JP2021508696A - がん処置のためのコドン対脱最適化領域を有する組換え型ウイルス及びその使用法 - Google Patents

がん処置のためのコドン対脱最適化領域を有する組換え型ウイルス及びその使用法 Download PDF

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Abstract

本発明は、様々な形態の悪性腫瘍の処置のための設計された組換えウイルスの使用である。本発明の組換え型ウイルスは、野生型ウイルスの１つ以上の領域が、ヒトコドン対バイアスに相関したコドン対スコアを低減する合成再コード配列、またはＣｐＧジヌクレオチドの数を増加させる合成再コード配列、またはＵｐＡジヌクレオチドの数を増加させる合成再コード配列と交換された、組換え型ウイルスである。本発明の方法は、様々な臓器、例えば、乳房、皮膚、結腸、気管支、胃腸の上皮内層、上気道及び尿生殖器管、肝臓、前立腺、ならびに脳における悪性腫瘍の処置に特に有用である。実験動物において、悪性多形神経膠芽腫の処置に関して、さらに乳がん及び黒色腫の処置に関しても、驚くべき寛解が示された。
【選択図】図１９

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１７年１２月２２日に出願された米国仮特許出願番号第６２／６０９，９４５号、２０１８年３月８日に出願された同第６２／６４０，３６２号、２０１８年５月２８日に出願された同第６２／６７７，１３２号、及び２０１８年３月８日に出願された同第６２／６４０，３５５号に対する優先権の請求を含むものであり、これらの各出願は、参照により本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は、がんを処置するために使用される、複数のヌクレオチド置換を含む改変されたウイルスゲノムを含む改変されたウイルスに関する。このヌクレオチド置換は、コドンの他の同義コドンへの交換、及び／またはコドン再編成及びコドン対バイアスのバリエーションをもたらす。このような改変されたウイルスは、悪性腫瘍を処置するために使用される。
背景
本明細書における全ての刊行物は、各々の刊行物または特許出願が、参照により援用されているように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度において、参照により援用される。以下の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれについても、今回請求する本発明に対する先行技術であることもしくはそれに関連することを認めるものではなく、または具体的もしくは暗黙的に言及された出版物が先行技術であることを認めるものでもない。
合成ウイルス学
ＤＮＡ合成技術の急速な向上により、ウイルス学で用いられる従来的な方法に変革がもたらされることが期待される。ウイルスゲノムの異なる領域の機能を排除するために従来用いられているアプローチの１つでは、ウイルス株のゲノムにおける小さな配列バリエーションの影響を探索するのに、部位特異的変異誘発の使用が広範で労力を要するものとなる。しかし、ウイルスゲノム、特にＲＮＡウイルスのゲノムは比較的短く、多くの場合１０，０００塩基長未満であり、このようなゲノムは現状利用できる技術を用いた全ゲノム合成に適用可能である。最近開発されたマイクロ流体チップ系技術は、仕様通りに設計された新たなゲノムの新規合成を１件当たりわずか数百ドルで実施することができる。これにより、完全に新規のコード配列の生成及び既存配列の調整が、従来のクローニング法では実質的に不可能な程度まで可能になる。このような設計の自由により、ＤＮＡ／ＲＮＡコード配列の大規模な再設計を実施する上で多大な力がもたらされ、（１）コドンバイアス、コドン対バイアス、及びＲＮＡ２次構造のようなパラメーターの変化がウイルスの翻訳及び複製効率に及ぼす影響の研究；（２）ウイルス増殖を成功させるのに必要な未知の制御エレメント及びその他のシグナルのための効率的な完全ゲノムスキャンの実施；（３）ウイルス株の遺伝子操作及び抗ウイルスワクチン設計のための新たなバイオテクノロジーの開発；（４）腫瘍溶解療法で使用するための改変されたウイルスの合成、を行うことができる。
ポリオウイルスの逆遺伝学
逆遺伝学とは、概して、古典的遺伝学のいわゆる順遺伝学的アプローチとは反対方向に進行する、遺伝子の機能を発見するための実験的アプローチを指す。すなわち、順遺伝学アプローチが、表現型形質の遺伝的基盤を解明することにより遺伝子の機能を特定しようとするのに対し、逆遺伝学に基づく戦略は、単離された遺伝子に始まり、ｗｔまたは変異遺伝子の発現で生成される可能性のある表現型を調べることにより、その機能を発見しようとするものである。ウイルスシステムの文脈において本明細書で使用される場合、「逆遺伝学」システムとは、ＲＮＡから作製されるウイルスゲノムの遺伝子操作を可能にする技法の利用可能性を指す。簡潔に述べると、ウイルスゲノムは、ビリオンまたは感染細胞から単離され、逆転写酵素によってＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」）に変換され、場合により所望のように改変され、通常はＲＮＡ中間体を介して、感染ウイルス粒子に戻される。ピコルナウイルスにおけるこのプロセスは極めて単純であり、実際に、任意の動物ＲＮＡウイルスに対し開発された最初の逆遺伝学システムは、ＰＶに対するものであった。ウイルスの逆遺伝学システムは、裸のウイルスゲノムＲＮＡは適切な哺乳類細胞にトランスフェクションすると感染性を有するという過去の知見に基づいている。１９７０年代における逆転写酵素の発見及び分子クローニング技法の開発により、科学者は、ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡコピーを生成し操作することが可能になった。最も一般的には、ゲノムの全ｃＤＮＡコピーは、ゲノムＲＮＡのインビトロ合成を可能にするファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのすぐ下流にクローンさせ、次いで、ウイルスの生成のために細胞にトランスフェクションする。代替的に、同じＤＮＡプラスミドを、細胞質内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞にトランスフェクションしてもよい。
ウイルスゲノムの新規合成
ウイルスゲノムを新規に設計し合成するためにコンピューターベースのアルゴリズムが使用される。本明細書に記載の改変されたＰＶに例証されるようなこれらの合成ゲノムは、野生型（ｗｔ）ウイルスと同じタンパク質をコードしているが、代替となる同義コドンを使用することにより、コドンバイアス、コドン対バイアス、ＲＮＡ２次構造、及び／またはジヌクレオチド含有量を含めた様々なパラメーターが変更されている。提示されたデータは、これらのコード非依存的変化によって高度に改変されたウイルスが産生されることを示しているが、これは多くの場合タンパク質の翻訳が不十分であることによるものである。
「（１つまたは複数の）改変されたウイルス」は、別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、そのゲノムが、全体的にまたは部分的に、同義コドン、及び／またはコドン再構成及びコドン対バイアスのバリエーションを有するウイルス（１つまたは複数）を指す。本発明の改変されたウイルスは、がんを処置するために使用することができる。本明細書に記載の組換え型ウイルスは、別段の指示がない限り、改変されたウイルスである。
全てのウイルスの基本的機能、すなわちタンパク質翻訳を標的とすることにより、本明細書に記載の本発明の方法は、腫瘍溶解療法の作製に有用である改変されたウイルスを予測可能に、安全に、迅速に、及び安価に産生するために開発された。本明細書では、ＰＶカプシドコード領域におけるコドン及びコドン対バイアス両方の脱最適化により、ＰＶ適応度が劇的に低減することが示されている。本発明は、同義コドンの置換を介したウイルス弱毒化の根底にあるいかなる特定の分子機構にも限定されない。
代替的なコード化
所与のペプチドは、多数の核酸配列によってコードされ得る。例えば、典型的な短い１０−ｍｅｒオリゴペプチドであっても、およそ４１０（約１０６）種類の異なる核酸によってコードされ得、ＰＶのタンパク質は、約１０４４２種類の異なる核酸によってコードされ得る。自然選択により、最終的には、これらの考えられる１０４４２種類の核酸のうちの１つがＰＶゲノムとして選択されている。一次アミノ酸配列は所与のｍＲＮＡによりコードされる最も重要なレベルの情報であるが、異なるＲＮＡ配列内にはさらなる種類の情報が存在する。このような情報には、別々の機能のＲＮＡ構造エレメントが含まれる（例えば、ＰＶについては、シス作用性複製要素（すなわちＣＲＥ）、翻訳動態シグナル（休止部位、フレームシフト部位など）、ポリアデニル化シグナル、スプライスシグナル、酵素機能（リボザイム）、そして可能性が高いのは、その他の未確認の情報及びシグナル）。
ＣＲＥのようなシグナルを保存しなければならないという警告を伴っても、１０４４２種類の考えられるコード配列は、同じタンパク質をコードする能力を保持しながらポリオのＲＮＡ配列を徹底的に変化させる多大な柔軟性をもたらす。変化がなされ得るのはコドンバイアスまたはコドン対バイアスに対してであり、ＲＮＡにおける核酸シグナル及び２次構造が追加される場合もあれば除去される場合もある。追加または新規のタンパク質が代替的フレーム内で同時にコードされる場合すらある。
コドン対バイアス
コード配列を区別する特徴の１つは、そのコドン対バイアスである。これは、アミノ酸対Ａｌａ−Ｇｌｕを検討することによって説明することができる。Ａｌａ−Ｇｌｕは８つの異なるコドン対によりコードされ得、この対合は、ヒト細胞内のヒト及びウイルス遺伝子の翻訳に影響を及ぼすバイアスを有し得る（表１）。（表２に示されるような）各個別のコドンの頻度以外でコドン対の頻度の原因となる因子がない場合、８つのコード化物の各々における予想頻度は、２つの関連するコドンの頻度を掛け合わせることにより計算することができる。例えば、この計算により、コドン対ＧＣＡ−ＧＡＡは、全てのＡｌａ−Ｇｌｕコドン対のうち０．０９７の頻度で発生することが予想される（０．２３×０．４２；表２の頻度に基づく）。各コドン対の予想（仮説的）頻度を、ヒトゲノムにおいて実際に観察された頻度と関連付けるため、合計１４，７９５種類のヒト遺伝子を含む、一貫した注釈付きのヒトコード領域のコンセンサスＣＤＳ（ＣＣＤＳ）データベースが使用された。この遺伝子セットは、ヒトコード配列を最も包括的に表現したものである。この遺伝子を用いて、コドンの出現数を、同じアミノ酸をコードする全ての同義コドンの数で割ることにより、コドン使用の頻度を再計算した。予想されたように、頻度は、表２に示されるような過去に公表された頻度と密接に相関した。わずかな頻度の変動は、おそらくは、Ｋａｚｕｓａ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｏｄｏｎ．ｈｔｍｌ）のコドン使用データベースにより提供されたデータにおけるオーバーサンプリング効果によるものであり、このデータベースでは８４９４９種類のヒトコード配列が計算に含まれていた（これは、ヒト遺伝子の実数よりもはるかに多い）。このようにして計算されたコドン頻度を、次に予想コドン対頻度を計算するのに使用し、この計算は、最初に２つの関連するコドンの頻度を互いに掛け合わせ（表１の予想頻度を参照）、次いでこの結果を、問題となるコドン対でコードされたアミノ酸が出現する観察された頻度（全体のＣＣＤＳデータセットにおいて）と掛け合わせることにより行った。コドン対ＧＣＡ−ＧＡＡを例にすると、この第２の計算により、（Ｋａｚｕｓａデータセットを用いた第１の計算の０．９７と比較して）０．０９８の予想頻度がもたらされる。最後に、１４，７９５種類のヒト遺伝子セットで観察された実際のコドン対頻度は、セット内の各コドンペアの出現数の合計を計数し、それを、同じアミノ酸対をコードするセット内の全ての同義コード対の数で割ることにより決定した（表２；観察頻度）。８つの異なるコドン対によってコードされ得るアミノ酸対Ａｌａ−Ｇｌｕにおける頻度及び観察／予想値は表１に見られ、３７２１（６１２）種類の完全なコドン対セットは１４，７９５種類のヒト遺伝子セットに基づく（Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００８）。
（表１）アミノ酸対のアラニン−グルタミンについてのコドン対スコア
Figure 2021508696
（表２）ヒト遺伝子におけるコドンバイアス
Figure 2021508696
Figure 2021508696
Figure 2021508696
コドン対の観察頻度／予想頻度の比が１より大きい場合、コドン対が過剰提示されていると言う。比が１よりも小さい場合、過少提示されていると言う。例において、コドン対ＧＣＡ−ＧＡＡが１．６５倍過剰提示されているのに対し、コーディング対（ｃｏｄｉｎｇ ｐａｉｒ）ＧＣＣ−ＧＡＡは５倍超過少提示されている。
他の多くのコドン対も非常に強いバイアスを示しており、過少提示されている対もあれば、過剰提示されている対もある。例えば、コドン対ＧＣＣＧＡＡ（ＡｌａＧｌｕ）及びＧＡＴＣＴＧ（ＡｓｐＬｅｕ）が３〜６倍過少提示されている（優先されている対は、それぞれＧＣＡＧＡＧ及びＧＡＣＣＴＧである）のに対し、コドン対ＧＣＣＡＡＧ（ＡｌａＬｙｓ）及びＡＡＴＧＡＡ（ＡｓｎＧｌｕ）は約２倍過剰提示されている。注目すべきであるのは、コドン対バイアスは、アミノ酸対の頻度とも個別のコドンの頻度とも関係がないことである。例えば、過少提示された対ＧＡＴＣＴＧ（ＡｓｐＬｅｕ）は、偶然にも最も頻度の高いＬｅｕコドン（ＣＴＧ）を使用している。
コドン対バイアスは原核細胞内で発見されたが、以来、ヒトを含めた他の全ての検討対象種で見られている。その効果は非常に高い統計的有意性を有し、単なるノイズではないことは確かである。しかし、その機能的重要性については、存在するとしても分かっていない。ある提唱は、ｔＲＮＡ対には、リボソーム上で一緒になったときに十分に相互作用する対もあれば、十分に相互作用しない対もあるというものである。通常、異なるコドンは異なるｔＲＮＡによって読み取られるため、適合しないｔＲＮＡ対を一緒にするのを避けるようにコドン対にバイアスがかかる可能性がある。別の考えは、多くの（ただし全てではない）過少提示された対は、ＣＧが中央にあるジヌクレオチド（例えば、ＡｌａＧｌｕをコードするＧＣＣＧＡＡ）を有するというものであり、ＣＧジヌクレオチドは哺乳類では系統的に過少提示されている。したがって、コドン対バイアスの効果は２種類考えられる。一方は哺乳類ゲノムにおけるＣＧの過少提示という間接的な効果であり、他方は翻訳の効率、スピード、及び／または正確さと関係がある。本発明は、コドン対バイアスの根底にある任意の特定の分子機構に限定されるものではないことを強調しておきたい。
コドン対バイアスの計算
３７２１個の非「停止」含有コドン対におけるあらゆる個別のコドン対（例えば、ＧＴＴ−ＧＣＴ）は、遺伝子の所与の「トレーニングセット」に対し特異的な、割り当てられた「コドン対スコア（ｃｏｄｏｎ ｐａｉｒ ｓｃｏｒｅ）」すなわち「ＣＰＳ」を保有する。所与のコドン対のＣＰＳは、この遺伝子セット（この例では、ヒトゲノム）において予想された出現数に対する観測された出現数の対数比として定義される。特定のコドン対の実際の出現数（言い換えれば、特定のアミノ酸対が特定のコドン対によってコードされる可能性）の決定は、単に、特定のコード配列セットにおけるコドン対の実際の出現数を計数するだけでよい。しかし、予想数を決定するには追加の計算が必要となる。予想数は、Ｇｕｔｍａｎ ａｎｄ Ｈａｔｆｉｅｌｄと同様に、アミノ酸頻度及びコドンバイアスに依存しないように計算される。すなわち、予想頻度は、アミノ酸が特定のコドンによってコードされる回数の相対割合に基づいて計算される。正のＣＰＳ値は、所与のコドン対が統計的に過剰提示されていることを意味し、負のＣＰＳ値は、ヒトゲノム内で所与のコドン対が統計的に過少提示されていることを示す。
これらの計算をヒトの文脈内で実施するため、合計１４，７９５種類の遺伝子を含む、一貫した注釈付きの最新のコンセンサスＣＤＳ（ＣＣＤＳ）データベースを使用した。このデータセットではコドン及びコドン対が示され、よってゲノムスケールにおけるアミノ酸及びアミノ酸対の頻度がもたらされた。
Ｆｅｄｅｒｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００２）のパラダイムを使用して、Ｇｕｔｍａｎ ａｎｄ Ｈａｔｆｉｅｌｄ（１９８９）のアプローチをさらに強化した。これにより、特定のアミノ酸対をコードする近隣のコドンのコドン頻度及び非ランダム関連性に依存せずに、所与のコドン対の予想頻度の計算が可能になった。ＣＰＢの計算に使用する詳細な式は、ＷＯ２００８／１２１９９２及びＷＯ２０１１／０４４５６１で開示されており、これらは参照により援用される。
Figure 2021508696
計算中、Ｐｉｊは、その同義群においてＮＯ（Ｐｉｊ）の頻度で出現するコドン対である。Ｃｉ及びＣｊは、それらの同義群においてそれぞれＦ（Ｃｉ）及びＦ（Ｃｊ）の頻度で出現するＰｉｊを含む２つのコドンである。より明示的には、Ｆ（Ｃｉ）は、対応するアミノ酸Ｘｉが全てのコード領域内でコドンＣｉによってコードされる頻度であり、Ｆ（Ｃｉ）＝ＮＯ（Ｃｊ）／ＮＯ（Ｘｉ）である（式中、ＮＯ（Ｃｉ）及びＮＯ（Ｘｉ）は、それぞれコドンＣｉ及びアミノ酸Ｘｉの観察出現数である）。Ｆ（Ｃｊ）はこのように計算される。さらに、ＮＯ（Ｘｉｊ）は、全てのコード領域におけるアミノ酸対Ｘｉｊの出現数である。Ｐｉｊのコドン対バイアススコアＳ（Ｐｉｊ）は、予想出現数Ｎｅ（Ｐｉｊ）に対する観察頻度Ｎｏ（Ｐｉｊ）の対数オッズ比として計算した。
上記の式を用いて、次に、全体のヒトＣＣＤＳデータセットを使用することにより計算される対応ゲノムＮｅ（Ｐｉｊ）値と比較したときに、個別のコード配列における個別のコドン対が過剰提示または過少提示されているかを決定した。この計算により、ヒトコード領域内で過剰提示されたコドン対については正のＳ（Ｐｉｊ）スコア値が、過少提示されたコドン対については負の値が得られた。
個別のコード配列の「組み合わされた」コドン対バイアスを、以下の式に従って全てのコドン対スコアを平均することにより、計算した。
Figure 2021508696
したがって、コード領域全体のコドン対バイアスは、領域を含む個別のコドン対スコア全てを加え、この合計をコード配列の長さで割ることにより計算される。
コドン対バイアスの計算、コドン対バイアスを変更するためのアルゴリズムの実施
コドン対バイアスを定量化するためのアルゴリズムが開発された。全ての考えられる個々のコドン対に対し、「コドン対スコア」、すなわち「ＣＰＳ」を付与した。ＣＰＳは、全てのヒトコード領域における各コドン対の予想出現数に対する観察出現数の比の自然対数として定義され、このときヒトが、再コードされるべき目下のワクチンウイルスの宿主種に相当する。
Figure 2021508696
特定のコドン対の観察出現数の計算は単純明快（遺伝子セット内の実測数）であるが、コドン対の予想出現数は追加的な計算を必要とする。本発明者らは、Ｇｕｔｍａｎ ａｎｄ Ｈａｔｆｉｅｌｄと同様に、この予想数をアミノ酸頻度及びコドンバイアスに依存しないように計算する。すなわち、予想頻度は、アミノ酸が特定のコドンによってコードされる回数の相対割合に基づいて計算される。正のＣＰＳ値は、所与のコドン対が統計的に過剰提示されていることを意味し、負のＣＰＳは、ヒトゲノム内で所与のコドン対が統計的に過少提示されていることを示す。
次に、これらの計算されたＣＰＳを用いて、任意のコード領域に対し、コドン対スコアの平均をとることにより、過剰提示または過少提示されたコドン対を使用しているものとして評価することができ、よって全体の遺伝子にコドン対バイアス（ＣＰＢ）を付与することができる。
Figure 2021508696
以下でさらに論じるように、コドン対バイアスは、コード配列の全長にわたって平均されたコード配列中の各コドン対におけるスコアを考慮している。本発明によれば、コドン対バイアスは次式により決定される。
Figure 2021508696
したがって、コード配列における同様のコドン対バイアスは、例えば、部分配列にわたる最小化されたコドン対スコアまたはコード配列の全長にわたる適度に減少したコドン対スコアにより得ることができる。
６１個全てのセンスコドン及び全てのセンスコドン対が確実に使用され得るため、１つの稀少コドンを高頻用コドンの代わりに、または稀少コドン対を頻用コドン対の代わりに置き換えることが大きな影響をもたらすと予想されることはないであろう。詳細な機構にかかわらず、このデータは、ウイルスゲノム内への同義脱最適化コドンの大規模な置換により、著しく弱毒化されたウイルスがもたらされることを示している。改変されたウイルスを産生するためのこの手順は、ＳＡＶＥ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）と呼ばれている。
本発明の態様によれば、ウイルス改変は、ウイルスのゲノムの１つ以上の部分におけるコドン対バイアス及びコドンバイアスの変化によって遂行することができる。ただし、コドン対バイアスの調整が特に有利であることが予想される。例えば、コドンバイアスを通じてウイルスを弱毒化するには、概して共通コドンの除去が必要となるため、ヌクレオチド配列の複雑さが低減される。これに対し、コドン対バイアスの低減または最小化は、はるかにより大きな配列多様性、及びその結果としての核酸２次構造、アニーリング温度、ならびにその他の物理的及び生化学的性質に対するより大きな制御を維持しながら遂行することができる。本明細書で開示されている取り組みは、コドンがシャッフルされているがコドン使用プロファイルは不変である、改変されたコドン対バイアス低減または最小化配列を含む。
悪性腫瘍は、臓器内の細胞の制御不能な成長に起因することが知られている。腫瘍は、腫瘍浸潤、機能的組織の置換え、必須資源に対する競合、及びしばしば生じる２次的部位への転移的拡散により、正常な臓器機能が致命的に損なわれ得る程度まで成長する。悪性がんは、米国における死亡原因の第２位である。
現在までのところ、悪性腫瘍を処置するための方法としては、外科的切除、放射線、及び／または化学療法が挙げられる。しかし、多くの悪性腫瘍は、従来利用可能な全ての処置選択肢に対する応答が不十分であり、既知の実践されている方法には重大な副作用が存在する。副作用の重症度の低減に大きな進歩が見られ、一方で一般的に実践されている処置レジメンの効率が向上している。しかし、多くの問題が残されており、代替的な処置モダリティーを探索する必要がある。探索は、中枢神経系の原発性悪性腫瘍については特に急務である。脳腫瘍、特に神経膠芽腫は、依然として最も困難な治療上の課題の１つである。手術、放射線療法、及び化学療法を単独及び併用で適用しても、神経膠芽腫はほぼ常に致命的であり、生存率の中央値は１年未満、５年生存率は５．５％以下である。利用可能な治療様式のうちで、神経膠芽腫の絶え間ない進行を実質的に変えたものはない。
悪性神経膠腫と診断され、全体的または部分的に腫瘍を除去する手術を後続の化学療法及び／または放射線と共に受けた患者の系統的な研究からは、特に６０歳超の患者において、１年後の生存率が低いままであることが示された。悪性神経膠腫は、放射線及び化学療法のレジメンに対し比較的抵抗性であることが判明している。外科的切除及び補助的な放射線／化学療法の後に局所的再発の傾向が頻繁に見られることが、悪性神経膠腫の予後をさらに不良にする。
近年、がんの処置のためにウイルスを、（１）遺伝子送達ビヒクルとして；（２）病原性特色を喪失するように遺伝子改変されたウイルスを使用することにより、直接的な腫瘍溶解媒介物として；または（３）この目的のために遺伝子操作されたウイルスを用いての、悪性細胞を選択的に損傷するための媒介物として、使用することが提案されている。
悪性神経膠腫に対するウイルスの使用例としては、以下のものが挙げられる。単純ヘルペスウイルスｄｌｓｐｔｋ（ＨＳＶｄｌｓｐｔｋ）は、ＨＳＶのチミジンキナーゼ（ＴＫ）陰性変異体である。このウイルスは、正常なウイルス複製に必要な産物をもたらすＴＫ遺伝子の３６０塩基対が欠失していることにより、神経毒性が弱毒化されている。ＨＳＶｄｌｓｐｔｋは、細胞の溶解及び死を引き起こす悪性細胞を迅速に分割する増殖の潜在能力を保持することが分かっている。残念ながら、神経病原性が弱毒化された全ての欠陥ヘルペスウイルスは、実験動物における脳炎の重篤な症状との関連が見られている。例えば、脳内にＨＳＶｄｌｓｐｔｋを感染させたマウスにおいて、ＬＤ５０ Ｉｃ（頭蓋内投与）は１０６ ｐｆｕとかなり低用量である。これが、この変異体ＨＳＶの使用を制限する。他のＨＳＶ変異体が提案され、試験されている。それにもかかわらず、ウイルス性脳炎による死亡が依然として問題となっている。
別の提案は、ＨＳＶ ｔｋ遺伝子を含むように操作されたレトロウイルスを使用して、ガンシクロビル又はアシクロビルのようなヌクレオシドアナログのインビボリン酸化を引き起こすチミジンキナーゼを発現させ、ＤＮＡ複製を遮断し、分裂細胞を選択的に殺滅することであった。Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２：６６−６９（１９９５）は、ＨＳＶ ｔｋ遺伝子及びそのプロモーターの挿入により操作されたモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）の使用について報告した。治療用レトロウイルスの新生物内接種で処置した神経膠芽腫患者をＭＲＩにより経過観察したところ、明らかな短期的副作用を伴わない腫瘍の縮小が明らかになった。しかし、この実験的療法は、罹患患者の短期生存率にも長期生存率にも影響を及ぼさなかった。レトロウイルス療法は、典型的には、重篤な長期的副作用（例えば、挿入変異誘発）の危険性を伴う。
同様のシステムが、上気道の悪性腫瘍、アデノウイルス感染に対し天然に感受性の組織内で生じ、アクセスが容易な腫瘍を標的とするように開発されている。しかし、多形神経膠芽腫は、広範に異種の細胞タイプから構成された（多形という名称はこのためである）高度に悪性の腫瘍であるが、極めて可変性の遺伝子型によって特徴づけられ、一様な遺伝子異常を伴った均質の腫瘍を対象とする腫瘍溶解ウイルスシステムに応答する可能性は低い。
本発明者らのウイルス改変の効果は、当業者に周知されている方法で確認することができる。非限定的な例は、プラークアッセイ、成長測定、ＲＮＡウイルスの逆遺伝学、及び試験動物における致死率低減を誘導する。本出願は、改変されたウイルスが宿主における防御免疫応答を誘導できることを実証するものである。
以下の実施形態及び態様が、代表的かつ例示的であり、範囲を限定しないように意図されている組成物及び方法と共に、記載及び例示される。
本発明の目的は、様々なタイプのがんの処置のための改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体治療薬またはその他の免疫オンコロジー療法と組み合わせて使用することができる、様々なタイプのがんの処置のための改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、がん細胞に改変されたウイルスを感染させてがん細胞の溶解及び死を引き起こすことにより、がん細胞を処置することである。
本発明のさらなる目的は、がん細胞に改変されたウイルスを感染させて抗腫瘍免疫応答を誘発することにより、がん細胞を処置することである。
本発明のさらなる目的は、がん細胞に改変されたウイルスを感染させて、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ１、ＴＩＭ３、ｌａｇ−３のような抗腫瘍免疫タンパク質の発現を増加または減少させることによって抗腫瘍免疫応答を誘発することにより、がん細胞を処置することである。
本発明のさらなる目的は、がん細胞に改変されたウイルスを感染させて、腫瘍における自然シグナリング受容体ＲＩＧ−Ｉ、ＳＴＮＧ、ならびに自然免疫転写因子ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、またはＮＦｋＢの活性化を介して腫瘍細胞における自然免疫応答を誘発することにより、がん細胞を処置することである。
本発明のさらなる目的は、がん細胞に改変されたウイルスを感染させて腫瘍における自然免疫応答を誘発することにより、がん細胞を処置することである。
本発明のさらなる目的は、がん細胞に改変されたウイルスを感染させて腫瘍における炎症促進性免疫応答を誘発することにより、がん細胞を処置することである。
本発明のさらなる目的は、がん細胞に改変されたウイルスを感染させて炎症促進性白血球を腫瘍に動員させることにより、がん細胞を処置することである。
本発明のさらなる目的は、がん細胞に改変されたウイルスを感染させて腫瘍からの制御性白血球を減少させることにより、がん細胞を処置することである。
本発明のさらなる目的は、レシピエントに対し、がんを処置するために改変されたウイルスを投与する前に、免疫応答を誘発するために改変されたウイルスで前処置することである。
本発明のさらなる目的は、レシピエントに対し、がんを処置するために改変されたウイルスの自然分離株を投与する前に、免疫応答を誘発するために改変されたウイルスで前処置することである。
本発明のさらなる目的は、神経膠腫、特に神経膠芽腫の処置及び治癒に適切と考えられる、新規の野生型ウイルス−改変されたウイルスのキメラを開発することである。
