreendido das glicoproteínas C (Núcleo), M(Membrana) e E (Envelope) que tem 40 a 65 nanômetros de diâmetro. O genoma de vírus Zika é uma molécula de RNA positivo de fita simples com comprimento de 10.000 a

11.000 que codifica proteínas estruturais (C, prM, E) e não estruturais (NS1, NS2, NS3, NS4, e NS5). Os vírus Zika transcrevem e replicam seu genoma no citoplasma celular, com o genoma traduzido em um polipeptídeo único que é clivado e processado tanto por proteínas hospedeiras e quanto proteínas virais. O vírus Zika é um aumente emergente de preocupação internacional nos trópicos que foi dividido em linhagens africana e asiática, embora ambas as linhagens sejam bastante homólogas e ainda não há serotipo individual a ser identificado.

Sumário da Invenção

[007] [0007] As modalidades a seguir e aspectos das mesmas são descritos e ilustrados em combinação com composições e métodos que devem ser exemplificativos e ilustrativos, sem limitar o escopo.

[008] O presente documento afirma que os vírus Zika recodificados produzidos por modificação das regiões E e NS3 por grandes números de mutações de nucleotídeo sinônimos são altamente eficazes em fornecer imunidade protetora contra desafio letal do tipo selvagem e proteção cruzada contra diferentes linhagens. Além disso, os vírus têm perfis de segurança excepcionais.

[009] Desse modo, a invenção fornece um vírus Zika atenuado no qual a expressão de proteínas virais é reduzida por meio de desotimização de par de códons das regiões de codificação E e NS3. Em determinadas modalidades, E e NS3 são as únicas regiões de codificação de proteína do vírus tidas como alvo. Em outras modalidades da invenção, a expressão de uma ou mais outras regiões de codificação de proteína de vírus também pode ser reduzida, tal como, por exemplo, C, prM, NS1, NS2, NS4, ou NS5. Em determinadas modalidades, quando outra região de codificação de proteína do vírus Zika diferente da E e da NS3 é desotimizada, a redução é pequena em comparação à redução de E e NS3. De acordo com a invenção, a redução na expressão das proteínas de vírus da invenção é realizada por mudanças na sequência de codificação de proteína, por exemplo, diminuindo-se o viés de par de códons da sequência de codificação de proteína, substituindo-se códons raros, modificando-se o teor de G+C, modificando-se o teor dos nucleotídeos CG e/ou TA (ou UA) ou combinações. A expressão reduzida também pode ser obtida por modificações às sequências reguladoras das proteínas.

[010] Em tal modalidade, a redução do viés de par de códons pode compreender identificar um par de códons na sequência de codificação de proteína parental que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzida e reduzir os viés de par de códons substituindo-se o par de códons com a par de códons que tem uma pontuação de par de códons inferior. Em tal modalidade, a redução do viés de par de códons pode compreender redispor os códons de uma sequência de codificação de proteína parental. Em determinadas modalidades, a sequência de codificação de proteína E e a sequência de codificação de proteína NS3 têm individualmente um viés de par de códons inferior a −0,1 ou inferior a −0,2 ou inferior a −0,3 ou inferior a −0,4. O viés de par de códons de uma sequência de codificação de proteína (isto é, um quadro aberto de leitura) é calculado, conforme descrito no documento Coleman et al., 2000 e no presente documento.

[011] Em uma modalidade da invenção, a expressão tanto da sequência de codificação de proteína E quanto da sequência de codificação de proteína NS3, ou de cada uma dentre as mesmas, é reduzida substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos que são menos frequentes no hospedeiro.

[012] A invenção fornece adicionalmente uma composição de vacina contra Zika para induzir a resposta imune protetora em um indivíduo, em que a composição de vacina compreende vírus no qual a tradução viral é reduzida ao mesmo tempo que a identidade antigênica é mantida com vírus wt.

[013] A invenção também fornece um método para elicitar uma resposta imune protetora em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina que compreende um vírus Zika atenuado, em que a expressão das proteínas virais é reduzida. Em uma modalidade da invenção, é elicitada uma resposta imune que é eficaz contra o vírus Zika da mesma linhagem do vírus atenuado da vacina. Em outra modalidade, é elicitada uma resposta imune que é eficaz contra um vírus Zika heterólogo.

[014] A invenção também fornece um método para produzir um genoma do vírus Zika atenuado que compreende a) obter o nucleotídeo genômico b) recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope para reduzir a expressão e recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 para reduzir a expressão e substituir as sequências de nucleotídeos recodificadas em um genoma de vírus Zika para produzir um genoma do vírus Zika atenuado. Em determinadas modalidades, apenas as regiões E e NS3 são tidas como alvo. Em algumas modalidades, a expressão de outra proteína de vírus que codifica a região também é reduzida.

[015] A invenção também fornece um método para construir sequências de DNA do vírus Zika de molde para transcrição de genomas de RNA viral por polimerase T7 com o uso da PCR em sobreposição. Todos os genomas do Zika foram divididos em três fragmentos que começam da extremidade 5’ (fragmento 1: nt1-3596; fragmento 2: nt3030-6959 e fragmento 3: nt: extremidade nt6851) e quimicamente/bioquimicamente sintetizados. Em vez de construir um clone de cDNA infeccioso, uma estratégia de PCR de extensão de sobreposição inovadora (ou: estratégia de fusão com base em PCR longa) foi usada para obter genoma de Zika de comprimento total (ou: os genomas de Zika syn-wt e min simultaneamente).

[016] Várias modalidades da invenção fornecem um vírus Zika modificado no qual a expressão de proteínas virais é reduzida em comparação a um vírus parental, em que a redução na expressão é o resultado de recodificar a prM ou a região de envelope (E) ou uma região de proteína não estrutural 3 (NS3) ou tanto a região E quanto a região NS3.

[017] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, podem ser recodificadas reduzindo-se o viés de par de códons ou o viés de uso de códon da sequência de codificação de proteína. Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons pode compreender identificar um par de códons na sequência de codificação de proteína parental que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzida e reduzir os viés de par de códons substituindo-se o par de códons com a par de códons que tem uma pontuação de par de códons inferior. Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons pode compreender redispor os códons de uma sequência de codificação de proteína parental.

[018] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, podem ser recodificadas aumentando-se o número de dinucleotídeos CpG ou UpA em comparação a um vírus parental.

[019] Em várias modalidades, uma dentre a sequência de codificação de proteína prM/E recodificada e a sequência de codificação de proteína NS3 recodificada pode ter um viés de par de códons inferior a -0,05, −0,1 ou inferior a −0,2 ou inferior a −0,3 ou inferior a −0,4.

[020] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, podem ser recodificadas substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos que são menos frequentes no hospedeiro.

[021] Várias modalidades da invenção fornecem uma composição de vacina contra Zika para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo que compreende um vírus modificado do presente pedido as descrito no presente documento.

[022] Várias modalidades da invenção fornecem um método para elicitar uma resposta imune protetora em um indivíduo que compreende: administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina que compreende um vírus modificado do presente pedido, conforme descrito no presente documento.

[023] Em várias modalidades, o método pode compreender administrar adicionalmente ao indivíduo pelo menos um adjuvante.

[024] Em várias modalidades, a resposta imune oferece proteção cruzada contra um vírus Zika heterólogo.

[025] Várias modalidades da invenção fornecem um método para produzir um genoma de vírus Zika modificado que compreende: obter a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de envelope de um vírus Zika e a sequência de nucleotídeos que codificas proteínas não estruturais 3 de um vírus Zika; recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope a fim de reduzir expressão de proteína e recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 a fim de reduzir a expressão de proteína e substituir um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada em um genoma de vírus Zika parental para produzir um genoma de vírus Zika modificado; por meio de quê a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada são reduzidas em comparação ao vírus parental.

[026] Várias modalidades da invenção fornecem um

Flavivírus modificado no qual a expressão de proteínas virais é reduzida em comparação a um vírus parental, em que a redução na expressão é o resultado de recodificar a prM ou a região de envelope (E) ou uma região de proteína não estrutural 3 (NS3) ou tanto a região E quanto a região NS3.

[027] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, podem ser recodificadas reduzindo-se o viés de par de códons ou o viés de uso de códon da sequência de codificação de proteína.

[028] Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons pode compreender identificar um par de códons na sequência de codificação de proteína parental que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzida e reduzir os viés de par de códons substituindo-se o par de códons com a par de códons que tem uma pontuação de par de códons inferior.

[029] Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons pode compreender redispor os códons de uma sequência de codificação de proteína parental.

[030] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, podem ser recodificadas aumentando-se o número de dinucleotídeos CpG ou UpA em comparação a um vírus parental.

[031] Em várias modalidades, uma dentre a sequência de codificação de proteína prM/E recodificada e a sequência de codificação de proteína NS3 recodificada pode ter um viés de par de códons inferior a -0,05, −0,1 ou inferior a −0,2 ou inferior a −0,3 ou inferior a −0,4.

[032] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, podem ser recodificadas substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos que são menos frequentes no hospedeiro viral.

[033] Em várias modalidades, o vírus parental pode ser um Flavivírus selecionado a partir do grupo que consiste em vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, vírus da encefalite japonesa, vírus Spondweni, vírus da encefalite Saint Louis, e vírus Powassan. Em várias modalidades, o vírus parental pode ser um isolado natural.

Em várias modalidades, o vírus parental pode ser um mutante de um isolado natural.

[034] Várias modalidades da invenção fornecem uma composição de vacina contra Flavivírus para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo, que compreende um vírus modificado da presente invenção, conforme descrito no presente documento.

[035] Várias modalidades da invenção fornecem um método para elicitar uma resposta imune protetora em um indivíduo que compreende: administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina que compreende um vírus modificado da presente invenção, conforme descrito no presente documento. Em várias modalidades, o método pode compreender administrar adicionalmente ao indivíduo pelo menos um adjuvante.

[036] Em várias modalidades, a resposta imune pode ser de proteção cruzada contra um vírus heterólogo Flavivírus.

[037] Várias modalidades da presente invenção fornecem um método para produzir um genoma de vírus Flavivírus modificado que compreende: obter a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de envelope de um vírus Flavivírus e a sequência de nucleotídeos que codificas proteínas não estruturais 3 de um vírus Flavivírus; recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope a fim de reduzir expressão de proteína e recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 a fim de reduzir a expressão de proteína e substituir um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada em um genoma de vírus Flavivírus parental para produzir um genoma de vírus Flavivírus modificado; por meio de quê a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada são reduzidas em comparação ao vírus parental.

[038] Várias modalidades da presente invenção fornecem um método para elicitar uma resposta imune em um indivíduo com necessidade da mesma que compreende: administrar uma dose inicial de um Flavivírus atenuado produzido por um método que não seja desotimização de par de códons ou um Flavivírus modificado no qual a expressão de proteínas virais é reduzida em comparação a um vírus parental, em que a redução na expressão é o resultado de recodificar a prM ou a região de envelope (E) ou a região de proteína não estrutural 3 (NS3) ou tanto da região E quanto da região NS3; e administrar uma ou mais doses de reforço do Flavivírus atenuado por métodos que não sejam desotimização de par de códons ou do Flavivírus modificado ao indivíduo com necessidade da mesma, em que pelo menos a dose inicial ou a uma ou mais doses de reforço é o vírus modificado.

[039] Em várias modalidades, uma primeira dentre a uma ou mais doses de reforço pode ser administrada cerca de 2 semanas após a dose inicial.

[040] Em várias modalidades, o Flavivírus pode ser um vírus Zika.

[041] Em várias modalidades, o Flavivírus pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, vírus da encefalite japonesa, vírus Spondweni, vírus da encefalite Saint Louis, e vírus Powassan.

[042] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, podem ser recodificadas reduzindo-se o viés de par de códons ou o viés de uso de códon da sequência de codificação de proteína.

[043] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, podem ser recodificadas aumentando-se o número de dinucleotídeos CpG ou UpA em comparação a um vírus parental.

[044] Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons pode compreender identificar um par de códons na sequência de codificação de proteína parental que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzida e reduzir os viés de par de códons substituindo-se o par de códons com a par de códons que tem uma pontuação de par de códons inferior.

[045] Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons pode compreender redispor os códons de uma sequência de codificação de proteína parental.

[046] Em várias modalidades, uma dentre a sequência de codificação de proteína prM/E recodificada e a sequência de codificação de proteína NS3 recodificada pode ter um viés de par de códons inferior a -0,05, −0,1 ou inferior a −0,2 ou inferior a −0,3 ou inferior a −0,4.

[047] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, podem ser recodificadas substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos que são menos frequentes no hospedeiro viral.

