JP2010523086A

JP2010523086A - ワクチンに有用な弱毒化ウイルス

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Publication number: JP2010523086A
Application number: JP2010501289A
Authority: JP
Inventors: エックハード・ウィマー; スティーヴ・スキーナ; ステファン・ミューラー; ブルース・フュッチャー; ディミトリ・パパミシャイル; ジョン・ロバート・コールマン
Original assignee: ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステート・ユニヴァーシティー・オブ・ニュー・ヨーク
Priority date: 2007-03-30
Filing date: 2008-03-31
Publication date: 2010-07-15
Anticipated expiration: 2028-03-31
Also published as: MX2009010549A; CA2682089A1; PL2139515T3; US20170067030A1; EP2139515B1; MX349825B; CN103476425A; EP3431099A1; EP3431099B1; US9476032B2; KR101621100B1; EP4368202A2; HRP20181319T1; CA2682089C; KR20100019423A; JP2015091247A; BRPI0809600B1; DK2139515T4; WO2008121992A2; US20190010469A1

Abstract

本発明は、改変ウイルスゲノムを含む弱毒化ウイルスを提供し、該ゲノムは、ゲノム中の複数の場所に操作されたヌクレオチド置換を含有し、該置換は、ゲノムに脱最適化された（ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）同義コドンを導入する。本弱毒化ウイルスは、対象における防御免疫応答を誘発するためのワクチン組成物中で使用することができる。また、本発明は、本弱毒化ウイルスの合成方法も提供する。さらに、本発明は、本弱毒化ウイルスを含む予防上有効な用量のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、対象がウイルス関連の疾病に罹患するのを予防するための方法をさらに提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００７年３月３０日出願の米国出願第６０／９０９，３８９号、および２００８年３月７日出願の米国出願第６１／０６８，６６６号に対する優先権を主張し、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

連邦政府による資金拠出
本発明は、国立衛生研究所からの助成金番号ＡＩ１５１２２、国立科学財団からの助成金番号ＥＩＡ０３２５１２３、および国立癌研究からの助成金番号Ｔ３２−ＣＡ００９１７６の下、合衆国政府の支援を受けて行われた。したがって、合衆国政府は本発明の一部の権利を有する。

著作権表示
本特許文献の本開示の一部分は、著作権保護の対象となる内容を含む。著作権所有者は、何人による特許文献または特許開示の複製に対しても、特許商標局の包袋または特許記録に見られる通りである限り異存はないが、それ以外はそれが何であれ全ての著作権の権利を留保する。

本発明は、複数のヌクレオチド置換を含有する改変ウイルスゲノムを含む、弱毒化ウイルスの生成に関する。ヌクレオチド置換は、コドンの他の同義コドンとの交換および／またはコドン対バイアスのコドン再編成および変化をもたらす。

ＤＮＡ合成技術における急速な向上により、ウイルス学において利用される伝統的な方法の大変革が見込まれている。ウイルスゲノムの異なる領域の機能を排除するために伝統的に使用されてきた手法の１つは、ウイルス株のゲノムにおけるわずかな配列多様性の影響を調査するために、大規模であるが骨の折れる部位特異的変異誘発を利用する。ところが、ウイルスゲノム、特にＲＮＡウイルスのものは比較的短く、しばしば１０，０００塩基長未満であり、現在利用可能な技術を使用する全ゲノム合成の影響を受けやすくする。近年開発されたマイクロ流体チップ技術は、１個わずか数百ドルの仕様に設計される、新ゲノムのデノボ合成を行うことができる。これは、従来のクローニング法では実質的に不可能な程度まで、全く新規のコード配列の生成または既存配列の調節を可能にする。

そのような設計の自由は、（１）ウイルス翻訳および複製効率への、コドンバイアス、コドン対バイアス、ならびにＲＮＡ二次構造等のパラメータの変化の影響を研究するために、（２）ウイルス複製の成功のために必要な未知の調節要素および他のシグナルに対して、効率的な全ゲノムスキャンを行うために、および（３）ウイルス株の遺伝子操作および抗ウイルスワクチンの設計のための新しいバイオ技術を開発するために、ＤＮＡ／ＲＮＡコード配列の大規模な再設計を行うための驚異的な力を提供する。

遺伝子コードの縮退の結果として、タンパク質コード配列中の２個のアミノ酸を除く全てが、２個以上のコドンによってコード化されることができる。そのような同義コドンが使用される頻度は一定ではなく、しばしば希少あるいはそうでなければ不利なｔＲＮＡに対応する準最適コドンの過剰使用を防止するために、細胞の翻訳機構と共進化してきた（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎｅｔａｌ．，２００４）。これは、「同義コドンバイアス」と呼ばれる現象をもたらし、これは進化的に遠い種の間、および場合によっては同種における異なる組織の間でさえ、大きく異なる（Ｐｌｏｔｋｉｎｅｔａｌ．，２００４）。

組み換え法によるコドン最適化（すなわち、遺伝子の同義コドンの使用を宿主細胞のコドンバイアスと一致させること）は、異種間発現を向上させるために広く使用されてきた（例えば、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎｅｔａｌ．，２００４を参照）。準最適同義コドンの意図的導入による発現の減少という反対の目的は、広範囲に研究されてこなかったが、少数の報告は、天然コドンの希少コドンによる置換が、異なる生物中の遺伝子発現レベルを減少させることができることを示す。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，１９８４、Ｈｏｅｋｅｍａｅｔａｌ．，１９８７、ＣａｒｌｉｎｉａｎｄＳｔｅｐｈａｎ，２００３、Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，１９９９を参照されたい。したがって、脱最適化された同義コドンのウイルスゲノムへの導入は、タンパク質翻訳に悪影響を及ぼす可能性があり、その結果、ウイルス性疾病に対するワクチンの製造に有用であり得る弱毒化ウイルスを産生するための方法を提供することができる。

ウイルス性疾病およびワクチン

ウイルスは、常にヒトの死および疾病の主な原因の１つである。細菌性疾病とは異なり、ウイルス性疾病は、抗生物質に対して感受性がなく、したがって、治療が困難である。したがって、ワクチン接種は、ヒトの主な、かつ最も強力なウイルス防御である。今日、天然痘および灰白髄炎（ポリオ）等の最も古く、かつ最も重いウイルス性疾病のいくつかは、世界的な予防接種計画によって根絶されている（またはほぼ根絶されている）。しかしながら、ライノウイルスおよびインフルエンザウイルス等の多くの他の古いウイルスは、うまく抑制されておらず、なおも大きな問題を引き起こすが、これらの問題は、年ごとおよび国ごとに異なる。加えて、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス等の新ウイルスが、ヒト集団において頻繁に発現し、しばしば死者を出す世界的大流行を引き起こす。また、戦争またはテロリズムの手段としての意図的導入のために、人間が製造した、または変化させた致死的なウイルスが発現する可能性もある。

ワクチンの効果的な製造は、依然として予測できない仕事である。ワクチンには、サブユニットワクチン、不活化（死菌）ワクチン、および弱毒化生ワクチンの３つの主な種類がある。サブユニットワクチンについては、ウイルスからの１つまたは複数のタンパク質（例えば、組み換えＤＮＡ技術を使用して製造されるキャプシドタンパク質）が、ワクチンとして使用される。大腸菌または酵母中で産生されるサブユニットワクチンは、非常に安全であり、ウイルス性疾病の脅威を与えない。しかしながら、それらの有効性は、免疫原性ウイルスタンパク質の全てが存在するとは限らず、存在するものも、それらの未変性構造で存在しない場合があるため、低い可能性がある。

不活化（死菌）ワクチンは、例えば、程度の差はあるが野生型（ｗｔ）のウイルスを増殖させ、次いで、ホルムアルデヒド（ソークポリオワクチンにあるような）で不活性化することによって製造される。ウイルスの全てを死滅させるが、それにもかかわらず粒子の免疫原性を損なわない不活化処理を発見するために、多くの実験が必要とされる。加えて、ウイルスを増殖させるための設備は、毒性ウイルスを漏らす可能性があるか、または不活性化が失敗する可能性があるという点で、残留物に関する安全問題が依然として残って
弱毒化生ワクチンは、ウイルスの毒性を弱め、予防接種に使用可能な状態にする変異を受けたウイルスを含む。生弱毒化ウイルスは、ワクチンとして多くの利点を有する。それらは、製造が容易で、速く、かつ安価である場合が多く、投与が容易である場合が多く（例えば、サビンポリオワクチンは角砂糖で経口投与された）、また弱毒化ウイルスの残存増殖が、「集団」予防接種（一次患者と近く接触する人々の予防接種）を可能にする場合がある。これらの利点は、ワクチンがすぐに必要とされる緊急事態において特に重要である。弱毒化ワクチンの主な欠点は、かなりの頻度でｗｔ毒性への復帰を有する点である。このため、サビンワクチンは、米国ではもはや使用されていない。

Alexander, H.E., G. Koch, I.M. Mountain, K. Sprunt, and O. Van Damme. 1958. Infectivity of ribonucleic acid of poliovirus on HeLa cell mono-layers Virology. 5:172-3.

したがって、復帰の可能性が実質的になく、したがって、速く、効率的で、かつ安全なワクチンの製造方法を提供する弱毒化生ウイルスを生成するための、系統的方法の必要性が依然として残っている。本発明は、弱毒化生ウイルスが何百または何千もの小さい欠損を有するため、復帰の可能性が本質的にない弱毒化生ウイルスを生成するための、系統的方法である合成弱毒化ウイルス工学（ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＡｔｔｅｎｕａｔｅｄＶｉｒｕｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＳＡＶＥ）を提供することによって、この必要性を満たす。この方法は、多様なウイルスに広く適用でき、多種多様の抗ウイルスワクチンを産生するための効果的な方法を提供する。

本発明は、ゲノム中の複数の場所に操作されたヌクレオチド置換を含有する改変ウイルスゲノムを含む、弱毒化ウイルスを提供し、置換は、ゲノムに複数の同義コドンを導入する。同義コドンのこの置換は、ゲノム中のコドンバイアス、コドン対バイアス、脱最適化されたコドンおよび脱最適化されたコドン対の密度、ＲＮＡ二次構造、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、Ｃ＋Ｇ含有量、翻訳フレームシフト部位、翻訳中止部位、組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列の有無、またはそれらの任意の組み合わせを含む、種々のパラメータを変化させる。多くの欠損が関与するため、本発明の弱毒化ウイルスは、多種多様のウイルス性疾病に対する安定弱毒化生ワクチンを産生する手段を提供する。

一実施形態では、親ウイルスの対応配列と同一である、ウイルスタンパク質またはその一部をコード化する核酸配列を含む、弱毒化ウイルスが提供され、弱毒化ウイルスのヌクレオチド配列は、それが由来する親配列のコドンを含有し、ヌクレオチド配列は、親ウイルスのヌクレオチド配列と９０％未満相同である。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、親ウイルスの配列と８０％未満相同である。弱毒化を提供する置換されたヌクレオチド配列は、少なくとも１００ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２５０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも５００ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１０００ヌクレオチドの長さである。弱毒化配列のコドン対バイアスは、親ウイルスのコドン対バイアスよりも少なく、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．２減少している。

弱毒化されるウイルスは、動物または植物ウイルスであることができる。ある実施形態では、ウイルスは、ヒトウイルスである。別の実施形態では、ウイルスは、複数の種を感染させる。特定の実施形態は、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、デングウイルス、ＨＩＶ、ロタウイルス、およびＳＡＲＳを含むがこれらに限定されない。

本発明はまた、本弱毒化ウイルスおよび薬剤として許容される担体を含む、対象における防御免疫応答を誘発するためのワクチン組成物を提供する。本発明は、野生型宿主細胞において生存不能である弱毒化ウイルスに対して許容状態になるように特に操作された、改変宿主細胞株をさらに提供する。

加えて、本発明は、（ａ）ウイルスゲノムの少なくとも１つの非制御部分における複数の場所でコドンを同定するステップであって、コドンは、同義コドンによって置換されることができる、ステップと、（ｂ）同定されたコドンの各々の代わりになる同義コドンを選択するステップと、（ｃ）同定されたコドンの各々を同義コドンで置換するステップとを含む、本弱毒化ウイルスを合成するステップを提供する。

さらに、本発明は、コドン対バイアスを調節するために、同一アミノ酸をコード化する既存コドンのコード領域内の順序を変化させるステップを含む、本弱毒化ウイルスを合成するステップを提供する。

さらに、本発明は、前記の２つの方法を組み合わせる、本弱毒化ウイルスを合成するステップを提供する。

本発明にしたがって、弱毒化ウイルス粒子は、宿主細胞にウイルスゲノムを導入し、それにより弱毒化ウイルス粒子が産生されることによって、製造される。本発明は、予防接種に好適な弱毒化ウイルスを含む、医薬組成物をさらに提供する。

本発明は、予防上または治療上有効な用量の本ワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、対象がウイルス関連の疾病に罹患するのを予防するための、およびウイルスに感染した対象におけるウイルス関連の疾病の発症を遅延させるか、またはその進行速度を遅らせるための、対象における防御免疫応答を誘起するための方法をさらに提供する。

本発明は、ゲノム中の複数の場所に操作されたヌクレオチド置換を含有する改変ウイルスゲノムを含む、弱毒化ウイルスをさらに提供し、置換は、ゲノムに複数の同義コドンを導入し、ヌクレオチド置換は、それぞれのアミノ酸許容位置に同義コドンを無作為に割り当てることによって、コード配列を最初に作製するステップと、コード配列のコドン対スコアを計算するステップと、シミュレーテッドアニーリング最適化関数に従って、（ａ）同一アミノ酸をコード化するコドンの対、または（ｂ）置換同義コドンのいずれかを無作為に選択および交換するステップと、特定の数または十分な数の反復にわたって、さらなる改善が認められなくなる（対スコアまたはバイアスの変化がなくなる）まで、解が最適値に、またはその近傍に収束するまで、前記のステップを繰り返すステップとを含むプロセスによって選択される。

合成Ｐ１キャプシド設計におけるコドン使用統計値。ＰＶ−ＳＤは、配列中のコドン配置変化を最大化する一方で、ｗｔと比較してほぼ同一のコドン頻度を維持する。ＰＶ−ＡＢキャプシドにおいて、非優先コドンの使用が最大化される。棒の長さおよび各棒の後ろの数字は、配列中の各コドンの発生を示す。参照として、各アミノ酸に対する正常なヒトの同義コドン頻度（「頻度」は百分率で表される）が、３列目に示される。ＰＶ（Ｍ）、ＰＶ−ＡＢ、およびＰＶ−ＳＤキャプシドコード領域の配列アライメント。ＰＶ（Ｍ）（配列番号１）、ＰＶ−ＡＢ（配列番号２）、およびＰＶ−ＳＤ（配列番号３）のヌクレオチド配列は、ＭｕｌｔＡｌｉｎオンラインソフトウェアツール（Ｃｏｒｐｅｔ、１９８８）を使用して整合された。配列上の数字は、キャプシド配列内の位置を指す。ヌクレオチド１は、ＰＶ（Ｍ）ウイルスゲノムにおけるヌクレオチド７４３に対応する。共通配列において、３つ全ての配列中の同一ヌクレオチドの発生は、大文字によって示され、３つの配列のうちの２つにおける同一ヌクレオチドの発生は、小文字によって示され、３つの配列中の３つの異なるヌクレオチドの発生は、ピリオドによって示される。図２ａ参照。コドン脱最適化ウイルス表現型。（Ａ）本研究に使用されるウイルス構築物の概要。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞単層における一段増殖速度。（Ｃ〜Ｈ）感染細胞を視覚化するために、抗３Ｄ^ｐｏｌ抗体で染色された、インキュベーションの４８時間後（Ｃ〜Ｆ）または７２時間後（ＧおよびＨ）の、コドン脱最適化ウイルスのプラーク表現型。（Ｃ）ＰＶ（Ｍ）、（Ｄ）ＰＶ−ＳＤ、（Ｅ）ＰＶ−ＡＢ、（Ｆ）ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}、（ＧおよびＨ）ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}。除去されたプラーク領域は、感染細胞の縁によって輪郭が描かれる（ＣおよびＤ）。（Ｈ）パネルＧに示されるウェルの後続のクリスタルバイオレット染色後に、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}でプラークは見られない。（ＩおよびＪ）感染の４８時間後、ＰＶ（Ｍ）によって産生された、免疫染色されたプラークの端のマイクロ写真、（Ｉ）またはＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}によって産生された、感染した病巣（Ｊ）。コドン脱最適化は、特異的感染の減少をもたらす。（Ａ）ＰＶ（Ｍ）（レーン１）、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}（レーン２）、およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}（レーン３）の精製ウイルス粒子から単離されたビリオンゲノムのアガロースゲル電気泳動。（Ｂ）精製ＰＶ（Ｍ）（レーン１）、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}（レーン２）、およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}（レーン３）ウイルス粒子の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル。４個のキャプシドタンパク質のうちのより大きな３個（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）が示され、ウイルス調合物の純度および相対量を表す。（Ｃ）ポリオウイルス受容体アルカリ性ホスファターゼ（ＣＤ１５５−ＡＰ）融合タンパク質プローブを使用した、ウイルス検出ＥＬＩＳＡの構築。ＥＬＩＳＡプレートを被覆するために、ウイルス特異的抗体を使用し、未知のウイルス濃度を含有するサンプルを利用し、次に、ＣＤ１５５−ＡＰでの検出が続いた。既知量の精製ｗｔウイルスと並行して作成された標準曲線を使用して、ウイルス濃度を計算した（Ｅ）。（Ｄ）精製ウイルスおよび抽出ビリオンＲＮＡの量を分光光度法で定量化し、粒子またはゲノム等価数（１ゲノム＝１ビリオン）を計算した。加えて、ビリオン濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。各ウイルスの感染力価をプラーク／感染病巣アッセイによって決定し、特異的感染をＰＦＵ／粒子またはＦＦＵ／粒子として計算した。コドン脱最適化および野生型ウイルスの生体外翻訳。ＰＶ−ＡＢ表現型は、ゲノム翻訳レベルで決定される。（Ａ）外因的に添加されたアミノ酸およびｔＲＮＡの存在下でのＨｅＬａＳ１０抽出物における標準的生体外翻訳は、ＰＶ（Ｍ）ｗｔと比較して、コドン脱最適化ゲノムの翻訳能の差を示さない。１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分解した、［^３５Ｓ］メチオニン標識翻訳生成物のオートラジオグラフが示される。異常バンドが何であるか（^＊）は未知である。（Ｂ）外因性アミノ酸およびｔＲＮＡの添加がない、競合細胞ｍＲＮＡの存在下での非透析ＨｅＬａＳ１０抽出物における生体外翻訳は、コドン脱最適化ＰＶゲノムの翻訳能の欠損を明らかにする。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分解した、ポリオウイルス２Ｃ反応翻訳生成物（２Ｃ^{ＡＴＰａｓｅ}、２ＢＣ、およびＰ２）のウエスタンブロットが示される。２ＢＣ翻訳生成物の相対量は、ｗｔバンドの割合（％）として各レーンの下に表される。ジシストロニックレポーターレプリコンを使用した生体内翻訳の分析は、ＰＶ翻訳へのコドン脱最適化の悪影響を確認する。（Ａ）ジシストロニックレプリコンの概略図。種々のＰ１キャプシドコード配列をホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｆ−Ｌｕｃ）の上流に挿入した。内部対照（Ｒ−Ｌｕｃ）に対するＦ−Ｌｕｃ発現の変化レベルの決定は、Ｐ１キャプシド領域を通したリボソーム輸送の定量化を可能にする。（Ｂ）レプリコンＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入し、２ｍＭの塩酸グアニジンの存在下で７時間インキュベートし、ＲＮＡ複製を阻止した。Ｐ１領域を通した翻訳の相対速度は、コドン脱最適化の程度に反比例した。２つの生存ウイルス構築物、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}およびＰＶ−ＡＢ^{２９５４−３３８６}が、６０〜８０％の間のｗｔ翻訳を可能にする一方で、２０％以下の翻訳効率が、ＰＶ−ＡＢ、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−３３８６}、およびＰＶ−ＡＢ^{１５１３−２４７０}ゲノムで認められた致死表現型に伴う。値は、３つの独立した実験からの６つのアッセイの平均を表す。ヒトおよびウイルスＯＲＦのコドン対バイアスの決定。点は、その長さに対して表示される、１つのＯＲＦに対する１つのコドン対当たりの平均コドンペアスコアを表す。コドン対バイアス（ＣＰＢ）を１４，７９５個の注釈付きヒト遺伝子に対して計算した。過少に存在するコドン対は、負のスコアを得る。種々のポリオウイルスＰ１構築物に対してＣＰＢがプロットされ、矢印付きの記号によって表される。図は、ヒト遺伝子の大部分が、０．１の周りに集まっていることを図示する。ＣＰＢは、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔ（「ＷＴ」と標識される）（−０．０２）、カスタマイズ合成ポリオウイルスキャプシドＰＶ−Ｍａｘ（＋０．２５）、ＰＶ−Ｍｉｎ（−０．４８）、ならびにＰＶ（Ｍ）−ｗｔ：ＰＶ−ＭｉｎキメラキャプシドＰＶ−Ｍｉｎ^{７５５−２４７０}（＝“ＰＶ−ＭｉｎＸＹ”）（−０．３１）およびＰＶ−Ｍｉｎ^{２４７０−３３８６}（＝“ＰＶ−ＭｉｎＺ”）（−０．２０）に対して示される。ウイルスＰＶ−ＳＤおよびＰＶ−ＡＢは、変化したコドン対バイアスではなく、変化したコドンバイアスの結果である。コドンペア脱最適化ポリオの特性。一段増殖速度は、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔと比較して、約２．５桁減少した、ＰＶ−Ｍｉｎ^{７５５−２４７０}およびＰＶ−Ｍｉｎ^{２４７０−３３８５}に対するＰＦＵ産生を示す。しかしながら、全てのウイルスは、同様の数のウイルス粒子を産生する（この図には図示せず）。結果として、ＰＦＵ／粒子の比は、コドン脱最適化ウイルスＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}と同様に減少する（図３Ｂを参照）（ＰＦＵは、「プラーク形成単位」である）。キメラウイルスゲノムの集合。標的ゲノム（赤色）を通して「スキャン」するために、小断片が増幅または合成され、重複ＰＣＲによってｗｔゲノム（黒色）に導入される。インフルエンザＡウイルスの生成のための８プラスミドｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩ系。ヒトｐｏｌＩプロモータとｐｏｌＩＩプロモータとの間に挿入された、８個のウイルスｃＤＮＡを含有する、８個の発現プラスミドは、真核細胞に導入される。各プラスミドは、２つの異なるプロモータを含有するため、細胞ｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩの両方は、推定上異なる核分画において、プラスミドテンプレートを転写し、ウイルスｍＲＮＡおよびｖＲＮＡの合成をもたらす。ウイルスポリメラーゼ複合体タンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、核タンパク質）の合成後、ウイルス複製サイクルが開始される。最終的には、細胞転写および翻訳機構から直接的に（ｐｏｌＩＩ転写）、または間接的に（ｐｏｌＩ転写およびウイルス複製）得られる全てのウイルス分子の集合が、全ての合成分子（ｖＲＮＰおよび構造タンパク質ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ２／ＮＥＰ）の相互作用をもたらし、感染性インフルエンザＡウイルスを生成する（ＲｅｐｒｏｄｕｃｅｄｆｒｏｍＮｅｕｍａｎｎｅｔａｌ．，２０００．）（注：インフルエンザをデノボ合成する方法は他にもある）。ポリオウイルスゲノムおよび合成ウイルス構築物。ポリオウイルスゲノムおよびキメラウイルス構築物のオープンリーディングフレーム。上は、完全長ＰＶ（Ｍ）−ｗｔゲノムＲＮＡの概略図である。下は、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔ、ＣＰＢカスタマイズ合成ウイルスＰＶ−Ｍａｘ、ＰＶ−Ｍｉｎ、およびＰＶ（Ｍ）−ｗｔ：ＰＶ−Ｍｉｎキメラウイルスのオープンリーディングフレームである。黒色は、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔ配列に対応し、灰色は、Ｖ−Ｍｉｎ合成配列に対応し、斜線は、ＰＶ−Ｍａｘに対応する。強調されたウイルス構築物、ＰＶ−Ｍｉｎ^{７５５−２４７０}（ＰＶ−ＭｉｎＸＹ）およびＰＶ−Ｍｉｎ^{２４７０−３３８５}（ＰＶ−ＭｉｎＺ）は、顕著な弱毒化表現型によってさらに特徴付けられた。一段増殖曲線は、感染性の減少した同様の量の粒子を得る、同様の速度を示す。（Ａ）ＨｅＬａＲ１９細胞の単分子層を感染させるために、２のＭＯＩを使用し、プラークアッセイによって、所与の時点（０、２、４、７、１０、２４、４８時間）におけるＰＦＵを測定した。対応する記号：（□）ＰＶ（Ｍ）−ｗｔ、（●）ＰＶ−Ｍａｘ、（◇）ＰＶ−Ｍｉｎ７５５−１５１３、（ｘ）ＰＶ−Ｍｉｎ１５１３−２４７０、（◆）ＰＶ−ＭｉｎＸＹ、（△）ＰＶ−ＭｉｎＺ。（Ｂ）各時点における計算されたＰＦＵ／ｍｌの粒子／ｍｌへの変換を表示する。これは、ＰＦＵ／ｍｌにそれぞれのウイルス特異的感染性を乗じることによって得られる。対応する記号は、（Ａ）にある通りである。ＣＰＢの変化による翻訳の生体内調節。（Ａ）ＣＰＢが翻訳に対して有する生体内効果を定量化するために、ジシストロニックＲＮＡ構築物を使用した。第１のシストロンは、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ−Ｌｕｃ）の翻訳を誘発する、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用する。この第１のシストロンは、投入ＲＮＡの量を正規化するために使用される内部対照である。ＰＶ（Ｍ）−ｗｔＩＲＥＳによって制御される第２のシストロンは、ホタルルシフェラーゼ（Ｆ−Ｌｕｃ）の翻訳を誘発する。構築物において「Ｐ１」と標識される領域をそれぞれのウイルスＰ１のｃＤＮＡによって置換した。（Ｂ）２ｍＭの塩酸グアニジンの存在下で、それぞれのＲＮＡ構築物をＨｅＬａＲ１９細胞に導入し、６時間後、Ｒ−ＬｕｃおよびＦ−Ｌｕｃを測定した。Ｆ−Ｌｕｃ／Ｒ−Ｌｕｃの値をＰＶ（Ｍ）−ｗｔ翻訳（１００％）に対して正規化した。合成ウイルスの熱不活性化プロファイルは変化しない。キャプシドタンパク質がミスフォールドした場合に予想できるように、大規模なコドン対バイアス変化が、ビリオンの全体的な形態を変化させることを阻止するために、ＰＶＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺの熱安定性を試験した。同数の粒子を５０℃でインキュベートし、プラークアッセイによって所与の期間の後、残存する感染性を定量化した。合成ウイルスのキャプシドが不安定になった場合は、ｗｔＰＶ（Ｍ）と比較して、５０℃での生存性の低下が増加することが予想される。この場合は当てはまらなかった。両方の合成ウイルスの熱不活性化速度は、ｗｔと同一であった。対照的に、サビン−１ウイルスは、キャプシドをコード化するゲノム領域において多数の変異を有し、ｗｔＰＶ１（Ｍ）と比較して、このウイルスを適切に熱不安定にさせた。ワクチン接種後の中和抗体力価。８匹のＣＤ１５５ｔｇマウスの一群は、そのうち７匹が投与計画を完了したが、ＰＶ−ＭｉｎＺ（●）およびＰＶ−ＭｉｎＸＹ（◆）の１０^８個の粒子を１週間間隔で３回腹腔内注射することによって、それぞれを予防接種し、最終ワクチン接種の１０日後に血清変換を測定した。各データセットを横切る横線は、各ウイルス構築物に対する平均中和抗体力価を示す。マイクロ中和アッセイによって、抗ポリオウイルス抗体力価を測定した。（^＊）試験された最も低い１：８において、偽の予防接種を受けた動物に対するウイルス中和は検出されなかった。コドン対脱最適化ＮＰ断片を有するインフルエンザウイルス。（Ａ）Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎウイルスは、生存しており、Ａ／ＰＲ８ｗｔと比較して、ＭＤＣＫ細胞上により小さいプラークを産生する。（Ｂ）Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎウイルスは、遅延した増殖速度、および野生型Ａ／ＰＲ８よりも３〜５倍下回る最終力価を示す。コドン対脱最適化ＰＢ１またはＨＡおよびＮＰ断片を有するインフルエンザウイルス。（Ａ）Ａ／ＰＲ８−ＰＢ１^{Ｍｉｎ−ＲＲ}およびＡ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ／ＮＰ^Ｍｉｎウイルスは、生存しており、Ａ／ＰＲ８野生型と比較して、ＭＤＣＫ細胞上により小さいプラークを産生する。（Ｂ）Ａ／ＰＲ８−ＰＢ１^{Ｍｉｎ−ＲＲ}およびＡ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ／ＮＰ^Ｍｉｎウイルスは、遅延した増殖速度、および野生型Ａ／ＰＲ８よりも約１０倍下回る最終力価を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおけるＡ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎの弱毒化。（Ａ）Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎウイルスは、ワクチン接種による体重減少によって測定されるように、野生型Ａ／ＰＲ８ウイルスと比較して、病原性が減少している。（Ｂ）Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎウイルスを接種した全てのマウス（８匹中８匹）が生存したが、Ａ／ＰＲ８に感染したマウスの２５％（８匹中２匹）のみが、ワクチン接種の１３日後に生存していた。（Ｃ）Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎウイルスを接種したマウスは、Ａ／ＰＲ８野生型ウイルスの１００倍のＬＤ_５０で、抗原投与から防御される。

本発明は、ウイルス感染および疾病を予防するためのワクチンとして使用され得る、弱毒化ウイルスの産生に関する。したがって、本発明は、ゲノム中の複数の場所に操作されたヌクレオチド置換を含有する改変ウイルスゲノムを含む、弱毒化ウイルスを提供し、置換は、ゲノムに複数の同義コドン、および／または同一アミノ酸に対する既存コドンの順序の変化（コドン対利用の変化）を導入する。両方の場合において、ウイルス遺伝子産物の元の野生型アミノ酸配列は保持される。

大部分のアミノ酸は、２個以上のコドンによってコード化される。表１の遺伝子コードを参照されたい。例えば、アラニンは、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、およびＧＣＧによってコード化される。３個のアミノ酸（Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、およびＡｒｇ）が、６個の異なるコドンによってコード化される一方で、ＴｒｐおよびＭｅｔのみが、特異的なコドンを有する。「同義」コドンは、同一アミノ酸をコード化するコドンである。したがって、例えば、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧ、ＵＵＡ、およびＵＵＧは、Ｌｅｕに対してコードする同義コドンである。同義コドンは、同頻度で使用されない。概して、特定の生物において最も頻繁に使用されるコドンは、同族ｔＲＮＡが豊富なコドンであり、これらのコドンの使用は、タンパク質翻訳の速度および／または正確性を高める。反対に、ほとんど使用されないコドンに対するｔＲＮＡは、比較的低いレベルで見られ、希少コドンの使用は、翻訳速度および／または正確性を低下させると考えられている。したがって、同義であるがあまり頻繁に使用されないコドンによって、核酸中の所与のコドンを置換することは、核酸中に「脱最適化された」コドンを置換することである。

加えて、所与の生物は、所与のコドンＡに最近接するコドンに対して特定の優先傾向があり、コドン対利用におけるバイアスと称される。既存コドンを変化させることなくコドン対バイアスを変化させることにより、タンパク質合成の速度およびタンパク質の産生に影響を及ぼすことができる。

本発明の種々の実施形態では、ウイルスは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２本鎖、または１本鎖ウイルスである。さらなる実施形態では、ウイルスは、動物または植物を感染させる。好ましい実施形態では、動物はヒトである。数多くの動物ウイルスが、疾病を引き起こすことがよく知られている（以下を参照）。狂犬病、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、および鳥インフルエンザを引き起こすような、ある医学的に重要なウイルスはまた、それらの通常の非ヒト宿主からヒトに広がる可能性がある。

ウイルスはまた、植物病原菌の主要な群を構成し、遺伝子導入植物を産生するためのウイルスベクターを開発するための研究が続いている。そのようなベクターの利点には、植物の形質転換の容易さ、単一の形質転換された細胞からの遺伝子導入植物の再生の必要性を除去する、成熟した植物を形質転換する能力、および１細胞当たりの、ウイルスの複数のコピーからの外来遺伝子の高い発現レベルが含まれる。しかしながら、これらのベクターの主な不利点のうちの１つは、ウイルスの病原性決定基から、本質的なウイルス複製機能を分離することが可能ではなかったことである。本明細書に開示されるＳＡＶＥ戦略は、植物形質転換のための非病原性ウイルスベクターを操作する手段を提供することができる。

ヒトにおける主要なウイルス病原体

ウイルス病原体は、ヒトおよび他の動物における多くの疾病の原因病原体である。ヒトにおけるウイルス性疾病のよく知られている例には、風邪（ヒトライノウイルス、ＨＲＶによって引き起こされる）、インフルエンザ（インフルエンザウイルス）、水疱瘡（水痘帯状疱疹ウイルス）、麻疹（パラミクソウイルス）、流行性耳下腺炎（パラミクソウイルス）、灰白髄炎（ポリオウイルス、ＰＶ）、狂犬病（リッサウイルス）、ヘルペス（単純ヘルペスウイルス［ＨＳＶ］１型）、および性器ヘルペス（ＨＳＶ２型）が含まれる。小児へのワクチン接種プログラムの導入前に、これらの多くは、世界中で一般的な小児期の疾病であり、今もなお一部の発展途上国では健康への多大なる脅威である。ウイルス性疾病には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ＳＡＲＳコロナウイルスによって引き起こされる重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、鳥インフルエンザ（インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプ）、エボラ（エボラウイルス）、マールブルグ出血熱（マールブルグウイルス）、デング熱（フラビウイルス血清型）、ウエストナイル脳炎（フラビウイルス）、伝染性単核球症（エプスタインバーウイルス、ＥＢＶ）、肝炎（Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＢＶ）、および黄熱（フラビウイルス）等のより深刻な疾病も含まれる。ある種類の癌もまた、ウイルスによって引き起こされる可能性がある。例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によるほとんどの感染が良性であるが、ＨＰＶは、子宮頸癌と関連することがわかっており、ＡＩＤＳ患者において一般的な腫瘍であるカポジ肉腫（ＫＳ）は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）によって引き起こされる。

ウイルスは細胞内に存在し、再生のために宿主細胞の機構を使用するため、それらは、宿主細胞を殺滅することなく除去することが困難である。ウイルス性疾病に対処する最も効果的な方法は、感染への抵抗性をもたらすために、感染のリスクのある対象のワクチン接種であった。いくつかの疾病（例えば、水疱瘡、麻疹、流行性耳下腺炎、黄熱）に対して、効果的なワクチンが利用可能である。しかしながら、多くの他のウイルス性疾病のためのワクチンを早急に開発する必要性がある。本明細書に記載されるワクチンを製造するためのＳＡＶＥ（合成弱毒化ウイルス工学）方法は、原則として、逆遺伝学系（以下を参照）が利用可能である全てのウイルスに適用できる。この方法は、灰白髄炎、風邪、およびインフルエンザのための弱毒化ウイルスワクチンを開発するために、ＳＡＶＥの適用に重点を置くことによって、本明細書に例示される。

いずれのウイルスも、本明細書に開示される方法によって弱毒化することができる。ウイルスは、ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、１本鎖「プラス」センスＤＮＡウイルス（例えば、パルボウイルス）、２本鎖ＲＮＡウイルス（例えば、レオウイルス）、１本鎖＋センスＲＮＡウイルス（例えば、ピコルナウイルス、トガウイルス）、１本鎖「マイナス」センスＲＮＡウイルス（例えば、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス）、ＤＮＡ中間体を有する１本鎖＋センスＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）、または２本鎖逆転写ウイルス（例えば、ヘパドナウイルス）であることができる。本発明のある限定されない実施形態では、ウイルスは、ポリオウイルス（ＰＶ）、ライノウイルス、鳥インフルエンザを含むインフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、伝染性気管支炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デング熱ウイルス（フラビウイルス血清型）、西ナイル熱ウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、黄熱病ウイルス、エボラ（エボラウイルス）、水疱瘡（水痘帯状疱疹ウイルス）、麻疹（パラミクソウイルス）、流行性耳下腺炎（パラミクソウイルス）、狂犬病（リッサウイルス）、ヒトパピローマウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型）、または性器ヘルペス（ＨＳＶ２型）である。

「親」ウイルスまたは「親」タンパク質コード化配列という用語は、程度の差はあるが弱毒化され得る新しい配列が由来する、ウイルスゲノムおよびタンパク質コード化配列を指すために、本明細書で使用される。親ウイルスおよび配列は、通常、「野生型」もしくは「自然発生的」な原型、またはより高度な弱毒化ウイルスを得ることが望ましい変異体の単離株である。しかしながら、親ウイルスはまた、実際の、または認識された望ましい特性に基づいて、研究室で特に作製または選択される突然変異体を含む。したがって、弱毒化の候補である親ウイルスは、欠失、挿入、アミノ酸置換等を有する、野生型または自然発生的ウイルスの突然変異体を含み、またコドン置換を有する突然変異体も含む。一実施形態では、そのような親配列は、天然単離株と約３０アミノ酸以下異なる。別の実施形態では、親配列は、天然単離株と約２０アミノ酸以下異なる。さらに別の実施形態では、親配列は、天然単離株と約１０アミノ酸以下異なる。

弱毒化ＰＶは、ポリオウイルス１型（Ｍａｈｏｎｅｙ、「ＰＶ（Ｍ）」）、ポリオウイルス２型（Ｌａｎｓｉｎｇ）、ポリオウイルス３型（Ｌｅｏｎ）、１価経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）ウイルス、または３価ＯＰＶウイルスに由来し得る。ある実施形態では、ポリオウイルスは、配列番号２に記載のゲノム配列を有するＰＶ−ＡＢ、またはＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−２４７０}、ＰＶ−ＡＢ^{１５１３−３３８６}、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−３３８６}、ＰＶ−ＡＢ^{１５１３−２４７０}、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}、もしくはＰＶ−ＡＢ^{２９５４−３３８６}である。名称は、ＰＶ（Ｍ）ゲノムで、ゲノムのどの一部がＰＶ−ＡＢのヌクレオチドで置換されるかを反映する。上付き文字は、置換されるＰＶ−ＡＢのヌクレオチド番号を提供する。