本発明のさらなる目的は、腺がん、特に子宮頸がんの処置に適切と考えられる、新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、乳がん（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）の処置に適切と考えられる、新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、免疫ペルオキシダーゼ染色でケラチン陽性であるがん細胞の処置に適切と考えられる、新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、ｐ５３遺伝子発現が低いかまたはないと報告されているがん細胞の処置に適切と考えられる、さらなる新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、細胞が低２倍体である腫瘍の処置に適切と考えられる、さらなる新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、肺のがん腫、特に肺がんの処置に適切である、新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、低３倍体（例えば、細胞の約４０％で染色体数６４、６５、または６６）であるがんの処置に適切である、新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、細胞当たり単一コピーの染色体Ｎ２及びＮ６を有したがんの処置に適切である、新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の酵素のアイソエンザイムＧ６ＰＤ−Ｂを発現するがんの処置に適切である、新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、黒色腫の処置に適切である、新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、メラニン形成細胞に由来する悪性細胞の処置に適切である、新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、神経芽腫の処置に適切である、新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、少なくとも３倍のＭＹＣＮ腫瘍遺伝子増幅を有するがんの処置に適切である、新規の改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、乳がんの処置に適切である、改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、膀胱がんの処置に適切である、改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、結腸がんの処置に適切である、改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、前立腺がんの処置に適切である、改変されたウイルスを開発することである。
本発明のさらなる目的は、末梢神経鞘腫瘍の処置に適切である、改変されたウイルスを開発することである。
本発明は、１つ以上（例えば、１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０個、またはそれ以上）の位置で操作されたヌクレオチド置換を有する改変されたウイルスゲノムを含み、当該置換が複数の同義コドンをゲノム内に導入する、改変されたウイルスを提供する。この同義コドンの置換は、ゲノム内のコドンバイアス、コドン対バイアス、脱最適化コドン及び脱最適化コドン対の密度、ＲＮＡ２次構造、ＣｐＧジヌクレオチド含量、Ｃ＋Ｇ含量、ＵｐＡジヌクレオチド含量、翻訳フレームシフト部位、翻訳休止部位、組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列の存在もしくは不在、またはこれらの任意の組合せを含めた様々なパラメーターを変更する。多数の欠損が関与するため、本発明の改変されたウイルスは、多様な種々の腫瘍タイプに対する安定的に改変された腫瘍溶解性ウイルスを産生する１つの方法をもたらす。
１つの実施形態において、親ウイルスの対応する配列と同一であるウイルスタンパク質またはその一部をコードする核酸配列を含む改変されたウイルスであって、改変されたウイルスのヌクレオチド配列が、改変されたウイルスが由来する親配列のコドンを含有し、当該ヌクレオチド配列が、親ウイルスのヌクレオチド配列に対し９８％未満同一である、改変されたウイルスが提供される。別の実施形態において、ヌクレオチド配列は、親ウイルスの配列に対し９０％未満同一である。改変をもたらす置換されたヌクレオチド配列は、少なくとも１００ヌクレオチド長、または少なくとも２５０ヌクレオチド長、または少なくとも５００ヌクレオチド長、または少なくとも１０００ヌクレオチド長である。改変された配列のコドン対バイアスは、親ウイルスのコドン対バイアスより小さく、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．２低減される。
１つの実施形態において、親ウイルスの対応する配列と同様のウイルスタンパク質またはその一部をコードする核酸配列を含む改変されたウイルスであって、改変されたウイルスのヌクレオチド配列が、親ウイルスのヌクレオチド配列に対し９８％未満同一であるヌクレオチドを含有する、改変されたウイルスが提供される。別の実施形態において、ヌクレオチド配列は、親ウイルスの配列に対し９０％未満同一である。改変をもたらす置換されたヌクレオチド配列は、少なくとも１００ヌクレオチド長、または少なくとも２５０ヌクレオチド長、または少なくとも５００ヌクレオチド長、または少なくとも１０００ヌクレオチド長である。改変された配列のＣｐＧジヌクレオチド含量は、親ウイルスに対し少なくとも１９、または少なくとも４１増加する。
１つの実施形態において、親ウイルスの対応する配列と同様のウイルスタンパク質またはその一部をコードする核酸配列を含む改変されたウイルスであって、改変されたウイルスのヌクレオチド配列が、親ウイルスのヌクレオチド配列に対し９８％未満同一であるヌクレオチドを含有する、改変されたウイルスが提供される。別の実施形態において、ヌクレオチド配列は、親ウイルスの配列に対し９０％未満同一である。改変をもたらす置換されたヌクレオチド配列は、少なくとも１００ヌクレオチド長、または少なくとも２５０ヌクレオチド長、または少なくとも５００ヌクレオチド長、または少なくとも１０００ヌクレオチド長である。改変された配列のＵｐＡジヌクレオチド含量は、親ウイルスに対し少なくとも１３、または少なくとも約２６増加する。
また、本発明の実施形態は、対象において処置するための治療用組成物であって、改変されたウイルスと、医薬的に許容される担体とを含む、治療用組成物も提供する。また、本発明は、対象における免疫応答を誘発するための治療用組成物であって、改変されたウイルスと、医薬的に許容される担体とを含む、治療用組成物も提供する。本発明はさらに、野生型宿主細胞内では生存不能な改変ウイルスに対し許容的であるように操作された、改変された宿主細胞株を提供する。
本発明によれば、改変されたウイルスは、改変されたウイルスゲノムを宿主細胞にトランスフェクションして改変されたウイルス粒子が産生されることにより、作製される。本発明はさらに、がんの処置に適切な改変されたウイルスを含む医薬組成物を提供する。
本発明の様々な実施形態は、悪性腫瘍を処置する方法であって、それを必要とする対象に、修飾されたウイルスを投与することを含み、改変されたウイルスが、以下からなる群より選択される、方法を提供する：野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を、同様のタンパク質配列をコードするコドン対脱最適化領域で置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、改変された配列のコドン対バイアスが、親ウイルスのコドン対バイアスより小さく、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．２低減されている、改変されたウイルス；同様のタンパク質配列をコードする、ＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、ＣｐＧジヌクレオチドの増加では、少なくとも４１インスタンスが親を上回るか、または少なくとも２１インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、改変されたウイルス；同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、ＵｐＡジヌクレオチドの増加では、少なくとも２６インスタンスが親を上回るか、または少なくとも１３インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、改変されたウイルス；同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドの増加では、合わせて少なくとも４２インスタンスが親を上回っていた、改変されたウイルス、ならびにこれらの組合せ。
本発明の様々な実施形態は、悪性腫瘍を処置する方法であって、それを必要とする対象に、改変されたウイルスのプライム用量を投与することと、それを必要とする対象に、改変されたウイルスの１回以上のブースト用量を投与することとを含み、プライム用量及びブースト用量の改変されたウイルスが各々独立に、以下からなる群より選択される、方法を提供する：コドン対脱最適化以外の方法によって産生された弱毒化ウイルス；野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を、同様のタンパク質配列をコードするコドン対脱最適化領域で置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、改変された配列のコドン対バイアスが、親ウイルスのコドン対バイアスより小さく、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．２低減されている、改変されたウイルス；同様のタンパク質配列をコードする、ＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、ＣｐＧジヌクレオチドの増加では、少なくとも４１インスタンスが親を上回るか、または少なくとも２１インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、改変されたウイルス；同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、ＵｐＡジヌクレオチドの増加では、少なくとも２６インスタンスが親を上回るか、または少なくとも１３インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、改変されたウイルス；同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドの増加では、合わせて少なくとも４２インスタンスが親を上回っていた、改変されたウイルス；ならびにこれらの組合せ。
様々な実施形態において、プライム用量は、皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内、または静脈内に投与することができる。様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、腫瘍内または静脈内に投与することができる。
様々な実施形態において、１回以上のブースト用量の１回目は、１回のプライム用量から約２週間後に、または、２回以上のプライム用量の場合は最後のプライム用量から約２週間後に投与することができる。
様々な実施形態において、対象はがんを有する可能性がある。様々な実施形態において、対象はがん発症のより高いリスクを有する可能性がある。
様々な実施形態において、プライム用量は、対象ががんを有しない場合に投与することができる。
様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、対象ががんを有しない場合に、プライム用量後約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０年毎に投与することができる。様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、対象ががんと診断された後に投与することができる。
様々な実施形態において、当該方法はさらに、ＰＤ−１阻害物質またはＰＤ−Ｌ１阻害物質を投与することを含み得る。
様々な実施形態において、ＰＤ−１阻害物質は抗ＰＤ１抗体であり得る。様々な実施形態において、抗ＰＤ１抗体は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、スパルタリズマブ、セミプリマブ、ＡＫ１０５、ＢＣＤ−１００、ＢＩ ７５４０９１、ＪＳ００１、ＬＺＭ００９、ＭＧＡ０１２、Ｓｙｍ０２１、ＴＳＲ−０４２、ＭＧＤ０１３、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、チスレリズマブ、及びこれらの組合せからなる群より選択することができる。
様々な実施形態において、ＰＤ−１阻害物質は、ＰＦ−０６８０１５９１、抗ＰＤ１抗体発現多能性キラーＴリンパ球（ＰＩＫ−ＰＤ−１）、自己由来抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ４ＳＣＡＲ−ＩｇＴ細胞、及びこれらの組合せからなる群より選択することができる。
様々な実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害物質は抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり得る。様々な実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＧＢ−Ａ３３３、ＣＫ−３０１、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、ＭＤＸ−１１０５、ＭＳＢ２３１１、ＳＨＲ−１３１６、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＣＫ−３０１、及びこれらの組合せからなる群より選択することができる。
様々な実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１阻害物質はＭ７８２４である。
様々な実施形態において、悪性腫瘍を処置することによって、当該悪性腫瘍の再発の可能性が減少し得る。様々な実施形態において、悪性腫瘍を処置することによって、当該悪性腫瘍と異なる第２のがんを有する可能性が減少し得る。
様々な実施形態において、対象が、悪性腫瘍と異なる第２のがんを発症した場合に、当該悪性腫瘍の処置は、第２のがんの成長を遅くするという結果をもたらし得る。
様々な実施形態において、悪性腫瘍の寛解後、対象が、当該悪性腫瘍と異なる第２のがんを発症した場合に、当該悪性腫瘍の処置は、第２のがんの成長を遅くするという結果をもたらし得る。
様々な実施形態において、悪性腫瘍を処置することによって、腫瘍の炎症性免疫応答が刺激され得る。様々な実施形態において、悪性腫瘍を処置することによって、炎症促進性細胞が腫瘍に動員され得る。様々な実施形態において、悪性腫瘍を処置することによって、抗腫瘍免疫応答が刺激され得る。
本発明の様々な実施形態は、本発明の悪性腫瘍を処置する方法であって、改変されたウイルスが組換え型の改変されたウイルスであり得る、方法を提供する。
本発明の様々な実施形態は、本発明の悪性腫瘍を処置する方法であって、改変されたウイルスがピコルナウイルスから改変され得る、方法を提供する。
様々な実施形態において、ピコルナウイルスはエンテロウイルスである。様々な実施形態において、エンテロウイルスはエンテロウイルスＣである。様々な実施形態において、エンテロウイルスＣはポリオウイルスである。
本発明の様々な実施形態は、本発明の悪性腫瘍を処置する方法であって、改変されたウイルスがオルソミクソウイルスから改変され得る、方法を提供する。様々な実施形態において、オルトミクソウイルスはインフルエンザＡウイルスであり得る。様々な実施形態において、インフルエンザＡウイルスの１つ以上のセグメントが再コードされ得る。様々な実施形態において、ＨＡ、ＮＡ、またはＨＡ及びＮＡ両方の領域が再コード（例えば、脱最適化）され得る。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは配列番号５または配列番号６であり得る。
本発明の様々な実施形態は、本発明の悪性腫瘍を処置する方法であって、改変されたウイルスがフラビウイルスから改変され得る、方法を提供する。
様々な実施形態において、フラビウイルスはジカウイルスであり得る。
様々な実施形態において、ジカウイルスの前膜（ｐｒｅ−ｍｅｍｂｒａｎｅ）／エンベロープ（Ｅ）コード領域もしくは非構造タンパク質３（ＮＳ３）コード領域または両方が再コードされ得る。様々な実施形態において、再コード化は、Ｅ及びＮＳ３コード配列中のＣＧ及び／またはＴＡジヌクレオチドの頻度を変更することを含み得る。様々な実施形態において、再コードされたＥタンパク質コード配列、もしくはＮＳ３コード配列、または両方は、−０．１より小さいコドン対バイアスを有し得る。様々な実施形態において、再コードされたＥタンパク質コード配列、もしくはＮＳ３コード配列、または両方は、０．１〜０．４のコドン対バイアスを有し得る。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４であり得る。
本発明の様々な実施形態は、本発明の悪性腫瘍を処置する方法であって、悪性腫瘍が固形腫瘍であり得る、方法を提供する。
本発明の様々な実施形態は、本発明の悪性腫瘍を処置する方法であって、悪性腫瘍が、神経膠芽腫、腺がん、黒色腫、肺がん、神経芽腫、乳がん、膀胱がん、結腸がん、前立腺がん、または肝臓がんであり得る、方法を提供する。
本発明の様々な実施形態は、本発明の悪性腫瘍を処置する方法であって、改変されたウイルスを、腫瘍内、静脈内、脳内、筋肉内、脊髄内、または髄腔内に投与することができる、方法を提供する。
本発明の様々な実施形態は、本発明の悪性腫瘍を処置する方法であって、改変されたウイルスが、ＰＶ１−ＭｉｎＹであってもよく、かつ野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから調製され、改変されたウイルスのＰ１領域の中央部分が、ヒトコドン対バイアスに従うコドン対スコアの低減のために再コードされた合成配列で置換されている、方法を提供する。
本発明の様々な実施形態は、本発明の悪性腫瘍を処置する方法であって、組換え型の改変されたウイルスが、ＰＶ１−ＭｉｎＹであってもよく、組換え型の改変されたウイルスが、予め改変されたウイルスＰＶｌ（Ｍ）または野生型ウイルスＰＶ１（Ｍ）から調製され、組換え型の改変されたウイルスのＰ１領域の中央部分が、ＵｐＡ及びまたはＣｐＧジヌクレオチド増加のために再コードされた合成配列で置換されている、方法を提供する。
様々な実施形態において、組換え型ウイルスは、ＰＶ１（Ｍ）から調製されたＰＶ１−ＭｉｎＹであり、Ｐ１領域のヌクレオチド位置１５１３〜ヌクレオチド位置２４７０を含むヌクレオチドの断片は、ヒトコドン対バイアスに従うコドン対スコアの低減のために再コードされたＰ１領域のヌクレオチド位置１５１３〜ヌクレオチド位置２４７０を含むヌクレオチドの対応する断片で置換されている。
本発明の様々な実施形態は、本発明の悪性腫瘍を処置する方法であって、改変されたウイルスが、ＰＶ１（Ｍ）から調製されたＰＶ１−ＭｉｎＹであり、Ｐ１領域のヌクレオチド位置１５１３〜ヌクレオチド位置２４７０からなるヌクレオチドの断片が、ヒトコドン対バイアスに従うコドン対スコアの低減のために再コードされたＰ１領域のヌクレオチド位置１５１３〜ヌクレオチド位置２４７０を含むヌクレオチドの対応する断片で置換されている、方法を提供する。
本発明の様々な実施形態は、悪性腫瘍を処置する方法であって、野生型ピコルナウイルスのＰ１ドメイン内のヌクレオチドの少なくとも１つの断片を、ヒトコドン対バイアスに従ってコドン対スコア低減のために再コードされた合成配列を含むヌクレオチドの対応する断片で置換することにより、野生型ピコルナウイルスから組換え型の改変されたウイルスを調製することと、ＰＶ１（Ｓ）、ＰＶ２（Ｓ）、及びＰＶ３（Ｓ）からなる群より選択される、ヒトコドン対バイアスに従うコドン対スコアの低減のために再コードされた合成Ｐ１で、野生型ピコルナウイルスのＰ１を任意選択で置換することと、それを必要とする対象に、組換え型の改変されたウイルスを投与することとを含む、方法を提供する。
様々な実施形態において、ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を置換することは、改変されたウイルスのＰ１ドメインである配列番号１のヌクレオチド番号１５１３〜ヌクレオチド番号２４７０を含むヌクレオチドの少なくとも１つの断片を、ヒトコドン対バイアスに従うコドン対スコアの低減のために再コードされた合成配列を含むヌクレオチドの対応する断片で置換することを含み得る。
様々な実施形態において、組換え型ウイルスは腫瘍内、静脈内、脳内、筋肉内、脊髄内、または髄腔内に投与することができ、腫瘍細胞における細胞溶解を引き起こす。
様々な実施形態において、悪性腫瘍は、多形神経膠芽腫、髄芽腫、乳がん（ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、気管支がん、及び類表皮がんからなる群より選択することができる。
様々な実施形態において、ピコルナウイルスはエンテロウイルスＣの種であり得る。様々な実施形態において、ピコルナウイルスはポリオウイルスであり得る。
様々な実施形態において、Ｐ１ドメインは、セービンワクチン株ＰＶ１（Ｓ）、ＰＶ２（Ｓ）、及びＰＶ３（Ｓ）から選択することができる。
以下の発明を実施するための形態、及び例として本発明の実施形態の様々な特徴を例示する付属の図面から、本発明の様々な特徴及び利点が明らかになる。
参照される図面には代表的な実施形態が例示されている。本明細書で開示されている実施形態及び図面は、限定的ではなく例示的とみなされるように意図されている。
全てのヒトＯＲＦ及び合成Ｐ１領域のコドン対バイアスを示している。１４，７９５種類の注釈付きヒト遺伝子に対しコドン対バイアス（ＣＰＢ）スコアが計算されている。各灰色のドットは、遺伝子の計算されたＣＰＢスコアを、その遺伝子のアミノ酸長に対しプロットして表す。ＣＰＢ ＰＶ（Ｍ）−ｗｔ Ｐ１領域のＣＰＢ、ならびに設計された合成ポリオウイルスのカプシドＰＶ−Ｍｉｎ、ＰＶ−ＭｉｎＸＹ、ＰＶ−ＭｉｎＺ、及びＰＶ−ＭａｘのＣＰＢが矢印及びラベルで示されている。 構築されたＰＶ−Ｍｉｎサブクローンの生存能を示す。（上）単一のオープンリーディングフレームとして翻訳されるポリオウイルスゲノム。（下）分子クローニングを介して構築された様々なキメラ合成ポリオウイルスコンストラクトのｃＤＮＡ、及び培養ＨｅＬａ Ｒ１９細胞におけるこれらのコンストラクトの生存能。ＰＶ−Ｍｉｎの少なくとも１つのセグメントを含むウイルスが得られ、よっていずれの１つの合成領域（Ｘ、Ｙ、またはＺ）にも肉眼的欠陥は見られなかった。領域を分離するヌクレオチド位置が示されている。全てのリーディングフレームにおける最初の１２ヌクレオチド（４コドン）は、翻訳の適正な開始を可能にするＰＶ（Ｍ）−ｗｔ配列である。配列に対応する色：黒：ＰＶ（Ｍ）−ｗｔ；灰色：ＰＶ−Ｍｉｎ；藁葺模様：ＰＶ−Ｍａｘ。 構築された合成ウイルスの増殖力価を示している。全ての生存可能なウイルスコンストラクト（図４）からの転写ＲＮＡをトランスフェクションしてから、続いてＨｅＬａ Ｒ１９細胞内で２回継代させることによってウイルスを増幅した。次いで、これらのウイルスが増殖した力価を、ＨｅＬａ Ｒ１９細胞単層上でのプラークアッセイによって測定した。ＰＶ−Ｍａｘ及びＰＶ（Ｍ）−ｗｔウイルスは同様の力価（約１０９）まで増殖し、一方ＰＶ−Ｍｉｎキメラウイルスはこれより低いＰＦＵ／ｍｌ力価をもたらし、力価は見かけ上段階的に減少した。ＰＶ−Ｍｉｎ配列をＰ１領域に添加することで、ＰＦＵ力価が減少した。グラフは、３つの独立した実験の平均力価を、標準偏差の値を示すエラーバーと共に示している。 変更されたコドン対バイアスが翻訳に及ぼす効果を示している。図４Ａは、２シストロン性レポーターの構造を示すものである。第１のシストロンは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用してＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ｒ−Ｌｕｃ）の翻訳を開始する。この第１のシストロンは、入力ＲＮＡの量を正常化するための内部制御をもたらす。第２のシストロンは、ポリオウイルスＩＲＥＳを使用してホタルルシフェラーゼ（Ｆ−Ｌｕｃ）の翻訳を開始する。「Ｐ１」とラベリングされた領域は、ＣＰＢ変更ウイルスの合成Ｐ１領域で置き換えた。これらのコンストラクトから（＋）ＲＮＡが転写された。 変更されたコドン対バイアスが翻訳に及ぼす効果を示している。各２シストロン性ＲＮＡを、２ｍＭ ＧｕＨＣｌの存在下でＨｅＬａ Ｒ１９細胞にトランスフェクションした。６時間後、Ｒ−Ｌｕｃ及びＦ−Ｌｕｃの活性を測定した。Ｆ−Ｌｕｃ／Ｒ−Ｌｕｃ比の値を、１００％に設定したＰＶ（Ｍ）−ｗｔ Ｐ１領域のＦ−Ｌｕｃ／Ｒ−Ｌｕｃ比を基準に正規化した。グラフは、３つの独立した実験の平均値を、標準偏差の値を示すエラーバーと共に示している。過少提示されたコドン対を利用したＰ１（ＰＶ−Ｍｉｎ、ＰＶ−ＭｉｎＺ、及びＰＶ−ＭｉｎＸＹ）は翻訳速度が減少し、一方過剰提示されたコドン対を含むＰ１（ＰＶ−Ｍａｘ）は翻訳効率がわずかに増加したと考えられた。 図５Ａ〜５Ｂは、改変されたポリオウイルスＭＶ−ＭｉｎＹで処置したＮＣＲヌードマウスにおける腫瘍成長の制御を示している。各マウス（ｎ＝７；Ａ）に対し、腫瘍が０．２ｃｍ３のサイズに到達してから０、３、及び５日目に２×１０７ ＰＦＵのＰＶ−ＭｉｎＹ注射または偽注射で処置した。 ＮＣＲヌードマウス（下）におけるＰＶ−ＭｉｎＹによる星細胞腫の腫瘍溶解を未処置対照マウス（上）と比較して示している。ＮＣＲヌードマウスに１×１０６ ＨＴＢ−１４細胞を皮下注射し、腫瘍が０．２ｃｍ３のサイズに到達したら実験を開始した。０日目、３日目、及び５日目に、腫瘍に対し偽希釈液（上）または２×１０７ ＰＦＵのＰＶ−ＭｉｎＹ（下）を注射した。ＰＶ−ＭｉｎＹを注射した腫瘍サイズは維持または低減されたが、偽処置群の動物は、腫瘍サイズの問題で７日後に安楽死させざるを得なかった。 改変されたウイルスＰＶ−ＭｉｎＹによるＡ５４９細胞の腫瘍溶解を示している。Ａ５４９細胞は、低３倍体（細胞の４０％で染色体数が６４、６５、または６６）のヒト肺上皮がん細胞株である（Ｇｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９７３）。染色体Ｎ２及びＮ６は細胞当たり１つのコピーを有し、Ｎ１２及びＮ１７は通常４コピーを有した。Ａ５４９細胞は、免疫ペルオキシダーゼ染色でケラチン陽性である。Ａ５４９は、酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）のアイソザイムＧ６ＰＤ−Ｂを発現する。肺がんのモデルとしてＡ５４９細胞を使用した。Ａ５４９細胞に１．０のＭＯＩでＰＶ−ＭｉｎＹを感染させた。Ａ５４９細胞をＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ中で成長させた。細胞に９０％のコンフルエンスで１０６ ＰＦＵのＰＶ−ＭｉｎＹを感染させ、室温で１時間揺動させた後、接種物を取り出し、ＤＭＥＭ＋２％ ＦＢＳで置き換えた。感染した細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。図７によって明らかなように、非感染の肺がん細胞と比較して、ＰＶ−ＭｉｎＹは、感染後３６時間までにほとんどの細胞を溶解し、感染後７２時間までに全ての細胞を腫瘍分解することができた。 動物構成成分を含まない条件下のＶｅｒｏ細胞の成長を伴ったＳＡＶＥ脱最適化生弱毒化ジカウイルスワクチン候補６種類の１ヵ月未満での迅速な構築を説明している。図８Ａは、ジカｐｒＭ／Ｅ遺伝子及びＮＳ３遺伝子のコドン対バイアスと、ヒトＯＲＦｅｏｍｅとの関連におけるこれらのＳＡＶＥ脱最適化対応物とを示している。コドン対バイアス（ＣＰＢ）は、所与の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の平均コドン対スコアとして表現される。正及び負のＣＰＢ値は、ＯＲＦにおける統計的にそれぞれ過剰提示または過少提示されたコドン対の優位性を示している。赤色の丸は、１４，７９５種類のヒトＯＲＦにおける各々のＣＰＢを示し、本発明者らの解析時における既知の注釈付きヒト遺伝子の大部分に相当する（ＯＲＦｅｏｍｅ）。野生型ｐｒＭ／Ｅ遺伝子及びＮＳ３遺伝子のＣＰＢは、ヒト宿主細胞の遺伝子の正常範囲内に収まっている。ＳＡＶＥを介したコドン対「脱最適化」の後、得られた脱最適化ｐｒＭ／Ｅ遺伝子セグメント及びＮＳ３遺伝子セグメントは、これらの極端な負のＣＰＢによって明らかなように、過少提示されたヒトコドン対によって優勢にコードされ、いかなるヒト遺伝子とも大幅に異なる。 動物構成成分を含まない条件下のＶｅｒｏ細胞の成長を伴ったＳＡＶＥ脱最適化ジカウイルスワクチン候補６種類の１ヵ月未満の迅速な構築を説明している。図８Ｂは、野生型及び合成的に「脱最適化された」キメラジカジカワクチンバリアントのｃＤＮＡゲノムを示している。図８ＡからのＳＡＶＥ脱最適化ｐｒＭ／Ｅ及びＮＳ３を新規に合成し、重複ＰＣＲを用いて個別にＷＴ ＰＲＶＡＢＣ５９（ＰＲ１５）ゲノムまたはＭＲ７６６ゲノムにサブクローンして、各々が合成的に「脱最適化された」断片を含む、６種類の独立したｃＤＮＡゲノムを得た。