[048] [0009] Outros recursos e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da descrição detalhada, obtida em combinação com os desenhos anexos, que ilustram, a título de exemplo, vários recursos de modalidades da invenção Breve Descrição das Figuras

[049] As Figuras 1A a 1B retratam a Construção Rápida de seis candidatos de vacina viva atenuada contra o Zika, desotimizado por SAVE, em menos de 1 mês com crescimento em células Vero sob condições livres de componente animal. (1A) Viés de par de códons dos genes prM/E e NS3 do Zika e seus equivalentes desotimizados por SAVE em relação ao ORFeoma humano. O viés de par de códons (CPB) é expresso como a’ pontuação média do par de códons do quadro aberto de leitura (ORF) de um determinado gene. o valor CPB positivo e negativo significa a predominância de pares de códons estatisticamente sobre ou sub-representados, respectivamente em um ORF. Os círculos vermelhos indicam o CPB de cada um dentre os 14.795 ORFs humanos, o que representa a maioria dos genes humanos anotados conhecidos no momento da presente análise (ORFeoma). O CPB dos genes do tipo selvagem prM/E e NS3 são abrangidos pela faixa normal de genes de célula hospedeira humana. Após a “desotimização” de par de códons por meio de SAVE, os segmentos gênicos prM/E e NS3 desotimizados resultantes foram codificados predominantemente por pares de códons humanos sub- representados como evidentes por seu CPB extremamente negativo e são consideravelmente diferentes de qualquer gene humano. (1B) Genomas de cDNA do tipo selvagem e variantes de vacina contra Zika quimérico desotimizado sinteticamente. O prM/E e NS3 sintético desotimizado por SAVE da Figura 1A foram sintetizados de novo e com o uso de PCR em sobreposição subclonadas individualmente nos genomas WT PR15 ou MR766 - rendendo seis genomas de cDNA independentes que contêm, cada um, um fragmento “desotimizado” (ou fragmentos “desotimizados”). Os genomas de cDNA infeccioso para PR15 e MR766 wt foram construídos em 7 dias e, em seguida, o vírus replicante completamente infeccioso foi recuperado para os seis candidatos de vacina contra ZIKV desotimizado em 27 dias por meio de transfecção de RNA em células Vero ou BHK.

[050] A Figura 2 mostra um diagrama de estratégias de subclonagem para diminuir atenuação ou aumentar a imunogenicidade reduzindo-se o comprimento da sequência desotimizada na região de codificação de prM + E. A segunda geração dos candidatos de vacina contra Zika alavanca a flexibilidade da plataforma SAVE para reduzir a região desotimizada de 2.014 bp (E-min) para 997 bp (W-E-Min) ou até mesmo para 664 bp (W-W-E-Min), ao mesmo tempo que a sequência de aminoácidos seja mantida 100% idêntica.

[051] A Figura 3 retrata o crescimento de candidatos de vacina contra Zika em células Vero sob condições livres de componente animal. As 6 cepas da vacina contra Zika foram usadas para infectar células Vero sob condições livres de componente animal a uma MOI de 0,1. Dentre as seis cepas, quatro cresceram até titulações detectáveis em células Vero sob essas condições. MR766-Emin cresceu até uma titulação de pico de 5x107 PFU/ml após cinco dias e PR15-EhMin, até uma titulação de pico de 5x106 PFU/ml após 5 dias em células Vero proliferadas em condições livres de animal.

[052] A Figura 4 retrata a neuroatenuação de MR766- EMin em células neuronais humanas. As linhagens de células neuronais humanas HTB-14 e HTB-15 que foram usadas anteriormente para caracterizar o tropismo da célula do vírus Zika wt no cérebro humano em desenvolvimento foram infectadas a uma MOI de 0,1 e 4 dias após infecção, o vírus replicante foi titulado em células BHK, com crescimento de MR766 wt até altas titulações (5 x 107 PFU/ml para HTB-14 e 8 x 105 PFU/ml para HTB-15. O candidato principal, MR766 E-Min, foi atenuado aproximadamente 10.000 vezes tanto nessas linhagens celulares, indicando um alto nível de neuroatenuação em células humanas.

[053] A Figura 5 retrata redução de da expressão de proteína e de RNA em células infectadas com ZIKV. Western blot foi usado para medir a expressão de glicoproteína de envelope em células Vero infectadas por E-Min (min) e variante do tipo selvagem (WT) das cepas PRVABC59 e MR766 do ZIKV após serem incubadas por 24 horas a 33 °C. Em ambas as cepas de ZIKV, a expressão de glicoproteína de envelope foi consideravelmente reduzida para as variantes E-Min.

[054] A Figura 6 retrata fenótipos de vírus em camundongos infectados. Atenuação dos candidatos SAVE à vacina contra ZIKV em camundongos AG129. Os camundongos AG129 foram injetados ou com: i) vírus MR766 e vírus PR15 do tipo selvagem derivados sinteticamente a uma dose de 102 (controle positivo); ii) ou uma dose de 104 ou 102 PFU dos candidatos de vacina PR15 E-Min ou MR766 E-Min e NS3-Min; iii) uma dose única de 104 dos candidatos de vacina PR15 NS3+E-Min; todos entregues em 100 µl por via subcutânea. Os camundongos injetados foram examinados quanto à mortalidade e morbidade (perda de peso). Todos os camundongos inoculados com 102 vírus wt e 80% dos camundongos inoculados com 104 MR766-NS3-

Min sucumbido à infecção. Todos os outros camundongos sobreviveram incluindo todos os camundongos vacinados com 104 PFU do candidato principal MR 766 E-Min e nenhum exibiu nenhuma perda de peso.

[055] A Figura 7 retrata que candidatos de vacina contra ZIKV atenuado por SAVE induzem altos níveis de anticorpos neutralizantes e são protegidos contra desafio letal em camundongos AG129. A) Anticorpos Anti-PR15 Zika após uma dose única. O soro de animais vacinados foi colhido no dia 28, e os anticorpos foram quantificados contra a cepa ZIKV Puerto Rico 2015 PRVABC-59 por meio de ensaio PRNT50 em células Vero. Os camundongos vacinados tanto com PR15 E-Min quanto MR766 E-Min na dose 104 desenvolveram altos níveis de anticorpos neutralizantes (2,8 log10 PRNT50).

[056] A Figura 8 retrata a sobrevivência após o desafio de ZIKV letal. Os camundongos AG129 foram vacinados no dia 28 e reforçados no Dia 49. Em seguida, os camundongos foram desafiados com uma dose letal (102.3 CCID50/animal) do vírus ZIKV PR15 PRVABC59 Wt em 0,1 ml entregue s.c. A vacinação foi bem-sucedida na prevenção e na redução da mortalidade e perda de peso (não mostrada) em comparação aos controles não vacinados. Os camundongos vacinados candidatos principais MR 766 E-Min, PR-15-EMin e MR766 NS3-Min estavam todos protegidos a uma dose de 104 PFU.

[057] A Figura 9 retrata a imunogenicidade da vacinação E-W/Min em macacos-Cinomolgo. Os macacos seronegativos para vírus Zika foram vacinados ou com 105 ou 107 unidades formadoras de placa (PFU) ou E-W/Min entregues por via subcutânea em um volume de 0,5 ml. Animais com vacinação simulada receberam injeção de 0,5 ml do diluente de vacina. Os macacos foram vacinados inicialmente no dia 0 e, em seguida, reforçados no dia 28. As amostras de soro foram coletadas nos dias 0, 14, 21, 28 e 50 e testadas para neutralizar atividade contra cepa ZIKV do tipo selvagem MR766 com o uso de um ensaio de neutralização da redução de foco a 50% (FRNT50) em células Vero. Constatou-se que a vacinação com 107 PFU E-W/Min é superior ao candidato de vacina contra ZIKV inativada NIH após a primeira vacinação e comparável após o reforço. A menor dose de 105 PFU também foi eficaz em disparar os anticorpos neutralizantes. Todos os animais vacinados com E-W/Min foram seroconvertidos próximo do dia 14 após a vacinação.

[058] A Figura 10 retrata a imunogenicidade da vacinação E-W/Min em macacos-Cinomolgo. Os macacos seronegativos para vírus Zika foram vacinados ou com 105 ou 107 unidades formadoras de placa (PFU) ou E-W/W/Min entregues por via subcutânea em um volume de 0,5 ml. Animais com vacinação simulada receberam injeção de 0,5 ml do diluente de vacina. Os macacos foram vacinados inicialmente no dia 0 e, em seguida, reforçados no dia 28. As amostras de soro foram coletadas nos dias 0, 14, 21, 28 e 50 e testadas para neutralizar atividade contra cepa ZIKV do tipo selvagem MR766 com o uso de um ensaio de neutralização da redução de foco a 50% (FRNT50) em células Vero. Constatou-se que a vacinação com 107 ou 105 PFU E-W/W/Min é superior ao candidato de vacina contra ZIKV inativada NIH após a primeira vacinação e as duas doses dispararam níveis comparáveis de anticorpos neutralizantes. Todos os animais vacinados com E-W/Min foram seroconvertidos próximo do dia 14 após a vacinação. Nenhum aumento na titulação de FRNT50 foi observado após o reforço no dia 28, o que indica a imunidade de esterilização que impediu que a infecção secundária disparasse uma resposta anamnéstica. Isso indica adicionalmente que uma dose única relativamente baixa de W-W-E-Min pode ser suficiente para disparar altos níveis (≥1,028 FRNT50).

Descrição Detalhada

[059] A presente invenção se refere à produção de vírus Zika atenuados que pode ser usado para proteção contra infecção e doença viral. Uma premissa básica na vacinação é a entrega adequada de antígenos protetores para receptores da vacina, presumindo que uma dose muito alta (“Peptídeo ou Peptídeo tipo Vírus”) ou uma dose correspondente à infecção viral viva (“ChimeriVax”) desses polipeptídeos antigênicos tradicionalmente dominantes isoladamente são suficientes para eficácia adequada da vacina. Apesar dessas expectativas, a presente invenção se beneficia de uma abordagem contrária. A invenção fornece vírus Zika atenuados nos quais expressão de proteínas virais é reduzida, que têm excelentes propriedades de crescimento úteis para a produção de vacina e também possuem um perfil de segurança extraordinário e características de proteção amplificadas.

Os vírus atenuados se proliferam quase tão bem quanto o vírus do tipo selvagem, têm fenótipos atenuados intensamente, conforme revelado pelos valores LD50 , são normalmente eficazes no fornecimento de imunidade protetora contra desafio pelo vírus Zika da mesma cepa e também fornece imunidade protetora contra o desafio pelo vírus Zika de outras cepas.

[060] Em determinadas modalidades da invenção, os vírus Zika atenuados da invenção compreendem uma região de codificação de pré-membrana/Envelope(E) recodificada, uma região de codificação da proteína não estrutural 3 (NS3) recodificada, ou tanto a região de codificação de E quanto a região de codificação de NS3. O fato de que as regiões de codificação de proteínas C, NS1, NS2, NS4 ou NS5 não são recodificadas não exclui mutações e outras variações nessas sequências, porém significa apenas que quaisquer mutações ou variações feitas nessas sequências têm pouco ou nenhum efeito na atenuação. Pouco ou nenhum efeito na atenuação inclui um dentre ou ambos os itens seguintes: 1) As mutações ou variações no fato de que as regiões de codificação de C, NS1, NS2, NS4 ou NS5 não reduzem a replicação viral ou infectividade viral em mais que 20% quando a região de codificação de C, NS1, NS2, NS4 ou NS5 variante é a única variante em um vírus Zika teste; 2) as mutações ou variações em qualquer uma das regiões de codificação de C, NS1, NS2, NS4 ou NS5 representam menos de 10% dos nucleotídeos nessa sequências de codificação.

[061] Os vírus da invenção são altamente atenuados.

Nas modalidades da invenção, em comparação ao tipo selvagem, os vírus são atenuados pelo menos 5.000 vezes ou atenuados pelo menos 10.000 vezes. ou atenuados pelo menos 20.000 vezes. ou atenuados pelo menos 33.000 vezes. ou atenuados pelo menos 50.000 vezes, ou atenuados pelo menos 100.000 vezes no modelo de camundongo AG129 em comparação a um vírus do tipo selvagem que tem proteínas da mesma sequência, porém codificado por uma sequência de nucleotídeos diferente.

[062] Os vírus atenuados também são altamente protetores contra o vírus do tipo selvagem da mesma cepa.

Nas modalidades da invenção, a dose protetora (PD50) dos vírus é inferior a 1.000 PFU, ou inferior a 100 PFU, ou inferior a 50 PFU, ou inferior a 20 PFU, ou inferior a 10 PFU, ou inferior a 5 PFU, quando medida por um modelo de camundongo, conforme exemplificado no presente documento.

[063] Os vírus atenuados da invenção também exibem uma margem grande de segurança (isto é, a diferença entre LD50 e PD50), portanto, têm altos fatores de segurança, definido no presente, como a razão de LD50/PD50. Em determinadas modalidades da invenção, o fato de segurança é pelo menos 102, ou pelo menos 103, ou pelo menos 104, ou pelo menos 105, ou pelo menos 2×105, ou pelo menos 5×105, ou pelo menos 106, ou pelo menos 2×106, ou pelo menos 5×106. Em determinadas modalidades, o fator de segurança é de 102 a 103, ou de 103 a 104, ou de 104 a 105, ou de 105 a 106.

[064] Os vírus atenuados da invenção também são altamente protetores contra cepas heterólogas do vírus Zika.

Em determinadas modalidades da invenção, a dose protetora (PD50) de um vírus atenuado da invenção é inferior a 1.000 PFU, ou inferior a 500 PFU, ou inferior a 200 PFU, ou inferior a 100 PFU, quando medidos por um modelo de camundongo, conforme exemplificado no presente documento.

