BR112015023635B1 - Moléculas de polinucleotídeo que codificam uma cepa pdk-53 modificada do vírus dengue-2 vivo atenuado, cepa pdk-53 do vírus vivo atenuado dengue 2 modificada, polipeptídeos, vetor, composição farmacêutica, uso da mesma, composição imunogênica e kit - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA CONSTRUTOS QUIMÉRICOS DE VÍRUS DA DENGUE EM VACINAS. As modalidades no presente documento referem-se ao campo de composições, usos e fabricação de construtos de vírus da dengue e vírus da dengue vivos atenuados. Algumas modalidades referem-se a uma composição que inclui, porém sem limitação, uma composição de vírus da dengue tetravalente. Em determinadas modalidades, as composições podem incluir construtos de um ou mais serotipos de vírus da dengue, tais como os construtos de vírus da dengue 1 (DEN- 1), vírus da dengue 2 (DEN-2), dengue 3 (DEN-3) ou dengue 4 (DEN- 4). Em outras modalidades, os construtos revelados no presente documento podem ser combinados em uma composição para gerar uma vacina contra um ou mais construtos de vírus da dengue que podem ou não ser subsequentemente passados em células de mamífero.

Description

PRIORIDADE

[0001] Este Pedido PCT reivindica prioridade do Pedido Provisório n° U.S. 61/800.204 depositado em 15 de março de 2013. Este pedido é incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência para todos os propósitos.

PESQUISA FINANCIADA PELO GOVERNO FEDERAL

[0002] Algumas modalidades reveladas no presente documento foram suportadas em parte pelo número de concessão R43 AI084291- 01 dos Institutos Nacionais de Saúde. O governo dos EUA pode ter determinados direitos de praticar a presente invenção.

CAMPO

[0003] As modalidades no presente documento relatam composições, métodos, usos e procedimentos de fabricação para construtos de vírus da dengue e composições de vacina dos mesmos. Algumas modalidades referem-se a uma composição que inclui, porém, sem limitação, construtos quiméricos de vírus flavivírus que, sozinhos ou em combinação com outros construtos, podem ser usados em uma composição de vacina. Em determinadas modalidades, as composições podem incluir construtos de mais do que um sorotipo de vírus da dengue, tal como o vírus da dengue-1 (DEN-1), vírus da dengue-2 (DEN-2), vírus da dengue-3 (DEN-3) e/ou vírus da dengue-4 (DEN-4). Em outras modalidades, a estratégia de fabricação que pode melhorar a segurança e a estabilidade genética dos vírus de vacina contra dengue quiméricos vivos atenuados recombinantes (DENVax).

[0004] Determinadas modalidades incluem pelo menos um vírus da dengue vivo atenuado em combinação com os construtos quiméricos de vírus da dengue identificados para serem tanto seguros quanto eficazes em composições de vacina em que os construtos passaram por passagens adicionais em culturas celulares.

ANTECEDENTES

[0005] A infecção com o vírus da dengue pode levar a uma febre dolorosa de gravidade variável. Até hoje, quatro sorotipos de vírus da dengue foram identificados: dengue-1 (DEN-1), dengue-2 (DEN-2) ou dengue-3 (DEN-3) em combinação com dengue-4 (DEN-4). A febre da dengue é causada pela infecção de um vírus da dengue. Outros subtipos podem ser revelados no futuro (por exemplo, DEN-5). Os sorotipos de vírus da dengue 1 a 4 podem também causar dengue hemorrágica (DHF) e síndrome do choque da dengue (DSS). As consequências mais graves da infecção, DHF e DSS, podem ser potencialmente letais. Os vírus da dengue causam 50 a 100 milhões de casos de dengue debilitante, 500.000 casos de DHF/DSS e mais do que 20.000 mortas por ano. Até hoje, não há nenhuma vacina eficaz para proteção contra a dengue e nenhum tratamento com fármaco para a doença. Os esforços para controle o mosquito foram ineficazes na prevenção de surtos da dengue em áreas endêmicas ou na prevenção da dispersão geográfica adicional da doença. Estima-se que 3,5 bilhões de pessoas estão ameaçadas pela infecção pelo vírus da dengue. Adicionalmente, o vírus da dengue é uma causa principal de febre em viajantes para áreas endêmicas, tais como Ásia, Américas Central e Sul e o Caribe.

[0006] Todos os quatro sorotipos de vírus da dengue são endêmicos por todas as regiões trópicas do mundo e constituem a ameaça viral a humanos transmitida por mosquitos mais significativa em regiões tropicais, no mundo inteiro. Os vírus da dengue são transmitidos a humanos primariamente pelos mosquitos Aedes aegypti. A infecção por um sorotipo de vírus da dengue resulta na proteção para toda a vida da reinfecção por esse sorotipo, mas não previne a infecção secundária por um dos outros três sorotipos de vírus da dengue. De fato, a infecção antes por um sorotipo de vírus da dengue leva a um risco aumentado da doença grave (DHF/DSS) mediante a infecção secundária por um sorotipo diferente. O desenvolvimento de uma vacina eficaz representa uma abordagem importante da prevenção e controle dessa doença emergente global. Múltiplas imunizações tornam a cobertura de vacina completa difícil tanto para esforços de saúde pública em países endêmicos de vírus da dengue assim como para viajantes.

SUMÁRIO

[0007] As modalidades no presente documento referem-se a composições, métodos e usos de construtos quiméricos de vírus da dengue. Em algumas modalidades, uma composição pode incluir construtos quiméricos de vírus da dengue que têm uma cadeia principal de vírus da dengue atenuado com genes estruturais de pelo menos um outro sorotipo de vírus da dengue. Outras modalidades referem-se a pelo menos um vírus vivo atenuado em combinação com um ou mais vírus quiméricos da dengue. Outras modalidades podem incluir uma composição de vírus quiméricos da dengue que têm uma cadeia principal de DEN-2 modificada (por exemplo, PDK-53 como uma cadeia principal de partida em P1 (passagem-1) e variabilidade de passagem (após a passagem e a proliferação in vitro em uma linhagem celular permissiva) conforme indicado para P2, P3,...P8..P10 etc.) e um ou mais componentes estruturais de DEN-1, DEN-2, DEN-3 ou DEN-4. Em outras modalidades, uma composição imunogênica é gerada em que, quando introduzida em um indivíduo, a composição produz uma resposta imunológica a um ou mais vírus da dengue no indivíduo. Portanto, os construtos contemplados no presente documento podem ser gerados e passados in vitro, e cada uma das passagens fornece um vírus da dengue atenuado contemplado para o uso em uma composição de vacina farmaceuticamente aceitável. Em determinadas modalidades um vírus vivo atenuado pode ser um vírus da dengue-2 vivo atenuado sozinho ou em combinação com um ou mais vírus quiméricos da dengue.

[0008] Em determinados exemplos, os construtos quiméricos de vírus da dengue dos sorotipos de vírus da dengue podem incluir vírus vivos atenuados de passagem 7 (P7) ou vírus quiméricos que têm sequências de ácidos nucleicos identificadas por SEQ ID NOS: 1, 1, 9, 17 e 25 ou sequências de polipeptídeos indicadas por SEQ ID NOS: 2, 10, 18 e 26. Contempla-se no presente documento que qualquer uma das passagens para qualquer um dos vírus vivos atenuados descritos no presente documento pode ser usada em uma composição imunogênica para induzir respostas imunológicas aos vírus da dengue representados (por exemplo, os sorotipos 1 a 4). Em conformidade com essas modalidades, uma composição imunogênica que inclui um vírus vivo atenuado isolado P-8 pode ser administrada a um indivíduo para induzir uma resposta imunogênica contra um ou mais sorotipos de vírus da dengue dependendo do construto selecionado.

[0009] Adicionalmente, um vírus vivo atenuado pode ser combinado com um ou mais desses vírus quiméricos. Isso é contemplado para cada um dos vírus vivos atenuados isolados/produzidos em cada passagem celular subsequente (por exemplo, produção de células Vero de Macaco Verde Africano, doravante: células Vero). Contempla-se no presente documento que qualquer linhagem celular (por exemplo, banco de células produzido por GMP, aprovado por FDA ou EMA) que tem a capacidade de produzir vírus da dengue é de uso para a passagem de qualquer um dos construtos virais a uma escala de fabricação ou conforme apropriadamente contemplado no presente documento para o uso subsequente em uma vacina ou composição imunogênica contra o vírus da dengue.

[00010] Em outras modalidades, as composições contempladas no presente documento podem ser combinadas com outras composições imunogênicas contra outros Flavivírus tais como vírus do Oeste do Nilo, encefalite japonesa ou qualquer outro construto quimérico de flavivírus e/ou vírus vivo atenuado. Em determinadas modalidades, uma única composição pode ser usada contra múltiplos flavivírus.

[00011] Em determinadas modalidades, uma composição imunogênica da presente invenção pode incluir vírus quiméricos da dengue contra um ou mais dentre DEN-1, DEN-2, DEN-3 e/ou DEN-4, sozinhos ou em combinação com uma composição de vírus da dengue vivo atenuado.

[00012] Em outras modalidades, um construto pode incluir um construto que tem mutações adaptativas nas regiões estruturais ou não estruturais do vírus que aumento a proliferação ou a produção sem afetar a atenuação ou segurança do vírus quando introduzido em um indivíduo. Em determinadas modalidades, qualquer um dos construtos quiméricos de vírus da dengue contemplados pode incluir um vírus DEN-2 vivo atenuado que tem mutações específicas usadas como uma cadeia principal em que o vírus DEN-2 PDK vivo atenuado inclui adicionalmente proteínas estruturais de um ou mais dentre as proteínas estruturais prM (pré-membrana) e E (envelope) dos outros sorotipos de vírus da dengue. Adicionalmente, uma cadeia principal de DEN-2 pode incluir mutações adicionais a fim de aumentar a produção de ou aumentar a resposta imunológica a uma composição predeterminada em um indivíduo mediante a administração (por exemplo, vírus da dengue quimérico 2/1, 2/3 ou 2/4).

[00013] Em algumas modalidades, os genes de proteína estrutural podem incluir os genes de prM e E de DEN-1, DEN-2, DEN-3 ou DEN- 4 em uma cadeia principal de DEN-2 que tem uma ou duas mutações que são parte de um vírus da dengue vivo atenuado. Por exemplo, um construto de dengue, em determinadas modalidades, pode incluir aqueles construtos designados como DENVax-1-A, DENVax-2-F, DENVax-3-F e DENVax-4-F (consulte a seção Exemplo) em que a cadeia principal de DEN-2 tem uma ou mais mutações (por exemplo, não encontradas na P1 ou outro vírus passado anterior ou PDK-53) do vírus vivo atenuado DEN-2 anteriormente demonstrado para ser seguro e eficaz para induzir uma resposta imunológica. O vírus vivo atenuado DEN-2 do presente pedido é uma versão melhorada do vírus vivo atenuado DEN-2 originalmente usado. Um construto quimérico da presente invenção pode incluir uma cadeia principal de DEN-2 PDK-53 atenuado modificada, que tem uma ou mais proteínas estruturais do segundo sorotipo de vírus da dengue em que as proteínas estruturais podem incluir mutações adicionais para aumentar uma resposta imunogênica ao construto quimérico. Em algumas modalidades, determinadas mutações adquiridas por DEN-2 PDK-53 atenuado podem produzir uma alteração de aminoácido conservadora ou não em um construto diferente do construto de P1 que pode resultar em características desejáveis para a produção, etc.

[00014] Em outras modalidades, um genoma de DEN-2 vivo atenuado pode ser usado para gerar construtos do sorotipo de vírus da dengue 1 (DEN-1) e sorotipo de vírus da dengue 3 (DEN-3), sorotipo de vírus da dengue 4 (DEN-4) em que um ou mais genes de proteína estrutural do genoma viral DEN-2 podem ser substituídos por um ou mais genes de proteína estrutural dentre DEN-1, DEN-3 ou DEN-4, respectivamente. Em algumas modalidades, uma proteína estrutural pode ser a proteína C, prM ou E de um segundo vírus da dengue. Em determinadas modalidades, os genes de proteína estrutural incluem os genes de prM e E dentre DEN-1, DEN-3 ou DEN-4. Esses vírus híbridos expressam os antígenos de superfície de DEN-1, DEN-3 ou DEN-4 enquanto retêm os fenótipos de atenuação do DEN-2 atenuado progenitor.

[00015] Os construtos revelados no presente documento podem incluir os construtos quiméricos de DEN-4, DEN-2, DEN-1 e DEN-3 que expressam os antígenos de superfície de DEN-1, DEN-3 e DEN-4 com o uso do vírus DEN-2 atenuado como uma cadeia principal.

[00016] Em determinadas modalidades, as composições da presente invenção podem incluir uma composição que compreende um único construto quimérico de vírus da dengue revelado no presente documento e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, as composições da presente invenção podem incluir uma composição que compreende dois ou mais ou três ou mais construtos quiméricos de vírus da dengue revelados no presente documento e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em conformidade com essas modalidades, um ou mais construtos quiméricos de vírus da dengue contemplados no presente documento podem ser combinados com um ou mais vírus da dengue vivos atenuados. Em determinadas modalidades, um vírus vivo atenuado pode ser um vírus DEN-2 vivo atenuado em que mutações adicionais nas regiões NCR, NS1 ou outras regiões aumentam a resposta imunológica, aumento a proliferação viral ou outra melhora para um vírus da dengue vivo atenuado melhorado.

[00017] Em determinadas modalidades, os loci de atenuação, nucleotídeo 5'NCR-57-T, NS1-53-Asp e NS3-250-Val, da vacina contra DENV-2 foram anteriormente determinados e todas essas alterações são compartilhadas pelo antecedente genético específico para vírus PDK-53 comum dos quatro vírus DENVax. A sequência genética dos três loci de atenuação assim como os fenótipos de atenuação in vitro e in vivo anteriormente estabelecidos desses candidatos de vacina foram cuidadosamente monitorados para as sementes de DENVax fabricadas por cGMP. Esse relatório descreve as estratégias usadas para gerar as sementes originais de vírus (MVS) assim como sua caracterização genética e fenotípica do uso na fabricação do vírus da dengue composições de vacina. Essas MVS podem ser usadas para a fabricação de materiais clínicos e suprimentos de vacina essencialmente comerciais.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00018] Os desenhos a seguir formam parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar adicionalmente determinadas modalidades. Algumas modalidades podem ser mais bem entendidos em referência a um ou mais desses desenhos sozinhos ou em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas.

[00019] A Figura 1 representa um gráfico exemplificativo que reflete um construto quimérico exemplificativo da presente invenção, DEN- 2/DEN-4 em comparação aos construtos gerados anteriormente e vírus da dengue do tipo selvagem.

[00020] A Figura 2 representa uma plotagem de histograma exemplificativa comparando várias respostas com o uso de uma cadeia principal de DEN-2 vivo atenuado (com mutações adicionais) e um segundo sorotipo de vírus da dengue como componentes estruturais substituídos pelos componentes estruturais de dengue-2 (por exemplo, MVS de DENVax-1). Essa plotagem ilustra tamanhos de placa da MVS de DENVax. Os vírus da dengue do tipo selvagem e os vírus candidatos de vacina de grau de pesquisa anteriormente publicados foram incluídos para controle e comparação. Essa plotagem ilustra a produção melhorada dos construtos de vírus da dengue em comparação aos construtos quiméricos de vírus da dengue de controle.

[00021] A Figura 3 representa uma plotagem de histograma exemplificativa que representa as sensibilidades de temperatura da MVS de DENVax (Semente Original de Vírus). Os vírus da dengue do tipo selvagem e os vírus candidatos de vacina de grau de pesquisa anteriormente publicados foram incluídos para comparação com o grau de MVS.

[00022] A Figura 4 representa uma plotagem de histograma exemplificativa que representa a proliferação viral da MVS de DENVax em células C6/36 em comparação aos controles. Os vírus da dengue do tipo selvagem e os vírus candidatos de vacina de grau de pesquisa foram incluídos para comparação com a MVS de DENVax.

[00023] As Figuras 5A a 5C representam plotagens exemplificativas de neurovirulência em camundongos recém-nascidos. Os resultados agrupados de diversos experimentos que resumem a neurovirulência do vírus DENV-2 16681 do tipo selvagem em camundongos recém- nascidos CDC-ICR (n=72) e Taconic-ICR (n=32) estimulados ic com 104 pfu do vírus (A). A neurovirulência de MVS de DENVax testada em camundongos Taconic-ICR com uma dose de 104 pfu (B) ou 103 pfu (C). Os números de animais testados por grupo em um experimento (n=16) ou dois experimentos agrupados (n=31 ou 32) são indicados.

[00024] A Figura 6 representa um histograma exemplificativo que ilustra o tamanho de placa de MVS de DENVax, WVS e BVS. Os diâmetros médios de placa ± SD (barras de erro) das placas de vírus em células Vero ou LLC-MK2 sob cobertura de agarose medida no dia 9 pi. DENVs do tipo selvagem e os vírus candidatos de vacina de grau de pesquisa anteriormente publicados foram incluídos para controle e comparação.

[00025] A Figura 7 representa uma plotagem de histograma exemplificativa que ilustra a proliferação de MVS de DENVax, WVS e BVS em células C6/36 a duas temperaturas de incubação para verificar sua retenção desse marcador de atenuação in vitro após a fabricação em grande escala.

[00026] A Figura 8 representa um histograma exemplificativo que plota a proliferação de MVS de DENVax, WVS e BVS em células C6/36. Títulos médios ± SD (barras de erro) dos vírus replicados em células C6/36 7 dias pi. Os vírus da dengue do tipo selvagem e os vírus candidatos de vacina de grau de pesquisa anteriormente publicados foram incluídos para comparação.

[00027] As Figuras 9A a 9B representam gráficos exemplificativos dos dados de neurovirulência da MVS de DENVax em camundongos ICR recém-nascidos. (A) Inoculações IC do vírus a uma dose de 104 PFU. (B) Inoculação IC do vírus a uma dose de 103 PFU.

[00028] A Figura 10 representa um gráfico exemplificativo que compara novos vírus vivos atenuados a vírus da dengue vivos atenuados gerados anteriormente.

DEFINIÇÕES

[00029] Conforme usado no presente documento, "um" ou "uma" pode significar um ou mais do que um de um item.

[00030] Conforme usado no presente documento no relatório descritivo, "indivíduo" ou "indivíduos" podem incluir, porém, sem limitação, mamíferos tais como humanos ou mamíferos domesticados ou selvagens, por exemplo, cães, gatos, outros animais de estimação domésticos (por exemplo, hamster, porquinho da índia, camundongo, rato), furões, coelhos, porcos, cavalos, gado, cães-da-pradaria, roedores selvagens ou animais de zoológico.