７日間でｗｔ ＰＲ１５及びＭＲ７６６のための感染性ｃＤＮＡゲノムを構築し、次いで、ＲＮＡをＢＨＫ細胞にトランスフェクションすることにより、２７日間で６種類の脱最適化ＺＩＫＶワクチン候補のための完全に感染性の複製ウイルスを回収した。 ｐｒＭ＋Ｅコード領域内の脱最適化配列の長さを低減することによる、弱毒化減少または免疫原性増加のためのサブクローン戦略の図表を記載している。第２世代のジカ熱ワクチン候補は、ＳＡＶＥプラットフォームの柔軟性を利用して、アミノ酸配列を１００％同一に保ちながら、２０１４ｂｐ（Ｅ−ｍｉｎ）から９９７ｂｐ（Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎ）またはさらに６６４ｂｐ（Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ）まで脱最適化領域を低減する。 ＺＩＫＶ感染細胞におけるタンパク質及びＲＮＡ発現の低減を説明している。ウェスタンブロットを使用して、Ｅ−Ｍｉｎ（ｍｉｎ）ならびにＺＩＫＶ株の野生型（ＷＴ）バリアントＰＲＶＡＢＣ５９（ＰＲ１５）及びＭＲ７６６に感染したＶｅｒｏ細胞におけるエンベロープ糖タンパク質発現を、３３℃で２４時間インキュベートした後に測定した。ＺＩＫＶの両株において、エンベロープ糖タンパク質の発現はＥ−Ｍｉｎバリアントに対し大きく低減した。 感染したマウスにおけるウイルス表現型を説明している。ＡＧ１２９マウスにおけるＳＡＶＥ ＺＩＫＶワクチン候補の弱毒化。ＡＧ１２９マウスに以下のいずれかを注射した：ｉ）１０２の用量の合成的に得られた野生型ウイルスＭＲ７６６及びＰＲ１５ウイルス（陽性対照）；ｉｉ）１０４または１０２ ＰＦＵいずれかの用量のワクチン候補ＰＲ１５ Ｅ−ＭｉｎまたはＭＲ７６６ Ｅ−Ｍｉｎ及びＮＳ３−Ｍｉｎ；ｉｉｉ）１０４の単回用量のワクチン候補ＰＲ１５ ＮＳ３＋Ｅ−Ｍｉｎ。これらは全て１００μＬで皮下的に送達した。注射マウスの死亡率及び罹患率（体重減少）を検討した。１０２ ｗｔウイルスを接種した全てのマウス及び１０４ ＭＲ７６６ ＮＳ３−Ｍｉｎを接種したマウスの８０％が感染で死亡した。その他のマウスは全て、１０４ ＰＦＵのリード候補ＭＲ７６６ Ｅ−Ｍｉｎをワクチン接種した全てのマウスを含めて生存し、いかなる体重減少も示さなかった。 ＡＧ１２９マウスにおいて高レベルの中和抗体及び致死性攻撃からの保護を誘導するＳＡＶＥ弱毒化ＺＩＫＶワクチン候補を説明している。Ａ）単回用量後の抗ＰＲ１５ジカ抗体。ワクチン接種動物からの血清を２８日目に採取し、Ｖｅｒｏ細胞上でのＰＲＮＴ５０アッセイにより、ＺＩＫＶ株ＰＲ１５に対する抗体を定量化した。１０４の用量のＰＲ１５ Ｅ−Ｍｉｎ及びＭＲ７６６ Ｅ−Ｍｉｎ両方でワクチン接種したマウスは、高レベルの中和抗体（２．８ｌｏｇ１０ ＰＲＮＴ５０）を生じた。 マカク属カニクイザルにおけるＥ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎワクチン接種の免疫原性を説明している。ジカウイルス血清反応陰性のマカクへのワクチン接種を１０５または１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＥ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎで行い、０．５ｍＬの体積で皮下送達した。偽ワクチン接種対象の動物には、０．５ｍＬのワクチン希釈液を注射した。マカクに対し０日目に初回ワクチン接種し、次いで２８日目にブースト接種した。血清試料を０、１４、２１、２８、及び５０日目に収集し、Ｖｅｒｏ細胞における５０％フォーカス低減中和（ＦＲＮＴ５０）アッセイを用いて、野生型ＺＩＫＶ株ＭＲ７６６に対する中和活性を試験した。１０７または１０５ ＰＦＵ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎのワクチン接種は、１回目のワクチン接種後にＮＩＨ不活化ＺＩＫＶワクチン候補よりも優れていることが分かり、２つの用量が同等レベルの中和抗体を誘発した。Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎをワクチン接種した全ての動物は、ワクチン接種後１４日までに血清転換した。２８日目のブースト後、ＦＲＮＴ５０力価の増加は観察されなかった。これは、２次感染が既往応答を誘発することを防止した殺菌免疫を示すものである。これはさらに、単回の比較的低用量のＥ−Ｗ／ＷＭｉｎが高レベルの中和抗体（≧１，０２８ ＦＲＮＴ５０）を誘発するのに十分であり得ることを示すものである。 免疫コンピテントＤＢＡ／２マウスに移植したＣＣＬ５３．１マウス上皮黒色腫細胞のインビボ腫瘍モデルを用いてＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎジカウイルスの腫瘍溶解特性を試験するための実験的概要を記載している。マウスへのワクチン接種を０日目、１４日目、２６日目、７１日目、及び８５日目に５回、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎで行った。ＣＣＬ５３．１細胞を、最終ワクチン接種から１１日後の９７日目にワクチン接種マウスまたは偽ワクチン接種マウスに移植した。移植は、１×１０６ ＣＣＬ５３．１細胞を全ての動物の右下側腹部に皮下注射することにより行った。また、一部の動物には、左下側腹部に２．５×１０５ ＣＣＬ５３．１細胞も皮下注射した。移植マウスに対し、腫瘍移植から１０日後の１０３日目に右側腹部腫瘍内のみへの直接注射により、１×１０７ ＰＦＵ ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎで処置するか、またはＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭで偽処置した。処置は、注射されていない腫瘍の免疫媒介腫瘍溶解を観察するため、右側腹部腫瘍のみに対し実施した。同じ処置をさらに２回、１０５日目（腫瘍移植から１２日後）及び１０７日目（腫瘍移植から１４日後）に繰り返した。マウスにおいて体重及び腫瘍サイズの測定を、処置後１０日間は毎日（１０７〜１１７日目）、処置後２０日目までは２日毎（１１８〜１２７日目）にモニターした。 ＣＣＬ５３．１マウス上皮黒色腫細胞を移植したＤＢＡ／２マウスにおいて、腫瘍内経路により注射したＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎで３回処置したマウスの腫瘍サイズ低減を説明している。処置動物では、５日目までに腫瘍が有意に縮小したのに対し、偽処置ＤＢＡ／２マウスでは、改善はなく腫瘍サイズ増大が認められた。 ジカウイルスＭＲ７６６ Ｗ−Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎによる前免疫処置がＣＣＬ５３．１マウス上皮黒色腫細胞移植ＤＢＡ／２マウスの腫瘍サイズに及ぼす効果を説明している。マウスへのワクチン接種を０日目、１４日目、２６日目、７１日目、及び８５日目に５回、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎで行い、またはＯｐｔｉＰｒｏ培地で偽ワクチン接種した。ＣＣＬ５３．１細胞のワクチン接種マウスまたは偽ワクチン接種マウスへの移植を、１×１０６ ＣＣＬ５３．１細胞を全ての動物の右下側腹部に皮下注射することにより行った。移植マウスに対し、右側腹部腫瘍内への直接注射により、１×１０７ ＰＦＵ ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ、１×１０７ ＰＦＵ ＭＲ７６６ ＷＴで処置するか、または偽処置した。処置は２日毎に３回実施し、処置後１０日目まで毎日腫瘍サイズを測定した。偽免疫処置：偽処置ＤＢＡ／２マウス腫瘍は、１０日目まで着実に増大したが、ＭＲ７６６ ＷＴ及びＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置は、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎで予め免疫処置したマウスにおける平均腫瘍体積を低減するのに有効であった。 ジカウイルスＥ−Ｗ／Ｍｉｎ及びＥ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎによる前免疫処置がＣＣＬ５３．１マウス上皮黒色腫細胞を移植したＤＢＡ／２マウスの腫瘍サイズに及ぼす効果を説明している。マウスへのワクチン接種を０日目、１４日目、２６日目、７１日目、及び８５日目に５回、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ及びＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎで行い、またはＯｐｔｉＰｒｏ培地で偽ワクチン接種した。ＣＣＬ５３．１細胞のワクチン接種マウスまたは偽ワクチン接種マウスへの移植を、１×１０６ ＣＣＬ５３．１細胞を全ての動物の右下側腹部に皮下注射することにより行った。移植マウスに対し、右側腹部腫瘍内への直接注射により、１×１０７ ＰＦＵ ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ、１×１０７ ＰＦＵ ＭＲ７６６ ＷＴで処置するか、または偽処置した。処置は２日毎に３回実施し、処置後１０日目まで毎日腫瘍サイズを測定した。偽免疫処置：偽処置ＤＢＡ／２マウス腫瘍は１０日目まで着実に増大したが、ＭＲ７６６ ＷＴ及びＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置腫瘍はサイズが減少した。ワクチン接種マウスにおいて、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置はＭＲ７６６ ＷＴ処置よりも優れていた。 ＭＲ７６６ ＷＴ処置がＣＣＬ５３．１マウス上皮黒色腫細胞移植ＤＢＡ／２マウスの腫瘍サイズに及ぼす効果を説明している。マウスへのワクチン接種を０日目、１４日目、２６日目、７１日目、及び８５日目に５回、ＭＲ７６６−Ｗ−Ｗ−Ｅ−Ｍｉｎで行い、またはＯｐｔｉＰｒｏ培地で偽ワクチン接種した。ＣＣＬ５３．１細胞のワクチン接種マウスまたは偽ワクチン接種マウスへの移植を、１×１０６ ＣＣＬ５３．１細胞を全ての動物の右下側腹部に皮下注射することにより行った。移植マウスを、右側腹部腫瘍内への直接注射により、１×１０７ ＰＦＵ ＭＲ７６６ ＷＴで処置するか、または偽処置した。処置は２日毎に３回実施し、処置後１０日目まで毎日腫瘍サイズを測定した。偽免疫処置：偽処置ＤＢＡ／２マウス腫瘍は１０日まで着実に増大し、偽ワクチン接種マウスにおけるＭＲ７６６ ＷＴ処置腫瘍も同様であった。ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎワクチン接種ＤＢＡ／２マウスにおいて、ＭＲ７６６ ＷＴ処置は、１０日目まで腫瘍サイズを大幅に低減するのに有効であった。 ＣＣＬ５３．１マウス上皮黒色腫細胞移植ＤＢＡ／２マウスの腫瘍サイズに対するジカウイルスＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置の有効性に及ぼすワクチン接種の効果を説明している。マウスへのワクチン接種を０日目、１４日目、２６日目、７１日目、及び８５日目に５回、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ、及びＥ−Ｗ／Ｍｉｎで行い、またはＯｐｔｉＰｒｏ培地で偽ワクチン接種した。ＣＣＬ５３．１細胞のワクチン接種マウスまたは偽ワクチン接種マウスへの移植を、１×１０６ ＣＣＬ５３．１細胞を全ての動物の右下側腹部に皮下注射することにより行った。移植マウスに対し、右側腹部腫瘍内への直接注射により、１×１０７ ＰＦＵ ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎで処置するか、または偽処置した。処置は２日毎に３回実施し、処置後１０日目まで毎日腫瘍サイズを測定した。偽免疫処置：偽処置ＤＢＡ／２マウス腫瘍は１０日まで着実に増大し、偽ワクチン接種マウスにおけるＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置腫瘍も同様であった。ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ及びＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／ＭｉｎとＥ−Ｗ／Ｍｉｎとの組合せをワクチン接種したＤＢＡ／２マウスでは、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置後に腫瘍サイズが消失した。 ＯｐｔｉＰｒｏ培地で偽ワクチン接種またはＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎでワクチン接種しＣＣＬ５３．１マウス上皮黒色腫細胞を移植したＤＢＡ／２マウスにおいて、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置がオフサイド腫瘍サイズに及ぼす効果を説明している。この試験のマウスの右下側腹部に１×１０６ ＣＣＬ５３．１マウス上皮黒色腫細胞を皮下注射し、腫瘍内注射によりＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎで処置するか、またはＯｐｔｉＰｒｏ培地で偽処置した。これらのマウスの左下側腹部にも２．５×１０５ ＣＣＬ５３．１細胞を皮下注射し、こちらには処置をしなかった。これらの腫瘍のサイズも、ウイルス腫瘍溶解範囲外の免疫媒介クリアランスを評価するために測定した。偽ワクチン接種、偽処置左側腹部腫瘍では、治療後１０日にわたりサイズが着実に増大した。左側腹部腫瘍サイズは、偽ワクチン接種、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置マウスでは維持されたが、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎワクチン接種、Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置マウスでは、左側腹部腫瘍サイズが数倍に増大し、その後再び低減した。両方のＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置群の左側腹部腫瘍は、一元配置分散分析によれば、偽ワクチン接種、偽処置動物よりも有意に小さかった（ｐ＜０．００１）。 図２１Ａ〜２１Ｂは、ジカウイルス処置動物が腫瘍再攻撃から防御されていることを示している。ＤＢＡ／２マウスに、最初に希釈液（偽）、ＭＲ７６６ ＷＴウイルス（ＷＴ）、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎ（ＥＷ）またはＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ（ＥＷＷ）をワクチン接種した。Ａ）ＷＴまたはＥＷＷいずれかの処置によりＣＣＬ５３．１腫瘍（黒色腫）が治癒したマウスの反対側側腹部を１×１０６ ＣＣＬ５３．１細胞で再攻撃し、ナイーブ対照ＤＢＡ／２マウスと比較した（ｎ＝５；ＲＣ０１−１３−１，２，３，４，５）。側腹部の腫瘍成長を、各群に対し腫瘍細胞投与後２２日にわたって評価した。Ｙ軸はｍｍ３として測定された平均腫瘍サイズであり、Ｘ軸は攻撃後の日数（ＤＰＣ：ｄａｙ ｐｏｓｔ−ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）である。Ｂ）各マウスの腫瘍を注射後２２日目に撮影した。 図２２Ａ〜２２Ｃは、ジカウイルス処置動物が異種腫瘍再攻撃から防御されていることを示している。ＤＢＡ／２マウスを最初にＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎでワクチン接種し、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎで３回ブーストした。ＷＴまたはＥＷＷいずれかの処置によりＣＣＬ５３．１腫瘍が治癒したマウスに対し、Ａ）両側腹部における１×１０６ ＣＲＬ２９４７細胞（腎臓がん細胞）（ｎ＝４）（両側腹部から腫瘍サイズをプール）、またはＢ）ＫＬＮ−２０５細胞（肺がん細胞）（ｎ＝５）で再攻撃し、ナイーブ対照ＤＢＡ／２マウス（ｎ＝３）と比較した。側腹部の腫瘍成長を、各群に対し攻撃後２１日にわたって評価した。Ｙ軸はｍｍ３として測定された平均腫瘍サイズであり、Ｘ軸は攻撃後の日数（ＤＰＣ）である。免疫マウスは「腫瘍抵抗性」であり、有意に小さいＣＲＬ ２９４７腫瘍サイズが１１日目（ｐ＝０．００６４）及び２１日目（ｐ＝０．００１２）に認められた。ＫＬＮ−２０５腫瘍サイズも攻撃後１１日目（ｐ＝０．０１７９）及び１４日目（ｐ＝０．０４７８）で小さくなっており、他の時点でも有意性に接近していた（ｐ＝．０．０５３２）。Ｃ）注射後２１日目（ＣＲＬ ２９４７）及び１７日目（ＫＬＮ−２０５）に各マウスの腫瘍を撮影した。 代表的な処置プロトコールを示している。 ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６接種マウスでは死亡及び罹患が観察されなかったことを示している。 Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける同系４Ｔ１ ＴＮＣＢ細胞移植の処置において、移植後（ＤＰＩ：ｄａｙ ｐｏｓｔ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）８、１０、１２、１４、１６、１８、２６、及び２８日に送達された１０７ ＰＦＵの８回の処置にわたって腫瘍溶解性ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６の有効性が観察されたことを示している。図２５Ａは、４Ｔ１細胞を移植した偽処置（ｎ＝５、赤色）または１０７ ＰＦＵ ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６処置（ｎ＝８、青色）Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、移植後（ＤＰＩ）８、１０、１２、１４、１６、１８、２６、及び２８日における経時的な平均腫瘍体積（ｍｍ３）を示している。 Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける同系４Ｔ１ ＴＮＣＢ細胞移植の処置において、移植後（ＤＰＩ）８、１０、１２、１４、１６、１８、２６、及び２８日に送達された１０７ ＰＦＵの８回の処置にわたって腫瘍溶解性ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６の有効性が観察されたことを示している。図２５Ｂは生存率を示しており、腫瘍体積≧４００ｍｍ３の人道的早期エンドポイントを用いて計算した。 Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける同系４Ｔ１ ＴＮＣＢ細胞移植の処置において、移植後（ＤＰＩ）８、１０、１２、１４、１６、１８、２６、及び２８日に送達された１０７ ＰＦＵの８回の処置にわたって腫瘍溶解性ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６の有効性が観察されたことを示している。図２５Ｃは、４Ｔ１細胞を移植した偽処置（ｎ＝５、赤色）または１０７ ＰＦＵ ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６処置（ｎ＝８、青色）Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、移植後（ＤＰＩ）８、１０、１２、１４、１６、１８、２６、及び２８日における経時的な平均腫瘍体積（開始体積のパーセンテージ）を示している。 ＣＣＬ５３．１細胞を皮下移植したＤＢＡ／２マウスの処置計画を示している。マウスに対し、０日目に移植し、８、１０、１２、１４、及び１６日目にＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６で処置した。腫瘍を測定して処置の進行をモニターした。１つの偽処置マウス群及び１つのＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６処置マウス群には、０．１ｍｇの抗ＰＤ−１抗体も移植後３、７、及び１０日目に投与した。 ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１接種マウスでは死亡及び罹患が観察されなかったことを示している。 ＤＰＩ ８日における処置開始時の腫瘍サイズ（ｍｍ３）の比較を示している。３日目及び７日目に０．１ｍｇの抗ＰＤ−１抗体で処置したＣＣＬ５３．１細胞を移植したマウスは、ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６処置の開始時に腫瘍が小さくなっていた（ｐ＝０．０４６６、スチューデントのｔ検定）。 ＤＢＡ／２マウスにおける同系ＣＣＬ５３．１黒色腫細胞移植の処置において、ＤＰＩ ８、１０、１２、１４、及び１６日に送達された８×１０５ ＰＦＵの５回の処置にわたって腫瘍溶解性ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６の有効性が観察されたことを示している。Ａ）生存率は、腫瘍体積≧４００ｍｍ３の人道的早期エンドポイントを用いて計算した。腫瘍サイズを測定し、体積（ｍｍ３）として報告し、Ｂ）平均±標準偏差としてグラフ化した。 培養したヒト単球（ＴＨＰ−１）を培地への１００ｎＭ ＰＭＡの添加によってマクロファージに分化するように誘導し、示されるウイルスを感染させ、次いで３７℃、５％ ＣＯ２で１日及び３日間インキュベートし、上清中のＩＬ−１Ｂの分泌をＥＬＩＳＡにより測定したときの効果を示している。 図３１Ａ〜Ｆは、０日目、１４日目、２８日目、及び４２日目に１０７ ＦＦＵ ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎでワクチン接種またはウイルス希釈液で偽ワクチン接種したＤＢＡ／２マウスにおける免疫細胞活性化を示している。ワクチン接種マウス及び偽ワクチン接種マウスに対し、６３日目に１×１０６ ＣＣＬ５３．１黒色腫細胞を皮下経路で送達させて移植し、７３日目に処置を開始し、７３日目、７５日目、及び７７日目に１０７ ＰＦＵ ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎまたはウイルス希釈液を腫瘍内に送達させた。処置後１日目及び７日目（７４日目及び８０日目）に、免疫組織化学検査及び染色のために腫瘍を採取して４％パラホルムアルデヒドに固定して、免疫マーカーを計数しＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞浸潤を測定した。図３１Ａは、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ単独による処置後、またはＥ−Ｗ／Ｍｉｎワクチン接種してからのＥ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置後１日目における、移植したＣＣＬ５３．１腫瘍内に存在するＣＤ４５＋細胞のパーセントを示している。図３１Ｂは、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ単独による処置後、またはＥ−Ｗ／Ｍｉｎワクチン接種してからのＥ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置後１日目及び７日目における、移植したＣＣＬ５３．１腫瘍内に存在するＣＤ４＋細胞のパーセントを示している。図３１Ｃは、処置後７日目の移植したＣＣＬ５３．１腫瘍内に存在するＣＤ８＋細胞のパーセントを示している。図３１Ｄは、移植ＣＣＬ５３．１黒色腫細胞の免疫組織化学検査において、処置後１日目の移植したＣＣＬ５３．１腫瘍内に存在するＦｏｘＰ３＋細胞のパーセントを示している。図３１Ｅでは、ＤＢＡ／２マウスにおいて、事前のＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎワクチン接種によって処置後１日目の移植ＣＣＬ５３．１腫瘍内のＣＤ４５＋細胞浸潤が非常に増加したことが、免疫組織化学検査により可視化されている。図３１Ｆでは、事前のＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎワクチン接種によって処置後７日目の移植ＣＣＬ５３．１腫瘍内のＣＤ８＋細胞浸潤が増強したことが、免疫組織化学検査により可視化されている。
発明の説明
本明細書で引用されている全ての参考文献は、その全体が、完全に記載されているかのように参照により本明細書に援用される。別途定義されない限り、本明細書で使用する技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｒｅｖｉｓｅｄ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２００６）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ２０１２）は、本出願で使用されている用語の多くに対する全般的指針を当業者に提供する。
当業者であれば、本発明の実施において使用することができる、本明細書に記載されるものと同様または同等である多くの方法及び材料を認識するであろう。実際に、本発明は、記載されている方法及び材料に決して限定されるものではない。
コドン対バイアスの脱最適化によるウイルス改変
本発明の態様によれば、コドン対バイアスは、コドン使用に依存せずに変更することができる。例えば、目的のタンパク質コード配列において、コドン対バイアスは、単にそのコドンの指向的再構成によって変更することができる。詳細には、親配列中で見られる、宿主生物内に様々な頻度で存在し得る同じコドンが、変更された配列中の、ただし異なる位置で使用される。最も単純な形態では、同じコドンが親配列内のように使用されているため、検討されているタンパク質コード配列におけるコドン使用は、（コードされたアミノ酸配列と同様）不変のままである。それにもかかわらず、ある特定のコドンが、新たな文脈で、すなわち、親配列内と同じアミノ酸をコードするコドンの後及び／または前に、ただし異なるヌクレオチドトリプレットを用いて現れる。理想的には、コドンの再構成は、親配列内よりも低頻度のコドン対をもたらす。実際には、コドンの再構成は多くの場合、ある位置ではより低頻度のコドン対を、第２の位置ではより高頻度の対をもたらす。コドンを適切に再構成することにより、所与の長さのコード配列にわたるコドン対使用バイアスを、親配列に対し低減することができる。代替的に、コドンは、親配列内よりも宿主内で高頻度のコドン対を利用する配列を産生するように再構成してもよいと考えられる。
コドン対バイアスの評価は、各コドン対を順に検討し、コドン対が宿主のタンパク質コード配列内で観察される頻度に従って各対をスコア付けし、次いで、本明細書で開示されているようにその配列に対するコドン対バイアスを決定することにより行われる。同じコドン対バイアスを有する多くの異なる配列を創出できることが理解されよう。また、コドン対バイアスは、コドンが再構成される方法に応じて、より大きいまたは小さい程度に変更することもできる。コード配列のコドン対バイアスは、全体のコード配列を再コードすることにより、または１つ以上の部分配列を再コードすることにより変更することができる。本明細書で使用される場合、「コドン対バイアス」は、配列の一部のみが変異している場合であっても、コード配列の長さ全体にわたり評価される。コドン対は宿主生物のコドン使用と関連してスコア化されるため、コドン対バイアス値は、野生型ウイルス配列及び変異ウイルス配列に割り当てることができる。本発明の態様によれば、ウイルスは、ウイルスタンパク質コード配列の全てまたは一部を再コードすることにより、そのコドン対バイアスを低減するように改変することができる。
本発明の態様によれば、コドン対バイアスは、宿主のコドン対使用から決定される定量的な特性である。したがって、絶対コドン対バイアス値は、任意の所定のウイルスタンパク質コード配列に対し決定することができる。代替的に、脱最適化されたウイルスタンパク質コード配列を、それが由来する「親」配列と関連付けるコドン対バイアス値の相対的変化を決定することができる。ウイルスが多様なタイプ（すなわち、ボルチモア分類によりＩ型〜ＶＩＩ型）で生じ、異なるウイルスの天然（すなわち、病毒性）の分離株が異なる値の絶対コドン対バイアスをもたらすため、通常、弱毒化の所望レベルの決定するのにより適切であるのは、コドン対バイアスの相対的変化である。したがって、本発明は、改変されたウイルスが、１つ以上のタンパク質コードヌクレオチド配列が変異によって低減されるコドン対を有するウイルスゲノムを含む、改変されたウイルス及びそれを作製する方法、ならびに、このようなウイルス及び療法を悪性腫瘍のために使用する方法を提供する。単一のタンパク質（すなわち、ポリタンパク質）のみをコードするウイルスの場合、ポリタンパク質の全てまたは一部は、所望の程度まで変異させてコドン対バイアスを低減することができ、また、変異した配列の全てまたは一部は、組換え型のウイルスコンストラクトにおいて提供することができる。複数のタンパク質を別々にコードするウイルスについては、全てのタンパク質コード配列のコドン対バイアスを同時に減少させるか、またはタンパク質コード配列のうちの１つまたはいくつかのみを改変用に選択することができる。コドン対バイアスの低減は、タンパク質コード配列の長さにわたって決定され、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．１５、または少なくとも約０．２、または少なくとも約０．３、または少なくとも約０．４である。ウイルスに応じて、宿主のコドン対使用に基づいた絶対コドン対バイアスは、約−０．０５以下、または約−０．１以下、または約−０．１５以下、または約−０．２以下、または約−０．３以下、または約−０．４以下とすることができる。