[065] A recodificação de sequências de codificação de proteínas E e NS3 dos vírus atenuados da invenção pode ter sido feita utilizando qualquer algoritmo ou procedimento conhecido na técnica ou criado recentemente para recodificar uma sequência de codificação de proteína. De acordo com a invenção, substituições de nucleotídeo são submetidas à engenharia em múltiplas localizações nas sequências de codificação de E e NS3, em que as substituições introduzem uma pluralidade de códons sinônimos no genoma. Em determinadas modalidades, as substituições de códon sinônimo alteram o viés de códon, viés de par de códons, a densidade de códons não frequentes ou pares de códons de ocorrência não frequente, estrutura secundária de RNA, teor de dinucleotídeo CG e/ou TA (ou UA), teor de C+G, sítios de deslocamento de quatro de tradução, sítios de pausa de tradução, a presença ou ausência de sequências de reconhecimento de microRNA ou qualquer combinação dos mesmos, no genoma. As substituições de códon podem ser submetidas à engenharia em múltiplas localizações distribuídas ao longo das sequências de codificação de E e NS3 ou nas múltiplas localizações limitadas a uma porção das sequências de codificação de E e NS3. Devido ao grande número de defeitos (isto é, substituições de nucleotídeo) envolvidos, a invenção fornece um meio para produzir vírus estavelmente atenuados e vacinas vivas.

[066] Conforme mais discutido a seguir, em algumas modalidades, uma sequência de codificação de vírus é recodificada substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos usados menos frequentemente no hospedeiro com Zika (por exemplo, seres humanos, mosquitos). Em algumas modalidades, uma sequência de codificação de vírus é recodificada substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos usados menos frequentemente no vírus Zika. Em determinadas modalidades, o número de códons substituídos por códons sinônimos é pelo menos 5. Em algumas modalidades, pelo menos 10, ou pelo menos 20 códons são substituídos por códons sinônimos.

[067] Em algumas modalidades, os vírus pares de códons são recodificados para reduzir (isto é, diminuir o valor) do viés de par de códons. Em determinadas modalidades, o viés de par de códons é reduzido identificando-se um par de códons em uma sequência de codificação de E ou NS3 que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzido e reduzindo-se o viés de par de códons substituindo-se o par de códons por um par de códons que tem uma pontuação de par de códons inferior. Em algumas modalidades, essa substituição de pares de códons assume a forma da redisposição dos códons existentes de uma sequência. Em algumas dessas modalidades, um subconjunto de pares de códons é substituído redispondo-se um subconjunto de códons sinônimos. Em outras modalidades, os pares de códons são substituídos maximizando-se o número de códons sinônimos redispostos. Verifica-se que embora a redisposição de códons faça com que o viés de par de códons seja reduzido (se torne mais negativo) para a sequência de codificação de vírus geral, e a redisposição resulta em CPS diminuída em muitas localizações, pode haver aumentos de CPS acompanhantes em outras localizações, porém em média, as pontuações de par de códons e, logo, o CPB da sequências modificada, é reduzido.

Em algumas modalidades, a recodificação de códons ou pares de códons pode considerar a alteração do teor G+C das sequências de codificação de E e NS3. Em algumas modalidades, a recodificação de códons ou pares de códons podem considerar a alteração da frequência de dinucleotídeos CG e/ou TA nas sequências de codificação de E e NS3.

[068] Em determinadas modalidades, a sequência de codificação de proteína E recodificada tem um viés de par de códons inferior a −0,1, ou inferior a −0,2, ou inferior a −0,3, ou inferior a −0,4. Em determinadas modalidades, a sequência de codificação de proteína NS3 recodificada (isto é, expressão reduzida) tem um viés de par de códons inferior a −0,1, ou inferior a −0,2, ou inferior a −0,3, ou inferior a −0,4. Em determinadas modalidades, o viés de par de códons da sequência de codificação de proteína HA recodificada é reduzido em pelo menos 0,1, ou pelo menos 0,2, ou pelo menos 0,3, ou pelo menos 0,4, em comparação à sequência de codificação de proteína E parental da qual derivado. Em determinadas modalidades, o viés de par de códons da sequência de codificação de proteína NS3 recodificada é reduzido em pelo menos 0,1, ou pelo menos 0,2, ou pelo menos 0,3, ou pelo menos 0,4, em comparação à sequência de codificação de proteína E parental da qual derivado. Em determinadas modalidades, a redisposição dos códons sinônimos da sequência de codificação de proteína E fornece um viés de par de códons redução de pelo menos 0,1, ou pelo menos 0,2, ou pelo menos 0,3, ou pelo menos 0,4, a sequência de codificação de proteína E parental da qual é derivado. Em determinadas modalidades, a redisposição dos códons sinônimos da sequência de codificação de proteína NS3 fornece um viés de par de códons redução de pelo menos 0,1, ou pelo menos 0,2, ou pelo menos 0,3, ou pelo menos 0,4, a sequência de codificação de proteína NS3 parental da qual é derivado.

[069] Normalmente, essas substituições e alterações são feitas e reduzem a expressão das proteínas de vírus codificadas sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína codificada. Em determinadas modalidades, a invenção também inclui alterações nas sequências de codificação de E e/ou NS3 que resultam na substituição de códons não sinônimos e nas substituições de aminoácidos na proteína codificada, que podem ou não ser conservativas.

[070] A maioria dos aminoácidos são codificados por mais de um códon. Consultar o código genético na Tabela 1.

Por exemplo, alanina é codificada por GCU, GCC, GCA e GCG.

Três aminoácidos (Leu, Ser e Arg) são codificados por seis códons diferentes, ao passo que apenas Trp e Met tenham códons exclusivos. Os códons “sinônimos” são códons que codificam os mesmos aminoácidos. Desse modo, por exemplo, CUU, CUC, CUA, CUG, UUA, e UUG são códons sinônimos que codificam Leu. Códons sinônimos não são usados com a mesma frequência. De modo geral, os códons usados mais frequentemente em um organismo particular são aqueles para os quais o tRNA cognato é abundante, e o uso desses códons amplifica a taxa e/ou precisão da tradução da proteína. Em contrapartida, os tRNAs para os códons raramente usados são encontrados em níveis relativamente baixos, considera-se que o uso de códons raros reduz a taxa e/ou precisão da tradução.

Tabela 1. Código Genético

U C A G U Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser STOP STOP A Leu Ser STOP Trp G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G A Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G a O primeiro nucleotídeo em cada códon que codifica um aminoácido particular é mostrado na coluna à mais esquerda; o segundo nucleotídeo é mostrado na fileira superior; e o terceiro nucleotídeo é mostrado na coluna mais à direita.

Viés de Códon

[071] Conforme no presente documento, um códon "raro” é um dentre pelo menos dois códons sinônimos que codifica um aminoácido particular que está presente em um mRNA a uma frequência significativamente inferior ao códon usado mais frequentemente para esse aminoácido.

Desse modo,

o códon raro pode estar presentes em uma frequência aproximadamente 2 vezes inferior ao códon usado mais frequentemente.

De preferência, o códon raro está presente pelo menos em uma frequência pelo menos 3 vezes, com mais preferência, pelo menos 5 vezes, menor que o códon usado mais frequentemente para o aminoácido.

Em contrapartida, um códon “frequente” é um dentre pelo menos dois códons sinônimos que codificam um aminoácido particular que está presente em um mRNA em uma frequência significativamente superior ao códon usado menos frequentemente para esse aminoácido.

O códon frequente pode estar presente em uma frequência de cerca de 2 vezes, de preferência, pelo menos

3 vezes, com mais preferência, pelo menos 5 vezes, superior ao códon usado menos frequentemente para o aminoácido.

Por exemplo, os genes humanos usam o códon de leucina CTG 40% do tempo, porém usam o CTA sinônimo apenas 7% do tempo

(consultar Tabela 2). Desse modo, o CTG é um códon frequente,

ao passo que o CTA é um códon raro.

Aproximadamente consistente com essas frequências de uso, há 6 cópias no genoma para o gene para o tRNA que reconhece o CTG, ao passo que há apenas 2 cópias do gene para o tRNA que reconhece

CTA.

De modo semelhante, genes humanos usam os códons frequentes TCT e TCC para serina 18% e 22% do tempo, respectivamente, porém o códon raro TCG apenas 5% do tempo.

TCT e TCC são lidos, por meio de pareamento oscilante, pelo mesmo tRNA, que tem 10 cópias de seu gene no genoma, ao passo que TCG é lido por um tRNA com apenas 4 cópias. Sabe-se que esses mRNAs, que são traduzidos muito ativamente, são fortemente enviesados a usar apenas os códons mais frequentes. Isso inclui genes para proteínas ribossomais e enzimas glicolíticas. Por outro lado, os mRNAs para proteínas não abundantes podem ser usar os códons raros.

Tabela 2. Uso do Códon em Homo Sapiens (Fonte: www.kazusa.ou.jp/códon/) Aminoácido Códon Número /1000 Fração Gly GGG 636457,00 16,45 0,25 Gly GGA 637120,00 16,47 0,25 Gly GGT 416131,00 10,76 0,16 Gly GGC 862557,00 22,29 0,34 Glu GAG 1532589,00 39,61 0,58 Glu GAA 1116000,00 28,84 0,42 Asp GAT 842504,00 21,78 0,46 Asp GAC 973377,00 25,16 0,54 Val GTG 1091853,00 28,22 0,46 Val GTA 273515,00 7,07 0,12 Val GTT 426252,00 11,02 0,18 Val GTC 562086,00 14,53 0,24 Ala GCG 286975,00 7,42 0,11 Ala GCA 614754,00 15,89 0,23 Ala GCT 715079,00 18,48 0,27 Ala GCC 1079491,00 27,90 0,40 Arg AGG 461676,00 11,93 0,21 Arg AGA 466435,00 12,06 0,21 Ser AGT 469641,00 12,14 0,15 Ser AGC 753597,00 19,48 0,24 Lys AAG 1236148,00 31,95 0,57 Lys AAA 940312,00 24,30 0,43 Asn AAT 653566,00 16,89 0,47

Asn AAC 739007,00 19,10 0,53 Met ATG 853648,00 22,06 1,00 Ile ATA 288118,00 7,45 0,17 Ile ATT 615699,00 15,91 0,36 Ile ATC 808306,00 20,89 0,47 Thr ACG 234532,00 6,06 0,11 Thr ACA 580580,00 15,01 0,28 Thr ACT 506277,00 13,09 0,25 Thr ACC 732313,00 18,93 0,36 Trp TGG 510256,00 13,19 1,00 End TGA 59528,00 1,54 0,47 Cys TGT 407020,00 10,52 0,45 Cys TGC 487907,00 12,61 0,55 End TAG 30104,00 0,78 0,24 End TAA 38222,00 0,99 0,30 Tyr TAT 470083,00 12,15 0,44 Tyr TAC 592163,00 15,30 0,56 Leu TTG 498920,00 12,89 0,13 Leu TTA 294684,00 7,62 0,08 Phe TTT 676381,00 17,48 0,46 Phe TTC 789374,00 20,40 0,54 Ser TCG 171428,00 4,43 0,05 Ser TCA 471469,00 12,19 0,15 Ser TCT 585967,00 15,14 0,19 Ser TCC 684663,00 17,70 0,22 Arg CGG 443753,00 11,47 0,20 Arg CGA 239573,00 6,19 0,11 Arg CGT 176691,00 4,57 0,08 Arg CGC 405748,00 10,49 0,18 Gln CAG 1323614,00 34,21 0,74 Gln CAA 473648,00 12,24 0,26 His CAT 419726,00 10,85 0,42 His CAC 583620,00 15,08 0,58 Leu CTG 1539118,00 39,78 0,40 Leu CTA 276799,00 7,15 0,07 Leu CTT 508151,00 13,13 0,13 Leu CTC 759527,00 19,63 0,20 Pro CCG 268884,00 6,95 0,11 Pro CCA 653281,00 16,88 0,28 Pro CCT 676401,00 17,48 0,29 Pro CCC 767793,00 19,84 0,32

[072] A propensão de genes altamente expressos usarem códons frequentes é denominada de “viés de códon”. Um gene para uma proteína ribossomal pode usar apenas os 20 a

25 mais frequentes dentre os 61 códons e tem um alto viés de códon (um viés de códon próximo de 1), ao passo que um gene insuficientemente expresso pode usar todos os 61 códons e tem pouco ou nenhum viés de códon (um viés de códon próximo de 0). Considera-se que os códons frequentemente usados são códons em que quantidades maiores do tRNA cognato são expressos e que o uso desses códons permite que a tradução prossiga mais rapidamente ou mais precisamente ou os dois.

A proteína capsidial PV, por exemplo, é muito traduzida ativamente e tem um alto viés de códon.

Viés de Par de Códons

[073] Além disso, um determinado organismo tem uma preferência para o códon mais próximo vizinho de um determinado códon A, denominado de viés em uma utilização de par de códons. Uma mudança do viés de par de códons, sem mudar os códons existentes, pode influenciar a taxa de síntese de proteína e a produção de uma proteína.

[074] O viés de par de códons pode ser ilustrado considerando-se o par de aminoácidos Ala-Glu, que pode ser codificado por 8 pares de códons diferentes. Caso nenhum fator que não seja a frequência de cada códon individual (conforme mostrado na Tabela 2) são responsáveis pela frequência do par de códons, a frequência esperada de cada uma dentre as 8 codificações pode ser calculada multiplicando-se as frequências dos dois códons relevantes.

Por exemplo, por meio desse cálculo, espera-se que o par de códons GCA-GAA ocorra em uma frequência de 0,097 dentre todos os pares de codificação de Ala-Glu (0,23×0,42; com base nas frequências na Tabela 2). A fim de relacionar a frequência esperada (hipotética) de cada par de códons à frequência realmente observada no genoma humano, o banco de dados de

Consenso CDS (CCDS) de regiões de codificação humana anotadas consistentemente que contêm um total de 14.795 genes humanos,

foi usado.

Esse conjunto de genes é a representação mais abrangente de sequências de codificação humana.

