DE01979431T1 - Konstruktion ganzer zellen durch mutagenese eines wesentlichen anteils eines ausgangsgenoms, kombination von mutationen und gegebenfalls wiederholung - Google Patents

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Abstract

Verfahren zum Identifizieren von Proteinen durch unterschiedliches Markieren von Peptiden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen einer Probe, die ein Polypeptid umfasst;
(b) Bereitstellen einer Mehrzahl von Markierungsreagenzien, die sich im Hinblick auf ihre Molekülmasse unterscheiden, die unterschiedlich markierte Peptide erzeugen können, die sich im Hinblick auf ihre chromatografischen Retentionseigenschaften nicht unterscheiden und die sich im Hinblick auf ihre Ionisierungs- und Nachweiseigenschaften bei der Massenspektrografieanalyse nicht unterscheiden, wobei die Molekülmassendifferenzen durch Massenspektrografieanalyse erkennbar sind;
(c) Fragmentieren des Polypeptids zu Peptidfragmenten durch enzymatischen Verdau oder durch nichtenzymatische Fragmentierung;
(d) Inkontaktbringen der Markierungsreagenzien von Schritt (b) mit den Peptidfragmenten von Schritt (c), um die Peptide mit den unterschiedlichen Markierungsreagenzien zu markieren;
(e) Trennen der Peptide durch Chromatografie, um ein Eluat zu erzeugen;
(f) Einspeisen des Eluats von Schritt (e) in ein Massenspektrometer und Quantifizieren der Menge jedes Peptids und Erzeugen der Sequenz jedes...

Claims (178)

  1. Verfahren zum Identifizieren von Proteinen durch unterschiedliches Markieren von Peptiden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Probe, die ein Polypeptid umfasst; (b) Bereitstellen einer Mehrzahl von Markierungsreagenzien, die sich im Hinblick auf ihre Molekülmasse unterscheiden, die unterschiedlich markierte Peptide erzeugen können, die sich im Hinblick auf ihre chromatografischen Retentionseigenschaften nicht unterscheiden und die sich im Hinblick auf ihre Ionisierungs- und Nachweiseigenschaften bei der Massenspektrografieanalyse nicht unterscheiden, wobei die Molekülmassendifferenzen durch Massenspektrografieanalyse erkennbar sind; (c) Fragmentieren des Polypeptids zu Peptidfragmenten durch enzymatischen Verdau oder durch nichtenzymatische Fragmentierung; (d) Inkontaktbringen der Markierungsreagenzien von Schritt (b) mit den Peptidfragmenten von Schritt (c), um die Peptide mit den unterschiedlichen Markierungsreagenzien zu markieren; (e) Trennen der Peptide durch Chromatografie, um ein Eluat zu erzeugen; (f) Einspeisen des Eluats von Schritt (e) in ein Massenspektrometer und Quantifizieren der Menge jedes Peptids und Erzeugen der Sequenz jedes Peptids mit Hilfe des Massenspektrometers; (g) Eingeben der Sequenz in ein Computerprogrammprodukt, das die eingegebene Sequenz mit einer Datenbank von Polypeptidsequenzen vergleicht, um das Polypeptid zu identifizieren, von dem das sequenzierte Peptid stammte.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe von Schritt (a) eine Zelle oder einen Zellextrakt umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Bereitstellen von zwei oder mehr Proben, die ein Polypeptid umfassen.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei eine Probe von einer Wildtypzelle und eine Probe von einer anormalen oder einer modifizierten Zelle stammt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die anormale Zelle eine Krebszelle ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Reinigen oder Fraktionieren des Polypeptids vor dem Fragmentieren in Schritt (c).
  7. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Reinigen oder Fraktionieren des Polypeptids vor dem Markieren in Schritt (d).
  8. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Reinigen oder Fraktionieren des markierten Peptids vor der Chromatografie in Schritt (e).
  9. Verfahren nach Anspruch 6, Anspruch 8 oder Anspruch 8, wobei das Reinigen oder Fraktionieren ein Verfahren umfasst, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Größenausschlusschromatografie, HPLC, Umkehrphasen-HPLC und Affinitätsreinigung.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Inkontaktbringen des Polypeptids mit einem Markierungsreagens von Schritt (b) vor dem Fragmentieren in Schritt (c).
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Markierungsreagens von Schritt (b) eine allgemeine Formel umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: i. ZAOH und ZBOH zum Verestern von Peptid-C-Endgruppen und/oder Glu und Asp Seitenketten; ii. ZANH2 und ZBNH2 zum Bilden einer Amidbindung mit Peptid-C-Endgruppen und/oder Glu und Asp Seitenketten; und iii. ZACO2H und ZBCO2H zum Bilden einer Amidbindung mit Peptid-N-Endgruppen und/oder Lys und Arg Seitenketten; wobei ZA und ZB unabhängig voneinander die allgemeine Formel R-Z1-A1-Z2-A2-Z3-A3-Z4-A4- umfassen, Z1, Z2, Z3 und Z4 unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus nichts, O, OC(O), OC(S), OC(O)O, OC(O)NR, OC(S)NR, OSiRR1, S, SC(O), SC(S), SS, S(O), S(O2), NR, NRR1+, C(O), C(O)O, C(S), C(S)O, C(O)S, C(O)NR, C(S)NR, SiRR1, (Si(RR1)ßO)n, SnRR1, Sn(RR1)O, BR(OR1), BRR1, B(OR)(OR1), OBR (OR1), OBRR1 und OB (OR) (OR1), und R und R1 eine Alkylgruppe sind, A1, A2, A3 und A4 unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus nichts oder (CRR1)n, wobei R, R1, unabhängig von anderen R und R1 in Z1 bis Z4 und unabhängig von anderen R und R1 in A1 bis A4, ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einem Halogenatom und einer Alkylgruppe; n in Z1 bis Z4, unabhängig von n in A1 bis A4, eine ganze Zahl mit einem Wert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 0 bis etwa 51; 0 bis etwa 41; 0 bis etwa 31; 0 bis etwa 21; 0 bis etwa 11 und 0 bis etwa 6.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Alkylgruppe ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Alkenyl-, einer Alkynyl- und einer Arylgruppe.
  13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei eine oder mehrere C-C-Bindungen von (CRR1) n durch eine Doppel- oder eine Dreifachbindung ersetzt werden.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei eine R- oder R1-Gruppe deletiert wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei (CRR1)n ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem o-Arylen, einem m-Arylen und einem p-Arylen, wobei jede Gruppe keine oder bis zu 6 Substituenten hat.