[00031] Conforme usado no presente documento, os termos "quimera de vírus", "vírus quimérico", "quimera de flavivírus" e "flavivírus quimérico" podem significar um construto que compreende uma porção da sequência de nucleotídeos de um vírus da dengue-2 e a sequência de nucleotídeos adicional que não é do vírus da dengue-2 ou é de um flavivírus diferente. Uma "quimera de dengue" compreende pelo menos dois sorotipos de vírus da dengue diferentes, mas não um flavivírus diferente. Assim, os exemplos de outros vírus da dengue ou flavivírus incluem, porém, sem limitação, sequências de vírus da dengue-1, vírus da dengue-3, vírus da dengue-4, vírus do Oeste do Nilo, vírus da encefalite japonesa, vírus da encefalite St. Louis, vírus da encefalite transmitida por carrapatos, vírus da febre amarela e qualquer combinação dos mesmos.

[00032] Conforme usado no presente documento, "quimera de ácido nucleico" pode significar um construto da invenção que compreende um ácido nucleico que compreende uma porção da sequência de nucleotídeos de um vírus da dengue-2 e da sequência de nucleotídeos adicional que não tem a mesma origem que a sequência de nucleotídeos do vírus da dengue-2. Consequentemente, qualquer flavivírus quimérico ou quimera de flavivírus revelada no presente documento pode ser reconhecida como um exemplo de uma quimera de ácido nucleico.

[00033] Conforme usado no presente documento, "um vírus vivo atenuado" pode significar um vírus do tipo selvagem, mutado ou selecionado para as características de uso em vacinas ou outras composições imunogênicas em que algumas características podem incluir virulência reduzida, segurança, eficácia ou proliferação aumentada, etc.

DESCRIÇÃO

[00034] Nas seções a seguir, várias composições e métodos exemplificativos são descritos a fim de detalhar várias modalidades.

[00035] Será óbvio para um versado na técnica que praticar as várias modalidades não exige o emprego de todos ou mesmo alguns dos detalhes específicos descritos no presente documento, mas, em vez disso, concentrações, tempos e outros detalhes específicos podem ser modificados através da experimentação de rotina. Em alguns casos, os métodos ou componentes bem conhecidos não foram incluídos na descrição.

[00036] Em conformidade com modalidades da presente invenção, podem ser empregadas técnicas de biologia molecular convencional, química de proteína, microbiologia e de DNA recombinante dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Consulte, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed., 1986).

[00037] As modalidades no presente documento referem-se a composições, métodos e usos para induzir respostas imunológicas contra um ou mais sorotipos de vírus da dengue em um indivíduo, individual ou simultaneamente. Em conformidade com essas modalidades, os vírus da dengue atenuados e quimeras de ácido nucleico são gerados e usados em composições de vacina reveladas no presente documento. Algumas modalidades referem-se a quimeras ou construtos de dengue modificados ou mutados. Outras modalidades envolvem introduzir mutações para modificar as sequências de aminoácidos de proteínas estruturais dos vírus da dengue em que a mutação aumenta a imunogenicidade ao vírus. Os vírus da dengue vivos atenuados de todos os quatro sorotipos foram desenvolvidos passando os vírus do tipo selvagem na cultura celular. Esses são alguns dos candidatos de vacina vivos atenuados mais promissores para a imunização contra o flavivírus e, particularmente, a doença e/ou infecção pelo vírus da dengue. Esses candidatos de vacina foram designados por uma combinação de seu sorotipo de dengue, a linhagem celular através da qual os mesmos são passados e o número de vezes que os mesmos foram passados. Assim, o vírus do tipo selvagem de sorotipo de dengue 1 passado em células PDK 13 vezes é designado como vírus DEN-1 PDK-13. Outros candidatos de vacina são DEN-2 PDK-53, DEN-3 PGMK-30/FRhL-3 (por exemplo, trinta passagens em células primárias de rim de macaco verde, seguidas por três passagens em células de pulmão de reso fetal e DEN-4 PDK-48). Esses quatro vírus de vacina de candidato foram derivados pela passagem em cultura de tecido de vírus DEN-1 16007, DEN-2 16681, DEN-3 16562 e DEN-4 1036 progenitores do tipo selvagem, respectivamente.

[00038] Em determinadas modalidades, o vírus da dengue-2 PDK-53 vivo atenuado continha uma mistura de vírus, com a população contendo diferenças de nucleotídeo variáveis. Após a caracterização genética de mutações atenuantes, determinadas características atenuantes foram descritas e modificadas em um clone infeccioso de cDNA. O RNA foi transcrito a partir de seu clone infeccioso e introduzido em células Vero como uma passagem 1 do vírus PDK-53-Vero-DEN-2- P 1 recentemente caracterizado e derivado (consulte, por exemplo, a Tabela 1). Esse vírus atenuado foi criado para cada sorotipo DEN, mas para DEN-1, DEN-3 e DEN-4, os genes de prM e E foram modificados em 3 clones infecciosos de cDNA separados, gerando, assim, quatro vírus PDK-53-Vero separados (designados no presente documento como: PDK-53-Vero-DEN-2-P 1, PDK-53-Vero-DEN-1-P 1, PDK-53- Vero-DEN-3-P 1 e PDK-53-Vero-DEN-4-P 1). Essas cepas de vírus de vacina atenuadas foram passadas em células Vero 10 vezes (Tabela 1), e cada linhagem separada adquiriu mutações mediante sua adaptação para proliferar em células Vero (Tabela 3). Determinadas modalidades são direcionadas aqui para derivação e usos para esses vírus da dengue vivos atenuados. Os testes clínicos humanos anteriores com esses vírus atenuados indicaram que DEN-2 PDK-53 tem a menor dose infecciosa (dose infecciosa mínima de 50% de 5 unidades de formação de placa ou PFU) em humanos, é fortemente imunogênica e não produz nenhum problema de segurança aparente. Os candidatos de vírus de vacina DEN-1 PDK-13, DEN-3 PGMK-30/FRhL-3 e DEN-4 PDK-48 têm doses infecciosas mínimas de 50% maiores de 10.000, 3.500 e 150 PFU, respectivamente, em humanos. Embora apenas uma imunização com o vírus DEN-2 PDK-53 monovalente ou o vírus DEN-4 PDK-48 foi exigida para alcançar 100% de soroconversão em indivíduos humanos, um intensificador foi necessário para alcançar a mesma taxa de soroconversão para os vírus DEN-1 PDK-13 e DEN-3 PGMK-30/FRhL- 3, que têm as duas doses mais infecciosas para humanos.

[00039] O candidato de vacina de vírus DEN-2 PDK-53, também abreviado como PDK-53, tem diversos marcadores biológicos mensuráveis associados à atenuação, incluindo sensibilidade à temperatura, tamanho de placa pequeno, replicação diminuída na cultura celular C6136 de mosquito, replicação diminuída em mosquitos intactos, perda de neurovirulência para camundongos lactentes e incidência diminuída de viremia em macacos. Os testes clínicos da vacina de PDK-53 candidata demostraram sua segurança e imunogenicidade em humanos. Ademais, a vacina de PDK-53 induz respostas de memória de célula T específicas para vírus da dengue em receptores de vacina humanos. Algumas modalidades no presente documento descrevem uma melhora no DEN-2 PDK-53 usado em construtos quiméricos revelados no presente documento. As quimeras de flavivírus imunogênicas que têm uma cadeia principal de vírus da dengue-2 e pelo menos uma proteína estrutural de outro sorotipo de vírus da dengue podem ser usadas para preparar as quimeras de vírus da dengue e métodos para produzir as quimeras de vírus da dengue são descritos. As quimeras de vírus da dengue imunogênicas são fornecidas, sozinhas ou em combinação, em um carreador farmaceuticamente aceitável como composições imunogênicas para minimizar, inibir ou imunizar indivíduos contra a infecção por um ou mais sorotipos, tais como os sorotipos de vírus da dengue DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4, sozinhos ou em combinação. Quando combinadas, as quimeras de vírus da dengue imunogênicas podem ser usadas como vacinas multivalentes (por exemplo bi, tri e tetravalentes) para conferir proteção simultânea contra a infecção por mais do que uma espécie ou cepa do flavivírus. Em determinadas modalidades, as quimeras de vírus da dengue são combinadas em uma composição imunogênica útil como uma vacina bivalente, trivalente ou tetravalente contra os sorotipos de vírus da dengue conhecidos ou conferem imunidade a outros flavivírus patogênicos incluindo ácidos nucleicos que codificam uma ou mais proteínas de um flavivírus diferente.

[00040] Em algumas modalidades, as quimeras de vírus da dengue imunogênicas e avirulentas fornecidas no presente documento contêm genes de proteína não estrutural do vírus da dengue-2 atenuado (por exemplo, PDK-53) ou o equivalente dos mesmos e um ou mais dos genes de proteína estrutural ou porções imunogênicas dos mesmos do flavivírus contra qual a imunogenicidade deve ser induzida em um indivíduo. Por exemplo, algumas modalidades referem-se a uma quimera que tem o genoma de vírus da dengue-2 PDK-53 atenuado como a cadeia principal viral e um ou mais genes de proteína estrutural que codificam o capsídeo, pré-membrana/membrana ou envelope do genoma de PDK-53 ou combinações dos mesmos substituídos por um ou mais genes de proteína estrutural correspondentes de DEN-1, DEN- 3 ou DEN-4 ou outro flavivírus do qual ser protegido, tal como um flavivírus diferente ou um sorotipo de vírus da dengue diferente. Em conformidade com essas modalidades, uma quimera de ácido nucleico revelada no presente documento pode ter propriedades funcionais do vírus da dengue-2 atenuado e é avirulenta, mas expressa epítopos antigênicos dos produtos de gene estrutural de DEN-1, DEN-3 ou DEN- 4 adicionalmente a outros flavivírus e é imunogênica (por exemplo, induz uma resposta imunológica aos produtos de gene em um indivíduo). Então, esses construtos de DNA são usados para transcrever RNA de um clone infeccioso, esse RNA é introduzido em células Vero produzindo novamente um novo vírus de progênie em P1. Esses novos vírus de progênie são distinguíveis de PDK-53. (Consulte, por exemplo, PIPIO).

[00041] Em outra modalidade, uma quimera de ácido nucleico pode ser uma quimera de ácido nucleico que tem, porém, sem limitação, uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica proteínas não estruturais de um vírus da dengue-2 atenuado e uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína estrutural do vírus da dengue-4 sozinho ou em combinação com outro flavivírus. Em outras modalidades, o vírus da dengue-2 atenuado pode ser uma cepa de vacina PDK-53 que tem um ou mais aminoácidos mutados (consulte os Exemplos). Essas mutações adicionais conferem características desejáveis de uso como dengue-2 vivo atenuado ou como os construtos quiméricos descritos no presente documento. Algumas modalidades incluem proteínas estruturais de uma ou mais dentre proteína C, prM ou E de um segundo vírus da dengue.

[00042] Outros aspectos incluem que vírus quiméricos podem incluir substituições, deleções ou inserções de nucleotídeo e aminoácido, por exemplo, no genoma de PDK-53 dengue-2 de controle para reduzir a interferência com as respostas de imunogenicidade a um sorotipo de vírus da dengue direcionado. Essas modificações podem ser feitas em proteínas estruturais e não estruturais, sozinhas ou em combinação com as modificações de exemplo reveladas no presente documento e podem ser geradas passando-se o vírus atenuado e obtendo uma composição melhorada para induzir uma resposta imunológica contra um ou mais sorotipos de vírus da dengue.

[00043] Determinadas modalidades reveladas no presente documento fornecem um método para produzir os vírus quiméricos desta invenção com o uso de técnicas recombinantes, inserindo as substituições exigidas no genoma de cadeia principal apropriado.

[00044] Outras modalidades no presente documento envolvem passar um vírus quimérico vivo atenuado confirmado (por exemplo, seguro e eficaz) para melhoras adicionais. Em determinadas modalidades, uma cadeia principal de dengue-2 usada no presente documento pode incluir uma ou mais mutações apresentadas na Tabela 3. Em outras modalidades, uma quimera de dengue-dengue do presente pedido pode incluir uma ou mais mutações conforme apresentadas na Tabela 3. Em ainda outras modalidades, uma quimera de dengue-dengue pode incluir todas as mutações para cada quimera conforme representado na Tabela 3 para Den-2/Den-1, Den-2/Den-3 ou Den-2/Den-4. As composições farmacêuticas que incluem um vírus vivo atenuado representado pelos construtos da Tabela 3 são contempladas. Por exemplo, as composições mono, di, tri ou tetravalentes são contempladas para o uso no presente documento com o uso de quimeras e vírus da dengue-2 vivos atenuados conforme apresentado na Tabela 3.

[00045] Em determinadas modalidades, uma variante de DEN-2 vivo atenuado contemplada no presente documento pode ser formulada em uma composição farmacêutica em que a composição farmacêutica pode ser administrada sozinha ou em combinação com quimeras de denguedengue ou quimeras de dengue-flavivírus. Em determinadas modalidades, uma composição bi, tri ou tetravalente pode ser administrada em uma única aplicação ou em múltiplas aplicações a um indivíduo.

QUIMERAS DE FLAVIVÍRUS

[00046] Os tipos de vírus da dengue 1 a 4 (DEN-1 a DEN-4) são patógenos de flavivírus transmitidos por mosquitos. O genoma de flavivírus contém uma região de não codificante 5' (5'-NC), seguida por uma região de codificação de proteína de capsídeo (C), seguida por uma região de codificação de proteína pré-membrana/membrana (prM), seguida por uma região de codificação de proteína de envelope (E), seguida pela região que codifica as proteínas estruturais (NS1-NS2A- NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) e, finalmente, uma região de não codificante 3' (3'NC). As proteínas estruturais virais são C, prM e E e as proteínas não estruturais são NS1-NS5. As proteínas estruturais e não estruturais são traduzidas como uma única glicoproteína e processadas por proteases celulares e virais.

[00047] As quimeras de flavivírus podem ser construtos formados fundindo-se genes de proteína não estrutural de um tipo ou sorotipo do vírus da dengue ou espécie de vírus da flaviviridae com genes de proteína, por exemplo, genes de proteína estrutural, de um tipo ou sorotipo diferente do vírus da dengue ou espécie de vírus da flaviviridae. Alternativamente, uma quimera de flavivírus da invenção é um construto formado fundindo-se genes de proteína não estrutural de um tipo ou sorotipo do vírus da dengue ou espécie de vírus da flaviviridae com sequências de nucleotídeos adicionais que direcionam a síntese de polipeptídeos ou proteínas selecionadas a partir de outros sorotipos de vírus da dengue ou outros vírus da flaviviridae.

[00048] Em outras modalidades, as quimeras de flavivírus imunogênicas e avirulentas fornecidas no presente documento contêm genes de proteína não estrutural do vírus da dengue-2 atenuado ou o equivalente dos mesmos e um ou mais dos genes de proteína estrutural ou porções antigênicas dos mesmos do flavivírus contra qual a imunogenicidade deve ser conferida. Os flavivírus adequados incluem, porém, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1.

[00049] Outros vírus da dengue adequados para o uso na construção de quimeras podem ser DEN-1 16007, DEN-2 16681, DEN-3 16562 e DEN-4 1036 virulentos do tipo selvagem e DEN-1 PDK-13, DEN-2 PDK- 53, DEN-3 PMK-30/FRhL-3 e DEN-4 PDK-48 atenuados de cepa de vacina. As diferenças genéticas entre os pares de vírus do tipo selvagem/atenuados DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4 são contempladas juntamente com as alterações nas sequências de aminoácido codificadas pelos genomas virais.

[00050] As listagens de sequência para DEN-2 PDK-53 correspondem à variante de DEN-2 PDK-53-V, em que a posição de nucleotídeo de genoma 5270 é mutada de uma A para uma T e a posição de aminoácido 1725 da poliproteína ou posição de aminoácido 250 da proteína NS3 contém um resíduo de valina. A variante de DEN- 2 PDK-53 sem essa mutação de nucleotídeo, DEN-2 PDK-53-E, difere- se de PDK-53-V apenas nessa posição. DEN-2 PDK-53-E tem uma A na posição de nucleotídeo 5270 e um glutamato na posição de aminoácido de poliproteína 1725, NS3 posição de aminoácido de proteína 250. Entende-se que as modalidades no presente documento incluem PDK 53 modificado que inclui uma ou mais passagens em uma célula hospedeira separada (por exemplo, células Vero, consulte a Tabela 1) em que características desejáveis de uso em composições de vacina contempladas no presente documento são geradas.

[00051] Em determinadas modalidades, as designações das quimeras podem se basear nas cadeias principais modificadas por clone infeccioso específicas para vírus DEN-2 e inserto de genes estruturais (prM-E ou C-prM-E) de outros vírus da dengue ou outros flavivírus. DEN-2 para a cadeia principal de dengue-2, seguido pela cepa a partir da qual os genes estruturais são inseridos. Uma variante de cadeia principal de DEN-2 é refletida na última letra após a designação numérica. Uma variante de cadeia principal de DEN-2 particular a partir da qual a quimera foi construída é indicada pela seguinte letra colocada após um hífen, 16681 progenitor (P), PDK-53-E (E) ou PDK-53-V (V); a última letra indica os genes estruturais de C- prM-E da cepa progenitora (P) ou seu derivado de vacina (V) ou os genes estruturais de prM-E do progenitor (P) ou seu derivado de vacina (V1). Por exemplo; DEN-2/1-VP denota a quimera que compreende a cadeia principal de DEN-2 PDK-53V atenuado que compreende uma valina em NS3-250 e os genes de C-prM-E de DEN-1 16007 do tipo selvagem; DEN-2/1-VV denota a cadeia principal de DEN-2 PDK-53V com a cepa de vacina da dengue-1, DEN-1 PDK-13; DEN-2/1-VP1 denota a cadeia principal de DEN-2 PDK-53V e os genes de prM-E do DEN-1 16007 do tipo selvagem; DEN-2/3-VP1 denota a cadeia principal de DEN-2 PDK-53V e os genes de prM-E do DEN-3 16562 do tipo selvagem; DEN-2/4VP1 denota a cadeia principal de DEN-2 PDK-53V e os genes de prM-E do DEN-4 1036 do tipo selvagem. Outras quimeras reveladas no presente documento são indicadas da mesma maneira.

[00052] Em uma modalidade, as quimeras reveladas no presente documento contêm o genoma de vírus da dengue-2 PDK-53 atenuado como a cadeia principal viral, no qual os genes de proteína estrutural que codificam as proteínas C, prM e E do genoma de PDK-53 ou combinações dos mesmos podem ser substituídos pelos genes de proteína estrutural correspondentes dentre os vírus dengue-1, dengue 3 ou dengue-4 e, opcionalmente, outro flavivírus do qual ser protegido, tal como um flavivírus diferente ou uma cepa de vírus da dengue diferente.