Com o uso desse conjunto de genes, as frequências de uso de códon foram recalculadas dividindo-se o número de ocorrências de um códon pelo número de todos os códons sinônimos que codificam os mesmos aminoácidos.

Conforme esperado, as frequências estavam intimamente correlacionadas às frequências anteriormente publicadas, tais como aquelas fornecidas na

Tabela 2. Leves variações de frequência são devidas possivelmente a um efeito de sobreamostragem nos dados fornecidos pelo uso de banco de dados no Instituto de

Pesquisa de Kazusa DNA

(http://www.kazusa.or.jp/codon/codon.html) em que 84.949 sequências humanas de codificação foram incluídas no cálculo

(muito mais que o número real de genes humanos). As frequências de códon então calculadas foram, em seguida,

usadas para calcular as frequências de par de códons esperadas multiplicando-se primeiramente as frequências dos dois códons relevantes entre si (consultar Tabela 3, frequência esperada) e, em seguida, multiplicando-se esse resultado com a frequência observada (em todo o conjunto de dados de CCDS) com os quais o par de aminoácidos codificados pelo par de códons em questão ocorre. No exemplo de par de códons GCA-GAA, esse segundo cálculo fornece uma frequência esperada de 0,098 (em comparação a 0,097 no primeiro cálculo com o uso conjunto de dados Kazusa). Por fim, a real frequência de par de códons, conforme observado em um conjunto de 14.795 genes humanos foi determinada contando- se o número total de cada par de códons no conjunto e dividindo-se o mesmo pelo número de todos os pares sinônimos de codificação no conjunto que codifica o mesmo par de aminoácidos (Tabela 3; frequência observada). A frequência e os valores observados/esperados para o conjunto completo de 3.721 (612) pares de códons, com base no conjunto de

14.795 genes humanos, são fornecidos no presente documento na Tabela 3.

Tabela 3. Pontuações de Par de Códons Exemplificada Pelo par de Aminos Ala-Glu amino códons esperada observada observada/e ácido par frequência frequência sperada par razão AE GCAGAA 0,098 0,163 1,65 AE GCAGAG 0,132 0,198 1,51 AE GCCGAA 0,171 0,031 0,18

AE GCCGAG 0,229 0,142 0,62 AE GCGGAA 0,046 0,027 0,57 AE GCGGAG 0,062 0,089 1,44 AE GCTGAA 0,112 0,145 1,29 AE GCTGAG 0,150 0,206 1,37 Total 1,000 1,000

[075] Caso a razão entre frequência observada/frequência esperada do par de códons seja maior que o par de códons esteja super-representada. Caso a razão seja menor que um, isso significa que está sub-representado.

No exemplo, o par de códons GCA-GAA está super-representado 1,65 vez, o passo que o par de codificação GCC-GAA está super-representado mais que 5 vezes.

[076] Muitos outros pares de códons mostram um viés muito fonte; alguns pares são sub-representados, ao passo que outros pares sobrerrepresentados. Por exemplo, os pares de códons GCCGAA (AlaGlu) e GATCTG (AspLeu) estão sub- representados três a seis vezes (os pares preferenciais são GCAGAG e GACCTG, respectivamente), ao passo que os pares de códons GCCAAG (AlaLys) e AATGAA (AsnGlu) estão super- representados cerca de duas vezes. Vale ressaltar que o viés de par de códons não está relacionado com a frequência de pares de aminoácidos, tampouco com a frequência de códons individuais. Por exemplo, o par de sub-representado GATCTG (AspLeu) usa o códon Leu mais frequente (CTG).

[077] Conforme discutido mais completamente a seguir, o viés de par de códons considera a fonte para cada par de códons em uma sequência de codificação calculada em média em todo o comprimento da sequência de codificação. De acordo com a invenção, o viés de par de códons é determinado por ! '()* CPB = & +−1 "#$

[078] De modo correspondente, o viés de par de códons para uma sequência de codificação pode ser obtido, por exemplo, por pontuações minimizadas de par de códons em uma subsequência ou em pontuações de par de códons moderadamente diminuídas em todo o comprimento das sequências de codificação.

Cálculo do Viés de Par de Códons

[079] Qualquer par de códons individual dos possíveis 3.721 pares de códons que não contêm “PARADA” (por exemplo, GTT-GCT) porta uma “pontuação de par de códons” atribuída ou “CPS” que é específico para um “conjunto de treinamento” de genes. A CPS de um determinado par de códons é definida como a razão logarítmica do número observado de ocorrência sobre o número que é esperado nesse conjunto de genes (nesse exemplo, o genoma humano). A determinação do real número de ocorrências de um par de códons particular (ou, em outras palavras, a probabilidade de um par de aminoácidos particular ser codificado por par de códons particular) é simplesmente uma questão de constar o real número de ocorrências de um par de códons em um conjunto particular de sequências de codificação. No entanto, a determinação do número exige cálculos adicionais. O número esperado é calculado de modo a ser independente tanto da frequência de aminoácido quanto do viés de códon semelhantemente a Gutman e Hatfield. Ou seja, a frequência esperada é calculada com base na proporção relativa do número de vezes que um aminoácido é codificada por um códon específico. Um valor positivo de CPS significa que o determinado par de códons está estatisticamente super- representado e que uma CPS negativa indica que o par está estatisticamente sub-representado no genoma humano.

[080] A fim de realizar esses cálculos dentro do contexto humano, o banco de dados CDS de Consenso (CCDS) mais recente de regiões de codificação humanas anotadas consistentemente, que contém um total de 14.795 genes, foi usado. Esse conjunto de dados forneceu o códon e par de códons e, consequentemente, forneceu as frequências de aminoácido e de par de aminoácidos em uma escala genômica.

[081] O paradigma de Federov et al. (2002) foi usado para amplificar ainda mais a abordagem de Gutman e Hatfield (1989). Isso permitiu que o cálculo da frequência esperada de um determinado par de códons independente da frequência de códon e das associações não aleatórias de códons vizinhos que codificam um par de aminoácido particular. A equações detalhadas usadas para calcular o CPB são reveladas nos documentos nº WO 2008/121992 e WO 2011/044561, que são incorporadas a título de referência.

3' .(%& / 3' .(%& / ).(%& / = ln 2 4 = ln 2 4 3( .(%& / 5('% )5.'& /3' .8%& /

[082] No cálculo, Pij é um par de códons que ocorre com uma frequência de NO(Pij) em seu grupo sinônimo. Ci e Cj são os dois códons que compreendem Pij, que ocorrem com as frequências F(Ci) e F(Cj) em seus grupos sinônimos respectivamente. De modo mais explícito, F(Ci) é a frequência na qual ao aminoácido correspondente Xi é codificado pelo códon Ci em todas as regiões de codificação e F(Ci)=NO(Cj)/NO(Xi), em que NO(Ci) e NO(Xi) são o número observado de ocorrências do códon Ci e do aminoácido Xi respectivamente. F(Cj) é calculado correspondentemente.

Além disso, NO(Xij) é o número de ocorrências do par de aminoácido Xij em todas as regiões de codificação. O viés de pontuação de par de códons S(Pij) de Pij foi calculado como a razão logarítmica de possibilidades da frequência observada No(Pij) em relação ao número esperado de ocorrências de Ne(Pij).

[083] Com o uso da fórmula acima, determinou-se a possibilidade de os pares de códons individuais em, sequências de codificação individuais estarem super-

representados ou sub-representados quando comparados aos valores genômicos Ne(Pij) correspondentes que foram calculados com o uso de todo o conjunto de dados CCDS humanos. Esse cálculo resultou em valores positivos de pontuação S(Pij) para valores negativos e super-representados para pares de códons sub-representados nas regiões de codificação humana.

[084] O viés de par de códons “combinados” de uma sequência de codificação individual foi calculado calculando-se em média todas as pontuações de par de códons, de acordo com a fórmula seguinte: ) ).(%& /: ).(%& / = 9 ;−1 *#$

[085] O viés de par de códons de toda uma região de codificação é, então, calculado adicionando-se todas as pontuações individuais do par de códons que compreendem a região e dividindo-se essa soma pelo comprimento da sequência de codificação.

[086] Cálculo de Viés de Par de Códons, Implantação do Algoritmo para Alterar o Viés de Par de Códons.

[087] Um algoritmo foi desenvolvido para quantificar o viés de par de códons. Qualquer par individual de códons possíveis recebeu uma “pontuação de par de códons” ou “CPS”. A CPS é definida como o log natural da razão entre o número observado e o número esperado de ocorrências de cada par de códons em todas as regiões de codificação humana, em que seres humanos representam a espécie do hospedeiro do presente vírus de vacina a ser recodificado.

5(=>)' '() = ln < A 5(=) × 5(>) × 5(8@) 5(8) × 5(@)

[088] Embora o cálculo das ocorrências observadas de um par de códons particular seja objetivo (a real contagem dentro do conjunto de genes), o número esperado de ocorrências de um par de códons exige cálculo adicional.

Calcula-se que esse número esperado é independente tanto da frequência de aminoácido quanto do viés de códon, semelhantemente a Gutman e Hatfield. Ou seja, a frequência esperada é calculada com base na proporção relativa do número de vezes que um aminoácido é codificada por um códon específico. Um valor positivo de CPS significa que o determinado par de códons está estatisticamente super- representado e que uma CPS negativa indica que o par está estatisticamente sub-representado no genoma humano.

[089] Com o uso dessas CPSs calculadas, qualquer região de codificação pode, então, ser classificada como usando pares de códons sobrerrepresentados ou sub- representados obtendo-se a média das pontuações de par de códons, desse modo, fornecendo um viés de par de códons (CPB) para o gene inteiro.

) '()* '(> = 9 ;−1 %#$

[090] O CPB foi calculado para todos os genes humanos anotados com o uso das equações mostradas e plotadas (Figura 1). Cada ponto no gráfico corresponde ao CPB de um único gene humano. O pico da distribuição tem um viés de par de códons positivo de 0,07, que é a pontuação média para todos os genes humanos anotados. Além disso, há muito menos genes com um viés de par de códons negativo. As equações estabelecidas para definir e calcular o CPB foram, então, usadas para manipular esse viés.

[091] Algoritmo Para Reduzir Viés de Par de Códons.

[092] A recodificação de sequências de codificação de proteína pode ser realizada com ou sem o auxílio de um computador, com o uso, por exemplo, de uma descida do gradiente, ou recozimento simulado, ou outra rotina de minimização. Um exemplo do procedimento que redispõe códons presentes na sequência inicial pode ser representado pelas seguintes etapas:

[093] (1) Obter sequências de genoma viral do tipo selvagem.

[094] (2) Selecionar sequências de codificação de proteína para ter como alvo o modelo atenuado.

[095] (3) Travar segmentos de DNA conhecidos ou conjecturados com funções de não codificação.

[096] (4) Selecionar a distribuição de códon desejada para os aminoácidos restantes nas proteínas remodeladas.

[097] (5) Realizar embaralhamento aleatório de pelo menos duas posições de códon destravados sinônimos e calcular a pontuação de par de códons.

[098] (6) Reduzir (ou aumentar) ainda mais a pontuação de par de códons que emprega opcionalmente um procedimento de recozimento simulado.

[099] (7) Inspecionar o modelo para estrutura secundária excessiva e sítio de restrição não desejado:

[100] • caso sim -> ir para a etapa (5) ou corrigir o modelo substituindo-se regiões problemáticas com sequências do tipo selvagem e ir para a etapa (8).

[101] (8) Sintetizar sequência de DNA correspondente ao modelo do vírus.

[102] (9) Criar construto viral e avaliar o fenótipo viral:

[103] • caso muito atenuado, preparar o construto de subclone e ir para 9;

[104] • caso atenuado insuficientemente, ir para 2.

[105] A atenuação dos vírus reduzindo-se o viés de par de códons é revelada nos documentos nº WO 2008/121992 e nº WO 2011/044561, que são incorporados a título de referência.

[106] Os métodos para obter sequência genômica de comprimento total do Flavivírus ou do Zika ou para obter sequência desotimizada de par de códons incorporada em uma sequência genômica do Flavivírus ou do Zika do tipo selvagem podem incluir, por exemplo, construir um clone de cDNA infeccioso, com o uso de uma estratégia de PCR por expressão de sobreposição ou estratégia de fusão com base em PCR longa.

Flavivírus Modificado

[107] Várias modalidades da invenção fornecem um vírus Flavivírus modificado no qual a expressão de proteínas virais é reduzida em comparação a um vírus parental. A redução na expressão é o resultado de recodificar o prM ou região de envelope (E) ou a região de proteína não estrutural 3 (NS3) ou tanto a região E quanto a região NS3.

[108] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas reduzindo-se o viés de par de códons ou o viés de uso de códon da sequência de codificação de proteína. Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons compreende identificar um par de códons na sequência de codificação de proteína parental que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzida e reduzir os viés de par de códons substituindo-se o par de códons com a par de códons que tem uma pontuação de par de códons inferior. Em outras modalidades, reduzir o viés de par de códons compreende redispor os códons de uma sequência de codificação de proteína parental.

[109] Em várias modalidades, uma dentre a sequência de codificação de proteína prM/E recodificada e a sequência de codificação de proteína NS3 recodificada tem um viés de par de códons inferior a -0,05, −0,1 ou inferior a −0,2 ou inferior a −0,3 ou inferior a −0,4.

[110] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas aumentando-se o número de dinucleotídeos CpG ou UpA em comparação a um vírus parental.