様々な実施形態において、弱毒化ライノウイルスは、ＨＲＶ２、ＨＲＶ１４、ヒトライノウイルス１０、ヒトライノウイルス１００、ヒトライノウイルス１１、ヒトライノウイルス１２、ヒトライノウイルス１３、ヒトライノウイルス１５、ヒトライノウイルス１６、ヒトライノウイルス１８、ヒトライノウイルス１９、ヒトライノウイルス１Ａ、ヒトライノウイルス１Ｂ、ヒトライノウイルス２、ヒトライノウイルス２０、ヒトライノウイルス２１、ヒトライノウイルス２２、ヒトライノウイルス２３、ヒトライノウイルス２４、ヒトライノウイルス２５、ヒトライノウイルス２８、ヒトライノウイルス２９、ヒトライノウイルス３０、ヒトライノウイルス３１、ヒトライノウイルス３２、ヒトライノウイルス３３、ヒトライノウイルス３４、ヒトライノウイルス３６、ヒトライノウイルス３８、ヒトライノウイルス３９、ヒトライノウイルス４０、ヒトライノウイルス４１、ヒトライノウイルス４３、ヒトライノウイルス４４、ヒトライノウイルス４５、ヒトライノウイルス４６、ヒトライノウイルス４７、ヒトライノウイルス４９、ヒトライノウイルス５０、ヒトライノウイルス５１、ヒトライノウイルス５３、ヒトライノウイルス５４、ヒトライノウイルス５５、ヒトライノウイルス５６、ヒトライノウイルス５７、ヒトライノウイルス５８、ヒトライノウイルス５９、ヒトライノウイルス６０、ヒトライノウイルス６１、ヒトライノウイルス６２、ヒトライノウイルス６３、ヒトライノウイルス６４、ヒトライノウイルス６５、ヒトライノウイルス６６、ヒトライノウイルス６７、ヒトライノウイルス６８、ヒトライノウイルス７、ヒトライノウイルス７１、ヒトライノウイルス７３、ヒトライノウイルス７４、ヒトライノウイルス７５、ヒトライノウイルス７６、ヒトライノウイルス７７、ヒトライノウイルス７８、ヒトライノウイルス８、ヒトライノウイルス８０、ヒトライノウイルス８１、ヒトライノウイルス８２、ヒトライノウイルス８５、ヒトライノウイルス８８、ヒトライノウイルス８９、ヒトライノウイルス９、ヒトライノウイルス９０、ヒトライノウイルス９４、ヒトライノウイルス９５、ヒトライノウイルス９６、ヒトライノウイルス９８、ヒトライノウイルス１４、ヒトライノウイルス１７、ヒトライノウイルス２６、ヒトライノウイルス２７、ヒトライノウイルス３、ヒトライノウイルス８００１フィンランド１９９５年１１月、ヒトライノウイルス３５、ヒトライノウイルス３７、＋ヒトライノウイルス６２５３フィンランド１９９４年９月、ヒトライノウイルス９１６６フィンランド１９９５年９月、ヒトライノウイルス４、ヒトライノウイルス４２、ヒトライノウイルス４８、ヒトライノウイルス９８６４フィンランド１９９６年９月、ヒトライノウイルス５、ヒトライノウイルス５２、ヒトライノウイルス６、ヒトライノウイルス７４２５フィンランド１９９５年１２月、ヒトライノウイルス６９、ヒトライノウイルス５９２８フィンランド１９９５年５月、ヒトライノウイルス７０、ヒトライノウイルス７２、ヒトライノウイルス７９、ヒトライノウイルス８３、ヒトライノウイルス８４、ヒトライノウイルス８３１７フィンランド１９９６年８月、ヒトライノウイルス８６、ヒトライノウイルス９１、ヒトライノウイルス７８５１フィンランド１９９６年９月、ヒトライノウイルス９２、ヒトライノウイルス９３、ヒトライノウイルス９７、ヒトライノウイルス９９、アントワープライノウイルス９８／９９、ヒトライノウイルス２６３ベルリン２００４、ヒトライノウイルス３０８３／ライノ／兵庫／２００５、ヒトライノウイルスＮＹ−００３、ヒトライノウイルスＮＹ−０２８、ヒトライノウイルスＮＹ−０４１、ヒトライノウイルスＮＹ−０４２、ヒトライノウイルスＮＹ−０６０、ヒトライノウイルスＮＹ−０６３、ヒトライノウイルスＮＹ−０７４、ヒトライノウイルスＮＹ−１０８５、ヒトライノウイルス株Ｈａｎｋｓ、未区分ヒトライノウイルスＯＫ８８−８１６２、ヒトエンテロウイルス種ｅｘアメリカキララマダニ、ヒトライノウイルス種、またはヒトライノウイルスＵＣに由来するヒトライノウイルス（ＨＲＶ）である。

他の実施形態において、弱毒化インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、またはインフルエンザウイルスＣに由来する。さらなる実施形態において、インフルエンザウイルスＡは、サブタイプであるＨ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ１、Ｈ１０Ｎ２、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１０Ｎ４、Ｈ１０Ｎ５、Ｈ１０Ｎ６、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１０Ｎ９、Ｈ１１Ｎ１、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ３、Ｈ１１Ｎ４、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１１Ｎ８、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ１、Ｈ１２Ｎ２、Ｈ１２Ｎ４、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１２Ｎ６、Ｈ１２Ｎ８、Ｈ１２Ｎ９、Ｈ１３Ｎ２、Ｈ１３Ｎ３、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ９、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ１４Ｎ６、Ｈ１５Ｎ２、Ｈ１５Ｎ８、Ｈ１５Ｎ９、Ｈ１６Ｎ３、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ８、Ｈ１Ｎ９、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ４、Ｈ２Ｎ５、Ｈ２Ｎ６、Ｈ２Ｎ７、Ｈ２Ｎ８、Ｈ２Ｎ９、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ３Ｎ４、Ｈ３Ｎ５、Ｈ３Ｎ６、Ｈ３Ｎ８、Ｈ３Ｎ９、Ｈ４Ｎ１、Ｈ４Ｎ２、Ｈ４Ｎ３、Ｈ４Ｎ４、Ｈ４Ｎ５、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ７、Ｈ４Ｎ８、Ｈ４Ｎ９、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ４、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ３、Ｈ６Ｎ４、Ｈ６Ｎ５、Ｈ６Ｎ６、Ｈ６Ｎ７、Ｈ６Ｎ８、Ｈ６Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９、Ｈ８Ｎ２、Ｈ８Ｎ４、Ｈ８Ｎ５、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ４、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ９Ｎ９、および未同定サブタイプに属するが、それらに限定されない。

さらなる実施形態において、インフルエンザウイルスＢは、サブタイプである、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／愛知／１８６／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／愛知／５／８８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／秋田／２７／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／秋田／５／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アラバマ／１／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アラバマ／２／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アラスカ／０３／１９９２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アラスカ／１２／１９９６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アラスカ／１６／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アラスカ／１６／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アラスカ／１７７７／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アラスカ／２／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アラスカ／６／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アナーバー／１／１９８６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アナーバー／１９９４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アルゼンチン／１３２／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アルゼンチン／３６４０／１９９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アルゼンチン／６９／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１２／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１３／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１３５／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１４／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１４／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１４０／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１４６／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１４８／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１５／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１６／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１６２／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１６３／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／１６４／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／２／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／２／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／２ｅ／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／３／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／４／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／４／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／４８／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／５／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／５９／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／アリゾナ／７／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／オークランド／０１／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バンコク／１４１／１９９４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バンコク／１４３／１９９４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バンコク／１５３／１９９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バンコク／１６３／１９９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バンコク／１６３／９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バンコク／３４／９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バンコク／４６０／０３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バンコク／５４／９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バルセロナ／２１５／０３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／北京／１５／８４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／北京／１８４／９３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／北京／２４３／９７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／北京／４３／７５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／北京／５／７６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／北京／７６／９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ベルギー／ＷＶ１０６／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ベルギー／ＷＶ１０７／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ベルギー／ＷＶ１０９／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ベルギー／ＷＶ１１４／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ベルギー／ＷＶ１２２／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ボン／４３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブラジル／０１７／００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブラジル／０５３／００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブラジル／０５５／００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブラジル／０６４／００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブラジル／０７４／００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブラジル／０７９／００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブラジル／１１０／０１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブラジル／９５２／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブラジル／９７５／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブリズベン／３２／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブカレスト／３１１／１９９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブカレスト／７９５／０３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブエノスアイレス／１６１／００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブエノスアイレス／９／９５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブエノスアイレス／ＳＷ１６／９７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ブエノスアイレス／ＶＬ５１８／９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／０１／１９９５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／０２／１９９４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／０２／１９９５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／１／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／１０／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／１１／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／１４／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／２／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／２／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／３／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／３／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／６／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カリフォルニア／７／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カナダ／１６１８８／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カナダ／４６４／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／カナダ／４６４／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／チャコ／３６６／００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／チャコ／Ｒ１１３／００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／チャンタブリ／２１８／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／済州／３０３／０３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／千葉／４４７／９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／チリ／３１６２／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／重慶／３／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１０タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１００フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１０１フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１０２フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１０３フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１０４フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１０５フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１０６フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１０７フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１０８フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１０９フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１１タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１１０フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１１２フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１１３フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１１４フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１１５フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１１６フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１２タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１３タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１４タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１５タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１６タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１７タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１８タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ１９タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ２タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ２０タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ２１タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ２２タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ２３タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ２４タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ２５タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ２６タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ２７タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ２８タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ２９タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ３タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ３０タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ３１タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ３２タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ３３タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ３４タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ３７タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ３８フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ３９タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ４０タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ４１フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ４２フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ４３タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ４４タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ４５フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ４６フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ４７フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ５タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ５０フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ５１フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ５２フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ５３フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（
Ｂ／臨床単離株ＳＡ５７フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ５８フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ５９フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ６タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ６０フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ６１フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ６２フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ６３フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ６４フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ６５フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ６６フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ６７フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ６８フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ６９フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ７タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ７０フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ７１フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ７３フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ７４フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ７６フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ７７フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ７８フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ７９フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ８タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ８０フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ８１フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ８２フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ８３フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ８４フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ８５タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ８６タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ８７タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ８８タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ８９タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ９タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ９０タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ９１タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ９２タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ９３タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ９４タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ９５フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ９６タイ／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ９７フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ９８フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／臨床単離株ＳＡ９９フィリピン／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ＣＮＩＣ／２７／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／０４／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／１１ｅ／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／１２ｅ／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／１３／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／１３ｅ／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／１５／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／１６ｅ／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／１７ｅ／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／２／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／２５９７／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／４ｅ／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コロラド／５／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コネティカット／０２／１９９５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コネティカット／０７／１９９３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コルドバ／２９７９／１９９１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／コルドバ／ＶＡ４１８／９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／チェコスロバキア／１６／８９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／チェコスロバキア／６９／１９９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／チェコスロバキア／６９／９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／大邱／１０／９７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／大邱／４５／９７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／大邱／４７／９７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／大邱／９／９７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／デラウェア／１／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／Ｄｕ／４／７８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ダーバン／３９／９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ダーバン／４３／９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ダーバン／４４／９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ダーバン／５２／９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ダーバン／５５／９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ダーバン／５６／９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／エジプト／２０４０／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／イングランド／１７１６／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／イングランド／２０５４／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／イングランド／２３／０４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／エスピリトゥサント／５５／０１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／エスピリトゥサント／７９／９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１５４／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１５９／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１６０／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１６１／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１６２／０３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１６２／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１６２／９１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１６４／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１７２／９１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１７３／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１７６／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１８４／９１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１８８／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１９０／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１９１／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１９２／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１９３／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／１９９／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２０２／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２０３／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２０４／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２０５／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２０６／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２２０／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２２３／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２２５／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２２７／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２３１／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２３５／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２３９／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２４４／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２４５／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２５４／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２５４／９３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２５５／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２６０／９３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２６８／９３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２７０／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／２７５／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／７６７／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／８４／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／８８６／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／ＷＶ４／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フィンランド／ＷＶ５／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フロリダ／０２／１９９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フロリダ／０２／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フロリダ／１／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フロリダ／１／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フロリダ／２／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フロリダ／２／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フロリダ／２／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／フロリダ／７ｅ／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／福建／３６／８２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジュネーブ／５０７９／０３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア／１１／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア／２／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア／２１／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア／３３／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア／４１／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア／５２／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア／５５／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア／５６／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア／７／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア／８／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア１２／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア３／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア４８／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア４９／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア５／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア５３／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア６／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノア６５／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノバ／１２９４／０３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノバ／１６０３／０３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノバ／２／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノバ／２０／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノバ／２０５９／０３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノバ／２６／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノバ／３０／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノバ／５４／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジェノバ／５５／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジョージア／０２／１９９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ジョージア／０４／１９９８）、イ
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ンフルエンザＢウイルス（Ｂ／テキサス／３／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／テキサス／３／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／テキサス／３／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／テキサス／３７／１９８８）、インフルエンザＢウ
イルス（Ｂ／テキサス／３７／８８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／テキサス／４／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／テキサス／４／９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／テキサス／５／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／テキサス／５７／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／テキサス／６／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／徳島／１０１／９３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／東京／６／９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トレント／３／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／１／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／１／０３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／１５／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／１７／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／１９／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／２／０３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／２５／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／２７／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／２８／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／３４／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／３７／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／４／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ／８／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ１４／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ１８／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ２３／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ２４／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／トリエステ７／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウランウデ／４／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウランウデ／６／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウランウデ／４／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／イギリス／３４３０４／９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／イギリス／３４５２０／９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／１９／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／１９／０５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／２／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／２８／０５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／３３／０５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／４／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／５／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／６５／０５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／７／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／７４／０４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／７５／０４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウルグアイ／ＮＧ／０２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウスアイア／１５７３２／９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ソ連／１００／８３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ユタ／１／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ユタ／２０１３９／９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ユタ／２０９７５／９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バーモント／１／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ビクトリア／０２／１９８７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ビクトリア／１０３／８９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ビクトリア／１９／８９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ビクトリア／２／８７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ビクトリア／５０４／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィーン／１／９９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バージニア／１／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バージニア／１／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バージニア／１１／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バージニア／２／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バージニア／３／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バージニア／３／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／バージニア／９／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ワシントン／１／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ワシントン／２／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ワシントン／２／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ワシントン／３／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ワシントン／３／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ワシントン／５／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウェリントン／０１／１９９４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／１／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／１／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／１０／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／１５ｅ／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／１７／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／２／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／２／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／２２／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／２６／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／２９／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／３／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／３／２００４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／３／２００５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／３／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／３１／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／４／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／５／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／６／２００６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ウィスコンシン／７／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／武漢／２／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／武漢／３５６／２０００）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ＷＶ１９４／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ワイオミング／１５／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ワイオミング／１６／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ワイオミング／２／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／許晶／１／８２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／許晶／２３／８２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／１／７３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／１１５／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／１２４６／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／１３１１／２００３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／１６／１９８８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／１６／８８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／２２２／２００２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ１９８／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ２４６／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ２７０／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ２９８／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ３２０／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ３５４／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ３８６／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ４１１／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ４６１／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ４９０／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ５００／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ５０１／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ５０８／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ５１３／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ５１５／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ５１９／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ５２０／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ５２１／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ５３５／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山形／Ｋ５４２／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山梨／１６６／１９９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／山梨／１６６／９８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／雲南／１２３／２００１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／アラスカ／１２／９６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／アナーバー／１／６６［低温適応型］）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／アナーバー／１／６６［野生型］）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／ＢＡ／７８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／北京／１／８７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／イングランド／２２２／８２）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／フィンランド／１４５／９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／フィンランド／１４６／９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／フィンランド／１４７／９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／フィンランド／１４８／９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／フィンランド／１４９／９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／フィンランド／１５０／９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／フィンランド／１５１／９０）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／フィンランド／２４／８５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／フィンランド／５６／８８）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／福岡／８０／８１）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／ＧＡ／８６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／ＧＬ／５４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／香港／８／７３）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／ＨＴ／８４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／ＩＤ／８６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／レニングラード／１７９／８６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／メリーランド／５９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／メンフィス／６／８６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／長崎／１／８７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／大阪／４９１／９７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／ＰＡ／７９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／ＲＵ／６９）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／シンガポール／６４）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／東京／９４２／９６）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／ビクトリア／３／８５）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ株／ビクトリア／８７）、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／ロチェスター／０２／２００１）、および他のサブタイプに属するが、それらに限定されない。さらなる実施形態において、インフルエンザウイルスＣは、サブタイプである、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／愛知／１／８１）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／愛知／１／９９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／アナーバー／１／５０）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／青森／７４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／カリフォルニア／７８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／イングランド／８３）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／福岡／２／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／福岡／３／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／福島／１／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／ギリシャ／７９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／広島／２４６／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／広島／２４７／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／広島／２４８／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／広島／２４９／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／広島／２５０／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／広島／２５１／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／広島／２５２／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／広島／２５２／９９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／広島／２９０／９９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／広島／４
／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／兵庫／１／８３）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／ヨハネスブルク／１／６６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／ヨハネスブルク／６６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／神奈川／１／７６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／神奈川／２／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／カンザス／１／７９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／京都／１／７９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／京都／４１／８２）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／ミシシッピ／８０）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／１／９０）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／１／９３）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／１／９４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／１／９７）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／１／９９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／１２／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／２／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／２／９２）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／２／９３）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／２／９４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／２／９６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／２／９８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／３／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／３／９１）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／３／９２）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／３／９３）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／３／９４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／３／９７）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／３／９９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／４／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／４／９３）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／４／９６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／４／９７）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／４／９８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／４２／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／５／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／５／９１）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／５／９３）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／６／９３）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／６／９６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／７／９１）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／７／９３）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／７／９６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／７７）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／８／９６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／９／９１）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／宮城／９／９６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／奈良／１／８５）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／奈良／２／８５）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／奈良／８２）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／ニュージャージー／７６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／新潟／１／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／大阪／２／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／ブタ／北京／１１５／８１）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／埼玉／１／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／埼玉／１／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／埼玉／２／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／埼玉／３／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／札幌／７１）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／静岡／７９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／１／８６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／１／８８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／１０／８９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／１３／９８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／１５／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／２／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／２／９８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／２／９９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／２０／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／２０／９６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／２１／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／２６／８１）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／２７／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／３／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／３／２００４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／３／８８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／３／９６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／４／８８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／４／８９）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／５／９２）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／６／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／６／９８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／６４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／７／８８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／８／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／８／８８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／８／９６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／９／２０００）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／９／８８）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ／山形／９／９６）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ株／ベルリン／１／８５）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ株／イングランド／８９２／８３）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ株／五大湖／１１６７／５４）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ株／ＪＪ／５０）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ株／ブタ／北京／１０／８１）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ株／ブタ／北京／４３９／８２）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ株／テイラー／１２３３／４７）、インフルエンザＣウイルス（Ｃ株／山形／１０／８１）、イサウイルスもしくは伝染性サケ貧血ウイルス、ソゴトウイルスもしくはドーリウイルス、バトケンウイルス、ドーリウイルス（インド株／１３１３／６１）もしくはソゴトウイルス、ソゴトウイルス（単離株ＳｉＡｒ１２６）もしくは未分類ソゴトウイルス、アラグアリウイルス、未分類オルトミクソウイルス科または家禽ペストウイルスもしくはブタインフルエンザウイルス、または未同定インフルエンザウイルス、および他のサブタイプに属するが、それらに限定されない。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、デルタウイルスファミリおよび全ての近縁属に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、例えば、ヒトアデノウイルスＡ、Ｂ、Ｃであるがこれに限定されない、アデノウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルスであるがこれに限定されない、ヘルペスウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、レオウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、パピローマウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、ポックスウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、例えば、ヒト免疫不全ウイルスであるがこれに限定されない,レトロウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、フィロウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、パラミクソウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、オルソミクソウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、ピコルナウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、ブニヤウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、ニドウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、カルシウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。

ある実施形態では、同義コドン置換は、ゲノム中のコドンバイアス、コドン対バイアス、脱最適化されたコドンおよび脱最適化されたコドン対の密度、ＲＮＡ二次構造、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、Ｃ＋Ｇ含有量、翻訳フレームシフト部位、翻訳中止部位、マイクロＲＮＡ認識配列の有無、またはそれらの任意の組み合わせを変化させる。コドン置換は、ゲノム全体にわたって分布した複数の場所で、またはゲノムの一部に制限された複数の場所で操作され得る。さらなる実施形態では、ゲノムの一部は、キャプシドコード領域である。

本発明の好ましい実施形態では、ウイルスは、動物宿主における防御免疫応答を誘発する能力を保持する。他の好ましい実施形態では、ウイルスの毒性は、野生型に戻らない。

ポリオウイルス、ライノウイルス、およびインフルエンザウイルス

ピコルナウイルスファミリの一員であるポリオウイルスは、７．５ｋｂの長さの１本鎖（＋）センスＲＮＡゲノムを有する、小型の非エンベロープウイルスである（Ｋｉｔａｍｕｒａｅｔａｌ．，１９８１）。細胞侵入時、ゲノムＲＮＡは、一連の自己触媒的切断事象の後に、機能ポリオウイルスタンパク質の完全な相補体を生じさせる単一ポリタンパク質をコード化する、ｍＲＮＡとして機能する。同一のゲノムＲＮＡは、子孫ビリオンへのキャプシド形成の対象とされている、ｍＲＮＡ、複製テンプレート、またはゲノムＲＮＡのいずれかとして機能する新しい（＋）鎖の合成のための中間体である、（−）センスＲＮＡの合成のためのテンプレートとして機能する（Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，２００５）。本明細書に記載されるように、弱毒化合成ウイルスの産生のための設計戦略を最適化する上での一般的な問題に対処するために、十分に確立したＰＶ系を使用した。ＰＶは、抗ウイルス戦略を構築するための、最も重要かつ最もよく理解された分子モデルのうちの１つを提供する。特に、逆遺伝学系が存在し、それによりウイルス核酸は、完全な合成方法によって生体外で合成し、次いで、感染性ビリオンに変換することができる（以下を参照）。さらに、前述の通り、合成ＰＶ設計の弱毒化を試験するための便利なマウスモデルが利用可能である（ポリオに対するヒト受容体を発現する、ＣＤ１５５ｔｇマウス）（Ｃｅｌｌｏｅｔａｌ．，２００２）。

ライノウイルスも、ピコルナウイルスファミリの一員であり、ＰＶに関連する。ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）は、風邪の通常の原因病原体であり、したがって、それらは、いずれの他の感染病原体よりも多くの疾病の発現に関与する（Ｈｅｎｄｌｅｙ，１９９９）。風邪に加えて、ＨＲＶはまた、耳および副鼻腔感染、喘息、および他の疾病に関与する。ＰＶと同様に、ＨＲＶは、１本鎖プラスセンスＲＮＡウイルスを含み、そのゲノムは、自己プロセシングポリタンパク質をコード化する。ＲＮＡは、キャプシドを形成する構造タンパク質に加えて、２つのウイルスプロテアーゼ、２Ａおよび３Ｃ、ならびにＲＮＡ依存性ポリメラーゼ等の非構造タンパク質を産生するために、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、内部開始機構によって翻訳される（Ｊａｎｇｅｔａｌ．，１９８９、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒｅｔａｌ．，１９８８）。やはりＰＶと同様に、ＨＲＶは、４個のキャプシドタンパク質ＶＰ１−４の６０個のコピーによって形成される、非エンベロープ２０面体キャプシドを有する（Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎｅｔａｌ．，２００３）。ＨＲＶの複製サイクルもまた、ポリオウイルスのものと同一である。ＰＶとの酷似は、ヒトの健康への有意な、ほとんど普遍的な影響と組み合わせて、ＨＲＶを、予防接種に有用な新規の弱毒化ウイルスを生成するための、非常に魅力的な候補にする。

製薬会社による何十年もの研究にもかかわらず、ＨＲＶに対する好ましい薬剤は開発されていない。これは、１つには、ほとんど深刻ではない疾病を治療する薬剤に対する、連邦規制機関および大衆の比較的低いリスク許容度が原因である。すなわち、軽度の副作用でさえ受け入れられない。したがって、薬剤がないので、安全かつ効果的な抗ライノウイルスワクチンへの明確な要望がある。しかしながら、抗ライノウイルスワクチンの開発は、ＨＲＶの血清型が１００以上あり、そのうちの約３０は、広範囲にわたって広がり、日常的にヒトを感染させるため、非常に困難である。効果的なワクチンは、確実な免疫をもたらすために、免疫系が全ての血清型を認識することを可能にしなければならない。本明細書に記載されるＳＡＶＥ方法は、効果的なライノウイルスワクチンの開発への現実的な解決策を提供する。ＳＡＶＥ設計プロセスの予測可能性に基づくと、組み合わせてワクチンを構成する、１００以上のＳＡＶＥ弱毒化ライノウイルスの設計および合成は安価である。

インフルエンザウイルス−１９９０年から１９９９年の間、インフルエンザウイルスは、米国において毎年約３５，０００人の死者を出した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，２００３）。約２００，０００件の入院と合わせて、米国経済への影響は、年間２３０億ドルを超えると推測されている（Ｃｒａｍｅｔａｌ．，２００１）。世界的には、３００，０００から５００，０００人の間の人が、インフルエンザウイルス感染によって毎年死亡している（Ｋａｍｐｓｅｔａｌ．，２００６）。ウイルスは、全年齢層の間で疾病を引き起こすが、重い合併症の速度は、小児および６５歳以上の人で最も高い。インフルエンザは、約３０００万人が死亡した１９１８年のインフルエンザの大流行の間に起こったように、極度の致死性に変異する、または組み換わる可能性がある。これは、ヒトの歴史において、恐らくたった１つの最も致命的な１年の流行であった。

インフルエンザウイルスは、Ａ、Ｂ、およびＣの３つの型に分類される。抗原性は、エンベロープビリオンの表面における２個の糖タンパク質、血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）によって決定される。両方の糖タンパク質は、体液性免疫を逃れるために、それらの抗原性を連続的に変化させる。糖タンパク質の変化は、ウイルス株がワクチン接種者を感染させ続けることを可能にし、それが、高リスク群の毎年のワクチン接種の理由である。加えて、ヒトインフルエンザウイルスは、ＨＡまたはＮＡ糖タンパク質を鳥類またはブタのもので置換することができ、遺伝的シフトとして知られる遺伝子断片の再集合は、新ウイルスをもたらす（Ｈ１Ｎ１からＨ２Ｎ２またはＨ３Ｎ２等）（ＳｔｅｉｎｈａｕｅｒａｎｄＳｋｅｈｅｌ，２００２）。世界人口が免疫学的に感受性であるこれらの新規ウイルスは、何百万人もの人が死亡する流行の原因である（Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，２００６、ＲｕｓｓｅｌｌａｎｄＷｅｂｓｔｅｒ，２００５）。極めて病原性の高い鳥インフルエンザウイルス、Ｈ５Ｎ１の近年の脅威と合わせて、インフルエンザウイルスの歴史（ＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎａｎｄＤｅｍｏｃｒａｔｉｓ，２００６）は、インフルエンザ疾病の予防の必要性を強調する。

現在、生弱毒化ワクチン（低温に適応、「ＦｌｕＭｉｓｔ」）および不活化ウイルスの、２つのインフルエンザワクチンが使用されている。弱毒化ワクチンの適用は、５〜４９歳の健康な小児、若年者、および成人（妊婦を除く）に制限されている。この年齢制限は、まさにインフルエンザのリスクが最も高い人を除外する。さらに、弱毒化ＦｌｕＭｉｓｔウイルスは、生ウイルスには一般的な復帰の可能性がある。２番目により一般的に投与される不活化インフルエンザウイルスワクチンの産生は、複雑である。さらに、このワクチンは、高齢者（６５歳より高齢）人口の死亡の予防において、期待したよりも効果的でないように思われる（Ｓｉｍｏｎｓｏｎｅｔａｌ．，２００５）。これらの事実は、インフルエンザウイルスワクチンを生成するための新規戦略の必要性を強調する。

ピコルナウイルスの逆遺伝学

逆遺伝学は、概して、古典的遺伝学のいわゆる順遺伝学的方法と反対方向に進む、遺伝子の機能を発見するための実験的方法を指す。すなわち、順遺伝学的方法が、表現型形質の遺伝的基礎を解明することによって、遺伝子の機能を決定しようとするのに対して、逆遺伝学に基づく戦略は、単離された遺伝子で始まり、ｗｔまたは変異遺伝子の発現によって生成される、考えられる表現型を研究することによって、その機能を発見しようとする。ウイルス系との関連で本明細書に使用される「逆遺伝学」系は、ＲＮＡで作られるウイルスゲノムの遺伝子操作を可能にする技術の利用可能性を指す。簡潔に、ウイルスゲノムは、ビリオンまたは感染細胞から単離され、酵素逆転写によってＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換され、必要に応じて改変される場合もあり、通常ＲＮＡ中間体を介して、感染性ウイルス粒子に復帰する。ピコルナウイルスにおけるこのプロセスは非常に単純であり、実際に、全ての中で、動物ＲＮＡウイルスのために開発された最初の逆遺伝学系は、ＰＶのためのものであった（ＲａｃａｎｉｅｌｌｏａｎｄＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８１）。ウイルス逆遺伝学系は、裸のウイルスゲノムＲＮＡが、好適な哺乳類細胞に導入される際に感染性であるという歴史的な所見に基づいている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒｅｔａｌ．，１９５８）。１９７０年代の逆転写酵素の発見および分子クローニング技術の開発は、科学者がＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡコピーを生成および操作することを可能にした。最も一般的に、ゲノムの全ｃＤＮＡコピーは、次にウイルスの生成のために細胞に導入されるゲノムＲＮＡの生体外合成を可能にする、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータのすぐ下流でクローン化される（ｖａｎｄｅｒＷｅｒｔ，ｅｔａｌ．，１９８６）。あるいは、同一のＤＮＡプラスミドは、細胞質においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞に導入され得る。この系は、ＰＶおよびＨＲＶの両方を含む種々のウイルス病原体に使用することができる。

インフルエンザウイルスの分子ウイルス学および逆遺伝学

ピコルナウイルス、ＰＶ、およびＨＲＶと同様に、インフルエンザウイルスはＲＮＡウイルスであるが、その他の点ではＰＶとは無関係であり全く異なる。ピコルナウイルスと対照的に、インフルエンザはマイナス鎖ウイルスである。さらに、インフルエンザは、８９０〜２３４１ヌクレオチドに及ぶ８個の別々の遺伝子断片から成る（ＬａｍｂａｎｄＫｒｕｇ，２００１）。１つにはマイナス鎖組織によって、また１つには８個の別々の遺伝子断片によって、逆遺伝学系はＰＶに対してよりも複雑である。それにもかかわらず、逆遺伝学系は、インフルエンザウイルスのために開発されてきた（Ｅｎａｍｉｅｔａｌ．，１９９０、Ｆｏｄｏｒｅｔａｌ．，１９９９、Ｇａｒｃｉａ−ＳａｓｔｒｅａｎｄＰａｌｅｓｅ，１９９３、Ｈｏｆｆｍａｎｅｔａｌ．，２０００、Ｌｕｙｔｊｅｓｅｔａｌ．，１９８９、Ｎｅｕｍａｎｎｅｔａｌ．，１９９９）。８個の遺伝子断片の各々は、別々のプラスミドから発現される。この逆遺伝学系は、最長の個々の遺伝子断片が３ｋｂ未満であり、したがって合成および操作が容易であるため、本明細書に記載されるＳＡＶＥ戦略での使用に非常に便利である。さらに、異なる遺伝子断片は、単純に異なるプラスミドを混合することによって組み合わせ、および組み換えることができる。したがって、ＳＡＶＥ方法の適用は、ＰＶに対してよりもインフルエンザウイルスに対して、さらに実行可能である可能性がある。

ウイルス逆遺伝学における近年のパラダイムシフトは、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドからの集合による感染性ウイルスゲノムの本発明者らの最初の化学合成で起こった（Ｃｅｌｌｏｅｔａｌ．，２００２）。この達成は、逆遺伝学系が利用可能であるほとんどまたは全てのウイルスが、それらのゲノム配列情報のみから合成することができることを明確にし、所望の要件を満たすためのこれらのウイルスの再合成および改変において、これまでにない柔軟性を保証する。

ウイルスゲノムのデノボ合成

ウイルスゲノムをデノボ設計および合成するために、コンピュータによるアルゴリズムが使用される。本明細書に記載される弱毒化ＰＶの合成で例示される、これらの合成されたゲノムは、野生型（ｗｔ）ウイルスと全く同一のタンパク質をコード化するが、代替同義コドンを使用することによって、コドンバイアス、コドン対バイアス、ＲＮＡ二次構造、および／またはジヌクレオチド含有量を含む種々のパラメータは変化させられる。示されたデータは、しばしばタンパク質の不十分な翻訳によって、これらのコーディング非依存的変化が高度な弱毒化ウイルスを産生することを示す。全てのウイルスの基本的機能、すなわちタンパク質翻訳を標的にすることによって、ワクチン製造に有用な弱毒化ウイルスを予想通りに、安全に、迅速に、かつ安価に産生するための、非常に一般的な方法が開発された。「ＳＡＶＥ」（合成弱毒化ウイルス工学）と呼ばれるこの方法は、新ワクチンの医学的必要性があるＰＶ以外の多種多様のウイルスに適用できる。これらのウイルスは、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳおよび他のコロナウイルス、ＨＩＶ、ＨＣＶ、伝染性気管支炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デング熱ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ＥＢＶ、黄熱病ウイルス；エコーウイルス、コクサッキーウイルス、およびエンテロウイルス７１等の、ポリオウイルス以外のエンテロウイルス；Ａ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス等のアフトウイルス、インフルエンザウイルス等のミクソウイルス、麻疹ウイルス等のパラミクソウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、呼吸器多核体ウイルス；デングウイルス、黄熱病ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、およびダニ媒介性ウイルス等のフラビウイルス；西部および東部ウマ脳炎ウイルス等のアルファウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびウシ下痢症ウイルス、ならびにエボラウイルスを含むがこれらに限定されない。

ＰＶキャプシドコード領域におけるコドンおよびコドンペア脱最適化の両方が、ＰＶ適応度を劇的に減少させることを本明細書に示す。本発明は、同義コドンの置換によるウイルス弱毒化の基礎となるいずれの特定の分子機構にも限定されない。それにもかかわらず、弱毒化ウイルスの産生におけるコドンおよびコドン対脱最適化の基礎的な分子機構をよりよく理解するために、実験は進行中である。特に、コドン脱最適化およびコドン対脱最適化が、非効率的な翻訳をもたらす可能性があることを示唆する証拠が、本願に提供される。迅速な生成および数多くのウイルス構築物のスクリーニングのためのハイスループット方法もまた、開発されている。

大規模ＤＮＡ集合

近年、オリゴヌクレオチド合成のコストの急落および質の増加は、合成オリゴヌクレオチドからＤＮＡの大断片（少なくとも最大で約１０ｋｂ）を集合させることを実用的にしてきた。ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，ＷＡ）等の（および多くの他の）商業ベンダーは、現在、１塩基当たり約＄１．５０という比較的低い価格で、既知の配列の合成ＤＮＡの大断片を合成、集合、クローニング、配列検証、および配達する。したがって、商業サプライヤーからの合成されたウイルスゲノムの購入は、便利かつコスト効率のよい選択肢であり、価格は急激に下がり続けている。さらに、極めて低いコストで非常に大きなＤＮＡ分子を合成し、集合させる新しい方法が現れている（Ｔｉａｎｅｔａｌ．，２００４）。Ｃｈｕｒｃｈｌａｂは、何千ものオリゴヌクレオチドの平行合成（例えば、ＮｉｍｂｌｅｇｅｎＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩまたはＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡから入手可能な、光プログラム可能マイクロフルイディクスチップ上、またはマイクロアレイ上で）、続いて、重複ＰＣＲによるエラー低減および集合を使用する方法を先駆けて開発してきた。これらの方法は、合成巨大ＤＮＡのコストを１塩基当たり１セント未満まで削減する可能性がある。大規模ＤＮＡ合成の効率および正確性の向上、ならびコストの急激な低下は、ＳＡＶＥ戦略の構築および幅広い適用のための推進力を提供する。

代替的コード化、コドンバイアス、およびコドン対バイアス

代替的コード化

所与のペプチドは、数多くの核酸配列によってコード化することができる。例えば、典型的な１０ｍｅｒオリゴペプチドでさえ、約４^１０（約１０^６）個の異なる核酸によってコード化することができ、ＰＶのタンパク質は、約１０^４４２個の異なる核酸によってコード化することができる。自然選択は、これらの考えられる１０^４４２個の核酸のうちの１つを、ＰＶゲノムとして最終的に選択している。一次アミノ酸配列が、所与のｍＲＮＡによってコード化される最も重要なレベルの情報である一方で、異なる種類のＲＮＡ配列において、追加の種類の情報がある。これらには、異なる機能のＲＮＡ構造要素（例えば、ＰＶに対しては、シス作用性複製要素、またはＣＲＥ（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｅｔａｌ．，２０００、ＭｃＫｎｉｇｈｔ，２００３）、翻訳動的シグナル（中止部位、フレームシフト部位等）、ポリアデニル化シグナル、スプライスシグナル、酵素機能（リボザイム）、および恐らく、他のまだ同定されていない情報およびシグナル）が含まれる。

ＣＲＥ等のシグナルを保存しなければならないという注意があるにしても、１０^４４２個の考えられるコード化配列は、同一タンパク質をコード化する能力を保存しながら、ポリオのＲＮＡ配列において劇的な変化をもたらす驚異的な柔軟性を提供する。コドンバイアスもしくはコドン対バイアスにおける変化が可能であり、ＲＮＡにおける核酸シグナルおよび二次構造は、追加または除去することができる。追加または新規タンパク質は、代替フレームにおいて同時にコード化することさえ可能である（例えば、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２００６を参照）。