[00053] Nas regiões de proteína não estrutural, uma mutação de Gly- para-Asp (tipo selvagem-para-PDK-53) foi revelada em NS1-53 de proteína não estrutural (posição de nucleotídeo de genoma 2579); uma mutação de Leu-para-Phe (tipo selvagem-para-PDK-53) foi revelada em NS2A-181 de proteína não estrutural (posição de nucleotídeo de genoma 4018); uma mutação de Glu-para-Val (tipo selvagem-para- PDK-53) foi revelada em NS3-250 de proteína não estrutural (posição de nucleotídeo de genoma 5270); e uma mutação de Gly-para-Ala (tipo selvagem-para-PDK-53) foi revelada em NS4A-75 de proteína não estrutural (posição de nucleotídeo de genoma 6599). O vírus DEN-2 vivo atenuado da presente invenção inclui adicionalmente mutações conforme apresentadas em qualquer quimera ou vírus da dengue-2 vivo atenuado da Tabela 3.

[00054] A cepa de vírus PDK-53 tem um genótipo misturado no nucleotídeo de genoma 5270. Uma porção significativa (aproximadamente 29%) da população viral codifica o NS3-250-Glu não mutado que está presente no vírus DEN-2 16681 do tipo selvagem em vez da mutação de NS3-250-Val. Como ambas as variantes genéticas são avirulentas, essa mutação pode não ser necessária em uma quimera avirulenta.

[00055] Anteriormente, foi revelado que a avirulência da cepa de vírus PDK-53 atenuada pode ser atribuída às mutações na sequência de nucleotídeos que codifica proteínas não estruturais e na região de não codificante 5'. Por exemplo, uma mutação única em NS1-53, uma mutação dupla em NS1-53 e em 5'NC-57, uma mutação dupla em NS1- 53 e em NS3-250 e uma mutação tripla em NS1-53, em 5'NC-57 e em NS3-250 resultam na atenuação do vírus DEN-2. Portanto, o genoma de qualquer vírus da dengue-2 que contém tais substituições de aminoácido não conservadoras ou substituições de nucleotídeo nesses loci pode ser usado como uma sequência base para entregar os vírus PDK-53 modificados revelados no presente documento. Outra mutação na haste da estrutura de haste/alça na região não codificante 5' fornecerá estabilidade de fenótipo avirulento adicional, se desejado. As mutações a essa região rompem as estruturas secundárias potenciais importantes para a replicação viral. Uma mutação única nessa estrutura de haste curta (apenas 6 resíduos de nucleotídeo de comprimento) tanto em DEN quanto nos vírus da encefalite equina venezuelana rompe a formação da estrutura de grampo. Mutações adicionais nessa estrutura de haste diminuem a possibilidade de reversão nesse locus, enquanto mantêm a disponibilidade de vírus.

[00056] As mutações reveladas no presente documento podem ser alcançadas por qualquer método conhecido na técnica incluindo, porém, sem limitação, clones selecionados ou de ocorrência natural que têm recursos adicionais passados uma vez em uma linhagem celular de interesse (por exemplo, células Vero). É entendido por aqueles versados na técnica que os ensaios de triagem de virulência, conforme descritos no presente documento e conforme são bem conhecidos na técnica, podem ser usados para distinguir entre estruturais de cadeia principal virulentas e avirulentas.

CONSTRUÇÃO DE QUIMERAS DE FLAVIVÍRUS

[00057] As quimeras de flavivírus descritas no presente documento podem ser produzidas dividindo-se um ou mais dos genes de proteína estrutural do flavivírus contra o qual a imunidade de desejada em uma cadeia principal de genoma de vírus da dengue PDK-53 ou outros métodos conhecidos na técnica com o uso de engenharia recombinante para remover o gene PDK-53 correspondente e substituir o mesmo com um gene do vírus da dengue-1, dengue-3 ou dengue-4 ou outro gene conhecido na técnica. Alternativamente, com o uso das sequências fornecidas na listagem de sequências, as moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas de flavivírus podem ser sintetizadas com o uso de técnicas de síntese de ácido nucleico e inseridas em um vetor apropriado. O vírus avirulento imunogênico é, portanto, produzido com o uso de técnicas de engenharia recombinante conhecidas por aqueles versados na técnica.

[00058] Um gene alvo pode ser inserido na cadeia principal que codifica uma proteína estrutural de flavivírus de interesse para DEN-1, DEN-3, DEN-4 ou outro flavivírus. Um gene de flavivírus a ser inserido pode ser um gene que codifica uma proteína C, uma proteína PrM e/ou uma proteína E. A sequência inserida na cadeia principal de dengue-2 pode codificar ambas as proteínas estruturais PrM e E. A sequência inserida na cadeia principal de dengue-2 pode codificar todas ou uma dentre as proteínas estruturais C, PrM e E.

[00059] Os vírus quiméricos adequados ou quimeras de ácido nucleico que contêm sequências de nucleotídeos que codificam proteínas estruturais de outros flavivírus ou sorotipos de vírus da dengue podem ser avaliados quanto à utilidade como vacinas triando os mesmos para os marcadores de atenuação fenotípicos anteriores que indicam a avirulência e triando os mesmos para imunogenicidade. A antigenicidade e a imunogenicidade podem ser avaliadas com o uso de reatividade in vitro ou in vivo com anticorpos de flavivírus ou soro imunorreativo com o uso de procedimentos de triagem de rotina conhecidos por aqueles versados na técnica.

VACINAS CONTRA VÍRUS DA DENGUE

[00060] Em determinadas modalidades, os vírus quiméricos e quimeras de ácido nucleico podem fornecer vírus vivos atenuados úteis como imunógenos ou vacinas. Algumas modalidades incluem quimeras que exibem alta imunogenicidade ao vírus da dengue-4 enquanto não produz nenhum efeito letal ou patogênico perigoso.

[00061] Para reduzir a ocorrência de DHF/DSS em indivíduos, uma vacina tetravalente é necessária para fornecer imunidade simultânea para todos os quatros sorotipos do vírus. Uma vacina tetravalente é produzida combinando-se um vírus da dengue-2 vivo atenuado do presente pedido com as quimeras de dengue-2/1, dengue-2/3 e dengue- 2/4 descritas acima em um carreador farmaceuticamente aceitável para a administração como uma vacina multivalente.

[00062] Os vírus quiméricos ou quimeras de ácido nucleico desta invenção podem incluir genes estruturais do vírus vivo atenuado ou do tipo selvagem em uma cadeia principal de vírus DEN-2 atenuado ou virulento. Por exemplo, a quimera pode expressar os genes de proteína estrutural do vírus DEN-4 1036 do tipo selvagem, seu derivado de vacina candidato em ambos os antecedentes de DEN-2.

[00063] Os vírus usados nas quimeras descritas no presente documento podem ser cultivados com o uso de tecnologias conhecidas na técnica. As titulações de placa de vírus são, então, realizadas e as placas contadas a fim de avaliar a disponibilidade e as características fenotípicas das culturas proliferativas. Os vírus do tipo selvagem podem ser passados através de linhagens celulares cultivadas para derivar os materiais de partida candidatos atenuados.

[00064] Os clones infecciosos quiméricos podem ser construídos a partir de clones de sorotipo de dengue disponíveis. A clonagem dos fragmentos de cDNA específicos para vírus pode ser também realizada, se desejado. Os fragmentos de cDNA que contém os genes de proteína estrutural ou proteína não estrutural são amplificados pela reação em cadeia de transcriptase-polimerase inversa (RT-PCR) do RNA de vírus da dengue com vários iniciadores. Os fragmentos amplificados são clonados nos sítios de outros clones intermediários. Os clones de vírus da dengue quiméricos intermediários são, então, sequenciados para verificar a precisão do cDNA específico para vírus da dengue inserido.

[00065] Os plasmídeos quiméricos de comprimento de genoma completo construídos inserindo-se a região de gene de proteína estrutural e/ou proteína não estrutural dos vírus de sorotipo da dengue em vetores são obteníveis com o uso de técnicas recombinantes bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

ANÁLISE DE NUCLEOTÍDEO E AMINOÁCIDO

[00066] A mutação de NS1-53 no vírus de vacina de DEN-2 PDK-53 é significativa para o fenótipo atenuado desse vírus, porque o NS1-53- Gly do vírus DEN-2 16681 é conservado em quase todos os flavivírus, incluindo os vírus de carrapato, sequenciados para a data. O vírus de vacina DEN-4 também pode conter uma mutação de aminoácido na proteína NS1 em posição 253. Esse locus, que é uma mutação Gln para His em vírus de vacina DEN-4 PDK-48, é Gln em todos os quatro sorotipos selvagens do vírus da dengue. Esse resíduo de Gln é exclusivo para os vírus da dengue dentro do gênero flavivírus. A proteína NS1 é uma glicoproteína que é secretada de células infectadas com flavivírus. Está presente na superfície da célula infectada e anticorpos específicos de NS1 estão presentes no soro de indivíduos infectados com vírus. A proteção de animais imunizados com proteína NS1 ou passivamente com anticorpo específico de NS1 tem sido relatada. A proteína NS1 parece participar em replicação de RNA viral precoce.

[00067] As mutações que ocorreram nas proteínas NS2A, NS2B, NS4A e NS4B das cepas atenuadas de DEN-1, -2, -3 e -4 são conservadoras por natureza. As mutações NS4A-75 e NS4A-95 de vírus de vacina DEN-2 e DEN-4, respectivamente, ocorreram em sítios de conservação de aminoácido entre vírus da dengue, mas não entre flavivírus em geral.

[00068] A proteína NS3 flaviviral tem pelo menos duas funções reconhecidas: a proteinase viral e helicase/NTPase de RNA. A proteína de NS3 de 698-aa de comprimento (vírus de DEN-2) contém um domínio de protease de serina de amino-terminal (tríade catalítico NS3- 51-His, -75-Asp, -135-Ser) que é seguido de motivos de sequência para funções de helicase/NTPase de RNA (NS3-196-GAGKT, -284-DEAH, - 459-GRIGR). Nenhuma das mutações nas proteínas de NS3 de vírus de DEN-1, DEN-2, ou DEN-3 ocorreu dentro de um motivo reconhecido. A mutação Tyr para Phe de NS3-510 em vírus DEN-1 PDK-13 foi conservadora. Visto que os vírus DEN-2, -3 e -4 do tipo selvagem contêm Phe nessa posição, é improvável que a mutação Tyr para Phe desempenhe uma função na atenuação de vírus DEN-1. A mutação Glu para Lys de NS3-182 no vírus DEN-1 PDK-13 ocorreu em uma posição que é conservada como Asp ou Glu na maioria dos flavivírus transmitidos por mosquito e pode desempenhar alguma função em atenuação. Essa mutação foi localizada 15 resíduos aminoácido a montante do motivo de helicase de GAGKT. Conforme observado em relatos prévios, o NS3-250-Glu em vírus de DEN-2 16681 é conservado em todos flavivírus transmitidos por mosquito exceto pelo vírus da febre amarela.

[00069] As sondas de ácido nucleico hibridizam de modo seletivo com moléculas de ácido nucleico que codificam os vírus de DEN-1, DEN-3 e DEN-4 ou sequências complementares das mesmas. Por "seletivo" ou "de modo seletivo" significa uma sequência que não hibridiza com outros ácidos nucleicos para evitar detecção adequada do vírus da dengue. Portanto, no projeto de ácido nucleicos de hibridização, a seletividade dependerá dos outros componentes presentes em uma amostra. O ácido nucleico de hibridização deve ter pelo menos 70% de complementaridade com o segmento do ácido nucleico ao qual o mesmo hibridiza. Conforme usado no presente documento para descrever ácidos nucleicos, o termo "hibridiza de modo seletivo" exclui os ácidos nucleicos de hibridização aleatória ocasional e, desse modo, tem o mesmo significado de "que hibridiza especificamente". O ácido nucleico de hibridização de modo seletivo desta invenção pode ter pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% e 99% de complementaridade com o segmento da sequência ao qual o mesmo hibridiza, preferencialmente 85% ou mais.

[00070] Sequências, sondas e iniciadores que hibridizam de modo seletivo ao ácido nucleico de codificação ou o complementar, ou oposto, cepa do ácido nucleico são contemplados. A hibridização específica com ácido nucleico pode ocorrer com modificações menores ou substituições no ácido nucleico, desde que a capacidade de hibridização específica de espécie funcional seja mantida. Por "sonda" significa sequências de ácido nucleico que podem ser usadas como sondas ou iniciadores para hibridização seletiva com sequências de ácido nucleico complementares para a detecção ou ampliação das mesmas, cujas sondas podem variar no comprimento de cerca de 5 a 100 nucleotídeos, ou preferencialmente de cerca de 10 a 50 nucleo- tídeos, ou mais preferencialmente cerca de 18 a 24 nucleotídeos.

[00071] Se usada como iniciadores, a composição preferencialmente inclui pelo menos duas moléculas de ácido nucleico que hibridizam a diferentes regiões da molécula alvo de modo a ampliar uma região desejada. Dependendo do comprimento da sonda ou iniciador, a região alvo pode variar entre 70% de bases complementares e complementaridade total e ainda hibridizar sob condições severas. Por exemplo, para o propósito de detectar a presença do vírus da dengue, o grau de complementaridade entre o ácido nucleico de hibridização (sonda ou iniciador) e a sequência à qual o mesmo hibridiza é pelo menos suficiente para distinguir hibridização com um ácido nucleico de outros organismos.

[00072] As sequências de ácido nucleico que codificam o vírus de DEN-4, DEN-3 ou DEN-1 (por exemplo, elementos estruturais) podem ser inseridas em um vector, tal como um plasmídeo, e expressas de modo recombinante em um organismo vivo (por exemplo, em uma cadeia principal de dengue-2) para produzir vírus e/ou polipeptídeos e/ou peptídeos do vírus da dengue recombinante. Métodos de Detecção de Ácido nucleico Um teste genético rápido que é diagnóstico para cada um dos vírus de vacina descritos no presente documento é fornecido pela presente invenção. Essa modalidade da invenção aprimora a análise de vírus isolados do soro de humanos vacinados que desenvolveram uma viremia, bem como aprimora caracterização de viremia em primatas não humanos imunizados com os vírus de vacina candidatos.

[00073] Essas sequências incluem uma sonda de TaqMan de diagnóstico que serve para relatar a detecção do amplicon de cDNA ampliado a partir do modelo de RNA genômico viral usando-se uma reação em cadeia se polimerase/transcriptase reversa (RT/PCR), bem como os amplimers direto e reverso que são desenvolvidos para ampliar o amplicon de cDNA, conforme descrito abaixo. Em determinados casos, um dos amplimers foi desenvolvido para conter uma mutação específica de vírus de vacina na extremidade de 3'-terminal do amplimer, que torna, de modo eficaz, o teste ainda mais específico para a cepa de vacina porque extensão do iniciador no sítio alvo, e consequentemente ampliação, ocorrerão apenas se o modelo de RNA viral contiver aquela mutação específica.

[00074] O sistema de detecção de sequência de ácido nucleico com base em PCR automático pode ser usado, ou outra tecnologia conhecida para detecção de ácido nucleico. O ensaio de TaqMan é um ensaio altamente específico e sensível que permite visualização em tempo real automática e quantitação de amplicons gerados por PCR a partir de um modelo de ácido nucleico de amostra. TaqMan pode determinar a presença ou ausência de uma sequência específica. Nesse ensaio, um iniciador direto e um reverso são desenvolvidos para fortalecer a montante e a jusante do sítio de mutação alvo, respectivamente. Uma sonda de detector específica, que é projetada para ter uma temperatura de fusão de cerca de 10 graus C. maior do que qualquer um dos amplimers e contendo a mutação de nucleotídeo específica de vírus de vacina ou o complemento do mesmo (dependendo do filamento de RT/PCR amplicon que está sendo detectado), constituo o terceiro componente de iniciador desse ensaio.

[00075] Uma sonda desenvolvida para detectar especificamente um locus mutado em um dos genomas virais de vacina irá conter o nucleotídeo específico de vacina no meio da sonda. Essa sonda resultará em fluorescência detectável no ensaio de TaqMan se o modelo de RNA viral é específico de vírus de vacina. Entretanto, modelos de RNA genômico de vírus de DEN do tipo selvagem terá eficiência diminuída de hibridização de sonda por causa da incompatibilidade de nucleotídeo único (no caso dos vírus de DEN de vírus parentais) ou possivelmente mais do que uma incompatibilidade (conforme pode ocorrer em outros vírus de DEN do tipo selvagem) e não resultará em fluorescência significativa. A polimerase de DNA é mais provável de deslocar uma sonda incompatível a partir do modelo de amplicon de RT/PCR do que clivar a sonda incompatível para liberar o corante repórter (TaqMan Allelic Discrimination Assay, Applied Biosystems).

[00076] Uma estratégia para teste genético de diagnóstico faz uso de beacons moleculares. A estratégia de beacon molecular também utiliza iniciadores para ampliação de RT/PCR de amplicons, e detecção de uma sequência específica dentro de amplicon por uma sonda contendo corantes repórter e silenciador na sonda termini. Nesse ensaio, a sonda forma uma estrutura de ciclo de haste. O ensaio de beacons moleculares emprega corantes silenciador e repórter que diferem daqueles usados no ensaio de TaqMan. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00077] As modalidades no presente documento fornecem administração de composições para indivíduos em uma forma biologicamente compatível adequada para administração farmacêutica in vivo. Por "forma biologicamente compatível adequada para administração in vivo" significa uma forma do agente ativo (por exemplo, química farmacêutica, proteína, gene, das modalidades) a ser administrado em que qualquer efeito tóxico é superado pelos efeitos terapêuticos do agente ativo. A administração de uma quantidade terapeuticamente ativa das composições terapêuticas é definida como uma quantidade eficaz, em dosagens e para períodos de tempo necessários para alcançar o resultado desejado. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente ativa de um composto pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo de produzir uma resposta desejada no indivíduo. O regime de dosagem pode ser ajustado para fornecer a resposta terapêutica ideal.

[00078] Em uma modalidade, o composto (por exemplo, química farmacêutica, proteína, peptídeo etc. das modalidades) pode ser administrado de um modo conveniente, por exemplo, via subcutânea, intravenosa, por administração oral, inalação, aplicação intradérmica, transdérmica, aplicação intravaginal, aplicação tópica, administração intranasal ou retal. Dependendo da via de administração, o composto ativo pode estar contido em um tampão protetor (por exemplo FTA, F127/trehalose/albumina). Em uma modalidade, uma composição pode ser administrada oralmente. Em outra modalidade, a composição pode ser administrada de modo intravenoso. Em uma modalidade, a composição pode ser administrada de modo intranasal, tal como inalação. Em ainda outra modalidade, a composição pode ser administrada de modo intradérmico com o uso de um sistema livre de agulha (por exemplo, Pharmajet®) ou outro sistema de administração intradérmica.