  16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei (CRR1)n ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem carbocyclischen, einem bicyclischen und einem tricyclischen Fragment, wobei das Fragment bis zu 8 Atome im Zyklus hat, mit oder ohne ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem O-Atom, einem N-Atom und einem S-Atom.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zwei oder mehr Markierungsreagenzien dieselbe Struktur, aber eine unterschiedliche Isotopenzusammensetzung haben.
  18. Verfahren nach Anspruch 11, wobei ZA dieselbe Struktur hat wie ZB, aber ZA eine andere Isotopenzusammensetzung als ZB hat.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Isotop Bor-10 und Bor-11 ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Isotop Kohlenstoff-12 und Kohlenstoff-13 ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Isotop Stickstoff-14 und Stickstoff-15 ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Isotop Schwefel-32 und Schwefel-34 ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 17, wobei dort, wo das Isotop mit der geringeren Masse x und das Isotop mit der höheren Masse y ist, und x und y ganze Zahlen sind, x größer ist als y.
  24. Verfahren nach Anspruch 17, wobei x und y zwischen 1 und etwa 11, zwischen 1 und etwa 21, zwischen 1 und etwa 31, zwischen 1 und etwa 41 oder zwischen 1 und etwa 51 liegen.
  25. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Markierungsreagens von Schritt (b) eine allgemeine Formel umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: i. CD3(CD2)nOH/CH3(CH2)nOH zum Verestern von Peptid-C-Endgruppen, wobei n = 0, 1, 2 oder y; ii. CD3(CD2)nNH2/CH3(CH2)nNH2 zum Bilden einer Amidbindung mit Peptid-C-Endgruppen, wobei n = 0, 1, 2 oder y; und iii. D(CD2)nCO2H/H(CH2)nCO2H zum Bilden einer Amidbindung mit Peptid-N-Endgruppen, wobei n = 0, 1, 2 oder y; wobei D ein Deuteronatom und y eine ganze Zahl ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus etwa 51; etwa 41; etwa 31; etwa 21; etwa 11; etwa 6 und zwischen etwa 5 und 51.
  26. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Markierungsreagens von Schritt (b) eine allgemeine Formel umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: i. ZAOH und ZBOH zum Verestern von Peptid-C-Endgruppen; ii. ZANH2/ZBNH2 zum Bilden einer Amidbindung mit Peptid-C-Endgruppen; und iii. ZACO2H/ZBCO2H zum Bilden einer Amidbindung mit Peptid-N-Endgruppen; wobei ZA und ZB die allgemeine Formel R-Z1-A1-Z2-A2-Z3-A3-Z4-A4- haben, Z1, Z2, Z3 und Z4 unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus nichts, O, OC(O), OC(S), OC(O)O, OC(O)NR, OC(S)NR, OSiRR1, S, SC(O), SC(S), SS, S(O), S(O2), NR, NRR1+, C(O), C(O)O, C(S), C(S)O, C(O)S, C(O)NR, C(S)NR, SiRR1, (Si(RR1)O)n, SnRR1, Sn(RR1)O, BR(OR1), BRR1, B(OR)(OR1), OBR (OR1), OBRR1, und OB (OR) (OR1), A1 , A2, A3 und A4 unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus nichts und der allgemeinen Formel (CRR1)n, und R und R1 eine Alkylgruppe sind.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei eine einfache C-C-Bindung in einer (CRR1)n Gruppe durch eine Doppel- oder Dreifachbindung ersetzt wird.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei R und R1 fehlen. 29, Verfahren nach Anspruch 27, wobei (CRR1)n einen Anteil umfasst, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem o-Arylen, einem m-Arylen und einem p-Arylen, wobei die Gruppe keine oder bis zu 6 Substituenten hat.
  29. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Gruppe ein carbocyclisches, ein bicyclisches oder ein tricyclisches Fragment mit bis zu 8 Atomen im Zyklus hat, mit oder ohne ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem O-Atom, einem N-Atom und einem S-Atom.
  30. Verfahren nach Anspruch 26, wobei R, R1, unabhängig von anderen R und R1 in Z1-Z4 und unabhängig von anderen R und R1 in A1-A4, ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer Halogen- und einer Alkylgruppe.
  31. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Alkylgruppe ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Alkenyl-, einer Alkynyl- und einer Arylgruppe.
  32. Verfahren nach Anspruch 26, wobei n in Z1-Z4 unabhängig von n in A1-A4 und eine ganze Zahl ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus etwa 51; etwa 41; etwa 31; etwa 21; etwa 11 und etwa 6.
  33. Verfahren nach Anspruch 26, wobei Z" dieselbe Struktur hat wie ZB, aber ZA ferner eine Anzahl x von -CH2-Fragment(en) in einem oder mehreren A1-A4 Fragmenten hat, wobei x eine ganze Zahl ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 26, wobei ZA dieselbe Struktur hat wie ZB, aber ZA ferner eine Anzahl x von -CF2-Fragment(en) in einem oder mehreren A1-A4 Fragmenten hat, wobei x eine ganze Zahl ist.
  35. Verfahren nach Anspruch 26, wobei ZA eine Anzahl x von Protonen und ZB eine Anzahl y von Halogenen anstelle von Protonen umfasst, wobei x und y ganze Zahlen sind.
  36. Verfahren nach Anspruch 26, wobei ZA eine Anzahl x von Protonen und ZB eine Anzahl y von Halogenen enthält, und wobei eine Anzahl x-y von Protonen in einem oder mehreren A1-A4 Fragmenten verbleibt, wobei x und y ganze Zahlen sind.
  37. Verfahren nach Anspruch 26, wobei ZA ferner eine Anzahl x von -O-Fragment(en) in einem oder mehreren A1-A4 Fragmenten umfasst, wobei x eine ganze Zahl ist.
  38. Verfahren nach Anspruch 26, wobei ZA ferner eine Anzahl x von -S-Fragment(en) in einem oder mehreren A1-A4 Fragmenten umfasst, wobei x eine ganze Zahl ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 26, wobei ZA ferner eine Anzahl x von -O-Fragment(en) und ZB ferner eine Anzahl y von -S-Fragment(en) anstelle von -O-Fragment(en) umfasst, wobei x und y ganze Zahlen sind.
  40. Verfahren nach Anspruch 26, wobei Z" ferner eine Anzahl x-y von -O-Fragment(en) in einem oder mehreren A1-A4 Fragmenten umfasst, wobei x und y ganze Zahlen sind.