[111] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos que são menos frequentes no hospedeiro viral.

[112] Em várias modalidades, o vírus parental é um Flavivírus selecionado a partir do grupo que consiste em vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, vírus da encefalite japonesa, vírus Spondweni, vírus da encefalite Saint Louis, e vírus Powassan. Em várias modalidades, o vírus parental é um isolado natural. Em várias modalidades, o vírus parental é um mutante de um isolado natural.

Vírus Zika Modificados

[113] Várias modalidades da presente invenção fornecem vírus Zika modificados como o Flavivírus modificado.

[114] Em várias modalidades, é fornecido um vírus Zika modificado no qual a expressão de proteínas virais é reduzida em comparação a um vírus parental, em que a redução na expressão é o resultado de recodificar a prM ou região de envelope (E) ou a região de proteína não estrutural 3 (NS3) ou tanto a região E quanto a região NS3.

[115] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas reduzindo-se o viés de par de códons ou o viés de uso de códon da sequência de codificação de proteína. Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons compreende identificar um par de códons na sequência de codificação de proteína parental que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzida e reduzir os viés de par de códons substituindo-se o par de códons com a par de códons que tem uma pontuação de par de códons inferior. Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons compreende redispor os códons de uma sequência de codificação de proteína parental.

[116] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas aumentando-se o número de dinucleotídeos CpG ou UpA em comparação a um vírus parental. Em várias modalidades, uma dentre a sequência de codificação de proteína prM/E recodificada e a sequência de codificação de proteína NS3 recodificada tem um viés de par de códons inferior a -0,05, −0,1 ou inferior a −0,2 ou inferior a −0,3 ou inferior a −0,4. Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos que são menos frequentes no hospedeiro.

[117] Várias modalidades da presente invenção fornecem um método para produzir um genoma de vírus Flavivírus modificado. O método compreende obter a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de envelope de um vírus Flavivírus e a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína não estrutural 3 de um vírus Flavivírus; recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope para reduzir a expressão de proteína e recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 a fim de reduzir a expressão de proteína e substituir um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada em um genoma de vírus Flavivírus parental para produzir um genoma de vírus Flavivírus modificado; por meio de quê a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada são reduzidas em comparação ao vírus parental.

[118] Várias modalidades da presente invenção fornecem um método para produzir um genoma de vírus Zika modificado que compreende: obter a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de envelope de um vírus Zika e a sequência de nucleotídeos que codificas proteínas não estruturais 3 de um vírus Zika; recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope a fim de reduzir expressão de proteína e recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 a fim de reduzir a expressão de proteína e substituir um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada em um genoma de vírus Zika parental para produzir um genoma de vírus Zika modificado; por meio de quê a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada são reduzidas em comparação ao vírus parental.

[119] De acordo com várias modalidades da invenção, a atenuação viral é realizada reduzindo-se proteínas virais de expressão através de desotimização de par de códons de sequências de codificação de E e NS3. Um modo de reduzir a expressão das sequências de codificação é por meio de uma redução no viés de par de códons, porém outros métodos também podem ser usados, isoladamente ou em combinação. Embora o viés de códon possa ser mudado, o ajuste do viés de par de códons é particularmente vantajoso. Por exemplo, a atenuação de um vírus através do viés de códon exige geralmente de eliminação de códons comuns e, então, a complexidade da sequência de nucleotídeos é reduzida. Em contrapartida, uma redução ou minimização de viés de par de códons pode ser realizada ao mesmo tempo que mantém uma diversidade de sequência muito maior e, consequentemente, mais controle sobre a estrutura secundária de ácido nucleico, temperatura de recozimento e outras propriedades físicas ou bioquímicas.

[120] O viés de par de códons de uma sequência de codificação de proteína (isto é, um quadro aberto de leitura) é calculado conforme apresentado acima e descrito em Coleman et al., 2008.

[121] As respostas imunes protetoras à atenuação e indução viral podem ser confirmadas de maneira bem conhecida pelas pessoas de habilidade comum na técnica incluindo, porém sem limitação, os métodos ensaios revelados no presente documento. Os exemplos não limitativos incluem, ensaios em placa, medições de crescimento, letalidade reduzida em animais de teste e proteção contra infecção subsequente com um vírus do tipo selvagem.

[122] Em modalidades preferenciais, a invenção fornece um vírus que são altamente atenuados e induzem imunidade contra uma pluralidade de tipos de e/ou subtipos de Zika. Tais variedades de vírus Zika incluem os vírus nas então chamadas linhagens africana e asiática. Exemplos de sequências de codificação de proteína do Zika atenuado são fornecidos a seguir.

Tabela 4. Genes de Vírus Zika com Expressão Reduzida Sequências de Sequência de Codificação WT codificação Recodificada Gene SEQ ID SEQ ID NO: NO: PR15 Syn WT 1 PR15 E-Min 2 PR15 NS3- 3 Min PR15 E- 4 W/min PR15 E- 5 W/W/min MR766 Syn 6

WT MR766 E-Min 7

MR766 E- 8 W/Min MR766 E- 9 W/W/min MR766 NS3- 10 Min MR766 NS3- 11 W/Min MR766 NS3- 12 W/W/Min Composições de Vacina

[123] várias modalidades fornecem uma composição de vacina contra Flavivírus para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo que compreende o Flavivírus modificado da presente invenção, conforme descrito no presente documento.

[124] Várias modalidades da presente invenção fornece uma composição de vacina contra Zika para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo que compreende o vírus Zika modificado da presente invenção. Exemplos não limitativos dos vírus Zika modificados são fornecidos: SEQ ID NO:1 – PR15 Syn WT Agttgttgatctgtgtgaatcagactgcgacagttcgagtttgaagcgaaagct agcaacagtatcaacaggttttattttggatttggaaacgagagtttctggtcatgaaa aacccaaaaaagaaatccggaggattccggattgtcaatatgctaaaacgcggagtagc ccgtgtgagcccctttgggggcttgaagaggctgccagccggacttctgctgggtcatg ggcccatcaggatggtcttggcgattctagcctttttgagattcacggcaatcaagcca tcactgggtctcatcaatagatggggttcagtggggaaaaaagaggctatggaaaTaat aaagaagttcaagaaagatctggctgccatgctgagaataatcaatgctaggaaggaga agaagagacgaggcgcagatactagtgtcggaattgttggcctcctgctgaccacagct atggcagcggaggtcactagacgtgggagtgcatactatatgtacttggacagaaacga tgctggggaggccatatcttttccaaccacattggggatgaataagtgttatatacaga tcatggatcttggacacatgtgtgatgccaccatgagctatgaatgccctatgctggat gagggggtggaaccagatgacgtcgattgttggtgcaacacgacgtcaacttgggttgt gtacggaacctgccatcacaaaaaaggtgaagcacggagatctagaagGgctgtgacgc tcccctcccattccaccaggaagctgcaaacgcggtcgcaaacctggttggaatcaaga gaatacacaaagcacttgattagagtcgaaaattggatattcaggaaccctggcttcgc gttagcagcagctgccatcgcttggcttttgggaagctcaacgagccaaaaagtcatat acttggtcatgatactgctgattgccccggcatacagcatcaggtgcataggagtcagc aatagggactttgtggaaggtatgtcaggtgggacttgggttgatgttgtcttggaaca tggaggttgtgtcaccgtaatggcacaggacaaaccgactgtcgacatagagctggtta caacaacagtcagcaacatggcggaggtaagatcctactgctatgaggcatcaatatca gacatggcttctgacagccgctgcccaacacaaggtgaagcctaccttgacaagcaatc agacactcaatatgtctgcaaaagaacgttagtggacagaggctggggaaatggatgtg gactttttggcaaagggagcctggtgacatgcgctaagtttgcatgctccaagaaaatg accggCaagagcatccagccagagaatctggagtaccggataatgctgtcagttcatgg ctcccagcacagtgggatgatcgttaatgacacaggacatgaaactgatgagaatagag cgaaagttgagataacgcccaattcaccgagagccgaagccaccctggggggttttgga agcctaggacttgattgtgaaccgaggacaggccttgacttttcagatttgtattactt gactatgaataacaagcactggttggttcacaaggagtggttccacgacattccattac cttggcacgctggggcagacaccggaactccacactggaacaacaaagaagcactggta gagttcaaggacgcacatgccaaaaggcaaactgtcgtggttctagggagtcaagaagg agcagttcacacggcccttgctggagctctggaggctgagatggatggtgcaaagggaa 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aaaaaccccatgtggagaggtccacagagattgcccgtgcctgtgaacgagctgcccca cggctggaaggcttgggggaaatcgtatttcgtcagagcagcaaagacaaataacagct ttgtcgtggatggtgacacactgaaggaatgcccactcaaacatagagcatggaacagc tttcttgtggaggatcatgggttcggggtatttcacactagtgtctggctcaaggttag agaagattattcattagagtgtgatccagccgttattggaacagctgttaagggaaagg aggctgtacacagtgatctaggctactggattgagagtgagaagaatgacacatggagg ctgaagagggcccatctgatcgagatgaaaacatgtgaatggccaaagtcccacacatt gtggacagatggaatagaagagagtgatctgatcatacccaagtctttagctgggccac tcagccatcacaataccagagagggctacaggacccaaatgaaagggccatggcacagt gaagaActtgaaattcggtttgaggaatgcccaggcactaaggtccacgtggaggaaac atgtggaacaagaggaccatctctgagatcaaccactgcaagcggaagggtgatcgagg aatggtgctgcagggagtgcacaatgcccccactgtcgttccgggctaaagatggctgt tggtatggaatggagataaggcccaggaaagaaccagaaagcaacttagtaaggtcaat ggtgactgcaggatcaactgatcacatggaccacttctcccttggagtgcttgtgatcc tgctcatggtgcaggaagggctgaagaagagaatgaccacaaagatcatcataagcaca tcaatggcagtgctggtagctatgatcctgggaggattttcaatgagtgacctggctaa 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SEQ ID NO:3 – PR15 NS3-Min

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[125] A presente invenção fornece uma composição de vacina para induzir uma resposta imune em um indivíduo que compreende qualquer um dentre os vírus atenuados descritos no presente documento e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em várias modalidades, a resposta imune é uma resposta imune protetora.

[126] Deve-se entender que um vírus atenuado da invenção, quando usado para elicitar uma resposta imune em um indivíduo (ou resposta imune protetora) ou para prevenir ou reduzir a probabilidade de um indivíduo ser afligido com uma doença associada ao vírus, é administrado ao indivíduo na forma de uma composição que compreende adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e incluem, porém sem limitação,

um ou mais dentre tampão de fosfato 0,01 a 0,1 M e, de preferência, tampão de fosfato 0,05 M, solução salina tamponada por fosfato (PBS) ou 0,9% de solução salina.

Tais carreadores também incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas.

Os carreadores aquosos incluem água,

soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, solução salina e meios tamponados.

Os exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, tais como azeite, ésteres orgânicos injetáveis,

tais como oleato de etila.

Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado e óleos fixos.

Veículos intravenosos incluem recargas de fluido e de nutriente,

recargas de eletrólito, tais como aqueles com base em dextrose de Ringer e semelhantes.

Composições sólidas podem compreender carreadores sólidos não tóxicos, tais como, por exemplo, glicose, sacarose, manitol, sorbitol, lactose,

amido, estearato de magnésio, celulose ou derivados de celulose, carbonato de sódio e carbonato de magnésio.

Para administração em um aerossol, tal como para entrega pulmonar e/ou intranasal, um agente ou composição é formulado, de preferência, com um tensoativo não tóxico, por exemplo,

ésteres ou ésteres parciais de C6 a C22 ácidos graxos ou glicerídeos naturais e um propelente. Carreadores adicionais, tais como lecitina podem ser incluídos para facilitar a entrega intranasal. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem compreender mais quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes e agentes quelantes, que amplificam a vida em prateleira e/ou eficácia dos ingredientes ativos. As presentes composições podem, conforme é bem conhecido na técnica, ser formuladas para fornecer liberação rápida, prolongada ou retardada do ingrediente ativo após administração a um indivíduo.

[127] Em várias modalidades da presente composição de vacina, o vírus atenuado (i) não altera substancialmente a síntese e processamento de proteínas virais em uma célula infectada; (ii) produz quantidades semelhantes de vírions por célula infectada como vírus wt; e/ou (iii) exibe infectividade vírion-específica substancialmente inferior vírus wt. Em modalidades adicionais, o vírus atenuado induz uma resposta imune substancialmente semelhante em um hospedeiro animal como o vírus wt correspondente.

[128] A presente invenção também fornece uma linhagem de células hospedeira modificadas especialmente isolada ou submetida à engenharia para ser permissiva para um vírus atenuado que é inviável em uma célula hospedeira do tipo selvagem. Visto que o vírus atenuado não pode se proliferar em células hospedeiras normais (do tipo selvagem), o vírus depende absolutamente da linhagem celular auxiliar específica para se proliferar. Isso fornece um nível muito alto de segurança para a geração de vírus para produção da vacina. Várias modalidades da presente linhagem celular modificada permitem a proliferação de um vírus atenuado, em que o genoma da linha linhagem celular foi alterado para aumentar o número de genes que codificam tRNAs raros.

Métodos Para Elicitar uma Resposta Imune

[129] Várias modalidades fornecem um método para elicitar uma resposta imune em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina que compreende um Flavivírus modificado da presente invenção.