[00079] Uma composição pode ser administrada em um indivíduo em um carreador ou diluente apropriado, co-administrada com inibidores de enzima ou em um carreador apropriado tal como lipossomas. O termo "carreador farmaceuticamente aceitável" conforme usado no presente documento é destinado a incluir diluentes tais como soluções salina e tampão aquoso. Pode ser necessário revestir o composto com, ou co- administrar o composto com um material para evitar a inativação do mesmo. O agente ativo também pode ser administrado de modo parenteral ou intraperitoneal. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietileno glicois líquidos, e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições comuns de armazenamento e uso, essas preparações podem conter um conservante para evitar a proliferação de micro-organismos ou outra formulação estabilizante (por exemplo, FTA).

[00080] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetável podem ser administradas por meio conhecidos na técnica. Por exemplo, soluções aquosas estéreis (quando solúvel em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão podes ser usados. Em todos os casos, a composição pode ser estéril e pode ser fluida na medida em que fácil siringabilidade existe. A mesma pode ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e pode ser preservada contra a ação de contaminação de micro-organismos tais como bactérias e fungos. O carreador farmaceuticamente aceitável pode ser um meio de dispersão ou solvente contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e similar), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela conservação do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção de micro-organismos pode ser alcançada aquecendo-se, expondo o agente ao detergente, irradiação ou adicionando vários agentes antibacterianos ou antifúngicos.

[00081] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se composto ativo (por exemplo, um composto que induz uma resposta imunológica a um ou mais sorotipos do vírus da dengue) na quantidade exigida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme exigido, seguido de esterilização filtrada.

[00082] Mediante formulação, as soluções serão administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade que é terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tal como o tipo de soluções injetáveis descritas acima. Contempla-se que as composições são especialmente adequadas para administração intramuscular, subcutânea, intradérmica, intranasal e intraperitoneal. Uma razão particular pode ser obtida tal como um 1:1, 1:2 ou outra razão (por exemplo, PFUs de um determinado sorotipo do vírus da dengue).

[00083] Os agentes terapêuticos ativos podem ser formulados dentro razões predeterminadas de misturas. A dose única ou múltiplas doses também podem ser administradas em um cronograma apropriado para uma determinada situação (por exemplo, antes de viagem, ocorrência de febre de dengue).

[00084] Em outra modalidade, as soluções nasais ou aspersões, aerossóis ou inalantes podem ser usados para entregar o composto de interesse. As formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e pessários.

[00085] Determinadas formulações podem incluir excipientes, por exemplo, farmacêutica grades de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e similares.

[00086] Uma composição farmacêutica pode ser preparada com carreadores que protegem ingredientes ativos contra rápida eliminação do corpo, tais como revestimentos ou formulações de liberação por tempo. Tais carreadores incluem formulações de liberação controlada, tal como, mas sem limitação, sistemas de entrega microencapsulada, e polímeros biocompatíveis biodegradáveis tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicolico, poliortoésteres, ácido polilático e outros são conhecidos.

[00087] As composições farmacêuticas são administradas em uma quantidade, e com uma frequência, que é eficaz para inibir ou aliviar efeitos colaterais de um transplante e/ou reduzir ou prevenir rejeição. A dosagem precisa e duração de tratamento podem ser determinados empiricamente com o uso de protocolos de teste conhecidos ou testando as composições em sistemas de modelo conhecidos na técnica e que extrapolam da mesma. As dosagens também podem variar com a severidade da afecção. Uma composição farmacêutica é geralmente formulada e administrada para exercer um efeito terapeuticamente útil enquanto minimiza os efeitos colaterais indesejáveis. Em geral, faixas de dose de cerca de 102 a 106 PFU podem ser administradas de modo inicial e opcional, seguido de uma segunda administração dentro de 30 dias ou até 180 dias depois, conforme necessário. Em determinadas modalidades, um indivíduo pode receber administração dupla de uma composição mono, bi, tri ou tetravalente revelada no presente documento em que a composição é uma mistura de composição única ou tem composições predeterminadas de diferentes sorotipos do vírus da dengue. Em algumas modalidades, uma quimera de DEN2/4 pode estar presente em concentrações mais altas do que outros sorotipos do vírus da dengue tais como um vírus da dengue 1 vivo, atenuado.

[00088] Ficará evidente que, para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos podem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual.

[00089] Em uma modalidade, uma composição revelada no presente documento pode ser administrada em um indivíduo de modo subcutâneo ou intradérmico.

[00090] As composições farmacêuticas contendo vírus da dengue atenuados vivos podem ser administradas em indivíduos, particularmente humanos, por exemplo por via subcutânea, intramuscular, intranasal, oral, tópica, transdérmica, parenteral, gastrointestinal, transbronquial e transalveolar. A administração tópica é realizada através de um creme, gel, solução para enxágue topicamente aplicado, etc. contendo quantidades terapeuticamente eficazes de inibidores de proteases de serina. A administração transdérmica é realizada através de aplicação de um creme, solução para enxágue, gel, etc. que tem a capacidade de permitir que os inibidores de proteases de serina penetrem na pele e entrem na corrente sanguínea. Além disso, bombas osmóticas podem ser usadas para administração. A dosagem necessária irá variar com a afecção particular sendo tratada, método de administração e taxa de depuração da molécula do corpo.

[00091] Em determinadas modalidades dos métodos da presente invenção, o indivíduo pode ser um mamífero tal como um humano ou um veterinário e/ou um animal domesticado ou gado ou animal selvagem.

MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[00092] Em uma modalidade da presente invenção, os métodos fornecem induzir uma resposta imunológica ao sorotipo(s) do vírus da dengue com o uso de uma formulação mono, bi, tri ou tetravalente de construtos virais quiméricos e/ou atenuados vivos contemplados no presente documento.

[00093] As modalidades da presente invenção são ilustradas adicionalmente pelos exemplos não limitantes a seguir, que não devem ser interpretados de modo algum como impondo limitações mediante o escopo das mesmas. Pelo contrário, deve-se entender claramente que reclassificação pode ser tida a várias outras modalidades, modificações e equivalentes das mesmas que, após a leitura a descrição no presente documento, pode sugerir por si àqueles versados na técnica sem se afastar do espírito da presente invenção ou o escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS

[00094] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar determinadas modalidades apresentadas no presente documento. Será verificado por aqueles versados na técnica que as técnicas reveladas nos Exemplos a seguir representam técnicas constatadas para funcionar bem nas práticas reveladas no presente documento e, desse modo, podem ser considerados constituir modos preferidos para a prática dos mesmos. Entretanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente revelação, verificar que muitas mudanças podem ser feitas em modalidades particulares que são reveladas e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e escopo no presente documento.

EXEMPLO 1

[00095] Em alguns métodos exemplificativos, as composições usadas para gerar, conforme denominadas no presente documento, "sementes originais de vírus (MVS)" são reveladas. Essas composições podem ser derivadas de um ou mais vírus da dengue atenuados vivos, tais como DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4. Em determinados métodos, as composições podem ser derivadas de um ou mais vírus da dengue atenuados vivos que incluem, mas sem limitação, construtos específicos revelados no presente documento denominados DENVax- 1, DENVax-2, DENVax-3, e DENVax-4. Em outros métodos exemplificativos, as estratégias usadas para gerar e caracterizar essas composições são fornecidas. Em ainda outras modalidades, formulações do vírus da dengue tetravalentes e caracterização genética e fenotípica dessas formulações são fornecidos.

PRODUÇÃO E ANÁLISE DE VÍRUS PRÉ-ORIGINAL DENVAX

[00096] Determinados procedimentos foram realizados para gerar sementes de vírus da dengue pré-original, tais como ampliação serial e purificação dos vírus da dengue (por exemplo, DENVax). Primeiro, os vírus DENVax foram re-derivados através de transfecção de RNA viral transcrito a partir do cDNA de DENVax recombinante de comprimento total em células de produção certificada (por exemplo, células Vero), resultando em semente de vírus P1 (passagem 1). Os quatro vírus de P1 de cada um dentre dengue-1 a dengue-4 foram, então, ampliados e com placa purificada para obter as sementes de P7 de vacina pré- originais candidatas (consulte a Tabela 1). Determinados testes foram realizados para analisar as passagens dos vírus da dengue. Por exemplo, o sequenciamento de genoma de comprimento total demonstrou que todos os vírus de semente de P2 (passagem 2) eram geneticamente idênticos ao vírus de vacina candidato de grau de pesquisa, derivado de pesquisa progenitor homólogo dos mesmos . Os fenótipos de laca original também foram retidos nos vírus P2. Seis vírus purificados de placa (P3 A-F) foram isolados para cada sorotipo do vírus da dengue (por exemplo, DENVax1-4 a partir das sementes P2, e cada placa isolada foi diretamente purificada por placa mais duas vezes. A terceria purificação de placa (P5) de cada vírus foi ampliada duas vezes (P6 A-F e P7 A-F) em células Vero para produzir as sementes DENVax de P7 pré-originais potenciais (Tabela 1). TABELA 1 EXEMPLO DE UMA REDERIVAÇÃO DE CGMP DE VÍRUS DENVAX EM CÉLULAS VERO WCB

[00097] Foram geralmente similares àqueles das sementes de P2. Em alguns experimentos exemplificativos, os títulos de vírus foram monitorados. Os títulos de vírus alcançaram mais de 6,0 log pfu/ml para a maioria das sementes de P7, exceto para 5 vírus. O sequenciamento de genoma de mais do que 60 sementes de vírus de vacina candidato após 10 ou mais passagens seriais em células Vero não identificou evento de reversão em NS1-53 e NS3-250 dos três principais determinantes de atenuação do vetor genético DENV-2 PDK-53, que sugere que esses 2 loci são um tanto estáveis em sementes de vírus de vacina de candidato. Todos cromatogramas de sequência das 24 cepas candidatas geradas tanto a partir de sequenciamento direto e reverso para esses dois sítios foram homogêneos sem nenhuma população de nucleotídeo pequena evidente nos loci genéticos de NS1-53 e NS3-250. Em contraste aos sítios de NS1 e NS3, diferentes níveis de reversões no locus de atenuação 5'NCR-57 foram identificados a partir de múltiplos vírus de vacina de grau de pesquisa serialmente passado, que sugere que esse locus pode não ser tão estável quanto NS1 e NS3 após múltiplas passagens na cultura celular. Portanto, um ensaio de ampliação de incompatibilidade sensível (TaqMAMA) foi desenvolvido para medir, de maneira precisa, a taxa de reversão no locus 5'NCR-57 através de RT-PCR em tempo real. Em alguns estudos, as taxas de reversão de 5'NCR-57 de todas as 24 das sementes de P7 foram medidas pelo TaqMAMA. Dependendo da concentração do RNA viral de entrada para cada vírus no ensaio, o limite de sensibilidade do TaqMAMA variou entre 0,01% e 0,07% de reversão, que é muito mais sensível do que o limite de sensibilidade de reversão de 10 a 30% detectável por análise de sequência de genoma consensual. Os dados resultantes ilustram que 15 dod 24 vírus de P7 teve reversão mínima ou indetectável (< 0,07%), um vírus (DENVax-3-D) teve quase 100% de reversão, e 8 vírus (1 DENVax-1, 1 DENVax-2, 2 DENVax-3, e 4 DENVax-4) tiveram reversão parcial na faixa de 0,08% a 12,85% (Tabela 2). O sequenciamento de genoma de comprimento total foi conduzido para 16 dos 24 vírus de P7 com baixos níveis de reversão de 5'NCR57 conforme medido por TaqMAMA. Todos os vírus sequenciados mantiveram os outros dois determinantes de atenuação DENVax (NS1-53, NS3-250), e todos tiveram mutações adicionais adquiridas que não estavam presentes nos clones de cDNA recombinantes modificados originais (Tabela 2). Em uma composição de vacina alvo exemplificativa, DENVax-1-A, DENVax-2-F, DENVax-3- F e DENVax-4-F foram selecionados como semente pré-original alvo para cada sorotipo porque os genótipos e fenótipos de placa dos mesmos mais se assemelhava àqueles dos recombinantes de vacina originalmente desenvolvidos. Os DENVax-1-A, DENVax-2-F, e DENVax-4-F tiveram duas mutações não sinônimas, e o DENVax-3-F teve uma. A evidência sugere que essas mutações adicionais observadas nessas 4 sementes pré-originais não causam preocupações de segurança ou alterações de imunogenicidade para os vírus. Essas sementes pré-originais foram ampliadas adicionalmente para gerar a MVS (semente original, designada como P7, Tabela 1).

[00098] Os métodos exemplificativos fornecidos no presente documento usaram RNA viral transcrito in-vitro purificado de plasmídeo de cDNA clonado como a fonte pura para transfectar células Vero certificadas para vacina para gerar vírus de vacina. As análises de sequência de genoma inteiro e purificações de placa seriais foram incorporadas nos procedimentos de fabricação para garantir sementes de vacina fabricadas com estabilidade genética e pureza ideais. Seis vírus clonados foram preparados como sementes pré-originais potenciais para cada sorotipo de DENVax. Por meio de análise genômica, incluindo TaqMAMA e sequenciamento genômico completo, bem como caracterização de fenótipos de placa virais, as sementes pré- originais foram escolhidas para avançar para produção de sementes de vírus originais para cada sorotipo (sorotipos 1-4). As sementes pré- originais selecionadas tiveram reversões indetectáveis (<0,01% ou <0,07%) no locus de 5'NCR-57, com 1 ou 2 substituições de aminoácido nos genomas das mesmas, e retiveram os fenótipos de placa pequena previamente observado. TABELA 2. CARACTERIZAÇÕES DE SEMENTES PRÉ-ORIGINAIS (P7) a Vírus clonado (por purificações de placa serial) selecionado para desenvolvimento adicional de MVS são designados em negrito. b *: Taxa de reversão < 0,07% (limite de detecção). **: Taxa de reversão < 0,01% (limite de detecção) c Fenótipos de placa: P2: similar a vírus de P2; L = maior do que vírus de P2, D = tamanho similar, mas parece, de alguma maneira, diferente em clareza das placas; S = menor do que P2. dSubstituições diferem dos clones de cDNA de DENVax modificados. As mutações de aminoácido são listadas com posição de resíduo da proteína de vírus e as mudanças (wtmutação). Número total de mutações silenciosas em genes estruturais e não estruturais de cada semente é listado. As mutações em região não codificante (NCR) também são notadas. e nd = Não realizado. Esses clones tiveram maiores taxas de reversão de 5'NCR-57 (por TaqMAMA) do que outros clones, então estavam excluídos de análise de sequência adicional.

EXEMPLO 2

[00099] Em alguns métodos exemplificativos, as composições de sementes de vírus originais, sementes de vírus de trabalho e sementes de vírus de a granel bem como a caracterização genética e fenotípica das mesmas são descritas. Essas composições são fornecidas para a fabricação de materiais clínicos e por fim suprimentos de vacina comercial. As purificações de placa serial e análise de sequência de genoma inteiro foram incorporados no processo de fabricação para garantir composições de sementes de vacina com segurança ideal e estabilidade genética para a fabricação de materiais de teste clínicos.

PRODUÇÃO E CONTROLES DE QUALIDADE DE FABRICAÇÃO PARA MVS, WVS E BVS

[000100] Em alguns estudos, MVS do 4 DENVax foram produzidos amplificando-se a semente de P7 pré-original em células Vero certificadas. Em outros estudos, MVS foram usados para fazer grandes quantidade de WVS em fábricas de célula. Adicionalmente, os estoques de BVS de DENVax foram ampliados a partir do WVS e foram formulados em misturas de produto de fármaco tetravalente a serem usadas para testes clínicos humanos. Os controles de qualidade para liberação de produto foram realizados em alguns métodos exemplificativos, incluindo, mas sem limitação, testar todos os MVS, WVS e BVS por identidade, título infecioso, esterilidade, micoplasma e agentes adventícios in vitro e in vivo. Todas as sementes passaram no teste de identidade de vírus com o uso de ensaios RT-PCR específicos de sorotipo, que mostraram ampliação positiva correspondente ao sorotipo do mesmo e negativo para sorotipos heterólogo (dados não mostrados). Nenhum micoplasma detectável ou agentes adventícios foram detectados nos estoques de MVS, WVS ou BVS.

ANÁLISE GENÉTICA DO MVS, WVS E BVS

[000101] Em determinados métodos exemplificativos, após a geração de MVS a partir das cepas de pré-MVS (P7) selecionadas acima foram produzidas e o respectivo RNA viral foi sequenciado novamente. O sequenciamento de genoma de comprimento total revelou que o MVS para DENVax-1 era idêntico à semente pré-original do mesmo, enquanto o WVS e BVS subsequente adquiriram 2 substituições adicionais em E-483 e NS4B-108 (consulte as Tabelas 2 e 3). A substituição de Ala em E-483 representou parte do genótipo no MVS, mas se tornou o genótipo dominante em BVS. DENVax-2 e DENVax-3 eram idênticos às respectivas sementes pré-originais dos mesmos (Tabela 2 e 3). O DENVax-2 MVS era idêntico à semente pré-original do mesmo, e o WVS e BVS tiveram 2 mutações adicionais em NS4A-36 e NS4B-111. Ambas as mutações eram parciais em WVS e eram o principal genótipo no BVS. O MVS de DENVax-3 era novamente idêntico à semente pré-original, mas o WVS e BVS continha uma substituição aa adicional em NS4A-23. O MVS de DENVax-4 adquiriu uma mutação de aminoácido adicional, em locus NS2A-99 (de Lys para genótipo misturado Lys/Arg) durante produção do MVS (Tabela 3). O WVS e BVS do mesmo retiveram o genótipo misturado Lys/Arg NS2A- 99, e o BVS teve um genótipo misturado Ser/Phe NS4B-238 extra. Os resultados de sequência consensuais também confirmaram que MVS, WVS bem como BV retiveram os três determinantes genéticos de atenuação no loci 5'NCR-57, NS1-53 e NS3-250. A análise do locus de atenuação menos estável por TaqMAMA demonstrou que a taxa de reversão de 5'NCR-57 entre <0,7% a e 0,13% entre MVS, <0,07% entre WVS, e entre <0,07 e 0,21% entre BVS. Uma reversão de 3% no locus 5'NCR-57 foi considerada a taxa máxima permissível para aceitação de um lote de vacina (Tabela 3). Tabela 3. Substituições de nucleotídeo e aminoácido em sementes de DENVax

[000102] A análise de sequência de genoma inteiro revelou que uma mutação de aminoácido adicional desenvolveu no MVS de DENVax-4, enquanto os outros três lotes de MVS de DENVax retiveram a sequência de genoma consensual das sementes pré-originais dos mesmos. Em geral, a partir da derivação das sementes de P1 para as sementes pré-originais (P7), apenas 1 ou 2 mutações não sinônimas ocorreram em uma determinada semente. A partir de sementes de P1 para MVS (P8), 2 a 7 substituições de nucleotídeo foram identificadas em qualquer determinada semente de DENVax e apenas 2 a 3 dessas substituições resultaram em mudanças de aminoácido. Desse modo, mudanças menores ocorreram. Os vírus de RNA são propenso a erro na replicação de genoma dos mesmos, então substituições genéticas em genoma de flavivirus durante passagens celulares não são inesperadas. Nenhuma das mutações silenciosas no MVS estava dentro de 5' ou 3'NCR que pode afetar replicação de vírus. Apenas a mudança em prM-52 Lys-Glu do DENVax-2, e a substituição em NS2A- 66 Asp-Gly de DENVax-4 não são conservadoras. A mutação de NS2A-66 do DENVax-4 é na parte de cadeia principal não estrutural do DENV-2 PDK-53. Embora o locus de NS2A-66 seja normalmente Asp entre várias cepas de DENV-2, é normalmente Gly para DENV-4. É possível que a mudança de Asp para Gly no DENVax-4 seja relevante para adequação do DENVax-4 em células Vero. A mutação de DENVax-2 prM-52 reside na porção de C-terminal do prM que é clivado a partir das partículas de vírus maduras. Em alguns métodos exemplificativos, a caracterização fenotípica foi realizada para confirmar que nenhuma das mutações nas sementes de MVS alterou de modo significativo os fenótipos de atenuação da vacina.