  41. Verfahren nach Anspruch 37, Anspruch 40 oder Anspruch 41, wobei x und y ganze Zahlen sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus zwischen 1 und etwa 51; zwischen 1 und etwa 41; zwischen 1 und etwa 31; zwischen 1 und etwa 21; zwischen 1 und etwa 11 und zwischen 1 und etwa 6, wobei x größer ist als y.
  42. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Markierungsreagens von Schritt (b) eine allgemeine Formel umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: i. CH3(CH2)nOH/CH3(CH2)n+mOH zum Verestern von Peptid-C-Endgruppen, wobei n = 0, 1, 2, . . ., y; m = 1, 2, . . ., y; ii. CH3(CH2)nNH2/CH3(CH2)n+mNH2 zum Bilden einer Amidbindung mit Peptid-C-Endgruppen, wobei n = 0, 1, 2, . . ., y; m = 1, 2, . . ., y; und, iii. H(CH2)nCO2H/H(CH2)n+mCO2H zum Bilden einer Amidbindung mit Peptid-N-Endgruppen, wobei n = 0, 1, 2, . . ., y; m = 1, 2, . . ., y; wobei n, m und y ganze Zahlen sind.
  43. Verfahren nach Anspruch 43, wobei n, m und y ganze Zahlen sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus etwa 51; etwa 41; etwa 31; etwa 21; etwa 11; etwa 6 und zwischen etwa 5 und 51.
  44. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Trennen in Schritt (e) ein Flüssigkeitschromatografiesystem umfasst.
  45. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Flüssigkeitschromatografiesystem eine mehrdimensionale Flüssigkeitschromatografie umfasst.
  46. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Massenspektrometer ein Tandem-Massenspektrometriegerät umfasst.
  47. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Quantifizieren der Menge jedes Polypeptids.
  48. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Quantifizieren der Menge jedes Peptids.
  49. Verfahren zum Definieren der exprimierten Proteine in Verbindung mit einem bestimmten zellulären Zustand, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Probe, die eine Zelle in dem gewünschten zellulären Zustand umfasst; (b) Bereitstellen einer Mehrzahl von Markierungsreagenzien, die sich im Hinblick auf ihre Molekülmasse unterscheiden, die sich aber im Hinblick auf ihre chromatografischen Retentionseigenschaften nicht unterscheiden und sich im Hinblick auf ihre Ionisierungs- und Nachweiseigenschaften in der Massenspektrografieanalyse nicht unterscheiden, wobei die Molekülmassendifferenzen durch Massenspektrografieanalyse erkennbar sind; (c) Fragmentieren von Polypeptiden, die von der Zelle abstammen, zu Peptidfragmenten durch enzymatischen Verdau oder durch nichtenzymatische Fragmentierung; (d) Inkontaktbringen der Markierungsreagenzien von Schritt (b) mit den Peptidfragmenten von Schritt (c), um die Peptide mit den unterschiedlichen Markierungsreagenzien zu markieren; (e) Trennen der Peptide durch Chromatografie zum Erzeugen eines Eluats; (f) Einspeisen des Eluats von Schritt (e) in ein Massenspektrometer und Quantifizieren der Menge jedes Peptids und Erzeugen der Sequenz jedes Peptids mit Hilfe des Massenspektrometers; (g) Eingeben der Sequenz in ein Computerprogrammprodukt, das die eingegebene Sequenz mit einer Datenbank von Polypeptidsequenzen vergleicht, um das Polypeptid zu identifizieren, von dem das sequenzierte Peptid stammte, um die exprimierten Proteine in Verbindung mit dem zellulären Zustand zu definieren.
  50. Verfahren zum Quantifizieren von Änderungen in der Proteinexpression zwischen wenigstens zwei zellulären Zuständen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen von wenigstens zwei Proben, die Zellen in einem gewünschten zellulären Zustand umfassen; (b) Bereitstellen einer Mehrzahl von Markierungsreagenzien, die sich im Hinblick auf ihre Molekülmasse unterscheiden, die sich aber im Hinblick auf die chromatografischen Retentionseigenschaften nicht unterscheiden und sich im Hinblick auf die Ionisierungs- und Nachweiseigenschaften in der Massenspektrografieanalyse nicht unterscheiden, wobei die Molekülmassendifferenzen durch Massenspektrografieanalyse erkennbar sind; (c) Fragmentieren von Polypeptiden, die von den Zellen stammen, zu Peptidfragmenten durch enzymatischen Verdau oder durch nichtenzymatische Fragmentierung; (d) Inkontaktbringen der Markierungsreagenzien von Schritt (b) mit den Peptidfragmenten von Schritt (c), um die Peptide mit den unterschiedlichen Markierungsreagenzien zu markieren, wobei sich die in einer Probe verwendeten Markierungen von in anderen Proben verwendeten Markierungen unterscheiden; (e) Trennen der Peptide durch Chromatografie zum Erzeugen eines Eluats; (f) Einspeisen des Eluats von Schritt (e) in ein Massenspektrometer und Quantifizieren der Menge jedes Peptids und Erzeugen der Sequenz jedes Peptids mit Hilfe des Massenspektrometers; (g) Eingeben der Sequenz in ein Computerprogrammprodukt, das erkennt, von welcher Probe die jeweiligen Peptide stammen, die eingegebene Sequenz mit einer Datenbank von Polypeptidsequenzen vergleicht, um das Polypeptid zu identifizieren, von dem das sequenzierte Peptid stammte, und die Menge jedes Polypeptids in jeder Probe vergleicht, um Änderungen in der Proteinexpression zwischen wenigstens zwei zellulären Zuständen zu quantifizieren.
  51. Verfahren zum Identifizieren von Proteinen durch unterschiedliche Markierung von Peptiden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Probe, die ein Polypeptid umfasst; (b) Bereitstellen einer Mehrzahl von Markierungsreagenzien, die sich im Hinblick auf ihre Molekülmasse unterscheiden, die sich aber im Hinblick auf ihre chromatografischen Retentionseigenschaften nicht unterscheiden und sich im Hinblick auf ihre Ionisierungs- und Nachweiseigenschaften in der Massenspektrografieanalyse nicht unterscheiden, wobei die Molekülmassendifferenzen durch Massenspektrografieanalyse erkennbar sind; (c) Fragmentieren des Polypeptids zu Peptidfragmenten durch enzymatischen Verdau oder durch nichtenzymatische Fragmentierung; (d) Inkontaktbringen der Markierungsreagenzien von Schritt (b) mit den Peptidfragmenten von Schritt (c), um die Peptide mit den unterschiedlichen Markierungsreagenzien zu markieren; (e) Trennen der Peptide durch mehrdimensionale Flüssigkeitschromatografie zum Erzeugen eines Eluats; (f) Einspeisen des Eluats von Schritt (e) in ein Tandem-Massenspektrometer und Quantifizieren der Menge jedes Peptids und Erzeugen der Sequenz jedes Peptids mit Hilfe des Massenspektrometers; (g) Eingeben der Sequenz in ein Computerprogrammprodukt, das die eingegebene Sequenz mit einer Datenbank von Polypeptidsequenzen vergleicht, um das Polypeptid zu identifizieren, von dem das sequenzierte Peptid stammte.