コドン対バイアスが他の配列バリエーションにも重ねられ得ることは明らかであろう。例えば、コード配列は、１つ以上のアミノ酸変化を含むタンパク質またはポリペプチドをコードするように変更することも、変更されたコドン対バイアスを有するように変更することもできる。また、場合によっては、コドンバイアスが低減したタンパク質コード配列におけるコドン使用を親タンパク質コード配列におけるコドン使用と全く同じに維持するようにコドンをシャッフルすることもある。この手順はコドン対バイアス変化の力に光を当てているが、これに固執する必要はない。代替的に、コドン選択は、コード配列内のコドン使用に全体的な変化をもたらし得る。この点において留意されたいのは、本明細書で提供されるある特定の例（例えば、ＰＶ−Ｍｉｎの設計）において、コドン対バイアス最小化配列を生成するプロセスでコドン使用プロファイルが変化しない場合であっても、その配列の一部が非変異配列（例えば、ＰＶ−ＭｉｎＸＹまたはＰＶ−ＭｉｎＺ）にサブクローンされたときに、サブクローンされた部分及び産生されたハイブリッドにおけるコドン使用プロファイルは、元の非変異タンパク質コード配列と一致しないことである。しかし、これらのコドン使用プロファイルの変化は、コドン対バイアスの影響を最小限に抑えている。
同様に留意されたいのは、ヌクレオチド配列を、１つまたは複数のアミノ酸置換を伴うタンパク質またはポリペプチドをコードするように変化させることは、単独では、コドン対バイアスの顕著な変化を伴う配列を産生する可能性も非常に低いことである。その結果、コドン対バイアスの変更は、変異したアミノ酸配列をコードするようにさらに改変されたヌクレオチド配列中であっても認識される。また、コドンバイアスを増加させるように意図された変異は、コドン対バイアスに大きな影響を及ぼす可能性が低いことも注目すべきである。例えば、本明細書に開示されているように、非優先コドン（ＰＶ−ＡＢ）の使用を最大化するために再コードされた改変されたウイルス変異体に対するコドン対バイアスは、野生型（ＰＶ−１（Ｍ））から約０．０５減少する（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００６）。また、大きく減少した配列多様性をこのようなタンパク質コード配列が有することも注目すべきである。逆に、本発明のコドン対バイアス改変配列では、相当な配列多様性が維持される。さらに、稀少コドンの使用増加を伴わずに得られるコドン対バイアスの顕著な低減からは、非優先コドンの使用を最大化する代わりに、より有効にコドン対バイアスを低減するために非優先コドンを十分な数の優先コドンで再構成するのが有益であることが示唆される。
変異の程度及び強度は、全てが変異し得るか一部が変異し得るかにかかわらずタンパク質コード核酸の長さ、及び所望のコドン対バイアス低減に応じて変動し得る。本発明の１つの実施形態において、タンパク質コード配列は、少なくとも約１００ヌクレオチド、または少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチド、または少なくとも約５００ヌクレオチド、または少なくとも約１０００ヌクレオチドの長さにわたって改変され得る。
「親」ウイルスまたは「親」タンパク質コード配列という用語は、本明細書では、多少改変されている可能性がある新規の配列が由来するウイルスゲノム及びタンパク質コード配列を指すために使用される。したがって、親ウイルスは、実際のまたは理解された望ましい特性に基づいて具体的に創出または選択された、「野生型」または「天然存在」のプロトタイプまたは分離株またはバリアントまたは変異体であり得る。
新規のＤＮＡ合成を用いて、ＰＶ（Ｍ）のカプシドコード領域（ヌクレオチド７５５〜ヌクレオチド３３８５のＰ１領域）を再設計して、ほとんど使用されないコドン対を可能な限り多数導入した（ウイルスＰＶ−Ｍｉｎ）。ＰＶ−Ｍｉｎ変異ＲＮＡをトランスフェクションした細胞は殺滅されず、生存可能なウイルスは回収できなかった。ＰＶ−Ｍｉｎのカプシド領域の断片（ＰＶ−Ｍｉｎ７５５−２４７０、ＰＶ−Ｍｉｎ２４７０−３３８６）をｗｔバックグラウンドにサブクローンしたところ、非常に衰弱しているが死なないウイルスが産生された。この結果は、全体の配列におけるコドン対バイアス及びウイルス産物の弱毒化を変動させるために、野生型親ウイルスゲノム内で置き換えられるコドン対脱最適化配列の程度を変動させることが有効であることを実証するものである。
脱最適化コドン対バイアスを有するウイルスは弱毒化されている。Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）による参考文献により例証されるように、ＣＤ１５５ｔｇマウスは、野生型ウイルスの場合に致死性と考えられる量の１０００倍の弱毒化ウイルスの脳内注射による曝露を生き延びた。これらの知見は、コドン対バイアスの脱最適化におけるウイルスの致死性を最小化する威力を示すものである。さらに、ウイルスの生存能は、コドン対バイアス脱最適化の程度を選択することにより感染性の低減とバランスを取ることができる。さらに、所望の弱毒化特性をもたらすコドン対バイアス脱最適化の程度または程度の範囲が決定されると、そのコドン対バイアスの程度を達成するように追加配列を設計することができる。例えば、配列番号１は、コドン対バイアスが約−０．２の改変されたウイルス配列と、ＰＶ−ＭｉｎＹの変異部分を包含する領域にわたり分布する変異とを提供する。
配列設計のためのアルゴリズム
本発明者らは、特定の望ましい性質に対しＤＮＡ配列を最適化し、それと同時に所与のアミノ酸配列をコーディングする、遺伝子設計のためのいくつかのアルゴリズムを開発した。詳細には、配列内の所望のＲＮＡ２次構造を最大化または最小化し（Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｓｋｉｅｎａ，２００３）、さらに指定のパターンセットを最大限に追加及び／または除去する（Ｓｋｉｅｎａ，２００１）ためのアルゴリズムを開発した。前者の問題は、生存可能なウイルスの設計で生じ、一方後者は、技術的な理由のために制限部位を最適に挿入するのに有用である。代替のリーディングフレーム内で２つ以上の遺伝子を同時にコードする重複遺伝子が設計され得る程度も研究されている。異なる機能的ポリペプチドが単一の核酸の異なるリーディングフレーム内でコードされるこの性質は、ウイルスに共通しており、抗生物質抵抗性遺伝子におけるウィービング（ｗｅａｖｉｎｇ）のような技術的目的に活用することができる。
合成生物学向けの第１世代の設計ツールが、Ｊａｙａｒａｊ ｅｔ ａｌ．（２００５）及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）に記載されているように構築された。これらは主に、生物学的活性のために配列を最適化するのではなく、生産性（すなわち、局所的な２次構造及び末端反復を伴わないオリゴヌクレオチド）のために設計を最適化することに焦点を合わせている。これらの第１世代ツールは、より高次の設計原理をサポートするのではなく設計ルールチェックを中心に構築されている、初期のＶＬＳＩ ＣＡＤツールに類似するとみなすことができる。
本明細書で例証されるように、任意のコード領域のコドン対バイアスを操作するためにコンピューターベースのアルゴリズムを使用することができる。このアルゴリズムは、既存のコドンをシャッフルし、得られるＣＰＢを評価し、次いで配列を再シャッフルし、任意選択で特に「有益な」コドン対を固定する能力を有する。当該アルゴリズムは、極小値で行き詰らないように「シミュレーテッドアニーリング」の形態も採用している。望ましくない２次構造の創出を回避するために、その他のパラメーター、例えばＲＮＡ折畳みの自由エネルギーが、任意選択で当該アルゴリズムの制御下に置かれてもよい。当該アルゴリズムは、最小のコドン対バイアスを有する配列を見いだすのに使用することができ、このような配列が生存可能なウイルスをもたらさない場合は、低減されているが最小化されてないバイアスを有する配列を見いだすようにアルゴリズムを調整することができる。当然ながら、生存可能なウイルス配列は、コンピューターにより最小化された配列の部分配列のみを用いて産生することも可能と考えられる。
コンピューターの助けにより実施するか否かにかかわらず、例えば、勾配降下、またはシミュレーテッドアニーリング、または別の最小化ルーチンを用いて、出発配列中に存在するコドンを再構成する手順の１つの例は、以下のステップにより表すことができる。
１）野生型ウイルスゲノム配列を得る。
２）改変された設計の標的となるタンパク質コード配列を選択する。
３）非コード機能を有する既知のまたは推測されるＤＮＡセグメントをロックダウンする。
４）再設計されたタンパク質内の残りのアミノ酸に対する所望のコドン分布を選択する。
５）ロックされていないコドン位置のランダムシャッフルを実施し、コドン対スコアを計算する。
６）任意選択でシミュレーテッドアニーリング手順を用いて、コドン対スコアをさらに低減（または増加）する。
７）得られた設計に対し、過剰な２次構造及び不要な制限部位があるかを調べる。
ａ．ある場合→ステップ（５）に進むか、または問題のある領域を野生型配列で置き換えることにより設計を修正し、ステップ（８）に進む。
８）ウイルス設計に対応するＤＮＡ配列を合成する。
９）ウイルスコンストラクトを創出し、発現を評価する。
ａ．弱毒化が過度の場合は、サブクローンコンストラクトを調製し、９に進み、
ｂ．弱毒化が不十分の場合は、２に進む。
代替的に、コドンをタンパク質コード配列内の他の場所から交換する必要を伴わずにコドン対を選択することによってアミノ酸の各対を脱最適化できるようにする手順を考案してもよい。
ウイルス及び改変されたウイルス
多くのウイルスは、本明細書で開示されている方法により、がんを処置するための使用向けに改変することができる。ウイルスは、ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、１本鎖「プラス」センスＤＮＡウイルス（例えば、パルボウイルス）、２本鎖ＲＮＡウイルス（例えば、レオウイルス）、または１本鎖「マイナス」センスＲＮＡウイルス（例えば、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス）であり得る。本発明のある特定の非限定的な実施形態において、ウイルスは、ポリオウイルス（ＰＶ）、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス、ウェストナイル病ウイルス、水痘（水痘帯状疱疹ウイルス）、麻疹（パラミクソウイルス）、流行性耳下腺炎（パラミクソウイルス）、狂犬病（リッサウイルス）、ヒトパピローマウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ １型）、性器ヘルペス（ＨＳＶ ２型）である。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。
灰白髄炎は、ポリオウイルスの感染によって引き起こされる中枢神経系の疾患である。ポリオウイルスは、ピコルナウイルスファミリーに属するヒトエンテロウイルスであり、安定した３つの血清型に分類される。ポリオウイルスは球状でサイズが２０ｎｍであり、タンパク質からなるカプセルで覆われたＲＮＡのコアを含む。ポリオウイルスは、口腔、咽頭、または消化管の粘膜を介して伝播する。３つの改変ウイルス血清型は全て、異なる頻度（１型＞２型＞３型）ではあるが、麻痺性灰白髄炎の原因病原体として報告されている。
しかし、改変されたウイルスによる感染は、必ずしも灰白髄炎の発症につながるものではない。逆に、感染の大多数（９８〜９９％）は局所的な胃腸管でのウイルス複製につながり、これは軽度の症状のみを引き起こすか、または全く症状を引き起こさない。改変されたウイルスは、脊髄前角及び髄質運動ニューロンを選択的に破壊の標的とする中枢神経系にほとんど侵入しない。Ｂｏｄｉａｎ，Ｄ．（Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｃｋｌｅｒ，Ｊ．ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２３２３−２３３９ （１９７２））。
改変されたウイルスの異常に限定された細胞指向性は、独特の疾病特徴的な特色をもたらす。これらは、灰白髄炎の著明な臨床徴候である弛緩性麻痺を生じさせる、脊髄及び髄質における運動ニューロン喪失によって特徴付けられる。中枢神経系の他のニューロン構成成分及びグリア細胞は、典型的には感染を免れる。電子顕微鏡下での感染脳組織において、運動ニューロンには重篤な変化が観察されるが、グリア神経膠構成成分には顕著な変更が観察されない。正常な星状膠細胞及び乏突起膠細胞が、感染または反応のエビデンスを伴わずに変性ニューロンまたは軸索に隣接して見られることがある。Ｂｏｄｉａｎ，Ｄ．（前掲）。改変されたウイルスの限定的指向性については分かっていない。限定的な細胞及び組織の指向性に加えて、改変されたウイルスは、霊長類及び霊長類細胞培養物のみに感染する。他の哺乳類種は無影響のままである。
１９０８年に改変されたウイルスが単離されたことにより、感染機構を理解するための集中的な研究努力につながった。初期の研究は、動物モデルとしてのサル及びチンパンジーの使用を必要とした。このような長いライフサイクルを有する動物は非常にコストがかかり、研究で使用するのが困難である。ポリオウイルスに対する細胞ドッキング分子のＣＤ１５５としても知られている、ヒトポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）の発見は、灰白髄炎向けの新たな動物モデルとしての、ヒトの改変されたウイルスの受容体を発現するトランスジェニックマウスの開発につながった。改変されたウイルスの病原性は、トランスジェニックマウスを用いて研究することができる。
初期の研究努力は、神経病原可能性が欠如した弱毒化ＰＶ株の開発にもつながり、この弱毒化株は、速やかに灰白髄炎予防のための潜在的ワクチン候補として試験された。これらのうち最も有効なのは、Ａ．Ｓａｂｉｎが開発した改変されたウイルスのサビン株１型、２型、及び３型である。改変されたウイルスの生弱毒化株（サビン株）の経口投与後、ワクチンに関連する麻痺性灰白髄炎は、極めて稀にしか観察されていない。ワクチン関連の麻痺性ポリオの発生は、免疫処置後の弱毒化サビン株の神経毒性変異体の出現と相関している。
本発明を理解するためには、ポリオウイルスの構造を理解することも重要である。エンテロウイルス、カルジオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、ヘパトウイルス、及びパレコウイルスを含めた全てのピコルナウイルスは、４つのポリペプチド鎖：ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及びＶＰ４の各々６０個のコピーを含む。これらの鎖は、成熟した「プロトマー」と呼ばれるタンパク質サブユニットのエレメントである。プロトマーは、ウイルスの最小の同一サブユニットとして定義される。第５のタンパク質ＶＰ０の痕跡も観察され、このＶＰ０は切断されてＶＰ２及びＶＰ４になっている。これらのタンパク質は、共にポリオウイルスのシェルまたは被膜を形成する。
ピコルナウイルスゲノムは、１本鎖のメッセンジャー−活性ＲＮＡを有する。ゲノムメッセンジャー活性ＲＮＡは「＋」鎖を有し、＋鎖は３′末端でポリアデニル化され、５′末端に共有結合した小さなタンパク質Ｖｐｇを保有する。最初に完全に配列決定されＤＮＡにクローニングされたピコルナウイルスＲＮＡは、１型ポリオウイルスのＲＮＡであった。しかし、ポリオウイルスは５′ｍ７ＧｐｐｐＧキャップ構造が欠如しており、ＲＮＡを効率的に翻訳するには、５′非翻訳領域（５′ＮＴＲ）内で配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を通じて遂行されるリボソーム結合が必要となる。
改変されたウイルスの共通の組織パターンは図２に概略的に表されており、５′ＮＴＲ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及び３′ＮＴＲ、ならびにポリアデニル化テイルを含む。５′ＮＴＲは、恣意的にＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩと称される６つのドメインを含む。ＩＲＥＳはドメインＩＩ〜ＶＩを含む。Ｐ１は、カプシドタンパク質としても知られる構造タンパク質のコード領域である。Ｐ２及びＰ３は、非構造タンパク質をコードする。
自然では、３つの免疫学的に区別的なタイプの改変されたウイルス、すなわち血清型１、２、及び３が生じる。これらのタイプは、特定の中和抗体セットと相互作用するカプシドタンパク質内の特定の配列によって区別される。３つのタイプ全てが異なる株で発生し、天然に存在するタイプ及び株全てが灰白髄炎を引き起こし得る。したがって、これらは神経毒性である。これらの血清型の遺伝子的組織化及び複製機構は同一であり、これらのゲノムのヌクレオチド配列は９０％超同一である。さらに全てのポリオウイルスは、弱毒化ワクチン株であっても、宿主細胞に進入し感染するのに同じ細胞受容体（ＣＤ１５５）を使用しており、また、ヒト及び感受性を有するトランスジェニック動物の組織に対する同じ指向性を発現する。
改変されたウイルスの神経病原性は、Ｐ１及びＰ３タンパク質を指定する領域ならびに５′ＮＴＲ内の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）における変異によって弱毒化することができる。１型、２型、及び３型のサビンワクチン株は、弱毒化表現型に関与するとされているＩＲＥＳエレメントのドメインＶ内に各々単一の変異を保有する。サビン株は、ワクチンとしての有効性にもかかわらず、灰白髄炎の動物モデルにおいて神経病原可能性を保持している。非常に低い割合ではあるものの、サビン株はワクチンにおいて疾患を引き起こす可能性がある。
実際に、各サビンワクチン株のＩＲＥＳエレメントにおける単一の点突然変異は、３６時間〜数日の期間内にワクチン内で復帰し得る。全体的に見て、ワクチン関連急性灰白髄炎は、米国内でワクチン５３０，０００件中１件の割合で発生する。灰白髄炎のワクチン接種を行った患者から単離されたポリオウイルスも、ゲノムの異なる位置で変異が復帰することがある。
他の実施形態において、改変されたウイルスは、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、またはインフルエンザウイルスＣに由来する。さらなる実施形態において、インフルエンザウイルスＡは、限定されるものではないが、サブタイプＨ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ１、Ｈ１０Ｎ２、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１０Ｎ４、Ｈ１０Ｎ５、Ｈ１０Ｎ６、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１０Ｎ９、Ｈ１１Ｎ１、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ３、Ｈ１１Ｎ４、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１１Ｎ８、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ１、Ｈ１２Ｎ２、Ｈ１２Ｎ４、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１２Ｎ６、Ｈ１２Ｎ８、Ｈ１２Ｎ９、Ｈ１３Ｎ２、Ｈ１３Ｎ３、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ９、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ１４Ｎ６、Ｈ１５Ｎ２ 、Ｈ１５Ｎ８、Ｈ１５Ｎ９、Ｈ１６Ｎ３、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ８、Ｈ１Ｎ９、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ４、Ｈ２Ｎ５、Ｈ２Ｎ６、Ｈ２Ｎ７、Ｈ２Ｎ８、Ｈ２Ｎ９、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ３Ｎ４、Ｈ３Ｎ５、Ｈ３Ｎ６ 、Ｈ３Ｎ８、Ｈ３Ｎ９、Ｈ４Ｎ１、Ｈ４Ｎ２、Ｈ４Ｎ３、Ｈ４Ｎ４、Ｈ４Ｎ５、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ７、Ｈ４Ｎ８、Ｈ４Ｎ９、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ４、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ３、Ｈ６Ｎ４、Ｈ６Ｎ５、Ｈ６Ｎ６ 、Ｈ６Ｎ７、Ｈ６Ｎ８、Ｈ６Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９、Ｈ８Ｎ２、Ｈ８Ｎ４、Ｈ８Ｎ５、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ４、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ９Ｎ９、及び未確認のサブタイプに属する。様々な実施形態において、改変されたウイルスは、本明細書で開示されているＨ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６である。様々な実施形態において、インフルエンザウイルスＡの１つ以上のセグメントが再コードされる（例えば、脱最適化される）。様々な実施形態において、ＨＡセグメントが再コードされる。様々な実施形態において、ＮＡセグメントが再コードされる。様々な実施形態において、ＨＡセグメント及びＮＡセグメントの両方が再コードされる。様々な実施形態において、再コードされたインフルエンザウイルスＡは、他のウイルスについて本明細書で論じられているように、コドンバイアスまたはコドン対バイアス減少を有する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。様々な実施形態において、改変されたウイルスは、本明細書でさらに論じられているようにジカウイルス種である。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株、例えば、限定されるものではないが、ヒトアデノウイルスＡ、Ｂ、Ｃに属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株、例えば、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスに属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、ニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、カリチウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、分類、及び分離株に属する。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、配列番号１、２、３、４、５、または６のいずれか１つである。
改変されたジカウイルス
本発明の実施形態は、ウイルスタンパク質の発現が低減された弱毒化ジカウイルスを使用する。弱毒化ジカウイルスは、ワクチン産生に有用な優れた増殖特性を有し、その上異例の安全性プロファイル及び強化された保護特性も備える。この弱毒化ウイルスは、野生型ウイルスとほぼ同程度に増殖し、ＬＤ５０値によって明らかにされるように高度に弱毒化された表現型を有し、同じ株のジカウイルスによる攻撃に対する防御免疫をもたらす上で著しく有効であり、さらに他の株のジカウイルスによる攻撃に対する防御免疫ももたらす。
本発明のある特定の実施形態において、本発明の弱毒化ジカウイルスは、再コードされた前膜／エンベロープ（Ｅ）コード領域、再コードされた非構造タンパク質３（ＮＳ３）コード領域、またはＥ及びＮＳ３両方のコード領域を含む。Ｃ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ４、またはＮＳ５タンパク質コード領域が再コードされないというのは、これらの配列の変異及びその他のバリエーションを排除するものではなく、単に、これらの配列でなされる変異及びバリエーションが弱毒化にほとんどまたは全く影響しないことを意味するに過ぎない。弱毒化にほとんどまたは全く影響しないとは、以下のうちの一方または両方を含む：１）Ｃ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ４、またはＮＳ５コード領域の変異またはバリエーションは、Ｃ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ４、またはＮＳ５の変異が試験ジカウイルスにおける唯一の変異である場合に、ウイルス複製またはウイルス感染性を２０％より多く低減しない；２）Ｃ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ４、またはＮＳ５コード領域のいずれにおける変異もバリエーションも、そのコード配列中のヌクレオチドの１０％未満に相当する。
本発明で使用されるジカウイルスは、高度に弱毒化されている。本発明の実施形態において、野生型との比較で、このジカウイルスは、ＡＧ１２９マウスモデルにおいて、同じ配列を有するタンパク質だが異なるヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質を有する野生型に対し、少なくとも５，０００倍弱毒化、または少なくとも１０，０００倍弱毒化、または少なくとも２０，０００倍弱毒化、または少なくとも３３，０００倍弱毒化、または少なくとも５０，０００倍弱毒化、または少なくとも１００，０００倍弱毒化されている。
また、本発明で使用される弱毒化ジカウイルスは大きなマージンの安全性（すなわち、ＬＤ５０とＰＤ５０との差）も示し、そのため、ＬＤ５０／ＰＤ５０の比として本明細書で定義される高い安全係数を有する。本発明のある特定の実施形態において、安全係数は、少なくとも１０２、または少なくとも１０３、または少なくとも１０４、または少なくとも１０５、または少なくとも２×１０５、または少なくとも５×１０５、または少なくとも１０６、または少なくとも２×１０６、または少なくとも５×１０６である。ある特定の実施形態において、安全係数は、１０２〜１０３、または１０３〜１０４、または１０４〜１０５、または１０５〜１０６である。
本発明の弱毒化ウイルスの配列をコードするＥ及びＮＳ３タンパク質の再コード化は、当技術分野で知られているかまたは新たに考案されたタンパク質コード配列を再コードするための任意のアルゴリズムまたは手順を利用して行うことができたと考えられる。本発明によれば、ヌクレオチド置換は、Ｅ及びＮＳ３コード配列中の複数の位置で操作され、このとき、当該置換は複数の同義コドンをゲノム内に導入する。ある特定の実施形態において、同義コドン置換は、ゲノム内のコドンバイアス、コドン対バイアス、低頻用コドンもしくは低頻度で生じるコドン対の密度、ＲＮＡ２次構造、ＣＧ及び／またはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含量、Ｃ＋Ｇ含量、翻訳フレームシフト部位、翻訳休止部位、マイクロＲＮＡ認識配列の存在または不在、あるいはこれらの任意の組合せを変更する。コドン置換は、Ｅ及びＮＳ３コード配列の全体に分布する複数の場所で、またはＥ及びＮＳ３コード配列の一部に限定された複数の場所で、操作することができる。多数の欠損（すなわち、ヌクレオチド置換）が関与するため、本発明は安定的に弱毒化されたウイルス及び生ワクチンを産生する手段を提供する。
本明細書で論じられるように、いくつかの実施形態において、ウイルスコード配列は、１つ以上のコドンを、ジカ宿主（例えば、ヒト、蚊）内での使用頻度がより低い同義コドンで置換することにより、再コードされる。いくつかの実施形態において、ウイルスコード配列は、１つ以上のコドンを、ジカウイルス内での使用頻度がより低い同義コドンで置換することにより、再コードされる。ある特定の実施形態において、同義コドンで置換されたコドンの数は、少なくとも５個である。いくつかの実施形態において、少なくとも１０個、または少なくとも２０個のコドンが同義コドンで置換されている。
いくつかの実施形態において、ウイルスコドン対は、コドン対バイアスを低減する（すなわち、その値を低下させる）ように再コードされる。ある特定の実施形態において、コドン対バイアスの低減は、ＥまたはＮＳ３コード配列中の低減され得るコドン対スコアを有するコドン対を同定し、そのコドン対をより低いコドン対スコアを有するコドン対で置換することによってコドン対バイアスを低減することにより、行われる。いくつかの実施形態において、このコドン対の置換は、配列の既存コドンを再構成する形態をとる。いくつかのこのような実施形態において、コドン対のサブセットは、同義コドンのサブセットを再構成することによって置換される。他の実施形態において、コドン対は、再構成された同義コドンの数を最大化することによって置換される。留意されたいのは、コドンの再構成は、ウイルスコード配列全体に対し低減されている（よりマイナスになっている）コドン対バイアスをもたらし、この再構成は多くの位置でＣＰＳの減少をもたらすが、他の位置では付随的なＣＰＳの増加を伴う場合があり、ただし平均すると、コドン対スコアは、よって改変された配列のＣＰＢは低減されるということである。いくつかの実施形態において、コドンまたはコドン対の再コード化は、Ｅ及びＮＳ３コード配列のＧ＋Ｃ含量の変更を考慮し得る。いくつかの実施形態において、コドンまたはコドン対の再コード化は、Ｅ及びＮＳ３コード配列中のＣＧ及び／またはＴＡジヌクレオチドの頻度の変更を考慮し得る。