コドンバイアス

ほとんどのアミノ酸が、いくつかの異なるコドンによってコード化することができる一方で、全てのコドンが同頻度で使用されるとは限らず、「希少」コドンであるコドンもあれば、「高頻度」コドンであるコドンもある。ここで使用される「希少」コドンは、そのアミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンよりも大幅に低い頻度でｍＲＮＡに存在する特定のアミノ酸をコード化する、少なくとも２個の同義コドンのうちの１つである。したがって、希少コドンは、最も頻繁に使用されるコドンよりも２倍低い頻度で存在し得る。好ましくは、希少コドンは、アミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンよりも少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも５倍低い頻度で存在する。反対に、「高頻度」コドンは、そのアミノ酸に対して最低頻度で使用されるコドンよりも大幅に高い頻度でｍＲＮＡに存在する特定のアミノ酸をコード化する、少なくとも２個の同義コドンのうちの１つである。高頻度コドンは、アミノ酸に対して最低頻度で使用されるコドンよりも約２倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも５倍高い頻度で存在し得る。例えば、ヒト遺伝子は、４０％の確率でロイシンコドンＣＴＧを使用するが、たった７％の確率で同義ＣＴＡを使用する（表２を参照）。したがって、ＣＴＧが高頻度コドンである一方で、ＣＴＡは希少コドンである。これらの使用頻度におおむね一致して、ＣＴＧを認識するｔＲＮＡの遺伝子に対して、ゲノム中のコピーが６個ある一方で、ＣＴＡを認識するｔＲＮＡの遺伝子のコピーは２個のみである。同様に、ヒト遺伝子は、セリンに対して高頻度コドンＴＣＴおよびＴＣＣを、それぞれ１８％および２２％の確率で使用するが、希少コドンＴＣＧはたった５％の確率で使用する。ＴＣＴおよびＴＣＣは、ゲノム中のその遺伝子の１０個のコピーを有する、同一ｔＲＮＡによるゆらぎを介して読み取られるが、ＴＣＧは、たった４個のコピーによって読み取られる。非常に活発に翻訳されるｍＲＮＡが、最高頻度コドンのみを使用するために強くバイアスされることはよく知られている。これは、リボソームタンパク質および糖分解酵素の遺伝子を含む。一方で、比較的豊富ではないタンパク質のｍＲＮＡは、希少コドンを使用し得る。

高度に発現された遺伝子が高頻度コドンを使用する傾向は、「コドンバイアス」と呼ばれる。リボソームタンパク質の遺伝子は、６１個のコドンのうちの２０〜２５個の最高頻度コドンを使用し、高いコドンバイアス（１に近いコドンバイアス）を有する可能性があるが、わずかに発現された遺伝子は、６１個のコドン全てを使用し、コドンバイアスをほとんどまたは全く有しない可能性がある（０に近いコドンバイアス）。頻繁に使用されるコドンは、より多くの同族ｔＲＮＡが発現されるコドンであり、これらのコドンの使用は、翻訳がより迅速に、もしくはより正確に、またはその両方で進むことを可能にすることが考えられる。ＰＶキャプシドタンパク質は、非常に活発に翻訳され、高いコドンバイアスを有する。

コドン対バイアス

コード配列の目立った特徴は、それらのコドン対バイアスである。これは、８個の異なるコドン対によってコード化することができるアミノ酸対Ａｌａ−Ｇｌｕを考察することによって説明され得る。個々のコドンの頻度（表２に示される通り）以外の要因が、コドン対の頻度に関与しない場合、８個のコード化の各々の予測頻度は、２個の関連コドンの頻度を乗じることによって計算することができる。例えば、この計算によって、コドン対ＧＣＡ−ＧＡＡは、全てのＡｌａ−Ｇｌｕコード化対の中から、０．０９７の頻度で発生すると予測される（０．２３ｘ０．４２、表２の頻度に基づく）。各コドン対の予測（仮想）頻度をヒトゲノム中で実際に観察される頻度と関連付けるために、合計で１４，７９５個のヒト遺伝子を含有する、常に注釈付きのヒトコード領域のＣｏｎｓｅｎｓｕｓＣＤＳ（ＣＣＤＳ）データベースを使用した。この遺伝子セットは、ヒトコード配列の最も包括的な表現である。この遺伝子セットを使用して、コドンの発生回数を同一アミノ酸に対してコード化する全ての同義コドンの数で割ることによって、コドン使用の頻度を再計算した。予測通り、頻度は、表２に示される頻度等のすでに公開された頻度と密接に相関した。わずかな頻度変化は、８４９４９個のヒトコード配列が計算に含まれる（実際のヒト遺伝子数よりもはるかに多い）、ＫａｚｕｓａＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｏｄｏｎ．ｈｔｍｌ）のコドン使用データベースによって提供されるデータにおける、過剰サンプリング効果による可能性がある。次いで、このように計算したコドン頻度を使用し、最初に２個の関連コドンの頻度を互いに乗じ（表３の予測頻度を参照）、次いでこの結果に、当該コドン対によってコード化されるアミノ酸対が発生する実測頻度（全ＣＣＤＳデータセットにおける）を乗じることによって、予測コドンペア頻度を計算した。コドン対ＧＣＡ−ＧＡＡの例において、この第２の計算は、０．０９８の予測頻度をもたらす（Ｋａｚｕｓａデータベースを使用した第１の計算の０．９７と比較して）。最後に、セット内の各コドン対の発生の総数を数え、それを同一アミノ酸対に対してコード化するセット内の全ての同義コード化対の数で割ることによって、１４，７９５個のヒト遺伝子セットで認められるような実際のコドン対頻度を決定した（表３、実測頻度）。１４，７９５個のヒト遺伝子セットに基づく、３７２１（６１^２）個のコドン対の完全セットの頻度および実測／予測値は、捕捉表１として本明細書で提供される。

コドン対の実測頻度／予測頻度の比率が１よりも大きい場合、コドン対は、過剰に存在すると言える。比率が１よりも小さい場合、過少に存在すると言える。例において、コドン対ＧＣＡ−ＧＡＡが１．６５倍過剰に存在する一方で、コード化対ＧＣＣ−ＧＡＡは、５倍以上過少に存在する。

多くの他のコドン対は非常に強いバイアスを示し、過少に存在する対もあれば、過剰に存在する対もある。例えば、コドン対ＧＣＣＧＡＡ（ＡｌａＧｌｕ）およびＧＡＴＣＴＧ（ＡｓｐＬｅｕ）は、３〜６倍過少に存在するが（好ましい対は、それぞれＧＣＡＧＡＧおよびＧＡＣＣＴＧである）、コドン対ＧＣＣＡＡＧ（ＡｌａＬｙｓ）およびＡＡＴＧＡＡ（ＡｓｎＧｌｕ）は、約２倍過剰に存在する。コドン対バイアスが、アミノ酸の対の頻度とも、個々のコドンの頻度とも無関係であることは、注目すべきである。例えば、過少に存在する対ＧＡＴＣＴＧ（ＡｓｐＬｅｕ）は、最高頻度Ｌｅｕコドン（ＣＴＧ）を使用する。

コドン対バイアスは原核細胞中で発見されたが（Ｇｒｅｖｅｅｔａｌ．，１９８９を参照）、その後ヒトを含む全ての他の検査した種に見られた。効果は、非常に高い統計的有意性を有し、確実に単なるノイズではない。しかしながら、その機能的有意性があるとすれば、それは未解決である。一提案は、ｔＲＮＡには、リボソーム上で集められる時によく相互作用する対もあれば、一方で、十分に相互作用しない対もあることである。異なるコドンは、通常異なるｔＲＮＡによって読み取られるため、コドン対は、不適合ｔＲＮＡの対をまとめることを防ぐために、バイアスされ得る（Ｇｒｅｖｅｅｔａｌ．，１９８９）。別の考えは、多くの（しかし全てではない）過少に存在する対が、中央ＣＧジヌクレオチド（例えば、ＧＣＣＧＡＡ、ＡｌａＧｌｕをコード化する）を有し、ＣＧジヌクレオチドは、哺乳動物において系統的に過少に存在することである（Ｂｕｃｈａｎｅｔａｌ．，２００６、Ｃｕｒｒａｎｅｔａｌ．，１９９５、Ｆｅｄｏｒｏｖｅｔａｌ．，２００２）。したがって、コドン対バイアスの効果は２種類であり得、１つは、哺乳類ゲノム中のＣＧの過少存在の間接的効果であり、もう１つは、翻訳の効率、速度、および／または正確性と関係がある。本発明が、コドン対バイアスの基礎となるいかなる特定の分子機構にも限定されないことが強調される。

以下に詳述するように、コドン対バイアスは、コード配列の全長にわたって平均化される、コード配列中の各コドン対のスコアを考慮に入れる。本発明に従って、コドン対バイアスは、以下の式によって決定される。

したがって、コード配列に対する同様のコドン対バイアスは、例えば、部分列にわたって最小化されたコドン対、またはコード配列の全長にわたってやや減少したコドン対スコアによって得ることができる。

６１個のセンスコドンの全ておよびセンスコドン対の全てを確実に使用することができるため、高頻度コドンの代わりに単一希少コドンを使用する、または高頻度コドン対の代わりに希少コドン対を使用することが、多くの効果を有するとは予測されない。したがって、コドンおよびコドン対バイアスの多くの以前の研究は、実験ではなく情報科学を介して行われてきた。実験研究に基づいたコドン対バイアスの一研究は、Ｉｒｗｉｎｅｔａｌ．（１９９５）の研究であり、Ｉｒｗｉｎは、ある過剰に存在するコドン対が、直感に反して、より遅い翻訳を引き起こしたことを発見した。しかしながら、この結果は、２番目のグループによって再現することができなかった（ＣｈｅｎｇａｎｄＧｏｌｄｍａｎ，２００１）、また、以下に報告する結果と矛盾する。したがって、本結果（以下を参照）は、コドン対バイアスの機能的役割の最初の実験的証拠であり得る。

本明細書に開示されるある実験は、約１０００個のコドンを含む、ＰＶの全キャプシド領域等の再コードし、ゲノム中の少ないコドンバイアスおよび少ないコドン対バイアスの両方を別々に組み込むことに関連する。これらの実験の基礎となる理論的根拠は、各置換が小さい効果を生み出すならば、全ての置換が合わせて大きな効果を生み出すはずであるということである。実際に、脱最適化されたコドンバイアスおよび脱最適化されたコドン対バイアスの両方が、生存しないウイルスを別々に作製するということがわかっている。実施例においてより詳細に考察されるように、予備データは、非効率的な翻訳が、少ないコドンバイアスまたはコドン対バイアスでウイルスの生存性を減少させるための主要な機構であることを示唆する。正確な機構に関係なく、データは、ウイルスゲノムへの脱最適化された同義コドンの大規模置換が、極度の弱毒化ウイルスをもたらすことを示唆する。弱毒化ウイルスを産生するためのこの方法は、ＳＡＶＥ（合成弱毒化ウイルス工学）と呼ばれている。

本発明に従って、コドン対バイアスならびにコドンバイアスの変化によって、ウイルス弱毒化を達成することができる。しかしながら、コドン対バイアスの調整は、特に有利であることが期待される。例えば、コドンバイアスによるウイルスの弱毒化は、概して共通コドンの除去を必要とし、したがって、ヌクレオチド配列の複雑性は低減する。対照的に、コドン対バイアス低減または最小化は、はるかに大きな配列多様性、およびその結果としてより大きな核酸二次構造の制御、アニーリング温度、ならびに他の物理的および生化学的特性を維持しながら達成することができる。本明細書に開示される研究は、コドンがシャッフルされるが、コドン使用プロファイルは変化しない、弱毒化コドン対バイアスが低減または最小化された配列を含む。

当業者似よく知られている方法で、ウイルス弱毒化を確認することができる。限定されない例には、プラークアッセイ、増殖測定、および試験動物における死亡率の減少が含まれる。本願は、弱毒化ウイルスが宿主における防御免疫応答を誘発することが可能であることを立証する。

合成弱毒化ウイルス工学（ＳＡＶＥ）

ＳＡＶＥは、特別に設計されたコンピュータソフトウェア、およびウイルスのゲノムを再コードおよび再合成するための、核酸合成および集合の現代的方法を採用する。この戦略は、有効なワクチンが求められる種々の医学的に重要なウイルスに対するワクチンを産生する、効率的な方法を提供する。

２つの効果的なポリオワクチン、ＪｏｎａｓＳａｌｋによって開発された不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）、およびＡｌｂｅｒｔＳａｂｉｎによって開発された生弱毒化ウイルスを含む経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）は、１９５０年代からそれぞれ入手可能である。実際に、灰白髄炎の根絶への世界的な取り組みが１９８８年に始まり、ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）が主導し、世界中のほとんどの国からのポリオの根絶に成功した。年間の診断症例数は、２００５年には数十万から２０００件未満に減少し、インドおよびナイジェリアで主に発生している。しかしながら、ＯＰＶの幅広い利用に関する問題は、それが病原型に戻る可能性があることであり、まれな事象と考えられるが、ワクチン由来のポリオの発生が報告されている（Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕｅｔａｌ．，１９９７、Ｋｅｗｅｔａｌ．，２００２、Ｓｈｉｍｉｚｕｅｔａｌ．，２００４）。実際に、生ポリオウイルスワクチン株を使用する限り、各々は７個未満の弱毒突然変異を保因し、この株がｗｔに戻る可能性があり、そのような復帰は、ポリオの完全な根絶に深刻な脅威を与える。したがって、ＷＨＯは、ポリオ根絶におけるその取り組みの終盤において、復帰の可能性を防ぐ新しいポリオワクチンが十分に必要であり得、これは、ＰＶへのＳＡＶＥの適用に関する本明細書に開示される研究の一理論的根拠を提供する。しかしながら、主にＰＶはＳＡＶＥを開発するための優れたモデル系であるという理由から、ＰＶを選択した。

再コード中、ウイルスゲノム中の必須核酸シグナルは保存されるが、タンパク質翻訳の効率は、コドンバイアス、コドン対バイアス、ならびにＲＮＡ二次構造、およびＣｐＧジヌクレオチド含有量、Ｃ＋Ｇ含有量、翻訳フレームシフト部位、翻訳中止部位、またはそれらの任意の組み合わせ等の他のパラメータを脱最適化することによって、系統的に減少する。この脱最適化は、何百または何千もの変化を伴う可能性があり、各々は小さい効果を有する。概して、脱最適化は、ウイルスが一部の細胞株（特定のウイルスに対して許容性を有するように特に操作された株を含む）でなおも増殖することができるが、ウイルスが正常動物またはヒトにおいて非病原性である時点まで実施される。そのような非病原性ウイルスは、完全毒性ウイルスと全く同一のタンパク質をコード化し、したがって、完全毒性ウイルスと全く同一の免疫応答を誘発するため、死菌または生ワクチンのいずれにも優れた候補である。加えて、ＳＡＶＥプロセスは、弱毒化レベルの微調整に対する可能性を提供する。すなわち、それは、ほぼ予測可能な程度まで脱最適化された合成ウイルスを設計する能力を提供する。ウイルス粒子の設計、合成、および産生は、一度ゲノム配列が既知になると、数週間の期間で達成可能であり、潜在的な緊急事態におけるワクチンの産生の重要な利点を有する。さらに、弱毒化ウイルスは、非常の数多くの有害なヌクレオチド変化が伴うため、毒性に戻る可能性は実質的にないと予測される。この方法は、概して多様なウイルスに適用でき、いずれの特定のウイルスに対するウイルスゲノム配列および逆遺伝学系の知識のみを必要とする。

コドンバイアスの脱最適化によるウイルス弱毒化

上記の対照細胞／試験細胞のＩＣ_５０比の方法を使用する場合、１以下のＣＳＧ値を有する化合物は、概して、よい臨床候補化合物とはみなされないが、約１０よりも大きなＣＳＧ値を有する化合物は、非常に有望であり、さらに考察する価値がある。

弱毒化ウイルスを操作する手段として、同義コドン使用を変化させることによって、ポリオウイルス１型Ｍａｈｏｎｅｙ［ＰＶ（Ｍ）］のキャプシドコード領域を再操作した。キャプシド領域は、ウイルス約３分の１を成し、非常に活発に翻訳される。可能な限り多い数の頻繁に使用されるコドンを希少同義コドンで置換することによって、非常に低いコドンバイアスを有する、１つの変異ウイルス（ウイルスＰＶ−ＡＢ）を作製した。対照として、元のコドンバイアスを維持しながら可能な限り多い数の同義コドン変化を有する、別のウイルス（ＰＶ−ＳＤ）を作製した。図１および２を参照されたい。したがって、ＰＶ−ＳＤは、ｗｔと本質的に同一のコドンを有するウイルスであるが、それれらはシャッフルされた位置にあって、その一方全く同一のタンパク質をコード化する。ＰＶ−ＳＤにおいて、シャッフル方法によってコドン対バイアスを増加または減少させようとする試みはなかった。実施例１を参照されたい。キャプシドコード領域における９３４個のヌクレオチドの変化にもかかわらず、ＰＶ−ＳＤＲＮＡは、ｗｔと区別できない特性を有するウイルスを産生した。対照的に、６８０個のサイレント変異を保因するＰＶ−ＡＢからは、生存ウイルスは回収されなかった。実施例２を参照されたい。

ＰＶ−ＡＢの生存不能に関しては、ヌクレオチド変化のうちの１つのみが、何らかの形で致死的であり、他の６７９個は無害であるということによりわずかに説明される。例えば、ヌクレオチド変化は、複製の阻害等のある破壊的だが認められていない理由で致死的であり得る。しかしんながら、この説明は疑わしい。ＰＶは、ＣＲＥ等、そのＲＮＡにおける重要な調節要素を含有しないが、そのような要素は、キャプシドコード領域内に存在しないことが知られている。これは、もちろん、ウイルス粒子を形成することはできないが、全キャプシドコード領域が、細胞中の残存ゲノムの正常な複製に影響を与えることなく削除することができるという証明によって裏付けられる（ＫａｐｌａｎａｎｄＲａｃａｍｉｅｌｌｏ，１９８８）。

ある再操作されたウイルスの生存不能に関する問題に対処するために、ウイルスＰＶ−ＡＢのキャプシド領域のサブ断片を野生型ウイルスにサブクローン化した。実施例１および図３を参照されたい。大きなサブクローン化された断片（非重複断片を含む）の組み込みは、致死性であることが認められ、その一方小さいサブクローン化された断片は、生存する（１つの例外を除いて）が健康でないウイルスを産生した。「健康でないこと」は、多くのアッセイから明白であり、例えば、少ないコドンバイアスの断片は、少ない力価（図３Ｂ）および小さいプラーク（図３Ｃ〜Ｈ）をもたらす。概して、大きな致死性断片が２個のサブ断片に分割され、それらの両方は生存するが健康でないことは、特に有益である。これらの結果は、生存不能が１つの変化のみによるものであるという仮説を除外し、代わりに、少なくとも、多くの変化が表現型に寄与しているはずである。

位置１５１３〜２４７０に特別な断片がある。この断片は極めて小さいが、ＰＶゲノム中のその包含は、生存不能を引き起こす。このフラグメントが、単に疾病を引き起こすだけで、ウイルスを不活性化しないサブフラグメントに細分することができるかどうかは、現在知られていない。この断片は、非常に有害な変化、場合によっては翻訳フレームシフト部位を含有しないことが考えられる。

少ないコドンバイアスは、編訳への効果を自然と示すため、ウイルスＰＶ−ＡＢによってコード化されるタンパク質の翻訳を試験した。実施例５および図５を参照されたい。実際に、全ての健康ではないウイルスは、キャプシドタンパク質をあまり翻訳しなかった（図５Ｂ）。翻訳は、健康ではないことの原因となっている不十分な翻訳と一致して、より健康ではないウイルスにおいてあまり効率的ではなかった。翻訳は、制限している希少コドンの認識速度と一致して、過剰ｔＲＮＡおよびアミノ酸が添加された反応において、本質的にｗｔレベルまで改善された（図５Ａ）。

脱最適化されたコドンバイアスが非効率的な翻訳を引き起こしていたかどうかの第２の試験として、ｗｔおよび脱最適化キャプシドの一部を、ジシストロニックレポータ構築物におけるホタルルシフェラーゼのＮ末端に融合させた。実施例５および図６を参照されたい。これらの融合構築物において、ルシフェラーゼの翻訳は、Ｎ末端で融合したキャプシドタンパク質によって決まる。この場合もやはり、脱最適化されたコドンでのキャプシドタンパク質の翻訳は不十分であり、より健康ではないウイルスにおいて悪化したことがわかり、因果関係を示唆する。したがって、データは、ＰＶ−ＡＢウイルス中の何百もの希少コドンが、主に不十分な翻訳によって生存不能を引き起こすことを示唆する。さらに、生体外に見られる不十分な翻訳および培養細胞に見られるウイルス疾病もまた、動物の感染に反映される。最も衰弱していない脱最適化ウイルスのうちの１つ、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}に対してでさえ、マウスにおける疾病を引き起こすために必要とされるウイルス粒子の数は、約１００倍増加した。実施例４、表４を参照されたい。

Ｂｕｒｎｓｅｔａｌ．（２００６）は、ＰＶのサビン２型ワクチン株を用いたいくつかの同様の実験を最近記載し、同様の結論に達した。Ｂｕｒｎｓｅｔａｌ．は、完全に異なるコドン脱最適化ウイルスを合成し（すなわち、本明細書に記載されるＰＶ−ＡＢウイルスのヌクレオチド配列と、それらの「ａｂｃｄ」ウイルスは非常に異なる）、それにもかかわらず、同様のアッセイを使用して、同様の程度の衰弱を得た。Ｂｕｒｎｓｅｔａｌ．は、弱毒化に対する宿主生物におけるそれらのウイルス構築物を試験しなかった。しかしながら、それらの結果は、ＳＡＶＥが予測可能であり、結果が、正確なヌクレオチド配列にあまり左右されないという考えを立証する。

コドン対バイアスの脱最適化によるウイルス弱毒化

本発明に従って、コドン対バイアスは、コドン使用とは無関係に変化させることができる。例えば、当該のタンパク質コード化配列において、コドン対バイアスは、単にそのコドンの指示された再編成によって変化させることができる。特に、宿主生物において異なる頻度である可能性がある、親配列に生じるのと同一コドンは、変化した配列で使用されるが、異なる位置である。最も単純な形において、親配列におけるのと同一コドンが使用されるため、考察されているタンパク質コード領域でのコドン使用は変化しないままである（コード化したアミノ酸配列と同様）。それにもかかわらず、あるコドンは、新しい状況で生じ、すなわち、親配列にあるものと同一のアミノ酸をコード化するコドンが先行する、および／または後に続くが、異なるヌクレオチドトリプレットを採用する。理想的には、コドンの再編成は、親配列にあるコドン対よりも頻繁ではないコドン対をもたらす。実際には、コドンの再編成は、しばしば、１つの位置においてあまり高頻度でないコドン対、および第２の位置においてより頻繁な対をもたらす。コドンの慎重な再編成によって、コード配列の所与の長さにわたるコドン対使用バイアスは、親配列に比して減少させることができる。あるいは、親配列においてよりも、宿主においてより頻繁なコドン対を使用する配列を産生するために、コドンを再編成し得る。

本明細書に開示されるように、各コドン対を順に考察し、コドン対が宿主のタンパク質コード配列中に認められる頻度に従って各対をスコアリングし、次いで、配列に対するコドン対バイアスを決定することによって、コドン対バイアスは評価される。同一コドン対バイアスを有する多くの異なる配列を作製することができることは、十分に理解される。また、コドン対バイアスは、コドンが再編成される方法に応じて、異なる程度で変化させることができる。コード配列のコドン対バイアスは、全コード配列を再コード化することによって、または１つ以上の部分列を再コード化することによって変化させることができる。ここで使用される「コドン対バイアス」は、配列の一部のみが変異する可能性があるが、コード配列の長さにわたって評価される。コドン対は宿主生物のコドン使用に照らしてスコアリングされるため、コドン対バイアス値は、野生型ウイルス配列および変異ウイルス配列に割り当てることができる。本発明に従って、ウイルスは、ウイルスのタンパク質コード化配列の全部または一部を再コード化することによって弱毒化し、そのコドン対バイアスを減少させることができる。

本発明に従って、コドン対バイアスは、宿主のコドン対使用から決定される定量的特性である。したがって、絶対コドン対バイアス値は、いずれの所与のウイルスタンパク質コード配列に対しても決定され得る。あるいは、脱最適化されたウイルスタンパク質コード配列を、それが由来する「親」配列に関連付ける、コドン対バイアス値の相対的変化を決定することができる。ウイルスは種々の種類で現れ（すなわち、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ分類によるＩ〜ＶＩＩ型）、異なるウイルスの自然（すなわち、毒性）単離株は、絶対コドン対バイアスの異なる値を得るため、通常、弱毒化の所望のレベルの決定に対してより関連深いのは、コドン対バイアスにおける相対変化である。したがって、本発明は、弱毒化ウイルスおよび弱毒化ウイルスを製造する方法を提供し、弱毒化ウイルスは、１つ以上のタンパク質コード化ヌクレオチド配列が、変異によって減少したコドン対バイアスを有する、ウイルスゲノムを含む。単一タンパク質（すなわち、ポリタンパク質）のみをコード化するウイルスにおいて、ポリタンパク質の全部または一部は、コドン対バイアスを減少させるために、所望の程度まで変異することができ、変異配列の全部または一部は、組み換えウイルス構築物において提供することができる。複数のタンパク質を別々にコード化するウイルスに対して、タンパク質コード化配列の全てのコドン対バイアスを同時に減少させるか、またはタンパク質コード化配列の１つのみもしくは数個を改変のために選択することができる。コドン対バイアスの減少は、タンパク質コード化配列の長さにわたって決定され、少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、または少なくとも約０．１５、または少なくとも約０．２、または少なくとも約０．３、または少なくとも約０．４である。ウイルスに依存して、絶対コドン対バイアスは、宿のコドン対使用に基づいて、約−０．０５以下、または約-０．１以下、または約−０．１５以下、または約−０．２以下、または約−０．３以下、または約−０．４以下であることができる。

コドン対バイアスを他の配列多様性に重ね合わせることができることは明らかである。例えば、コード配列は、１つ以上のアミノ酸変化を有するタンパク質またはポリペプチドをコード化するため、および改変コドン対バイアスを有するために変化させることができる。また、場合によっては、コドンバイアスが減少したタンパク質コード化配列において、親タンパク質コード化配列にあるものと全く同一のコドン使用プロファイルを維持するために、コドンをシャッフルすることができる。この方法は、コドン対バイアス変化の力を強調するがそれのみを用いる必要はない。あるいは、コドン選択は、コード配列におけるコドン使用の全体の変化をもたらすことができる。この関連で、本明細書に提供されるある実施例において（例えば、ＰＶ−Ｍｉｎの設計）、コドン対バイアスが最小化された配列を生成するプロセスにおいて、コドン使用プロファイルが変化しないとしても、その配列の一部が未変異配列にサブクローン化された場合（例えば、ＰＶ−ＭｉｎＸＹまたはＰＶ−ＭｉｎＺ）、サブクローン化した部分にわたる、かつ産生されるハイブリッドにおけるコドン使用プロファイルは、元の未変異タンパク質コード配列のプロファイルと一致しないことに留意されたい。しかしながら、コドン使用プロファイルのこれらの変化は、わずかなコドン対バイアスの効果しか有さない。

同様に、１つまたは多くのアミノ酸置換でタンパク質またはポリペプチドをコード化するために、単独でヌクレオチド配列を変化させることも、それ自体、コドン対バイアスの有意な変化を有する配列を産生する可能性が非常に低いことに留意されたい。したがって、コドン対バイアス改変は、変異アミノ酸配列をコード化するためにさらに改変されたヌクレオチド配列中でさえ、認識することができる。それ自体でコドンバイアスを増加させるように意図される変異は、コドン対バイアスに対して小さい効果しか有しない可能性があることも注目すべきである。例えば、本明細書に開示されるように、非優先コドン（ＰＶ−ＡＢ）の使用を最大化するために再コード化される、ポリオウイルス変異体に対するコドン対バイアスは、約０．０５のみ野生型（ＰＶ−１（Ｍ））から減少する。また、そのようなタンパク質コード化配列は、大きく減少した配列多様性を有することも注目すべきである。それとは反対に、かなりの配列多様性が、本発明のコドン対バイアスが改変された配列中で維持される。さらに、希少コドンの使用を増加させることなく得られるコドン対バイアスの大幅な減少は、ＰＶ−ＡＢにあるような非優先コドンの使用の最大化の代わりに、コドン対バイアスをより効果的に減少させるために、十分な数の好ましいコドンで非優先コドンを再編成することが有益であることを示唆する。

全部または一部が変異可能かどうかにかかわらず、タンパク質コード化核酸の長さ、およびコドン対バイアスの所望の減少に応じて、変異の程度および強度は変化させることができる。本発明の一実施形態では、タンパク質コード化配列は、少なくとも約１００ヌクレオチド、または少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチド、または少なくとも約５００ヌクレオチド、または少なくとも約１０００ヌクレオチドの長さにわたって改変される。

上記のように、「親」ウイルスまたは「親」タンパク質コード化配列という用語は、程度の差はあるが弱毒化され得る配列が由来する、ウイルスゲノムおよびタンパク質コード化配列を指すために本明細書に使用される。したがって、親ウイルスは、「野生型」もしくは「自然発生的」な原型、または単離株もしくは変異体、または実際の、もしくは認識された望ましい特性に基づいて、特に作製または選択される突然変異体であることができる。

デノボＤＮＡ合成を使用して、ＰＶ（Ｍ）のキャプシドコード領域（ヌクレオチド７５５〜ヌクレオチド３３８５のＰ１領域）を再設計し、野生型ウイルスのコドンバイアスを保存しながら、可能な限り多い数のほとんど使用されないコドン対（ウイルスＰＶ−Ｍｉｎ）（配列番号４）、または可能な限り多い数の頻繁に使用されるコドン対（ウイルスＰＶ−Ｍａｘ）（配列番号５）を導入した。実施例７を参照されたい。すなわち、設計された配列は、親配列と同一のコドンを使用するが、それらは異なる順で現れる。ＰＶ−Ｍａｘウイルスは、野生型ウイルスと本質的に同一の一段増殖速度および感染細胞の殺滅を示した（増殖速度が、野生型と比較して、コドン対が最大化されたウイルスに対して増加していないことは、他のウイルスにも当てはまると思われる）。反対に、ＰＶ−Ｍｉｎ変異体ＲＮＡが導入された細胞は殺滅されず、生存ウイルスを回収することができなかった。ＰＶ−Ｍｉｎのキャプシド領域のフラグメント（ＰＶ−Ｍｉｎ^{７５５−２４７０}、ＰＶ−Ｍｉｎ^{２４７０−３３８６}）のｗｔ背景へのサブクローニングは、非常に衰弱しているが死滅していないウイルスを産生した。実施例７および図８を参照されたい。この結果は、有害なコドン変化が好ましくは広く分布するという仮説を立証し、全配列およびウイルス産物の弱毒化に対するコドン対バイアスを変化させるために、野生型親ウイルスゲノムへと置換されるコドン対脱最適化配列の程度を変化させることの単純性および有効性を証明する。ＰＶ−ＡＢウイルスでわかるように、ＰＶ−Ｍｉｎウイルスの表現型は、子孫ウイルスの低い産生の結果よりも、ウイルス粒子の特異的感染の減少の結果である。

脱最適化されたコドン対バイアスを有するウイルスは、弱毒化される。以下に例示されるように（実施例８および表５を参照）、ＣＤ１５５ｔｇマウスは、野生型ウイルスに対して致死的な量よりも約１０００倍高い量の弱毒化ウイルスの脳内接種による抗原投与で生存した。これらの所見は、ウイルスの致死性を最小化するための、コドン対バイアスの脱最適化の力を証明する。さらに、ウイルスの生存性は、コドン対バイアス脱最適化の程度を選択することによって、感染性の減少とのバランスを取ることができる。さらに、一度、所望の弱毒化特性を提供するコドン対バイアス脱最適化の程度または程度の範囲が決定されると、コドン対バイアスのその程度に達するために、追加の配列を設計することができる。例えば、配列番号６は、約−０．２のコドン対バイアス、およびＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺの変異部分を包含する領域にわたって分布する変異（すなわち、ＰＶ^{７５５−３３８５}）を有するポリオウイルス配列を提供する。

配列設計のためのアルゴリズム

本発明者らは、同時に所与のアミノ酸配列に対してコードしながら、特定の所望の特性に対してＤＮＡ配列を最適化する遺伝子設計のための、いくつかの新規アルゴリズムを開発した。特に、配列中の所望のＲＮＡ二次構造を最大化または最小化するためのアルゴリズム（ＣｏｈｅｎａｎｄＳｋｉｅｎａ，２００３）、ならびに特定のパターンのセットを最大限に追加および／または除去するためのアルゴリズム（Ｓｋｉｅｎａ，２００１）が、開発された。前者の課題は、生存ウイルスの設計において生じ、後者は、技術的な理由から制限部位を最適に挿入するために有用である。代替リーディングフレームにおいて２個以上の遺伝子を同時にコード化する、重複遺伝子を設計することができる程度もまた、研究されてきた（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２００６）。単一核酸の異なるリーディングフレームにおいてコード化されている、異なる機能性ポリペプチドのこの特性は、ウイルスによく見られ、抗生物質抵抗性遺伝子におけるウィービング等の技術的な目的で活用することができる。

合成生物学のための第１世代の設計ツールは、Ｊａｙａｒａｊｅｔａｌ．（２００５）およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎｅｔａｌ．（２００６）によって記載されるように構築されてきた。これらは、生物学的活性のための配列を最適化する代わりに、製造可能性のための設計を最適化することに主に重点を置いている（すなわち、局所的二次構造および末端反復のないオリゴヌクレオチド）。これらの第１世代のツールは、高次設計原理を裏付ける代わりに、設計規則検査を中心に構築された初期のＶＬＳＩＣＡＤツールの類似とみることもできる。

本明細書に例示されるように、いかなるコード領域のコドン対バイアスをも操作するために、コンピュータによるアルゴリズムを使用することができる。アルゴリズムは、既存コドンをシャッフルし、得られるＣＰＢを評価し、次いで配列を再シャッフルし、任意に特に「有用」なコドン対を固定する能力を有する。アルゴリズムはまた、極小値から抜け出せなくならないように、多くの「シミュレーテッドアニーリング」を採用する。ＲＮＡの折り畳みの自由エネルギー等の他のパラメータは、望ましくない二次構造の生成を防止するために、任意にアルゴリズムの制御下置くことができる。アルゴリズムは、最小コドン対バイアスを有する配列を見つけるために使用することができ、そのような配列が生存ウイルスをもたらさない場合、アルゴリズムは、減少したが最小化されていないバイアスを有する配列を見つけるために、調整することができる。もちろん、生存ウイルス配列もまた、コンピュータで最小化された配列の部分列のみを使用して産生し得る。

コンピュータを用いて実行されるかどうかにかかわらず、例えば、勾配降下、もしくはシミュレーテッドアニーリング、または他の最小化ルーチンを使用する。開始配列中に存在するコドンを再編成する方法の実施例は、以下のステップによって表すことができる。
１）野生型ウイルスゲノム配列を得る。
２）弱毒化設計のための標的にタンパク質コード配列を選択する。
３）非コード機能を有する既知の、または推測されたＤＮＡ断片を固定する。
４）再設計されたタンパク質中の残存アミノ酸に対する、所望のコドン分布を選択する。
５）固定されていないコドン位置のランダムシャッフルを行い、コドンペアスコアを計算する。
６）任意にシミュレーテッドアニーリング方法を採用し、コドンペアスコアをさらに減少（または増加）させる。
７）過剰な二次構造および不要な制限部位に対して得られる設計を検査し、
はいの場合→ステップ（５）に進むか、または問題のある領域を野生型配列で置換することによって、設計を修正し、ステップ（８）に進む。
８．ウイルス設計に対応するＤＮＡ配列を合成する。
９．ウイルス構築物を作製し、発現を評価する。
弱毒化され過ぎている場合、サブクローン構築物を調製し、９に進む。
弱毒化が不十分である場合、２に進む。

コンピュータによるシミュレーテッドアニーリングルーチンのソースコード（ＰＥＲＬスクリプト）が提供される。

あるいは、コドンがタンパク質コード化配列中の他の場所から交換されるという要件なしで、コドン対を選択することによって、アミノ酸の各対が脱最適化されることを可能にする方法を考案することができる。

ウイルス弱毒化の分子機構：ハイスループット方法を使用した弱毒化ＰＶの特性化

上記のように、かつ実施例においてより詳細に記載されるように、野生型ウイルスと全く同一のタンパク質をコード化するが、改変コドンバイアスまたは改変コドン対バイアスを有する、２個の合成弱毒化ポリオウイルスを構築した。一方のウイルスは、脱最適化されたコドンを使用し、もう一方のウイルスは、脱最適化されたコドン対を使用する。各ウイルスは、ｗｔウイルスに対して数百のヌクレオチド変化を有する。

本明細書に示されるデータは、これらのウイルスが不十分な翻訳によって弱毒化されることを示唆する。この所見は、正しければ、重要な因果関係を有する。最初に、各ウイルスの適応度／毒性の減少は、ゲノムにわたって広がる何百もの位置における小欠損が原因である。したがって、ウイルスが野生型に戻る可能性は本質的にないため、ウイルスは生または死菌ワクチンのいずれに対しても良好な開始点である。第２に、適応度/毒性の減少が、翻訳における何百もの小欠損の相加的効果が原因である場合、復帰のリスクを最小限に抑えて適応度を減少させるこの方法は、多くの他のウイルスに適用できるはずである。

本発明は、いずれの特定の操作方法または基本的な分子機構にも限定されないということが強調されているが、進行中の研究は、これらの対立仮説を区別することを目的としている。進行中の研究は、コドンおよびコドン対脱最適化されたポリオウイルス、ならびにインフルエンザウイルス等の種々の弱毒化ウイルス設計のゲノムを通してスキャンするための、および各変異ウイルスの重複３００−ｂｐ部分をｗｔ背景に置くことによって、キメラを構築するためのハイスループット方法の使用を含む。実施例１１を参照されたい。これらのキメラウイルスの機能が次いで分析される。本明細書に開示される予備データによって示唆されるように、ほとんどのキメラが、野生型よりも大幅にではなくわずかに適応していないという所見は、多くの有害な変異が、キメラが覆う領域全体にわたって分布するという「機能の漸進的低下」仮説を裏付ける。反対に、１個またはほんの数個のキメラが親突然変異体と同様に弱毒化される一方で、キメラのほとんどがｗｔと同様または同一であるという所見は、変異が弱毒化を引き起こす配列中の位置は比較的少なく、それらの位置における弱毒化は有意であることを示唆する。