  52. Chimäres Markierungsreagens, das Folgendes umfasst: (a) eine erste, ein Biotin umfassende Domäne; und (b) eine zweite Domäne, umfassend eine reaktionsfähige Gruppe, die sich kovalent an eine Aminosäure binden kann, wobei das chimäre Markierungsreagens wenigstens ein Isotop umfasst.
  53. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 53, wobei sich das Isotop in der ersten Domäne befindet.
  54. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 54, wobei sich das Isotop in dem Biotin befindet.
  55. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 53, wobei sich das Isotop in der zweiten Domäne befindet.
  56. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 53, wobei das Isotop ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Deuteriumisotop, einem Bor-10 oder Bor-11 Isotop, einem Kohlenstoff-12 oder Kohlenstoff-13 Isotop, einem Stickstoff-14 oder Stickstoff-15 Isotop und einem Schwefel-32 oder Schwefel-34 Isotop.
  57. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 53, umfassend zwei oder mehr Isotope.
  58. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 53, wobei die reaktionsfähige Gruppe, die sich kovalent an eine Aminosäure binden kann, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Succimidgruppe, einer Isothiocyanatgruppe und einer Isocyanatgruppe.
  59. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 53, wobei sich die reaktionsfähige Gruppe, die sich kovalent an eine Aminosäure binden kann, an ein Lysin oder ein Cystein bindet.
  60. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 53, ferner umfassend einen Linker-Anteil, der die Biotingruppe mit der reaktionsfähigen Gruppe verbindet.
  61. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 53, wobei der Linker-Anteil wenigstens ein Isotop umfasst.
  62. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 53, wobei der Linker ein spaltbarer Anteil ist.
  63. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 53, wobei der Linker durch enzymatischen Verdau gespalten werden kann.
  64. Chimäres Markierungsreagens nach Anspruch 53, wobei der Linker durch Reduktion gespalten werden kann.
  65. Verfahren zum Vergleichen von relativen Proteinkonzentrationen in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen einer Mehrzahl von unterschiedlichen kleinen Molekül-Tags, wobei die kleinen Molekül-Tags strukturell identisch sind, sich aber im Hinblick auf ihre Isotopenzusammensetzung unterscheiden, und die kleinen Moleküle reaktionsfähige Gruppen umfassen, die sich kovalent an Cystein- oder Lysinreste oder beide binden; (b) Bereitstellen von wenigstens zwei Proben, die Polypeptide umfassen; (c) kovalentes Anlagern der unterschiedlichen kleinen Molekül-Tags an Aminosäuren der Polypeptide; (d) Bestimmen der Proteinkonzentrationen jeder Probe in einem Tandem-Massenspektrometer; und (d) Vergleichen relativer Proteinkonzentrationen jeder Probe.
  66. Verfahren nach Anspruch 66, wobei die Probe eine vollständige oder eine fraktionierte zelluläre Probe umfasst.
  67. Verfahren nach Anspruch 66, wobei unterschiedliche kleine Molekül-Tags ein chimäres Markierungsreagens umfassen, umfassend (a) eine ein Biotin umfassende erste Domäne und (b) eine zweite Domäne, die eine reaktionsfähige Gruppe umfasst, die sich kovalent an eine Aminosäure binden kann, wobei das chimäre Markierungsreagens wenigstens ein Isotop umfasst.
  68. Verfahren nach Anspruch 68, wobei das Isotop ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Deuteriumisotop, einem Bor-10 oder Bor-11 Isotop, einem Kohlenstoff-12 oder Kohlenstoff-13 Isotop, einem Stickstoff-14 oder Stickstoff-15 Isotop und einem Schwefel-32 oder Schwefel-34 Isotop.
  69. Verfahren nach Anspruch 68, wobei das chimäre Markierungsreagens zwei oder mehr Isotope umfasst.
  70. Verfahren nach Anspruch 68, wobei die reaktionsfähige Gruppe, die sich kovalent an eine Aminosäure binden kann, ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Succimidgruppe, einer Isothiocyanatgruppe und einer Isocyanatgruppe.
  71. Verfahren zum Vergleichen von relativen Proteinkonzentrationen in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen einer Mehrzahl von unterschiedlichen kleinen Molekül-Tags, wobei die unterschiedlichen kleinen Molekül-Tags ein chimäres Markierungsreagens umfassen, umfassend (i) eine erste, ein Biotin umfassende Domäne; und (ii) eine zweite Domäne, die eine reaktionsfähige Gruppe umfasst, die sich kovalent an eine Aminosäure binden kann, wobei das chimäre Markierungsreagens wenigstens ein Isotop umfasst; (b) Bereitstellen von wenigstens zwei Proben, die Polypeptide umfassen; (c) kovalentes Anlagern der unterschiedlichen kleinen Molekül-Tags an Aminosäuren der Polypeptide; (d) Isolieren der mit Tag markierten Polypeptide an einer Biotin-Bindesäule durch Binden von mit Tag markierten Polypeptiden an die Säule, Abwaschen von ungebundenen Materialien von der Säule und Herauslösen von mit Tag markierten Polypeptiden von der Säule; (e) Ermitteln der Proteinkonzentrationen jeder Probe in einem Tandem-Massenspektrometer; und (f) Vergleichen relativer Proteinkonzentrationen jeder Probe. Zweiter Anspruchssatz:
  72. Verfahren zum Erzeugen eines verbesserten Organismus mit einer wünschenswerten Eigenschaft, umfassend die folgenden Schritte: a) Erhalten einer Ausgangspopulation von Organismen, b) Erzeugen eines Satzes mutagenisierter Organismen, so dass dann, wenn alle genetischen Mutationen in dem Satz mutagenisierter Organismen als Ganzes genommen werden, ein Satz von substantiellen genetischen Mutationen repräsentiert wird, und c) Nachweisen der Anwesenheit des genannten verbesserten Organismus.
  73. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der Satz von substantiellen genetischen Mutationen in Schritt b) das Ausschalten von wenigstens 15 verschiedenen Genen umfasst.
  74. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der Satz von substantiellen genetischen Mutationen in Schritt b) das Ausschalten von wenigstens 50 verschiedenen Genen umfasst.