[000103] Os vírus de DENVax demonstraram alta estabilidade genética durante o processo de fabricação. Os três loci de atenuação DENV-2 PDK-53 definidos localizados em 5'NCR, NS1-53 e NS3-250 permaneceram estáveis na sequência de genoma consensual mediante passagem serial do DENVax a partir de cepas pré-originais para preparações de vacina a granel. O TaqMAMA altamente sensível do locus 5'NCR-57 demonstrou reversão mínima ou indetectável no MVS, WVS (P9/de trabalho), e BVS (Semente de Vírus a Granel para vacinas) de sorotipos do vírus da dengue. As taxas de reversão de 5'NCR-57 das preparações de BVS de DENVax (P10-equivalente) foram significativamente menores do que as taxas de reversão de 5'NCR-57 que evoluíram em candidatos de vacina de grau de pesquisa após 10 passagens seriais em células Vero (4 a 74% de reversão). A estratégia para fabricação em larga escala das sementes de DENVax fornecida no presente documento resultou em uma semente de vacina geneticamente estável que reteve as marcações de atenuação nos vírus de vacina de candidato.

FENÓTIPO DE PLACA DE MVS DE DENVAX

[000104] Em um método exemplificativo, os fenótipos de placa do MVS de DENVax foram comparados com vírus da dengue do tipo selvagem e os vírus quiméricos de grau de pesquisa homólogos dos mesmos em células Vero (Figura 2). Todo o MVS de DENVax-1, -2, e - 3 produziram placas que eram significativamente menores do que os homólogos de tipo selvagem dos mesmos e muito similares (dentro de 0,4-mm de diferenças) aos vírus de grau de pesquisa homólogos dos mesmos em células Vero. MVS de DENVax-4 também era significativamente menor do que o DENV-4 de tipo selvagem, mas era um pouco maior (0,9 mm de diferença) do que a quimera de D2/4-V derivada de laboratório original.

[000105] A Figura 2 representa um histograma exemplificativo que ilustra tamanhos de placa do MVS de DENVax em contraste com vírus do tipo selvagem de controle e vírus de candidato de vacina de grau de pesquisa. Os diâmetros médios de placa (mm) ± SD (barras de erro) das placas de vírus em células Vero sob revestimento de agarose mediram no dia 9 pi. Os vírus de DEN do tipo selvagem, representados por barras pretas, e vírus de candidato de vacina de grau de pesquisa previamente publicado, representados por barras brancas, foram incluídos para controle e comparação às sementes de vacina originais de DENVax representadas por barras cinzas.

SENSIBILIDADE DE TEMPERATURA DE DENVAX MVS

[000106] Em outro método exemplificativo, a sensibilidade de temperatura foi testada em células Vero para o DENVax MVS e comparada com o vírus do tipo selvagem homólogo e o vírus de vacina quimérico de grau de pesquisa original dos mesmos. O (wt) DENV-3 16562 de tipo selvagem não era sensível à temperatura. O sorotipo 1 do vírus da dengue wt e o sorotipo 4 do vírus da dengue eram moderadamente sensíveis à temperatura a 39 °C (títulos foram aproximadamente 1,0 log10 pfu/ml menores a 39 °C do que a 37 °C, Figura 3). O sorotipo 2 do vírus da Dengue Wt 16681 foi o mais sensível à temperatura dos vírus da Dengue wt testados, e resultou em uma queda de título de 100 vezes a 39 °C. DENVax-1, -2, e -3 eram tão sensíveis à temperatura quanto os vírus de vacina quiméricos de grau de pesquisa homólogos originais dos mesmos (Figura 2). Os títulos a 39 °C caíram entre 2,0 e 3,0 log10 pfu/ml para essas cepas de DENVax. DENVax-4 também foi sensível à temperatura, demonstrando uma redução de 5 vezes em título. Entretanto, o D2/4V de grau de pesquisa original demonstrou redução de cerca de 10 vezes em título. O MVS de DENVax-4 estabilizado final continha F127 (e outros agentes conhecidos por estabilizar essas formulações (FTA)), que foi mostrado aprimorar estabilidade térmica dos vírus da Dengue. A presença do F127 em DENVax-4 MVS provavelmente contribuiu para a sensibilidade de temperatura menos pronunciada do vírus no ensaio de cultura Vero. Em um experimento separado, a sensibilidade à temperatura de uma cepa de DENVax-4 derivada de MSV na ausência de F127 foi avaliada adicionalmente. Para remover o F127 da cepa, RNA viral foi isolado de uma preparação de vírus a granel de DENVax-4 e foi transfectado em células Vero. Esse vírus DENVax-4 pareceu ser tão sensível à temperatura quanto a cepa de pesquisa de D2/4 V (título reduzido 1,5 log10 pfu/ml) no dia 3 pi na ausência de F127 (Figura 3).

[000107] A Figura 3 ilustra um histograma exemplificativo que ilustra sensibilidades de temperatura de DENVax MVS. Os vírus da dengue do tipo selvagem e os vírus de candidato de vacina de grau de pesquisa previamente publicados foram incluídos para comparação. O MVS de DENVax-4 contém F-127 adicional que pode mascarar os resultados de sensibilidade à temperatura do vírus nesse ensaio. Um experimento separado que analisa um DENVax-4 substituto na ausência de F127 também estava incluído. Títulos médios ± SD (barras de erro) dos vírus replicaram em células Vero a 37 °C ou 39 °C.

REPLICAÇÃO DE MVS DE DENVAX EM CÉLULAS C6/36 DE MOSQUITO

[000108] Em alguns métodos exemplificativos, as MVS de DENVax foram cultivadas em células C6/36 para verificar sua retenção do fenótipo de atenuação in vitro, com o conhecimento de que os vírus de vacina quimérica de grau de pesquisa retiveram o fenótipo de atenuação do vírus DENV-2 PDK53 de cadeia principal nessas células de mosquito. Em comparação os vírus da Dengue wt, as MVS de DENVax-1, DENVax-2 e DENVax-4 mostraram redução de proliferação significativa (redução de pelo menos 3 log 10 pfu/ml) em células C6/36 no dia 6 pi (Figura 4). As MVS de DENVax-3 também exibiram proliferação reduzida em comparação ao DENV-3 16562 wt, mas a redução não foi tão marcada (redução de 1 a 2 log10 pfu/ml). No entanto, as titulações de C6/36 dos lotes de semente de DENVax- 3 foram similares (dentro de 1 log10 pfu/ml de diferença) ao título de C6/36 do vírus de vacina D2/3-V quimérica de grau de pesquisa.

[000109] A Figura 4 ilustra um histograma exemplificativo que plota a proliferação restrita de MVS de DENVax (barras cinza) em células C6/36 em comparação com vírus da Dengue wt (barras pretas) e vírus de vacina de grau de pesquisa (barras brancas). Titulações médias ± SD (barras de erro) dos vírus replicados em células C6/36 6 dias pi.

TAXAS DE INFECÇÃO, DISSEMINAÇÃO E TRANSMISSÃO DE VÍRUS EM MOSQUITOS INTEIROS

[000110] Em alguns métodos exemplificativos, as taxas de infecção e disseminação da DENVax foram comparados com seus vírus da Dengue wt progenitores. Em determinados experimentos exemplificativos, experimentos de infecção oral foram conduzidos em mosquitos Ae. aegypti. Farinhas de sangue infecciosas foram tituladas de volta para medir as titulações de vírus e apenas os experimentos com titulações de vírus similares na farinha de sangue (diferenças de menos do que 1 log10 pfu/ml) entre vírus da Dengue progenitores e DENVax para cada sorotipo foram incluídos para comparações na Tabela 4. DENVax-1, DENVax-2 e D2 PDK-53- VV45R de grau de pesquisa não infectaram os mosquitos através de alimentação oral, o que é significativamente diferente (p < 0,0001) de seus vírus progenitores, DENV-1 16007 (44% de infecção) e DENV-2 16681 (43,3% de infecção). Devido ao fato de que nenhum mosquito foi infectado por DENVax-1 e 2, houve pouca ou nenhuma disseminação em relação a esses dois vírus de vacina. Apesar de DENVax-4 não ter infectado alguns mosquitos através de alimentação oral (2 dentre 55), a taxa de infecção foi significativamente mais baixa (p < 0,05) do que seu vírus wt progenitor, DENV-4 1036 (8 dentre 50). DENVax-3 não infectou quaisquer mosquitos em dois experimentes com titulações virais de farinha de sangue de 5,2±0,02 log10 pfu/ml (Tabela 4) e em um experimento separado com título viral de farinha de sangue de 6,0 log10 pfu/ml, apenas 1 dentre 30 mosquitos tornaram-se infectados (dados não mostrados). No entanto, o vírus 3 da Dengue wt 16562 também teve uma taxa de infecção muito baixa (8%) a 5,2 log10 pfu/ml, e a taxa não aumentou em um experimento separado com um título viral de farinha de sangue mais alta a 6,2 log10 pfu/ml (3%, 1 positivo dentre 30 mosquitos, dados não mostrados). Embora o vírus 3 da Dengue e o vírus 4 Dengue do tipo selvagem (wt) tenham tido taxas de infecção significativamente mais baixas do que o vírus 1 da Dengue vírus-1 e o vírus 2 da Dengue wt, as titulações virais médias nos mosquitos infectados foram similares (3,1 a 3,9 log10 pfu/mosquito). Em contraste, as titulações de DENVax-4 dos dois mosquitos infectados foram ambas mínimas (0,7 log10 pfu/mosquito), que foram 1.000 vezes mais baixas do que o título dos mosquitos infectados por sorotipo 4 do vírus da Dengue wt 1036 (3,9 ± 1,5 pfu/mosquito).

[000111] Para aqueles mosquitos que foram infectados, a disseminação para fora do intestino intermediário poderia ser avaliada por determinação de se o vírus estava presente nas pernas. Os quatro DENVs progenitores resultaram em taxas de disseminação na faixa entre 36,3% e 62,5%, e suas titulações virais médias (em log10 pfu) das pernas estavam entre 0,9±0,3 e 2,2±0,7 (excluindo amostras negativas). Nenhum dos dois mosquitos infectados com DENVax-4 resultou em disseminação de vírus para as pernas (Tabela 4). Apensar de o vírus disseminado ter sido detectável nas pernas, nenhum dos quatro vírus da Dengue wt foi detectável na saliva de mosquitos infectados oralmente, sugerindo que as condições de alimentação oral podem não ser suficientemente sensíveis para medir a taxa de transmissão desses DENVs. Portanto, em outros métodos exemplificativos, infecções de mosquito artificiais altamente rigorosas por inoculação IT direta foram subsequentemente realizadas (Tabela 4). Exceto por DENVax-4, todos os vírus (wt e DENVax) atingiram 100% de infecção no Ae. aegypti inoculado IT. O inóculo de DENVax- 4 teve um título viral ligeiramente mais baixa do que os outros três inóculos viriais, mas ainda infectou com sucesso 70% dos mosquitos inoculados. A despeito das taxas de infecção corporal altas atingidas por inoculação IT, todos os quatro vírus DENVax exibiram taxas de transmissão significativamente mais baixas (p < 0,005) ou não detectáveis (0 a 10%) em comparação aos vírus da Dengue wt (43 a 87%, Tabela 4). Os vírus DENVax demonstraram pouca ou nenhuma infecção e disseminação após alimentação oral, e os resultados IT altamente rigorosos confirmaram a capacidade de transmissão mínima desses vírus DENVax em Ae. aegypti. TABELA 4: TAXAS DE INFECÇÃO, DISSEMINAÇÃO E TRANSMISSÃO DE VÍRUS EM MOSQUITOS INTEIROS a títulos virais ou Média±desvio padrão se de mais de um 1 experimento em farinha de sangue (log10 pfu/ml) por titulação reversa b Taxa de vírus detectada em corpos de mosquitos. P/N = mosquitos positivos/total c Títulos virais médios ± desvio padrão (log10 pfu/mosquito) em corpo de mosquito, apenas amostras positivas positive estão incluídas para cálculo d Análise estatística das diferenças entre DENV wt e DENVax por probabilidade Exata de Fisher e Taxa de vírus detectada nas pernas dos mosquitos positivamente infectados f Taxa de vírus detectada na saliva dos mosquitos positivamente infectados. Usado para medir eficácia de transmissão

[000112] A competência de vetor é um componente de segurança importante para vírus de vacina de flavivírus vivo atenuado. Anteriormente, o vírus DENV-2 PDK-53-VV45R de grau de pesquisa e os derivados wt foram testados em Ae. aegypti e concluído que a mutação de atenuação de NS1-53-Asp foi o determinante dominante para replicação de mosquito debilitada. Os outros dois loci de atenuação principais da vacina DENV-2 PDK-53, nucleotídeo 5'NCR-57-T e NS3- 250-Val, também exibiram algum efeito de inibição sobre a replicação de mosquitos, fornecendo, assim, restrições redundantes para competência de vetor de mosquito. Alguns métodos exemplifica- tivos descritos no presente documento foram usados para testar a infecção oral e IT de mosquito e a replicação para todas as quatro cepas de DENVax. DENVax-1, 2 e 3 não infectaram quaisquer mosquitos Ae. aegypti através de infecção oral (Tabela 4). A DENVax-4 infectou apenas 3,6% de mosquitos expostos oralmente, um nível significativamente mais baixo do que do aquele do DENV-4 wt com um título médio replicativo nos corpos dos mosquitos mais baixo do que aquele de mosquitos infectados por DENV-4 wt. De modo surpreendente, DENVax-4 foi detectada nas pernas dos mosquitos infectados, sugerindo que DENVax-4 não teve capacidade para disseminar-se a partir do intestino intermediário após a infecção oral. As taxas de infecção para DENVax-1, 2 e 4 foram todas significativamente menores do que suas contra partes wt, mas a diferença não foi significativa entre DENVax-3 e DENV-3 wt 16562 devido às taxas de infecção muito baixas para ambos os vírus. Em comparação a outras cepas wt de DENV avaliadas em Ae. aegypti coletado da mesma Província Mae Sot, Tailândia, as cepas de vírus da Dengue wt progenitoras usadas para projetar DENVax pareceram ter taxas de infecção e disseminação mais baixas por infecção oral. Os DENV-1 wt PUO359, DENV-2 PUO218, DENV-3 PaH881/88 e DENV-4 1288 usados para projetar as vacinas de ChimeriVax-DEN baseadas em vacina 17D de Febre Amarela (YF) tiveram taxas de infecção na faixa de 47 a 77%. Em contraste, a vacina YF 17D não pode infectar Ae. aegypti. Embora as cepas ChimeriVax contivessem o prM-E desses DENV wt altamente infecciosos, a ChimeriVax retém o fenótipo de atenuação de mosquito de sua cadeia principal replicativa YF 17D. Os resultados fornecidos no presente documento indicaram também que a atenuação de mosquito de cadeia principal de DENV-2 PDK-53 foi mantida nas cepas DENVax. Adicionalmente, o uso de cepas de vírus da Dengue wt com infectividade de mosquito mais baixa em construtos incluídos em composições descritas no presente documento fornece um recurso de segurança adicional.

[000113] Os resultados de infecção oral ilustram que o DENVax teve capacidade de disseminação e infectividade de mosquito mínima . Adicionalmente, os experimentos de infecção IT mais sensíveis e rigorosos foram realizados para analisar, ainda, o potencial de DENVax ser transmitido por Ae. aegypti. Os resultados de IT demonstraram que todos os quatro vírus DENVax tiveram potencial de transmissão de mosquito não detectável ou mínimo em comparação a suas contrapartes wt. A transmissão de DENVax poderia apenas ocorrer teoricamente se (1) o vetor se alimentar de uma vacina com uma viremia suficiente para infectar o intestino intermediário do mosquito, (2) o vírus tiver capacidade de replicação no epitélio do intestino médio e puder disseminar-se subsequentemente para fora do intestino intermediário e (3) o vírus disseminado puder replicar-se em glândula salivar e expectorar vírus suficiente na saliva para transmissão. O limite de viremia humana exigido para infectar mosquitos não foi estabelecido adequadamente, mas a viremia humana pode ser dose50 infecciosa de 106 a 108 mosquitos (MID50)/ml após a infecção por DENV wt natural. Essa MID50 foi baseada em inoculação IT direta de mosquitos com plasma humano diluído. A análise de DENVax em primatas não humanos indicou que os títulos de viremia após imunização com DENVax foram muito baixos (menos do que 2,4 log10 pfu/ml) e duraram por 2 a 7 dias. Dados os níveis de viremia baixos e a capacidade de infecção, disseminação e transmissão de mosquito baixa de DENVax, é improvável que esses vírus de vacina possam ser transmitidos por mosquitos na natureza ou causar viremia.

[000114] Portanto, propõe-se que qualquer uma das passagens de qualquer um dos sorotipos (P1 a P10) poderia ser usada em uma composição para gerar uma vacina segura e eficaz contra um, dois, três ou todos os quatro sorotipos de vírus da dengue. NEUROVIRULÊNCIA EM CAMUNDONGOS EM ALEITAMENTO

[000115] Os vírus de vacina de grau de pesquisa originais foram altamente atenuados para neurovirulência em camundongos ICR recém-nascidos mantidos confinados a DVBD/CDC. Todos esses camundongos sobreviveram ao estímulo ic (intracerebral) com 104 pfu de cada vírus de vacina. O vírus 16681 de sorotipo 2 do vírus da Dengue wt, por outro lado, resultou em 62,5% a 100% de mortalidade nesses camundongos CDC-ICR em vários experimentos. Em alguns experimentos, camundongos ICR comerciais obtidos junto ao Taconic Labs (Taconic-ICR) foram usados para estudar neurovirulência em camundongos recém-nascidos. Observou-se que os camundongos Taconic-ICR recém-nascidos foram significativamente mais suscetíveis à infecção por sorotipo 2 de vírus da Dengue do que os camundongos CDC-ICR anteriores. A Figura 5A sumariza a neurovirulência de sorotipo 2 de vírus da Dengue wt 16681 em camundongos de colônia CDC-ICR e recém-nascidos Taconic-ICR estimulados ic com 104 pfu do vírus. Os camundongos Taconic-ICR (100% de mortalidade em 32 camundongos, tempo médio de sobrevivência de 8,3 ± 0,5 dias) foram mais suscetíveis ao estímulo ic com sorotipo 2 de vírus da Dengue 16681 do que os camundongos CDC-ICR anteriores (91% de fatalidades em 72 camundongos, tempo médio de sobrevivência de 14,6 ± 2,3 dias).