Modalidades particulares fornecem um método para elicitar uma resposta imune protetora em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina que compreende um Flavivírus modificado da presente invenção. Em várias modalidades, a resposta imune oferece proteção cruzada contra um vírus Flavivírus heterólogo.

[130] Em várias modalidades, o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo pelo menos um adjuvante. Os exemplos não limitativos de adjuvantes são discutidos no presente documento. Modalidades particulares fornecem um método para elicitar uma resposta imune em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina que compreende um vírus Zika modificado da presente invenção.

[131] Várias modalidades fornecem um método para elicitar uma resposta imune protetora em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina que compreende um vírus Zika modificado da presente invenção.

[132] Em várias modalidades, o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo pelo menos um adjuvante. Os exemplos não limitativos de adjuvantes são descritos no presente documento.

[133] Em várias modalidades, a resposta imune oferece proteção cruzada contra um vírus Zika heterólogo.

[134] Várias modalidades da presente invenção fornecem um método para elicitar uma resposta imune em um indivíduo com necessidade da mesma que compreende: administrar uma dose inicial de um Flavivírus atenuado produzido por um método que não seja desotimização de par de códons ou um Flavivírus modificado no qual a expressão de proteínas virais é reduzida em comparação a um vírus parental, em que a redução na expressão é o resultado de recodificar a prM ou a região de envelope (E) ou a região de proteína não estrutural 3 (NS3) ou tanto da região E quanto da região NS3; e administrar uma ou mais doses de reforço do Flavivírus atenuado por métodos que não sejam desotimização de par de códons ou do Flavivírus modificado ao indivíduo com necessidade da mesma, em que pelo menos a dose inicial ou a uma ou mais doses de reforço é o vírus modificado. Em várias modalidades, uma primeira dentre a uma ou mais doses de reforço é administrada cerca de 2 semanas após a dose inicial.

[135] Em várias modalidades, o Flavivírus é um vírus Zika. Em outras modalidades, o Flavivírus é selecionado a partir do grupo que consiste em vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, vírus da encefalite japonesa, vírus Spondweni, vírus da encefalite Saint Louis, e vírus Powassan.

[136] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas reduzindo-se o viés de par de códons ou o viés de uso de códon da sequência de codificação de proteína. Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons compreende identificar um par de códons na sequência de codificação de proteína parental que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzida e reduzir os viés de par de códons substituindo-se o par de códons com a par de códons que tem uma pontuação de par de códons inferior.

[137] Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons compreende redispor os códons de uma sequência de codificação de proteína parental. Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas aumentando-se o número de dinucleotídeos CpG ou UpA em comparação a um vírus parental.

Em várias modalidades, uma dentre a sequência de codificação de proteína prM/E recodificada e a sequência de codificação de proteína NS3 recodificada tem um viés de par de códons inferior a -0,05, −0,1 ou inferior a −0,2 ou inferior a −0,3 ou inferior a −0,4. Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos que são menos frequentes no hospedeiro viral.

[138] Além disso, a presente invenção fornece um método para elicitar uma resposta imune protetora em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições de vacina descritas no presente documento. A presente invenção também fornece um método para prevenir que um indivíduo seja afligido com uma doença associado a vírus que compreende administrar ao indivíduo uma dose profilaticamente eficaz de qualquer uma das presentes composições de vacina. Nas modalidades dos métodos acima, o indivíduo foi exposto a um vírus patogênico. “Exposto(a)” a um vírus patogênico significa o contato com o vírus de modo que a infecção possa acontecer.

[139] A invenção fornece adicionalmente um método para retardar o início ou desacelerar a taxa de progressão de uma doença associada ao vírus em um indivíduo infectado pelo vírus que compreende administrar ao indivíduo uma dose terapeuticamente eficaz de qualquer uma dentre das presentes composições de vacina.

[140] Conforme usado no presente documento, “administrar” significa entregar com o uso de qualquer dos vários sistemas de métodos e de entrega conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. A administração pode ser realizada, por exemplo, por via intranasal, por via intraperitoneal, por via intracerebral, por via intravenosa, por via oral, por via transmucosa, por via por via subcutânea, por via transdérmica, por via intradérmica, por via intramuscular, por via tópica, por via parenteral, por meio de implante, por via intratecal, por via intralinfática, por via intralesional, por via pericárdica por via ou epidural. Um agente ou composição também podem ser administrados em um aerossol, tal como para entrega pulmonar e/ou entrega intranasal. A administração pode realizada, por exemplo, uma vez, várias vezes, e/ou durante um ou mais períodos estendidos.

[141] Elicitar uma resposta imune protetora em um indivíduo pode ser realizada, por exemplo, administrando-se uma dose primária de uma vacina a um indivíduo, seguido após um período adequado de tempo por uma ou mais administrações subsequentes da vacina. Um período de tempo adequado entre administrações da vacina pode ser prontamente determinado por uma pessoa versada na técnica e está normalmente na ordem de diversas semanas a meses. No entanto, a presente invenção não se limita a nenhum método, rota ou frequência de administração em particular.

[142] Em várias modalidades, a presente invenção fornece um método para elicitar uma resposta imune em um indivíduo com necessidade da mesma que compreende: administrar uma dose inicial de um Flavivírus atenuado produzido por um método que não seja desotimização de par de códons ou um Flavivírus modificado no qual a expressão de proteínas virais é reduzida em comparação a um vírus parental, em que a redução na expressão é o resultado de recodificar a prM ou a região de envelope (E) ou a região de proteína não estrutural 3 (NS3) ou tanto da região E quanto da região NS3; e administrar uma ou mais doses de reforço do Flavivírus atenuado por métodos que não sejam desotimização de par de códons ou do Flavivírus modificado ao indivíduo com necessidade da mesma, em que pelo menos a dose inicial ou a uma ou mais doses de reforço é o vírus modificado.

[143] Em várias modalidades, a uma ou mais doses de reforço é administrada cerca de 2 semanas após uma dose inicial. Em várias modalidades, 2, 3, 4, ou 5 doses de reforço são administradas. Em várias modalidades, os intervalos entre as doses de reforço podem ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 semanas. Em modalidades adicionais, os intervalos entre as doses de reforço podem ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses. Como um exemplo não limitativo, a dose inicial pode ser administrada, cerca de duas semanas depois uma primeira dose de reforço pode ser administrada, cerca de um mês após a primeira dose de reforço, uma segunda dose de reforço pode ser administrada, cerca de 6 meses após a segunda dose de reforço, uma terceira dose de reforço pode ser administrada. Como outro exemplo não limitativo, a dose inicial pode ser administrada, cerca de duas semanas depois uma primeira dose de reforço pode ser administrada, cerca de seis meses após a primeira dose de reforço, uma segunda dose de reforço pode ser administrada, cerca de 12 meses após a segunda dose de reforço, uma terceira dose de reforço pode ser administrada. Em modalidades adicionais, as dosagens de reforço adicionais podem ser administradas periodicamente; por exemplo, a cada 5 anos, a cada 10 anos etc.

[144] Em várias modalidades, o Flavivírus é um vírus Zika. Em várias modalidades, o Flavivírus é selecionado a partir do grupo que consiste em vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, vírus da encefalite japonesa, vírus Spondweni, vírus da encefalite Saint Louis, e vírus Powassan.

[145] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas diminuindo-se o viés de par de códons ou o viés de uso de códon da sequência de codificação de proteína.

Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas aumentando-se o número de dinucleotídeos CpG ou UpA em comparação a um vírus parental.

[146] Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons compreende identificar um par de códons na sequência de codificação de proteína parental que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzida e reduzir os viés de par de códons substituindo-se o par de códons com a par de códons que tem uma pontuação de par de códons inferior.

[147] Em várias modalidades, a redução do viés de par de códons compreende redispor os códons de uma sequência de codificação de proteína parental. Em várias modalidades, isso inclui o aumento do dinucleotídeo CpG no vírus modificado. Em várias modalidades, isso inclui o aumento do dinucleotídeo UpA no vírus modificado.

[148] Em várias modalidades, uma dentre a sequência de codificação de proteína prM/E recodificada e a sequência de codificação de proteína NS3 recodificada tem um viés de par de códons inferior a -0,05, −0,1 ou inferior a −0,2 ou inferior a −0,3 ou inferior a −0,4.

[149] Em várias modalidades, tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos que são menos frequentes no hospedeiro viral.

[150] Em várias modalidades, a dose inicial é administrada por via subcutânea, por via intramuscular, intradérmica ou intranasal. Em várias modalidades, a uma ou mais doses de reforço é administrada por via intratumoral, intravenosa ou intratecal.

[151] O tempo entre as dosagens inicial e de reforço pode variar, por exemplo, dependendo do estágio de infecção ou da doença (por exemplo, sem infecção, com infecção, número de dias após infecção) e a saúde do paciente. Em várias modalidades, a uma ou mais doses de reforço é administrada cerca de 2 semanas após a dose inicial. Ou seja, a dose inicial é administrada e cerca de duas semanas após isso, uma dose de reforço é administrada.

[152] Em várias modalidades, a quantidade de dosagem pode variar entre as dosagens inicial e de reforço.

Como um exemplo não limitante, a dose inicial pode conter menos cópias do vírus em comparação à dose de reforço.

[153] Em outras modalidades, o tipo de vírus atenuado produzido por um método diferente de desotimização de par de códons ou vírus modificado da presente invenção pode variar entre as dosagens inicial e de reforço. Em um exemplo não limitativo, um vírus modificado da presente invenção pode ser usado na dose inicial e um vírus atenuado (produzido por um método que não seja desotimização de par de códons) de uma família, gênero, espécie ou grupo ou ordem igual ou diferente pode ser usado na dose de reforço.

[154] Em outras modalidades, a rota de administração pode variar entre a dose inicial e a dose de reforço. Em um exemplo não limitativo, a dose inicial pode ser administrada por via subcutânea, e a dose de reforço pode ser administrada por meio de injeção no tumor; para tumores que são acessíveis ou que são de difícil acesso, a dose de reforço pode ser administrada por via intravenosa.

[155] Um “indivíduo” significa qualquer animal ou animal modificado artificialmente. Os animais incluem, porém sem limitação, seres humanos, primatas não humanos, vacas, cavalos, ovelha, porcos, cachorros, gatos, coelhos, furões, roedores, tais como camundongos, ratos e porquinhos-da-índia e pássaros. Os animais artificialmente modificados incluem, porém sem limitação, camundongos SCID com sistemas imunes humanos, e camundongos transgênicos CD155tg que expressam o receptor humano do poliovírus CD155. Em uma modalidade preferencial, o indivíduo é um ser humano. Modalidades preferenciais de pássaros são espécies de aves domesticadas, porém sem limitação, frangos, perus, patos e gansos.

[156] Uma “dose profilaticamente eficaz” é qualquer quantidade de uma vacina que, quando administrado a um indivíduo propenso à infecção viral ou propenso à aflição com um distúrbio associado a vírus, induz no indivíduo uma resposta imune que protege o indivíduo contra infecção pelo vírus ou afligido com o distúrbio. “Proteger” o indivíduo significa ou reduzir a probabilidade de o indivíduo se infectar com o vírus ou diminuir a probabilidade de o distúrbio iniciar no indivíduo, em pelo menos duas vezes, de preferência, pelo menos dez vezes. Por exemplo, caso um indivíduo tenha um 1% de chance de se infectar com um vírus, uma redução dupla na probabilidade de o indivíduo se infectar com o vírus resulta em 0,5% de chance de o indivíduo se infectar com o vírus. Com máxima preferência, uma “dose profilaticamente eficaz” induz no indivíduo uma resposta imune que previne completamente que o indivíduo seja infectado pelo vírus ou previne inteiramente o início do distúrbio no indivíduo.

[157] Conforme usado no presente documento, uma “dose terapeuticamente eficaz” é qualquer quantidade de uma vacina que, quando administrada a um indivíduo aafligido com um distúrbio contra o qual a vacina é e eficaz, induz no indivíduo uma resposta imune que faz com que o indivíduo tenha uma redução, remissão ou regressão do distúrbio e/ou seus sintomas. Em modalidades preferenciais, a recorrência do distúrbio e/ou seus sintomas é prevenida. Em outras modalidades preferencias, o indivíduo está curado do distúrbio e/ou seus sintomas.

[158] Determinadas modalidades de qualquer um dentre os presentes métodos de imunização e terapêuticos compreendem adicionalmente administrar ao indivíduo pelo menos um adjuvante. Um “adjuvante” deve significar qualquer agente adequado para amplificar a imunogenicidade de um antígeno e reforçar uma resposta imune em um indivíduo.

Inúmeros adjuvantes, incluindo adjuvantes particulados, adequados para uso tanto com vacinas à base de proteína quanto vacinas à base de ácido nucleico e métodos para combinar adjuvantes com antígenos são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Adjuvantes adequados para vacinas à base de ácido nucleico incluem, porém sem limitação, Quil A, imiquimod, resiquimod e interleucina-12 entregues em forma de proteína ou ácido nucleico purificado.

Os adjuvantes adequados para uso com imunização por proteína incluem, porém sem limitação, alum, adjuvante incompleto de Freund (FIA), saponina, Quil A e QS-21.

[159] A invenção também fornece um kit para imunização de um indivíduo com um vírus atenuado da invenção.