実施例１２に記載されるように、コドンおよびコドンペア脱最適化が、ＲＮＡ安定性および存在度にどのように影響を及ぼすかを決定するために、および再操作されたウイルスゲノムの翻訳を損なうパラメータを特定するために実験が行われる。この障害の分子基礎の理解は、幅広いウイルスへのＳＡＶＥ方法の適用性をさらに高める。翻訳障害の基礎となる別の考えられる機構は翻訳フレームシフトであり、そこではリボソームが、異なるリーディングフレームを翻訳し始め、インフレーム終止コドンに遭遇するまで、偽性の典型的に切断されたポリペプチドを生成する。残基１５１３〜２４７０からのＡＢ変異体断片を有するＰＶゲノムは、生存不可能なだけでなく、約４２〜４４ｋＤａの生体外翻訳中に新規タンパク質バンドを産生する（図５Ａを参照）。ＰＶを不活性化するこのＡＢ^{１５１３−２４７０}フラグメントの能力、および新規タンパク質の産生を誘発するその能力は、フレームシフト事象の発生を反映し得、この可能性もまた研究されている。フレームシフト部位の導入を防ぐためのフィルタが、ＳＡＶＥ設計ソフトウェアに組み込まれている。

実施例１２に記載されるように、ポリソームプロファイリング、先端プリント化、および融合タンパク質のルシフェラーゼアッセイを含むがこれらに限定されない、種々の技術を使用して、翻訳欠損のより詳細にわたる研究が行われる。

ポリオウイルスの分子生物学

ＳＡＶＥによって、ウイルス弱毒化の基礎となる機構を解明するための研究が進行中であるが、ＰＶキャプシドコード領域の大規模コドン脱最適化は、ＰＶ自体の生態に関する興味深い見解を明らかにした。何がウイルスのＰＦＵ／粒子の比（特異的感染）を決定するのかは、長年の疑問であった。概して、増殖感染の確立前の感染ライフサイクル中のいずれのステップにおける失敗も、不稔感染をもたらし、したがって、感染粒子の消滅をもたらす。ＰＶの場合、培養細胞における１つの感染事象を引き起こすために、約１００個のビリオンが必要とされることが示されている（ＪｏｋｌｉｋａｎｄＤａｒｎｅｌｌ，１９６１、ＳｃｈｗｅｒｄｔａｎｄＦｏｇｈ，１９５７）。すなわち、接種された１００個の粒子のうち、約１個のみが、受容体結合（ステップ１）、続いて、内在化および脱殻（ステップ２）、ゲノム翻訳の開始（ステップ３）、ポリタンパク質翻訳（ステップ４）、ＲＮＡ複製（ステップ５）、ならびに子孫のキャプシド形成（ステップ６）のレベルで、全てのステップを成功裏に完了する可能性がある。

本明細書に記載されるＡＢ型ウイルスの感染サイクルにおいて、ステップ１および２は、それらのキャプシドが同一であるため、ＰＶ（Ｍ）感染と同一であるはずである。同様に、同一の５’非翻訳領域は、翻訳複合体の集合において同様に十分に機能するはずである（ステップ３）。一方で、ウイルスポリタンパク質翻訳（ステップ４）は、キャプシド領域における多数の準最適同義コドンの導入によって大幅に弱められる（図５および６）。翻訳機構による希少コドンの遭遇の反復は、質量作用の法則によって、希少アミノアシルｔＲＮＡが、リボソーム上の部位Ａに拡散するのにより長くかかるため、リボソームの失速を引き起こすと考えられる。ペプチド伸長が、大体において利用可能なアミノアシルｔＲＮＡの濃度によって促進されるため、ｍＲＮＡの多くの希少ｔＲＮＡへの依存は、必然的に翻訳時間を長くする（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎｅｔａｌ．，２００４）。あるいは、リボソームの過剰失速は、ＲＮＡからの翻訳複合体の早期解離を引き起こし、分解の対象とされている、切断されたタンパク質をもたらす可能性がある。両方のプロセスは、単位時間当たりの、１ｍＲＮＡ分子当たりのタンパク質合成速度の低下をもたらす。本明細書に示されるデータは、コドン脱最適化ウイルスの表現型がゲノム翻訳の速度によって決定されることを示唆しているが、他の機構的説明も考えられる。例えば、Ａ型肝炎ウイルス中のウイルスキャプシド配列全体にわたる希少同義コドンの保存位置は、必要な翻訳中止を導入することによる新生ポリペプチドの適切な折り畳みに対して、機能的に重要であることが示唆されている（Ｓａｎｃｈｅｚｅｔａｌ．，２００３）。したがって、コドン組成の大規模改変は、これらの中止部位の一部を変化させる可能性があり、ミスフォールドしたキャプシドタンパク質の増加をもたらし得る。

これらの考察がＰＶキャプシドにも適用するかどうかは明らかではない。そうであるなら、ｗｔコドンは保存されたが、キャプシド全体にわたるそれらの位置は、完全に変化している、変化した表現型がＰＶ−ＳＤ設計で予測されたであろう。すなわち、中止部位と言われているうちの１つも、タンパク質配列に対して適切な位置にないであろう。しかしながら、表現型において何の変化も認められず、ＰＶ−ＳＤは、野生型レベルにおいて翻訳および複製した（図３Ｂ）。

別の可能性は、試験された設計における大規模コドン変化が、安定した二次構造等の偶発的な優性阻害ＲＮＡ要素、またはゲノムの他の領域との破壊的な長距離相互作用を受け得る配列を作製し得ることである。

ウイルス脱殻前、およびウイルス脱殻を含む全てのステップは、本明細書に記載されるｗｔおよび変異ウイルスが比較される際に変化していないはずであると考えられる。これは、全てのこれらの単離株の暗黒期が同様であるという観察結果によって裏付けられる（図３Ｂ）。したがって、ＰＦＵ／粒子の比の劇的な減少は、脱最適化されたゲノムの翻訳能の減少の結果である可能性が高く、すなわち、変異ウイルスの障害は、細胞内で決定される。

概して、１／１００〜１／１，０００のピコルナウイルスの比較的低いＰＦＵ／粒子の比（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ，１９８５）は、細胞侵入レベル前あるいは細胞侵入レベルでの受容体結合ステップにおける構造変化によって主に決定されると考えられる。ほとんど感染性ではない１３５Ｓ粒子の形成は、ポリオウイルス感染性の非効率性の主な原因であり得る（Ｈｏｇｌｅ，２００２）。しかしながら、あるウイルス突然変異体は、より高い特異的感染性をもたらすことなく、粒子変換を回避するように思われ、観察結果は、他の侵入後機構が低いＰＦＵ／粒子の比に関与している可能性があることを示唆する（ＤｏｖｅａｎｄＲａｃａｎｉｅｌｌｏ，１９９７）。

本データは、ウイルスと細胞との間のそのような侵入後の相互作用の明確な証拠を示し、侵入前事象ではなく、これらが、ポリオウイルスの明確なＰＦＵ／粒子の比に寄与することを示唆する。ポリオウイルス中の全ての複製タンパク質が、ポリタンパク質上のＰ１の下流に位置するため、それらは、決定的に、Ｐ１翻訳がうまく完了することに依存する。したがって、Ｐ１翻訳の速度の低下は、全ての複製タンパク質の翻訳を同一の程度まで低下させる。次に、これは、宿主細胞翻訳の停止または宿主細胞の生得的反応等の、増殖感染の確立に必要とされる、宿主細胞への必要な改変を行う、ウイルスの能力の低下をもたらす可能性が高い。本明細書に記載されるようなコドン脱最適化が、ペプチド伸長ステップにおいて翻訳をもたらす可能性が高い一方で、翻訳の開始の減少はまた、ポリオウイルスのサビンワクチン株中の内部リボソーム侵入部位における変異に対して示されてきたように、強力な弱毒化の決定要因である可能性もある（Ｓｖｉｔｋｉｎｅｔａｌ．，１９９３、１９８５）。

これらの考察に基づいて、ゲノム翻訳の欠損または早期ゲノム複製に起因する多くの突然変異表現型は、実際にはＰＦＵ／粒子の比を低下させることによって現れることが予測される。これは、欠損が不稔感染の可能性の増加をもたらす限りみられる。ほとんど全ての研究において、遍在プラークアッセイは、最適なウイルス検出方法であるため、明らかなウイルス力価の減少は、しばしば、ウイルス産生それ自体の減少と同等とみなされる。これは、単細胞レベルでウイルス特性を特性化する困難さによって正当化することができる、内在する危険であり得る。代わりに、ほとんどのアッセイは、数多くの細胞に対して行われる。選択された試験のより低い計測値（ＰＦＵで測定されるタンパク質合成、ＲＮＡ複製、ウイルス産生）は、ウイルスを産生する細胞数が減少する一方で、細胞中のウイルス産生は正常であり得るということを考慮せず、１細胞当たりのより低い産生の指標として、そのままの値で取られる。

コドン脱最適化ウイルスによる１細胞当たりの粒子のほぼ同一の産生は、タンパク質産生の速度が大幅に低下した一方で、長期間の後に産生されるタンパク質の合計が大幅には影響されていないことを示す。これは、ＣＰＥの遅延出現にも反映され、同様の細胞内ウイルスのタンパク質濃度を増加させるために、ウイルスがさらなるＲＮＡ複製サイクルを経験しなければならないという表示であり得る。入ってくる感染ゲノムの初期翻訳速度が低下するため、コドン脱最適化ウイルスが、増殖感染の確立において大きな障害を有するように思われる。この翻訳速度の低下の結果として、細胞の抗ウイルス応答を不可能にする上で必須のＰＶタンパク質（プロテイナーゼ２Ａ^ｐｒｏおよび３Ｃ^ｐｒｏである可能性がもっとも高い）は、十分速くライフサイクル中のこの重大な障害を克服するのに十分な量で、合成されない。したがって、ウイルス複製が展開し細胞を支配し得る前に、細胞が感染を除去する可能性が高い。したがって、増殖感染事象の可能性は減少し、不稔感染の速度は増加する。しかしながら、コドン脱最適化ウイルスが細胞を無能にすることに成功する場合、このウイルスは、野生型とほぼ同一の量の子孫を産生する。本データは、細胞自体の翻訳が大きく停止した場合、複製段階中の初期翻訳（新しいＲＮＡゲノムから）と後期翻訳との間に、基本的な差があることを示唆する。これは一般的な現象であり得るが、コドン脱最適化ゲノムの場合には特に重要であり得る。宿主細胞の停止は、遊離アミノアシルｔＲＮＡの過剰存在をもたらす可能性が非常に高く、ＰＶゲノムがもはや翻訳リソースをめぐって細胞ＲＮＡと競合する必要がないため、準最適コドン使用の与えられた効果を克服し得る。これは、実際に、本明細書に記載される改変された生体外翻訳系での観察結果（図５Ｂ）と類似する可能性がある。ヌクレアーゼ処理されず（したがって、細胞ｍＲＮＡを含有）、外因性アミノ酸またはｔＲＮＡが添加されなかった翻訳抽出物を使用すると、異なるキャプシド設計の突然変異体翻訳能において明らかな差が認められた。これらの条件下で、ウイルスゲノムは、供給が限られている環境下において細胞ｍＲＮＡと競合しなければならない。対照的に、内因性ｍＲＮＡが除去され、過剰ｔＲＮＡおよびアミノ酸が添加された、伝統的な翻訳抽出物において、すべてのＰＶＲＮＡが、コドンバイアスに関係なく同様に十分に翻訳した（図５Ａ）。これらの２つの異なる生体外条件は、ＰＶ感染細胞における初期および後期段階中の生体内翻訳に類似している可能性がある。

本研究の１つの重要な所見は、物理的相互作用およびウイルスの取り込みの間のステップに加えて、ＰＦＵ／粒子の比もまた、宿主細胞の抗ウイルス応答を克服するウイルスの能力を大きく反映するという認識である。これは、ピコルナウイルスが、実際には、この競争に勝ち残るには非常に非効率的であり、細胞が効果的に応答することができる前に、迅速に複製することができる小ゲノムを進化させる選択を取ったようであることを示唆する。データが示すように、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}において翻訳速度をほんの３０％低下させることによって（図６を参照）、より低い特異的感染性に反映されるように、不稔感染の速度は１，０００倍高まる（図４Ｄ）。ピコルナウイルスは、明らかに、エラーカタストロフィの始めだけでなく（Ｃｒｏｔｔｙｅｔａｌ．，２００１、Ｈｏｌｌａｎｄｅｔａｌ．，１９９０）、宿主細胞の抗ウイルス防御による除去の始めにも複製する。この効果は、ピコルナウイルスの病原性表現型に重大な影響を及ぼし得る。コドン脱最適化ウイルスによる中断された感染の速度増加に関与する細胞抗ウイルスプロセスは、現在のところ完全には解明されていない。ＰＶは、アポトーシスの誘発および阻害の両方を行うことが示されている（Ｂｅｌｏｖｅｔａｌ．，２００３、Ｇｉｒａｒｄｅｔａｌ．，１９９９、Ｔｏｌｓｋａｙａｅｔａｌ．，１９９５）。同様に、ＰＶは、ＮＦ−κＢを切断することによって、インターフェロン経路を妨害する（Ｎｅｚｎａｎｏｖｅｔａｌ．，２００５）。初期ゲノム翻訳の速度が減少したＰＶは、ｗｔウイルスと同一の方法で抗ウイルス応答をなおも誘発するが（初期設定によるアポトーシスおよびインターフェロンの誘発）、次いで、低いタンパク質合成によって、これらのプロセスを阻害する可能性は低下することが考えられる。このシナリオは、細胞が新生感染を中断する可能性を増加させ得、観察された現象を説明し得る。個々の細胞レベルにおいて、ＰＶ感染は、全か無かの現象である可能性がある。ウイルスタンパク質およびＲＮＡ合成は、恐らく、増殖感染を確実にするために、最大範囲に近い範囲内である必要がある。

弱毒化ウイルスワクチン組成物

本発明は、本明細書に記載される弱毒化ウイルス、および任意の薬剤として許容される担体を含む、対象における防御免疫応答を誘発するためのワクチン組成物を提供する。

本発明の弱毒化ウイルスは、対象における防御免疫応答を誘起するため、または対象がウイルス関連の疾病に罹患するのを予防するために使用される場合、薬剤として許容される担体を付加的に含む組成物の形で、対象に投与されることは理解されるべきである。薬剤として許容される担体は、当業者にはよく知られており、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、または０．９％の生理食塩水のうちの１つ以上を含むがこれらに限定されない。そのような担体には、水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳液も含まれる。水性担体には、水、アルコール溶液／水溶液、乳液または懸濁液、生理食塩水、および緩衝媒体が含まれる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、ならびに固定油が含まれる。静脈内媒体には、リンガーデキストロースに基づくような液体および栄養補充液、電解質補充液等が含まれる。固体組成物は、例えば、グルコース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、セルロースまたはセルロース誘導体、炭酸ナトリウム、および炭酸マグネシウム等の非毒性固体担体を含み得る。肺および／または鼻腔内送達用等のエアロゾルでの投与のために、薬剤または組成物は、例えば、Ｃ６〜Ｃ２２脂肪酸のエステルもしくは部分エステルまたは天然グリセリド等の非毒性界面活性剤、および噴射剤で好ましくは処方される。鼻腔内送達を促進するために、レシチン等の追加担体を含めることができる。薬剤として許容される担体は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、ならびに例えば、抗菌剤、抗酸化剤、およびキレート剤等の他の添加剤等の、有効成分の有効期限および／または有効性を高める少量の補助物質をさらに含んでもよい。本組成物は、当技術分野でよく知られている通り、対象への投与後の有効成分の即時放出、持続放出、または遅延放出を提供するように処方することができる。

本ワクチン組成物の種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、（ｉ）感染細胞におけるウイルスタンパク質の合成およびプロセシングを多く変化させず、（ｉｉ）ｗｔウイルスと類似した感染細胞当たりの量のビリオンを産生し、および／または（ｉｉｉ）ｗｔウイルスよりもかなり低いビリオン特異的感染性を呈する。さらなる実施形態では、弱毒化ウイルスは、宿主動物において、対応するｗｔウイルスと実質的に類似した免疫応答を誘発する。

本発明はまた、野生型宿主細胞において生存不能の弱毒化ウイルスを許容するように特に単離または操作される、改変宿主細胞株を提供する。弱毒化ウイルスは、正常（野生型）宿主細胞において増殖することができないため、増殖のための特異的なヘルパー細胞株に完全に依存している。これは、ワクチン産生のためのウイルス生成に対して、非常に高いレベルの安全性を提供する。本改変細胞株の種々の実施形態は、弱毒化ウイルスの増殖を可能にし、該細胞株のゲノムは、希少ｔＲＮＡをコード化する遺伝子数を増加させるために変化している。

好ましい実施形態では、希少コドンは、ＣＴＡ（ｃｏｄｉｎｇｆｏｒＬｅｕ）、ＴＣＧ（Ｓｅｒ）、およびＣＣＧ（Ｐｒｏ）である。異なる実施形態では、これらの希少コドンのうちの１つ、２つ、または３つ全てが、ウイルスゲノム中の同義高頻度コドンの代わりとなる。例えば、ウイルス中の全てのＬｅｕコドンは、ＣＴＡに変化してもよく、全てのＳｅｒコドンは、ＴＣＧに変化してもよく、全てのＰｒｏコドンは、ＣＣＧに変化してもよく、ＬｅｕおよびＳｅｒ、またはＬｅｕおよびＰｒｏ、またはＳｅｒおよびＰｒｏコドンは、同定された希少コドンによって置換されてもよく、あるいは全てのＬｅｕ、Ｓｅｒ、およびＰｒｏコドンは、単一のウイルス中でそれぞれＣＴＡ、ＴＣＧ、およびＣＣＧに変化してもよい。さらに、関連コドンの一部分、すなわち、１００％未満は、希少コドンに変化してもよい。したがって、置換されるコドンの割合は、コドンの合計数の約２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％であってもよい。

ある実施形態では、これらの置換は、ウイルスのキャプシド領域内のみで行われ、翻訳の高速度が最も重要である。他の実施形態では、置換は、ウイルス全体にわたって行われる。さらなる実施形態では、細胞株は、希少コドンに結合するｔＲＮＡを過剰発現する。

本発明は、本明細書に記載される弱毒化ウイルスのいずれかを合成する方法をさらに提供し、該方法は、（ａ）ウイルスゲノムの少なくとも１つの非制御部分における複数の場所でコドンを同定するステップであって、コドンは、同義コドンによって置換されることができる、ステップと、（ｂ）同定されたコドンの各々の代わりになる同義コドンを選択するステップと、（ｃ）同定されたコドンの各々を同義コドンで置換するステップとを含む。

本方法のある実施形態では、ステップ（ａ）および（ｂ）は、好ましい限度内で、脱最適化されたコドン分布および／または脱最適化されたコドンペア分布の特定のパターンセットを変化させることによって、ウイルスゲノムの設計を可能にする、合成弱毒化ウイルス工学（ＳＡＶＥ）のためのコンピュータによるアルゴリズムによって誘導される。本発明はまた、パターンセットが、脱最適化されたコドンおよび脱最適化されたコドン対の密度、ＲＮＡ二次構造、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、Ｃ＋Ｇ含有量、重複コーディングフレーム、制限部位分布、フレームシフト部位、またはそれらの任意の組み合わせを代替的または付加的に含む、方法を提供する。

他の実施形態では、ステップ（ｃ）は、同義コドンおよび／またはコドン対を含有するＤＮＡのデノボ合成、ならびに合成されたＤＮＡでのゲノムの対応する領域の置換によって達成される。さらなる実施形態では、全ゲノムは、合成されたＤＮＡで置換される。さらなる実施形態では、ゲノムの一部は、合成されたＤＮＡで置換される。さらに他の実施形態では、ゲノムの該一部は、キャプシドコード領域である。

加えて、本発明は、対象に、予防上または治療上有効な用量の本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれかを投与するステップを含む、対象における防御免疫応答を誘起するための方法を提供する。本発明はまた、対象に、予防上有効な用量の本ワクチン組成物のいずれかを投与するステップを含む、対象がウイルス関連の疾病に罹患するのを予防するための方法を提供する。上記の方法の実施形態では、対象は、病原性ウイルスに曝されている。病原性ウイルスに「曝されている」というのは、感染が生じ得るウイルスとの接触を意味する。

本発明は、対象に、治療上有効な用量の本ワクチン組成物のいずれかを投与するステップを含む、ウイルスに感染した対象におけるウイルス関連の疾病の発症を遅延させるか、またはその進行速度を遅らせるための方法をさらに提供する。

ここで使用される「投与」は、種々の方法のいずれかを使用した送達、および当業者に既知の送達システムを意味する。投与は、例えば、腹腔内、脳内、静脈内、経口、経粘膜、皮下、経皮、皮内、筋肉内、局所、非経口、埋め込み、髄腔内、リンパ内、病巣内、心膜内、または硬膜外で行うことができる。薬剤または組成物はまた、肺および／または鼻腔内送達用等のエアロゾルで投与されてもよい。投与は、例えば、１回、複数回、および／または１回以上の長期間にわたって行われてもよい。

対象における防御免疫応答を誘起するステップは、例えば、対象に一次用量のワクチンを投与し、適切な期間の後、１回以上のワクチンの後続投与を続けることによって達成することができる。ワクチン投与間の適切な期間は、当業者によって容易に決定され得、通常、約数週間から数ヶ月である。しかしながら、本発明は、いかなる特定の投与方法、投与経路、または投与頻度にも限定されない。

「対象」は、いずれの動物または人為的に改変された動物を意味する。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、マウス、ラット、およびモルモット等の齧歯動物、ならびに鳥類を含むがこれらに限定されない。人為的に改変された動物は、ヒト免疫系を有するＳＣＩＤマウス、およびヒトポリオウイルス受容体ＣＤ１５５を発現する、ＣＤ１５５ｔｇ遺伝子導入マウスを含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、対象はヒトである。鳥類の好ましい例は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、およびガチョウを含むがこれらに限定されない、家畜化された家禽種である。

「予防上有効な用量」は、ウイルス感染しやすい、またはウイルス関連の疾患に罹患しやすい対象に投与されると、対象がウイルスに感染するか、または疾患に罹患するのを防ぐ免疫応答を、対象において誘発するワクチンの任意の量である。対象を「防ぐ」という意味は、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍、対象がウイルスに感染する可能性を減少させること、あるいは、対象における疾病の発症の可能性を低下させることを意味する。例えば、対象がウイルスに感染する可能性を１％有する場合、対象がウイルスに感染する可能性の２倍の減少は、対象がウイルスに感染する可能性を０．５％有するという結果になる。最も好ましくは、「予防上有効な用量」は、対象がウイルスに感染するのを完全に予防するか、または対象における疾患の発症を完全に予防する免疫応答を、対象において誘発する。

ここで使用される「治療上有効な用量」は、ワクチンが有効な疾患に罹患した対象に投与されると、対象に疾患および／またはその症状の軽減、緩和、または退縮を経験させる免疫応答を、対象において誘発する。好ましい実施形態では、疾患および／またはその症状の再発が予防される。他の好ましい実施形態では、対象は、疾患および／またはその症状が治癒する。

本予防接種および治療方法のいずれかのある実施形態は、対象に、少なくとも１つのアジュバントを投与するステップをさらに含む。「アジュバント」は、抗原の免疫原性を高め、対象における免疫応答を促進するのに好適ないかなる薬剤も意味するものとする。タンパク質ベースおよび核酸ベース両方のワクチンでの使用に好適な、微粒子アジュバントを含む多数のアジュバント、ならびにアジュバントを抗原と組み合わせる方法は、当業者にはよく知られている。核酸ベースのワクチンに好適なアジュバントは、ＱｕｉｌＡ、イミキモド、レシキモド、および精製タンパク質または核酸の形で送達されるインターロイキン−１２を含むがこれらに限定されない。タンパク質免疫での使用に好適なアジュバントは、ミョウバン、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、サポニン、ＱｕｉｌＡ、およびＱＳ−２１を含むがこれらに限定されない。

本発明はまた、本発明の弱毒化ウイルスによる対象の予防接種のためのキットを提供する。キットは、弱毒化ウイルス、薬剤として許容される担体、アプリケータ、およびその使用に関する説明書を含む。さらなる実施形態では、弱毒化ウイルスは、１つ以上のポリオウイルス、１つ以上のライノウイルス、１つ以上のインフルエンザウイルス等であり得る。特定のウイルスの多くの異なる単離株に対して宿主に予防接種をすることが望ましい場合、２つ以上のウイルスが好ましい場合がある。本発明は、当業者に既知のキットの他の実施形態を含む。使用説明書は、弱毒化ウイルスの投与を指示する上で有用な、いかなる情報も提供することができる。

もちろん、本明細書に開示される発明の原理における変更が、当業者によって行われることができることは理解および予測されるものであり、そのような変更が、本発明の範囲内に含まれることを目的とする。以下の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明の範囲を何ら制限するものと解釈されるべきではない。組み換えプラスミドの構築、ウイルス構築物での宿主細胞の導入、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および免疫学的方法に採用されるような従来の方法の詳細な説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９）およびＣｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．（１９９４）を含む多数の出版物から得ることができる。本明細書で言及される全ての参照は、参照することによって全体として本願に組み込まれる。

本願全体にわたって引用される種々の出版物の全詳細は、請求項の直前の本明細書の最後に示される。これらの出版物の開示は、参照することによって全体として本願に組み込まれる。しかしながら、本明細書での参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であるという確認として解釈されるべきではない。

実施例１
コドンバイアスを変化させることによるポリオウイルスのキャプシド領域の再操作

細胞、ウイルス、プラスミド、およびバクテリア

ＨｅＬａＲ１９細胞単層を１０％の仔ウシ血清（ＢＣＳ）が添加されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に、３７℃で維持した。全てのＰＶ感染性ｃＤＮＡ構築物は、ＰＶ１（Ｍ）ｃＤＮＡクローンｐＴ７ＰＶＭに基づく（Ｃａｏｅｔａｌ．，１９９３、ｖａｎｄｅｒＷｅｒｆｅｔａｌ．，１９８６）。ジシストロニックレポータプラスミドをｐＨＲＰＦ−Ｌｕｃを使用して構築した（ＺｈａｏａｎｄＷｉｍｍｅｒ，２００１）。プラスミド形質転換および増殖のために、大腸菌ＤＨ５αを使用した。ウイルスを１細胞当たり５ＰＦＵのＨｅＬａＲ１９細胞単層の感染によって増幅した。完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が見えるようになるまで、または感染後少なくとも４日間、感染細胞をＤＭＥＭ（２％ＢＣＳ）中で、３７℃でインキュベートした。３回の冷凍および解凍後、溶解物を低速度の遠心分離によって細胞残屑から清澄し、ウイルスをが乳する上清をさらなる継代または分析に使用した。

合成キャプシド置換およびジシストロニックレポーターレプリコンのクローニング

ＧｅｎｅＭａｋｅｒ（登録商標）技術（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、ＳＤおよびＡＢと呼ばれる、ヌクレオチド４９５から３６３６の間のゲノムに及ぶ、２個のＰＶゲノムｃＤＮＡフラグメントを合成した。ＰｆｌＭＩ消化、および対応するＰｆｌＭＩフラグメントが除去されたｐＴ７ＰＶＭベクターへのＰｆｌＭＩ挿入によって、ベンダーのクローニングベクターから置換カセットを放出することによって、ｐＰＶ−ＳＤおよびｐＰＶ−ＡＢを生成した。ｐＰＶ−ＡＢから同等に消化されたｐＴ７ＰＶＭベクターに、ＢｓｍＩフラグメントまたはＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをそれぞれ挿入することによって、ｐＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}およびｐＰＶ−ＡＢ^{２４７０−３３８６}を得た。ｐＰＶ−ＡＢ^{１５１３−３３８６}およびｐＰＶ−ＡＢ^{７５５−２４７０}において、ｐＴ７ＰＶＭのＢｓｍＩフラグメントまたはＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントはそれぞれ、ｐＰＶ−ＡＢベクターの各々のフラグメントを置換する。ｐＰＶ−ＡＢ^{１５１３−３３８６}のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントのｐＴ７ＰＶＭのフラグメントでの置換は、ｐＰＶ−ＡＢ^{２４７０−３３８６}をもたらす。最終的に、ｐＰＶ−ＡＢ^{２４７０−３３８６}およびｐＴ７ＰＶＭのＳｎａＢＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの互いとの置換は、ｐＰＶ−ＡＢ^{２９５４−３３８６}およびｐＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}をそれぞれ産生する。

最初に、オリゴヌクレオチドＦｌｕｃ−ｍｕｔＲＩ（＋）／Ｆｌｕｃ−ｍｕｔＲＩ（−）を使用した部位特異的変異誘発によって、ｐＨＲＰＦ−Ｌｕｃにサイレント変異を導入し、ホタルルシフェラーゼオープンリーディングフレームにおけるＥｃｏＲＩ部位を変異させ、ｐｄｉＬｕｃ−ｍＲＩを生成することによって、ジシストロニックレポータ構築物のクローニングを行った。オリゴヌクレオチドＲＩ−２Ａ−Ｐ１ｗｔ（＋）／Ｐ１ｗｔ−２Ａ−ＲＩ（−）を使用して、ｐＴ７ＰＶＭ、ｐＰＶ−ＡＢ^{１５１３−２４７０}、およびｐＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}のキャプシド領域をＰＣＲ増幅した。ＲＩ−２Ａ−Ｐ１ｗｔ（＋）／Ｐ１ＡＢ−２Ａ−ＲＩ（−）、またはＲＩ−２Ａ−Ｐ１ＡＢ（＋）／Ｐ１ＡＢ−２Ａ−ＲＩ（−）をそれぞれ用いて、ｐＰＶ−ＡＢ^{２４７０−３３８６}およびｐＰＶ−ＡＢ^{２９５４−３３８６}、またはｐＰＶ−ＡＢのキャプシド配列を増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、ｐｄｉＬｕｃ−ｍＲＩにおける新しい特異的ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐｄｉＬｕｃ−ＰＶ、ｐｄｉＬｕｃ−ＡＢ^{１５１３−２４７０}、ｐｄｉＬｕｃ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}、ｐｄｉＬｕｃ−ＡＢ^{２４７０−３３８６}、ｐｄｉＬｕｃ−ＡＢ^{２９５４−３３８６}、およびｐｄｉＬｕｃ−ＡＢをそれぞれ得た。

オリゴヌクレオチド

以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
Ｆｌｕｃ−ｍｕｔＲＩ（＋）、５′−ＧＣＡＣＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧ−３′（配列番号６）、Ｆｌｕｃ−ｍｕｔＲＩ（−）、５′−ＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＧＴＧＣ−３′（配列番号７）、ＲＩ−２Ａ−Ｐ１ｗｔ（＋）、５′−ＣＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＴＡＣＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＡＧＴＧＧＧ−３′（配列番号８）、ＲＩ−２Ａ−Ｐ１ＡＢ（＋）、５′−ＣＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＴＡＣＧＧＴＧＣＧＣＡＡＧＴＡＴＣＧＴＣＧＣＡＡＡＡＡＧＴＡＧＧ−３（配列番号９）、Ｐ１ｗｔ−２Ａ−ＲＩ（−）、５′−ＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＡＴＧＴＧＧＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＧＧＴＧＧ−ＡＧＡＧＧ−３′（配列番号１０）、およびＰ１ＡＢ−２Ａ−ＲＩ（−）、５′−ＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＡＣＧＴＣＧＴＴＡＡＡＴＣＴＴＴＣＧＴＣＧＡＴＡＡＣＧ−３′（配列番号１１）。

生体外転写およびＲＮＡ導入

Ｔ７プロモータによって促進され、２ μｇのＥｃｏＲＩ線状化プラスミドＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって、３７℃で１時間転写した。ＤＥＡＥデキストラン方法の改良形に従って、１マイクログラムのウイルスまたはジシストロニック転写ＲＮＡを使用し、３５ｍｍ直径のプレート上に１０^６個のＨｅＬａＲ１９細胞を導入した（ｖａｎｄｅｒＷｅｒｆｅｔａｌ．，１９８６）。室温での３０分間のインキュベーション後、上清を除去し、ＣＰＥが現れるまで、細胞を２％ＢＣＳを含有する２ｍｌのＤＭＥＭ中で、３７℃でインキュベートするか、またはさらなる継代のために、細胞を導入後４日間冷凍した。最小イーグル培地中の０．６％のトラガカントゴム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の半固形重層を使用して、ＨｅＬａＲ１９細胞の標準的なプラークアッセイによって、ウイルス力価を決定した。

コドン脱最適化ポリオウイルスの設計および合成

ポリオウイルスＰ１キャプシド領域の２個の異なる同義コード化を生成し、各々を異なる設計要件によって制御した。全キャプシドコード配列は、得られるサブゲノムレプリコンの複製に影響を与えることなく、ＰＶゲノムから削除するか、または外因性配列で置換することができるということが決定的に示されているため、設計をキャプシドに限定した（ＪｏｈａｎｓｅｎａｎｄＭｏｒｒｏｗ，２０００、ＫａｐｌａｎａｎｄＲａｃａｎｉｅｌｌｏ，１９８８）。したがって、未同定の決定的な調節ＲＮＡ要素が、キャプシド領域に位置していないのは間違いなく、それらは不注意にＲＮＡ配列の調節の影響を受ける可能性がある。

第１の設計（ＰＶ−ＳＤ）は、野生型Ｐ１領域の正確なコドン使用分布を保存しながら、ＲＮＡ塩基の変化数を最大化しようとした（図１）。これを達成するために、各位置−コドン対の重量は、元のコドンとそれを置換する同義候補コドンとの間の塩基の変化数である、位置とコドンとの間の最大加重２部マッチングを見つけることによって、各アミノ酸に対して同義コドン位置を交換した（Ｇａｂｏｗ，１９７３）。マッチングアルゴリズムからのいかなる位置バイアスも防止するために、入力グラフを作成する前に、無作為に同義コドン位置の順序を変え、その後に位置を元に戻した。マッチングを算出するために、Ｒｏｔｈｂｅｒｇの最大２部マッチングプログラム（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ，１９８５）を使用した。各６個のヌクレオチドの、合計１１個の有用な制限酵素部位を、ウイルスゲノム配列中に固定し、コドン位置交換に関与しないようにした。コドンシャッフル技術は、得られる再構築された完全長ゲノム中で好ましくは特異的なままであるべきである、追加の制限部位を作製する可能性がある。したがって、望ましくない部位を除去するために、コドンを置換することによって、配列をさらに処理した。これは、コドン頻度分布をわずかに変化させた、さらに９個の同義コドン変化をもたらした。しかしながら、その頻度が、野生型配列に対して１を上回って変化したコドンはなかった。キャプシドコーディングドメインの同一のタンパク質配列を維持しながら、ｗｔＰ１配列と比較してＰＶ−ＳＤキャプシド設計において変化したヌクレオチドは、２，６４３個のうち合計で９３４個であった（図１および２を参照）。コドン使用は変化しなかったため、ＰＶＭ−ＳＤキャプシドコード配列中のＧＣ含有量は、４９％でｗｔと同一のままであった。

第２の設計ＰＶ−ＡＢは、ｗｔＰ１領域にわたるコドン使用分布を大幅に変化させようとした。この設計は、コドンバイアスが組織特異的発現に影響を与える可能性があることを示唆する、近年の研究の影響を受けた（Ｐｌｏｔｋｉｎｅｔａｌ．，２００４）。所望のコドン使用分布は、前述の脳特異的遺伝子のセットにおいて認められた最も好ましくないコドンから得た（Ｈｓｉａｏｅｔａｌ．，２００１、Ｐｌｏｔｋｉｎｅｔａｌ．，２００４）。この遺伝子セットにおいて認められるような、各特定のアミノ酸に対する最も希少な同義コドンの使用を最大化し、キャプシドコード領域を合成した（図１）。１個（Ｌｅｕ）を除く全てのアミノ酸に対して、脳内の最も希少なコドンが、一般に全てのヒト遺伝子の間の最も希少なコドンに対応するため、実際に、この設計は、他のヒト組織における発現も区別すると予測される。結局は、ＰＶ−ＡＢキャプシドは、６８０個のヌクレオチド位置においてｗｔキャプシドとは異なる（図２を参照）。ＰＶＭ−ＡＢキャプシド領域におけるＧＣ含有量は、ｗｔにおける４９％と比較して４３％に減少した。

実施例２
ポリオウイルスの増殖および感染へのコドン脱最適化の効果

感染病巣アッセイによるウイルス力価の決定

標準的なプラークアッセイに対して感染を行った。インキュベーションの４８または７２時間後、トラガカントゴム重層を除去し、ウェルをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、冷メタノール／アセトンで３０分間固定した。ウェルを１０％ＢＣＳを含有するＰＢＳ中にブロックし、続いて、１：２０の希釈の抗３Ｄマウスモノクローナル抗体１２５．２．３で、３７℃で１時間インキュベートした（Ｐａｕｌｅｔａｌ．，１９９８）。洗浄後、細胞を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ）でインキュベートし、ベクターＶＩＰ基質キット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用し、感染細胞を視覚化した。ｗｔウイルスで得たプラークと同等である染色された病巣数を数え、プラークアッセイ手順にあるように力価を計算した。