[000116] Em outros métodos de exemplo, a fim de avaliar a neurovirulência da MVS de DENVax, os camundongos Taconic-ICR inicialmente foram estimulados ic (por via intracerebral) com uma dose de aproximadamente 104 pfu de sorotipo 2 de vírus da Dengue wt 16681, D2 PDK-53 VV45R, D2/3-V ou vírus DENVax 1 a 4 em um (n=16) ou dois (n=31-32) experimentos (Figura 5B). Nessa dose, o vírus de grau de pesquisa D2/3-V, assim como DENVax-1 e MVS de DENVax-3 exibiram fenótipos de neurovirulência completamente atenuados (nenhuma enfermidade ou mortalidade). Conforme esperado, o sorotipo 2 de vírus da Dengue wt foi concluído como sendo "fatal", com tempo médio de sobrevivência de camundongo (AST) de 8,3 ± 0,8 dias. Nesses camundongos Taconic-ICR sensíveis a sorotipo 2 de vírus da Dengue, o vírus de grau de pesquisa D2 PDK-53-VV45R resultou em 81,3% de mortalidade. A MVS de DENVax-2 e a MVS de DENVax-4 foram uniformemente fatais no Taconic-ICR, mostrando valores AST de 9,8 ± 1,7, 10,2 ± 1,4 e 11,3 ± 0,4 dias, respectivamente.

[000117] Em alguns métodos exemplificativos, a neurovirulência de vírus 16681 de sorotipo 2 de vírus da Dengue wt foi comparada com aquela de D2 PDK-53 VV45R, MVS de DENVax-2 e MVS de DENVax-4, assim como vírus de grau de pesquisa D2/4-V, em uma dose 10 vezes mais baixa (103 pfu, Figura 5C). O sorotipo 2 de vírus da Dengue wt reteve um fenótipo neurovirulento uniformemente fatal, com AST de 9,0 ± 1,4 dias, nessa dose de estímulo mais baixa. Os outros 4 vírus exibiram fenótipos de neurovirulência intermediários, e o grau de neurovirulência foi sorotipo-específico. O vírus D2 PDK-53-VV45R e seu cognato de MVS de DENVax-2 mostraram uma atenuação significativa (32,3% de sobrevivência com AST de 13,1 ± 3,8 dias e 31,2% de sobrevivência com AST de 10,5 ± 3,4 dias, respectivamente). Tanto a MVS de DENVax-4 como o vírus D2/4-V de grau de pesquisa foram altamente atenuados por neurovirulência (81,3% de sobrevivência com AST de 18,8 ± 5,8 dias e 100% de sobrevivência, respectivamente). Os resultados sugeriram que a MVS de DENVax-1 e 3 exibiu atenuação completa de neurovirulência, enquanto os lotes de MVS de DENVax-2 e 4 mantiveram fenótipos de atenuação que lembravam, de modo próximo, seus candidatos de vacina de vírus de grau de pesquisa homólogos.

[000118] As Figuras 5A a 5C representam gráficos exemplificativos que ilustram a neurovirulência em camundongos recém-nascidos testados com várias composições, incluindo sorotipo 2 de vírus da Dengue wt e diferentes vírus da Dengue atenuados. Resultados agrupados de inúmeros experimentos que sumarizam a neurovirulência de vírus 16681 de sorotipo 2 de vírus da Dengue wt em camundongos recém-nascidos CDC-ICR (n=72) e Taconic-ICR (n=32) estimulados ic com 104 pfu do vírus (A). Neurovirulência de MVS de DENVax testada em camundongos Taconic-ICR com uma dose de 104 pfu (B) ou 103 pfu (C). Os número de animais testados por grupo em um experimento (n=16) ou dois experimentos agrupados (n=31 ou 32) são indicados.

FENÓTIPO DE PLACA DE WVS E BVS

[000119] Determinados estudos foram realizados para comparar os fenótipos de placa de WVS e BVS com MVS, vírus da Dengue wt e suas quimeras de grau de pesquisa derivadas de laboratório homólogas em células Vero (Figura 6). Os tamanhos de placa médios foram calculados a partir de 10 placas para cada vírus de vacina, mas a partir de números reduzidos de DENV-1, 3 e 4 wt. Todos os vírus MVS de DENVax-1, 2 e 3 produziram placas que foram significativamente menores que seus homólogos wt e muito similares (dentro de diferenças de 0,4 mm) a seus vírus de grau de pesquisa homólogos em células Vero. A MVS de DENVax-4 foi também significativamente menor do que o DENV-4 wt, mas foi ligeiramente maior (0,9 mm) do que a quimera de D2/4-V derivada de laboratório original. Com a exceção do DENVax-2, todas as WVS e BVS da DENVax-1, 3, 4 retiveram tamanhos de placa significativamente menores do que aqueles produzidos a partir de seus homólogos wt. As WVS e BVS de DENVax-2 produziram placas que foram similares às placas de vírus DENV-2 wt em células Vero, mas quanto testadas em células LLC-MK2 das sementas fabricadas de DENVax-2 produziram placas que eram um pouco maiores do que aquelas do DENV-2 wt (1,4 ± 0,4) e similares ao D2 PDK-53-VV45R derivado de laboratório (1,0 ± 0,3) (Figura 6).

[000120] A avaliação dos marcadores fenotípicos de atenuação viral, incluindo fenótipo de placa pequena, sensibilidade à temperatura, replicação reduzida em células de mosquito, infecção/disseminação/trans- missão reduzidas por mosquitos e neurovirulência reduzida em camundongos ICR recém-nascidos, foi realizada para as composições de estoques de MVS. Os resultados indicaram que todas as DENVax retiveram os fenótipos de atenuação esperados similares aos vírus de vacina de grau de pesquisa originais.

[000121] Dado que as mutações responsáveis pela atenuação são conservadas em todas as MVS, WVS e BV, pode ser esperado que os fenótipos atenuados a serem retidos no material fabricado para testa clínico em humanos.

[000122] A Figura 6 representa um histograma exemplificativo que ilustra o tamanho de placa das MVS, WVS e BVS de DENVax. Diâmetros médios de placa ± SD (barras de erro) das placas de vírus em células Vero ou LLC-MK2 sob sobreposição de agarose medidos no dia 9 pi. Os DENVs wt e vírus candidatos de vacina de grau de pesquisa previamente publicados foram incluídos para controle e comparação.

REPLICAÇÃO DE VÍRUS EM CÉLULAS C6/36 DE MOSQUITO

[000123] Os estudos anteriores demonstraram que os vírus de vacina â base de PDK-53 de grau de pesquisa retiveram o fenótipo de atenuação do vírus DENV-2 PDK53 de cadeia principal em células C6/36. Em alguns métodos exemplificativos, as MSV, WVS e BVS de DENVax foram proliferadas em células C6/36 para verificar sua retenção de seu marcador de atenuação in vitro após fabricação em larga escala. Em comparação aos vírus da Dengue wt, exceto pelo DENVax-3, as sementes fabricadas mostraram redução de proliferação marcada (redução de pelo menos 3 log10 PFU/ml) em células C6/36 no dia 6 pi (Figura 7). As sementes de DENVax-3 também exibiram proliferação reduzida em comparação ao DENV-3 16562 wt, mas a redução não foi tão marcada (redução de 1 a 2 log10 PFU/ml). No entanto, os títulos dos lotes de semente de DENVax-3 foram similares (dentro de 1 log10 PFU/ml de diferença) ao vírus de vacina D2/3-V quimérica de grau de pesquisa.

[000124] A Figura 8 representa um histograma exemplificativo que plota a proliferação restrita de MVS, WVS e BVS de DENVax em células C6/36. Titulações médias ± SD (barras de erro) dos vírus replicados em células C6/36 7 dias pi. Os vírus da Dengue wt e vírus candidatos de vacina de grau de pesquisa previamente publicados foram incluídos para comparação.

NEUROVIRULÊNCIA EM CAMUNDONGOS EM ALEITAMENTO

[000125] Experimentos adicionais foram realizados para analisar a neurovirulência em camundongos ICR recém-nascidos. Em uma dose intracraniana de 104 PFU, as taxas de sobrevivência para DENV-2 wt 16681 e o D2 PDK-53-VV45R foram 0% e 18,8%, respectivamente (Figura 9A) nos camundongos ICR, mas foram cerca de 20% para DENV-2 wt 16681 e 100% para o D2 PDK-53-VV45R nos camundongos CDC ICR. Nesse estudo, DENVax-1 e DENVax-3 MVS foram atenuados (100% de sobrevivência) para os camundongos a uma dose de 104 PFU, mas a MVS de DENVax-2 e DENVax-4 causou 100% de mortalidade na dose de mais de 104 PFU (Figura 5A). No entanto, quando testada a uma dose de 103 PFU de vírus, a DENVax-2 (31,3% de sobrevivência) e a DENVax-4 (81,3% de sobrevivência) mostraram neurovirulência reduzida em relação ao sorotipo 2 de vírus da Dengue wt 16681 (0% de sobrevivência), e suas taxas de sobrevivência foram similares àquelas dos candidatos de vacina de grau de pesquisa D2 PKD-53-VV45R (32,3%) e D2/4-V (100%), respectivamente (Figura 9B). Embora, DENV-1, 3 ou 4 wt não tenham sido incluídos para comparação nesse estudo, trabalhos anteriores demonstraram que DENV-1 wt 16007 foi atenuado nos camundongos CDC-ICR pela via ic, enquanto tanto DENV-3 wt 16562 como DENV-4 1036 foram altamente virulentos (0% de sobrevivência) para os camundongos CDC-ICR. É provável que esses 3 DENV wt possam exibir virulência similar ou maior nos camundongos Taconic ICR mais suscetíveis. Portanto, a inclusão desses vírus da Dengue wt para comparação com suas MVSs de DENVax homólogas foi considerada como não informativa. Esse estudo indicou que todas as 4 MVSs de DENVax e vírus de vacina candidatos derivados de laboratório originais exibem fenótipos de atenuação de camundongo comparáveis para o DENV-2 wt 16681.

[000126] As Figuras 9A e 9B representam gráficos exemplificativos de dados de neurovirulência de MVS de DENVax em camundongos ICR recém-nascidos. (A) Inoculações IC do vírus em dose de 104 PFU. (B) Inoculação IC do vírus em dose de 103 PFU

[000127] Todos os lotes da DENVax foram testados pela identidade, estabilidade e liberdade dos agentes indesejáveis. A análise de sequência de genoma completo revelou que uma mutação de aminoácido extra desenvolveu-se na MVS de DENVax-4, enquanto as outras 3 MVSs de DENVax retiveram sequência de genoma consenso de suas sementes pré-originais. Em lotes de WVS, a DENVax-3 adquiriu uma mutação de aminoácido extra e os outros 3 sorotipos acumularam 2 substituições de aminoácido extras, em relação a suas sementes pré- originais. As sequências de genoma de todos os quatro lotes de 4 BVS foram idênticas a sues lotes de WVS. No total das sementes P2 às sementes pré-originais (P7), apenas 1 ou 2 mutações não silenciosas ocorreram em uma dada semente. Entre sementes pré-originais e BCS (P10), apenas 1 a 2 substituições de nucleotídeo foram observadas, todas as quais ocorreram em NS2A, 4A ou 4B, com exceção de alteração de nucleotídeo único que resulta em uma glicina e alanina conservadas no resíduo E-483. Das sementes P2 a BVS (P10), 3 a 8 substituições de nucleotídeo totais foram identificadas em qualquer dada semente DENVax, e apenas 2 a 4 dessas substituições resultaram em alterações de aminoácido. Nenhuma das mutações silenciosas na BVS estavam dentro da região NCR 5' ou 3' que podem afetar a replicação viral. Esses resultados sugerem que os vírus DENVax eram altamente estáveis durante a fabricação. Os três loci de atenuação de DENV-2 PDK-53 definidos localizados em 5'NCR, NS1-53 e NS3-250 permaneceram inalterados na sequência de genoma consenso mediante passagem serial da DENVax para gerar estoques de BVS. O TaqMAMA altamente sensível do locus 5'-NCR-57 mostrou reversão mínima ou indetectável nas MVS, WVS e BVS de DENVax. A taxa de reversão mais alta de 0,21% foi identificada na BVS de DENVax-2. As taxas de reversão da BVS equivalente a P10 (<0,07% a 0,21%) foram significativamente mais baixas do que as taxas de reversão que se desenvolveram em outros candidatos de vacina após passagem seriais em células Vero (4 a 74% de reversão por P10). Isso sugere que essa estratégia para fabricação em larga escala das sementes de DENVax é bem sucedida, em relação a manter estabilidade genética e retenção de marcadores de atenuação nos vírus de vacina candidatos.

[000128] Como os estoques de MVS revelados no presente documento serão usados para fabricação futura de lotes de WVS e BVS, painéis completos de avaliações de fenótipo de atenuação de vírus, incluindo fenótipo de placa pequena, sensibilidade à temperatura, replicação reduzida em células de mosquito, infecção/dissemina- ção/transmissão reduzidas em mosquitos inteiros e neurovirulência reduzida em camundongos ICR recém-nascidos foram conduzidos para todas MVS ou seus estoques substitutos equivalentes. Para os estoques de WVS e BVS, tamanho de placa, infectividade em células de mosquito foram também realizados para confirmar suas atenuações. Os resultados indicaram que todos os estoques de MVS dos 4 sorotipos de DENVax mantiveram os fenótipos de atenuação esperados, tal como placas pequenas, replicação reduzida em células C6/36 e neuroviru- lência de camundongo reduzida, similarmente aos vírus de vacina derivados de laboratório originais (Figuras 6, 8 e 9). Exceto pela DENVax-4, todos os outros 3 estoques de MVS de DENVax foram TS a 39°C conforme mostrado nas Figuras 3 e 7.

[000129] Para os estoques de WVS e BVS, dois fenótipos de atenuação, placas pequenas e replicação restrita em células C6/36, foram analisados e confirmados. Como há muito poucas alterações genéticas entre a MVS e BVS, esperava-se que as mesmas poderiam manter os fenótipos de atenuação como a MVS. Adicionalmente aos experimentos descritos neste relatório, a segurança e a imunogeni- cidade da DENVax fabricada em camundongos Ag129 e primatas não humanos foram testadas.

[000130] Os métodos exemplificativos são fornecidos no presente documento para demonstrar a fabricação de estoques de MVS, WVS e BVS de DENVax sob cGMP. Os estoques de BVS foram usados para formular a DENVax tetravalente atualmente em avaliações de teste clínico em humanos. Uma estratégia de fabricação única para otimizar a estabilidade genética e a segurança da MVS fabricada foi fornecida em alguns métodos exemplificativos. Como os loci de atenuação principais da DENVax foram bem caracterizados anteriormente e um ensaio SNP altamente sensível e quantificável, TaqMAMA foi desenvolvido para integrar a sequência de genoma e o TaqMAMA para identificar sementes pré-originais para produzir a MVS. As caracterizações genética e fenotípica da MVS foram completamente analisadas para confirmar que esses vírus mantiveram atenuações desejáveis para segurança da vacina. Essa pode ser a única vacina viral viva atenuada que pode ser analisada de modo eficaz para todos os loci genéticos de atenuação principais durante a fabricação de pré-original de todas as formas para estoques de BVS. Os resultados no presente documento exemplificaram a vantagem de vacinas vivas atenuadas projetadas estrategicamente em segurança de vacina.

[000131] A Figura 10 representa uma Tabela exemplificativa que compara novos vírus vivos atenuados a vírus da dengue vivos atenuados gerados anteriormente. As mutações são indicadas nos casos em que há diferença de um vírus de controle (por exemplo, 16681), ou outros vírus da dengue 2 vivos atenuados.

MATERIAIS E MÉTODOS VÍRUS E CÉLULAS

[000132] DENV-1 16007, DENV-2 16681, DENV-3 16562 e DENV-4 1034 serviram como controles de DENV do tipo selvagem (wt) e foram os vírus de genótipo progenitor para os quatro candidatos de vacina DENVax recombinante. Os vírus de grau de pesquisa progenitores DENVax, designados como D2/1-V, D2 PDK-53-VV45R, D2/3-V, e D2/4-V, foram preparados e caracterizados anteriormente. Células Vero (rim de macaco verde africano) usadas para produzir bancos de células originais e de trabalho para produção de vacina foram originadas da linhagem celular Coleção de Cultura do Tipo Americana (ATCC) CCL81 que foi caracterizada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para a fabricação de vacina (células WCB-Vero).

DERIVAÇÃO DE VÍRUS DENVAX RECOMBINANTES VIVOS DE CLONES DE CDNA

[000133] Para derivar novamente os vírus de vacina candidatos sob condições de fabricação de cGMP, os clones de cDNA infecciosos de DENV projetados, pD2-PDK-53-VV45R, pD2/1-V, pD2/4-V e pD2/3-V ligado in vitro contendo os cDNAs virais de comprimento de genoma completo foram usados para produzir transcritos de RNA viral frescos por transcrição in vitro conforme descrito anteriormente. Em suma, cDNAs genômicos de DENV linearizados por Xbal foram tratados com proteinase K, extraídos com fenol/clorofórmio e precipitados em etanol para remover quaisquer proteínas residuais e, então, suspensos em tampão Tris-EDTA livre de RNase antes da transcrição. A transcrição in vitro foi conduzida com o uso do kit de Transcrição de Alto Rendimento AmpliScribe T7 (Epicentre Technologies) seguindo-se o protocolo recomendado pelo fabricante. O análogo de capa A de RNA, m7G(5')ppp(5')A (New England BioLabs), foi incorporado durante a reação de transcrição de 2 horas para adicionar a capa A 5'-terminal ao transcrito de RNA. As mostras foram então tratadas com DNase l para digerir o cDNA de modelo, seguido por extração com fenol/clorofórmio de pH baixo e precipitação de etanol para remover DNA e proteínas residuais. Os transcritos de RNA purificados, suspensos em água livre de RNase, foram distribuídos em alíquotas de 20 ul e armazenados a -80 °C até estarem prontos para transfecção de células. A integridade e a concentração dos transcritos de RNA foram analisadas por eletroforese em gel de agarose. Estimou-se que cada alíquota de 20 ul continha RNA viral de comprimento de genoma suficiente para permitir a transfecção de 0,4 a 1 x 107 células Vero de produção certificada por eletroporação.