  75. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der Satz von substantiellen genetischen Mutationen in Schritt b) das Ausschalten von wenigstens 100 verschiedenen Genen umfasst.
  76. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der Satz von substantiellen genetischen Mutationen in Schritt b) die Einführung von wenigstens 15 verschiedenen Genen umfasst.
  77. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der Satz von substantiellen genetischen Mutationen in Schritt b) die Einführung von wenigstens 50 verschiedenen Genen umfasst.
  78. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der Satz von substantiellen genetischen Mutationen in Schritt b) die Einführung von wenigstens 100 verschiedenen Genen umfasst.
  79. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der Satz von substantiellen genetischen Mutationen in Schritt b) eine Änderung der Expression von wenigstens 15 verschiedenen Genen umfasst.
  80. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der Satz von substantiellen genetischen Mutationen in Schritt b) eine Änderung der Expression von wenigstens 50 verschiedenen Genen umfasst.
  81. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der Satz von substantiellen genetischen Mutationen in Schritt b) eine Änderung der Expression von wenigstens 100 verschiedenen Genen umfasst.
  82. Verfahren zum Erzeugen eines verbesserten Organismus mit einer wünschenswerten Eigenschaft, umfassend die folgenden Schritte: a) Erhalten einer Ausgangspopulation von Organismen, b) Erzeugen eines Satzes mutagenisierter Organismen mit jeweils wenigstens einer genetischen Mutation, so dass dann, wenn alle genetischen Mutationen in dem Satz mutagenisierter Organismen als Ganzes genommen werden, ein Satz von substantiellen genetischen Mutationen repräsentiert wird, c) Nachweisen der Manifestation von wenigstens zwei genetischen Mutationen, d) Einführen von wenigstens zwei nachgewiesenen genetischen Mutationen in einen Organismus und e) optionales Wiederholen beliebiger der Schritte a), b), c) und d).
  83. Verfahren nach Anspruch 83, wobei Schritt d) das Ausschalten von wenigstens 15 verschiedenen Genen in einem Organismus umfasst.
  84. Verfahren nach Anspruch 83, wobei Schritt d) das Ausschalten von wenigstens 50 verschiedenen Genen in einem Organismus umfasst.
  85. Verfahren nach Anspruch 83, wobei Schritt d) das Ausschalten von wenigstens 100 verschiedenen Genen in einem Organismus umfasst.
  86. Verfahren nach Anspruch 83, wobei Schritt d) die Einführung von wenigstens 15 verschiedenen Genen in einen Organismus umfasst.
  87. Verfahren nach Anspruch 83, wobei Schritt d) die Einführung von wenigstens 50 verschiedenen Genen in einen Organismus umfasst.
  88. Verfahren nach Anspruch 83, wobei Schritt d) die Einführung von wenigstens 100 verschiedenen Genen in einen Organismus umfasst.
  89. Verfahren nach Anspruch 83, wobei Schritt d) eine Änderung der Expression von wenigstens 15 verschiedenen Genen in einem Organismus umfasst.
  90. Verfahren nach Anspruch 83, wobei Schritt d) eine Änderung der Expression von wenigstens 50 verschiedenen Genen in einem Organismus umfasst.
  91. Verfahren nach Anspruch 83, wobei Schritt d) eine Änderung der Expression von wenigstens 100 verschiedenen Genen in einem Organismus umfasst.
  92. Verfahren zum Identifizieren eines Gens, das ein Merkmal eines Organismus ändert, umfassend die folgenden Schritte: a) Erhalten einer Ausgangspopulation von Organismen, b) Erzeugen eines Satzes mutagenisierter Organismen, so dass dann, wenn alle genetischen Mutationen in dem Satz mutagenisierter Organismen als Ganzes genommen werden, ein Satz von substantiellen genetischen Mutationen repräsentiert wird, und c) Nachweisen der Anwesenheit eines Organismus mit dem genannten geänderten Merkmal, und d) Ermitteln der Nucleotidsequenz eines Gens, das in dem Organismus mit dem geänderten Merkmal mutagenisiert wurde.
  93. Verfahren zum Erzeugen eines Organismus mit einem verbesserten Merkmal, umfassend die folgenden Schritte: a) funktionelles Ausschalten eines endogenen Gens in einer im Wesentlichen klonalen Population von Organismen; b) Übertragen einer Bank von geänderten Genen in eine im Wesentlichen klonale Population von Organismen, wobei jedes geänderte Gen sich von dem endogenen Gen in nur einem Codon unterscheidet; c) Nachweisen eines mutagenisierten Organismus mit einem verbesserten Merkmal; und d) Ermitteln der Nucleotidsequenz eines Gens, das in den nachgewiesenen Organismus übertragen wurde.
  94. Verfahren zum Einführen von unterschiedlich aktivierbaren kombinierten Merkmalen in eine transgene Zelle oder einen transgenen Organismus, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Erhalten einer/eines Ausgangszelle oder -Organismus; b) Einführen einer Mehrzahl von Merkmalen (kombinierte Merkmale) in die Arbeitszelle oder den Arbeitsorganismus, einschließlich selektiv und unterschiedlich aktivierbarer Merkmale, wobei bearbeitbare Merkmale für diesen Zweck Merkmale beinhalten, die durch Gene verliehen werden, und Merkmale, die durch Genpfade verliehen werden; c) Analysieren der in den Schritten a) und b) erhaltenen Informationen, und d) optionales Wiederholen von beliebigen oder allen Schritten a), b), c) und d).
  95. Verfahren nach Anspruch 95, wobei Schritt a) auch die holistische Überwachung des Stammes oder Organismus beinhaltet, wobei die holistische Überwachung den Nachweis und/oder die Messung aller nachweisbaren Funktionen und physikalischen Parameter beinhalten kann (wie z.B. unter anderem Morphologie, Verhalten, Wachstum, Ansprechbarkeit auf Reize [z.B. Antibiotika, andere Umgebung usw.] und Profile aller nachweisbaren Moleküle, einschließlich Moleküle, die chemisch wenigstens teilweise Nucleinsäuren, Proteine, Kohlenhydrate, Proteoglykane, Glykoproteine oder Lipide sind).
  96. Verfahren nach Anspruch 95, wobei Schritt d) auch die holistische Überwachung des Stammes oder Organismus beinhaltet, wobei die holistische Überwachung den Nachweis und/oder die Messung aller nachweisbaren Funktionen und physikalischen Parameter beinhalten kann (wie z.B. unter anderem Morphologie, Verhalten, Wachstum, Ansprechbarkeit auf Reize [z.B. Antibiotika, andere Umgebung usw.] und Profile aller nachweisbaren Moleküle, einschließlich Moleküle, die chemisch wenigstens teilweise Nucleinsäuren, Proteine, Kohlenhydrate, Proteoglykane, Glykoproteine oder Lipide sind).