コドン脱最適化ポリオウイルスは、大きい増殖表現型を示す

２つの初期キャプシドＯＲＦ置換設計（図３Ａ）のうち、ＰＶ−ＳＤのみが生存ウイルスを産生した。対照的に、ＰＶ−ＡＢＲＮＡでの４回の独立した導入からは、３回の継代後でさえ生存ウイルスは回収されなかった（図３Ｅ）。ＰＶ−ＡＢゲノムに導入されたコドンバイアスは、あまりに大きかったと思われる。したがって、ＰＶ−ＡＢキャプシドコード配列のより小さい部分をＰＶ（Ｍ）背景にサブクローン化し、非優先コドンの有害な作用を減少させた。これらのサブクローンのうち、ＰＶ−ＡＢ^{２９５４−３３８６}は、ＲＮＡ導入の４０時間後にＣＰＥを産生したが、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}は、導入後に１代または２代の追加の継代をそれぞれ必要とした（野生型ウイルスの２４時間と比較して）。興味深いことに、これらのキメラウイルスは、元のＡＢ配列の最小部分での３個のサブクローンを表し、観察結果は、非優先コドン数とウイルス適応度との間の直接相関を示唆する。

ＲＮＡ導入に続いて最大で２代継代後に得られたウイルス細胞溶解物で、感染多重度（ＭＯＩ）２で、ＨｅＬａ単分子層を感染させることによって、全ての生存ウイルス変異体の一段増殖速度を決定した（図３Ｂ）。ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}の低力価の理由から、また接種材料を濃縮および精製するために必要とされる、さらなる継代の必要性を排除するために、ＭＯＩを選択した。使用された条件下で、全てのウイルスは、感染後２４時間までに完全な、またはほぼ完全なＣＰＥを産生した。

そのキャプシド領域における９３４個の単一点突然変異にもかかわらず、ＰＶ−ＳＤは、ｗｔの最大能力で複製し（図３Ｂ）、ｗｔと同様のサイズのプラークを産生した（図３Ｄ）。ＰＶ−ＡＢ^{２９５４−３３８６}がほぼ野生型の速度で増殖した一方で（図３Ｂ）、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}は、微小プラークおよび約２２倍感染性が低いウイルスを産生した（それぞれ、図２、３Ｂ、およびＦ）。非常に遅延してはいるが、高ＭＯＩ感染においてＣＰＥをもたらすことができるが（２０〜２４時間後に８０〜９０％のＣＰＥ）、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}は、標準的なプラークアッセイの条件下で、全くプラークを産生しなかった（図３Ｈ）。したがって、フォーカス形成アッセイを使用してこのウイルスを定量化し、プラークアッセイ条件下での７２時間のインキュベーション後の感染細胞の病巣の数を、ウイルスポリメラーゼ３Ｄに対する抗体で免疫組織化学的に染色した後に数えた。感染の４８時間後、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}感染病巣は通常、ｗｔの３ｍｍのプラーク（図３ＣおよびＤ）と比較して、０．２〜０．５ｍｍの直径の病巣を有する、ほんの数十から数百個の細胞（図３Ｊ）を含んだ。しかしながら、さらに２４時間後、病巣の直径は大幅に増加した（２〜３ｍｍ、図３Ｇ）。ＨｅＬａ細胞が、ＭＯＩ１でＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}に感染した場合、ＣＰＥは、ｗｔの８時間と比較して、１２から１８時間の間、および３から４日の間にそれぞれ現れた（データは図示せず）。

タンパク質コード配列中の特定のコドンバイアスの蓄積効果を定量化するために、ヒトゲノム中の全体的コドン分布に対する比較測定である、相対コドン脱最適化指数（ＲＣＤＩ）を計算した。１／コドンのＲＣＤＩは、遺伝子が正常なヒトコドン頻度に従うことを示し、一方、正常なヒトコドンバイアスからのいずれの偏差も、１より高いＲＣＤＩをもたらす。ＲＣＤＩを以下の式を使用して得た。

したがって、配列中の高い希少コドン数は、より高い指数をもたらす。この式を使用して、種々のキャプシドコード配列のＲＣＤＩ値は、ＰＶ（Ｍ）およびＰＶ−ＳＤに対して、１．１４であると計算され、これは、正常なヒト分布に非常に近い。ＡＢ構築物のＲＣＤＩ値は、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}に対して１．７３、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}に対して１．４５、および親ＰＶ−ＡＢに対して６．５１である。比較のために、恐らくもっとも知られているコドン最適化タンパク質である、「ヒト化」緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するＲＣＤＩは、元のオワンクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子に対する１．６８のＲＣＤＩと比較して、１．３１であった（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎｅｔａｌ．，１９９６）。これらの計算に従うと、２未満のＲＣＤＩを有するキャプシドコード配列が、生存ウイルス表現型と関連する一方で、２より高いＲＣＤＩ（ＰＶ−ＡＢ＝６．５１、ＰＶ−ＡＢ^{１５１３−３３８６}＝４．０４、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−２４７０}＝３．６１）は、致死表現型をもたらす。

実施例３
ポリオウイルスの特異的感染へのコドン脱最適化の効果

ウイルス粒子の分子定量化：直接ＯＤ_２６０吸光方法

ＨｅＬａ細胞（４ × １０^７個の細胞）の１５ｃｍのディッシュを、完全なＣＰＥが発生するまで（一晩対４日間）、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}またはＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}にＭＯＩ０．５で感染させた。３回の連続的冷凍／解凍サイクルによって、細胞関連ウイルスを放出した。細胞溶解物を２，０００×ｇでの１０分間の遠心分離、続いて、１４，０００×ｇでの２回目の１０分間の遠心分離によって取り除いた。上清を、１０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下で、室温で１時間インキュベートし、いかなる過剰なウイルスまたは細胞ＲＮＡも消化した。０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および２ｍＭのＥＤＴＡの添加後、ウイルス含有上清を６ｍｌのスクロースクッション（ハンクス平衡塩溶液［ＨＢＳＳ］中３０％のスクロース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上に重層した。ウイルス粒子を、ＳＷ２８スイングバケットロータを使用して、２８，０００ｒｐｍで４時間の超遠心分離によって堆積させた。上清を除去し、スクロースクッションをそのままの状態にしながら、遠心分離管をＨＢＳＳで２回すすいだ。最後の洗浄液およびスクロースクッションの除去後、ウイルスペレットを０．２％ＳＤＳおよび５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳに再懸濁した。ウイルス感染力価を、プラークアッセイ／感染病巣アッセイ（上記を参照）によって決定した。ウイルス粒子濃度を、２６０ｎｍ（ＯＤ_２６０）の光学濃度のＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて決定し、式：１ＯＤ_２６０単位＝９．４×１０^１２粒子／ｍｌ（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ，１９８５）を使用して計算した（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ，１９８５）。加えて、ビリオンＲＮＡを、３回のフェノール抽出および１回のクロロホルム抽出によって抽出した。ＲＮＡをエタノール沈殿させ、超純水に再懸濁した。ＲＮＡ純度をＴＡＥ緩衝アガロースゲル分析によって確認し、濃度を分光光度的に決定した。対応するウイルス調合物のゲノム等価物の合計数を、決定されたＲＮＡ濃度およびＲＮＡの分子量によって計算した。したがって、１個のＲＮａｓｅ保護ウイルスゲノム等価物が、１個のウイルス粒子に対応すると仮定すると、感染単位当たりのビリオンの相対量を計算することができる。

ウイルス粒子の分子定量化：ＥＬＩＳＡ方法

ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレートを、３７℃で２時間、さらに４℃で１４５時間、１００μｌのＰＢＳ中の１０μｇのウサギ抗ＰＶ（Ｍ）抗体（ＭｕｒｄｉｎａｎｄＷｉｍｍｅｒ，１９８９）で被覆し、次いで、プレートを、３５０μｌのＰＢＳで３回簡単に洗浄し、ＰＢＳ中の３５０μｌの１０％仔ウシ血清で、３７℃で１時間ブロックした。ＰＢＳでの３回の簡単な洗浄に続いて、ウェルを、２％ＢＣＳ含有ＤＭＥＭ中の１００μｌのウイルス含有細胞溶解物または対照で、室温で４時間インキュベートした。ウェルを３５０μｌのＰＢＳで３回、各５分間洗浄した。次いで、ウェルを、１００μｌのＤＭＥＭ−１０％ＢＣＳ中の２μｇのＣＤ１５５−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）融合タンパク質（Ｈｅｅｔａｌ．，２０００）で、室温で４時間インキュベートした。ＰＢＳでの５回の洗浄の最後の後、１００μｌの１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５を添加し、プレートを６５℃で１時間インキュベートした。１００μｌの９ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルリン酸（２Ｍのジエタノールアミン、１ｍＭＭｇＣｌ_２中、ｐＨ９．８）によって、比色アルカリホスファターゼ決定を行った。アルカリホスファターゼ活性を決定し、精製ＰＶ（Ｍ）ウイルスストックの既知の濃度の２倍連続希釈を使用して、同時に作製した標準曲線上で、４０５ｎｍの波長で、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）プレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で、ウイルス粒子濃度を計算した。

ＰＦＵ／粒子の比は、コドン脱最適化ウイルスにおいて減少する

細胞培養中のＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}の極めて不十分な増殖表現型、およびそれがプラークを形成できないことは、個々のウイルス粒子のより低い特異的感染性と一致し得る、細胞間伝播の欠損を示唆する。

この仮説を試験するために、ＰＶ（Ｍ）、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}、およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}ウイルスを精製し、ウイルス粒子の量を分光光度的に決定した。ＯＤ_２６０を測定することによって、精製ウイルス調合物を直接定量化し、式：１ＯＤ_２６０単位＝９．４×１０^１２粒子／ｍｌに従って、粒子濃度を計算した（図４Ｄ）（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ，１９８５）。さらに、ゲノムＲＮＡをそれらのビリオンから抽出し（図４Ａ）、ＯＤ_２６０で定量化した（データは図示せず）。次いで、ゲノムＲＮＡに対して２．５３×１０^６ｇ／ｍｏｌの分子サイズによって、ビリオン数（１ビリオン＝１ゲノム）を決定した。具体的に、上記に記載されるように、完全なＣＰＥが現れるまで、０．５ＭＯＩのウイルスに感染した４×１０^７個のＨｅＬａ細胞からウイルスを調製した。両方の粒子決定の方法は、同様の結果をもたらした（図４Ｄ）。実際に、ＰＶ（Ｍ）およびＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}が、ほぼ同量のビリオンを産生した一方で、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}は、ＰＶ（Ｍ）（ゲノムＲＮＡ方法による［データは図示せず］）と比較して、１／３（直接ＵＶ方法による（図４Ｄ））から１／８の間のビリオン数を産生したことがわかった。対照的に、ｗｔウイルスサンプルは、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}よりも、約３０倍および約３，０００倍それぞれ多い感染単位に対応した（図４Ｄ）。加えて、精製ビリオンのキャプシドタンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分解し、銀染色によって視覚化した（図４Ｂ）。これらのデータはまた、１細胞当たりで、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}およびＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}が、１細胞当たり同様またはほんのわずかに減少した量の子孫を産生する一方で（図４Ｂ、レーン３）、それらのＰＦＵ／粒子の比は減少するという結論を裏付ける。ウイルスに対するＰＦＵ／粒子の比は、プラーク（プラークアッセイおよび特定のプラークアッセイ技術のための細胞の種類）、または粒子数（分光光度法もしくは電子顕微鏡法）のいずれかを決定するための方法に応じて、大幅に変化し得る。本明細書に記載される方法を使用して、ＰＶ１（Ｍ）に対して１／１１５のＰＦＵ／粒子の比が決定され、それは、１／２７２（ＪｏｋｌｉｋａｎｄＤａｒｎｅｌｌ，１９６１）（ＨｅＬａ細胞で行った）および１／８７（ＳｃｈｗｅｒｄｔａｎｄＦｏｇｈ，１９５７）（初代サル腎細胞において）の以前の決定とよく一致する。

ビリオン特異的ＥＬＩＳＡの開発

コドン脱最適化ポリオウイルスで認められた、ＰＦＵ／粒子の比の減少を確認するために、生物学的変数である感染力価よりもむしろ、サンプル中の無傷のウイルス粒子の物理的な量を測定するための方法として、新規ビリオン特異的ＥＬＩＳＡを開発した（図４ＣおよびＥ）。アッセイは、耐熱性胎盤アルカリホスファターゼ（ＣＤ１５５−ＡＰ）に融合したＰＶ受容体ＣＤ１５５の細胞外ドメインが、無傷の１６０Ｓ粒子に非常にしっかりと、かつ特異的に結合するという以前の観察結果に基づいている（Ｈｅｅｔａｌ．，．２０００）。ＰＶ１３０Ｓ粒子（Ａ粒子）が、ＣＤ１５５を効率的に結合するそれらの能力を失うことを考慮すると（Ｈｏｇｌｅ，２００２）、他のキャプシド中間体またはキャプシドサブユニットでＣＤ１５５−ＡＰと相互作用するものはないと予測され、したがって、無傷の粒子に対する特異性を確実にする。この考えの裏付けとして、Ｐ１キャプシド前駆体を発現するワクシニアウイルス株（Ａｎｓａｒｄｉｅｔａｌ．，１９９３）に感染した細胞からの溶解物は、いかなる定量化可能なシグナルももたらさなかった（データは図示せず）。

ＥＬＩＳＡ方法は、感染後の細胞溶解物等の粗サンプル中のウイルス粒子の定量化を可能にし、サンプルの取り扱いおよび精製（熱／化学的不活性化、酸化、分解等）の間の他の機構によるＰＦＵ／粒子の比の考えられる変化を最小化するはずである。本条件下では、シグナル増幅ステップを伴わないため、このアッセイの感度は約１０^７個のウイルス粒子である。これは、非常に低い背景をもたらした。このＥＬＩＳＡを用いて、既知の濃度の精製ＰＶ（Ｍ）で作製された標準曲線上での逆算によって、サンプル中のＰＶ粒子濃度を決定することができた（図４Ｅ）。ＥＬＩＳＡによる粒子測定は、直接ＵＶ方法によって得られた結果とよく合致した（図４Ｄ）。

結果の意味

本研究は、弱毒化ウイルスの生成のためのデノボでの遺伝子合成による、ＰＶキャプシドコード配列の大規模コドン脱最適化の有用性を示した。初期目標は、生弱毒化ウイルスワクチンを生成するためのツールとしての本技術の可能性を調査することであった。コドン脱最適化ウイルスは、非常に低い特異的感染性を有することがわかった（図４）。低い特異的感染性（単一ウイルス粒子が、細胞中の感染サイクルの開始に成功する可能性）は、宿主においてよりゆっくりと広がるウイルス感染をもたらす。これは、宿主生物が免疫応答を開始し、感染を除去するのにさらなる時間をかけることを可能にし、それは、弱毒化ウイルスワクチンにおいて最も望ましい特徴である。一方で、コドン脱最適化ウイルスは、野生型ウイルスと比較して、１細胞当たり同様の量の子孫を生成した一方、感染性は２〜３桁少なかった（図４）。これは、ｗｔと抗原的に区別できないウイルス粒子を、ｗｔウイルス自体の産生と同じくらい効果的かつコスト効率よく産生することを可能にする。しかしながら、低い特異的感染性によって、そのようなウイルス調合物の実際の取り扱いおよびプロセシングは、はるかに安全である。高度な封じ込め条件下での十分な量の毒性ウイルスの産生、および偶然あるいは悪意による製造施設からのウイルス漏出の関連リスクに関する懸念が増加しているため、本明細書に記載されるウイルスは、不活化ウイルスワクチンの産生において、より安全な代替手段として非常に有用であることを証明し得る。それらは、タンパク質レベルにおいてｗｔウイルスと１００％同一であるため、不活化ウイルスを受容した宿主における同一の免疫応答が保証される。

実施例４
ポリオウイルスの神経病原性へのコドン脱最適化の効果

マウス神経病原性試験

６から８週齢の間の４〜５匹のＣＤ１５５ｔｇマウス（系統Ｔｇ２１）（Ｋｏｉｋｅｅｔａｌ．，１９９１）の群に、３０μｌのＰＢＳ中の１０^２から１０^６ＰＦＵ／フォーカス形成単位（ＦＦＵ）の間のウイルス希釈液を脳内注射した。ＲｅｅｄａｎｄＭｕｅｎｃｈ（１９３８）の方法によって、半数致死量（ＬＤ_５０）の値を計算した。プラークまたは感染病巣アッセイによって、死亡時または麻痺時の脊髄組織におけるウイルス力価を決定した。

コドン脱最適化ポリオウイルスは、CD155tgマウスにおいて粒子単位で神経弱毒化される

本研究において構築されるウイルスの病原可能性を試験するために、ＣＤ１５５遺伝子導入マウス（Ｋｏｉｋｅｅｔａｌ．，１９９１）に、１０^２から１０^５ＰＦＵ／ＦＦＵの間の用量で、ＰＶ（Ｍ）、ＰＶ−ＳＤ、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}、およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}を脳内注射した。非常に直観に反して、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}および特にＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}は、ｗｔウイルスと同じくらいの神経病原性を有するか、またはｗｔウイルスよりもわずかに高い神経病原性さえ有することがわかったため、初期結果は困惑させるものであった。表４を参照されたい。

加えて、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}の感染後の麻痺の発症時は、ｗｔウイルスの発症時と同程度であった（データは図示せず）。同様に困惑させたのは、死亡時または麻痺時に、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}に感染したマウスの脊髄における、プラークアッセイによって決定されるウイルス負荷が、ｗｔウイルスに感染したマウスのウイルス負荷よりも、３０倍および３００倍それぞれ低かったという観察結果である（表４）。したがって、明らかにｗｔウイルスのほんの０．３％で複製するＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}が、ｗｔと同一の神経病原可能性を有する可能性は低いように思われる。しかしながら、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}における変化したＰＦＵ／粒子関係を構築した後に（実施例３を参照）、接種材料の量は、接種された実際の粒子数と関連付けることができるようになる。この修正を行った後に、粒子単位で、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}は、ｗｔと比較して２０倍および１００倍それぞれ神経弱毒化されることが確定された。表４を参照されたい。さらに、粒子単位で、麻痺したマウスの脊髄におけるウイルス負荷は、３個すべてのウイルスで非常に類似していた（表４）。

中枢神経系における発現を特に区別し得る、同義コドンでのＰＶキャプシド遺伝子の再設計が可能ではなかったこともまた、結論づけられた。これは、他によって記載されるコドンバイアスの組織特異的差異（Ｐｌｏｔｋｉｎｅｔａｌ．，２００４）が、組織限定的ウイルス表現型をもたらすにはあまりに小さすぎることが原因である可能性がある。脳特異的遺伝子のＰｌｏｔｋｉｎｅｔａｌ．が使用したものよりも大きなセットにおいて、感知できるほどの組織特異的コドンバイアスは、全く検出されなかった（データは図示せず）。しかしながら、この結論は、本発明の方法によって産生されるポリオウイルスが、実際に、マウスにおいて最大で１００倍神経弱毒化されるという事実から反れるものではない。すなわち、中枢神経系においてｗｔウイルスと同一の損傷をもたらすために、１００倍以上のコドンまたはコドンペア脱最適化ウイルス粒子が必要とされる。

実施例５
ポリオウイルスのゲノム翻訳へのコドン脱最適化の効果

生体外および生体内翻訳

本研究において、２個の異なるＨｅＬａ細胞Ｓ１０の細胞質抽出物を使用した。標準抽出物をＭｏｌｌａｅｔａｌ．（１９９１）の方法によって調製した。[³⁵S]メチオニン標識翻訳生成物を、ゲルオートラジオグラフィによって分析した。第２の抽出物を、それを透析せず、内因性細胞ｍＲＮＡを小球菌ヌクレアーゼで除去しなかったことを除いて、すでに記載ている方法で調製した（ＫａｐｌａｎａｎｄＲａｃａｎｉｅｌｌｏ，１９８８）。改変された抽出物との反応に、外因性アミノ酸またはｔＲＮＡを添加しなかった。抗２Ｃモノクローナル抗体９１．２３（ＰｆｉｓｔｅｒａｎｄＷｉｍｍｅｒ，１９９９）を用いて、ウエスタンブロット法によって、翻訳生成物を分析した。ＮＩＨ−Ｉｍａｇｅ１．６２ソフトウェアを使用して、スキャンされたゲル画像の画素数によって、２ＢＣバンドの相対強度を決定した。全ての場合において、翻訳反応を、２００ｎｇの種々の生体外転写されたウイルスゲノムＲＮＡでプログラムした。

生体内翻訳の分析のために、ＨｅＬａ細胞に、上記の生体外転写されたジシストロニックレプリコンを導入した。ＲＮＡ複製から分離された翻訳を評価するために、２ｍＭの塩酸グアニジンの存在下で導入を行った。細胞を受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に７時間溶解させ、続いて、デュアルホタル（Ｆ−Ｌｕｃ）およびウミシイタケ（Ｒ−Ｌｕｃ）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行った。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制御下で発現した、第１のシストロンのウミシイタケルシフェラーゼ活性による分裂によって、第２のシストロン（Ｐ１−Ｆｌｕｃ−Ｐ２−Ｐ３ポリタンパク質）の翻訳効率を正規化した。

コドン脱最適化ウイルスは、ゲノム翻訳レベルにおいて不完全である

合成ウイルスおよびｗｔＰＶ（Ｍ）は、それらのタンパク質構成において区別ができず、何の既知のＲＮＡ調節要素も、改変されたＲＮＡゲノムにおいて変化しなかったため、これらの設計は、細胞および組織指向性またはウイルスの免疫学的特性に影響を及ぼすことのない、弱毒化へのゲノム翻訳／複製の減少の効果の研究を可能にした。キャプシドコード配列への多くの準最適コドンの導入が、ゲノム翻訳の減少をもたらすはずであるという仮説の下に、ＰＶ−ＡＢゲノムを設計した。Ｐ１領域は、ポリタンパク質のＮ末端にあるため、全ての下流にある非構造タンパク質の合成は、Ｐ１領域にわたる翻訳の速度によって決定される。実際に翻訳が影響を受けているかどうかを試験するために、生体外翻訳を行った（図５）。

意外なことに、標準ＨｅＬａ細胞の細胞質Ｓ１０抽出物（Ｍｏｌｌａｅｔａｌ．，１９９１）における初期翻訳は、試験されたゲノムのいずれに対しても翻訳能の差を示さなかった（図５Ａ）。しかしながら、この翻訳系は、最大翻訳のための最適化されるため、それは、過剰アミノ酸およびｔＲＮＡの外部からの添加を含んでおり、それが遺伝子操作されたコドンバイアスを補い得ることも考えられる。したがって、透析せず、細胞ｍＲＮＡを小球菌ヌクレアーゼ処理によって除去しなかった、改変されたＨｅＬａ細胞抽出物で、生体外翻訳を繰り返した（図５Ｂ）。この抽出物における翻訳を、外因性ｔＲＮＡまたはアミノ酸を添加することなく行った。このように、感染細胞における環境により酷似している環境を作製したが、ここでは、ＰＶゲノムの翻訳は、細胞ｍＲＮＡとリソースを競合しながら、細胞供給のみに依存する。細胞ｍＲＮＡからの高い背景翻訳および非透析抽出物における低い［^３５Ｓ］取り込み速度の理由から、ウイルス特異的翻訳生成物のセットを、抗２Ｃ抗体（ＰｆｉｓｔｅｒａｎｄＷｉｍｍｅｒ，１９９９）を用いて、ウエスタンブロット法によって検出した。これらの変更された条件は、脱最適化された配列の程度と相関した、改変されたゲノムの翻訳効率の劇的な減少をもたらした。ＰＶ−ＳＤの翻訳が、ｗｔの翻訳と同程度であった一方で、３個の非感染ゲノム、ＰＶ−ＡＢ、ＰＶ−ＡＢ^{１５１３−３３８６}、およびＰＶ−ＡＢ^{７５５−２４７０}の翻訳は、約９０％減少した（図５Ｂ）。

Ｂｕｒｎｓｅｔａｌ．（２００６）は、本明細書に記載される実験に関連した実験を近年報告した。これらの著者らは、本研究におけるよりも、はるかに限られた程度にコドン使用を改変し、それらの変異ウイルスのどれも、致死表現型を発現しなかった。興味深いことに、Ｂｕｒｎｓｅｔａｌ．は、翻訳がそれらの変異ウイルスの表現型の変化において主要な役割を果たさなかったと断定し、結論は、本明細書に示されるデータと異なっている。非感染ＨｅＬａ細胞抽出物および過剰アミノ酸を添加した、ヌクレアーゼ処理したウサギ網状赤血球溶血液を採用した、Ｂｕｒｎｓｅｔａｌ．（２００６）が使用した生体外翻訳アッセイは、翻訳のいかなる有意な減少も検出できなかったことを説明していると思われる。図５Ａを参照されたい。

生体外翻訳系の最終的な人工的性質を考慮して、細胞における翻訳への種々のキャプシド設計の効果もまた研究した。この目的で、すでに報告されたジシストロニックレプリコン（ＺｈａｏａｎｄＷｉｍｍｅｒ，２００１）に基づいて、ジシストロニックポリオウイルスレポーターレプリコンを構築した（図６Ａ）。種々のＰ１カセットを、ホタルルシフェラーゼ（Ｆ−Ｌｕｃ）遺伝子のすぐ下流およびインフレームに挿入した。したがって、ポリオウイルスＩＲＥＳは、キャプシドと２Ａ^ｐｒｏプロテイナーゼとの間のホタルルシフェラーゼタンパク質を除いて、ウイルスゲノムにおけるものと同様の単一ウイルスポリタンパク質の発現を促進する。ＨＣＶＩＲＥＳの制御下のウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ−Ｌｕｃ）遺伝子の発現は、内部対照を提供する。ゲノム複製を完璧にブロックする、２ｍＭの塩酸グアニジンの存在下で、全ての実験を行った（Ｗｉｍｍｅｒｅｔａｌ．，１９９３）。この種類の構築物の使用は、Ｆ−Ｌｕｃ／Ｒ−Ｌｕｃの比を計算することによって、第２のシストロンの相対的発現の正確な決定を可能にした。Ｆ−Ｌｕｃ発現は、上流Ｐ１領域を通したリボソーム輸送の成功に依存するため、それは、ポリタンパク質翻訳速度への挿入されたＰ１配列の効果の指標を提供する。この方法を使用して、ウイルス背景における致死表現型（例えば、ＰＶ−ＡＢ、ＰＶ−ＡＢ^{１５１３−２４７０}、およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−３３８６}）と関連した、改変されたキャプシドコード領域が、翻訳速度を約８０〜９０％減少させたことが実際にわかった（図６Ｂ）。２個の生存ウイルス構築物、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}およびＰＶ−ＡＢ^{２９５４−３３８６}からのキャプシドは、ｗｔレベルの６８％および８３％での翻訳をそれぞれ可能にした。第１のシストロンの生体内翻訳速度は、３から１２時間の間の期間にわたって、全ての構築物において一定のままであり、ＲＮＡ安定性がコドン変化の影響を受けていないことを示唆する（データは図示せず）。結論として、これらの実験の結果は、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}に見られるように、３０％のＰ１領域にわたる比較的小さい翻訳効率の低下が、大きいウイルス複製表現型をもたらしたことから、ポリオウイルスが、非常に効率的な翻訳に依存することを示唆する。

実施例６
コドン脱最適化ポリオウイルスの遺伝的安定性

表現型に寄与する大きなゲノム断片にわたって分布した多くの変異の効果の理由から、コドン脱最適化ウイルスは、遺伝的に安定した表現型を有するはずである。コドン脱最適化ウイルスの遺伝的安定性を研究するために、かつこれらのウイルスが遺伝的に安定しているという前提を試験するために、ウイルスは適切な宿主細胞において継代される。ワクチン設計の現在の「千の傷による死（ｄｅａｔｈｂｙ１０００ｃｕｔｓ）」理論の利点は、野生型への復帰のリスクの低下である。典型的なワクチン株は、ｗｔウイルスとはほんの数個の点突然変異によって異なり、これらの小サブセットのみが、実際に弱毒化に寄与し得る。ウイルス進化は、そのような少数の活性変異を戻す働きをする。実際に、そのような復帰は、世界からポリオウイルスを根絶するというＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）のプロジェクトに深刻な脅威を与える。生ワクチン株が使用される限り、この株がｗｔに戻る可能性は非常に高い。そのような復帰は、新ポリオの発生源としてすでに認められている（Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕｅｔａｌ．，１９９７、Ｋｅｗｅｔａｌ．，２００２、Ｓｈｉｍｉｚｕｅｔａｌ．，２００４）。

本合成設計における何百から何千もの点突然変異によって、ｗｔ株への復帰のリスクはほとんどない。しかしながら、自然選択は強力であり、継代によって、合成ウイルスは必然的に進化する。この進化の終点を決定するための研究が進行中であるが、起こりそうな結果は、それらが、元の設計からそれほど遠くない局所的最適に捕らわれてしまうことである。

この理論を実証するために、代表的な再操作されたウイルスは、宿主細胞において最大で５０代継代される。進化したウイルスのゲノムは、１０、２０、および５０代継代後に配列される。より具体的に、脱最適化されたウイルスの各種類から少なくとも１つのキメラの例が選択される。開始キメラは、非常に衰弱しているが死滅していない。例えば、ＰＶに対して、キメラは、ＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}およびＰＶ−Ｍｉｎ^{７５５−２４７０}であり得る。各開始ウイルスから、１０個のプラークが選択される。１０個のプラークに由来するウイルス集団の各々は、合計で５０代大量継代される。１０代、２０代、および５０代継代後、１０個のプラークの精製ウイルスが再び選択され、それらのゲノムは、１０個の親ウイルスのゲノムと合わせて配列される。継代後、プラークサイズを検査し、一段増殖速度として、プラーク形成単位／ｍｌを決定することによって、４０（１親ウイルス当たり３０＋１０）個の選択されたウイルスの適応度は、それらの親の適応度と比較される。選択継代単離株は、適切な宿主細胞においてそれらの病原性に関して試験される。たとえば、ポリオウイルスの病原性は、ＣＤ１５５ｔｇマウスにおいて試験される。

ゲノムの配列決定の際、１０個全てのウイルス株が共通のある変異を有するという所見は、これらの変化が、ウイルス適応度に対して特に重要であることを示唆し得る。これらの変化は、主要な中止部位として、先端プリント化によって同定される部位と比較されてもよく（実施例９を参照）、両方の種類のアッセイの組み合わせは、ウイルス適応度に最も有害な変異コドンを同定し得る。反対に、異なる株が全ての異なる変異を有するという所見は、変異コドン変化の多くが、適応度へのそれらの効果において非常に類似していることを示唆し得る。これまで、ＨｅＬａ細胞における１０代継代後、ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}およびＰＶ−ＡＢ^{２４７０−２９５４}は、適応度のいかなる感知できる増加も経験していない。ウイルス感染力価は、継代実験の開始と同様に低いままであり（１０^７ＰＦＵ／ｍｌおよび１０^６ＦＦＵ／ｍｌ）、プラーク表現型は変化しなかった（データは図示せず）。継代中に遺伝子変化が発生するのか、およびどの種類の遺伝子変化が発生するのかを決定するために、これらの継代されたウイルスの配列分析が現在進行中である。

Ｂｕｒｎｓｅｔａｌ．（２００６）は、彼らの変化したコドン組成物が、ＨｅＬａ細胞において２５連続継代中、大部分保存されたことを報告した。彼らは、改変されていないサビン２ウイルスおよびコドン置換ウイルスの両方のＨｅＬａ細胞における、複製への適応度が、より高い継代数で増加した一方で、改変ウイルスの相対的適応度は、改変されていないウイルスの適応度よりも低いままであったことを発見した。したがって、あらゆる点から考えると、ＳＡＶＥによって再設計されるウイルスは、遺伝的に非常に安定している。本発明のコドンおよびコドンペア脱最適化ウイルスに関する予備データは、多数のコドンにわたって分布するそれほど大きくないコドン変化は、個々のウイルス表現型の遺伝的安定性を高め、したがって、それらのワクチンでの使用の可能性を高めることを示唆する。

実施例７
コドン対を脱最適化することによるポリオウイルスのキャプシド領域の再操作

コドン対バイアスの計算

考えられる３７２１個の非「ストップ」含有コドン対（例えば、ＧＴＴ−ＧＣＴ）のそれぞれのコドン対は、遺伝子の所与の「トレーニングセット」に特異的な、割り当てられた「コドン対スコア」または「ＣＰＳ」を有する。所与のコドン対のＣＰＳは、この遺伝子セットにおいて（この実施例においては、ヒトゲノム）予測された数に対する、実測発生数の対数比として定義される。特定のコドン対の実際の発生数（または言い換えれば、特定のアミノ酸対が特定のコドン対によってコード化される可能性）の決定は、単にコード配列の特定のセットにおけるコドン対の実際の発生数を数えるということである。しかしながら、予測数の決定は、さらなる計算を必要とする。予測数は、ＧｕｔｍａｎａｎｄＨａｔｆｉｅｌｄと同様に、アミノ酸頻度およびコドンバイアスの両方とは無関係になるように計算される。すなわち、予測頻度は、アミノ酸が特異的コドンによってコード化される回数の相対的割合に基づいて計算される。正のＣＰＳ値は、所与のコドン対が統計的に過剰に存在することを示し、負のＣＰＳは、対がヒトゲノムにおいて統計的に過少に存在することを示す。

ヒトに関してこれらの計算を行うために、合計で１４，７９５個の遺伝子を含有する、常に注釈付きのヒトコード領域の最新のＣｏｎｓｅｎｓｕｓＣＤＳ（ＣＣＤＳ）データベースを使用した。このデータセットは、コドンおよびコドン対、したがって、ゲノムスケールでのアミノ酸およびアミノ酸対頻度を提供する。

ＧｕｔｍａｎａｎｄＨａｔｆｉｅｌｄ（１９８９）の方法をさらに強化するために、Ｆｅｄｅｒｏｖｅｔａｌ．（２００２）のパラダイムを使用した。これは、コドン頻度と無関係の所与のコドン対の予測頻度、および特定のアミノ酸対をコード化する隣接コドンの非ランダム関連性の計算を可能にする。

上記の式を使用して、次いで、個々のコード配列中の個々のコドン対が、全ヒトＣＣＤＳデータセットを使用して計算した対応するゲノム
と比較して、過剰または過少に存在しているかどうかを決定した。この計算は、ヒトコード領域における過剰に存在するコドン対に対して正の
を、過少に存在するコドン対に対して負の値をもたらした（図７）。

以下の式に従って、全てのコドン対スコアを平均化することによって、個々のコード配列の「総合」コドン対バイアスを計算した。

したがって、全コード領域のコドン対バイアスは、領域を含む個々のコドン対スコアの全てを合計し、この合計をコード配列の長さで割ることによって計算される。

コドン対バイアスの変化

ＰＶ（Ｍ）のキャプシドコード領域を再操作し、コドン対バイアスを変化させた。コドンバイアスおよびｗｔウイルスゲノムの全ての他の特徴を保存しながら、可能な限り多い数のほとんど使用されないコドン対（ウイルスＰＶ−Ｍｉｎを作製）、または可能な限り多い数の広く使用されるコドン対（ウイルスＰＶ−Ｍａｘを作製）を導入した。我々の方法を以下により詳細に説明する。

２つの配列を設計し、正（ＰＶ−Ｍａｘ、配列番号４）および負（ＰＶ−Ｍｉｎ、配列番号５）の方向に、ポリオウイルスＰ１領域コドン対スコアを変化させた。アミノ酸配列を変化させないまま残し、コドンバイアスを最小限に改変させることによって、Ｐ１キャプシド領域に対する最少または最大コドン対スコアの最適化を目的に、コドンをシャッフルするために、シミュレーテッドアニーリングアルゴリズムを使用た。スプライス部位の除去および局所的二次構造の減少のために、得られる配列を処理した。次いで、商業ベンダー、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによってこれらの配列を合成し、配列検証した。新キャプシド遺伝子を使用し、２つのＰｆｌＭＩ制限部位を介して、ｗｔＰＶの感染性ｃＤＮＡクローンにおいて同等のｗｔ配列を置換した。実施例１に記載されるように、ウイルスを得た。

ＰＶ−Ｍａｘウイルスに対して、２４時間後に感染細胞の死が見られ、ｗｔウイルスで得られた結果と同様の結果であった。ＰＶ−Ｍａｘの最大ウイルス力価および一段増殖速度も、ｗｔと同一であった。対照的に、ＰＶ−Ｍｉｎ変異体ＲＮＡを導入した細胞をもたらした細胞死はなく、生存ウイルスは全く回収できなかった。導入を複数回繰り返したが、結果は同じであった。ＰＶ−Ｍｉｎを導入した細胞の溶解物を４代連続盲目継代させたが、それでもなおウイルスは全く得られなかった。

ＰＶ−Ｍｉｎのキャプシド領域を、ＰＶ−ＡＢ（少ないコドンバイアス）に対して行ったように、２つのより小さいサブフラグメント（ＰＶ−Ｍｉｎ^{７５５−２４７０}およびＰＶ−Ｍｉｎ^{２４７０−３３８６}）に分割し、サブフラグメントをｗｔ背景にクローン化した。ＰＶ−ＡＢサブクローンと同様に、ＰＶ−Ｍｉｎのサブクローンは非常に健康ではなかったが、死滅していなかった（図８）。ＰＶ−ＡＢウイルスで認められたように、ＰＶ−Ｍｉｎウイルスの表現型は、子孫ウイルスの産生の低下よりもむしろ、ウイルス粒子の特異的感染の減少の結果である。進行中の研究は、ＣＤ１５５ｔｇマウスにおけるコドン対弱毒化キメラを、それらの病原性を決定するために試験するステップを伴う。また、ＰＶ−ＭｉｎｃＤＮＡのサブクローンを含むさらなるキメラウイルスも製造されており、それらの複製する能力が測定されている（以下の実施例８および９を参照）。また、より長い配列にわたって中程度の量のコドン対バイアスを分布させる効果が確認されている。例えば、ポリオウイルス誘導体は、約−０．２のコドン対バイアス（ＰＶ−０．２、配列番号６）を有するように設計され、野生型からの変異は、Ｐ１キャプシド領域の全長にわたって分布している。これは、同様のコドン対バイアスを有するが、より短い配列にわたって分布するコドン変化を有する、ＰＶ−ＭｉｎＺ（ＰＶ−Ｍｉｎ^{２４７０−３３８６}）と対照的である。