O kit compreende o vírus atenuado, um carreador farmaceuticamente aceitável, um aplicador e um material instrucional para o uso do mesmo. Em modalidades adicionais, o vírus atenuado pode um ou mais vírus da dengue, um ou mais vírus da encefalite japonesa, um ou mais vírus do Nilo Ocidental, um ou mais vírus da febre amarela, um ou mais vírus Zika etc. Mais de um vírus pode ser preferencial quando for desejável imunizar um hospedeiro contra vários isolados diferentes de um vírus particular. A invenção inclui outras modalidades de kits que são conhecidos pelas pessoas na técnica. As instruções podem fornecer quaisquer informações que sejam úteis para direcionar a administração dos vírus atenuados.

[160] Ao longo do presente pedido, várias publicações, textos de referência, livros didáticos, manuais técnicos, patentes e pedidos de patente foram citados. Os ensinamentos e revelações dessas publicações, patentes, pedidos de patente e outros documentos em suas totalidades são incorporados ao presente documento a título de referência no presente pedido a fim de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual a presente invenção se refere. No entanto, a citação de uma referência no presente documento não deve ser interpretada como uma confirmação de que tal referência é de técnica anterior à presente invenção.

[161] Deve-se entender e esperar que as variações nos princípios da invenção revelados no presente documento possam ser feitas por uma pessoa versada na técnica e que tais modificações devem ser incluídos no escopo da presente invenção. Os Exemplos a seguir ilustram adicionalmente a invenção, porém não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção de qualquer maneira. As descrições detalhadas dos métodos convencionais, tais como métodos convencionais, tais como aqueles empregados na construção de plasmídeos recombinantes, na transfecção de células hospedeiras com construtos virais, reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas imunológicas, podem ser obtidas de inúmeras publicações, incluindo Sambrook et al. (1989) e Coligan et al. (1994). Todas as referências mencionadas no presente documento são incorporadas em sua totalidade a título de referência no presente pedido. O conteúdo do documento n° WO 2008/121992 e n° WO 2011/044561 são incorporados a título de referência.

Exemplos Exemplo 1 Construção e Caracterização do Vírus Zika com Viés de Par de Códons E, Ns3 e E-Ns3 Reduzido em Cultura Tecidual

[162] A fim de obter a atenuação das cepas do vírus Zika PRVABC59 e MR766, o viés de par de códons dos genes prM/E e NS3 foi reduzido (introduzindo os pares de códon sub-representados) em genes virais, de acordo com algoritmos de computador e com síntese química, para reduzir o nível de expressão dos genes virais (Figura 1).

Tabela 6. Aumento de CpG e UpA Vírus CpG (%) UpA (%) PR15 SYN WT 24 (2,39%) 26 (2,59%) PR15 E-W/W/Min 59 (5,88%) 52 (5,18%) Exemplo 2 Alavancagem da Flexibilidade da Plataforma SAVE para criar Candidatos de Vacina Contra Vírus Zika de Segunda Geração

[163] A fim ajustar precisamente a atenuação e imunogenicidade, uma segunda geração de candidatos de vacina contra o vírus Zika foi elaborada com o uso da plataforma SAVE (Figura 2). Com base no modelo E-Min (Figura 1), os novos candidatos de vacina contiveram uma proporção pequena de sequência desotimizada diminuída de 2.014 pares de base

(E-Min) para out 997 pares de base (E-W/Min) ou 664 pares de base (E-W/W/Min) com o restante restaurado para a sequência do tipo selvagem.

[164] As sequências dos três candidatos MR766 E-Min (SEQ ID NO: 7), W-E-Min (SEQ ID NO: 8) e E-W/W/Min (SEQ ID NO: 9) são fornecidos no presente documento como exemplos.

Exemplo 3 Caracterização de Atenuação de Variantes de Viés de Par de Códons Reduzidos em Células Vero

[165] MR766-EMin replicado com cinética semelhante em comparação a MR766 do tipo selvagem em células Vero, atingindo uma titulação de ≥ 2 x 107 PFU/ml. PR15 E-Min foi mais atenuado, atingindo uma titulação de ~2 x 106 PFU/ml em células Vero. As variantes NS3-Min foram atenuadas mais intensamente; com titulações máximas de 1 x 103 PFU/ml e 5 x 105 PFU/ml para MR766 NS3-Min e PR15 NS3-Min respectivamente (Figura 3).

Exemplo 4 Neuroatenuação De Variantes de Viés de Par de Códons Reduzidos em Linhagens Celulares de Células Neuronais Humanas

[166] Diferentemente de cepas de ZIKV amis velhas, como MR766, as cepas atuais do ZIKV causam doenças neurológica, tais como microcefalia e síndrome de Guillain- Barré. Desse modo, com base na pré-reunião pré-IND com a

FDA, qualquer vacina viva atenuada contra o Zika precisa demonstrar neuroatenuação em células neuronais humanas in vitro, e neuroatenuação em primatas não humanos in vivo (proposto o trabalho de fase II). A fim de iniciar o desenvolvimento pré-clínico do presente candidato principal, duas linhagens de células neuronais humanas bem caracterizadas foram infectadas HTB-14 (também conhecidas como U-87) e HTB-15 (também conhecida como U-118), que foram usadas anteriormente para caracterizar o tropismo de célula do vírus Zika no cérebro humano em desenvolvimento e para testar inibidores potenciais anti-Zika. As linhagens de células neuronais humanas HTB-14 e HTB-15 foram infectadas, e as titulações de pico foram quantificadas após 4 dias. Foi observado que em células humanas HTB-14, MR766 E-Min foi atenuado em quase 4 Log10s e em células HTB-15 humanas, o crescimento foi ou indetectável em dois experimentos independentes ou no limite de detecção em um experimento (100 PFU/ml) o que também representa um nível de quase 4 Log10 da neuroatenuação in vitro (Figura 4) Exemplo 5 Níveis de proteína são reduzidos em células infectadas com E-Min derivadas de PRVABC59 ou MR766.

[167] Western Blot de lisados de célula inteira obtidos das células infectadas com ZIKV foram usados para comprar níveis de expressão de proteína entre diferentes variantes de PRVABC59 e MR766. Para a infecção com vírus, as células Vero foram cultivadas no meio OptiPRO a 37 °C até que seja 90% confluente. Os vírus Zika, incluindo MR766 e PRVABC59 (E-Min) do tipo selvagem sintéticas e desotimizadas, foram diluídos a uma MOI de 0,5 e foram adicionados às células. As células foram agitadas por 15 minutos à temperatura, em seguida, incubadas a 33 °C por 2 horas. A seguir, as inoculações foram removidas, e as células infectadas permaneceram em cultura no meio OptiPRO a 33 °C por 24 horas.

[168] Para a preparação de lisado de célula inteira após uma incubação de 24 horas, as células foram exaguadas brevemente com PBS frio, em seguida, lisado em gelo com tampão de RIPA (NaCl 150 mM, b-mercaptoetanol a 5 mM, 1% de NP-40, 0,1% de dodecil sulfato de sódio, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0). Os lisados de célula inteira foram coletados, diretamente misturados com tampão Laemmli 6x com b- mercaptoetanol, ebulidos e aliquotados para armazenamento.

[169] Para Western blot, um volume igual de WCL de cada amostra foi fracionado por SDS-PAGE e transferido para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi bloqueada com 5% de soro bovino de bezerro (BCS) em PBS por 1 hora à temperatura ambiente, em seguida, incubados com um anticorpo monoclonal 4G2 de camundongo contra proteína de envelope(E) da dengue tipo 2 de um dia para o outro a 4 °C, lavada três vezes com PBS-Tween, incubada subsequentemente com HRP anticorpo secundário anticamundongo conjugado em 5% de BCS por 1 hora à temperatura A membrana foi lavada três vezes, e as proteínas foram visualizadas com o uso da solução de Pierce 1-Step Ultra TMB Blotting.

[170] Constatou-se que os níveis da glicoproteína de envelope foram reduzidos em variantes de E-Min das cepas PRVABC59 e MR766 de ZIKV em comparação ao tipo selvagem (Figura 5).

Exemplo 6 Atenuação em Camundongos AG129

[171] Conforme descrito acima, o modelo de camundongo adulto AG129 ganha aceitação para estudos de vacinas contra Flavivírus e terapêuticos. Foram usados camundongos AG129 para testar: 1) cada vírus MR766 e vírus PR15 do tipo selvagem derivados sinteticamente a uma dose de 102 (controle positivo); 2) duas doses (104 e 102 PFU) dos candidatos de vacina PR15 E-Min ou MR766 E-Min e NS3-Min; e 3) uma dose única de 104 dos candidatos de vacina PR15 NS3/E- Min. Nesse estudo, foi examinada, atenuação, eficácia e imunogenicidade. Os animais foram atribuídos aleatoriamente a grupos de 5 animais. Os grupos foram infectados com vários vírus do tipo selvagem atenuados e sintéticos. Os ciclos de vacinação foram realizados no Dia 0 e Dia 28 para vacinar os camundongos. A fim de medir a atenuação, a sobrevivência e peso foram medidos após a vacinação (Figura 6).

[172] Os dados de sobrevivência, peso e de sinal clínico foram coletados diariamente durante o experimento.

As cepas PRVABC59 e MR766 desotimizadas por SAVE foram altamente atenuadas em comparação aos vírus do tipo selvagem sintéticos, apenas com a MR766 NS3-Min a uma dose de 104, induzindo óbito em 40% dos camundongos. Desse modo, todas as outras cepas foram atenuadas pelo menos 500 vezes. Os camundongos infectados com 102 PFU de ZIKV sintético do tipo selvagem com PR15 ou MR766 sofrerem uma considerável perda de peso bem antes do óbito, semelhante ao padrão observado com ZIKV do tipo selvagem “natural”. Os camundongos infectados com 104 PFU do candidato MR766 E-Min não tiveram perda significativa de mortalidade (Figura 6).

[173] O fenótipo de crescimento e a patogênese do PRVABC59 E-Min e da variante E+NS3-Min , assim como o MR766 E-Min e NS3-Min, foram examinados em um modelo animal. Os grupos de cinco camundongos AG129 receberam cada vírus em doses de 102 ou 104 de PFU por via subcutânea, e o peso corporal e sobrevivência dos animais foram monitorados continuamente por 28 dias pós infecção. Morbidade e mortalidade (perda de peso, atividade reduzida, óbito) foram monitoradas. A Dose Letal 50 (LD50) do vírus do tipo selvagem e os candidatos de vacina foi calculada pelo método de Reed e Muench (Reed, L. J.; Muench, H., 1938, The American Journal of Hygiene 27: 493 a 497). Notadamente, as variantes E-Min para PRVABC59 e MR766 e o vírus PRVABC59 E+NS3-Min não induziram doença aparente após uma dose de até 104 PFU sem mortalidade e perda mínima de peso. Portanto, a LD50 teórica das variantes E-Min foi calculada como igual ou maior que 316×104 PFU, o que excede aquela do PRVABC59 ou MR766 wt por um fator de pelo menos 1.000 (Tabela 5). A LD50 do vírus MR766 NS3-Min foi calculada como ≤42.

Tabela 5. LD50 e PD50 do Vírus atenuado Vírus LD50 PD50 MR766 WT <3,16x101 NA MR766 E-Min >3,16×104 6,81x101 MR766 NS3-Min <4,20×101 <6,81x103 PRVABC59 WT <3,16x101 NA PRVABC59 E-Min 3,16×104 1,47x102 PRVABC59 E+NS3-Min 3,16×104 <6,81x103 Exemplo 7 Imunogenicidade em Camundongos AG129

[174] Os candidatos de vacina devem ter capacidade para fornecer, a uma dose baixa, proteção a longo prazo do desafio com uma dose letal do vírus wt igual à dose infecciosa de cultura celular 102,3 (CCID50) por animal.

Embora as variantes E-Min tenham sido altamente atenuadas em cultura celular e em camundongos AG129, as mesmas foram bem sucedidas na prevenção da mortalidade em camundongos AG129 após o desafio com apenas 68 PFU (MR766 E-Min) ou 147 PFU (PRVABC59 E-Min). A eficácia da vacina foi estada nos sobreviventes de cada camundongo do estudo de atenuação.

Primeiramente, o soro foi colhido dos sobreviventes por meio de veia temporal superficial no dia 28, e os animais foram reforçados com a mesma dose da vacina por uma segunda vez no Dia 28. O soro também foi coletado no dia 49 (21 dias após o reforço). A neutralização de anticorpos desses animais foi quantificada com o uso de um ensaio de titulação de neutralização de redução de placa (PRNT50) a 50% de soro colhido a 14, 28 e 49 dias após a vacinação. Foram feitas diluições em série pela metade, começando em uma diluição a 1/10 dos soros de testes. Em seguida, as diluições foram feitas 1:1 com 102.4 PFU da cepa PRVABC59 do ZIKV (PR15). Em seguida, a mistura vírus-soro foi adicionada aos poços individuais de uma placa tecidual de cultura com 12 poços com células Vero 76. A reciprocidade da diluição do soro de teste que resultou em uma redução de ≥50% em placas médias de controle de vírus foi registrada como o valor PRNT50. No dia 28 e após apenas uma única vacinação, MR766 E-Min pôde gerar uma resposta robusta de anticorpo à cepa PR15 atual em todos os animais (Figura 7). De modo semelhante, o PR15 E- Min também forneceu uma resposta robusta de anticorpo após apenas uma única vacinação.