[000134] A transfecção de cada transcrito de RNA em células WCB- Vero foi realizada na instalação cGMP na Shantha Biotechnics. Os transcritos de RNA de DENVax foram descongelados, misturados com 400 ul da suspensão de células Vero (1 x 107 células/ml) e transferidos para um cadinho de eletroporação estéril pré-resfriado (vão de 4 mm) para eletroporação por um sistema total Gene Pulser Xcell (BioRad Laboratories). Cada amostra foi pulsada uma vez a 250V/°° Ohms/500 uF, incubada por 10 a 15 min à temperatura ambiente, transferida para um frasco de 75 cm2 contendo 30 ml de meio de proliferação celular (MEM com 10% de FBS) e incubadas a 36 °C ± 1 °C, 5% de CO2 por 6 a 11 dias. O meio de cultura foi coletado, clarificado por centrifugação, estabilizado e armazenado em alíquotas pequenas abaixo de -60 °C. Os títulos virais de estoques de vacina candidata (chamados de P1 para nível de passagem 1) resultantes da transfecção foram determinados por ensaio de titulação de placa em células Vero e usados para propagação adicional das sementes de DENVax.

FABRICAÇÃO DE SEMENTES DE VÍRUS DENVAX

[000135] As sementes de vírus P1 foram usadas para propagar lotes de semente de vírus pré-original, original, de trabalho e em massa através de uma estratégia projetada para garantir a estabilidade genética e a segurança ideais dos lotes fabricados. Essa estratégia incluiu três purificações de placa em série, assim como análises genéticas de vírus em vários níveis de passagem para selecionar a população de vírus clonal ideal para produção de semente contínua (Tabela 1). Em suma, as sementes P1 colhidas de células transfectadas foram amplificadas uma vez por infecção de células Vero em um MOl de 0,001 para gerar as sementes P2. As alíquotas dos estoques de semente P2 foram avaliados por morfologia de placa e sequenciamento genômico viral completo. Os estoques de P2 geneticamente confirmados foram plaqueados em monocamadas de células Vero como meio de sobreposição conforme descrito na seção de titulação de placa abaixo para gerar placas bem isoladas. Após a visualização com vermelho neutro, seis placas individuais de cada um dos vírus de vacina foram isolados (clones de placa A a F) e misturados em 0,5 ml de meio de cultura (passagem P3). Cada uma das seis suspensões de placada foi submetida a dois ciclos adicionais de purificação de placa, resultando em sementes de vírus duas e três vezes purificadas em placa nas passagens P4 e P5, respectivamente. Os vírus P5 foram amplificados através de duas passagens Vero sequenciais para produzir estoques de semente P7.

[000136] A análise genética dos três loci de atenuação de DENVax principais com o uso de sequenciamento de ponto e/ou ensaio de mutação de amplificação incompatível baseado em Taqman (TaqMAMA) conforme anteriormente revelado e análise de fenotipo de placa foram conduzidos para triar todas as 24 sementes P7. As sementes que possuíam características iniciais apropriadas foram, então, caracterizadas adicionalmente por sequenciamento genômico completo. Como resultado dessas análises, uma das 6 (clone A-F) sementes P7 de cada sorotipo de DENVax foi selecionada para ser a semente pré-original, com base na presença das mutações de atenuação de DENV-2 PDK-53, alterações genômicas mínimas e fenótipo de placa esperado. Cada semente pré-original selecionada foi expandida a semente viral original (MVS ou P8) por uma passagem de uma vez do vírus em MOl de 0,001 em múltiplos frascos de 175 cm2 de células Vero. Exceto pela MVS de DENVax-4, as sementes virais originais foram colhidas em 8 a 10 dias após a infecção (pi). Os estoques de MVS foram colhidos em 6 a 10 dias após a infecção (pi), clarificados por centrifugação, estabilizados pela adição de solução de sacarose/fosfato/glutamato (concentração final 7,5 % de sacarose, 3,4 mM de diidrogenofosfato de potássio, 7,2 mM de hidrogenofosfato de dipotássio, 5,4 glutamato de monossódio, respectivamente) e 0,95 a 1,90% de FBS (concentração final). A MVS de DENVax-4 foi preparada de modo diferente para otimizar seu rendimento. Em suma, múltiplos frascos de células foram infectados com semente pré-original de DENVax-4 a MOl de 0,001 na presença de 0,1% de F-127TM, poloxâmero 407, (outros copolímeros em bloco EO-PO foram avaliados e podem ser substituídos aqui, consulte a patente emitida) que demonstraram intensificar a estabilidade térmica de vírus DENV. Meio infeccioso foi coletado nos dias 6 a 10 pi e estabilizado com 17% de FBS (concentração final), agrupado e congelado. Todos os quatro estoques de MVS de DENVax foram armazenados como alíquotas abaixo de -60 °C.

[000137] As sementes de vírus de trabalho (WVS) de DENVax foram preparadas por passagem de uma vez em cultura de células Vero da MVS a um MOl de 0,001. Os procedimentos foram similares à produção de MVS, exceto pelo fato de que as mesmas foram cultivadas em fábricas celulares de múltiplas camadas (6.360 cm2). Os estoques de WVS foram filtrados através de filtros de 10 uM e 0,45 uM, estabilizados com os mesmos estabilizadores usados para a MVS, divididos em alíquotas em garrafas PETG de 30 ml ou crioampolas de 2,0 ml e armazenados abaixo de -60 °C.

[000138] Em determinados métodos, sementes virais em massa (BVS) foram produzidas por infecção de múltiplas fábricas celulares (6.360 cm2 cada) de células Vero confluentes com 90 ml de WVS diluída para obter um MOI de 0,001. Um meio usado para diluição dos inóculos de WVS continham 0,1% de F-127TM sem soro. Após absorção por 1,5 h, as células foram lavadas 3 vezes com PBS e 800 ml de meio DMEM livre de soro foram adicionados a cada fábrica celular e as fábricas foram incubadas a 36(±1) °C em 5(±0,5)% de CO2. Após a incubação por quatro dias, alíquotas pequenas de meio foram coletadas para teste de esterilidade. Os vírus foram colhidos entre o dia 5 e o dia 10 pi e imediatamente clarificados por filtração através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 um, e 1 l de cada agrupamento de vírus clarificado foi estabilizado por adição de 500 ml de tampão 3x FTA (concentrações finais de 15% de trealose, 1,0% de Pluronic® F-127TM poloxâmero 407, 0,1% de albumina humana USP em PBS, pH 7,4). O vírus estabilizado foi distribuído em garrafas PETG de i l e armazenado congelado abaixo de -60 °C para agrupamento e teste de controle de qualidade subsequentes. Todos os vírus estabilizados colhidos com um título de vírus acima de 105 PFU/ml e um nível aceitável de DNA residual foram rapidamente descongelados em um banho de água a 32 °C, então agrupados e misturados de modo asséptico. Cada BVS monovalente agrupada foi distribuída em contentores PETG identificados e armazenada abaixo de -60 °C até uso adicional.

CONTROLES DE QUALIDADE DE PRODUTO DE FABRICAÇÃO

[000139] As sementes MVS, WVS e BVS foram testadas por identidade, esterilidade e agentes acidentais detectáveis. A identidade de cada estoque de vacina foi confirmada por RT-PCR com iniciadores sorotipo-específicos de DENVax. Os fragmentos de cDNA amplificados continham o sítio de junção quimérico E/NS1 para permitir a identificação de cada um dos quatro sorotipos de DENVax. Cada semente foi testada em 4 reações RT-PCR sorotipo-específicas para confirmar a identidade virar e a liberdade de contaminação cruzada com sorotipos de DENVax heterólogos. O teste de esterilidade foi realizado em conformidade com a USP 71 (Farmacopeia dos Estados Unidos, seção 71). Teste de micoplasma foi realizado.

[000140] Os seguintes testes in vitro e in vivo para contaminação viral foram todos realizados com o uso de colheitas de DENVax não clarificadas e não estabilizadas coletadas durante a fabricação das sementes. Meios infecciosos colhidos foram primeiramente neutral- zados com antissoro policlonal de coelho de DENV (Inviragen) a 36 ± 1 °C por 1 h para inativar o DENV. Para teste in vitro, as sementes neutralizadas foram inoculadas em três linhagens celulares de indicador, MRC5, VERO e MA104, em frascos de 25 cm2. O vírus Echo (controle de CPE) ou o vírus da caxumba (controle de hemadsorção) foram usados como CPE positivo ou controle de hemadsorção, respectivamente. Todas as células foram monitoradas diariamente por CPE por um total de 14 dias. Ao final de 14 dias, o sobrenadante de cultura foi removido e substituído por 10 ml de solução de glóbulos vermelhos de porquinho-da-índia (RBC) (3 ml de 0,5% de RBC de porquinho-da-índia em solução salina tamponada com fosfato, constituída até 10 ml com meio de proliferação celular). Os frascos foram, então, incubados a 5 ± 3 °C por 30 minuto seguidos por incubação à temperatura ambiente por 30 minutos. As monocamadas foram lavadas com PBS e observadas sob magnificação de 10 X pela presença de quaisquer aglomerados em formato de estrela de RBCs para hemadsorção.

[000141] Testes in vivo para agentes foram realizados em camundongos em aleitamento, camundongos pós-desmame e porquinhos-da-índia. Os camundongos em aleitamento foram inoculados com 0,1 ml ou 0,01 ml (10 camundongos em cada grupo de dose) da amostra de semente neutralizada com antissoro de DENV através de injeção intraperitoneal (ip). Similarmente, 10 camundongos pós-desmame foram, cada um, inoculados ip com 0,5 ml ou 0,03 ml da amostra. Porquinhos-da-índia (5/grupo) foram, cada um, inoculados ip com 5,0 ml. Os camundongos em aleitamento foram observados diariamente por mobilidade e mortalidade por um total de 14 dias após a inoculação. Os camundongos pós- desmame foram observados por um total de 28 dias e os porquinhos-da- índia foram observados por um total de 42 dias após a incubação. Os artigos de teste atendem o critério de aceitação se >80% dos animais inoculados permanecerem saudáveis por todo o período de observação.

[000142] O teste in vivo para contaminantes foi também realizado em ovos de galinha embrionados e foi conduzido. Para cada amostra, 10 ovos de galinha embrionados (9 dias de vida) foram, cada um, inoculados com 0,5 ml da amostra neutralizada por antissoro de DENV no fluido alantoico e incubados a 35 °C por 3 dias. Os fluidos alantoicos desses 10 ovos foram colhidos, agrupados e passados no fluido alantônico de 10 ovos embrionados frescos (10 a 11 dias de vida; 0,5 ml/ovo) e incubados a 35 °C por mais 3 dias. Similarmente, para cada amostra, 10 ovos embrionados (6 a 7 dias de vida) foram, cada um, inoculados com 0,5 ml por ovo (BVS monovalente de DENVax-2) ou 0,25 ml por ovo (BVS de DENVax-1, DENVax-3 e DENVax-4) por injeção na cavidade da gema e incubados a 35 °C por 9 dias. As cavidades da gema desses 10 ovos foram colhidas e agrupadas, e uma suspensão a 10% foi passada nas cavidades de gema de 10 ovos embrionados frescos (6 a 7 dias de vida; 0,5 ml/ovo) e incubados a 35 °C por mais 9 dias. Os ovos inoculados no fluido alantoico (ambas as inoculações inicial e de passagem) foram observados por viabilidade após 3 dias de incubação. Ambos os agrupamentos de fluido alantoico foram testados por atividade de hemaglutinação com o uso de eritrócitos do tipo O de galinha, porquinho-da-índia e humano a 4 °C e 25 °C. Os ovos inoculados na cavidade da gema (ambas as inoculações inicial e de passagem) foram observados por viabilidade após 9 dias de incubação.

ENSAIO EM PLACA DE VÍRUS E ENSAIO DE FOCO IMUNOLÓGICO

[000143] Títulos de vírus foram medidos por ensaio em placa ou ensaio de foco imunológico com o uso de células Vero. Os ensaios em placa foram realizados em coberturas de agarose dupla em placas de seis cavidades de células Vero confluentes conforme descrito anteriormente, e os mesmos também foram usados para avaliar os fenótipos de placa das sementes de DENVax. Para comparação precisa, tamanhos de placa de todos os vírus foram medidos e comparados no mesmo experimento. Após visualização com vermelho neutro no dia 9 pi, até 10 placas isoladas de cavidade para cada vírus foram medidas para cálculo de tamanho de placa médio. Menos placas foram medidas para DENV-1, -3 e -4 do tipo selvagem, cujos tamanhos de placa maiores frequentemente não permitem a medição de 10 placas separadas em cavidade.

[000144] Visto que a DENVax tetravalente contém todos os quatro sorotipos de DENV, um ensaio de foco imunológico específico de sorotipo de DENV foi desenvolvido para quantificar cada componente de DENVax nas formulações tetravalentes. Os ensaios de foco imunológico de cada MVS de DENVax individual foram comparados aos ensaios de placa para garantir que os resultados de titulação de vírus foram comparáveis entre os dois ensaios. O ensaio de foco imunológico foi conduzido em placas de 6 cavidades de células Vero confluentes infectadas com vírus diluídos em série. As células foram sobrepostas com um meio salino equilibrado (meio BSS/YE-LAH) que contém 0,7% de carboximetilcelulose de alta viscosidade (Sigma) e foram incubadas por 7 dias a 37 °C com 5% de CO2. Após a remoção de coberturas, chapas de célula foram lavadas 3 vezes com PBS, fixadas com 80% de acetona fria por 30 min a -20 °C, lavadas uma vez com PBS, e bloqueadas com um tampão de bloqueio que contém 2,5% (p/v) de leite desidratado não gordo, 0,5% de Triton X-100, 0,05% de Tween-20 em PBS a 37 °C por 30 min. As células bloqueadas foram incubadas com MAbs específicos de sorotipo DENV diluídos, 1F1 (DENV-1), 3H5 (DENV-2), 8A-1 (DENV 3), ou 1H10 (DENV-4) em tampão de bloqueio a 37 °C por 1 hora ou 4 °C durante a noite, lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (0,05% de Tween-20 em PBS), e incubadas com IgG de cabra anti-camundongo puro conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) ou fosfatase alcalina (Jackson Immuno Research Laboratories) a 37 °C por 45 a 60 min. As placas foram lavadas 3 vezes antes de o substrato apropriado, 1-Step NBT/BCIP mais supressor (Pierce) para fosfatase alcalina ou kit Vector-VIP (Vector Labs) para HRP, ser adicionado para desenvolvimento de cor. O desenvolvimento de cor foi interrompido pelo enxágue com água quando os focos foram completamente desenvolvidos. Os focos imunológicos manchados foram diretamente visualizados e contabilizados em uma caixa de luz.

SEQUÊNCIA GENÉTICA

[000145] Os genomas integrais do MVS e do WVS foram sequenciados (consulte abaixo). Brevemente, o RNA viral foi extraído das sementes de DENVax usando-se o kit de RNA viral QIAamp (Qiagen), e os fragmentos de cDNA sobrepostos que cobrem todo o genoma foram amplificados com o uso do kit Titan One Tube RT-PCR (Roche Applied Science, Inc.). Os fragmentos de cDNA amplificados foram purificados com gel antes do sequenciamento com ambos os iniciadores direto e reverso com o uso do kit de sequenciamento de ciclo BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). As reações de sequência foram limpas com o uso do kit de purificação BigDye XTerminator (Applied Biosystems), e executadas no analisador genético 3130xl (Applied Biosystems) em DVBD/CDC. O software Lasergene SeqMan (DNAStar, Inc) foi usado para análise e comparação genômica.

ENSAIO DE MUTAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DE INCOMPATIBILIDADE COM BASE EM TAQMAN (TAQMAMA)

[000146] TaqMAMA é um ensaio de polimorfismo de nucleotídeo único quantitativo e sensitivo desenvolvido para permitir a avaliação mais precisa do nível de reversão no lócus 5'NC-57 de atenuação, e foi otimizado adicionalmente para este estudo. O RNA viral extraído do MVS e do WVS foi analisado pelo TaqMAMA com ambos os conjuntos de iniciadores/sonda Taqman que são específicos para tipo selvagem ou a região 5'NC-57 de vacina. Os iniciadores diretos usados para detectar sequências de DENV-2 do tipo selvagem e de vacina foram D2-41-GC e D2-40-TT, respectivamente. O nucleotídeo de 3'-terminal de cada iniciador direto foi compatível com o nucleotídeo 5'NCR-57 específico para cada vírus, enquanto o nucleotídeo adjacente ao nucleotídeo de 3'-terminal em cada iniciador diferiu da sequência genômica viral de DENV-2 para aperfeiçoar o efeito de incompatibilidade. O iniciador reverso, CD-207, e a sonda Taqman, CD-169F, para ambos os conjuntos de tipo selvagem e de vacina foram idênticos. As sequências dos iniciadores e sonda assim como as condições de ciclo foram descritas anteriormente. A RT-PCR em tempo real foi realizada com o sistema iQ5 ou CFX-95 (BioRad), com o uso de um kit de RT-PCR BioRad iScript (para sondas), em uma reação de 25 ul que contém 5 ul de modelo de RNA viral, 0,4 uM de cada iniciador, e 0,2 uM da sonda. Reações triplicadas para cada ensaio específico de tipo selvagem e de vacina foram conduzidas para cada amostra. Os números de cópia de genoma foram determinados em relação a uma curva padrão preparada para cada genótipo viral, em que os padrões de RNA foram transcrições derivadas de plasmídeos que contêm 1-2670 de tipo normal de cada cDNA especifico de genótipo. Além disso, a especificidade do ensaio foi confirmada testando-se cada padrão RNA com os conjuntos de iniciador/sonda de genótipo heterólogo para garantir reatividade cruzada mínima em cada experimento. Os resultados foram relatados como a porcentagem de genomas virais que apresenta reversão. Anteriormente, devido a antecedentes de reatividade cruzada superior que limitaram os níveis de RNA de entrada RNA para este ensaio, a sensibilidade de detecção original foi de cerca de 0,1% de reversão (poder de discriminação). Desde então, o ensaio foi otimizado adicionalmente com o uso de kits de reação e equipamento de PCR em tempo real aprimorados, e o antecedente de reatividade cruzada foi diminuído consideravelmente em níveis muito mais altos (7 a 8 log10 cópias) de entrada de modelo de RNA. Essa otimização resultou em aprimoramento significativo da sensibilidade de detecção, até 0,01 a 0,07% de reversão.