Ｖ−ＭｉｎおよびＰＶ−０．２が、野生型に対してコドン使用の変化がほとんどない配列であるということは、指摘しておく価値がある。大部分、配列は、野生型ＰＶ（Ｍ）ウイルスに現れるコドンと同一のコドンを採用する。ＰＶ−ＭｉｎＺは、それがＰＶ（Ｍ）にサブクローン化されたＰＶ−Ｍｉｎの一部を含有するという点で、幾分異なる。ＰＶ−ＭｉｎおよびＰＶ−０．２と同様に、コード化されたタンパク質配列は変化しないが、サブクローン化された領域あるいは全Ｐ１キャプシド領域のいずれかにおいて決定されたコドン使用は、コドン再編成配列の一部のみ（より小さい断片においてではなく、その全長にわたって同一コドンを有する）が、ＰＶ（Ｍ）野生型配列に置換されているため、ＰＶ−Ｍｉｎ（ｏｒＰＶ−０．２）と同一ではない。もちろん、変異キャプシド配列は、ヌクレオチド２４７０−３３８６からの領域においてのみコドンをシャッフルする一方で、全Ｐ１遺伝子にわたってコドン対バイアスを有するように設計され得る。

実施例８
コドン対バイアスの変化によって構築されるウイルスは、ＣＤ１５５ｔｇマウスにおいて弱毒化される

マウス脳内接種、生存

動物モデルにおいてＰＶ−Ｍｉｎ^{７５５−２４７０}およびＰＶ−Ｍｉｎ^{２４７０−３３８５}の弱毒化を試験するために、これらのウイルスを精製し、ＣＤ１５５（ＰＶＲ／ポリオウイルス受容体）遺伝子導入マウスに脳内接種した（表５を参照）。実際に、これらのウイルスは、我々のアルゴリズムを使用したコドン対バイアスのカスタマイズによって、大幅に弱毒化した表現型を示した。ＰＶＭ−ｗｔが原因で、１０ｅ５ビリオンで抗原投与された全てのマウスが死亡したため、ＰＶＭ−ｗｔはより高い用量で接種しなかった。この弱毒化表現型は、我々のアルゴリズムを使用したコドン対バイアスのカスタマイズが原因である。これは、コドン対バイアスのカスタマイズが、生ワクチンを作製するための手段に適用できることを再確認する。

これらの所見は、２つの点で重要である。第１に、それらは、コドン対バイアスが機能的に重要である、すなわち、有害な表現型は、コドン対バイアスを分布させることによって生成することができるという最初の明確な実験的証拠である。第２に、それらは、ウイルスを弱毒化するために使用することができる、同義コドン変化のさらなる側面をもたらす。これらのコドンペア弱毒化キメラの生体内病原性は、ＣＤ１５５ｔｇにおいて試験されており、弱毒化表現型を示している（表５を参照）。ＰＶ−ＭｉｎキャプシドｃＤＮＡのサブクローンを含むさらなるキメラウイルスが、感染細胞における複製に関して分析されており、同様に弱毒化表現型を示している。

実施例９
改変コドン対バイアスを有する合成ポリオウイルスの構築：ワクチン開発に対する意味

コドン対脱最適化配列を産生するためのコドン対バイアスの計算、アルゴリズムの実行

我々は、コドン対バイアスを定量化するためのアルゴリズムを開発した。可能な全ての個々のコドン対に、「コドン対スコア」または「ＣＰＳ」を与えた。我々は、ＣＰＳを、全てのヒトコード領域にわたる各コドン対の予測発生数に対する、実測発生数の自然対数比と定義する。
特定のコドン対の測定された発生の計算は単純（遺伝子セットにおける実際の数）であるが、コドン対の予測発生数は、さらなる計算を必要とする。我々は、ＧｕｔｍａｎａｎｄＨａｔｆｉｅｌｄと同様に、この予測数がアミノ酸頻度およびコドンバイアスの両方と無関係になるように計算する。すなわち、予測頻度は、アミノ酸が特異的コドンによってコード化される回数の相対的割合に基づいて計算される。正のＣＰＳ値は、所与のコドン対が統計的に過剰に存在することを示し、負のＣＰＳは、対がヒトゲノムにおいて統計的に過少に存在することを示す。

これらの計算されたＣＰＳを使用すると、次いで、いかなるコード領域も、コドン対スコアの平均を取ることによって、過剰に存在する、または過少に存在するコドン対を使用するとみなすことができ、したがって、全遺伝子に対するコドン対バイアス（ＣＰＢ）を得ることができる。
示され図示される（図７）方程式を使用して、ＣＰＢを全ての注釈付きヒト遺伝子に対して計算した。グラフ中の各点は、単一ヒト遺伝子のＣＰＢに対応する。分布のピークは、０．０７の正のコドン対バイアスを有し、全ての注釈付きヒト遺伝子に対する平均スコアである。また、負のコドン対バイアスを有する遺伝子は非常に少ない。次いで、このバイアスを操作するために、ＣＰＢを定義および計算するために確立された方程式を使用した。

コドン対脱最適化された配列を産生するためのコンピュータによるアルゴリズムの開発および実行

これらの式を使用して、我々は、次に、元のアミノ酸配列を維持しながら、いかなるコード領域のＣＰＢも操作するための、コンピュータによるアルゴリズムを開発した。アルゴリズムは、遺伝子のコドン使用を維持する（すなわち、各既存コドンの使用頻度を保存する）が、ＣＰＢが増加または減少することができるように既存コドンを「シャッフル」する重要な能力を有する。アルゴリズムは、完全長最適化に好適な数学的プロセスである、シミュレーテッドアニーリングを使用する（Ｐａｒｋ，Ｓ．ｅｔａｌ．，２００４）。例えば、ＲＮＡの折り畳みの自由エネルギー等の他のパラメータもまた、このアルゴリズムの制御下にある。この自由エネルギーは、コドン再編成の結果としての二次構造の大きな変化を予防するために、狭い範囲内で維持される。最適化プロセスは、特に、ヘアピンまたはステムループ等の、そうでなければカスタマイズされたＲＮＡにおいて生じ得る、大きな二次構造を有するいかなる領域の生成も除外する。このコンピュータソフトウェアを使用して、ユーザは、単に所与の遺伝子のｃＤＮＡ配列を入力するだけでよく、遺伝子のＣＰＢは、実験者が適切だと考えるようにカスタマイズすることができる。

過剰に存在する、あるいは過少に存在するコドン対によってコード化されるＰ１のデノボ合成

そのＰ１が過剰に存在する、あるいは過少に存在するコドン対によってコード化された、新規合成ポリオウイルスを得るために、我々は、ポリオウイルスＩ型Ｍａｈｏｎｅｙ（ＰＶ（Ｍ）−ｗｔ）のＰ１構造領域に対応するＤＮＡ配列を、我々のプログラムに入力し、過剰に存在するコドン対（５６６変異）を使用してＰＶ−Ｍａｘ−Ｐ１を、過少に存在するコドン対（６３１変異）を使用してＰＶ−Ｍｉｎ−Ｐ１を得た。これらのカスタマイズされた新規合成Ｐ−１領域のＣＰＢスコアが、ＰＶ−Ｍａｘ＝＋０．２５およびＰＶ−Ｍｉｎ＝−０．４８である一方で、７ＰＶ（Ｍ）−ｗｔのＣＰＢは、−０．０２である（図７）。

さらなるカスタマイズは、Ｐ１領域のサブクローン化を可能にするために、所与の間隔で両方の合成配列に設計した制限部位の含有を含んだ。これらの合成Ｐ１フラグメントをＢｌｕｅＨｅｒｒｏｎＣｏｒｐ．によってデノボ合成し、ポリオウイルスの完全長ｃＤＮＡ構築物に組み込んだ（図１１）（Ｋａｒｌｉｎｅｔａｌ．，１９９４）。ＰＶ（Ｍ）−ｗｔ配列の小フラグメント（３個のコドン、９個のヌクレオチド）を、両方の構築物におけるＡＵＧ開始コドンの後に残し、翻訳が全ての合成ウイルスに対して同等に開始することを可能にし、したがって、翻訳の伸長段階へのＣＰＢの効果のより正確な測定を提供した。

ＤＮＡ合成、プラスミド、合成キャプシドおよびバクテリアのサブクローン化

ＰＶゲノムのヌクレオチド４９５〜３６３６に対応する、大きなコドンペア変化ＰＶｃＤＮＡフラグメントを、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＣｏｒｐ．によって、彼らが所有するＧｅｎｅＭａｋｅｒ（登録商標）システムを使用して合成した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ／）。全てのその結果生じたポリオウイルスｃＤＮＡクローン／サブクローンを、特異的制限部位を使用して、ＰＶ１（Ｍ）ｃＤＮＡクローンｐＴ７ＰＶＭから構築した（ｖａｎｄｅｒＷｅｒｔ，ｅｔａｌ．，１９８６）。ＰｆｌＭＩ消化およびそのＰｆｌＭＩフラグメントが除去されたｐＴ７ＰＶＭベクターへの挿入によって、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎの担体ベクターから完全長ＰＶ−Ｍｉｎ、ＰＶ−Ｍａｘカセットを放出した。ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩでの同時の消化、次いで、このフラグメントを同様に消化されたｐＴ７ＰＶＭベクターと交換することによって、ＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺ構築物を得た。ＢｓｍＩ消化および同様に消化したｐＴ７ＰＶＭとのフラグメント／ベクターの交換によって、ＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺを構築した。ＰＶ−ＭｉｎＸＹ構築物をＢｓｍＩで消化し、このフラグメントを消化したｐＴ７ＰＶＭに対するＢｓｍＩフラグメントと交換することによって、ＰＶ−ＭｉｎＹを構築した。プラスミド形質転換および増幅は全て、大腸菌ＤＨ５αを介して達成した。

ＣＰＢ変化キャプシド領域を含有するキメラウイルスの生成：Ｐ１全体にわたって過少に存在するコドン対バイアスは、ヌル表現型をもたらす

ポリオウイルスゲノム配列の上流にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータを使用して、プラスセンスＲＮＡを転写した。上記からの１．５μｇの所与のプラスミドｃＤＮＡクローンを、ＥｃｏＲＩ消化を介して線状化し、次いで、ｃＤＮＡの上流にあるそのプロモータによって促進される、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を介して、２時間３７℃でＲＮＡに転写した（ｖａｎｄｅｒＷｅｒｆｅｔａｌ．，１９８６）。改変されたＤＥＡＥ−デキストラン方法（ｖａｎｄｅｒＷｅｒｆｅｔａｌ．，１９８６）を使用して、このＲＮＡをを１ｘ１０^６個のＨｅＬａＲ１９細胞に導入した。次いで、これらの細胞を室温（ｒｏｏｍ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；ＲＴ）で３０分間インキュベートした。導入の上清を除去し、２％仔ウシ血清（ＢＣＳ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を添加し、細胞を３７℃でインキュベートし、細胞変性効果（ＣＰＥ）の発症に関して観察した（最大で４日間）。

ＰＶ−ＭａｘＲＮＡ導入は、２４時間で９０％の細胞変性効果（ＣＰＥ）を産生し、それはＰＶ（Ｍ）−ｗｔＲＮＡの導入と同程度である。ＰＶ−Ｍａｘウイルスは、野生型と同一のサイズのプラークを生成した。対照的に、ＰＶ−ＭｉｎＲＮＡは、９６時間後に目に見える細胞変性効果を全く産生せず、導入された細胞からの上清の４代盲目継代の後でさえ、生存ウイルスを単離することはできなかった。

ＰＶ−ＭａｘＲＮＡ導入を受ける、細胞からの上清の後続の使用もまた、１２時間で９５％のＣＰＥを産生し、したがって、導入されたゲノム材料が、ＰＶ−Ｍａｘポリオウイルスビリオンの産生に成功したことを示唆する。対照的に、ＰＶ−ＭｉｎウイルスＲＮＡは、９６時間後に目に見えるＣＰＥを何ももたらさず、非常に低いレベルのウイルスを含有すると考えられる、上清の４代盲目継代もまた、ＣＰＥを産生しなかった。したがって、Ｐ１領域における、過少に存在するコドン対を利用する完全長ＰＶ−Ｍｉｎ合成配列は、生存ウイルスを生成することができず、したがって、サブクローン化される必要があり得る。

ＨｅＬａＲ１９細胞を、１０％ＢＣＳを含有するＤＭＥＭ中に単分子層として維持した。１ＭＯＩを使用して、（１．０ｘ１０^８個の細胞）ＨｅＬａＲ１９単分子層上で、ウイルス増幅を達成した。３日間、またはＣＰＥが認められるまで、感染細胞を２％ＢＣＳを含有するＤＭＥＭ中で、３７℃でインキュベートした。３回の冷凍／解凍サイクルの後に、低速度遠心分離によって、細胞残屑を溶解物から除去し、ウイルスを含有する上清をさらなる実験に使用した。

ＨｅＬａＲ１９細胞の単分子層を５ＭＯＩの所与のウイルスに感染させることによって、一段増殖曲線を得、接種材料を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、０、２、４、７、１０、２４、および４８時間、３７℃でインキュベートした。次いで、これらの時点を、プラークアッセイによって分析した。ＨｅＬａＲ１９細胞の単分子層に対して、全てのプラークアッセイを行った。これらの細胞を、精製ウイルスの所与の増殖曲線の時点の連続希釈で感染させた。ついで、これらの細胞を２％ＢＣＳを含有する変法イーグル培地中の０．６％のトラガカントゴムで重層し、次いで、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔおよびＰＶ−Ｍａｘに対していずれも２日間、ならびにＰＶ−Ｍｉｎ（Ｘ、Ｙ、ＸＹ、またはＺ）ウイルスに対して３日間、３７℃でインキュベートした。次いで、これらをクリスタルバイオレット染色によって現像し、目に見えるプラークを数えることによって、ＰＦＵ／ｍｌ力価を計算した。

過少に存在するコドン対バイアスの小領域は、生存性を助けるが、ウイルスを弱毒化する

ＰＶ−Ｍｉｎ配列において設計された制限部位を使用して、我々は、ＰＶ−ＭｉｎＰ１領域の一部を、それ以外は野生型のウイルスにサブクローン化し、Ｐ１のサブ領域のみが、少ないコドン対バイアスを有したキメラウイルスを産生した（図１１）（ｖａｎｄｅｒＷｅｒｆｅｔａｌ．，１９８６）。これらのサブクローンの各々から、生体外転写によってＲＮＡを産生し、次いで、ＨｅＬａＲ１９細胞に導入し、異なる程度の弱毒化を有するウイルスを得た（生存性スコア、図１１）。Ｐ１フラグメントＸおよびＹは、それぞれわずかに弱毒化されているが、しかしながら、合わせられると、それらは、相当に弱毒化されたウイルス（ＰＶ−Ｍｉｎ^{７５５−２４７０}、ＰＶ−ＭｉｎＸＹ）をもたらす（図３、４）。ウイルスＰＶＭｉｎ^{２４７０−３３８５}（ＰＶ−ＭｉｎＺ）は、ＰＶ−ＭｉｎＸＹとほぼ同程度の弱毒化される。構築物ＰＶ−Ｍｉｎ^{１５１３−３３８５}（ＹＺ）は、プラークをもたらさず、したがって、明らかに、生存ウイルスをもたらすにはあまりに弱毒化されすぎている。異なる程度の弱毒化を示した、これらのウイルス構築物を、それらの実際の増殖速度を決定するためにさらに研究した。

弱毒化の一段増殖速度および機構：特異的感染は減少する

各生存構築物に対して、一段増殖速度を分析した。これらの速度は、概して、それらが同一の基本的な方法で進む（すなわち、エクリプス期、続いて急速な対数増殖）という点で、野生型の速度と同様である。しかしながら、全てのＰＶ−Ｍｉｎ構築物に対して、プラーク形成単位（ＰＦＵ）での最終力価は、典型的に、野生型ウイルスの最終力価よりも１〜３桁低かった（図１２Ａ）。

ウイルスが、ＰＦＵの代わりに１ｍｌ当たりのウイルス粒子で測定される場合（図１２Ｂ）、わずかに異なる結果が得られ、これらのウイルスが、１感染サイクル当たりの１細胞当たり、野生型ウイルスとほぼ同等の粒子数を産生することを示唆する。１ｍｌ当たりのウイルス粒子を単位として、ほとんどの弱毒化ウイルスは、ほんの７８％（ＰＶ−ＭｉｎＸＹ）または８２％（ＰＶ−ＭｉｎＺ）弱毒化され、それは対数スケールで１桁未満である。したがって、これらのウイルスは、それらの特異的感染において、約２桁弱毒化されると思われる（プラークを精製するために必要とされるビリオン数）。

特異的感染が減少したことを確認するために、我々は、高度に精製されたウイルス粒子を使用して、ＰＦＵ当たりのウイルス粒子の比を再測定した。選択されたウイルスを１０^８個のＨｅＬａＲ１９細胞で増幅した。ウイルス溶解物をＲＮＡｓｅＡで処理し、ＯＤ値を曖昧にし得る、露出したウイルスゲノムおよびいかなる細胞ＲＮＡも破壊した。また、次いで、ウイルス溶解物を０．２％ＳＤＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡで１時間インキュベートし、細胞および非ビリオンウイルスタンパク質を変性させた。適切に折り畳まれ形成されたポリオウイルスキャプシドは、この荒いＳＤＳ処理に生き残るが、アルファ粒子は生き残らない（Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，２００５）。次いで、これらの処理された溶解物からのビリオンをスクロース勾配での超遠心分離によって精製した。式：９．４ｘ１０^１２粒子／ｍｌ＝１ＯＤ_２６０単位を使用して、２６０ｎｍの光学濃度によって、ウイルス粒子濃度を測定した（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ，１９８５）。４個のウイルスの各々に対して、同様の数の粒子を産生した（表６）。次いで、これらの精製ビリオンを使用して、プラークアッセイを行った。この場合もやはり、ＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺは、プラークを生成するために、野生型よりもはるかに多くのウイルス粒子を必要とした（表６）。

野生型ウイルスに対して、特異的感染は１３７個の粒子当たり１ＰＦＵであると計算され（表６）、文献（Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，２００６、ＳｃｈｗｅｒｄｔａｎｄＦｏｇｈ，１９５７、ＪｏｋｌｉｋａｎｄＤａｒｎｅｌｌ，１９６１）と一致する。ウイルスＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺの特異的感染性は、１０，０００個の粒子当たり１ＰＦＵに近い（表６）。

さらに、合成ウイルスの熱安定性を、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔの熱安定性と比較し、新規ＲＮＡの一部を有するこれらの粒子が、同等に安定していたというＳＤＳ処理データを再確認した。実際に、これらの合成ウイルスは、５０℃でインキュベートし、経時変化として定量化した場合、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔと同一の温度プロファイルを有した（データは図示せず）。

過少に存在するコドン対は、翻訳効率を低下させるが、過剰に存在する対は、翻訳を高める

コドン対バイアス存在に対する一仮説は、過少に存在する対の利用が、不十分な、または遅い翻訳速度をもたらすことである。我々の合成ウイルスは、我々の知る限り、高い濃度の過少に存在するコドン対を含有する最初の分子であり、したがって、翻訳仮説の試験に好適な最初の分子である。

翻訳へのコドン対バイアスの効果を測定するために、我々は、ジシストロニックレポータを使用した（Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，２００６）（図１３）。第１のシストロンは、Ｃ型肝炎ウイルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制御下で、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ−Ｌｕｃ）を発現し、正規化対照として使用される。第２のシストロンは、ポリオウイルスＩＲＥＳの制御下で、ホタルルシフェラーゼ（Ｆ−Ｌｕｃ）を発現する。しかしながら、この第２のシストロンにおいて、ポリオウイルスのＰ１領域がＦ−Ｌｕｃに先行し、このＰ１領域は、本明細書に記載される合成配列変異体のいずれによってもコード化され得る。Ｆ−Ｌｕｃは、Ｐ１領域のタンパク質との融合タンパク質として翻訳されるため、Ｐ１領域の翻訳可能性は、産生されるＦ−Ｌｕｃタンパク質の量に直接影響を与える。したがって、Ｒ−Ｌｕｃ発光に対するＦ−Ｌｕｃ発光の比は、種々のＰ１コード化の翻訳可能性の指標である。

野生型のＰ１領域ＰＶ−Ｍａｘ、ＰＶ−Ｍｉｎ、ＰＶ−ＭｉｎＸＹ、およびＰＶ−ＭｉｎＺを「Ｐ１」と標識される領域に挿入した（図１３Ａ）。ＰＶ−ＭｉｎＸＹ、ＰＶ−ＭｉｎＺ、およびＰＶ−Ｍｉｎは、野生型Ｐ１領域が生成するよりもはるかに少ないＲ−Ｌｕｃ単位当たりのＦ−Ｌｕｃを生成し、過少に存在するコドン対が、不十分な、または遅い翻訳速度をもたしていることを強く示唆する（図１３）。対照的に、ＰＶ−ＭａｘＰ１（過剰に存在するコドン対を使用）は、Ｒ−Ｌｕｃ単位当たりのＦ−Ｌｕｃをより多く産生し、翻訳が、実際に、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔＰ１と比較して、ＰＶ−ＭａｘＰ１に対してよりよいことを示唆する。

ジシストロニックレポータ構築および生体内翻訳

ジシストロニックレポータ構築物を、ｐｄｉＬｕｃ−ＰＶに基づいて全て構築した（Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，２００６）。オリゴヌクレオチドＰ１ｍａｘ−２Ａ−ＲＩ（＋）／Ｐ１ｍａｘ−２Ａ−ＲＩ（−）またはＰ１ｍｉｎ−２Ａ−ＲＩ（＋）／Ｐ１ｍｉｎ−２Ａ−ＲＩ（−）をそれぞれ利用して、ＰＣＲによって、ＰＶ−ＭａｘおよびＰＶ−Ｍｉｎキャプシド領域を増幅した。ＰＣＲフラグメントをゲル精製し、次いで、中間ベクター、ｐＣＲ−（登録商標）−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。次いで、この中間ベクターをＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞中で増幅した。Ｑｕｉａｇｎｅミニプレップによるプラスミドの調製後、ＰＶ−Ｍｉｎを含有する中間ベクターをＥｃｏＲＩで消化し、これらのフラグメントを、ＥｃｏＲＩで同様に消化したｐｄｉＬｕｃ−ＰＶベクターに結紮した（Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，２００６）。これらのプラスミドも、ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増幅した。ｐｄｉＬｕｃ−ＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびｐｄｉＬｕｃ−ＰＶ−ＭｉｎＺを構築するために、ｐｄｉＬｕｃ−ＰＶおよびｐｄｉＬｕｃ−ＰＶ−ＭｉｎをＮｈｅＩで同様に消化し、得られる制限フラグメントをそれぞれのベクター間で交換した。次いで、これらをＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞に形質転換し、次いで、増幅した。これらのクローンの４個全てから、Ｔ７ポリメラーゼ方法（ｖａｎｄｅｒＷｅｒｆｅｔａｌ．，１９８６）によってＲＮＡを転写した。

合成キャプシドの生体内翻訳効率を分析するために、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ）を介して、１２ウェルディッシュ上の２ｘ１０^５個のＨｅＬａＲ１９細胞に、ジシストロニックレポータ構築物のＲＮＡを導入した。投入ＲＮＡのみの翻訳を定量化するために、２ｍＭの塩酸グアニジン（ＧｕＨＣＬ）の存在下で導入を行った。導入の６時間後、受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって溶解させ、次いで、これらの溶解物を、デュアルホタル（Ｆ−Ｌｕｃ）ウミシイタケ（Ｒ−Ｌｕｃ）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって分析した。

ＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺの遺伝的安定性

ＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺはそれぞれ、何百もの変異（それぞれ４０７および２２４）を含有し、各変異は、全コドン対バイアスの極めてわずかな減少を引き起こすため、我々は、これらのウイルスが、野生型毒性に戻るのは非常に困難であるはずだと信じている。この考えの直接試験として、ウイルスＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺをそれぞれ、０．５のＭＯＩで１５代連続継代した。表現型復帰に対して力価を監視し、復帰または変異に対して継代されたウイルスの配列を監視した。１５代継代後、ウイルスにおける表現型の変化はなく（すなわち、同一の力価、ＣＰＥの誘発）、合成領域において固定変異はなかった。

熱安定性および継代

合成ウイルス、ＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺの安定性を試験し、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔと比較した。ＰＢＳ中に懸濁された１ｘ１０^８個の粒子を６０分間５０℃まで加熱し、次いで、プラークアッセイによって無傷のウイルス粒子の減少を５、１５、３０、および６０分で測定することによって、これを達成した（図１４）。ウイルスＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺのＰ１領域の合成部分の遺伝的安定性を試験するために、これらのウイルスを連続継代した。１ｘ１０^６個のＨｅＬａＲ１９細胞の単分子層を０．５ＭＯＩのウイルスＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺに感染させ、次いで、ＣＰＥの誘発を待つことによって、これを達成した。継代全体にわたって一定のままであったＣＰＥが開始されると、ＨｅＬａＲ１９細胞の新単分子層を感染させるために、溶解物を使用した。力価および配列を５、９、および１５代継代で監視した（データは図示せず）。

ウイルス精製およびＯＤ_２６０吸光によるウイルス粒子の決定

ＣＰＥが認められるまで、１５ｃｍディッシュ上のＨｅＬａＲ１９細胞の単分子層（１ｘ１０^８個の細胞）を、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔ、ＰＶ−Ｍａｘ、ＰＶ−ＭｉｎＸＹ、またはＰＶ−ＭｉｎＺに感染させた。３回の冷凍／解凍サイクルの後に、細胞溶解物を、最初に１５分間３，０００ｘｇ、次いで１５分間１０，０００ｘｇでの２回の遠心分離にかけた。次いで、１０μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅＡ（Ｒｏｃｈｅ）を上清に添加し、ＲＴで１時間インキュベートし、続いて、０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および２ｍＭＥＤＴＡを上清に添加し、軽く混合し、ＲＴで３０分間インキュベートした。ウイルス粒子を含有するこれらの上清を６ｍｌのスクロースクッション［ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中３０％のスクロース］上に置いた。ＳＷ２８スイングバケットロータを使用して、２８，０００ｒｐｍで３．５時間、スクロース勾配での超遠心分離によって、ウイルス粒子の沈降を達成した。

遠心分離後、スクロースクッションをそのままの状態にしながら、上清を除去し、管をＨＢＢＳで２回洗浄した。洗浄後、スクロースを除去し、「球状（ｐｅａｒｌ）」ウイルスを０．１％ＳＤＳを含有するＰＢＳに再懸濁した。ウイルス力価を、プラークアッセイ（上記）によって決定した。式：９．４ｘ１０^１２粒子／ｍｌ＝１ＯＤ_２６０単位（Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，２００６、Ｒｕｅｃｋｅｒｔ，１９８５）を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ技術）によって、２６０ｎｍの溶液での光学濃度の３回の測定の平均によって、ウイルス粒子濃度を決定した。

ＣＤ１５５ｔｇマウスにおけるＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺの神経弱毒化

野生型ポリオウイルスの感染の原発部位は、中咽頭および腸であるが、この感染は比較的無症状である。しかしながら、感染が、１％のＰＶ（Ｍ）−ｗｔ感染でＣＮＳの運動ニューロンに広がると、ウイルスはこれらのニューロンを破壊し、死または灰白髄炎として知られる急性弛緩性麻痺を引き起こす（ＬａｎｄｓｔｅｉｎｅｒａｎｄＰｏｐｐｅｒ，１９０９、Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，２００５）。運動ニューロンおよびＣＮＳは、ポリオウイルスの重要な標的であるため、我々は、合成ウイルスがこれらの組織において弱毒化されたかどうかを知りたいと思った。したがって、これらのウイルスを脳内接種によって、ＣＤ１５５ｔｇマウス（ポリオウイルス受容体を発現する遺伝子導入マウス）に投与した（Ｋｏｉｋｅｅｔａｌ．，１９９１）。それぞれのウイルスに対して、ＰＬＤ_５０値を計算し、ＰＶ−ＭｉｎＸＹおよびＰＶ−ＭｉｎＺウイルスを、粒子に基づいて１，０００倍、あるいはＰＦＵに基づいて１０倍弱毒化した（表６）（ＲｅｅｄａｎｄＭｕｅｎｃｈ，１９３８）。これらのウイルスは、神経弱毒化を実際に示したため、それらは可能なワクチンとして使用し得る。

ＣＤ１５５ｔｇマウスのワクチン接種は、致死的攻撃に対する免疫および防御を提供する

４〜６匹の６〜８週齢のＣＤ１５５ｔｇマウス（Ｔｇ２１系統）の群に、３０ｕｌのＰＢＳ中の１０^２個の粒子から１０^９個の粒子の精製ウイルス希釈を脳内接種し、神経病原性を決定した（Ｋｏｉｋｅ，ｅｔａｌ．，１９９１）。

ＲｅｅｄａｎｄＭｕｅｎｃｈ方法（ＲｅｅｄａｎｄＭｕｅｎｃｈ，１９３８）によって、致死量（ＬＤ_５０）を計算した。プラークアッセイによって、脊髄および脳におけるウイルス力価を定量化した（データは図示せず）。

ＰＶ−ＭｉｎＺおよびＰＶ−ＭｉｎＸＹは、野生型ウイルスと全く同一のタンパク質をコード化するが、特異的感染および神経弱毒化の減少、両方におけるいくつかの点で弱毒化される。

ワクチンとしてのＰＶ−ＭｉｎＺ、ＰＶ−ＭｉｎＸＹを試験するために、このウイルスの３つの致死未満量（１０^８個の粒子）を１００ｕｌのＰＢＳ中で、週に１回を３週間の腹腔内注射によって、８匹の６〜８週齢のＣＤ１５５ｔｇマウスに投与した。ワクチン集団からの１匹のマウスは、病気によりワクチン投与計画を完了しなかった。また、対照マウス群は、１００ｕｌのＰＢＳで３つの偽のワクチン接種を受けた。最終ワクチン接種の約１週間後、尾静脈から３０ｕｌの血液を抽出した。この血液を低速度遠心分離にかけ、血清を採取した。ＷＨＯの推薦に従って実行した、攻撃ウイルスの１００プラーク形成単位（ＰＦＵ）でのマイクロ中和アッセイによって、ＰＶ（Ｍ）−ｗｔに対する血清変換を分析した（Ｔｏｙｏｄａｅｔａｌ．，２００７、Ｗａｈｂｙ，Ａ．Ｆ．，２０００）。最終ワクチン接種の２週間後、予防接種を受けたマウスおよび対照マウスに、１００ｕｌのＰＢＳ中で、１０^６ＰＦＵでの筋肉内注射によって、致死量のＰＶ（Ｍ）−ｗｔを抗原投与した（Ｔｏｙｏｄａｅｔａｌ．，２００７）。ＣＤ１５５ｔｇマウスを利用した全ての実験を、ＳｔｏｎｙＢｒｏｏｋＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩＡＣＵＣ規則および連邦のガイドラインに従って行った。全ての１４匹の予防接種を受けたマウスは生存し、麻痺または不全麻痺の兆候は示さなかったが、対照的に、全ての偽の予防接種を受けたマウスは死亡した（表７）。これらのデータは、実際に、脱最適化されたコドン対を使用するＣＰＢウイルスが、野生型ウイルスに対して免疫性を与えることが可能であり、強い体液性応答を提供し、また抗原投与後の完全な生存も可能にすることを示唆する。

実施例１０
インフルエンザウイルスへのＳＡＶＥの適用

インフルエンザウイルスは、８個の異なるゲノム断片を有する。インフルエンザＡウイルス（Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４／ＭｏｕｎｔＳｉｎａｉ（Ｈ１Ｎ１））に対する断片配列を開示するＧｅｎＢａｎｋの寄託は、ＡＦ３８９１１５（断片１、ポリメラーゼＰＢ２）、ＡＦ３８９１１６（断片２、ポリメラーゼＰＢ１）、ＡＦ３８９１１７（断片３、ポリメラーゼＰＡ）、ＡＦ３８９１１８（断片４、血球凝集素ＨＡ）、ＡＦ３８９１１９（断片５、核タンパク質ＮＰ）、ＡＦ３８９１２０（断片６、ノイラミニダーゼＮＡ）、ＡＦ３８９１２１（断片７、マトリクスタンパク質Ｍ１およびＭ２）、ならびにＡＦ３８９１２２（断片８、非構造タンパク質ＮＳ１）を含む。

初期研究において、主要な構造タンパク質である核タンパク質ＮＰ、およびコイル状のリボ核タンパク質を形成するために、単量体を完全長ウイルスＲＮＡに結合させる、ビリオン（１粒子当たり１，０００コピー）の２番目に豊富なタンパク質をコード化する、株Ａ／ＰＲ／８／３４（本明細書ではＡ／ＰＲ８とも呼ばれる）のゲノム断片を脱最適化のために選択した（親配列および脱最適化された配列に関して、以下の表８を参照）。さらに、ＮＰは、ｍＲＮＡからテンプレートおよびビリオンＲＮＡ合成への重要な交換に関与する（ＰａｌｅｓｅａｎｄＳｈａｗ，２００７）。２つの同義コード化を、最初に頻繁に使用されるコドンを希少同義コドン（ＮＰ^ＣＤ）に置換し（すなわち、脱最適化されたコドンバイアス）、次に、コドン対（ＮＰ^{ＣＰｍｉｎ}）を脱最適化し、合成した。断片の両末端にある末端の１２０個のヌクレオチドは、複製およびキャプシド形成を妨げないように変化させなかった。ＮＰ^ＣＤは、３３８個のサイレント変異を含有し、ＮＰ^{ＣＰｍｉｎ}（配列番号２３）は、３１４個のサイレント変異を含有する。変異ＮＰ断片を（以下に）記載されるようにアンビセンスベクターに導入し、他の７個のｗｔインフルエンザプラスミドと合わせて、２９３Ｔ／ＭＤＣＫ共培養細胞に同時導入した。対照として、細胞に８個全てのｗｔＡ／ＰＲ８プラスミドを導入した。ＮＰ^ＣＤ断片およびＮＰ^{ＣＰｍｉｎ}断片を導入された細胞は、野生型ＮＰを導入された細胞と同様に、生存インフルエンザウイルスを産生した。Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^ＣＤまたはＡ／ＰＲ８−ＮＰ^{ＣＰｍｉｎ}と呼ばれる、これらの新脱最適化ウイルスはそれぞれ、弱毒化されているように思われる。力価（ＰＦＵを単位として）は、野生型ウイルスよりも３〜１０倍低く、変異ウイルスは両方、小プラークを形成する。

脱最適化されたインフルエンザウイルスは、同様の数の脱最適化されたコドンを含有するポリオウイルスほど大幅に弱毒化されてはいないが、２個のウイルスの翻訳戦略には違いがある。ポリオウイルスは、単一ポリタンパク質に翻訳される、単一の長いｍＲＮＡを有する。この長いｍＲＮＡ（我々のキャプシド脱最適化ウイルスにあるような）の開始点を通る遅い翻訳は、全メッセージの翻訳を低下させ、したがって、全てのタンパク質に影響を及ぼす。対照的に、インフルエンザは、８個の別々の断片を有し、１個の脱最適化は、他の翻訳に対して、たとえあったとしてもほんの少しの影響しかない。さらに、ＮＰタンパク質の発現は、特に、インフルエンザウイルス感染の初期段階に有利である（ＰａｌｅｓｅａｎｄＳｈａｗ，２００７）。

コドン対脱最適化されたNP断片を有するインフルエンザウイルスの特性化

０．００１の感染多重度（ＭＯＩ）で、１００ｍｍディッシュにおけるメイディンダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ細胞）の融合性単層を感染させることによって、Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^{ＣＰｍｉｎ}の増殖特性を分析した。ウイルス接種材料をロッキングプラットホーム上得、室温で３０分間吸着させ、次いで、０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｕｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理トリプシンを含有する、１０ｍｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を添加し、３７℃でインキュベートした。０、３、６、９、１２、２４、および４８時間後、１００μｌのウイルス含有培地を除去し、ウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。

３５ｍｍの６ウェルプレートにおけるＭＤＣＫ細胞の融合性単層のプラークアッセイによって、ウイルス力価およびプラーク表現型を決定した。０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理トリプシンを含有する、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、ウイルスの１０倍連続希釈を調製した。ウイルス希釈をＭＤＣＫ細胞上にプレートアウトし、ロッキングプラットホーム上で、室温で３０分間吸着させ、続いて、細胞培養インキュベータで、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、接種材料を除去し、０．６％のトラガカントゴム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．２％ＢＳＡ、および２ｕｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理トリプシンを含有する、３ｍｌの最小イーグル培地を添加した。３７℃での７２時間のインキュベーション後、ウェルをクリスタルバイオレットで染色することによって、プラークを視覚化した。

Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎは、Ａ／ＰＲ８ｗｔと比較して、ＭＤＣＫ細胞上により小さいプラークを産生した、生存ウイルスを産生した（図１６Ａ）。さらに、低ＭＯＩ感染によって、Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎは、感染の３時間後から１２時間後の間の遅延した増殖速度を示し、Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎ力価は、Ａ／ＰＲ８から１．５対数遅れを取っている（図１６Ｂ）。最終力価は、Ａ／ＰＲ８の最終力価よりも、３〜５倍低かった（３つの異なる実験の平均）。

コドン対脱最適化ＰＢ１、ＨＡ、またはＨＡおよびＮＰ断片を有する、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ８−ＰＢ１^{Ｍｉｎ−ＲＲ}、Ａ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ、およびＡ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ／ＮＰ^Ｍｉｎの特性化

血球凝集素タンパク質ＨＡおよびポリメラーゼサブユニットＰＢ１をコード化する、株Ａ／ＰＲ／８／３４のコドン対脱最適化ゲノム断片を産生した。ＨＡは、受容体結合およびウイルス侵入を仲介するウイルス表面から突き出ている、ウイルス構造タンパク質である。ＰＢ１は、ウイルスＲＮＡ複製機構の重要成分である。具体的に、野生型コドン使用（ＰＢ１^{Ｍｉｎ−ＲＲ}）を保持しながら、コドン１９０〜４８８（ＰＢ１断片のヌクレオチド５３１〜１４８８）の間のコドン対を脱最適化することによって、ＰＢ１（配列番号１５）の同義コード化を合成した。断片ＰＢ１^{Ｍｉｎ−ＲＲ}は、ｗｔＰＢ１断片と比較して、２３６個のサイレント変異を含有する。

野生型コドン使用（ＨＡ^Ｍｉｎ）を保持しながら、コドン５０〜５４１（ＨＡ断片のヌクレオチド１８０〜１６５５）の間のコドン対を脱最適化することによって、ＨＡ（配列番号２１）の第２の同義コード化を合成した。ＨＡ^Ｍｉｎは、ｗｔＰＢ１断片と比較して、３５５個のサイレント変異を含有する。