Exemplo 8 Eficácia de Proteção em Camundongos AG129

[175] No Dia 49 após vacinação inicial, cada grupo foi desafiado com uma dose letal (102.3 CCID50/animal) do vírus PR15 wt em 0,1 ml entregue s.c. O vírus de desafio foi fornecido ao Estado de Utah por meio da BEI Resources (Manassas, VA). Os camundongos foram observados pelo menos duas vezes diariamente para mortalidade, e os pesos foram obtidos juntos em dias alternados de 7 a 21 dias após o desafio para acompanhar a mudança de peso. Os candidatos de vacina SAVE da Codagenix tiveram êxito na prevenção ou na redução da mortalidade e morbidade (perda de peso, não mostrado) em camundongos desafiados AG129. Tanto MR766 E-Min quanto PR15 E-Min a uma dose de 104 podem proteger todos os camundongos e induzir uma resposta robusta de anticorpo, ao passo que outras variantes de vacina (por exemplo, PR15 E+NS3-Min) podem fornecer apenas fornecer proteção parcial (Figura 8). A dose protetora a 50% (PD50) para MR766 E-Min foi <102 PFU, pelo menos 1.000 vezes inferior à LD50 do MR766 E-Min, indicando pelo menos uma margem de segurança de magnitude de 3 ordens.

Exemplo 9 Eficácia em Primatas Não Humanos

[176] Os macacos-cinomolgo (CM) são usados comumente como um modelo para avaliar a infecção por Flavivírus incluindo Febre Amarela, Dengue, Nilo Ocidental e ZIKV. Os isolados ZIKV também foram recuperados de macacos- Cinomolgos infectados naturalmente. O trabalho anterior sugere que, embora a infecção por ZIKV experimental de CM não esteja propensa a produzir doença clínica, o ZIKV pode se replicar e é encontrado no sangue, na urina e em outros tecidos.

Em um estudo não GLP conduzido por Southern

Research, foi avaliada a eficácia dos candidatos de vacina de vírus Zika vivo atenuado (ZIKV) em CM naïve.

Um total de quinze (15) (10 machos e 5 fêmeas) CMs seronegativos com

ZIKV foi randomizado em cinco (5) grupos de tratamento.

Os

CMs nos grupos 1 a 4 foram vacinados com o uso de um regime de reforço inicial (dias 0 e 28) por injeção subcutânea (SC)

com os vírus atenuados (MR776 E-W/Min ou MR776 E-W/W/Min) em doses do 107 ou 105 PFU em um volume de 500 µl.

Os CMs atribuídos ao grupo de controle simulado (Grupo 5) receberam

PBS por meio de injeção SC.

A presença do anticorpo neutralizante anti-ZIKV induzido por vacina (Nab) foi avaliada no Dia 14, 21, 28, 50 e 61 por teste de neutralização por redução de foco (FRNT). Os valores do FRNT foram 2 a 4 vezes superiores tanto para MR766 E-W/Min (Figura 9) quanto para MR766 E-W/W/Min (Figura 10) macacos vacinados em comparação à vacina inativada NIH após uma dose única.

Os valores de FRNT em macacos vacinados com E-W/W/Min não aumentaram após o reforço no dia 28, o que indica que as vacinas induziram imunidade esterilizante que preveniu maior infecção pelo vírus reforçado.

Todos os animais vacinados com E-W/Min ou E-W/W/Min seroconverteram aproximadamente no dia 14 após vacinação. Esses dados indicam adicionalmente que uma dose única relativamente baixa de E-W/W/Min pode ser suficiente para disparar altos níveis (≥ 1.028 FRNT50).

[177] Várias modalidades da invenção são descritas acima na Descrição Detalhada. Embora essas descrições descrevam diretamente as modalidades acima, entende-se que as pessoas versadas na técnica podem conceber modificações e/ou variações às modalidades específicas mostradas e descritas no presente documento. Quaisquer modificações ou variações que são abrangidas pela presente descrição devem estar incluídas na mesma também. Salvo quando observado especificamente, a intenção dos presentes inventores é as palavras a sintagmas no relatório descritivo e nas reivindicações sejam interpretados por seus significados comuns e rotineiros pelas pessoas habilidade comum na técnica aplicável (ou técnicas aplicáveis).

[178] A descrição supracitada de várias modalidades da invenção conhecida pela requerente no momento de depósito do presente pedido foi apresentada e serve a título de ilustração e de descrição. A presente descrição não está destinada a ser exaustiva tampouco a limitar a invenção à forma precisa, e muitas modificações e variações são possíveis e à luz dos ensinamentos acima. As modalidades descritas servem para explicar os princípios da invenção e sua aplicação prática e para possibilitar que outras pessoas versadas na técnica utilizem a invenção em várias modalidades e com várias modificações, conforme são adequadas ao uso particular contemplado. Portanto, a invenção não se limita às modalidades particulares reveladas para realizar a invenção.

[179] Embora modalidades particulares da presente invenção tenham sido mostradas e descritas, ficará óbvio para as pessoas versadas na técnica que, com base nos ensinamentos no presente documento, que mudanças e modificações podem ser feitas sem haver afastamento da presente invenção e de seus aspectos mais amplos e que, portanto, as reivindicações anexas devem abranger em seu escopo todas essas mudanças e modificações uma vez que estão dentro do verdadeiro espírito e escopo da presente invenção.

Será entendido pelas pessoas versadas na técnica que, em geral, os termos usados no presente documento são, de modo geral, concebidos como termos “abertos” (por exemplo, o termo “incluindo” deve ser interpretado como “incluindo, porém sem limitação”, o termo “que tem” deve ser interpretado como “que tem pelo menos”, o termo “inclui” deve ser interpretado como “inclui, porém sem limitação” etc.).

[180] Conforme usado no presente documento, o termo “que compreende” ou “compreende” é usado em referência a composições, métodos e componente respectivo (ou componentes respectivos) dos mesmos que são úteis para uma modalidade,

ainda que passíveis de inclusão de elementos não especificados, sejam úteis ou não.

Será entendido pelas pessoas versadas na técnica que, em geral, os termos usados no presente documento são, de modo geral, concebidos como termos “abertos” (por exemplo, o termo “incluindo” deve ser interpretado como “incluindo, porém sem limitação”, o termo

“que tem” deve ser interpretado como “que tem pelo menos”,

o termo “inclui” deve ser interpretado como “inclui, porém sem limitação” etc.). Embora o termo em aberto “que compreende”, como uma sinônimo de termos, tais como, que inclui, que contém ou que tem, seja usado no presente documento para descrever e reivindicar a invenção, a presente invenção, ou modalidades da mesma, pode ser descrita alternativamente com o uso de termos alternativos, tais como

“que consiste em” ou “que consiste essencialmente em”.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Vírus Zika modificado caracterizado pelo fato de que a expressão de proteínas virais é reduzida em comparação a um vírus parental, em que a redução na expressão é o resultado de recodificar a prM ou a região de envelope (E) ou uma região de proteína não estrutural 3 (NS3) ou tanto a região E quanto a região NS3.

2. Vírus Zika modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas reduzindo-se o viés de par de códons ou o viés de uso de códon da sequência de codificação de proteína.

3. Vírus Zika modificado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a redução do viés de par de códons compreende identificar um par de códons na sequência de codificação de proteína parental que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzida e reduzir o viés de par de códons substituindo-se o par de códons por um par de códons que tenha uma pontuação de par de códons inferior.

4. Vírus Zika modificado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a redução do viés de par de códons compreende redispor os códons de uma sequência de codificação de proteína parental.

5. Vírus Zika modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas aumentando-se o número de dinucleotídeos CpG ou UpA em comparação a um vírus parental.

6. Vírus Zika modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada uma dentre a sequência de codificação de proteína prM/E recodificada e a sequência de codificação de proteína NS3 recodificada tem um viés de par de códons inferior a -0,05, −0,1 ou inferior a −0,2 ou inferior a −0,3 ou inferior a −0,4.

7. Vírus Zika modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos que são menos frequentes no hospedeiro.

8. Composição de vacina contra Zika caracterizada pelo fato de que é para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo que compreende um vírus modificado conforme definido em com qualquer uma das reivindicações 1 a 0.

9. Método para elicitar uma resposta imune protetora em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende: administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina que compreende um vírus modificado conforme definido em com qualquer uma das reivindicações 1 a 0.

10. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar ao indivíduo pelo menos um adjuvante.

11. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que uma resposta imune oferece proteção cruzada contra um vírus Zika heterólogo.

12. Método para produzir um genoma de vírus Zika modificado caracterizado pelo fato de que compreende: obter a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de envelope de um vírus Zika e a sequência de nucleotídeos que codifica as proteínas não estruturais 3 de um vírus Zika; recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope para reduzir expressão de proteína e recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 para reduzir expressão de proteína, e substituir um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada em um genoma de vírus Zika parental para produzir um genoma de vírus Zika modificado; por meio de quê a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada são reduzidas em comparação ao vírus parental.

13. Vírus Flavivírus modificado caracterizado pelo fato de que a expressão de proteínas virais é reduzida em comparação a um vírus parental, em que a redução na expressão é o resultado de recodificar a prM ou a região de envelope (E) ou uma região de proteína não estrutural 3 (NS3) ou tanto a região E quanto a região NS3.

14. Vírus Flavivírus modificado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas reduzindo-se o viés de par de códons ou o viés de uso de códon da sequência de codificação de proteína.

15. Vírus Flavivírus modificado, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a redução do viés de par de códons compreende identificar um par de códons na sequência de codificação de proteína parental que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzida e reduzir o viés de par de códons substituindo-se o par de códons por um par de códons que tenha uma pontuação de par de códons inferior.

16. Vírus Flavivírus modificado, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a redução do viés de par de códons compreende redispor os códons de uma sequência de codificação de proteína parental.

17. Vírus Flavivírus modificado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas aumentando-se o número de dinucleotídeos CpG ou UpA em comparação a um vírus parental.

18. Vírus Flavivírus modificado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que cada uma dentre a sequência de codificação de proteína prM/E recodificada e a sequência de codificação de proteína NS3 recodificada tem um viés de par de códons inferior a -0,05, −0,1 ou inferior a −0,2 ou inferior a −0,3 ou inferior a −0,4.

19. Vírus Flavivírus modificado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos que são menos frequentes no hospedeiro viral.

20. Flavivírus modificado, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o vírus parental é um Flavivírus selecionado a partir do grupo que consiste em vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, vírus da encefalite japonesa, vírus Spondweni, vírus da encefalite Saint Louis e vírus Powassan.

21. Flavivírus modificado, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o vírus parental é um isolado natural.

22. Flavivírus modificado, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o vírus parental é um mutante de um isolado natural.

23. Composição de vacina contra Flavivírus para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo caracterizada pelo fato de que compreende um vírus modificado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 0.

24. Método para elicitar uma resposta imune protetora em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende: administrar ao indivíduo uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina que compreende um vírus modificado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 0 a 0.

25. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar ao indivíduo pelo menos um adjuvante.

26. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a resposta imune oferece proteção cruzada contra um vírus heterólogo Flavivírus.

27. Método para produzir um genoma de vírus Flavivírus modificado caracterizado pelo fato de que compreende: obter a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de envelope de um vírus Flavivírus e a sequência de nucleotídeos que codifica as proteínas não estruturais 3 de um vírus Flavivírus; recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope para reduzir expressão de proteína e recodificar a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 para reduzir expressão de proteína, e substituir um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e um ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada em um genoma de vírus Flavivírus parental para produzir um genoma de vírus Flavivírus modificado; por meio de quê a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de envelope recodificada e a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação de proteína não estrutural 3 recodificada são reduzidas em comparação ao vírus parental.

28. Método para elicitar uma resposta imune em um indivíduo com necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma dose inicial de um Flavivírus atenuado produzido por um método diferente da desotimização de par de códons ou de um Flavivírus modificado na qual a expressão de proteínas virais é reduzida em comparação a um vírus parental, em que a redução na expressão é o resultado de recodificar a prM ou a região de envelope (E) ou a região de proteína não estrutural 3 (NS3) ou tanto as regiões E quanto NS3; e administrar uma ou mais doses de reforço do Flavivírus atenuado por métodos diferentes da desotimização de par de códons ou do Flavivírus modificado para o indivíduo com necessidade das mesmas, em que pelo menos uma dose inicial ou a uma ou mais doses de reforço é o vírus modificado.

29. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que uma primeira dentre a uma ou mais doses de reforço é administrada cerca de 2 semanas após a dose inicial.

30. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o Flavivírus é um vírus Zika.

31. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o Flavivírus é selecionado a partir do grupo que consiste em vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, vírus da encefalite japonesa, vírus Spondweni, vírus da encefalite Saint Louis e vírus Powassan.

32. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas reduzindo-se o viés de par de códons ou o viés de uso de códon da sequência de codificação de proteína.

33. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas aumentando-se o número de dinucleotídeos CpG ou UpA em comparação a um vírus parental.

34. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a redução do viés de par de códons compreende identificar um par de códons na sequência de codificação de proteína parental que tem uma pontuação de par de códons que pode ser reduzida e reduzir o viés de par de códons substituindo-se o par de códons por um par de códons que tenha uma pontuação de par de códons inferior.

35. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a redução do viés de par de códons compreende redispor os códons de uma sequência de codificação de proteína parental.

36. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que cada uma dentre a sequência de codificação de proteína prM/E recodificada e a sequência de codificação de proteína NS3 recodificada tem um viés de par de códons inferior a -0,05, −0,1 ou inferior a −0,2 ou inferior a −0,3 ou inferior a −0,4.

37. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que tanto a sequência de codificação de proteína E quanto a sequência de codificação de proteína NS3, ou cada uma dentre as mesmas, são recodificadas substituindo-se um ou mais códons por códons sinônimos que são menos frequentes no hospedeiro viral.