ある特定の実施形態において、再コードされたＥタンパク質コード配列は、−０．１より小さい、または−０．２より小さい、または−０．３より小さい、または−０．４より小さいコドン対バイアスを有する。ある特定の実施形態において、再コードされた（すなわち、発現が低減した）ＮＳ３タンパク質コード配列は、−０．１より小さい、または−０．２より小さい、または−０．３より小さい、または−０．４より小さいコドン対バイアスを有する。ある特定の実施形態において、再コードされたＨＡタンパク質コード配列のコドン対バイアスは、当該配列が由来する親Ｅタンパク質コード配列に対し、少なくとも０．１、または少なくとも０．２、または少なくとも０．３、または少なくとも０．４低減されている。ある特定の実施形態において、再コードされたＮＳ３タンパク質コード配列は、当該配列が由来する親ＮＳ３タンパク質コード配列に対し、少なくとも０．１、または少なくとも０．２、または少なくとも０．３、または少なくとも０．４低減されている。ある特定の実施形態において、Ｅタンパク質コード配列の同義コドンの再構成は、当該配列が由来する親Ｅタンパク質コード配列に対し、少なくとも０．１、または少なくとも０．２、または少なくとも０．３、または少なくとも０．４のコドン対バイアス低減をもたらす。ある特定の実施形態において、ＮＳ３タンパク質コード配列の同義コドンの再構成は、当該配列が由来する親ＮＳ３タンパク質コード配列に対し、少なくとも０．１、または少なくとも０．２、または少なくとも０．３、または少なくとも０．４のコドン対バイアス低減をもたらす。
通常、これらの置換及び変更は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変更することなく行われ、コードされたウイルスタンパク質の発現を減少させる。ある特定の実施形態において、本発明は、コードされたタンパク質内の非同義コドンの置換及びアミノ酸の置換をもたらすＥ及び／またはＮＳ３コード配列の変更も含み、この置換は、保存的である場合もそうでない場合もある。
ほとんどのアミノ酸は、２個以上のコドンによってコードされる。表６の遺伝コードを参照。例えば、アラニンはＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、及びＧＣＧによってコードされる。３個のアミノ酸（Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、及びＡｒｇ）は６個の異なるコドンによってコードされるが、Ｔｒｐ及びＭｅｔのみ唯一のコドンを有する。「同義」コドンとは、同じアミノ酸をコードするコドンである。したがって、例えば、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧ、ＵＵＡ、及びＵＵＧは、Ｌｅｕをコードする同義コドンである。同義コドンは、同じ頻度で使用されることはない。一般的に、特定の生物で最も頻繁に使用されるコドンは、同族ｔＲＮＡが豊富であるコドンであり、このようなコドンの使用は、タンパク質翻訳の速度及び／または精度を増強する。逆に、ほとんど使用されないコドンのｔＲＮＡは比較的低レベルで見いだされ、稀少コドンの使用は翻訳速度及び／または精度を低減すると考えられている。
（表６）遺伝コード
Figure 2021508696
ａ特定のアミノ酸をコードする各コドンの１番目のヌクレオチドは左端の列に示され、２番目のヌクレオチドは上の行に示され、３番目のヌクレオチドは右端の列に示されている。
本発明によれば、ウイルスの弱毒化は、Ｅ及びＮＳ３コード配列のコドン対脱最適化を通じて発現ウイルスタンパク質を低減することにより、遂行される。コード配列の発現を低減する１つの方法は、コドン対バイアスの低減によるものであるが、他の方法も、単独でまたは組み合わせて使用することができる。コドンバイアスを変化させてもよいが、コドン対バイアスの調整が特に有利である。例えば、コドンバイアスを通じてウイルスを弱毒化するには、概して共通コドンの除去が必要となるため、ヌクレオチド配列の複雑さが低減される。これに対し、コドン対バイアスの低減または最小化は、はるかにより大きな配列多様性、及びその結果としての核酸２次構造、アニーリング温度、ならびにその他の物理的及び生化学的性質に対するより大きな制御を維持しながら遂行することができる。
タンパク質コード配列（すなわち、オープンリーディングフレーム）のコドン対バイアスは、上記のように計算され、Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８に記載されている。
ウイルス弱毒化及び誘導または防御免疫応答は、限定されるものではないが、本明細書で開示されている方法及びアッセイを含めた、当業者に周知されている方法で確認することができる。非限定的な例としては、プラークアッセイ、成長測定、試験動物における致死率低減、及び野生型ウイルスによる後続感染に対する保護が挙げられる。
様々な実施形態において、本発明は、高度に弱毒化されたウイルスを使用する。このようなジカウイルスの変種には、いわゆるアフリカ系列及びアジア系列のウイルスが含まれる。弱毒化ジカタンパク質コード配列の例としては、配列番号２、３、及び４が挙げられる。
コドン置換
ある特定の実施形態において、改変されたウイルスのための同義コドン置換は、ゲノム内のコドンバイアス、コドン対バイアス、脱最適化コドンもしくは脱最適化コドン対の密度、ＲＮＡ２次構造、ＣｐＧジヌクレオチド含量、Ｃ＋Ｇ含量、翻訳フレームシフト部位、翻訳休止部位、マイクロＲＮＡ認識配列の存在または不在、あるいはこれらの任意の組合せを変更する。コドン置換は、ゲノム全体に分布する複数の位置で、またはゲノムの一部に限定された複数の位置で操作することができる。
さらなる実施形態において、ゲノムの一部はカプシドコード領域である。
さらなる実施形態において、ゲノムの一部はゲノムの構造タンパク質コード領域である。
さらなる実施形態において、ゲノムの一部はゲノムの非構造タンパク質コード領域である。
改変された腫瘍溶解性ウイルスの組成物
本明細書はさらに、本明細書に記載の改変されたウイルスのいずれかを合成する方法であって、（ａ）ウイルスゲノムの少なくとも１つの非制御部分内の複数の位置で、同義コドンにより置き換えることができるコドンを同定することと、（ｂ）同定されたコドンの各々に対し置換すべき同義コドンを選択することと、（ｃ）同定されたコドンの各々に対し同義コドンを置換することとを含む、方法を提供する。
本方法のある特定の実施形態において、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、好ましい限度内で脱最適化コドン分布及び／または脱最適化コドン対分布の指定されたパターンセットを変動させることによりウイルスゲノムの設計を可能にするＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＳＡＶＥ）用のコンピューターベースのアルゴリズムによってガイドされる。また、本発明は、パターンセットが、代替的または追加的に、最適化コドン及び脱最適化コドン対の密度、ＲＮＡ２次構造、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、ＵｐＡジヌクレオチド含有量、Ｃ＋Ｇ含量、重複コードフレーム、制限部位分布、フレームシフト部位、またはこれらの任意の組合せを含む、方法を提供する。
他の実施形態において、ステップ（ｃ）は、同義コドン及び／または同義コドン対を含むＤＮＡの新規合成と、ゲノムの対応領域を合成ＤＮＡで置換することとによって達成される。さらなる実施形態において、全ゲノムが合成ＤＮＡで置換される。またさらなる実施形態において、ゲノムの一部が合成ＤＮＡで置換される。なお他の実施形態において、当該ゲノムの一部はカプシドコード領域である。
「対象」とは、動物または人為的に改変された動物を意味する。動物としては、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、マウス、ラット、及びモルモットのようなげっ歯類、ならびに鳥類が含まれる。人為的に改変された動物としては、限定されるものではないが、ヒト免疫システムを有するＳＣＩＤマウス、及びヒトポリオウイルス受容体ＣＤ１５５を発現するＣＤ１５５ｔｇトランスジェニックマウスが挙げられる。好ましい実施形態において、対象はヒトである。鳥類の好ましい実施形態は家禽種であり、これには、限定されるものではないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、及びガチョウが含まれる。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を、同様のタンパク質配列をコードするコドン対脱最適化領域で置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られ、改変された配列のコドン対バイアスは、親ウイルスのコドン対バイアスより小さく、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．２低減されている。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、類似のタンパク質配列をコードする、ＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られ、ＣｐＧジヌクレオチドの増加では、少なくとも４１インスタンスが親を上回るか、または少なくとも２１インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、類似のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られ、ＵｐＡジヌクレオチドの増加では、少なくとも２６インスタンスが親を上回るか、または少なくとも１３インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る。
様々な実施形態において、改変されたウイルスは、同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られ、このとき、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドの増加では、合わせて少なくとも４２インスタンスが親を上回っていた。
組換え型ポリオウイルスの合成
組換え型の改変されたウイルスキメラは、周知の組換えＤＮＡ技法によって合成することができる。ＤＮＡ技術の標準的マニュアルは、本発明の改変されたウイルスキメラを産生するための詳細なプロトコールを提供する。
改変されたウイルスの病原性低減の判定
ＰＶ−ＭｉｎキメラＸＹ及びＺならびにＰＶ−Ｍａｘの神経毒性を、ＣＤ１５５ｔｇマウスにおいて、ウイルスの漸増用量の脳内注射を介して試験した。具体的には、６〜８週齢のＣＤ１５５ｔｇマウス４〜６頭の群に種々の用量を接種し、次いで灰白髄炎の発症を観察した。マウスの対照群に、並行実験において、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔで注射を行った。注射用量は、ＰＦＵではなく粒子に基づいて、脳内に挿入されるビリオンの量を正規化するようにした。マウスに対し、灰白髄炎の特徴的症状である弛緩性麻痺が発症するかを毎日モニターした。ウイルスの病毒性を定量化するために使用される基準値は、５０％致死量（ＬＤ５０）である。この値は、動物の５０パーセントが生存し５０％が死亡する接種ウイルスの用量を示す。合成ウイルスＰＶ−ＭｉｎＸＹ及びＰＶ−ＭｉｎＺはＰＶ（Ｍ）−ｗｔより高いＬＤ５０を有し、その結果、病原性は粒子ベースで１，５００倍、ＰＦＵベースで２０倍低かった（表４）。
ポリオウイルスの腫瘍溶解特性の評価
本発明の改変されたウイルスキメラの腫瘍溶解特性は、以下のようにインビボで評価することもできる。実験的腫瘍は、無胸腺マウス内で悪性細胞の皮下または定位的脳内移植により産生される。様々な処置レジメンに従った未処置の無胸腺マウス及び腫瘍溶解性改変ウイルス組換え体を投与した無胸腺マウスにおける腫瘍進行を、臨床的観察及び病理学的検査により追跡する。無胸腺マウスへの腫瘍移植の技法は、Ｆｏｇｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．で詳述されている標準的な手順である。
医薬組成物
本発明の改変されたウイルスキメラは、様々な臓器、例えば、乳房、結腸、気管支、胃腸の上皮内層、上気道及び尿生殖器管、肝臓、前立線、脳、または他の任意のヒト組織における悪性腫瘍を処置するための予防用組成物及び治療用組成物に有用である。様々な実施形態において、本発明の改変されたウイルスキメラは、固形腫瘍の処置に有用である。特定の実施形態において、処置対象となる腫瘍は、神経膠芽腫、腺がん、黒色腫、または神経芽腫である。様々な実施形態において、処置対象の腫瘍はトリプルネガティブ乳がんである。
本発明の医薬組成物はさらに、悪性腫瘍の予防向けの他の治療薬を含んでもよい。例えば、本発明の改変されたウイルスキメラは、手術、放射線療法、及び／または化学療法と組み合わせて使用することができる。さらに、１つ以上の改変されたウイルスキメラは、上記の治療手順の２つ以上と組み合わせて使用することができる。このような併用療法は、より低い投薬量の投与治療剤を有利に利用することで、様々な単剤療法に関連するあり得る毒性または有害作用を回避することができる。
本発明の医薬組成物は、治療有効量の本発明に従う１つ以上の改変されたウイルスキメラと、医薬的に許容される担体とを含む。「治療有効量」とは、がん細胞の溶解を引き起こして腫瘍壊死を引き起こすことができる量を意味する。「医薬的に許容される担体」とは、投与される患者においてアレルギー反応またはその他の不利な効果を引き起こさない担体を意味する。
医薬的に許容される適切な担体としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つ以上、さらにこれらの組合せが挙げられる。医薬的に許容される担体はさらに、少量の補助物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、保存料、または緩衝液を含んでもよく、これらは改変されたウイルスキメラの貯蔵寿命または有効性を増強する。
本発明の組成物は、様々な形態をとることができる。このような形態としては、例えば、液体剤形、例えば、液体の溶液、分散液、または懸濁液、注射及び点滴溶液が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与様式及び予防用途または治療用途に依存する。好ましい組成物は、注射または点滴溶液の形態をとる。
予防的及び治療的がん処置
本発明は、異なる腫瘍タイプを処置するための腫瘍溶解療法として使用することができる改変されたウイルスの産生と、本明細書に記載の改変されたウイルスを投与することにより腫瘍及びがんを処置する方法とに関する。
したがって、本発明の様々な実施形態は、ゲノム内の１つまたは複数の位置で操作されたヌクレオチド置換を含む改変されたウイルスゲノムを含み、当該置換が、複数の同義コドンをゲノム内に導入する、及び／または同じアミノ酸における既存コドンの順序の変化（コドン対利用の変化）を導入する、改変されたウイルスを提供する。いずれの場合においても、ウイルス遺伝子産物の元の野生型アミノ酸配列は９８％以内で保持される。
ほとんどのアミノ酸は、２個以上のコドンによってコードされる。表１の遺伝コードを参照。例えば、アラニンはＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、及びＧＣＧによってコードされる。３個のアミノ酸（Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、及びＡｒｇ）は６個の異なるコドンによってコードされるが、Ｔｒｐ及びＭｅｔのみ唯一のコドンを有する。「同義」コドンとは、同じアミノ酸をコードするコドンである。したがって、例えば、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧ、ＵＵＡ、及びＵＵＧは、Ｌｅｕをコードする同義コドンである。同義コドンは、同じ頻度で使用されることはない。一般的に、特定の生物で最も頻繁に使用されるコドンは、同族ｔＲＮＡが豊富であるコドンであり、このようなコドンの使用は、タンパク質翻訳の速度及び／または精度を増強する。逆に、ほとんど使用されないコドンのｔＲＮＡは比較的低レベルで見いだされ、稀少コドンの使用は翻訳速度及び／または精度を低減すると考えられている。したがって、核酸内の所与のコドンを、同義だが使用頻度がより低いコドンにより置き換えることは、核酸内で「脱最適化」コドンを置換することである。
既存のがんの処置
本発明の様々な実施形態は、腫瘍またはがん細胞に対する腫瘍溶解効果を誘導する方法を提供する。様々な実施形態において、このタイプの処置は、対象ががんと診断された場合に行われ得る。当該方法は、それを必要とする対象に、改変されたウイルスを投与することを含み、改変されたウイルスは、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を、同様のタンパク質配列をコードするコドン対脱最適化領域で置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られ、改変された配列のコドン対バイアスは、親ウイルスのコドン対バイアスより小さく、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．２低減されている。
本発明の様々な実施形態は、悪性腫瘍に対する腫瘍溶解効果を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、改変されたウイルスを投与することを含み、同様のタンパク質配列をコードする、ＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、改変されたウイルスが、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られ、ＣｐＧジヌクレオチドの増加では、少なくとも４１インスタンスが親を上回るか、または少なくとも２１インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、方法を提供する。
本発明の様々な実施形態は、悪性腫瘍に対する腫瘍溶解効果を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、改変されたウイルスを投与することを含み、同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、改変されたウイルスが、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られ、ＵｐＡジヌクレオチドの増加では、少なくとも２６インスタンスが親を上回るか、または少なくとも１３インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、方法を提供する。
本発明の様々な実施形態は、悪性腫瘍に対する腫瘍溶解効果を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、改変されたウイルスを投与することを含み、同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、改変されたウイルスが、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られ、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドの増加では、合わせて少なくとも４２インスタンスが親を上回っていた、方法を提供する。
プライム及び／またはブースト投薬量として利用することもできる他の弱毒化ウイルスの例としては、本明細書内（例えば、上記の「ウイルス及び改変されたウイルス」セクション内）に記載のウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に加えて、ピコルナウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；ヘルペスウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；ラブドウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；レオウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；ポックスウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；トガウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルスが挙げられる。
様々な実施形態において、悪性腫瘍に腫瘍溶解効果を誘導することは、悪性腫瘍を処置するという結果をもたらす。
様々な実施形態において、処置はさらに、ＰＤ−１阻害物質を投与することを含む。他の実施形態において、処置はさらに、ＰＤ−Ｌ１阻害物質を投与することを含む。また他の実施形態において、処置はさらに、ＰＤ−１阻害物質及びＰＤ−Ｌ１阻害物質の両方を投与することを含む。
様々な実施形態において、ＰＤ−１阻害物質は抗ＰＤ１抗体である。様々な実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害物質は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ＰＤ−１阻害物質及びＰＤ−Ｌ１阻害物質の例は、本明細書に示されている。
様々な実施形態において、悪性腫瘍の処置によって、当該悪性腫瘍の再発の可能性が減少する。悪性腫瘍の治療は、当該悪性腫瘍と異なる第２のがんを有する可能性も減少させ得る。対象が、悪性腫瘍と異なる第２のがんを発症した場合に、当該悪性腫瘍の処置は、第２のがんの成長を遅くするという結果をもたらす。いくつかの実施形態において、悪性腫瘍の寛解後、対象は当該悪性腫瘍と異なる第２のがんを発症し、当該悪性腫瘍の処置は第２のがんの成長を遅くするという結果をもたらす。
プライム−ブースト処置
本発明の様々な実施形態は、プライム−ブーストタイプ処置レジメンを用いて、免疫応答を誘発し、腫瘍またはがん細胞に対する腫瘍溶解効果を誘導する方法を提供する。様々な実施形態において、免疫応答を誘発し、腫瘍またはがん細胞に対する腫瘍溶解効果を誘導することは、悪性腫瘍を処置するという結果をもたらす。
本発明の弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスのプライム用量は、初期免疫応答を誘発するように投与される。その後、本発明の弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスのブースト用量は、腫瘍に対する腫瘍溶解効果を誘導するように、及び／または腫瘍に対する腫瘍溶解効果を含む免疫応答を誘発するように投与される。
様々な実施形態において、プライム用量及びブースト用量は、本発明の同じ弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスを含む。他の実施形態において、プライム用量及びブースト用量は、本発明の異なる弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスである。
様々な実施形態において、当該方法は、それを必要とする対象に、改変されたウイルスのプライム用量を投与することと、それを必要とする対象に、改変されたウイルスの１回以上のブースト用量を投与することとを含み、プライム用量及びブースト用量の改変されたウイルスは各々独立に、（１）コドン対脱最適化以外の方法によって産生される弱毒化ウイルス；（２）野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を、同様のタンパク質配列をコードするコドン対脱最適化領域で置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、改変された配列のコドン対バイアスが、親ウイルスのコドン対バイアスより小さく、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．２低減されている、改変されたウイルス；（３）同様のタンパク質配列をコードする、ＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、ＣｐＧジヌクレオチドの増加では、少なくとも４１インスタンスが親を上回るか、または少なくとも２１インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、改変されたウイルス；（４）同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスか得られる、改変されたウイルスであって、ＵｐＡジヌクレオチドの増加では、少なくとも２６インスタンスが親を上回るか、または少なくとも１３インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、改変されたウイルス；（５）同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドの増加では、合わせて少なくとも４２インスタンスが親を上回っていた、改変されたウイルス；あるいは（６）これらの組合せから選択される。
様々な実施形態において、プライム用量は、皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内、または静脈内に投与される。
様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、腫瘍内、静脈内、髄腔内、または新生物内（腫瘍内に直接）に投与される。好ましい投与様式は、腫瘍部位に直接行う様式である。
プライム及びブースト投薬量間のタイミングは、例えば、がんのタイプ、がんのステージ、及び患者の健康状態に応じて変動し得る。様々な実施形態において、１回以上のブースト用量の１回目は、プライム用量から約２週間後に投与される。すなわち、プライム用量が投与され、その約２週間後にブースト用量が投与される。
様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、プライム用量の約２週間後に投与される。様々な実施形態において、２、３、４、または５回のブースト用量が投与される。様々な実施形態において、ブースト用量間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間とすることができる。さらなる実施形態において、ブースト用量間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヵ月とすることができる。非限定な例として、プライム用量を投与し、その約２週間後に１回目のブースト用量を投与し、１回目のブースト用量の約１ヵ月後に２回目のブースト用量を投与し、２回目のブースト用量の約６ヵ月後に３回目のブースト用量を投与することができる。別の非限定的な例として、プライム用量を投与し、その約２週間後に１回目のブースト用量を投与し、１回目のブースト用量の約６ヵ月後に２回目のブースト用量を投与し、２回目のブースト用量の約１２ヵ月後に３回目のブースト用量を投与することができる。さらなる実施形態において、追加のブースト投薬量は、定期的に、例えば、１年毎、２年毎、５年毎、１０年毎などで投与することができる。
様々な実施形態において、投薬量は、プライム及びブースト投薬量間で変動し得る。非限定的な例として、プライム用量は、ブースト用量よりも少ないコピー数のウイルスを含むことができる。
他の実施形態において、本発明のコドン対脱最適化以外の方法により産生された弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスのタイプは、プライム及びブースト投薬量間で変動し得る。１つの非限定的な例において、本発明の改変されたウイルスはプライム用量で使用し、（コドン対脱最適化以外の方法により産生された）同じまたは異なる科、属、種、群、または目の弱毒化ウイルスはブースト用量で使用することができる。
他の実施形態において、本発明のコドン対脱最適化以外の方法により産生された弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスのタイプは、プライム及びブースト投薬量としても利用することができる。１つの非限定的な例において、弱毒化ウイルスはプライム用量で使用し、（コドン対脱最適化以外の方法により産生された）同じまたは異なる科、属、種、群、または目の弱毒化ウイルスはブースト用量で使用することができる。