変異体ＰＢ１^{Ｍｉｎ−ＲＲ}およびＨＡ^Ｍｉｎ断片を上記のアンビセンスベクターに導入し、他の７個のｗｔインフルエンザプラスミドと合わせて、２９３Ｔ／ＭＤＣＫ共培養細胞に同時導入した。加えて、ＮＰ^Ｍｉｎ断片および残りの６個のｗｔプラスミドと合わせて、ＨＡ^Ｍｉｎ断片を同時導入した。対照として、細胞に８個全てのｗｔＡ／ＰＲ８プラスミドを導入した。ＰＢ１^{Ｍｉｎ−ＲＲ}またはＨＡ^Ｍｉｎ断片のいずれかを導入された細胞は、コドン対脱最適化断片ＨＡ^ＭｉｎおよびＮＰ^Ｍｉｎの組み合わせと同様に、生存ウイルスを産生した。これらの新脱最適化ウイルスは、Ａ／ＰＲ８−ＰＢ１^{Ｍｉｎ-ＲＲ}、Ａ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ、およびＡ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ／ＮＰ^Ｍｉｎとそれぞれ呼ばれる。

増殖特性およびプラーク表現型を上記のように評価した。

Ａ／ＰＲ８−ＰＢ１^{Ｍｉｎ−ＲＲ}、Ａ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ、およびＡ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ／ＮＰ^Ｍｉｎは全て、生存ウイルスを産生した。Ａ／ＰＲ８−ＰＢ１^{Ｍｉｎ−ＲＲ}およびＡ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ／ＮＰ^Ｍｉｎは、Ａ／ＰＲ８ｗｔと比較して、ＭＤＣＫ細胞上により小さいプラークを産生した（図１７Ａ）。さらに、ＭＤＣＫ細胞上の低ＭＯＩ感染の際、Ａ／ＰＲ８−ＨＡ^ＭｉｎおよびＡ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ／ＮＰ^Ｍｉｎは、特に感染後３〜１２時間から、はるかに低下した増殖速度を示し、Ａ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ／ＮＰ^Ｍｉｎ力価は、Ａ／ＰＲ８から１〜２桁遅れている（図１７Ｂ）。Ａ／ＰＲ８−ＨＡ^ＭｉｎおよびＡ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ／ＮＰ^Ｍｉｎの両方の最終力価は、Ａ／ＰＲ８の最終力価よりも１０倍低かった。Ａ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ／ＮＰ^Ｍｉｎが、Ａ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎよりもはるかに大幅に増殖が遅延しているため、２個の断片の脱最適化の効果は、付加的であるということが結論づけられる。

ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおけるＡ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎの弱毒化

６〜８匹の６週齢の麻酔したＢＡＬＢ／ｃマウスの群の各鼻孔に、１０^２から１０^６ＰＦＵの間のウイルスの１０倍連続希釈を含有する、１２．５μｌのＡ／ＰＲ８またはＡ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎウイルス溶液を投与した。死亡率および罹患率（体重減少、活性低下、死亡）を監視した。ＲｅｅｄａｎｄＭｕｅｎｃｈの方法（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．，ａｎｄＭ．Ｍｕｅｎｃｈ．１９３８．Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．２７：４９３−４９７）によって、致死量５０、ＬＤ_５０を計算した。

８匹のマウスに、鼻腔内接種によって、１０^２ＰＦＵのＡ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎウイルスを１回予防接種した。６匹のマウスの対照群は、いずれのウイルスも接種しなかった（偽）。この初回ワクチン接種の２８日後、ＬＤ５０の１００倍に相当する致死量のｗｔウイルスＡ／ＰＲ８を、マウスに抗原投与した。

Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎに対するＬＤ５０が１ｘ１０^３ＰＦＵであった一方で、Ａ／ＰＲ８に対するＬＤ５０は、４．６ｘ１０^１ＰＦＵであった。１０^２の用量では、全てのＡ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎに感染したマウスが生存した。ｗｔＡ／ＰＲ８ウイルスと比較して、Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎが、マウスにおいて１０倍を上回って弱毒化しているということが結論づけられる。したがって、この濃度をワクチン接種実験に選択した。マウスへの１０^２Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎのワクチン接種は、１０％未満の相対的体重減少によって示されるように、軽度および短期の病気を引き起こした（図１８Ａ）。予防接種を受けた８匹のマウスのうち８匹全てが生存した。同量のＡ／ＰＲ８に感染したマウスは、重度の疾病を伴う急激な体重減少を経験した。Ａ／ＰＲ８に感染した８匹のマウスのうち６匹は、感染の１０日後から１３日後の間に死亡した（図１８Ｂ）。２匹のマウスは生存し、野生型感染から回復した。

ＬＤ５０の１００倍のｗｔウイルスの抗原投与によって、全てのＡ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎの接種を受けたマウスは防御され、病徴または体重減少なく抗原投与に生き残った（図１８Ｃ）。一方で、偽の予防接種を受けたマウスは、重度の症状を示し、抗原投与の９日後から１１日後の間に感染して死亡した。Ａ／ＰＲ８−ＮＰ^Ｍｉｎは、マウスにおいて防御免疫を誘発し、したがって、生弱毒化インフルエンザワクチンとしての可能性を有するということが結論づけられる。Ａ／ＰＲ８−ＰＢ１^{Ｍｉｎ−ＲＲ}およびＡ／ＰＲ８−ＨＡ^Ｍｉｎ／ＮＰ^Ｍｉｎ等の他のウイルスも、まだマウスにおいて試験しなければならないが、ワクチンとしてのコドンペア脱最適化インフルエンザウイルスの有益な特性のさらなる改善をもたらす可能性がある。

実施例１１
ウイルスキメラを製造および特性化するためのさらなるハイスループットを有する方法の開発

重複ＰＣＲによるキメラウイルスの構築

各弱毒化変異ウイルスを通した「スキャン」は、重複ＰＣＲを使用して、各変異ウイルスからの約３００ｂｐのフラグメントをｗｔ背景に入れることによって行われる。いずれの所与の３００ｂｐ断片も、前断片と約２００ｂｐ重複し、すなわち、スキャン窓は、約３００ｂｐの長さであるが、各新キメラウイルスに対して約１００ｂｐ前進する。したがって、１個の変異ウイルス（約３０００ｂｐのキャプシド領域のみが変化されている）を通してスキャンするために、約３０個のキメラウイルスが必要である。２個のウイルスを同時に分析するのに十分すぎる容量を有する、９６ウェルディッシュフォーマットでスキャンを行った。

出発物質は、ピコグラム量の２個のプラスミドであり、一方は、ｗｔウイルスの配列を含有し、もう一方は、変異ウイルスの配列を含有する。プラスミドは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、ハンマーヘッド型リボザイム（ＨｅｒｏｌｄａｎｄＡｌｄｉｎｏ，２０００）、およびＤＮＡによってコード化されたポリ（Ａ）テールを含む、ＰＶ逆遺伝学系（ｖａｎｄｅｒＷｅｒｆｅｔａｌ．，１９８６）の全ての必要な要素を含む。ＰＣＲプライマの３つの対、Ａ、Ｍ（変異体）、およびＢ対が使用される。図９を参照されたい。Ｍ対は、変異ウイルスの所望の３００ｂｐ断片を増幅するが、Ｍプライマ対は、変異体において有意に変化されている配列に基づいて設計されているため、ｗｔを増幅しない。ＡおよびＢ対は、ｗｔウイルスゲノムの所望のフランクを増幅する。重要なことには、重複配列の約２０〜２５ｂｐが、Ａ２およびＢ１のそれぞれと同様に、各Ｍプライマの５’末端に構築される。これらの２０〜２５ｂｐは、Ａ断片の３’末端およびＢ断片の５’末端のそれぞれと重複する（１００％の相補性）。

重複ＰＣＲを実行するために、１個のウェルディッシュは、ｗｔプラスミドＤＮＡ、および３０個の異なるウェルにおいて３０個の異なるＡおよびＢ対を含有する。別個であるが一致している９６ウェルプレートは、変異体プラスミドＤＮＡ、および３０個の異なるＭプライマ対を含有する。ＰＣＲは、高度進行性、低エラー率の耐熱性ポリメラーゼで実行される。１回目のＰＣＲの後に、各反応物はＤｐｎＩで処理され、メチル化ＧｍＡＴＣ部位を切断することによって、テンプレートプラスミドを破壊する。次いで、各ｗｔおよび一致している変異反応物からのアリコートを、第３の９６ウェルディッシュにおけるＰＣＲ反応緩衝液中で混合される。この時、前構築物に隣接するプライマが使用される（すなわち、Ａ１およびＢ２プライマ）。各断片（Ａ、Ｍ、およびＢ）は、各隣接断片と少なくとも２０ｂｐ重複するように設計されるため、かつ反応は、完全長産物を増幅することしかできないプライマによって促進されているため、断片はアニールし相互に伸長し、２または３サイクル後に完全長産物をもたらす。これは、「１チューブ」（１個の９６ウェルディッシュ）設計に凝縮され得る「３チューブ」（３個の９６ウェルディッシュ）設計である。

キメラウイルスの特性化

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでのインキュベーション後、全ての必要とされる上流および下流調節要素で、上記で産生された完全長線状キメラＤＮＡゲノムは、活性ウイルスＲＮＡをもたらし、それは、ＨｅＬａＳ１０細胞抽出物（Ｍｏｌｌａｅｔａｌ．，１９９１）におけるインキュベーションまたはＨｅＬａ細胞への導入によって、ウイルス粒子を産生する。あるいは、細胞質においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するＨｅＬａ細胞に、ＤＮＡ構築物を直接導入することが可能である。

次いで、９６ウェルフォーマットにおいてウイルスにより誘発されたＣＰＥを評価するための細胞の目視検査、ＥＬＩＳＡを使用したウイルス産生の評価、一連の９６ウェルプレートにおける細胞に接種された等量のウイルス粒子の増殖速度の定量的測定、および特異的感染の測定（感染単位／粒子［ＩＵ／Ｐ］の比）を含む、種々の比較的ハイスループットなアッセイを使用して、各キメラウイルスの機能性が分析される。

次いで、各キメラウイルスの機能性を分析することができる。多数の比較的ハイスループットなアッセイが利用可能である。第１のアッセイは、９６ウェルフォーマットにおけるウイルスにより誘発されたＣＰＥ（細胞死）を調べるために顕微鏡を使用して、細胞を視覚的に検査するためであってもよい。これは、生体染色色素を使用して、自動化９６ウェルアッセイで行うこともできるが、ＣＰＥのための９６ウェルプレートの目視検査は、実践的な時間で１時間未満しか必要とせず、ほとんどの目的で十分速い。

第２に、導入の３〜４日後、ウイルス産生は、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡ方法を使用して分析されてもよい。あるいは、キャプシド特異的抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡを使用して、粒子力価が決定される。これらのアッセイは、非生存構築物（ウイルス粒子なし）、不十分に複製する構築物（ほんのわずかな粒子）、および十分に複製する構築物（多くの粒子）の同定、ならびにこれらの効果の定量化を可能にする。

第３に、より定量的な決定のために、上記で決定された等量のウイルス粒子は、増殖速度を測定するために、一連の新鮮な９６ウェルプレートに植菌される。種々の時間（感染後０、２、４、６、８、１２、２４、４８、７２時間）において、１個の９６ウェルプレートは除去され、冷凍／解凍サイクルにかけられ、細胞関連ウイルスを遊離させる。上記のＥＬＩＳＡによって、各時間において各構築物から産生されたウイルス粒子数が決定される。

第４に、ＩＵ／Ｐの比を測定することができる（実施例3を参照）。

より高分解能のスキャン

ウイルスの致死性が、予備データが示すように、キャプシド領域にわたって広がる多くの小欠損によるならば、キメラの多くまたはほとんどは健康ではなく、ほんの数個は生存できない。この場合には、より高分解能のスキャンは恐らく必要ない。反対に、300bp断片のうちの１つ以上が、実際に致死性をもたらす場合（以下に記載されるように、この断片の強い表現型に寄与する、翻訳フレームシフトシグナルを伝達し得る、１５１３から２４７０の間の断片におけるコドン脱最適化ウイルスに考えられるように）、ゲノムスキャンは、より高分解能、例えば、３００ｂｐ断片にわたって構築物間で３０ｂｐウィンドウ移動１０ｂｐで繰り返され、表現型分析が後に続く。３０ｂｐスキャンは、変異ウイルスのＰＣＲを含まず、代わりに、変化した３０ｂｐ断片は、ｗｔウイルスに対するＰＣＲプライマに直接設計される。これは、致死性に関与する変化が特定されることを可能にする。

実施例１２
ＳＡＶＥの基礎となる分子機構に対する進行中の研究

キメラの選択

２個の親生存不能ウイルスの各々からの２〜４個のキメラの例（すなわち、合計で４〜８個のウイルス）が、次の実験に使用される。変異体ＤＮＡの比較的小さい断片を有するが、強い表現型を有する生存キメラが選択される。例えば、脱最適化されたコドンウイルスからのウイルスＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}、ＰＶＡＢ^{２４７０−２９５４}、およびＰＶ−ＡＢ^{２９５４−３３８６}（実施例１を参照）、ならびにＰＶ−Ｍｉｎ^{７５５−２４７０}およびＰＶ−Ｍｉｎ^{２４７０−３３８６}（実施例７を参照）が好適である。分析をより容易にするより小さい挿入部分を有する、さらに良好な開始キメラもまた、上記の実験から得ることができる（実施例８）。

ＲＮＡ存在度／安定度

考えられる限りでは、変化したゲノム配列は、ウイルスＲＮＡを不安定化する。そのような不安定化は、新規配列の直接的影響、または翻訳の中止もしくは翻訳の他の欠損の間接的影響であり得る（例えば、ＤｏｍａａｎｄＰａｒｋｅｒ，２００６を参照）。したがって、変異ウイルスＲＮＡの存在度が検査される。キメラ変異ウイルスおよびｗｔウイルスからの等量のＲＮＡが混合され、ＨｅＬａ細胞に導入される。２、４、８、および１２時間後にサンプルは採取され、２個の異なるウイルスＲＮＡに対して、ノーザンブロット法または定量ＰＣＲによって分析されるが、それらは、何百ものヌクレオチドの差異があるため容易に識別できる。ＰＶ−ＳＤ（ｗｔ表現型を有する、コドンがシャッフルされたウイルス）と比較した、ｗｔウイルスＲＮＡでの対照実験も行なう。ｗｔウイルスＲＮＡに対する変異体の比の減少は、キメラが不安定化したＲＮＡを有することを示す。

生体外翻訳

コドン脱最適化ウイルスおよびその誘導体の一部に対して、翻訳が減少することが示された。実施例５を参照されたい。生体外翻訳実験は、コドン対脱最適化ウイルス（ＰＶ−Ｍｉｎ）およびその選択されたキメラで繰り返される。脱最適化されたコドン対がなぜウイルス生存不能を引き起こすのかということに関して、現在優れた理論はなく、ましてやいかなる証拠もなく、したがって、翻訳への効果を調査することは、基礎となる機構を明らかにするのに役立ち得る。

実施例５において２種類の抽出物に生体外翻訳をおこなった。一方は、「高性能」抽出物（Ｍｏｌｌａｅｔａｌ．，１９９１）であり、コドン脱最適化ウイルスさえも、明らかに良好な翻訳をもたらした。もう一方は、正常な生体内条件により近い抽出物であり、脱最適化されたコドンウイルスは、非効率的に翻訳された。抽出物間で４つの差異があり、より「天然」の抽出物は透析されず、内因性細胞ｍＲＮＡは、小球菌ヌクレアーゼで破壊されず、抽出物は、外因性アミノ酸を添加されず、抽出物は、外因性ｔＲＮＡを添加されなかった。本研究において、どれが翻訳に対して最も有意な効果をもたらすかを調べるために、これらの４つのパラメータは、１つずつ（または必要に応じて対で）変化される。例えば、コドン脱最適化ウイルスの翻訳を可能にするものが、アミノ酸およびｔＲＮＡの添加であるという所見は、希少アミノアシルｔＲＮＡが制限的であるため、翻訳が非効率的であるという仮説を強く裏付ける。そのような所見は、他の種類ウイルスにもＳＡＶＥ方法を行うという観点から重要である。

翻訳フレームシフト

別の考えられる欠損は、コドン変化が翻訳フレームシフトを促進し得ること、すなわち、いくつかのコドン対において、リボソームが異なるリーディングフレームに変移し、次いで、偽ペプチド配列を翻訳した後にインフレーム終止コドンに達し得ることである。この種類のフレームシフトは、いつくかのウイルスにおいて重要な制御事象である。本データは、残基１５１３〜２４７０のＡＢ変異体断片を有する全てのＰＶゲノムが、生存できないことを示す。さらに、この変異体領域を有する全てのゲノムは、約４２〜４４ｋＤａの生体外翻訳中に新規タンパク質バンドを産生する（図５Ａを参照。アスタリスクが付けられている）。この新規タンパク質は、フレームシフトの結果であり得る。

１５１３〜２４７０の間隔における配列の検査は、真核生物における−１フレームシフトに対するスリッパリィ七量体共通配列に適合する、３つの潜在的な候補部位を示す（Ｘ−ＸＸＹ−ＹＹＺ）（Ｆａｒａｂａｕｇｈ，１９９６）。これらの部位は、位置１８８５および１９４８におけるＡ−ＡＡＡ−ＡＡＴ、位置２１１９におけるＴ−ＴＴＡ−ＴＴＴである。それらには、１９２９、１９８６、または２１４９のそれぞれにおける−１フレームの終止コドンが続く。前者の２つは、測定されたサイズのバンドを産生するためのよりふさわしい候補であるように思われる。

フレームシフトが起こっているかどうかを決定するために、３つの候補領域の各々は、フレームシフトに好ましくなくなるように別々に変異される。さらに、候補終止コドンの各々は、センスコドンに別々に変異される。これらの６個の新しい点突然変異体は、生体外翻訳によって試験される。好ましくない配列へのフレームシフト部位の変異による新規４２〜４４ｋＤａタンパク質の損失、および終止コドン除去によるそのタンパク質バンドの分子量の増加は、フレームシフトが起こっていることを示す。フレームシフトが、異常翻訳産物の原因であるなら、フレームシフト部位を欠く新変異体の生存性が、１５１３〜２４７０の変異体断片との関連で試験される。明らかに、そのような所見は、将来のゲノム設計に重要であり、必要な場合は、フレームシフトフィルタが、考えられるフレームシフト部位を防ぐために、ソフトウェアアルゴリズムに組み込むことができる。

翻訳欠損に関するより詳細にわたる研究は、ポリソームプロファイリング、先端プリント化、および融合タンパク質のルシフェラーゼアッセイを含むがこれらに限定されない、種々の技術を使用して行われる。

ポリソームプロファイリング

ポリソームプロファイリングは、翻訳を検査する伝統的な方法である。ハイスループットではないが、非常によく開発され理解されている。ポリソームプロファイリングに対して、細胞抽出物は、翻訳を停止し（シクロヘキシミドで）、それにもかかわらずそれらのそれぞれのｍＲＮＡを翻訳しているリボソームのセット（「ポリソーム」）を保存する方法で作製される。これらのポリソームは、スクロース勾配で分別され、それにより多数のリボソームと関連するメッセージは、底部に向かって沈殿する。勾配の分別およびＵＶ吸収を使用したＲＮＡ含有量の分析後に、吸収の後続ピークがＮ＋１リボソームを有するｍＲＮＡに対応する、ポリソームプロファイルが見られ、典型的に１０〜１５個の明らかなピーク（単一ｍＲＮＡ上の４０Ｓリボソームサブユニット、６０サブユニット、および１、２、３、…１２、１３個のリボソームを表す）が、合わせて不鮮明になる前に識別することができる。次いで、スクロース勾配からの種々の分画は、ゲル上で行われ、膜にブロットされ、特定のｍＲＮＡのためのノーザン分析によって分析される。次いで、これは、その特定のｍＲＮＡが、例えば、１０〜１５個のリボソーム（十分に翻訳された）、または１〜４個のリボソーム（不十分に翻訳された）に主に関与するかどうかを示す。

この研究において、例えば、ｗｔウイルス、ＰＶ−ＡＢ（コドン脱最適化）ウイルス、ならびに主としてＮ末端またはＣ末端が脱最適化された断片をそれぞれ有する、その誘導体ＰＶ−ＡＢ^{７５５−１５１３}およびＰＶ−ＡＢ^{２９５４−３３８６}が比較される。Ｎ末端とＣ末端変異体断片との比較は、特に多くを明らかにする。コドン脱最適化が、翻訳を遅くするか、または中止させるなら、Ｎ末端変異体ＲＮＡは、比較的少ないリボソームと関連する（リボソームが、Ｎ末端領域にわたって非常にゆっくりと移動し、他のリボソームが加重することを予防し、次いで、脱最適化された領域を横切った後にメッセージの残りを通して迅速に動くため）。対照的に、Ｃ末端変異体ＲＮＡは、多くのリボソームが荷重することができるため、比較的多数のリボソームと関連するが、それらがＣ末端近傍で妨害されるため、それらは転写を終えることができず、関連リボソームの数は高い。

ポリソーム分析は、いくつのリボソームが、異なる種類の変異体ＲＮＡと積極的に関連するかを示し、例えば、翻訳が遅いモデルを、リボソームが実際にＲＮＡから早期に離れるモデルと区別することができる。他の種類のモデルも試験することができる。

先端プリント化

先端プリント化は、リボソームが遅いか、または中止されるｍＲＮＡ上の位置を同定するための技術である。ポリソームプロファイリングにあるように、活発に翻訳中のｍＲＮＡが得られ、それらのリボソームはで冷凍されているが、それでもなお関連しており、ｍＲＮＡは、しばしば生体外翻訳反応から得られる。ｍＲＮＡのある比較的に３’部分を補完するＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマが使用され、次いで逆転写酵素によって伸長される。逆転写酵素は、それがリボソームと衝突するまで伸長する。したがって、翻訳ｍＲＮＡ分子集団は、プライマの部位から最近傍のリボソームに伸長するＤＮＡフラグメント集団を生成する。リボソームが中止する傾向を有する部位または領域がある場合、（例えば、プライマからの２００個の塩基）、この部位または領域は、不均衡な数のＤＮＡフラグメントをもたらす（この場合、フラグメントは、２００塩基長）次いで、これは、高分解能ゲル上の「先端プリント」（バンドまたは暗い領域）として見える。これは、ｍＲＮＡ上のリボソーム中止部位（数個のヌクレオチド以内まで）をマッピングするための標準的方法である。

異なるキメラにおいて、断片がわずかに５’または３’変移される、脱最適化されたコドンまたはコドン対の断片を有するキメラが分析される。脱最適化された断片が、リボソームを遅くするか、または中止させる場合、先端プリントは、脱最適化された断片の位置と一致するように、５’または３’変移する。対照は、ｗｔウイルスＲＮＡおよびいくつかの（無害に）シャッフルされたウイルスＲＮＡを含む。対照はまた、逆転写への新規配列のリボソーム非依存的効果を除外するために、純粋な変異ウイルスＲＮＡ（すなわち、翻訳に関与していない）も含む。

先端プリントアッセイは、少なくとも２つの利点を有する。第１に、それは、中止されたリボソームの直接的証拠を提供することができる。第２に、それは、数個のヌクレオチドの分解を有するため、どの脱最適化されたコドンまたは脱最適化されたコドン対が中止を引き起こしているのかを正確に同定することができる。すなわち、脱最適化されたコドンまたはコドン対のうちの数個のみが、効果の大部分に関与している可能性があり、先端プリント化はそれを明らかにすることができる。

融合タンパク質のデュアルルシフェラーゼレポータアッセイ

上記の実験は、あるコドンまたはコドン対が翻訳に対して特に有害であることを示唆し得る。翻訳への特定のコドンおよびコドン対の効果を分析するためのハイスループットな方法として、小さい試験ペプチドを設計し、ウミシイタケルシフェラーゼのＮ末端に融合される。次いで、ルシフェラーゼ活性は、ペプチドの翻訳可能性のアッセイとして測定される。すなわち、Ｎ末端ペプチドが不十分に翻訳される場合、ルシフェラーゼはほとんど産生されない。

一連の８個の２５ｍｅｒペプチドは、上記の実験に基づいて設計される。８個の２５ｍｅｒの各々は、該希少コドンおよび／または希少コドン対の種々の置換を使用して、１２の異なる方法でコード化される。集合ＰＣＲを使用して、これらの９６構築物（８２５ｍｅｒｘ１２のコード化）は、上記のジシストロン性デュアルルシフェラーゼベクターにおける、ホタルルシフェラーゼ（Ｆ−ｌｕｃ）のＮ末端に融合される（実施例５および図６を参照）。デュアルルシフェラーゼ系は、ホタルルシフェラーゼ（Ｆ−Ｌｕｃ）およびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ（Ｒ−Ｌｕｃ）の両方を使用し、これらは、異なる生化学的条件下で光を発するため、１つの管またはウェルから別々に分析することができる。ジシストロニックレポータは、単一ｍＲＮＡとして発現されるが、対照ルシフェラーゼ（Ｒ−Ｌｕｃ）が、１つの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）から翻訳される一方で、実験用ルシフェラーゼ（Ｆ−ｌｕｃ）（そのＮ末端に融合される試験ペプチドを有する）は、それ自体のＩＲＥＳから独立して翻訳される。したがって、Ｒ−Ｌｕｃ活性に対するＦ−Ｌｕｃ活性の比は、試験ペプチドの翻訳可能性を暗示する。図６を参照されたい。

得られる９６個のジシストロニックレポータ構築物は、ＰＣＲ反応からＨＥＫ２９３またはＨｅＬａ細胞の９６個のウェルに直接導入される。上流シストロンのホタルルシフェラーゼは、内部導入制御として機能する。第２のシストロンにおけるウミシイタケルシフェラーゼのコドンまたはコドン対依存性発現は、Ｒ−ＬｕｃとＦ−Ｌｕｃとの間の比として正確に決定することができる。このアッセイは、本来ハイスループットであり、何百、または何千もの試験配列を必要に応じて分析することができる。

実施例１３
新規代替コドン戦略を使用した、弱毒化ウイルスの設計および合成

ワクチン産生のためのウイルスの再操作のためのＳＡＶＥ方法は、ウイルスタンパク質の翻訳を減少する大規模同義コドン置換に依存する。これは、コドンおよびコドン対バイアス、ならびにＲＮＡ二次構造およびＣｐＧ含有量等の他のパラメータを適切に調節することによって、達成することができる。４個のデノボのＰＶ設計のうち、２個（シャッフルされたコドンウイルス、ＰＶ−ＳＤ、および好適コドン対ウイルス、ＰＶ−Ｍａｘ）は、ｗｔウイルス対して表現型変化はほとんどもたらさなかった。他の２個のデノボ設計（ＰＶ−ＡＢおよびＰＶ−Ｍｉｎ）は、２個の異なる機構を通して同義置換のみを採用するウイルスを殺滅することに成功した（コドンバイアスおよびコドン対バイアスのそれぞれにおける大幅な変化）。生きているが弱毒化した株は、不活化ウイルス株からの領域をｗｔにサブクローン化することによって構築した。

大規模な同義置換を採用したウイルス弱毒化の基礎となる機構のよりよい理解は、合成ウイルスの表現型および発現レベルの予想を容易にする。進行中の研究は、翻訳効率への変化合計数および変化密度の効果、翻訳への高密度領域の位置の効果、コドンおよびコドン対バイアスの相互作用、ならびにゲノムへの数多くの短い範囲のＲＮＡ二次構造の再操作の効果に関する問題に対処する。ｗｔと活性化された株との間には連続性があり、いかなる所望の弱毒化レベルも、弱毒化された株に操作することができる可能性が高い。しかしながら、いかなる感染も自立的であり、したがって検出可能であるように達成することができる弱毒化レベルには厳しい制限があり得る。ＰＶタンパク質のこの１５^４４２のコード化は、調査すべき巨大な配列スペースを構成し、種々の方法が、この配列スペースをより系統的に調査するために利用されている。これらの方法は、第１に、新規弱毒化ウイルスの設計に役立つソフトウェアプラットフォームを開発するステップと、第２に、より多くの配列スペースを調査し、代替的コード化がどのように弱毒化を引き起こすかに関する特定の質問に答える、多数の新ウイルスを設計し、次いで、合成および特性化するために、このソフトウェアを使用するステップとを含む。さらに、考慮すべき重要な課題は、危険なウイルスが、同義コドンの外見上無害なシャッフルによって偶然に作製される可能性があるかどうかである。

ウイルスゲノムのコンピュータによる設計およびデータ分析のためのソフトウェアの開発

合成ウイルスの設計は、（１）配列特異的シグナルを保存、組み込み、または除去しながら、コドンおよびコドンペア使用を最適化し、ＲＮＡ二次構造を監視するための、および（２）正確な配列集合を確実にするために、配列をオリゴヌクレオチドに分割するための、多くのなソフトウェアサポートを必要とする。原型合成ゲノム設計ソフトウェアツールは、合成ゲノム設計のための完全な環境に拡張されている。この拡張されたソフトウェアにおいて、遺伝子エディタが、配列の代わりに制約を中心に概念的に構築される。遺伝子の設計者は、所望の遺伝子の特性を特定するレベルで機能し（例えば、アミノ酸配列、コドン／コドンペア分布、制限部位の分布、およびＲＮＡ二次構造制約）、遺伝子エディタは、これらの制約を実現するＤＮＡ配列をアルゴリズムで設計する。アミノ酸配列、コドンバイアス、コドン対バイアス、ＣＧジヌクレオチド含有量、ＲＮＡ二次構造、ＣＲＥ、スプライス部位、ポリアデニル化部位、および制限酵素認識部位等のシス作用性核酸シグナルを含むがこれらに限定されない、しばしば互いと相互作用する多くの制約がある。遺伝子の設計者は、これらの制約の存在を認識し、予め指定したレベルまで全ての制約を自動的に満たしながら、所望の特徴を有する遺伝子を設計する。

パターン、二次構造、重複コーディングフレーム、およびコドン／コドンペア分布への接着を組み込む／除去するためにすでに開発されている合成アルゴリズムは、エディタの一部として実現されるが、より重要なことは、そのような選好の異種の組み合わせを実現するためのアルゴリズムである。そのような組み合わせは、コンピュータ的に扱いにくい（ＮＰ完全）問題をもたらすため、発見的最適化が、エディタにおいて必然的に重要な役割を果たす。シミュレーテッドアニーリング技術は、そのような設計を実現するために採用され、これは、シミュレーテッドアニーリングが、初期の設計ツールにおけるその最初の実際的使用を達成したために特に適している。

フル機能の遺伝子設計プログラミング環境は、プラットフォーム非依存であり、Ｌｉｎｕｘ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、およびＭａｃＯＳにおいて作動している。システムは、バクテリアまたは菌（酵母）の規模でゲノムと連動するように設計され、以下に記載される新規弱毒化ウイルス設計の合成および評価によって認証される。

１個または数個のアミノ酸における極端なコドンバイアスでのウイルス設計

生ワクチンに対して、ウイルスは、不活性化されていない場合、可能な限り衰弱していなければならず、その場合、ウイルスを培養および製造する方法はない。最適な衰弱を得るための一方法は、１個または数個のみのアミノ酸に対して希少コドンの置換を操作し、それらの希少コドンと結合する希少ｔＲＮＡを過剰発現する、対応する細胞株を作製することである。次いで、ウイルスは、特別な許容細胞株において効率的に増殖することができるが、正常な宿主細胞株においては生存不能である。ウイルスは、許容細胞株を使用して培養および製造されるが、それは非常に便利であるだけでなく、生弱毒化ワクチンを産生するために現在使用されている方法よりも安全である。

ヒトゲノムの配列化によって、希少コドンを読み取る種々のｔＲＮＡ遺伝子のコピー数に関する情報が、入手可能である。文献（例えば、ＬａｖｎｅｒａｎｄＫｏｔｌａｒ，２００５）に基づくと、本目的に最適な希少コドンは、同族ｔＲＮＡ遺伝子の２個のコピーを有する非常に希少なコドン、ＣＴＡ（Ｌｅｕ）、同族ｔＲＮＡ遺伝子の４個のコピーを有する希少コドン、ＴＣＧ（Ｓｅｒ）、および同族ｔＲＮＡ遺伝子の４個のコピーを有する希少コドン、ＣＣＧ（Ｐｒｏ）である（ＬａｖｎｅｒａｎｄＫｏｔｌａｒ，２００５）。特定の種類のｔＲＮＡ遺伝子のコピー数の中央値は９個であるが、範囲は２〜３３個のコピーである（ＬａｖｎｅｒａｎｄＫｏｔｌａｒ，２００５）。したがって、ＣＴＡコドンは、希少コドンであるだけでなく、最も少ない同族ｔＲＮＡ遺伝子を有する１個のコドンでもある。これらのコドンは、いずれの他のｔＲＮＡによって読み取られず、例えば、ゆらぎ塩基対形成によって読み取られない。

Ｌｅｕ（１８０コドン）、Ｓｅｒ（１５３）、およびＰｒｏ（１１９）に対するウイルスゲノムコーディング全体を通して、コドンの全てを希少同義コドンＣＴＡ、ＴＣＧ、またはＣＣＧのそれぞれに変化させることは、重度に衰弱したウイルス、または非生存ウイルスでさえ作製すると予想される。次いで、対応する希少ｔＲＮＡを過剰発現するヘルパー細胞を作製することができる。対応するウイルスは、この人工培養系のみにおける増殖に完全に依存しており、ワクチン産生のためのウイルスの生成の最大の安全性を提供する。

４個の優先度の高いウイルスが設計および合成される。単一ウイルスにおいて、全てのＬｅｕコドンはＣＴＡに転換し、全てのＳｅｒコドンはＴＣＧに転換し、全てのＰｒｏコドンはＣＣＧに転換し、全てのＬｅｕ、Ｓｅｒ、およびＰｒｏコドンは、ＣＴＡ、ＴＣＧ、およびＣＣＧのそれぞれに転換される。一実施形態では、これらの置換は、ウイルスのキャプシド領域においてのみ行われ、そこでは、翻訳の高い速度が最も重要である。別の実施形態では、置換はウイルス全体にわたって行われる。

ＣＧジヌクレオチドバイアスウイルス

まれに例外はあるが、ウイルスゲノムは、ＧｐＣではなくジヌクレオチドＣｐＧを過少に示す（Ｋａｒｌｉｎｅｔａｌ．，１９９４）。この現象は、ゲノムの全Ｇ＋Ｃ含有量と無関係である。ＣｐＧは、しばしばバクテリアおよびＤＮＡウイルスに存在するような、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する１本鎖ＤＮＡが、Ｔｏｌｌ様受容体９によって病原体の特徴として認識されるように、ヒトゲノム中でメチル化される場合が多い。これは、自然免疫系の活性化をもたらす。同様の系がＲＮＡウイルスに対して作用することは示されてはいないが、ＰＶゲノムの検査は、ＰＶが、ヒトにおけるＣｐＧジヌクレオチドの有意な過少存在よりも大きい程度まで、ＣｐＧを含有する同義コドンに対して選択したことを示唆する。これは、特にアルギニンコドンに対して顕著である。６個の同義Ａｒｇコドンのうち、４個のＣＧ含有コドン（ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＣＵ）は合わせて、９６個全てのＡｒｇコドンのうち２４個のみを占める一方で、残りの２個（ＡＧＡ、ＡＧＧ）は、７２個を占める。これは、６５個のＣＧ含有コドンおよび３１個のＡＧＡ／ＡＧＯコドンを予測し得る、平均ヒトコドン使用と対照的である。実際に、ＰＶにおいて過少に存在するコドンのうちの２個は、ヒト細胞（ＣＧＣ、ＣＧＧ）において頻繁に使用される。ＣＧが、ＰＶにおいて不利なジヌクレオチドであり得るという他の暗示が２つある。第１に、コドン対脱最適化ウイルスにおいて、導入された希少コドン対の多くは、コドン対六量体の中心ジヌクレオチドとして、ＣＧを含有する。第２に、Ｂｕｒｎｓｅｔａｌ．（２００６）が彼らのコドンバイアス脱最適化ウイルスを継代し、ゲノムを配列した時に、これらのウイルスが、一部のＣＧジヌクレオチドを除去するために進化したことが認められた。

したがって、１個の優先度の高い再設計されたウイルスにおいて、ほとんどまたは全てのＡｒｇコドンは、ＣＧＣまたはＣＧＧ（２個の頻繁なヒトコドン）に変化される。これは、翻訳に悪影響を及ぼさず、ウイルス増殖へのＣｐＧジヌクレオチドバイアスの効果の評価を可能にする。得られるウイルスの増加したＣ＋Ｇ含有量は、二次構造の注意深い監視を必要とし、すなわち、Ａｒｇコドンの変化は、顕著な二次構造を作製することができない。

コドンバイアスおよびコドン対バイアスの同時調節

コドンバイアスおよびコドン対バイアスは、翻訳レベルにおいて互いと相互作用し得ると考えられる。この相互作用の理解は、場合によっては最大範囲にわたって、いかなる所与のタンパク質の翻訳可能性の調節も予測可能に可能にし得る。

野生型ポリオコドンバイアスおよびコドン対バイアスを０、および予想される最低のコドンバイアスおよびコドン対バイアスを−１として表すならば、４個の優先度の高いウイルスは、（−０．３，−０．３）、（−０．３，−０．６）、（−０．６，−０．３）、および（−０．６，−０．６）ウイルスである。これらのウイルスは、中程度に不十分な、または非常に少ないコドンバイアスが、中程度に不十分な、または非常に少ないコドン対ウイルスとどのように相互作用するかを明らかにする。これらのウイルスは、野生型、および極端なＰＶ−ＡＢ（−１，０）およびＰＶ−Ｍｉｎ（０，−１）設計とも比較される。

ＲＮＡ二次構造の調節

上記の合成設計は、過剰な二次構造を防ぐ。２つの追加の設計は、二次構造を系統的に防ぐ。これらのウイルスは、（１）恐らく最小の二次構造、および（２）翻訳を遅くするのに十分な、多くの小さい二次構造を含む、ｗｔコドンおよびコドン対バイアスを有するように操作される。