  97. Verfahren nach Anspruch 95, wobei Schritt a) und d) die holistische Überwachung des Stammes oder Organismus beinhalten, wobei die holistische Überwachung den Nachweis und/oder die Messung aller nachweisbaren Funktionen und physikalischen Parameter beinhalten kann (wie z.B. unter anderem Morphologie, Verhalten, Wachstum, Ansprechbarkeit auf Reize [z.B. Antibiotika, andere Umgebung usw.] und Profile aller nachweisbaren Moleküle, einschließlich Moleküle, die chemisch wenigstens teilweise Nucleinsäuren, Proteine, Kohlenhydrate, Proteoglykane, Glykoproteine oder Lipide sind).
  98. Verfahren nach Anspruch 95, wobei Schritt b) die Einführung von wenigstens 15 kombinierten Merkmalen beinhaltet.
  99. Verfahren nach Anspruch 95, wobei Schritt b) die Einführung von wenigstens 50 kombinierten Merkmalen beinhaltet.
  100. Verfahren nach Anspruch 95, wobei Schritt b) die Einführung von wenigstens 100 kombinierten Merkmalen beinhaltet.
  101. Verfahren nach Anspruch 96, wobei Schritt a) das Screenen zellulärer Charakteristiken durch die Anwendung von einem oder einer beliebigen Kombination der folgenden Verfahren beinhaltet: a) Genomik; b) Transkriptomcharakterisierung oder RNA-Profiling; c) Proteomik; d) Metabolomik oder Metabolitanalyse; e) Lipidomik oder Lipid-Profiling.
  102. Verfahren nach Anspruch 102, wobei die Proteomik insbesondere die Verwendung von mit Aminosäure reaktionsfähigen Tags beinhaltet.
  103. Verfahren nach Anspruch 97, wobei Schritt d) das Screenen zellulärer Charakteristiken durch die Anwendung von einem oder einer beliebigen Kombination der folgenden Verfahren beinhaltet: f) Genomik; g) Transkriptomcharakterisierung oder RNA-Profiling; h) Proteomik; i) Metabolomik oder Metabolitanalyse; j) Lipidomik oder Lipidprofiling.
  104. Verfahren nach Anspruch 104, wobei die Proteomik insbesondere die Verwendung von mit Aminosäure reaktionsfähigen Tags beinhaltet.
  105. Verfahren nach Anspruch 98, wobei die Schritte a) und d) das Screenen zellulärer Charakteristiken durch die Anwendung von einem oder einer beliebigen Kombination der folgenden Verfahren beinhalten: k) Genomik; l) Transkriptomcharakterisierung oder RNA-Profiling; m) Proteomik; n) Metabolomik oder Metabolitanalyse; o) Lipidomik oder Lipidprofiling. p)
  106. Verfahren nach Anspruch 106, wobei die Proteomik insbesondere die Verwendung von mit Aminosäure reaktionsfähigen Tags beinhaltet.
  107. Verfahren nach Anspruch 73, wobei Schritt c) das Screenen zellulärer Charakteristiken durch die Anwendung von einem oder einer beliebigen Kombination der folgenden Verfahren beinhaltet: q) Genomik; r) Transkriptomcharakterisierung oder RNA-Profiling; s) Proteomik; t) Metabolomik oder Metabolitanalyse; u) Lipidomik oder Lipidprofiling.
  108. Verfahren nach Anspruch 108, wobei die Proteomik insbesondere die Verwendung von mit Aminosäure reaktionsfähigen Tags beinhaltet.
  109. Verfahren nach Anspruch 93, wobei Schritt c) das Screenen zellulärer Charakteristiken durch die Anwendung von einem oder einer beliebigen Kombination der folgenden Verfahren beinhaltet: v) Genomik; w) Transkriptomcharakterisierung oder RNA-Profiling; x) Proteomik; y) Metabolomik oder Metabolitanalyse; z) Lipidomik oder Lipidprofiling.
  110. Verfahren nach Anspruch 110, wobei die Proteomik insbesondere die Verwendung von mit Aminosäure reaktionsfähigen Tags beinhaltet.
  111. Verfahren nach Anspruch 94, wobei Schritt c) das Screenen zellulärer Charakteristiken durch die Anwendung von einem oder einer beliebigen Kombination der folgenden Verfahren beinhaltet: aa) Genomik; bb) Transkriptomcharakterisierung oder RNA-Profiling; cc) Proteomik; dd) Metabolomik oder Metabolitanalyse; ee) Lipidomik oder Lipidprofiling.
  112. Verfahren nach Anspruch 112, wobei die Proteomik insbesondere die Verwendung von mit Aminosäure reaktionsfähigen Tags beinhaltet.
  113. Verfahren für das Whole-Cell-Engineering von neuen oder modifizierten Phänotypen durch die Anwendung einer metabolischen Echtzeit-Flussanalyse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Herstellen einer modifizierten Zelle durch Modifizieren der genetischen Zusammensetzung einer Zelle; (b) Kultivieren der modifizierten Zelle, um eine Mehrzahl von modifizierten Zellen zu erzeugen; (c) Messen von wenigstens einem Stoffwechselparameter der Zelle durch Überwachen der Zellkultur von Schritt (b) in Echtzeit; und (d) Analysieren der Daten von Schritt (c), um zu ermitteln, ob sich der gemessene Parameter von einer vergleichbaren Messung in einer unmodifizierten Zelle unter ähnlichen Bedingungen unterscheidet, um einen konstruierten Phänotyp in der Zelle mit metabolischer Echtzeit-Flussanalyse zu identifizieren.
  114. Verfahren nach Anspruch 114, wobei die genetische Zusammensetzung der Zelle mit einem Verfahren modifiziert wird, das die Zugabe einer Nucleinsäure zur Zelle umfasst.
  115. Verfahren nach Anspruch 115, wobei die Nucleinsäure eine zu der Zelle heterologe Nucleinsäure umfasst.
  116. Verfahren nach Anspruch 115, wobei die Nucleinsäure eine zu der Zelle homologe Nucleinsäure umfasst.
  117. Verfahren nach Anspruch 117, wobei die homologe Nucleinsäure eine modifizierte homologe Nucleinsäure umfasst.
  118. Verfahren nach Anspruch 118, wobei die homologe Nucleinsäure ein modifiziertes homologes Gen umfasst.
  119. Verfahren nach Anspruch 114, wobei die genetische Zusammensetzung der Zelle mit einem Verfahren modifiziert wird, das die Deletion einer Sequenz oder Modifikation einer Sequenz in der Zelle umfasst.