プライム及び／またはブースト投薬量として利用することもできる他の弱毒化ウイルスの例としては、本明細書内（例えば、上記の「ウイルス及び改変されたウイルス」セクション内）に記載のウイルスの科ならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に加えて、ピコルナウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；ヘルペスウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；ラブドウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；レオウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；ポックスウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；トガウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルスが挙げられる。
他の実施形態において、投与経路は、プライム用量とブースト用量との間で変動してもよい。非限定的な例において、プライム用量は皮下に投与することができ、ブースト用量は腫瘍内への注射により投与することができ、アクセス不能またはアクセスが困難な腫瘍の場合には、ブースト用量は静脈内に投与することができる。
様々な実施形態において、処置はさらに、ＰＤ−１阻害物質を投与することを含む。他の実施形態において、処置はさらに、ＰＤ−Ｌ１阻害物質を投与することを含む。また他の実施形態において、処置はさらに、ＰＤ−１阻害物質及びＰＤ−Ｌ１阻害物質の両方を投与することを含む。特定の実施形態において、ＰＤ−１阻害物質、ＰＤ−Ｌ１阻害物質、またはこの両方は、処置（ブースト）段階の間に投与され、プライム段階の間は投与されない。
様々な実施形態において、ＰＤ−１阻害物質は抗ＰＤ１抗体である。様々な実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害物質は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ＰＤ−１阻害物質及びＰＤ−Ｌ１阻害物質の例は、本明細書に示されている。
がんを有する前のプライム−ブースト処置
本発明の様々な実施形態は、がんを有しない対象における免疫応答を誘発し、もし腫瘍またはがん細胞が対象に発生した場合に腫瘍またはがん細胞に対する腫瘍溶解効果を誘導する方法を提供する。当該方法は、プライム−ブースト型の処置レジメンを使用する。様々な実施形態において、免疫応答を誘発し、腫瘍またはがん細胞に対する腫瘍溶解効果を誘導することは、もし対象ががんを発症した場合に、悪性腫瘍を処置するという結果をもたらす。
本発明の弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスのプライム用量は、対象ががんを有しない場合または対象ががんを有しないと考えられる場合に、初期免疫応答を誘発するように投与される。後者は、検出不能または検出されないがんに起因する可能性がある。
弱毒化ウイルスのプライム用量は、本発明のコドン対脱最適化以外の方法により産生された弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスとすることができ、当該ウイルスは、対象ががんを有しない場合または対象ががんを有しないと考えられる場合に、プライム及びブースト投薬としても利用することができる。この場合も、後者は、検出不能または検出されないがんに起因する可能性がある。
その後、いくつかの実施形態において、本発明の弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスのブースト用量は、免疫応答の誘発を継続するために定期的に投与される。例えば、ブースト用量は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０年毎に投与することができる。特定の実施形態において、ブースト用量は約５年毎に投与することができる。
代替的に、他の実施形態において、本発明の弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスのブースト用量は、対象ががんと診断された後に投与される。例えば、対象ががんと診断されたら、その後すぐにブースト用量の投与を伴う処置レジメンを開始して、腫瘍に及ぼす腫瘍溶解効果を誘導する、及び／または腫瘍に対する腫瘍溶解効果を含む免疫応答を誘発することができる。さらなる実施形態において、がんの処置を継続するために追加のブースト用量を投与することができる。
いかなる特定の理論にも設定レジメンにも束縛されることは望まないが、プライム用量及びブースト用量は、対象の免疫システムにウイルス感染細胞を認識するように「教示する」と考えられている。したがって、対象ががんを発症しブースト用量が投与される場合、対象の免疫システムはウイルス感染細胞を認識する。このとき、ウイルス感染細胞はがん細胞である。ウイルス感染がん細胞に対する免疫応答中、免疫システムはがん抗原によってもプライミングされ、よって免疫システムは、がん抗原を発現する細胞も標的としながら抗がん免疫を増強する。
そのため、様々な実施形態において、悪性腫瘍の処置によって、当該悪性腫瘍の再発の可能性が減少する。悪性腫瘍の治療は、当該悪性腫瘍と異なる第２のがんを有する可能性も減少させ得る。対象が、悪性腫瘍と異なる第２のがんを発症した場合に、当該悪性腫瘍の処置は、第２のがんの成長を遅くするという結果をもたらす。いくつかの実施形態において、悪性腫瘍の寛解後、対象は当該悪性腫瘍と異なる第２のがんを発症し、当該悪性腫瘍の処置は第２のがんの成長を遅くするという結果をもたらす。
プライム及びブースト用量は、がんが発生した場合に、処置対象の腫瘍細胞を標的とするように免疫システムを準備する抗がんワクチンと考えてもよい。
様々な実施形態において、プライム用量及びブースト用量は、本発明の同じ弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスを含む。他の実施形態において、プライム用量及びブースト用量は、本発明の異なる弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスである。
様々な実施形態において、当該方法は、それを必要とする対象に、改変されたウイルスのプライム用量を投与することと、それを必要とする対象に、改変されたウイルスの１回以上のブースト用量を投与することとを含み、プライム用量及びブースト用量の改変されたウイルスは各々独立に、（１）コドン対脱最適化以外の方法によって産生される弱毒化ウイルス；（２）野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を、同様のタンパク質配列をコードするコドン対脱最適化領域で置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、改変された配列のコドン対バイアスが、親ウイルスのコドン対バイアスより小さく、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．２低減されている、改変されたウイルス；（３）同様のタンパク質配列をコードする、ＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、ＣｐＧジヌクレオチドの増加では、少なくとも４１インスタンスが親を上回るか、または少なくとも２１インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、改変されたウイルス；（４）同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、ＵｐＡジヌクレオチドの増加では、少なくとも２６インスタンスが親を上回るか、または少なくとも１３インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、改変されたウイルス；（５）同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドの増加では、合わせて少なくとも４２インスタンスが親を上回っていた、改変されたウイルス；あるいは（６）これらの組合せから選択される。
様々な実施形態において、プライム用量は、皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内、または静脈内に投与される。
様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、がんを有しない、またはがんを有する疑いがない対象に投与される場合に、皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内、または静脈内に投与される。
様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、がんと診断されていた対象に投与される場合に、腫瘍内、静脈内、髄腔内、または新生物内（腫瘍内に直接）に投与される。好ましい投与様式は、腫瘍部位に直接行う様式である。
プライム及びブースト投薬量間のタイミングは、例えば、がんのタイプ、がんのステージ、及び患者の健康状態に応じて変動し得る。様々な実施形態において、１回以上のブースト用量の１回目は、対象が、がんを有しない、またはがんを有する疑いのない場合、プライム用量後約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０年毎に投与される。特定の実施形態において、ブースト用量は約５年毎に投与される。
様々な実施形態において、例えば、対象ががんと診断された場合に、１回以上のブースト用量は、がんの診断の後に投与される。様々な実施形態において、２、３、４、または５回のブースト用量が投与される。様々な実施形態において、ブースト用量間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間とすることができる。さらなる実施形態において、ブースト用量間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヵ月とすることができる。非限定的な例として、プライム用量を投与し、その約５年後に１回目のブースト用量を投与し、１回目のブースト用量の約１年後、対象ががんと診断され、２回目のブースト用量を投与し、２回目のブースト用量の約２週間後に３回目のブースト用量を投与し、３回目のブースト用量の約２週間後に４回目のブースト用量を投与し、４回目のブースト用量の約１ヵ月後に５回目のブースト用量を投与することができる。がんが寛解期にあると判定されたら、追加の定期的なブースト用量を、例えば、６ヵ月毎、１年毎、２年毎、３年毎、４年毎、または５年毎に投与することができる。
様々な実施形態において、投薬量は、プライム及びブースト投薬量間で変動し得る。非限定的な例として、プライム用量は、ブースト用量よりも少ないコピー数のウイルスを含むことができる。
他の実施形態において、本発明のコドン対脱最適化以外の方法により産生された弱毒化ウイルスまたは改変されたウイルスのタイプは、プライム及びブースト投薬量間で変動し得る。１つの非限定的な例において、本発明の改変されたウイルスはプライム用量で使用し、（コドン対脱最適化以外の方法により産生された）同じまたは異なる科、属、種、群、または目の弱毒化ウイルスはブースト用量で使用することができる。
プライム及び／またはブースト投薬量として利用することもできる他の弱毒化ウイルスの例としては、本明細書内（例えば、上記の「ウイルス及び改変されたウイルス」セクション内）に記載のウイルスの科ならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に加えて、ピコルナウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；ヘルペスウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；ラブドウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；レオウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；ポックスウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルス；トガウイルス科ウイルスファミリーならびに全ての関連する属、系統、タイプ、及び分離株に属する弱毒化ウイルスが挙げられる。
他の実施形態において、投与経路は、プライム用量とブースト用量との間で変動してもよい。非限定的な例において、プライム用量は皮下に投与することができ、ブースト用量は腫瘍内への注射により投与することができ、アクセス不能またはアクセスが困難な腫瘍の場合には、ブースト用量は静脈内に投与することができる。
様々な実施形態において、このような処置（例えば、がんを有する前のプライム用量、またはがんを有する前のプライム及びブースト用量、ならびにその後のがんを有した後のブースト用量）を受ける対象は、がん発症のより高いリスクを有する対象であり得る。このような対象の例としては、限定されるものではないが、遺伝子的素因（例えば、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２変異、ＴＰ５３変異、ＰＴＥＮ変異、ＫＲＡＳ変異、ｃ−Ｍｙｃ変異、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによりがん素因となる変異とみなされている任意の変異など）、がんの家族歴、高齢（例えば、４０、４５、５５、６５歳、またはそれ以上）、通常よりも高い放射線曝露、長期の日光曝露、タバコ（例えば、喫煙、咀嚼）の使用歴、アルコール乱用歴、薬物乱用歴、体型指数＞２５、慢性炎症疾患（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、喘息、関節リウマチ、など）の病歴、免疫抑制歴、がんリスクの増加と相関を有することが知られている慢性感染症（例えば、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、ＭＣＰｙＶ、Ｈ．ピロリ（Ｐｙｌｏｒｉ）など）の病歴を伴う対象が挙げられる。
様々な実施形態において、このような処置（例えば、がんを有する前のプライム用量、またはがんを有する前のプライム及びブースト用量、ならびにその後のがんを有した後のブースト用量）を受ける対象は、ハイリスクカテゴリーには入らないが、臨床医により、将来のがんリスクのための予防措置としてプライム及びブースト用量を処方されている対象であり得る。
様々な実施形態において、処置はさらに、ＰＤ−１阻害物質を投与することを含む。他の実施形態において、処置はさらに、ＰＤ−Ｌ１阻害物質を投与することを含む。また他の実施形態において、処置はさらに、ＰＤ−１阻害物質及びＰＤ−Ｌ１阻害物質の両方を投与することを含む。特定の実施形態において、ＰＤ−１阻害物質、ＰＤ−Ｌ１阻害物質、またはこの両方は、処置（ブースト）段階の間に投与され、プライム段階の間は投与されない。
様々な実施形態において、ＰＤ−１阻害物質は抗ＰＤ１抗体である。様々な実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害物質は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ＰＤ−１阻害物質及びＰＤ−Ｌ１阻害物質の例は、本明細書に示されている。
炎症応答
本発明の改変されたウイルスの投与はＩＬ−１Ｂを刺激する。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、本発明の改変されたウイルスはＲＩＧ−Ｉ、ＳＴＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、及びＮＦｋＢの刺激をもたらし、これによって持続的な炎症応答が促進され、部分的には治療有効性がもたらされる。
様々な実施形態において、本発明の改変されたウイルスの投与は、対象における内因性ＩＬ−１Ｂ産生を刺激することを目的とする。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、本発明の改変されたウイルスは、自然免疫受容体ＲＩＧ−Ｉ及びＳＴＮＧの刺激をもたらし、これによって持続的な炎症応答が刺激及び促進され、部分的には治療有効性がもたらされる。
様々な実施形態において、本発明の改変されたウイルスの投与は、対象における内因性ＩＬ−１Ｂ産生を刺激することを目的とする。いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、本発明の改変されたウイルスは、自然免疫転写因子ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、及びＮＦカッパＢの刺激をもたらし、これによって持続的な炎症応答が刺激及び促進され、部分的には治療有効性がもたらされる。
様々な実施形態において、本発明の改変されたウイルスの投与は、対象におけるＩＬ−１Ｂの治療有効量の産生を維持して、持続的な炎症応答を促進し、部分的には治療有効性をもたらすことを目的とする。
様々な実施形態において、本発明の改変されたウイルスの投与は、部分的には治療有効性をもたらす、対象における内因性１型インターフェロンの産生を刺激することを目的とする。
様々な実施形態において、本発明の改変されたウイルスの投与は、部分的には治療有効性をもたらす、対象における１型インターフェロンの治療有効量の産生を維持することを目的とする。
また他の実施形態において、本発明の改変されたウイルスの投与は、対象におけるＩ型インターフェロンを活性化して、対象におけるイオン化放射線及び化学療法の感作を維持することを目的としている。
様々な実施形態において、本発明の改変されたウイルスの投与は、部分的には治療有効性をもたらす、ＣＤ４５＋白血球、好中球、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、及びＣＤ８＋免疫細胞を含めた炎症促進性免疫細胞をがんの部位に動員することを目的とする。
様々な実施形態において、本発明の改変されたウイルスの投与は、部分的には治療有効性をもたらす、がんの部位からのＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞またはＭ２マクロファージのような抗炎症性免疫細胞を減少させることを目的とする。
様々な実施形態において、悪性腫瘍の処置によって、当該悪性腫瘍の再発の可能性が減少する。悪性腫瘍の治療は、当該悪性腫瘍と異なる第２のがんを有する可能性も減少させ得る。対象が、悪性腫瘍と異なる第２のがんを発症した場合に、当該悪性腫瘍の処置は、第２のがんの成長を遅くするという結果をもたらす。いくつかの実施形態において、悪性腫瘍の寛解後、対象は当該悪性腫瘍と異なる第２のがんを発症し、当該悪性腫瘍の処置は第２のがんの成長を遅くするという結果をもたらす。
ＰＤ−１阻害物質及びＰＤ−Ｌ１阻害物質
本明細書で論じられているように使用することができる抗ＰＤ１抗体の例としては、限定されるものではないが、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、スパルタリズマブ、セミプリマブ、ＡＫ１０５、ＢＣＤ−１００、ＢＩ ７５４０９１、ＪＳ００１、ＬＺＭ００９、ＭＧＡ０１２、Ｓｙｍ０２１、ＴＳＲ−０４２、ＭＧＤ０１３、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、及びチスレリズマブが挙げられる。
ＰＤ−１阻害物質のさらなる例としては、限定されるものではないが、ＰＦ−０６８０１５９１、抗ＰＤ１抗体発現多能性キラーＴリンパ球（ＰＩＫ−ＰＤ−１）、及び自己由来抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ４ＳＣＡＲ−ＩｇＴ細胞が挙げられる。
抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例としては、限定されるものではないが、ＢＧＢ−Ａ３３３、ＣＫ−３０１、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、ＭＤＸ−１１０５、ＭＳＢ２３１１、ＳＨＲ−１３１６、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、及びＣＫ−３０１が挙げられる。抗ＰＤ−Ｌ１阻害物質のさらなる例は、Ｍ７８２４である。
投与経路
上記で論じられているものに加えて、治療用腫瘍溶解性の改変されたウイルスは、腫瘍内、静脈内、髄腔内、または新生物内に（腫瘍内に直接）送達することができる。好ましい投与様式は、腫瘍部位に直接行う様式である。治療目的のために適用されるウイルスの接種物は、１〜１０μｌの範囲の極めて小さい体積で投与することができる。
当業者には、本発明の改変されたウイルスキメラの治療有効量が、投与スケジュール、投与される改変されたウイルスキメラの単位用量、改変されたウイルスキメラが他の治療剤と組み合わせて投与されるかどうか、患者の状態及び健康状態に依存し得ることは明らかであろう。
腫瘍溶解性の組換え型ウイルスの治療有効量は、経験的に決定され得、また、安全に投与することができる組換え型ウイルスの最大量及び効率的な腫瘍溶解をもたらす組換え型ウイルスの最小量に依存し得る。
腫瘍溶解性の改変されたウイルスの治療用接種物は、初期の処置レジメンの効果に応じて繰返し付与することができる。投与された特定の腫瘍溶解性の改変されたウイルスに対する宿主の免疫応答が最初にその有効性を制限した場合、異なる改変されたウイルスの血清型を有する腫瘍溶解性の改変されたウイルスの追加注射を行うことができる。特定の改変されたウイルスに対する宿主の免疫応答は、容易に血清学的に判定することができる。ただし、投与スケジュールに従って上に示されたものよりも低いまたは高い投薬量が選択されることが認識されよう。
この目的のために、任意の所与の改変されたウイルスに対する免疫状態についての血清学的データを使用して、改変されたウイルスのどのバリアントを使用するかの、情報に基づいた決断を行うことができる。例えば、腫瘍溶解ウイルスによる処置の候補患者の血清学的解析により、改変されたウイルス血清型１に対する高力価が明らかである場合、代替の改変されたウイルスの調製物を腫瘍療法に使用するべきである。
（表７）配列
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以下の実施例は、特許請求対象の発明をより十分に例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。特定の材料が言及されている範囲内において、それは単なる例示目的のものであり、本発明を限定する意図はない。当業者は、発明の範囲から逸脱することなく、発明能力の行使を伴わずに同等の手段または反応物を開発することができる。
実施例１
ヒトコドン対バイアスに相関したコドン対スコアを変更するためのＰＶ配列の改変
本発明者らのアルゴリズムに、ポリオウイルス１型Ｍａｈｏｎｅｙ株（ＰＶ（Ｍ）−ｗｔ）のＰ１構造領域のＤＮＡコード配列を入力し、この領域のＣＰＢをカスタマイズした（図２）。シミュレートしたアニーリングを用いてカスタマイズした後、シャッフルしたコドンを有する２つの新規セグメント、よって新規コドン対を産生した。第１の設計は、＋０．２４６の正のＣＰＢを有するＰＶ−Ｍａｘであった。この正のＣＰＢは、ＰＶ−Ｍａｘが平均すると過剰提示されたコドン対を利用していることを示すものであった。第２の設計は、−０．４７４の負のＣＰＢを有するＰＶ−Ｍｉｎであった。この負のＣＰＢは、ＰＶ−Ｍｉｎが平均すると過少提示されたコドン対を利用することを示すものであった（図１）。最初の４コドン（１２ヌクレオチド）はＰＶ−Ｍｉｎ及びＰＶ−Ｍａｘで変化しておらず、野生型ポリオウイルスコドンと同じままであった。これを、翻訳が全てのコンストラクトで均等に開始するように行った。また、Ｐ１領域を、この領域が外来非ポリオ由来配列で除去または置換されても複製に影響しないことが示されているため、合成断片による置換えに適切な領域として選択した。Ｐ１領域におけるこの外来配列の耐性は、この領域内に複製制御エレメントが存在しないことを強く示唆するものである。１つの候補、ＰＶ−ＭｉｎＹの配列（配列番号１）は１つの非限定的な例である。
ポリオウイルスＰ１領域のコンピューター変更により、極端なＣＰＢを有する２つの新規配列がもたらされた。ＰＶ−ＭａｘはＰＶ（Ｍ）−ｗｔと比較して５６６個のサイレント変異を所持し、ＰＶ−Ｍｉｎは６３１個のサイレント変異を所持した（図２）。先に言及した式を用いた新規Ｐ１領域及び全ての注釈付きＯＲＦの計算済みＣＰＢスコアは、図１で観察することができる。設計されたＰＶ−Ｍａｘ及びＰＶ−Ｍｉｎは、それぞれ＋０．２４６及び−０．４７４と極端なＣＰＢを有し、これは天然存在のヒト配列の外側限界を超えるものであった（図１）。
実施例２
コドン対脱最適化ポリオウイルスの構築
上述の遺伝子型の得られた組換え型ウイルスのｃＤＮＡまたは他の任意のバリアントを含むプラスミドを増幅し、精製し、直鎖化のために制限エンドヌクレアーゼＦｓｐＩで消化させた（このエンドヌクレアーゼはベクター配列内で切断する）。得られた直鎖化ｃＤＮＡ（ウイルスｃＤＮＡの５′挿入部位に先行するＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼＴ７の認識モチーフを含む）を、Ｔ７ポリメラーゼを用いたインビトロ転写で使用して全長ウイルスＲＮＡを産生した。感染性ウイルスを産生するために、このようにして生成したウイルスＲＮＡを使用してデキストラン−硫酸法によりＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞に対し、生産的な改変されたウイルスの感染を示す細胞変性効果の発現を観察し、感染ウイルスをＨｅＬａ細胞内で増殖させ、精製し、不定期間保管するために凍結した。
実施例３
改変されたウイルスは野生型に比べて弱毒化されているが、増殖して腺がん子宮頸がん細胞−ＨｅＬａ Ｒ１９細胞を殺滅する
ＲＮＡトランスフェクションはそのウイルス自体による自然感染ほど効率的ではないため、５種類のＰＶ−Ｍｉｎ派生ＲＮＡをＨｅＬａ Ｒ１９細胞にトランスフェクションした後、各産物ウイルスを２回継代して確実にウイルスが適切に増幅するようにした。次に、プラークアッセイを実施して各ウイルスの見かけ上のＰＦＵ／ｍｌ力価を解明した（図３）。これらのサブクローンは、様々な程度に弱毒化したウイルスを産生した。Ｐ１断片Ｘ及びＹを含むウイルスは、それぞれ０．８〜１ｌｏｇ１０で弱毒化したが、これらを一緒に加えたところ、２．５桁で大いに弱毒化したＰＶ−ＭｉｎＸＹウイルスを産生した。ウイルスＰＶ−ＭｉｎＺも、ＰＶ−ＭｉｎＸＹと同様に２．５ｌｏｇ１０台で弱毒化した。したがって、Ｙ断片をＰＶ−ＭｉｎＺに戻したところ、コンストラクトＰＶ−ＹＺは生存可能なウイルスを産生することができなかった（図３）。そのため、これらの様々な程度の弱毒化は、見かけ上の相加効果によるものであった。したがって、完全長ＰＶ−Ｍｉｎコンストラクトのヌル表現型は、様々な３つのサブ領域における欠損の和によるものと結論づけることができよう。
ＨｅＬａ Ｒ１９細胞は、ｐ５３遺伝子発現が低いまたは存在しない腺がん子宮頸がん細胞であり、免疫ペルオキシダーゼ染色でケラチン陽性である。
実施例４
改変配列におけるＣｐＧ及びＵｐＡジヌクレオチド頻度の増加
ＣＰＢのさらなる説明をもたらす別の重要な知見は、コドン対間のＮ３−Ｎ１ヌクレオチド（すなわちコドンＡの最後のヌクレオチド及びコドンＢの最初のヌクレオチド）が実際にはＣＰＢに最も大きな影響を及ぼし、よって対合に強く影響することを示唆する。具体的には、Ｎ３にＣ、Ｎ１にＧを有するコドン対（ＣｐＧまたはＣＧ３−１と称される）は回避されるか、または強力に過少提示される。実際にこのジヌクレオチドはコドン内でも抑制されており（ＣＧ１２、ＣＧ２３）、このジヌクレオチドが回避される理由は不明である。ＣｐＧジヌクレオチドは、個々のコドン内またはコドン間で翻訳に影響を及ぼし、ゲノム力によって抑制されている可能性が考えられ、またはＣｐＧの存在は真核生物内で自己との区別に使用される。注目すべき重要なことは、最も稀少な個別コドンも内部ＣＧ（すなわち、ＣＧ１−２及び２−３）も含み、このジヌクレオチドが何らかの目的で積極的に回避されていることが示唆されることである。
第１の仮定は、ＣｐＧが翻訳に影響を及ぼすということである。この第１の理由は、稀少コドンがそれ（すなわち、ＣＧ１−２及び２−３）を含むためであり、また、これはＣＧ３−１ジヌクレオチドに対応するｔＲＮＡが不適合である結果でもある。具体的には、このヌクレオチド対の高いスタッキングエネルギーが、移動するリボソームを妨害するように働くということである。別のグループは、ＣｐＧジヌクレオチドが哺乳類ゲノムにおけるＤＮＡメチル化の間接的な結果として遺伝子内で抑制されていると仮定している。しかし、ＣｐＧは依然としてｍＲＮＡに出現しており、よってメチル化の標的である可能性は低い。最後に、ＣｐＧ含有ＤＮＡ及びＣｐＧ含有１本鎖ＲＮＡが免疫刺激因子であることは知られており、したがって、真核生物自身の遺伝子内でのＣｐＧの過少提示は、細胞自身の遺伝子の自己反応性が自然応答を刺激するのを防止する手段である可能性が考えられる。自己対非自己認識の手段として使用されるＣｐＧという考え方には、いくつかの支持的知見が存在する。第１に、ＣｐＧ（すなわち、ＣＧ１−２及び２−３）を含むコドン自体は稀少コドンであり、接合点にＣｐＧ（ＣＧ３−１）を有するコドンは過少提示されている。また、ウイルス、具体的には真核生物に感染している小ＲＮＡウイルスは、自らのゲノム内でＣｐＧを抑制しているが、これはおそらくは、ＣｐＧ含量を低下させて自然免疫認識及び応答の誘発を回避するように進化したためである。最後に、ＣｐＧを含む１本鎖ＲＮＡが単球を刺激し得ることが分かっている。コドン−コドン接合点の核酸組成の効果に関するこれらの知見の全ては、専らさらなるＣＰＢの定義に役立つものであるが、これらの知見からはＣＰＢの生物学的効果を明らかにすることができない。
実施例５