追加のウイルス設計

追加のウイルス設計は、完全ゲノムコドンバイアスおよびコドン対バイアス設計、非ＣＧコドン対バイアス設計、濃度低下希少コドン設計、およびキャプシド領域にわたって広がるか、あるいはキャプシドのＮ末端の端部において分類されるか、またはキャプシドのＣ末端の端部において分類される、約１５０個の希少コドンを有するウイルスを含む。

実施例１４
増加した毒性のウイルスを偶然に作製する可能性の試験

ウイルスゲノムのこれらのウイルスの弱毒化を目的とした再設計が、ｗｔウイルスよりも毒性のウイルスを偶然に作製し得ることは、理論的には可能性がある。タンパク質配列は、ＳＡＶＥ方法において変化されないため、この結果は起こりそうもない。それでもやはり、ＳＡＶＥ方法が害のないものであることを実験的に証明することが望ましい。

ＰＶタンパク質をコード化する可能性がある、考えられる１０^４４２の配列のうち、ある適度に適合した形のＰＶが、過去のある時点で発生し、局所的最適に進化した可能性がある（大域的最適とは対照的）。同一タンパク質コーディング能力だが、非常に異なるコドンセットを有する新しい形のＰＶの生成は、この新ウイルスを大域的適応度地形上の異なる位置に配置し、それは、ｗｔＰＶよりも異なる局所的最適に近い可能性がある。考えられる限りでは、この新局所的最適は、野生型の局所的最適よりも良好であり得る。したがって、同義コドンのシャッフルがより適合したウイルスを作製する可能性はほとんどない。

この可能性を調査するために、１３個のＰＶゲノム、最良のコドンバイアスを有する１個のウイルス、最良のコドン対バイアス（すなわち、ＰＶ−Ｍａｘ）を有する１個のウイルス、最良のコドンおよびコドン対バイアスを有する１個のウイルス、およびｗｔコドンおよびコドン対バイアスであるが、シャッフルされた同義コドンを有する、１０個のさらなるウイルスを再設計および合成した。二次構造、Ｃ＋Ｇ含有量、およびＣＧジヌクレオチド含有量等の他のパラメータは、ｗｔレベルに可能な限り近く保持される。

これらの１３個のウイルスはそれぞれ、互いおよび野生型とは、大域的適応度地形の非常に異なる位置にある場合がある。しかしながら、それらは選択の対象になっていないため、それらのうち１つも局所的最適にはない。１３個のウイルスおよびｗｔが、継代され、サンプルウイルスが、１代、１０代、２０代、および５０代継代において採取される。それらの適応度は、プラークサイズ、一段増殖曲線におけるプラーク形成単位／ｍｌ、および１細胞当たり形成される粒子数を評価することによって、互いおよびｗｔと比較される。実施例１を参照されたい。１３個のウイルスの各々の５個の例は、１０代、２０代、および５０代継代後に配列される。ＣＤ１５５ｔｇマウスにおける病原性に対して、選択された継代の単離株が試験され、ＬＤ_５０が決定される。これらのアッセイは、ウイルスのいずれかが、ｗｔよりも適合しているかどうかを明らかにし、特に毒性のウイルスの偶発的産生のリスクの定量的測定を提供する。コドンおよびコドン対バイアスのｗｔレベルを有する１０個のウイルスはまた、コード化レベルでの適応度地形の多様性に関する情報を提供する。

より適合したウイルスが生じ得、より適合したウイルスが、より危険なウイルスであり得る可能性を考慮して、これらの実験がＢＳＬ３研究室において行われる。１０代継代後に、表現型および配列が評価され、ＰＶ特異的抗体による中和への新たなウイルスの感受性が検証される。有意に適合したウイルスへの進化、または抗体中和を回避する新しいタンパク質配列への系統的進化のいかなる証拠が得られた場合も、実験は中止および再検討される。表現型および配列は、５０代継代に進む前の２０代継代後に同様に評価される。ｗｔウイルスと全く同一のタンパク質をコード化するために、合成ウイルスが作製されるため、適応度の（わずかな）増加への進化が認められたとしても、毒性増加の余地は非常に限られているように思われる。

実施例１５
ポリオウイルス以外のウイルス系へのＳＡＶＥ方法の拡張

ポリオ根絶における国際努力の最終段階での復帰の可能性に対抗するための、新しいポリオワクチンの潜在的な必要性にもかかわらず、ＰＶは、主にＳＡＶＥの開発のためのモデル系として、本研究において選択された。しかしながら、ＳＡＶＥは、この方法が、ワクチンが必要とされる他のウイルスに拡張することができることを見込んで開発されてきた。ＳＡＶＥ戦略のこの拡張は、本明細書では、ライノウイルス、風邪の原因病原体、およびインフルエンザウイルスへの適用によって例示される。

ヒトライノウイルス−ポリオウイルスと密接な関係があるウイルスへのＳＡＶＥの適応

いくつかの理由によって、ＳＡＶＥ方法を試験するために、２個のモデルライノウイルス、ＨＲＶ２およびＨＲＶ１４を選択した。それらの理由は、（１）ＨＲＶ２およびＨＲＶ１４は、２個の異なる遺伝子サブグループ、ＡおよびＢの２つのメンバーを表す（Ｌｅｄｆｏｒｄｅｔａｌ．，２００４）こと、（２）これらの２個のモデルウイルスは、異なる受容体、ＬＤＬ受容体およびＩＣＡＭ−１をそれぞれ使用する（Ｇｒｅｖｅｅｔａｌ．，１９８９、Ｈｏｆｅｒｅｔａｌ．，１９９４）こと、（３）両方のウイルスならびにそれらの感染性ＤＮＡクローンは、広く使用されており、最も適用できる材料および方法が確立されていること（Ａｌｔｍｅｙｅｒｅｔａｌ．，１９９１、Ｇｅｒｂｅｒｅｔａｌ．，２００１）、および（４）ライノウイルスの利用可能な分子知識の大部分が、これらの２個の血清型の研究から生じていることである。

ＰＶ実験を通して開発された、最も期待できるＳＡＶＥ戦略が、ＨＲＶ２およびＨＲＶ１４のゲノムに適用される。例えば、コドン、コドン対、二次構造、またはそれらの組み合わせは脱最適化される。弱毒化の程度が異なる２〜３個のゲノムは、各遺伝子型に対して合成される。約６０個のヌクレオチドの重要なＲＮＡ二次構造であるＣＲＥを変化させないように、注意が払われる（Ｇｅｒｂｅｒｅｔａｌ．，２００１、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｅｔａｌ．，２０００、ＭｃＫｎｉｇｈｔ，２００３）。この要素は、ピコルナウイルスの複製に不可欠であり、したがって、ゲノムの再設計時に、構造自体が維持されなければならない。ゲノムにおけるＣＲＥの一は、異なるピコルナウイルスに対して異なるが、ほとんどの科に関して既知であり（Ｇｅｒｂｅｒｅｔａｌ．，２００１、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｅｔａｌ．，２０００、ＭｃＫｎｉｇｈｔ，２００３）、実験的証拠が欠けている他のためのホモロジーモデリングによって推定することができる。ＨＲＶ２の場合は、ＣＲＥは、非構造タンパク質２Ａ^ｐｒｏに対応するＲＮＡ配列に位置し、ＨＲＶ１４のＣＲＥは、ＶＰ１キャプシドタンパク質領域に位置する（Ｇｅｒｂｅｒｅｔａｌ．，２００１、ＭｃＫｎｉｇｈｔ，２００３）。

ＤＮＡゲノム等価物からライノウイルスを得るための逆遺伝学系は、ウイルスキャプシドを安定化するために、３ｍＭのＭｇ＋＋を含有するヘペス緩衝培養培地において、３４℃で、導入がＨｅＬａ−Ｈ１細胞に行われることを除いて、ＰＶに関して上記に記載されるものと基本的に同一である。ＰＦＵ／ＩＵの比を決定するために、得られる合成ウイルスは組織培養で分析される。実施例３を参照されたい。一段増殖曲線におけるプラークサイズおよび速度もまた、記載の通りに分析される。実施例２を参照されたい。ＳＡＶＥプロセスは、全ての１００個ほどの関連ライノウイルスに比較的安価に適用することができるため、この方法を使用して風邪のための安全かつ効果的なワクチンを産生することは、実現可能である。

インフルエンザＡウイルス−ポリオウイルスと無関係のウイルスへのＳＡＶＥの適応

ＰＶ実験から同定される、最も期待できるＳＡＶＥ設計基準が、コドン脱最適化型のインフルエンザウイルスを合成するために使用される。インフルエンザウイルスは、ＲＮＡの８個の別々の断片から成る「セグメント化」ウイルスであり、これらの各々は、コドン改変することができる。インフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４の変異体を生成するために、十分に確立したアンビセンスプラスミド逆遺伝学系が使用される。この８プラスミド系は、すでに記載されているものの変異形であり（Ｈｏｆｆｍａｎｎｅｔａｌ．，２０００）、Ｄｒｓ．Ｐ．ＰａｌｅｓｅａｎｄＡ．Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅによって好意的に提供された。簡潔に、別々のプラスミドにそれぞれ含有される、インフルエンザの８個のゲノム断片は、アンチセンス鎖上の３’末端におけるＰｏｌＩプロモータ、および５’末端におけるＰｏｌＩターミネータによって隣接される。次に、このカセットは、順方向鎖上の５’末端におけるサイトメガロウイルスプロモータ（ＰｏｌＩＩプロモータ）、および３’末端におけるポリアデニル化シグナルによって隣接される（Ｈｏｆｆｍａｎｎｅｔａｌ．，２０００）。共培養された２９３ＴおよびＭＤＣＫ細胞への同時導入の際、各アンビセンス発現カセットは、２種類のＲＮＡ分子を産生する。順方向鎖上のＰｏｌＩＩ転写単位は、ウイルスタンパク質のタンパク質合成に必要な全てのインフルエンザｍＲＮＡを産生する。逆方向鎖上のＰｏｌＩ転写単位は、リボ核タンパク質複合体の集合およびキャプシド形成に必要な、（−）センスゲノムＲＮＡ断片を産生する。したがって、感染インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４粒子が形成される（図１０）。Ｈ１Ｎ１血清型のこの特定の株は、ヒトに対して比較的無害である。それは、組織培養細胞における増殖に適応されており、特に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて病原性であるため、病因の研究に有用である。

代替としてスプライスされる断片（ＮＳおよびＭ）を合成する場合、スプライス部位および代替的リーディングフレームを破壊しないように注意が払われる。全ての場合において、これらの配列が、ＲＮＡ複製およびウイルス集合のシグナルを含有することが既知であるために、各断片の両端部における末端１２０ｎｔは除外される。各フラグメントの少なくとも２個の形が合成される（中程度および最大脱最適化）。１つの断片のみが改変されるウイルスが生成され、効果が評価され、必要に応じて、より多くの改変された断片が導入される。これは、各断片が別々のプラスミド上にあるため、この系においては容易である。

ウイルス感染性は、１ｕｇ／ｍｌ（ＴＰＣＫ）トリプシンの存在下での、ＭＤＣＫ細胞へのプラークアッセイによって力価決定される。あるいは、異なるウイルス構築物の数に応じて、基本的に、ＰＶに関して上記に記載されるＭＤＣＫ細胞上の細胞感染単位として、種々のウイルスの力価を決定するために、９６ウェルＥＬＩＳＡが使用される。実施例３を参照されたい。唯一の違いは、ここでは、感染細胞を染色するために、ＨＡ特異的抗体が使用されるという点である。加えて、ビリオンの相対濃度は、標準的なプロトコル（Ｋｅｎｄａｌｅｔａｌ．，１９８２）を使用した、ニワトリ赤血球細胞（ＲＢＣ）（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイによって決定される。簡潔に、ウイルス懸濁液は、Ｖ底９６ウェルプレートにおけるＰＢＳ中で２倍に連続希釈される。ＰＢＳのみが、アッセイ対照として使用される。標準化された量のＲＢＣが各ウェルに添加され、プレートは簡単に撹拌され、室温で３０分間インキュベートされる。ＨＡ力価は、完全な赤血球凝集を有する最後のウェルにおける、ウイルスの逆希釈として読み取られる。ＨＡ力価が、存在する粒子量の直接的な結果であるが、ＰＦＵ力価は、感染性の機能的測定値である。両方の測定値を決定することによって、相対的なＰＦＵ／ＨＡ単位の比は、ＰＶ実験において記載されるＰＦＵ／粒子の比と同様に計算される。実施例３を参照されたい。これは、コドンおよびコドン対脱最適化インフルエンザウイルスもまた、ＰＶに対して認められたように、より低いＰＦＵ／粒子を示すかどうかという課題に対処する。

毒性試験

致死量５０（ＬＤ_５０）の親ＮＰＲ／８／３４ウイルスは、最初にマウスに対して決定され、合成インフルエンザウイルスが、鼻内感染によるＢＡＬＢ／ｃマウスの感染に対して選択される。ＬＤ_５０値を決定するための方法は、当業者にはよく知られている（ＲｅｅｄａｎｄＭｕｅｎｃｈ，１９３８、および実施例４を参照）。理想的な候補ウイルスは、高いビリオン濃度（高いＨＡ−力価）を有する、低い感染性（低いＰＦＵ力価）を示す。麻酔されたマウスに、１０^２から１０^７ＰＦＵの間のウイルスの１０倍連続希釈を含有する、ＰＢＳ中の２５μｌのウイルス溶液が各鼻孔に投与される。死亡率および罹患率（体重減少、活性低下）は、１日２回、最大で３週間監視される。ＬＤ_５０は、ＲｅｅｄａｎｄＭｕｅｎｃｈ（１９３８）の方法によって計算される。Ａ／ＰＲ／８／３４ｗｔウイルスに対して、予測ＬＤ_５０は、約１０^３ＰＦＵ（Ｔａｌｏｎｅｔａｌ．，２０００）であるが、ウイルスが力価決定される特定の実験室条件に応じて異なり得る。

デング熱、ＨＩＶ、ロタウイルス、およびＳＡＲＳへのＳＡＶＥの適応

ＳＡＶＥ方法をさらに試験するために、いくつかのウイルスを選択した。表８は、デング熱、ＨＩＶ、ロタウイルス（２個の断片）、およびＳＡＲＳの各々のコード領域を示し、親ウイルス、および脱最適化されたコドン対バイアスを有する例示的なウイルスゲノム配列に対する、ヌクレオチド配列を提供する。上記のように、コドン対バイアスは、一部のみ（部分列）が脱最適化変異を含有する場合があるが、コード配列に対して決定される。

実施例１６
マウスにおけるポリオウイルスおよびインフルエンザウイルスワクチン候補の評価

脱最適化されたウイルスが、マウスにポリオまたはインフルエンザの予防接種をする能力を試験する。

ポリオウイルス免疫、抗体力価、およびｗｔ抗原投与実験

作業仮説は、良好なワクチン候補は、低い感染性力価を高いビリオン力価と併せ持つということである。これは、低いリスクプロファイルを有しながら、大量のウイルス粒子（すなわち、抗原）を注射することができることを確実にする。したがって、５匹のＣＤ１５５ｔｇマウスの群は、１０^３、１０^４、１０^５、および１０^６ＰＦＵのＰＶ（Ｍａｈｏｎｅｙ）（すなわち、野生型）、ＰＶ１サビンワクチン株、ＰＶ^{ＡＢ２４７０−２９５４}、ＰＶ−Ｍｉｎ^{７５５−２４７０}、または本研究中に開発された、他の期待できる弱毒化ポリオウイルスを腹腔内に注射される。野生型に対して、１ＰＦＵは約１００個のウイルス粒子であるが、弱毒化ウイルスに対しては、１ＰＦＵは約５，０００〜１００，０００個の粒子である。したがって、同数のＰＦＵでの注射は、弱毒化ウイルスの５０〜１０００倍多い粒子が注射されていることを意味する。腹腔内に注射されたｗｔウイルスに対して、ＬＤ_５０は、約１０^６ＰＦＵまたは約１０^８粒子である。したがって、低用量ではなく、最大用量である程度の死亡が予測される。

同一用量の追加接種が、最初の接種の１週間後および４週間後に行われる。２回目の追加免疫の１週間後、プラーク減少アッセイによって、ＰＶ中和抗体力価が決定される。この目的で、１００ＰＦＵのｗｔＰＶ（Ｍ）ウイルスが、免疫化マウスからの血清の２倍連続希釈でインキュベートされる。プラークアッセイによって、ＰＦＵの残余数が決定される。中和抗体力価は、プラークが認められない最低血清希釈の逆数として表される。

最後の追加免疫の４週間後、免疫化マウスおよび非免疫化対照は、致死量のＰＶ（Ｍ）ｗｔウイルス（１０^６ＰＦＵ、腹腔内。これは、ＬＤ_５０の１００倍に等しい）を抗原投与され、生存が監視される。

インフルエンザ免疫、抗体力価、およびｗｔ抗原投与実験

ワクチン接種実験のために、５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群は、０．００１、０．０１、０．１、および１．０ＬＤ_５０の用量で、ｗｔおよび弱毒化インフルエンザウイルスを腹腔内に注射される。追加のワクチン接種は、ＰＶに関して上記に記載されるものと同一の間隔で行われる。赤血球凝集（ＨＩ）阻害アッセイ、続いて標準的なプロトコルによって、２回目の追加免疫の１週間後のインフルエンザ抗体力価が決定される（Ｋｅｎｄａｌｅｔａｌ．，１９８２）。簡潔に、受容体破壊酵素（ＲＤＥ；Ｓｉｇｍａ，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理された、免疫化マウスおよび対照マウスからの血清は、２倍連続希釈され、Ｖ底９６ウェルにおける５ＨＡ単位のＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスと混合される。次いで、ＲＢＣが添加され、プレートは、標準的なＨＡアッセイに関する上記の通り処理される。抗体力価は、赤血球凝集の完全阻害をもたらす逆希釈として表される。

最後の追加のワクチン接種の３週間後、マウスは、１００または１０００ＬＤ_５０のＡ／ＰＲ／８／３４親ウイルス（約１０^５および１０^６ＰＦＵ）を鼻腔内に抗原投与され、生存が監視される。

動物の取り扱い

ヒトポリオウイルス受容体ＣＤ１５５（ＣＤ１５５ｔｇ）を発現する遺伝子導入マウスは、Ｄｒ．Ｎｏｍｏｔｏ、ＴｈｅＴｏｋｙｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得た。ＣＤ１５５ｔｇマウスコロニーは、ＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｅｗＹｏｒｋ（ＳＵＮＹ）の動物施設によって維持される。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から得られる。麻酔マウスは、静脈内、腹腔内、もしくは脳内経路によって３０μｌのウイルス懸濁液、または鼻腔内経路によって５０ｕ１を、２５ゲージの皮下注射針を使用して接種される。６〜２４週齢の両方の性別のマウスが使用される。マウスは、ポリオウイルスおよびインフルエンザウイルス研究の最も経済的なモデル系である。加えて、ＰＶの場合、ＣＤ１５５ｔｇマウス株は、非ヒト霊長類を除くと唯一の動物モデルである。マウスはまた、ポリオウイルスおよびインフルエンザウイルスの両方に対して、動物間でのウイルス拡大が起こらないため、最も安全な動物モデルを提供する。

全てのマウスは、ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ（ＤＬＡＲ）およびその獣医スタッフの指揮下で、ＳＵＮＹの最先端の動物施設に収容される。全ての動物は、獣医スタッフによって週２回検査される。ウイルスに感染した動物は、治験責任医師によって１日２回、および獣医スタッフによって毎日検査される。全ての感染実験は、動物施設内の特別に指定された最大隔離室において行われる。実験が終了した後に、生存しているマウスは安楽死され、死体は、オートクレーブによって殺菌される。ウイルス室に生きたまま残っているマウスは１匹もいない。

本研究において、マウスは、静脈内、脳内、腹腔内、筋肉内、または鼻腔内接種、麻酔注射、および血液サンプルの採集以外に、いかなる外科的処置も受けない。ワクチン接種実験のために、ウイルス特異的抗体の検出のために、ワクチン接種の前後に血液サンプルが採集される。この目的を達成するために、注射の１日前、および２回目の追加のワクチン接種の１週間後に、５０〜１００μｌがマウスか採取される。個々の動物への最大で２回の血液サンプルは、少なくとも４週間間隔で採取される。動物は麻酔され、尾を２ｍｍ切断するために、鋭い外科用メスが使用される。毛細管で血液が採取される。後続のサンプリングは、尾のかさぶたを除去することによって得られる。尾が治癒した場合、新しく尾を２ｍｍ切り落とすことが繰り返される。

全ての動物実験は、ＳＵＮＹＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されているプロトコルに従って行われる。安楽死は、ＡｍｅｒｉｃａｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの推奨に従って、ＣＯ_２ガス室において訓練されたスタッフによって実行される。感染実験は、ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）によって発行されたＡＢＳＬ２／ポリオに関する最新の推奨の下で行われる。

実施例１７
コドン対バイアスアルゴリズム−コドン対バイアスおよびスコアマトリクス

ほとんどの生物において、明確なコドンバイアスが存在し、それは、他よりも頻繁に、特定のコドンによってコード化されているアミノ酸の選好を表す。コドンバイアスは、タンパク質翻訳速度と関係があると広く考えられている。加えて、各種は、コドン対バイアスと呼ばれる、所与のコドンペアが遺伝子配列中の隣接として現れるかどうかに関する特定の選好を有する。

コドン対バイアスを定量化するために、我々は、コドン対距離を、生物の遺伝子におけるコドン対の発生予測数（頻度）に対する実測数の対数比として定義する。遺伝子セットにおけるコドン対の実測頻度の計算は直接的であるが、コドン対の予測頻度は、ＧｕｔｍａｎａｎｄＨａｔｆｉｅｌｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３６９９−３７０３，１９８９にあるように計算され、アミノ酸およびコドンバイアスとは無関係である。それを達成するために、予測頻度は、アミノ酸が特異的なコドンによってコード化される回数の相対的割合に基づいて計算される。要するに、
であり、式中、コドン対ＡＢは、アミノ酸対ＸＹをコード化し、Ｆは頻度（発生数）を示す。

このスキームにおいて、我々は、上記に定義されるような全ての対コストを有する、６４×６４コドンペア距離マトリクスを定義することができる。いかなる m残基タンパク質も、そのコード化を含むコドン対スコアの平均によって、過剰または過少に存在するコドン対を使用して、評価することができる。

コドン対バイアスに基づく遺伝子コード化の最適化

特異的なタンパク質の翻訳へのコドン対バイアスの効果を検査するために、我々は、同一コドン分布を維持しながら、コドン対を変化させることを決定した。したがって、我々は、以下の問題を定義する。アミノ酸配列およびコドン頻度（コドン分布）セットを所与として、コドン対スコアが最適化（通常、最小化または最大化）されるように、配列のＤＮＡコード化を変化させる。

上記に定義されるような我々の問題は、巡回セールスマン問題（ＴＳＰ）と関連づけることができる。巡回セールスマン問題は、最もよく知られたＮＰ完全問題である。これは、その一般的な実用性の機能であり、広く一般に説明することが容易であるためである。車で所与の都市セットの各々を訪問しなければならない巡回セールスマンを想像されたい。彼がそうして帰宅することを可能にする、したがって、彼の全運転を最小化する最短ルートは何か。

ＴＳＰヒューリスティック

ＴＳＰのほとんど全ての特色は、ＮＰ完全になるため、進めるための正しい方法はヒューリスティックによる。これらは、非常にうまくいくことが多く、典型的に、数パーセントの最適解に近づき、それは、ほとんどの用途に対して、特に我々の最適化されたコード化に対して十分に近い。

最小全域木−特に部位が平面中の点を表す場合の、単純かつ一般的なヒューリスティックは、点の最小全域木に基づいている。この木の深さ優先探索を行うことによって、新しい頂点を発見した時に下に行くのに１回、および引き返す時に上に行くのに１回の、ちょうど２回、木の各エッジを歩く。次いで、頂点が発見された順序に従って頂点の巡回路を定義し、それらを接続するために、この順序での頂点の各隣接対間の最短経路を使用することができる。この経路は、平面内の点と同様に、グラフが完全であり、三角不等式に従う場合、単一エッジでなければならない。得られる巡回路は、常に、最大でも最小ＴＳＰ巡回路の長さの２倍である。実際には、それより良好である場合が多く、典型的には最適よりも１５％〜２０％超である。さらに、アルゴリズムの時間は、最小全域木を算出する時間によって制限され、平面内の点の場合は
のみである。

逐次添加法−異なる種類のヒューリスティックは、巡回路が完全になるまで１つずつ部分的巡回路に新しい点を挿入する（単一頂点から開始）。最良に機能すると考えられるこのヒューリスティックの形は、最も離れた点挿入であり、全ての残りの点のうち、部分的巡回路Ｔに点ｖを挿入し、
になるようにする。最小値は、巡回路への最短距離を追加する位置への頂点の挿入を確実にし、最大値は、最初に最悪のそのような頂点を選択することを確実にする。詳細に記入する前に、最初に部分的巡回路を「大まかに描く」ため、これは、良好に機能するように思われる。典型的に、そのような巡回路は、最適よりもほんの５％〜１０％長い。

ｋ最適巡回路−かなりより強力なのは、Ｋｅｒｎｉｇｈａｎ−Ｌｉｎまたはｋ−ｏｐｔの種類のヒューリスティックである。方法は、任意の巡回路から始まり、それを改善することを求めて、巡回路に局所的微調整を適用する。特に、
のエッジのサブセットは、巡回路から削除され、サブチェーンを残しているｋは、得られる巡回路が改善されているかどうかを見るために、異なる方法で繋ぎ直される。巡回路は、巡回路のコストを下げるために、ｋのサブセットが削除および繋ぎ直しすることができない場合に、ｋ最適である。広範な実験は、３回の最適巡回路が、通常、最適巡回路コストの数パーセント内であることを示唆する。ｋ＞３に対して、算出時間は、解品質よりも大幅に速く増加する。巡回路の２選択は、いずれの他のヒューリスティックも改善するための迅速かつ効果的な方法である。シミュレーテッドアニーリングは、ヒューリスティックな巡回路を改善するために、エッジフリップを採用するための代替的機構を提供する。

最適コード化問題を解決するためのアルゴリズム

定義される我々の問題は、６４の国の測量基準の下で巡回セールスマン経路（巡回路ではない）を見つけることに関する問題と関連する。この定式化において、６４個の考えられるコドンの各々は、国に類似しており、コドン多様性は、国の都市の数として形作られる。コドン対バイアス測定は、国の距離マトリクスとして反映される。

コドン対バイアス測定下で遺伝子／ＤＮＡ配列を最適化するために、コドン多様性の所与のセットを使用して、特異的なタンパク質をコード化する遺伝子の設計に関する実際の生物学的問題は、わずかに異なる。国ＴＳＰモデルにおける我々のモデルに欠けているものは、特異的なタンパク質配列をコード化する必要性である。ＤＮＡトリプレットコードは、２１個の等価クラスに６４個のコドンを分割する（２０個の考えられるアミノ酸の各々および停止記号のコーディング）。いずれの所与のタンパク質/アミノ酸配列も、それをコード化するための関連コドンの等価クラスの任意の代表を選択することによって、特定することができる。

特別な制限および我々の問題の本質、ならびに最適化におけるさらなる基準の適用へのその適応性の理由から、我々は、配列を最適化するために、シミュレーテッドアニーリングヒューリスティックを選択した。技術は、以下に要約される。

シミュレーテッドアニーリングヒューリスティック

シミュレーテッドアニーリングは、より高価な（したがって劣る）解をもたらす、偶発的移行を可能にするヒューリスティック探索法である。これは、利点のように思われない可能性があるが、それは、我々の探索が局所的最適から抜け出せなくなることを防ぐ働きをする。

シミュレーテッドアニーリングのひらめきは、溶融物質を個体の状態に冷却する物理的プロセスから来ている。熱力学的理論において、系のエネルギー状態は、それを構成する粒子の各々のエネルギー状態によって示される。各粒子のエネルギー状態は、不規則にジャンプし回り、そのような移行は、系の温度によって影響される。特に、
は、
によって得られ、式中、ボルツマン定数と呼ばれるｋＢは定数である。この式は何を意味するのか。異なる条件下で指数値を考慮されたい。高エネルギー状態からより低いエネルギー状態への移動の確率は、非常に高い。しかしながら、高エネルギー状態への移行が許容され、小エネルギーが大エネルギーよりもジャンプする可能性がはるかに高い、非ゼロ確率もある。温度が高いほど、そのようなエネルギージャンプが生じる可能性も高い。

これは、組み合わせ最適化に対してどのような関連性を有するのか。物理系は、それが冷却すると、最小エネルギー状態になろうとする。いかなる別々の粒子セットに対しても、全エネルギーの最小化は、組み合わせ最適化の問題である。上記の確率分布に従って生成される不規則な移行を通して、我々は、任意の組み合わせ最適化の問題を解決するための物理学をシミュレートすることができる。

局所的探索と同様に、問題表示は、解空間の表示、および所与の解の質を測定する、適切かつ容易に計算可能なコスト関数の両方を含む。新しい構成要素は、冷却計画であり、そのパラメータは、我々が時間の関数として悪い移行を許容する可能性の程度を制御する。

探索の開始時に、我々は、良好ではない移行を許容する確率が高くなるように、乱雑度を使用して探索空間を広く調査することに意欲的である。探索が進むにつれて、我々は、局所的な改善および最適化に移行を制限しようと努める。冷却計画は、以下のパラメータによって調整される。

初期の系温度−典型的には、
である。

温度減少関数−典型的には、
であり、式中、
である。これは、線形減少とは異なり、温度の指数関数的減衰を暗示する。

温度変化間の反復数−典型的には、１００〜１，０００回の反復が、温度が低下する前に可能であり得る。

許容基準−典型的な基準は、
である時に、
のいかなる移行も許容すること、および
である場合はいつでも良好ではない移行を許容することであり、式中、
の乱数である。

停止基準−典型的に、現在の解の値が、最後の反復ほどのうちに変化または改善されていない場合、探索は終了し、現在の値が報告される。

専門家の手に委ねると、ＴＳＰに対する最適な問題特異的ヒューリスティックは、シミュレーテッドアニーリングよりわずかに機能が優れているが、シミュレーテッドアニーリング解は、容易かつ見事に機能する。

[参考文献]

Claims

弱毒化ウイルスであって、それが由来する親タンパク質コード化配列のコドン対バイアスよりも少ないコドン対バイアスを有する改変タンパク質コード化配列を含むウイルスゲノムを含む、弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、前記親タンパク質コード化配列のコドン対バイアスよりも少なくとも約０．０５少ないコドン対バイアスを有する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、前記親タンパク質コード化配列のコドン対バイアスよりも少なくとも約０．１少ないコドン対バイアスを有する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、前記親タンパク質コード化配列のコドン対バイアスよりも少なくとも約０．２少ないコドン対バイアスを有する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、約−０．０５以下のコドン対バイアスを有する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、約−０．１以下のコドン対バイアスを有する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、約−０．３以下のコドン対バイアスを有する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、約−０．４以下のコドン対バイアスを有する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、前記親ウイルスのタンパク質コード化配列と９０％未満同一である、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、前記親ウイルスのタンパク質コード化配列と８０％未満同一である、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列および前記親タンパク質コード化配列は、同一タンパク質をコード化する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、天然単離株と約１０アミノ酸以下だけ異なるタンパク質をコード化する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、天然単離株と約２０アミノ酸以下だけ異なるタンパク質をコード化する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さにわたり改変される、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、少なくとも約５００ヌクレオチドの長さにわたり改変される、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列は、少なくとも約１０００ヌクレオチドの長さにわたり改変される、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスは、動物または植物を感染させる、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記動物はヒトである、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスは、動物宿主における防御免疫応答を誘発する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記改変タンパク質コード化配列の復帰は、宿主中で生育された場合実質的に阻害される、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２本鎖、または１本鎖ウイルスである、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記タンパク質コード化配列は、ポリタンパク質をコード化する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記ヌクレオチド配列は、キャプシドタンパク質をコード化する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスは、ポリオウイルス、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、伝染性気管支炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デング熱ウイルス、西ナイル熱ウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、または黄熱病ウイルスである、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスは、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、またはアデノウイルスである、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記弱毒化ポリオウイルスは、ポリオウイルス１型（Ｍａｈｏｎｅｙ）、ポリオウイルス２型（Ｌａｎｓｉｎｇ）、ポリオウイルス３型（Ｌｅｏｎ）、１価経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）ウイルス、または３価ＯＰＶウイルスに由来する、請求項２４に記載の弱毒化ウイルス。
ヌクレオチド置換が、前記改変タンパク質コード化配列全体に分布する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記ヌクレオチド置換は、前記改変タンパク質コード化配列の一部分に限定される、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
前記部分は、前記キャプシドの１つ以上のタンパク質をコード化する、請求項２７に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスはピコルナウイルスである、請求項１から２９のうちのいずれか１項に記載の弱毒化ウイルス。
前記ピコルナウイルスはポリオウイルスである、請求項３０に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号４またはその一部分を含む、請求項３１に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号６を含む、請求項３１に記載の弱毒化ウイルス。
前記ピコルナウイルスはライノウイルスである、請求項３０に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号３０、または配列番号３２、またはそれらの一部分を含む、請求項３４に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスはオルソミクソウイルスである、請求項１から２９のうちのいずれか１項に記載の弱毒化ウイルス。
前記オルソミクソウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項３６に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２８、およびそれらの一部分のうちの１つ以上を含む、請求項３７に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号２３を含む、請求項３７に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号１５および配列番号２１を含む、請求項３７に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスはフラビウイルスである、請求項１から２９のうちのいずれか１項に記載の弱毒化ウイルス。
前記フラビウイルスはデングウイルスである、請求項４１に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号３４を含む、請求項４２に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスはレトロウイルスである、請求項１から２９のうちのいずれか１項に記載の弱毒化ウイルス。
前記レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項４４に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号３６を含む、請求項４５に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスはレオウイルスである、請求項１から２９のうちのいずれか１項に記載の弱毒化ウイルス。
前記レオウイルスはロタウイルスである、請求項４７に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号３８および／または配列番号４０を含む、請求項４８に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスはコロナウイルスである、請求項１から２９のうちのいずれか１項に記載の弱毒化ウイルス。
前記コロナウイルスは重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスである、請求項５０に記載の弱毒化ウイルス。
前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号４２を含む、請求項５１に記載の弱毒化ウイルス。
弱毒化ウイルスゲノムの作製方法であって、
ａ）親ウイルスのタンパク質コード化領域のヌクレオチド配列を取得するステップと、
ｂ）前記ヌクレオチド配列のコドンを再編成して、
ｉ）前記親ウイルスの前記コード領域と同一のアミノ酸配列をコード化し、
ｉｉ）前記親ウイルスの前記コード領域と比較して減少したコドン対バイアスを有する、変異ヌクレオチド配列を取得するステップと、
ｃ）前記変異ヌクレオチド配列のすべてまたは一部を、前記親ウイルスの前記ヌクレオチド配列に置換するステップと、を含む、方法。
前記コドンを再編成するステップは、同一アミノ酸をコード化するコドン対を無作為に選択および交換し、コドン対バイアスが前記交換により減少したかどうかを判定するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
前記ステップは、前記コドン対バイアスが所望の量減少するまで繰り返される、請求項５４に記載の方法。
前記ステップは、前記コドン対バイアスが最適値に、またはその近傍に収束するまで繰り返される、請求項５４に記載の方法。
ステップ（ａ）および（ｂ）はコンピュータ上で実行される、請求項５３から５６のうちのいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｃ）は、前記変異ヌクレオチド配列の新規合成により達成される、請求項５３に記載の方法。
ゲノム全体が前記合成されたＤＮＡと置換される、請求項５８に記載の方法。
前記ウイルスゲノムの一部分が、前記合成されたＤＮＡと置換される、請求項５８に記載の方法。
前記親ウイルスは天然単離株である、請求項４９に記載の方法。
前記親ウイルスは天然単離株の変異体である、請求項４９に記載の方法。
請求項５３に記載の方法により作製される弱毒化ウイルスゲノムを宿主生物に挿入するステップを含み、それにより弱毒化ウイルスが産生される、弱毒化ウイルスの作製方法。
請求項１から５２のうちのいずれかの弱毒化ウイルスと、薬剤として許容される担体とを含む、対象における防御免疫応答を誘発するためのワクチン組成物。
前記弱毒化ウイルスは、（ｉ）感染細胞におけるウイルスタンパク質の合成およびプロセシングを実質的に変化させず、（ｉｉ）感染細胞当たり野生型ウイルスと類似した量のビリオンを産生し、および／または（ｉｉｉ）前記野生型ウイルスよりもかなり低いビリオン特異的感染性を呈する、請求項６４に記載のワクチン組成物。
前記弱毒化ウイルスは、宿主動物において、前記対応する野生型ウイルスと実質的に類似した免疫応答を誘発する、請求項６４に記載のワクチン組成物。
対象における防御免疫応答を誘起するための方法であって、前記対象に、予防上または治療上有効な用量の請求項６４に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法。
前記対象は、病原性ウイルスに曝されている、請求項６７に記載の方法。
ウイルス関連の疾病に罹患するのを予防するための方法であって、前記対象に、予防上有効な用量の請求項６４に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法。
前記対象は、病原性ウイルスに曝されている、請求項６９に記載の方法。
ウイルスに感染した対象におけるウイルス関連の疾病の発症を遅延させるか、またはその進行速度を遅らせるための方法であって、前記対象に、治療上有効な用量の請求項６４に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法。
前記対象に、少なくとも１つのアジュバントを投与するステップをさらに含む、請求項６７から７１のうちのいずれかに記載の方法。
前記対象は、哺乳動物または鳥類である、請求項６７から７１のうちのいずれかに記載の方法。
前記哺乳動物はヒトである、請求項７３に記載の方法。
前記鳥類は、家畜化された家禽種である、請求項７３に記載の方法。
前記哺乳動物は、家畜化された家畜種である、請求項７３に記載の方法。
前記哺乳動物はウシである、請求項７３に記載の方法。
前記哺乳動物はブタである、請求項７３に記載の方法。
前記哺乳動物はヒツジである、請求項７３に記載の方法。
前記哺乳動物はウマである、請求項７３に記載の方法。
前記哺乳動物は、外来性の動物園の動物である、請求項７３に記載の方法。