  120. Verfahren nach Anspruch 114, wobei die genetische Zusammensetzung der Zelle mit einem Verfahren modifiziert wird, das das Modifizieren oder Ausschalten der Expression eines Gens umfasst.
  121. Verfahren nach Anspruch 114, ferner umfassend das Selektieren einer Zelle, die einen neu konstruierten Phänotyp umfasst.
  122. Verfahren nach Anspruch 122, ferner umfassend das Kultivieren der selektierten Zelle, um einen neuen Zellstamm zu erzeugen, der einen neu konstruierten Phänotyp umfasst.
  123. Verfahren nach Anspruch 122, wobei der neu konstruierte Phänotyp ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer erhöhten oder verringerten Expression oder Menge eines Polypeptids, einer erhöhten oder verringerten Menge eines mRNA-Transkripts, einer erhöhten oder verringerten Expression eines Gens, einer erhöhten oder verringerten Resistenz oder Empfindlichkeit gegenüber einem Toxin, einer Verwendung oder Produktion mit erhöhter oder verringerter Resistenz eines Metabolits, einer erhöhten oder verringerten Aufnahme einer Verbindung durch die Zelle, einer erhöhten oder verringerten Stoffwechselrate und einer erhöhten oder verringerten Wachstumsrate.
  124. Verfahren nach Anspruch 114, ferner umfassend das Isolieren einer Zelle, die einen neu konstruierten Phänotyp umfasst.
  125. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der neu konstruierte Phänotyp ein stabiler Phänotyp ist.
  126. Verfahren nach Anspruch 126, wobei das Modifizieren der genetischen Zusammensetzung einer Zelle die Insertion eines Konstrukts in die Zelle umfasst, wobei das Konstrukt eine Nucleinsäure umfasst, die funktionell mit einem konstitutiv aktiven Promotor verbunden ist.
  127. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der neu konstruierte Phänotyp ein induzierbarer Phänotyp ist.
  128. Verfahren nach Anspruch 128, wobei das Modifizieren der genetischen Zusammensetzung einer Zelle die Insertion eines Konstrukts in die Zelle umfasst, wobei das Konstrukt eine Nucleinsäure umfasst, die funktionell mit einem induzierbaren Promotor verbunden ist.
  129. Verfahren nach Anspruch 115, wobei die der Zelle in Schritt (a) zugegebene Nucleinsäure stabil in das Genom der Zelle eingesetzt wird.
  130. Verfahren nach Anspruch 115, wobei sich die der Zelle in Schritt (a) zugegebene Nucleinsäure als Episom in der Zelle vermehrt.
  131. Verfahren nach Anspruch 115, wobei die der Zelle in Schritt (a) zugegebene Nucleinsäure ein Polypeptid kodiert.
  132. Verfahren nach Anspruch 132, wobei das Polypeptid ein modifiziertes homologes Polypeptid umfasst.
  133. Verfahren nach Anspruch 132, wobei das Polypeptid ein heterologes Polypeptid umfasst.
  134. Verfahren nach Anspruch 115, wobei die der Zelle in Schritt (a) zugegebene Nucleinsäure ein Transkript kodiert, umfassend eine Sequenz, die antisense zu einem homologen Transkript ist.
  135. Verfahren nach Anspruch 114, wobei das Modifizieren der genetischen Zusammensetzung der Zelle in Schritt (a) das Erhöhen oder Verringern der Expression eines mRNA-Transkripts umfasst.
  136. Verfahren nach Anspruch 114, wobei das Modifizieren der genetischen Zusammensetzung der Zelle in Schritt (a) das Erhöhen oder Verringern der Expression eines Polypeptids umfasst.
  137. Verfahren nach Anspruch 114, wobei das Modifizieren des homologen Gens in Schritt (a) das Ausschalten der Expression des homologen Gens umfasst.
  138. Verfahren nach Anspruch 114, wobei das Modifizieren des homologen Gens in Schritt (a) das Erhöhen der Expression des homologen Gens umfasst.
  139. Verfahren nach Anspruch 114, wobei das heterologe Gen in Schritt (a) ein sequenzmodifiziertes homologes Gen umfasst, wobei die Sequenzmodifikation mit einem Verfahren erzielt wird, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Template-Polynucleotids, wobei das Template-Polynucleotid ein homologes Gen der Zelle umfasst; (b) Bereitstellen einer Mehrzahl von Oligonucleotiden, wobei jedes Oligonucleotid eine Sequenz umfasst, die zu dem Template-Polynucleotid homolog ist, um eine spezifische Sequenz des Template-Polynucleotids anzupeilen, und eine Sequenz, die eine Variante des homologen Gens ist; (c) Erzeugen von Nachkommenspolynucleotiden, umfassend nichtstochastische Sequenzvariationen, durch Replizieren des Template-Polynucleotids von Schritt (a) mit den Oligonucleotiden von Schritt (b), um Polynucleotide zu erzeugen, die homologe Gensequenzvariationen umfassen.
  140. Verfahren nach Anspruch 114, wobei das heterologe Gen in Schritt (a) ein sequenzmodifiziertes homologes Gen umfasst, wobei die Sequenzmodifikation mit einem Verfahren erzielt wird, das die folgenden Schritte umfasst:: (a) Bereitstellen eines Template-Polynucleotids, wobei das Template-Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die ein homologes Gen kodiert; (b) Bereitstellen einer Mehrzahl von Baustein-Polynucleotiden, wobei die Baustein-Polynucleotide für eine Cross-over-Reassemblierung mit dem Template-Polynucleotid in einer vorbestimmten Sequenz ausgelegt sind, und ein Baustein-Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die eine Variante des homologen Gens ist, und eine Sequenz, die zu dem die variante Sequenz flankierenden Template-Polynucleotid homolog ist; (c) Kombinieren eines Baustein-Polynucleotids mit einem Template-Polynucleotid, so dass es zu einer Cross-over-Reassemblierung des Baustein-Polynucleotids mit dem Template-Polynucleotid kommt, um Polynucleotide zu erzeugen, die homologe Gensequenzvariationen umfassen.
  141. Verfahren nach Anspruch 114, wobei die Zelle eine prokaryotische Zelle ist.
  142. Verfahren nach Anspruch 142, wobei die prokaryotische Zelle eine Bakterienzelle ist.
  143. Verfahren nach Anspruch 114, wobei die Zelle ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Pilzzelle, einer Hefezelle, einer Pflanzenzelle und einer Insektenzelle.