コドン対バイアスの改変及びＣｐＧまたはＵｐＡの増加によるタンパク質発現の低減
図４に示されるように、タンパク質発現はコドン対バイアスの改変によって低減した。
（表３）ＰＶ−ＷＴ及びＰＶ−ＭｉｎＹにおけるＣｐＧ及びＵＰＡの増加
Figure 2021508696
実施例６
改変によるインビボ弱毒化
ＰＶ−ＭｉｎキメラＸＹ及びＺならびにＰＶ−Ｍａｘの神経毒性を、ＣＤ１５５ｔｇマウスにおいて、ウイルスの漸増用量の脳内注射を介して試験した。具体的には、６〜８週齢のＣＤ１５５ｔｇマウス４〜６頭の群に種々の用量を接種し、次いで灰白髄炎の発症を観察した。マウスの対照群に、並行実験において、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔで注射を行った。注射用量は、ＰＦＵではなく粒子に基づいて、脳内に挿入されるビリオンの量を正規化するようにした。マウスに対し、灰白髄炎の特徴的症状である弛緩性麻痺が発症するかを毎日モニターした。ウイルスの病毒性を定量化するために使用される基準値は、５０％致死量（ＬＤ５０）である。この値は、動物の５０パーセントが生存し５０％が死亡する接種ウイルスの用量を示す。合成ウイルスＰＶ−ＭｉｎＸＹ及びＰＶ−ＭｉｎＺはＰＶ（Ｍ）−ｗｔより高いＬＤ５０を有し、その結果、病原性は粒子ベースで１，５００倍、ＰＦＵベースで２０倍低かった（表３）。
（表４）野生型ポリオウイルス及び改変されたウイルスの脳内（ｉ．ｃ．）注射によるＬＤ５０計算値
Figure 2021508696
実施例７
キメラポリオウイルスによる星細胞腫のインビボ腫瘍溶解
星状細胞腫細胞株ＨＴＢ−１４（ＡＴＣＣから入手）を用いて、１０６細胞をＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ ＮＣＲヌードマウスに皮下移植することにより、悪性神経膠腫を確立させた。マウスに対し、腫瘍が０．２ｃｍ３のサイズに到達してから０、３、及び５日目に、１００μＬの体積において２×１０７ ＰＦＵのＰＶ−ＭｉｎＹ、ＷＴ ＰＶＭ、または希釈液で処置または偽処置した。ＰＶ−ＭｉｎＹ及びＰＶＭは、ヌードマウスにおける腫瘍成長を防止するのに有効であった（図５及び６）。
ＨＴＢ−１４細胞は、Ｕ−８７ ＭＧ細胞としても知られ、低２倍体ヒトがん細胞株である悪性神経膠芽腫細胞である。
実施例８
肺がん細胞の腫瘍溶解
本発明者らは、肺がん細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）を腫瘍溶解候補ＰＶ−ＭｉｎＹのモデルとして、１．０のＭＯＩでＰＶ−ＭｉｎＹをＡ５４９細胞に感染させることにより使用した。Ａ５４９細胞をＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ中で成長させた。細胞に９０％のコンフルエンスで１ｅ＋６ ＰＦＵのＰＶ−ＭｉｎＹを感染させ、室温で１時間揺動させた後、接種物を取り出し、ＤＭＥＭ＋２％ ＦＢＳで置き換えた。感染した細胞を３７Ｃ、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。図７によって明らかなように、非感染の肺がん細胞と比較して、ＰＶ−ＭｉｎＹは、感染後３６時間までにほとんどの細胞を溶解し、感染後７２時間までに全ての細胞を腫瘍分解することができた。
Ａ５４９細胞は、低３倍体（細胞の４０％で染色体数が６４、６５、または６６）のヒト肺上皮がん細胞株である（Ｇｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９７３）。染色体Ｎ２及びＮ６は細胞当たり１つのコピーを有し、Ｎ１２及びＮ１７は通常４コピーを有した。Ａ５４９細胞は、免疫ペルオキシダーゼ染色でケラチン陽性である。Ａ５４９は、酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）のアイソザイムＧ６ＰＤ−Ｂを発現する。
実施例９
組織培養物中でのＥ、ＮＳ３、及びＥ−ＮＳ３コドン対バイアスが低減したジカウイルスの構築及び特性決定
ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９及びＭＲ７６６の弱毒化を達成するため、ウイルス遺伝子の発現レベルを低減するためのコンピューターアルゴリズム及び化学合成に従ってウイルス遺伝子におけるｐｒＭ／Ｅ及びＮＳ３遺伝子のコドン対バイアスを低減させた（図８）。
実施例１０
第２世代ジカウイルスワクチン候補を創出するためのＳＡＶＥプラットフォームの柔軟性の活用
弱毒化及び免疫原性を微調整するために、ＳＡＶＥプラットフォームを用いて第２世代ジカウイルスワクチン候補を構築した（図９）。Ｅ−Ｍｉｎ設計（図８）に基づき、新規のワクチン候補は、２０１４塩基対（Ｅ−Ｍｉｎ）から９９７塩基対（Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎ）または６６４塩基対（Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ）まで低下したより低い割合の脱最適化配列を含み、残りは野生型配列に復元された。本明細書では、３つの候補配列、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｍｉｎ（配列番号２）、Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎ（配列番号３）、及びＥ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ（配列番号４）を非限定的な例として提供する。
実施例１１
ヒト神経細胞株におけるコドン対バイアス低減バリアントの神経弱毒化
ＭＲ７６６のような古いＺＩＫＶ株とは異なり、ＺＩＫＶの現在の株は、小頭症及びギラン・バレー症候群のような神経疾患を引き起こす。したがって、ＦＤＡとのプレプレＩＮＤ会議に基づけば、任意の生弱毒化ジカワクチンは、ヒトの神経細胞におけるインビトロでの神経弱毒化、及び非ヒト霊長類におけるインビボでの神経弱毒化を実証する必要があると考えられる（提案された第ＩＩ相研究）。リード候補の前臨床開発を開始するために、本発明者らは、発達中のヒト脳におけるジカウイルスの細胞指向性の特性決定、及び有望な抗ジカ阻害物質の試験のために以前使用されていた、十分に特性決定された２種類のヒト神経細胞株ＨＴＢ−１４（Ｕ−８７としても知られている）及びＨＴＢ−１５（Ｕ−１１８としても知られている）に感染させた。ヒト神経細胞株ＨＴＢ−１４及びＨＴＢ−１５を感染させ、４日後にピーク力価を定量化した。ヒトＨＴＢ−１４細胞ではＭＲ７６６ Ｅ−Ｍｉｎがほぼ４Ｌｏｇ１０弱毒化されたことが観察され、ヒトＨＴＢ−１５細胞では、成長は、２つの独立した実験において検出不能、または、１つの実験において検出限界（１００ ＰＦＵ／ｍｌ）で、これもまたインビトロで４Ｌｏｇ１０の神経弱毒化も示すもののいずれかであった（データは示されず）。
実施例１２
タンパク質レベルはＰＲＶＡＢＣ５９またはＭＲ７６６由来Ｅ−Ｍｉｎ感染細胞で低減する
ＺＩＫＶ感染細胞から採取した全細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して、異なるＰＲＶＡＢＣ５９及びＭＲ７６６バリアント間のタンパク質発現レベルを比較した。ウイルス感染のため、Ｖｅｒｏ細胞を３７℃のＯｐｔｉＰＲＯ培地中で９０％コンフルエントまで成長させた。合成野生型ならびに脱最適化（Ｅ−Ｍｉｎ）ＭＲ７６６及びＰＲＶＡＢＣ５９を含めたジカウイルスを０．５のＭＯＩに希釈し、細胞に添加した。細胞を室温で１５分間揺動し、次いで３３℃で２時間インキュベートした。次に、接種物を除去し、感染細胞は３３ＣのＯｐｔｉＰＲＯ培地中で２４時間培養を継続した。
２４時間のインキュベート後の全細胞溶解物調製物において、細胞を冷ＰＢＳで短時間すすぎ、次いで氷上でＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール、１％ ＮＰ−４０、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて溶解した。全細胞溶解物を収集し、ｂ−メルカプトエタノールと共に６×レムリー緩衝液と直接混合し、煮沸し、保管用に分取した。
ウェスタンブロットにおいて、各試料からの等体積のＷＣＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、ニトロセルロース膜に移した。膜をＰＢＳ中５％ウシ胎児血清（ＢＣＳ）により室温で１時間ブロックし、次にデング熱２型エンベロープ（Ｅ）タンパク質４Ｇ２に対するマウスモノクローナル抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、続いてＨＲＰ結合体化抗マウス２次抗体と共に５％ ＢＣＳ中室温で１時間インキュベートした。膜を３回洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ １−Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ溶液を用いてタンパク質を可視化した。
エンベロープ糖タンパク質のレベルは、ＺＩＫＶのＰＲＶＡＢＣ５９及びＭＲ７６６株のＥ−Ｍｉｎバリアントにおいて、野生型と比較して低減したことが分かった（図１０）。
実施例１３
ＡＧ１２９マウスにおける弱毒化
上述のように、ＡＧ１２９成体マウスモデルは、フラビウイルスのワクチン及び治療薬の研究で承認を得ている。ＡＧ１２９マウスを使用して以下を試験した：１）１０２の用量の各々合成的に得られた野生型ウイルスＭＲ７６６及びＰＲ１５ウイルス（陽性対照）；２）２つの用量（１０４及び１０２ ＰＦＵ）ワクチン候補ＰＲ１５ Ｅ−ＭｉｎまたはＭＲ７６６ Ｅ−Ｍｉｎ及びＮＳ３−Ｍｉｎ；ならびに３）１０４の単回用量のワクチン候補ＰＲ１５−ＮＳ３＋Ｅ−Ｍｉｎ。この試験では、弱毒化、有効性、及び免疫原性を検査した。動物を動物５頭の群にランダムに割り付けた。これらの群を様々な弱毒化ウイルス及び合成野生型ウイルスに感染させた。マウスにワクチン接種するために、０日目及び２８日目に２ラウンドのワクチン接種を実施した。弱毒化を測定するために、ワクチン接種後、生存率及び体重を測定した（図１１）。
実験の全過程にわたり、生存率、体重、及び臨床徴候のデータを毎日収集した。ＳＡＶＥ脱最適化されたＰＲ１５株及びＭＲ７６６株は、合成野生型ウイルスに比べて高度に弱毒化され、１０４の用量のＭＲ７６６ ＮＳ３−Ｍｉｎのみがマウスの４０％で死亡を誘導した。したがって、他の全ての株は少なくとも５００倍弱毒化されていた。１０２ ＰＦＵの合成野生型ＰＲ１５またはＭＲ７６６ ＺＩＫＶに感染したマウスは、「天然」野生型ＺＩＫＶで観察されたパターンと同様に、死亡直前に劇的な体重減少を経験した。１０４ ＰＦＵの候補ＭＲ７６６ Ｅ−Ｍｉｎに感染したマウスは、有意な体重減少も死亡も経験しなかった（図１２）。
ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｅ−Ｍｉｎ及びＥ−Ｍｉｎ／ＮＳ３−Ｍｉｎバリアント、ならびにＭＲ７６６ Ｅ−Ｍｉｎ及びＮＳ３−Ｍｉｎの成長表現型及び病因を動物モデルで検査した。ＡＧ１２９マウス５頭の群に１０２または１０４ ＰＦＵの用量の各ウイルスを皮下投与し、動物の体重及び生存率を感染後２８日間継続的にモニターした。罹患率及び死亡率（体重減少、活動量低減、死亡）をモニターした。野生型ウイルス及びワクチン候補の５０％致死量（ＬＤ５０）をリード・ミュンヒ法（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．；Ｍｕｅｎｃｈ，Ｈ．，１９３８，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ２７： ４９３−４９７）により計算した。注目すべきことに、ＰＲＶＡＢＣ５９及びＭＲ７６６のＥ−ＭｉｎバリアントならびにＰＲＶＡＢＣ５９ Ｅ−Ｍｉｎ／ＮＳ３−Ｍｉｎウイルスは、１０４ ＰＦＵまでの用量後に明らかな疾患を誘導せず、死亡はゼロで体重減少は最小限であった。そのため、Ｅ−Ｍｉｎバリアントの理論上のＬＤ５０は３．１６×１０４ ＰＦＵ以上と計算された。これは、ｗｔ ＰＲＶＡＢＣ５９またはＭＲ７６６の値を少なくとも１，０００倍上回る（表５）。ＭＲ７６６ ＮＳ３−ＭｉｎウイルスのＬＤ５０は４２以下と計算された。
（表５）弱毒化ウイルスのＬＤ５０及びＰＤ５０
Figure 2021508696
実施例１４
ＡＧ１２９マウスにおける免疫原性
ワクチン候補は、低用量で、動物当たり１０２．３細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０）に等しいｗｔウイルスの致死量による攻撃からの長期的防御を提供可能であるべきである。Ｅ−Ｍｉｎバリアントは、細胞培養物及びＡＧ１２９マウスにおいて高度に弱毒化されたが、わずか６８ ＰＦＵ（ＭＲ７６６ Ｅ−Ｍｉｎ）または１４７ ＰＦＵ（ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｅ−Ｍｉｎ）による攻撃後にＡＧ１２９マウスにおける死亡防止に成功した。弱毒化試験からの各マウスの生存動物において、ワクチン有効性を試験した。最初に、２８日目に生存マウスから浅側頭静脈経由で血清を採取し、２８日目に２回目の同じワクチン用量でマウスをブーストした。血清は、４９日目（ブースト後２１日目）にも収集した。ワクチン接種後１４、２８、及び４９日に採取した血清の５０％プラーク低減中和力価（ＰＲＮＴ５０）アッセイを用いて、これらの動物からの中和抗体を定量化した。試験血清の１／２系列希釈を、１／１０希釈から開始して行った。次いで、希釈液を１０２．４ ＰＦＵのＺＩＫＶ株Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ ２０１５ ＰＲＶＡＢＣ−５９（ＰＲ１５）と１：１混合した。次いで、ウイルス−血清混合液を、Ｖｅｒｏ７６細胞と共に１２ウェル組織培養プレートの個別ウェルに添加した。ウイルス対照からの平均プラークの≧５０％低減をもたらす試験血清の希釈度の逆数をＰＲＮＴ５０値として記録した。ＭＲ７６６ Ｅ−Ｍｉｎは、２８日目で１回のみのワクチン接種後に、全ての動物において現在のＰＲ１５株に対するロバストな抗体応答を生成することができた（図１２）。同様に、ＰＲ１５ Ｅ−Ｍｉｎも、１回のみのワクチン接種後にロバストな抗体応答をもたらした。
実施例１５
非ヒト霊長類における有効性
マカク属カニクイザル（ＣＭ）は、黄熱、デング熱、西ナイル熱、及びＺＩＫＶを含めたフラビウイルス感染症を評価するためのモデルとして一般的に使用されている。ＺＩＫＶの分離株も、自然感染したマカク属カニクイザルから回収された。以前の研究では、ＣＭの実験的ＺＩＫＶ感染が臨床的疾患をもたらす可能性は高くないが、ＺＩＫＶは複製し、血、尿、及びその他の組織中に見いだされ得ることが示唆されている。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈが行った非ＧＬＰ試験で、ナイーブＣＭにおけるジカウイルス（ＺＩＫＶ）ワクチン候補の有効性を検討した。合計１５頭（オス１０頭及びメス５頭）のＺＩＫＶ血清陰性ＣＭを５つの処置群にランダムに割り付けた。１〜４群のＣＭに対し、５００μＬの体積中１０７または１０５ ＰＦＵの用量の弱毒化ウイルス（ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ）を、皮下（ＳＣ）注射によりプライム−ブーストレジメン（０日目及び２８日目）を用いてワクチン接種した。偽処置対照群（５群）に割り当てたＣＭには、ＳＣ注射によりＰＢＳを投与した。ワクチン誘導抗ＺＩＫＶ中和抗体（Ｎａｂ）の存在について、１４、２１、２８、５０、及び６１日目にフォーカス低減中和試験（ＦＲＮＴ）によって評価した。ＦＲＮＴ値は、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ（図１３）ワクチン接種マカクにおいて、単回用量後のＮＩＨ不活化ワクチンと比較して２〜４倍高かった。Ｗ−Ｗ−Ｅ−Ｍｉｎワクチン接種マカクのＦＲＮＴ値は２８日目のブースト後に増加せず、これによりワクチンがブーストウイルスによるさらなる感染を防止する殺菌免疫を誘導したことが示された。Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎをワクチン接種した全ての動物は、ワクチン接種後１４日までに血清転換した。このデータは、単回の比較的低用量のＥ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎが高レベルの中和抗体（≧１，０２８ ＦＲＮＴ５０）を誘発するのに十分であり得ることを示すものである。
実施例１６
免疫コンピテントマウスにおける腫瘍溶解有効性
ＤＢＡ／２マウス（４〜６週齢）に対し、最初にＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎを（１×１０７ ＰＦＵの用量で）ワクチン接種するか、またはＯｐｔｉＰｒｏ培地を偽注射し、５０μｌの体積で頸椎の背側に皮下送達させた。マウスへのワクチン接種を０日目、１４日目、２６日目、７１日目、及び８５日目に５回行った（図１４）。これらの日に血清試料を収集して、ジカウイルスに対する中和抗体の発生を５０％プラーク低減中和試験（ＰＲＮＴ５０）によって確認した。ＣＣＬ５３．１上皮黒色腫細胞（ＤＢＡマウスバックグラウンド）を、最終ワクチン接種から１１日後の９７日目にワクチン接種マウスまたは偽ワクチン接種マウスに移植した。移植は、１×１０６ ＣＣＬ５３．１細胞を全ての動物の右下側腹部に皮下注射することにより行った。また、一部の動物には左下側腹部にも２．５×１０５ ＣＣＬ５３．１細胞を皮下注射した（図２０）。
移植マウスに対し、腫瘍移植から１０日後の１０３日目に右側腹部腫瘍内のみへの直接注射により、１×１０７ ＰＦＵのＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ、ＭＲ７６６ ＷＴで処置するか、または偽処置した（図１５）。処置は、未処置腫瘍の免疫媒介腫瘍溶解を観察するため、右側腹部腫瘍のみに対し実施した。同じ処置をさらに２回、１０５日目（腫瘍移植から１２日後）及び１０７日目（腫瘍移植から１４日後）に繰り返した。マウスにおいて体重及び腫瘍サイズの測定を、処置後１０日間は毎日（１０７〜１１７日目）、処置後２０日目までは２日毎（１１８〜１２７日目）にモニターした。腫瘍サイズの有意な低減がＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置で観察された（図１５）。偽免疫処置：偽処置したＤＢＡ／２マウス腫瘍は、１０日目まで着実に増大した（図１６〜１９）。ＭＲ７６６ ＷＴ及びＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置は、以前にＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎで免疫処置したマウスの平均腫瘍体積の低減に有効であった（図１８）。ワクチン接種マウスにおいて、ＭＲ７６６ ＷＴ処置腫瘍及びＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置腫瘍がいずれもサイズ減少したが、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置はＭＲ７６６ ＷＴ処置よりも予想外に優れていた（図１７）。偽ワクチン接種マウスにおけるＭＲ７６６ ＷＴ処置腫瘍は改善せず、着実に増大した。Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎワクチン接種ＤＢＡ／２マウスにおいて、ＭＲ７６６ ＷＴ処置は、１０日目まで腫瘍サイズを大幅に低減するのに有効であった（図１８）。偽ワクチン接種マウスにおける腫瘍のＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置は成功しなかったが、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ及びＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／ＭｉｎとＥ−Ｗ／Ｍｉｎとの組合せをワクチン接種したＤＢＡ／２マウスでは、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置後に腫瘍サイズが消失した（図１９）。これらの実験から、事前のワクチン接種がジカウイルスによる黒色腫の腫瘍分解処置の成功に本質的な役割を果たしていることと、ウイルス複製単独からの腫瘍破壊の可能性は低いこととが示される。
偽ワクチン接種、偽処置左側腹部腫瘍では、治療後１０日にわたりサイズが着実に増大した。左側腹部腫瘍サイズは、偽ワクチン接種、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置マウスでは維持されたが、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎワクチン接種、Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置マウスでは、左側腹部腫瘍サイズが数倍に増大し、その後再び低減した。両方のＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎ処置群の左側腹部腫瘍は、一元配置分散分析によれば、偽ワクチン接種、偽処置動物よりも有意に小さかった（ｐ＜０．００１；図２０）。これらの実験は、小動物モデルにおいて、ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎによる腫瘍溶解処置が、処置部位にとどまらず、全身の腫瘍成長を首尾よく制御することができるという強力なエビデンスをもたらすものである。
実施例１７
Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける移植同系４ｔ１細胞を用いたトリプルネガティブ乳がんのＣｏｄａｖａｘ−Ｈ１Ｎ１処置
ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１は、ブタにおいて、１０５の用量における顕微鏡的肺病変の不在による測定で、野生型インフルエンザＡウイルスＡ／ＣＡ／０４／２００９に比べて有意に弱毒化されており（２）、第Ｉ相臨床試験の間安全であった。本試験では、ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１を腫瘍溶解剤として使用する可能性を試験することを求めた。このパイロット実験では、ＭＤＣＫ細胞内で１０１回、Ｖｅｒｏ細胞内で６回継代させたＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１を使用することを選択した。
本試験の目的のため、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に対し、最初に１０５ ４Ｔ１乳腺腫瘍細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２５３９）を移植し、移植後（ＤＰＩ）８日の処置は、１０７ ＰＦＵのＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６を含む１００μｌの注射により開始した。ＤＰＩ １０、１２、１４、１６、２６、及び２８日に腫瘍に再び注射した。偽処置対照マウス（ｎ＝５）をワクチン希釈液（０．２％ＢＳＡ ＭＥＭ）で処置した。死亡率については、体重減少≧２０％または腫瘍成長＞４００ｍｍ３の人道的早期エンドポイントを使用した。試料サイズは、以前の実験で観察された腫瘍サイズの標準偏差に基づき、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｔａｔｍａｔｅ ２を用いて十分な統計検出力（０．８０）を達成するように選択した。
マウス移植プロトコール：動物モデル：Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、マウス系統：Ｂａｌｂ／Ｃ（Ｔａｃｏｎｉｃ）；週齢：８〜９週齢（メス）；細胞培地：ＲＰＭＩ−１６４０；細胞濃度：１×１０５／０．１ｍＬ（４Ｔ１）。
最初に、４Ｔ１細胞をＲＰＭＩ−１６４０中で１×１０５／０．１ｍＬの濃度に再懸濁した。Ｂａｌｂ／Ｃマウスの右側腹部を剃毛し、０．１ｍｌを皮下注射し、腫瘍サイズが約４０ｍｍ３になる（８日目）まで観察した。
腫瘍処置プロトコール：動物モデル：Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；マウス系統：Ｂａｌｂ／Ｃ（Ｔａｃｏｎｉｃ）；週齢：８〜９週齢（メス）；ウイルス培地：０．２％ ＢＳＡ ＭＥＭ；ウイルス濃度：１×１０７／０．１ｍＬ（ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６）。
腫瘍に対し、移植後８、１０、１２、１４、１６、２６、及び２８日目に、ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６または対照としてのウイルス培地を含む０．１ｍｌで直接注射により処置した。
偽注射またはＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６で処置したＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて、有意な体重減少は検出されず、また、いずれの接種マウスもインフルエンザ感染による安楽死の早期時点に達しなかった（図２５Ａ〜２５Ｃ）。
ＤＰＩ ２１日までに、全ての偽注射対照マウスは腫瘍体積≧４００ｍｍ３により人道的早期エンドポイントを満たした（図２５Ａ〜２５Ｃ）。これに対し、ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６処置マウスでは腫瘍成長が遅くなり、生存期間が３５日増加した。行平均の多重ｔ検定（ホルム・サイダック法）を用いて、有意な腫瘍サイズ低減が移植後１１日目（ｐ＝０．００６６）、１３日目（ｐ＝０．００９７）、１５日目（ｐ＝０．００４８）、１６日目（ｐ＝０００４）、１７日目（ｐ＝０．００１１）、１９日目（ｐ＝０．０００４）、及び２１日目（ｐ＝０．００９９）に観察された。ログランクマンテル・コックス検定（ｐ＝０．００５２）及びゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定（ｐ＝０．０１３８）を用いた生存曲線解析により、処置マウスの生存率がＤＰＩ ３５日に向かって有意に増加したことが示された。
ＴＮＢＣは、４Ｔ１細胞移植を用いてＢａｌｂ／Ｃマウスで良好にモデル化することができ、本試験においてＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６による処置に感受性であることが示された。５／８頭のマウスでは腫瘍サイズが静的または低減したものの、処置は２頭のマウスでは効果がなく、ただし１頭のマウスでは視認可能な腫瘍が完全に消失した。このデータは有望であり、投与の用量または頻度を変化させることで、より成功することが判明する可能性がある。重要なことには、前免疫処置は、インフルエンザＡウイルスによる腫瘍分解活性をプライミングするのに必要ではなかった。
実施例１８
ＤＢＡ／２マウスに移植したＣＣＬ５３．１細胞に対するＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１連続腫瘍内注射による処置
ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１は、ブタにおいて、１０５の用量における顕微鏡的肺病変の不在による測定で、野生型インフルエンザＡウイルスＡ／ＣＡ／０４／２００９に比べて有意に弱毒化されており（１）、第Ｉ相臨床試験の間安全であった。本試験では、ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１を腫瘍溶解剤として使用する可能性を試験することを求めた。このパイロット実験では、マスターシードストックから継代されたＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１、ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｍ１０１／Ｖ６を使用することを選択した。
本試験の目的のため、ＤＢＡ／２マウス（ｎ＝７、８）に対し、最初に１０５クローンＭ３、クラウドマンＳ−９１黒色腫腫瘍細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−５３．１）を移植し、移植後（ＤＰＩ）８日に、処置を、偽希釈液、または８×１０５ ＰＦＵのＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１のいずれかを含む１００μｌの注射により開始した（図２６）。また、マウスに対し、移植後３、７、及び１０日目に偽希釈液または０．１ｍｇの抗マウスＰＤ−１抗体による腹腔内処置も行った。ＤＰＩ １０、１２、１４、及び１６日に腫瘍に再び注射した。偽処置対照マウス（ｎ＝５）をワクチン希釈液（０．２％ＢＳＡ ＭＥＭ）で処置した。死亡率については、体重減少≧２０％または腫瘍成長＞４００ｍｍ３の人道的早期エンドポイントを使用した。試料サイズは、以前の実験で観察された腫瘍サイズの標準偏差に基づき、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｔａｔｍａｔｅ ２を用いて十分な統計検出力（０．８０）を達成するように選択した。
実験手順：