REPLICAÇÃO DE VÍRUS EM CÉLULAS C6/36 DE MOSQUITO E SENSIBILIDADE À TEMPERATURA EM CÉLULAS VERO DE MAMÍFEROS

[000147] Os fenótipos de replicação dos quatro estoques de MVS de DENVax e os vírus DENV-1, -2, -3, e -4 do tipo selvagem foram avaliados em células de mosquito C6/36 (Aedes albopictus). As células C6/36 cultivadas em placas de 6 cavidades foram infectadas em duplicata com cada vírus em um MOI de 0,001 e incubadas com 4 ml/cavidade de meio de DMEM que contém 2% de FBS em um incubador com 5% de CO2 a 28 °C. Pequenas alíquotas do sobrenadante de cultura foram coletadas para cada vírus no dia 6 pi, misturadas com um volume igual de meio que contém 40% de FBS, e armazenadas a -80 °C até ficarem prontas para titulação em placa de vírus.

[000148] A sensibilidade à temperatura foi conduzida comparando-se a proliferação viral a 39 °C contra a proliferação a 37 °C em cinco dias pi de células Vero em placas de 6 cavidades. As células foram infectadas em quadruplicado com cada vírus em um MOI de 0,001 a 37 °C. Em seguida à adsorção de vírus, as culturas infectadas foram incubadas com 4 ml/cavidade de meio de DMEM que contém 2% de FBS em 2 incubadores de 5% de CO2 separados, um conjunto (placas duplicadas) a 37 °C e o outro a 39 °C. Alíquotas (50 ul) do sobrenadante de cultura foram coletadas no dia 5 pi, misturadas com um volume igual de DMEM que contém 40% de FBS, a armazenadas a -80 °C até ficarem prontas para a titulação em placa de vírus. As temperaturas do incubador foram calibradas com termômetros calibrados em fábrica reconhecidos pelo NIST (-1 a 51 °C; ERTCO).

INFECÇÃO, DISSEMINAÇÃO E TRANSMISSÃO POR MOSQUITO

[000149] Os mosquitos Aedes aegypti usados para o estudo foram de uma colônia estabelecida em 2002 a partir de um vilarejo próximo à Mae Sot (16' N, 33' E), Tailândia. Após emergirem das larvas, os mosquitos adultos foram mantidos a 28 °C em um fotoperíodo de 16:8 (luz:obscuridade) com 10% de solução de sacarose fornecida ad libitum. Fêmeas de mosquitos com cinco a sete dias de vida foram usados para inoculações intratorácicas (IT) ou de alimentação de farinha de sangue infeccioso. Alíquotas de DENVax e DENV do tipo selvagem novos cultivados foram usadas imediatamente após a coleta (sem qualquer ciclo de congelamento/descongelamento) para criar farinhas de sangue de vírus conforme indicado abaixo para infecção oral. Os sobrenadantes de vírus remanescentes foram suplementados com FBS a uma concentração final de 20%, e alíquotas foram armazenadas a -80 °C para futuros experimentos de inoculação de IT e titulação em placa de vírus. As novas sementes de DENVax preparadas para esses experimentos foram amplificadas a partir das sementes pré-originais em células Vero, e foram consideradas equivalentes de MVS de DENVax.

[000150] Farinhas de sangue infeccioso foram preparadas misturando-se vírus novo em uma razão de 1:1 com sangue de galinha desfibrinado (Colorado Serum Company) no dia de infecção oral. Mosquitos foram desprovidos de açúcar durante a noite e em seguida ofereceu-se a mistura de vírus:sangue por 1 hora com o uso de um sistema de alimentação de membrana Hemotek (Discovery Workshops). Uma alíquota de 50 ul da farinha de sangue foi retida a - 80 °C para titulação de retorno de doses de vírus. Fêmeas completamente ingurgitadas foram ordenadas sob anestesia a frio e colocadas em caixas com 10% de solução de sacarose fornecidas ad libitum. As caixas foram colocadas a 28 °C com um fotoperíodo de 16:8 h (luz:obscuridade). Após 14 dias, 25 a 30 mosquitos de cada grupo de vírus foram anestesiados através da exposição à trietilamina (Flynap ®, Carolina Biological Supply Company) e um perna posterior foi removida e colocada em 0,5 ml de DMEM com 10% de FBS e 5de % penicilina/estreptomicina (100 U/ml e 100 ug/ml, respectivamente). A saliva foi coletada inserindo-se o probóscide do mosquito anestesiado em um tubo capilar que contém 2,5% FBS e 25% de solução de sacarose. Permitiu-se que os mosquitos salivassem por pelo menos 15 minutos e, em seguida, os tubos capilares e corpos foram colocados em tubos separados contendo DMEM. Os corpos, pernas e saliva dos mosquitos foram armazenados a -80 °C até que os mesmos foram triturados e testados quanto ao vírus infeccioso. Para inoculação de IT, os mosquitos foram anestesiados a frio e inoculados com aproximadamente 50 pfu de vírus em 0,34 ul de inóculo. Os mosquitos inoculados foram mantidos por 7 dias nas mesmas condições conforme descrito acima. Em seguida, os mosquitos foram anestesiados, e a saliva e os corpos dos mesmos foram coletados conforme descrito acima. As amostras foram armazenadas a -80 °C até o processamento adicional.

[000151] Para processar as amostras para titulação de vírus, amostras de perna e de corpo foram homogeneizadas com BBs revestido com sobre (Crossman Corporation, NY) em 24 ciclos/segundo por 4 min com o uso de uma moinho misturador, e em seguida clarificadas por centrifugação em 3.000 x g por 3 min. Amostras de saliva foram centrifugadas em 3.000 x g por 3 minutos para expelir fluido dos tubos capilares. Diluições em dez vezes dos homogenados de corpo e perna e amostras de saliva foram testadas quanto à presença de vírus infecciosos pelo ensaio de placa. Resultados de corpos, pernas e saliva foram usados para determinar as taxas de infecção, disseminação e transmissão, respectivamente.

NEUROVIRULÊNCIA DE CAMUNDONGO

[000152] Fêmeas de camundongos de ICR com gravidez programada foram obtidas junto à Taconic Labs, e monitorados várias vezes por dia para determinar os tempos de nascimento aproximados de ninhadas de filhotes. Em um dado experimento, aproximadamente 12 a 24 horas após o nascimento, duas ninhadas de oito filhotes por vírus (n=16), foram estimuladas com 103 a 104 pfu de vírus em 20 ul de diluente por inoculação intracraniana (ic) com o uso de uma agulha de calibre 30. Os animais foram monitorados pelo menos 3 vezes por dia por pelo menos 32 dias após o estímulo. No primeiro sinal de enfermidade (pelo áspero, corcunda, perda de peso, movimento anormal, paralisia, ou letargia) os animais foram eutanasiados por anestesia letal com gás de isoflurano, seguida por deslocamento cervical. O dia pós-infecção da eutanásia representou o "tempo para enfermidade/morbidez" ou "tempo de sobrevivência" para o animal. Os experimentos em animais foram conduzidos seguindo um protocolo para animais aprovado pelo DVBD/CDC IACUC.

DERIVAÇÃO DE VÍRUS DE SEMENTE ORIGINAL SEMENTE DE VÍRUS ORIGINAL DE DENvax-1 (MVS)

[000153] A sequência de nucleotídeo do genoma viral quimérico e a sequência de aminoácidos deduzida da proteína traduzida são fornecidas no presente documento. A maior parte do gene prM-E (nt 457 a -2379, sublinhado) é específica de vírus DEN-1 16007 de tipo selvagem (wt); o genoma restante é específico de vírus DEN-2 PDK-53. Todas as substituições projetadas diferem do vírus de tipo selvagem (D1 16007 ou D2 16681), assim como as mutações extras (alterações do clone de cDNA projetado) detectadas no MVS, são marcadas.

SUBSTITUIÇÕES INCLUÍDAS NO GENOMA E NA PROTEÍNA:

[000154] Sítios de junção entre cadeia principal de D1 (prM-E) e D2: a. MluI (nt 451 a 456): mutação silenciosa projetada, nt-453 A para G b. NgoMIV (nt 2380 a 2385): mutações projetadas, nt- 2381/2382 TG para CC (resultou em alteração de Val para Ala de E-482)

[000155] Cadeia principal de vírus D2 PDK-53 (alteração de D2 wt 16681): toda em negrito a. região não codificante 5' (NCR)-57 (nt-57 C para T): locus de atenuação principal (em vermelho) b. NS1-53 Gly para Asp (nt-2579 G para A): locus de atenuação principal (em vermelho) c. NS2A-181 Leu para Phe (nt-4018 C para T) d. NS3-250 Glu para Val (nt-5270 A para T): locus de atenuação principal (em vermelho) e. mutação silenciosa T para C de nt-5547 (gene NS3) f. NS4A-75 Gly para Ala (nt-6599 G para C) * mutação silenciosa C para T nt-8571 de PDK-53 não é projetada no vírus de vacina DEN-1 prM-E (alteração de D1 wt 16007) a. Mutação silenciosa T para C de nt-1575 projetada para remover sítio XbaI nativo

[000156] Substituições adicionais encontradas em semente de vacina (0,03% de nt diferente do clone original) a. NS2A-116 Ile para Leu (nt-3823 A para C, em negrito) b. NS2B-92 Glu para Asp (nt-4407 A para T, em negrito) c. mutação silenciosa A para G de nt-7311 (em negrito)

Semente original de Vírus (MVS) de DENvax-2

[000157] A sequência de nucleotídeos do genoma viral recombinante e sequência de aminoácidos deduzida da proteína traduzida são fornecidas no presente documento. O vírus projetado é baseado no vírus D2 PDK-53. Todas as substituições projetadas que são diferentes do vírus DEN-2 16681 do tipo selvagem (também o vírus progenitor para PDK-53), assim como mutações extras (alterações de clone de cDNA projetado) detectadas estão marcadas. SUBSTITUIÇÕES INCLUÍDAS NO GENOMA E NA PROTEÍNA:

[000158] Cadeia principal de vírus D2 PDK-53 (alteração de D2 wt 16681): toda em negrito a. região de não codificante 5' (NCR)-57 (nt-57 C para T): locus de atenuação principal (em vermelho) b. prM-29 Asp para Val (nt-524 A para T) c. mutação silenciosa C para T de nt-2055 (gene E) d. NS1-53 Gly para Asp (nt-2579 G para A): locus de atenuação principal (em vermelho) e NS2A-181 Leu para Phe (nt-4018 C para T) f. NS3-250 Glu para Val (nt-5270 A para T): locus de atenuação principal (em vermelho) g. Mutação silenciosa T para C de nt-5547 (gene NS3) h. h. NS4A-75 Gly para Ala (nt-6599 G para C) * mutação silenciosa C para T nt-8571 de PDK-53 não é projetada no vírus de vacina

[000159] Marcador de clone projetado (mutação silenciosa): a. mutação silenciosa T para C nt-900: marcador de clone infeccioso

[000160] Substituições adicionais encontradas em semente de vacina (0,02% de nt diferente do clone original) a. prM-52 Lys para Glu (nt-592 A para G), em negrito b. NS5-412 Ile para Val (nt-8803 A para G), em negrito

Semente original de Vírus (MVS) de DENvax-3

[000161] A sequência de nucleotídeos do genoma viral quimérico e sequência de aminoácidos deduzida da proteína traduzida são fornecidas no presente documento. A maior parte do gene prM-E (nt-457 a 2373, sublinhado) é vírus-específica de DEN-3 16562 do tipo selvagem (wt); a sequência de nucleotídeos remanescente é vírus-específica de DEN-2 PDK-53. A proteína E de vírus DEN-3 tem dois aminoácidos a menos do que a proteína E de DEN-2. Portanto, a posição de nt que começa a partir de NgoMIV é 6 nt menor do que a posição de nt de DEN-2 PDK-53 original. Todas as substituições projetadas diferem de vírus wt (DEN-3 16562 ou DEN-2 16681), assim como mutações extras (alterações de clone de cDNA projetado) estão marcadas.

SUBSTITUIÇÕES INCLUÍDAS NO GENOMA E NA PROTEÍNA:

[000162] Sítios de junção: a. MluI (nt 451 a 456): mutação silenciosa projetada, nt-453 A para G b. NgoMIV (nt 2374 a 2379): mutações projetadas, nt- 2375/2376 TG para CC (resultou em alteração de Val para Ala de E- 480)

[000163] Cadeia principal de vírus D2 PDK-53 (alteração de D2 wt 16681): em negrito a. região de não codificante 5' (NCR)-57 (nt-57 C para T): locus de atenuação principal (em vermelho) b. NS1-53 Gly para Asp (nt-2573 G para A): locus de atenuação principal (em vermelho) c. NS2A-181 Leu para Phe (nt-4012 C para T) d. NS3-250 Glu para Val (nt-5264 A para T): locus de atenuação principal (em vermelho) e. mutação silenciosa T para C de nt-5541 (gene NS3) f. NS4A-75 Gly para Ala (nt-6593 G para C) * mutação silenciosa C para T nt-8565 de PDK-53 não é projetada no vírus de vacina

[000164] Mutação projetada em prM-E de DEN-3 (alteração de D3 wt 16562) a. Mutação silenciosa C para T de nt-552 projetada: marcador de clone b. His para Leu de E-345 projetada (nt-1970 A para T) para replicação eficaz em culturas

[000165] Substituições adicionais encontradas em semente de vacina (0,02% de nt diferente do clone original) a. Mutação Thr para Ser de E-223 (nt-1603 A para T, em negrito) b. Mutação silenciosa A para G de nt-7620 (em negrito)

Semente original de Vírus (MVS) de DENvax-4

[000166] Sequência de nucleotídeos do genoma viral quimérico e sequência de aminoácidos deduzida da proteína traduzida. A maior parte do gene prM-E (nt-457 a 2379, sublinhado) é vírus-específica de DEN-4 1036 do tipo selvagem (wt); a sequência de nucleotídeos remanescente é vírus-específica de DEN-2 PDK-53. Todas as substituições projetadas diferem de vírus wt (DEN-3 16562 ou DEN-2 16681), assim como mutações extras (alterações de clone de cDNA projetado) estão marcadas.

SUBSTITUIÇÕES INCLUÍDAS NO GENOMA E NA PROTEÍNA:

[000167] Sítios de junção: a. MluI (nt 451 a 456): mutação silenciosa projetada, nt-453 A para G b. NgoMIV (nt 2380 a 2385): mutações projetadas, nt- 2381/2382 TG para CC (resultou em alteração de Val para Ala de E-482)

[000168] Cadeia principal de vírus D2 PDK-53 (alteração de D2 wt 16681) a. região de não codificante 5' (NCR)-57 (nt-57 C para T): locus de atenuação principal (em vermelho) b. NS1-53 Gly para Asp (nt-2579 G para A): locus de atenuação principal (em vermelho) c. NS2A-181 Leu para Phe (nt-4018 C para T, em negrito) d. NS3-250 Glu para Val (nt-5270 A para T): locus de atenuação principal (em vermelho) e. mutação silenciosa T para C de nt-5547 (gene NS3) (em negrito) f. NS4A-75 Gly para Ala (nt-6599 G para C, em negrito) * mutação silenciosa C para T nt-8571 de PDK-53 não é projetada no vírus de vacina

[000169] Substituições projetadas em clone de cDNA a. Arg para Ser de C-100 projetado (nt-396 A para C): pode aprimorar replicação viral em cultura b. Mutação silenciosa A para G em nt-1401 projetada c. Ala para Val de E-364 projetado (nt-2027 C para T): pode aprimorar replicação viral em cultura d. Met para Leu de E-447 projetado (nt-2275 A para C): pode aprimorar replicação viral em cultura

[000170] Substituições adicionais encontradas em semente de vacina (0,06% de nt diferente do clone original) a. Mutação silenciosa A para T em nt-225 (C gene) (em negrito) b. Mutação Asp para Gly de NS2A-66 (nt-3674 A para G) (em negrito) c. Lys para mistura Lys/Arg de NS2A-99(nt-3773 A para mistura A/G, em negrito) d. Mutação silenciosa C para T em nt-5391 (gene NS3) (em negrito) e. NS4A-21 Ala para Val (nt-6437 C para T, em negrito) f. Mutação silenciosa T para mistura C/T em nt-7026 (em negrito) g. Mutação silenciosa A para C em nt-9750 (em negrito)

Claims (16)

1. Molécula de polinucleotídeo de comprimento do genoma completo, caracterizada pelo fato de que codifica uma cepa PDK-53 modificada do vírus do dengue-2 vivo atenuado, em que o polinucleotídeo compreende: uma mutação de adenina para guanina na posição 592 na SEQ ID N°: 14 e 4 que codifica um ácido glutâmico em vez de lisina na posição de aminoácido 166 na SEQ ID N°: 6 e 5 correspondente à posição 52 de prM; e uma mutação de adenina para guanina na posição 8803 na SEQ ID N°: 14 e 4 que codifica uma valina em vez de uma isoleucina na posição de aminoácido 2903 na SEQ ID N°: 6 e 5 correspondente à posição 412 de NS5.

2. Molécula de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma ou ambas das mutações adicionais: uma mutação de guanina para citosina na posição de ácido nucleico 6481 na SEQ ID N°: 4 codificando uma prolina em vez de uma alanina na posição de aminoácido 2129 na SEQ ID N°: 5 correspondente à posição 36 de NS4A; e uma mutação de citosina para timina na posição 7156 em SEQ ID N°: 4 que codifica uma fenilalanina em vez de uma leucina na posição de aminoácido 2354 em SEQ ID N°: 5 correspondente à posição 111 de NS4B.

3. Molécula de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é representado pela SEQ ID N°: 14.

4. Molécula de polipeptídeo, caracterizada pelo fato de que é representada pela SEQ ID N°: 6.

5. Cepa PDK-53 do vírus vivo atenuado de dengue 2 modificada, caracterizada pelo fato de que é representada por uma molécula de polinucleotídeo conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de polinucleotídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, uma molécula de polipeptídeo como definida na reivindicação 4, ou um vírus de dengue-2 como definido na reivindicação 5, e um excipiente farmacologicamente aceitável.

7. Uso da composição como definida na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma vacina para induzir uma resposta imune em um indivíduo, em que a composição induz uma resposta imune ao vírus da dengue no indivíduo.

8. Vetor, caracterizado pelo fato de que codifica uma molécula de polinucleotídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

9. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de polinucleotídeo como definida em qualquer das reivindicações 1 a 3, e um excipiente farmacologicamente aceitável.

10. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende a cepa de vírus PDK-53 de dengue-2 viva atenuada modificada conforme definida na reivindicação 5, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que é uma composição tetravalente.

12. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é capaz de induzir uma resposta imune em um indivíduo contra todos os quatro sorotipos de sengue.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que está em combinação com uma composição imunogênica para um flavivírus selecionado dentre o grupo constituído pelo vírus da febre amarela, o vírus da encefalite transmitida por carrapatos, o vírus da encefalite japonesa, vírus do Nilo Ocidental, o vírus da hepatite C e uma combinação de dois ou mais destes vírus.

14. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de polinucleotídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3; ou pelo menos uma composição como definida em qualquer das reivindicações 6 ou 9 a 13, e um recipiente.

15. Vetor, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é um vetor de plasmídeo.

16. Vetor, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é um clone infeccioso de cDNA.