  144. Verfahren nach Anspruch 114, wobei die Zelle eine eukaryotische Zelle ist.
  145. Verfahren nach Anspruch 145, wobei die Zelle eine Säugetierzelle ist.
  146. Verfahren nach Anspruch 146, wobei die Säugetierzelle eine menschliche Zelle ist.
  147. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der gemessene Stoffwechselparameter die Zellwachstumsrate umfasst.
  148. Verfahren nach Anspruch 148, wobei die Zellwachstumsrate anhand einer Änderung der optischen Dichte der Kultur gemessen wird.
  149. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der gemessene Stoffwechselparameter eine Änderung der Expression eines Polypeptids umfasst.
  150. Verfahren nach Anspruch 150, wobei die Änderung der Expression des Polypeptids mit einem Verfahren gemessen wird, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus eindimensionaler Gelelektrophorese, zweidimensionaler Gelelektrophorese, Tandem-Massenspektrografie, RIA, ELISA, Immunpräzipitation und Western-Blot.
  151. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der gemessene Stoffwechselparameter eine Änderung der Expression von wenigstens einem Transkript oder die Expression eines Transkripts eines neu eingeführten Gens umfasst.
  152. Verfahren nach Anspruch 152, wobei die Änderung der Expression des Transkripts mit einem Verfahren gemessen wird, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Hybridisierung, einer quantitativen Amplifikation und einem Northern-Blot.
  153. Verfahren nach Anspruch 153, wobei die Transkript-Expression durch Hybridisierung einer Probe, umfassend Transkripte einer Zelle oder Nucleinsäure, repräsentativ für oder komplementär zu Transkripte(n) einer Zelle, durch Hybridisierung mit immobilisierten Nucleinsäuren auf einem Array gemessen wird.
  154. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der gemessene Stoffwechselparameter eine Erhöhung oder Verringerung eines Sekundärmetabolits umfasst.
  155. Verfahren nach Anspruch 155, wobei der Sekundärmetabolit ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Glycerol und einem Methanol.
  156. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der gemessene Stoffwechselparameter eine Erhöhung oder Verringerung einer organischen Säure umfasst.
  157. Verfahren nach Anspruch 157, wobei die organische Säure ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Acetat, einem Butyrat, einem Succinat und einem Oxaloacetat.
  158. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der gemessene Stoffwechselparameter eine Erhöhung oder Verringerung des intrazellulären pH-Werts umfasst.
  159. Verfahren nach Anspruch 159, wobei die Erhöhung oder Verringerung des intrazellulären pH-Werts durch intrazelluläre Anwendung eines Farbstoffs gemessen wird und die Fluoreszenzänderung des Farbstoffs im Laufe der Zeit gemessen wird.
  160. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der gemessene Stoffwechselparameter eine Erhöhung oder Verringerung der DNA-Synthese im Laufe der Zeit umfasst.
  161. Verfahren nach Anspruch 161, wobei die Erhöhung oder Verringerung der DNA-Synthese im Laufe der Zeit durch intrazelluläre Anwendung eines Farbstoffs gemessen wird, und wobei die Fluoreszenzänderung des Farbstoffs im Laufe der Zeit gemessen wird.
  162. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der gemessene Stoffwechselparameter eine Erhöhung oder Verringerung der Aufnahme einer Zusammensetzung umfasst.
  163. Verfahren nach Anspruch 163, wobei die Zusammensetzung ein Metabolit ist.
  164. Verfahren nach Anspruch 164, wobei der Metabolit ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Monosaccharid, einem Disaccharid, einem Polysaccharid, einem Lipid, einer Nucleinsäure, einer Aminosäure und einem Polypeptid.
  165. Verfahren nach Anspruch 165, wobei das Saccharid, Disaccharid oder Polysaccharid Glucose oder Saccharose umfasst.
  166. Verfahren nach Anspruch 163, wobei die Zusammensetzung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Antibiotikum, einem Metall, einem Steroid und einem Antikörper.
  167. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der gemessene Stoffwechselparameter eine Erhöhung oder Verringerung der Sekretion eines Nebenproduktes oder einer sekretierten Zusammensetzung einer Zelle umfasst.
  168. Verfahren nach Anspruch 168, wobei das Nebenprodukt oder die sekretierte Zusammensetzung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Toxin, einem Lymphokin, einem Polysaccharid, einem Lipid, einer Nucleinsäure, einer Aminosäure, einem Polypeptid und einem Antikörper.
  169. Verfahren nach Anspruch 114, wobei bei der Echtzeitüberwachung gleichzeitig eine Mehrzahl von Stoffwechselparametern gemessen wird.
  170. Verfahren nach Anspruch 170, wobei bei der Echtzeitüberwachung einer Mehrzahl von Stoffwechselparametern ein Zellwachstumsüberwachungsgerät benutzt wird.
  171. Verfahren nach Anspruch 171, wobei das Zellwachstumsüberwachungsgerät ein Cell Growth Monitor, Modell 652, von Wedgewood Technology, Inc. ist.
  172. Verfahren nach Anspruch 171, wobei bei der gleichzeitigen Echtzeitüberwachung die Aufnahme von Substraten, das Niveau von intrazellulären organischen Säuren und das Niveau von intrazellulären Aminosäuren gemessen werden.
  173. Verfahren nach Anspruch 171, wobei bei der gleichzeitigen Echtzeitüberwachung Folgendes gemessen wird: die Aufnahme von Glucose; das Niveau von Acetat, Butyrat, Succinat oder Oxaloacetat; sowie das Niveau von intrazellulären natürlichen Aminosäuren.
  174. Verfahren nach Anspruch 171, ferner umfassend die Verwendung eines rechnerimplementierten Programms zur Echtzeitüberwachung der Änderung der gemessenen Stoffwechselparameter im Laufe der Zeit.
  175. Verfahren nach Anspruch 175, wobei das rechnerimplementierte Programm ein rechnerimplementiertes Verfahren wie in 28 dargestellt umfasst.
  176. Verfahren nach Anspruch 176, wobei das rechnerimplementierte Verfahren metabolische Netzwerkgleichungen umfasst.
  177. Verfahren nach Anspruch 176, wobei das rechnerimplementierte Verfahren eine Pfadanalyse umfasst.
  178. Verfahren nach Anspruch 176, wobei das rechnerimplementierte Programm eine Vorverarbeitungseinheit zum Ausfiltern von Messfehlern vor der metabolischen Flussanalyse umfasst.
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