マウス移植プロトコール：動物モデル：Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；マウス系統：ＤＢＡ／２（Ｔａｃｏｎｉｃ）週齢：８〜９週齢（メス）；細胞培地：Ｆ−１２Ｋ培地；細胞濃度：１×１０５／０．１ｍＬ（ＣＣＬ５３．１）。
最初に、ＣＣＬ５３．１細胞をＦ１２−Ｋ培地中で１×１０５／０．１ｍＬの濃度に再懸濁した。ＤＢＡ／２マウスの右側腹部を剃毛し、０．１ｍｌを皮下注射し、腫瘍サイズが約１００ｍｍ３になる（８日目）まで観察した。
腫瘍処置プロトコール：動物モデル：Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；マウス系統：ＤＢＡ／２（Ｔａｃｏｎｉｃ）；週齢：８〜９週齢（メス）；ウイルス培地：０．２％ ＢＳＡ ＭＥＭ；ウイルス濃度：８×１０５／０．１ｍＬ（ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１ Ｐ７）。
腫瘍に対し、移植後８、１０、１２、１４、及び１６日目に、ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１または対照としてのウイルス培地を含む０．１ｍｌで直接注射により処置した。
偽注射またはＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１で処置したＤＢＡ／２マウスにおいて、有意な体重減少は検出されず、また、いずれの接種マウスもインフルエンザ感染による安楽死の早期時点に達しなかった（図２７）。興味深いことに、抗ＰＤ−１抗体単独で注射したマウスは、ＰＤ−１／ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１処置群を含めた他の群ほどは体重が増加しなかった。
抗ＰＤ‐１抗体で処置したマウス（ｎ＝１４）または抗体希釈液で偽処置したマウス（ｎ＝１５）（３日目及び７日目）に対し、ＤＰＩ ８日に腫瘍サイズデータをプールしたところ、処置群で、腫瘍サイズがわずかながらも有意に減少した（図２８；ｐ＝０．０４６６；スチューデントのｔ検定）。
ＤＰＩ １４日までに、全ての偽注射対照マウスは腫瘍体積≧４００ｍｍ３により人道的早期エンドポイントを満たした（図２９）。これに対し、ＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１処置マウス、ＰＤ−１抗体処置マウスにおいて腫瘍成長はより遅く、生存期間が３４日増加し、併用療法により生存率が有意に改善された（ｐ＝０．０００８、ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定）。行平均の多重ｔ検定（ホルム・サイダック法）を用いて、有意な腫瘍サイズ低減が移植後１１日目（ｐ＝０．００６６）、１３日目（ｐ＝０．００９７）、１５日目（ｐ＝０．００４８）、１６日目（ｐ＝０００４）、１７日目（ｐ＝０．００１１）、１９日目（ｐ＝０．０００４）、及び２１日目（ｐ＝０．００９９）に観察された。ログランクマンテル・コックス検定（ｐ＝０．１２１８）及びゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定（ｐ＝０．１１３７）を用いた生存曲線解析により、ＰＤ−１抗体単独またはＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１との併用療法で処置したマウス間でほぼ有意な増加が示された。生存曲線はＰＤ−１抗体処置及びＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１処置マウス間で非常に類似していた（ｐ＞０．９９９９、ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定）。
黒色腫は、ＣＣＬ５３．１細胞移植（２）を用いてＤＢＡ／２マウスで良好にモデル化することができ、本試験においてＣｏｄａＶａｘ−Ｈ１Ｎ１またはＰＤ−１抗体単独による処置にある程度感受性であることが示された。このデータは有望であり、投与の用量または頻度を変化させることで、より成功することが判明する可能性がある。重要なことには、前免疫処置は、インフルエンザＡウイルスにより腫瘍分解活性をプライミングするのに必要ではなく、ＰＤ−１療法との組合せではより高度に有効であった。
実施例１９
改変されたウイルスはＩＬ−１Ｂを刺激する
図３０に見られるように、培地に１００ｎＭ ＰＭＡを添加し、３７℃、５％ ＣＯ２で３日間インキュベートすることにより、培養ヒト単球（ＴＨＰ−１）をマクロファージに分化するように誘導した。１２ウェルプレートの個別ウェルに３５０，０００細胞／ウェルの密度で接着した後、培地を新鮮な加温培地（１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０）で置き換え、細胞を２５０μｌの体積中５．０のＭＯＩ（１．７５×１０６ ＦＦＵ）で感染させた。細胞を室温で３０分間揺動し、次いでさらに２５０μｌの培地を添加し、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で２時間インキュベートし、その後ウイルス接種物を除去し、培地を温培養培地で置き換えた。感染後１日目及び３日目に上清試料を収集し、−８０℃で凍結し、定量キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ カタログ番号ＢＭＳ２２４−２）を用いてヒトＩＬ−１β ＥＬＩＳＡについて試験した。ＩＬ−１βは、活性化マクロファージによって産生されるサイトカインのインターロイキン１ファミリーの一員として選択した。ＩＬ−１βは炎症応答の重要なメディエーターである。ＩＬ−１β産生は、レチノイン酸誘導遺伝子１（ＲＩＧ−Ｉ）によりウイルスＲＮＡが認識され、続いてＮＦκＢ−ＩＲＦ３シグナリングが誘導された後に活性化される。また、ＲＩＧ−Ｉの活性化は、ＳＴＩＮＧ発現を誘導し、正のフィードバック機構を介して持続的な炎症応答を促進することも知られている。
実施例２０
腫瘍への免疫細胞の動員
図３１に見られるように、０日目、１４日目、２８日目、及び４２日目に１０７ ＦＦＵ ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎでワクチン接種またはウイルス希釈液で偽ワクチン接種した移植及び処置ＤＢＡ／２マウスにおいて、免疫細胞活性化をアッセイした。ワクチン接種マウス及び偽ワクチン接種マウスに対し、６３日目に１×１０６ ＣＣＬ５３．１黒色腫細胞を皮下経路で送達させて移植し、７３日目に処置を開始し、７３日目、７５日目、及び７７日目に１０７ ＰＦＵ ＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｗ／Ｍｉｎまたはウイルス希釈液を腫瘍内に送達させた。処置後１日目及び７日目（７４日目及び８０日目）に、免疫組織化学検査及び染色のために腫瘍を採取して４％パラホルムアルデヒドに固定して、免疫マーカーを計数しＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５＋、及びＦｏｘＰ＋細胞浸潤を測定した。事前のＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎワクチン接種によって処置後７日目の移植ＣＣＬ５３．１腫瘍内のＣＤ８＋細胞浸潤が増強したことが、免疫組織化学検査により可視化されている。ＤＢＡ／２マウスにおいて、事前のＭＲ７６６ Ｅ−Ｗ／Ｍｉｎワクチン接種によって処置後１日目の移植ＣＣＬ５３．１腫瘍内のＣＤ４５＋細胞浸潤が非常に増加したことが、免疫組織化学検査により可視化されている。ＦｏｘＰ３＋細胞は処置腫瘍において低減された。
本発明の様々な実施形態が、上記の発明を実施するための形態で説明されている。これらの説明は、上記の実施形態を直接的に説明しているが、当業者は、本明細書に示され説明されている特定の実施形態に対する変更形態及び／または変形形態を着想し得ることを理解されたい。この説明の範囲内に収まる任意のこのような変更形態または変形形態は、その中に含まれるように意図されている。具体的に記されていない限り、本発明者の意図では、明細書及び請求項における語句は、適用可能な技術分野の当業者にとって一般的かつ慣れ親しんだ意味が与えられている。
出願時に出願人に知られている本発明の様々な実施形態について上記の説明を提示したが、これは例示及び説明の目的で意図されている。本明細書は、網羅的であるようにも、また開示されている詳細な形式に発明を限定するようにも意図されておらず、上記の教示に照らして多くの変更形態及び変形形態が可能である。記載された実施形態は、本発明の原理及びその実際的適用を説明し、他の当業者が様々な実施形態において、また企図されている特定の使用に適合するように様々な変更形態を用いて、本発明を利用することを可能にするように機能する。そのため、本発明は、本発明を実施するために開示されている特定の実施形態に限定されないように意図されている。
本発明の特定の実施形態が示され説明されたが、当業者には、本明細書の教示に基づいて、本発明及びそのより広範な態様から逸脱することなく変更及び修正がなされ得ることが明白であろう。そのため、添付の請求項は、本発明の真の趣旨及び範囲内にあるものとして、その範囲内に全てのこのような変化及び変更を包含するものである。概して、当業者には、本明細書で使用される用語が概して「開かれた」用語として意図されていることが理解されよう（例えば、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「限定されるものではないが、〜を含む」と解釈されるべきであり、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は「少なくとも〜を有する」と解釈されるべきであり、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「限定されるものではないが、〜を含む」と解釈されるべきであることなど）。
本明細書で使用される場合、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、ある実施形態に有用である組成物、方法、及びこれらのそれぞれの構成要素に関して使用され、さらに不特定の構成要素を含むことに対しても、有用か否かにかかわらず開かれている。概して、当業者には、本明細書で使用される用語が概して「開かれた」用語として意図されていることが理解されよう（例えば、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「限定されるものではないが、〜を含む」と解釈されるべきであり、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は「少なくとも〜を有する」と解釈されるべきであり、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「限定されるものではないが、〜を含む」と解釈されるべきであることなど）。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という制限のない用語は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、または有する（ｈａｖｉｎｇ）のような用語の同義語として、本明細書では本発明の説明及び特許請求のために使用されているが、本発明またはその実施形態は、「〜からなる」または「本質的に〜からなる」のような代替的用語を用いて、代替的に説明されることもある。

Claims (55)

  1. 悪性腫瘍を処置する方法であって、
    それを必要とする対象に、改変されたウイルスを投与することを含み、前記改変されたウイルスが、以下からなる群より選択される、前記方法：
    野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を、同様のタンパク質配列をコードするコドン対脱最適化領域で置換することにより、前記野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、改変された配列のコドン対バイアスが、親ウイルスのコドン対バイアスより小さく、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．２低減されている、前記改変されたウイルス、
    同様のタンパク質配列をコードする、ＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、前記野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、前記ＣｐＧジヌクレオチドの増加では、少なくとも４１インスタンスが親を上回るか、または少なくとも２１インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、前記改変されたウイルス、
    同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、前記野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、前記ＵｐＡジヌクレオチドの増加では、少なくとも２６インスタンスが親を上回るか、または少なくとも１３インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、前記改変されたウイルス、
    同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、前記野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、前記ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドの増加では、合わせて少なくとも４２インスタンスが親を上回っていた、前記改変されたウイルス、ならびに
    これらの組合せ。
  2. 悪性腫瘍を処置する方法であって、
    それを必要とする対象に、改変されたウイルスのプライム用量を投与することと、
    それを必要とする前記対象に、改変されたウイルスの１回以上のブースト用量を投与することと
    を含み、
    前記プライム用量及びブースト用量の前記改変されたウイルスが各々独立に、以下からなる群より選択される、前記方法：
    コドン対脱最適化以外の方法によって産生される弱毒化ウイルス、
    野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を、同様のタンパク質配列をコードするコドン対脱最適化領域で置換することにより、前記野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、改変された配列のコドン対バイアスが、親ウイルスのコドン対バイアスより小さく、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．２低減されている、前記改変されたウイルス、
    同様のタンパク質配列をコードする、ＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、前記野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、前記ＣｐＧジヌクレオチドの増加では、少なくとも４１インスタンスが親を上回るか、または少なくとも２１インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、前記改変されたウイルス、
    同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、前記野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、前記ＵｐＡジヌクレオチドの増加では、少なくとも２６インスタンスが親を上回るか、または少なくとも１３インスタンスが親ウイルスゲノムを上回る、前記改変されたウイルス、
    同様のタンパク質配列をコードする、ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドが増加した領域で、野生型ウイルスの少なくとも１つのゲノム領域を置換することにより、前記野生型ウイルスまたは予め改変されたウイルスから得られる、改変されたウイルスであって、前記ＵｐＡ及びＣｐＧジヌクレオチドの増加では、合わせて少なくとも４２インスタンスが親を上回っていた、前記改変されたウイルス、ならびに
    これらの組合せ。
  3. 前記プライム用量が、皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内、または静脈内に投与される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記１回以上のブースト用量が腫瘍内または静脈内に投与される、請求項２に記載の方法。
  5. １回のプライム用量から約２週間後に、または２回以上のプライム用量の場合は最後のプライム用量から約２週間後に、前記１回以上のブースト用量の１回目が投与される、請求項２に記載の方法。
  6. 前記対象ががんを有する、請求項２に記載の方法。
  7. 前記対象ががんを有しない場合に前記プライム用量が投与される、請求項２に記載の方法。
  8. 前記対象が、がん発症のより高いリスクを有する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記対象ががんを有しない場合に、前記１回以上のブースト用量が、前記プライム用量後約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０年毎に投与される、請求項７に記載の方法。
  10. 前記対象ががんと診断された後に前記１回以上のブースト用量が投与される、請求項７に記載の方法。
  11. ＰＤ−１阻害物質またはＰＤ−Ｌ１阻害物質を投与することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ＰＤ−１阻害物質が抗ＰＤ１抗体である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記抗ＰＤ１抗体が、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、スパルタリズマブ、セミプリマブ、ＡＫ１０５、ＢＣＤ−１００、ＢＩ ７５４０９１、ＪＳ００１、ＬＺＭ００９、ＭＧＡ０１２、Ｓｙｍ０２１、ＴＳＲ−０４２、ＭＧＤ０１３、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、チスレリズマブ、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ＰＤ−１阻害物質が、ＰＦ−０６８０１５９１、抗ＰＤ１抗体発現多能性キラーＴリンパ球（ＰＩＫ−ＰＤ−１）、自己由来抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ４ＳＣＡＲ−ＩｇＴ細胞、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記抗ＰＤ−Ｌ１阻害物質が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＢＧＢ−Ａ３３３、ＣＫ−３０１、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、ＭＤＸ−１１０５、ＭＳＢ２３１１、ＳＨＲ−１３１６、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＣＫ−３０１、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ＰＤ−Ｌ１阻害物質がＭ７８２４である、請求項１１に記載の方法。
  18. 前記悪性腫瘍を処置することによって、前記悪性腫瘍の再発の可能性が減少する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記悪性腫瘍を処置することによって、前記悪性腫瘍と異なる第２のがんを有する可能性が減少する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記対象が、前記悪性腫瘍と異なる第２のがんを発症した場合に、前記悪性腫瘍の前記処置が、前記第２のがんの成長を遅くするという結果をもたらす、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記悪性腫瘍の寛解後、前記対象が、前記悪性腫瘍と異なる第２のがんを発症した場合に、前記悪性腫瘍の前記処置が、前記第２のがんの成長を遅くするという結果をもたらす、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記悪性腫瘍を処置することによって、前記腫瘍の炎症性免疫応答が刺激される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記悪性腫瘍を処置することによって、炎症促進性細胞が前記腫瘍に動員される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記悪性腫瘍を処置することによって、抗腫瘍免疫応答が刺激される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記改変されたウイルスが組換え型の改変されたウイルスである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の悪性腫瘍を処置する方法。
  26. 改変されたウイルスがピコルナウイルスから改変されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の悪性腫瘍を処置する方法。
  27. 前記ピコルナウイルスがエンテロウイルスである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記エンテロウイルスがエンテロウイルスＣである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記エンテロウイルスＣがポリオウイルスである、請求項２８に記載の方法。
  30. 改変されたウイルスがオルソミクソウイルスから改変されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の悪性腫瘍を処置する方法。
  31. 前記オルソミクソウイルスがインフルエンザＡウイルスである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記インフルエンザＡウイルスの１つ以上のセグメントが再コードされている、請求項３１に記載の方法。
  33. ＨＡセグメント、ＮＡセグメント、またはＨＡ及びＮＡ両方のセグメントが再コードされている、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記改変されたウイルスが配列番号５または配列番号６である、請求項３１に記載の方法。
  35. 改変されたウイルスがフラビウイルスから改変されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の悪性腫瘍を処置する方法。
  36. 前記フラビウイルスがジカウイルスである、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ジカウイルスの前膜（ｐｒｅ−ｍｅｍｂｒａｎｅ）／エンベロープ（Ｅ）コード領域もしくは非構造タンパク質３（ＮＳ３）コード領域または両方が再コードされている、請求項３５に記載の方法。
  38. 再コード化が、Ｅ及びＮＳ３コード配列中のＣＧ及び／またはＴＡジヌクレオチドの頻度を変更することを含む、請求項３５に記載の方法。
  39. 再コードされたＥタンパク質コード配列、もしくは前記ＮＳ３コード配列、または両方が、−０．１より小さいコドン対バイアスを有する、請求項３７に記載の方法。
  40. 再コードされたＥタンパク質コード配列、もしくは前記ＮＳ３コード配列、または両方が、０．１〜０．４のコドン対バイアス低減を有する、請求項３７に記載の方法。
  41. 前記改変されたウイルスが配列番号２、配列番号３、または配列番号４である、請求項３６に記載の方法。
  42. 前記悪性腫瘍が固形腫瘍である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の悪性腫瘍を処置する方法。
  43. 前記悪性腫瘍が、神経膠芽腫、腺がん、黒色腫、肺がん、神経芽腫、乳がん（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、結腸がん、前立腺がん、または肝臓がんである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の悪性腫瘍を処置する方法。
  44. 前記改変されたウイルスが、腫瘍内、静脈内、脳内、筋肉内、脊髄内、または髄腔内に投与される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の悪性腫瘍を処置する方法。
  45. 前記改変されたウイルスが、ＰＶ１−ＭｉｎＹであり、かつ前記野生型ウイルスまたは前記予め改変されたウイルスから調製され、前記改変されたウイルスのＰ１領域の中央部分が、ヒトコドン対バイアスに従うコドン対スコアの低減のために再コードされた合成配列で置換されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の悪性腫瘍を処置する方法。
  46. 前記組換え型の改変されたウイルスが、ＰＶ１−ＭｉｎＹであり、かつ予め改変されたウイルスＰＶｌ（Ｍ）または野生型ウイルスＰＶ１（Ｍ）から調製され、前記組換え型の改変されたウイルスのＰ１領域の中央部分が、ＵｐＡ及びまたはＣｐＧジヌクレオチド増加のために再コードされた合成配列で置換されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の悪性腫瘍を処置する方法。
  47. 前記組換え型ウイルスが、ＰＶ１（Ｍ）から調製されたＰＶ１−ＭｉｎＹであり、前記Ｐ１領域のヌクレオチド位置１５１３〜ヌクレオチド位置２４７０を含むヌクレオチドの断片が、ヒトコドン対バイアスに従うコドン対スコアの低減のために再コードされた前記Ｐ１領域のヌクレオチド位置１５１３〜ヌクレオチド位置２４７０を含むヌクレオチドの対応する断片で置換されている、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記改変されたウイルスが、ＰＶ１（Ｍ）から調製されたＰＶ１−ＭｉｎＹであり、前記Ｐ１領域のヌクレオチド位置１５１３〜ヌクレオチド位置２４７０からなるヌクレオチドの断片が、ヒトコドン対バイアスに従うコドン対スコアの低減のために再コードされた前記Ｐ１領域のヌクレオチド位置１５１３〜ヌクレオチド位置２４７０を含むヌクレオチドの対応する断片で置換されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の悪性腫瘍を処置する方法。
  49. 悪性腫瘍を処置する方法であって、
    野生型ピコルナウイルスのＰ１ドメイン内のヌクレオチドの少なくとも１つの断片を、ヒトコドン対バイアスに従うコドン対スコアの低減のために再コードされた合成配列を含むヌクレオチドの対応する断片で置換することにより、前記野生型ピコルナウイルスから組換え型の改変されたウイルスを調製することと、
    ＰＶ１（Ｓ）、ＰＶ２（Ｓ）、及びＰＶ３（Ｓ）からなる群より選択される、ヒトコドン対バイアスに従うコドン対スコアの低減のために再コードされた合成Ｐ１で、前記野生型ピコルナウイルスのＰ１を任意選択で置換することと、
    それを必要とする対象に、前記組換え型の改変されたウイルスを投与することと
    を含む、前記方法。
  50. 前記ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を置換することが、前記改変されたウイルスのＰ１ドメインである配列番号１のヌクレオチド番号１５１３〜ヌクレオチド番号２４７０を含む前記ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を、ヒトコドン対バイアスに従うコドン対スコアの低減のために再コードされた合成配列を含むヌクレオチドの対応する断片で置換することを含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記組換え型ウイルスが、腫瘍内、静脈内、脳内、筋肉内、脊髄内、または髄腔内に投与され、腫瘍細胞における細胞溶解を引き起こす、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記悪性腫瘍が、多形神経膠芽腫、髄芽腫、乳がん（ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、気管支がん、及び類表皮がんからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
  53. 前記ピコルナウイルスがエンテロウイルスＣの種である、請求項４９に記載の方法。
  54. 前記ピコルナウイルスがポリオウイルスである、請求項４９に記載の方法。
  55. 前記Ｐ１ドメインが、サビンワクチン株ＰＶ１（Ｓ）、ＰＶ２（Ｓ）、及びＰＶ３（Ｓ）から選択される、請求項４９に記載の方法。
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